JP2012500793A - 細胞内デリバリーのための異種性ポリマーミセル - Google Patents

細胞内デリバリーのための異種性ポリマーミセル Download PDF

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Abstract

異種性ポリマーミセルおよびミセルと結合した薬剤（たとえばポリヌクレオチド）を含む組成物が、かかる薬剤の細胞内デリバリーのための方法とともに開示される。

Description

関連出願
本出願は、以下の出願の各々の優先権および利益を主張し、以下の出願の各々は、参照により本明細書に組み込まれる：「ジブロック共重合体ミセルおよび細胞へのデリバリーのためのそのポリヌクレオチド複合体（Diblock Copolymer Micelles and Polynucleotide Complexes Thereof for Delivery into Cells）」というタイトルで2008年8月22日に出願されたU.S.仮出願No. 61/091,294；「ポリマーキャリア（Polymeric Carrier）」というタイトルで2008年11月6日に出願されたU.S.仮出願No. 61/112,054；「ミセル集合体（Micellic Assemblies）」というタイトルで2008年11月6日に出願されたU.S.仮出願No. 61/112,048；「ポリマーキャリア（Polymeric Carrier）」というタイトルで2008年12月24日に出願されたU.S.仮出願No. 61/140,779；「ミセル集合体（Micellic Assemblies）」というタイトルで2008年12月24日に出願されたU.S.仮出願No. 61/140,774；「ポリマーキャリア（Polymeric Carrier）」というタイトルで2009年4月21日に出願されたU.S.仮出願No. 61/171,358；および「ミセル集合体（Micellic Assemblies）」というタイトルで2009年4月21日に出願されたU.S.仮出願No. 61/171,369。
背景
本発明は、一般には、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤の細胞内デリバリーのための、より詳細には、ポリマーミセルを用いたかかる薬剤の細胞内デリバリーのための組成物および方法に関する。
ポリマーミセルは、細胞に治療薬をデリバーするために当該技術分野で公知である。PCT特許出願WO 2008/153940 (Hirt et al.) は、両親媒性セグメント化（segmented）共重合体から調製された小胞を開示する。Kataoka et al. (2005) (“Smart polymeric micelles as nanocarriers for oligosaccharides and siRNA delivery”, Oxford University Press - Nucleic Acids Symposium Series, No. 49, pp. 17-18) は、ポリイオン複合体を伴う種々のアプローチを開示する。PCT出願WO 2008/004978 (Yang et al.) は、低分子治療薬のデリバリーのために適合させた同種性ミセルを開示する。U.S.特許出願公報No. 2005/0070721 (Bae et al.) は、疎水性低分子治療薬のデリバリーのために適合させた異種性キャリアを開示する。U.S.特許No. 6,210,717 (Choi et al.) は、核酸を真核細胞へ輸送するためのポリカチオン-b-ポリエステルおよびポリサッカリド結合ポリエステルを含む異種性キャリアを開示する。PCT特許出願WO 2009/004978 (Torchilin et al.) は、ポリヌクレオチドをデリバーするためのコレステロール結合低分子干渉リボ核酸 (siRNA) およびポリエチレングリコール結合ホスファチジルエタノールアミンを含む異種性キャリアを開示する。
ミセルを用いて生体分子薬剤をデリバーするための公知のアプローチは、種々の欠点を有する。
一般に、たとえば、多くのかかるアプローチは、所望の機能性について、とりわけ、細胞内デリバリーの達成について、ポリヌクレオチドなどの特定クラスの生体分子薬剤のデリバリーについて、および/または対象の特定細胞への標的デリバリーの達成について、不足しているか、または不十分である。たとえば、検討されていない種々の公知のシステムは、薬剤がエンドサイトーシスにより細胞に入った後、エンドソームから細胞質への薬剤の放出に対して効果がないか、または他の欠陥を有する。また、公知のシステムは、ポリヌクレオチドをデリバーするために重要なある種の特徴、たとえば、潜在的な毒性および酵素による分解を回避し、かつ強固なミセルの安定性を維持しながら、ポリヌクレオチドのミセルへの十分な結合を提供することについて不足しているか、または不十分である。非限定的な例として、幾つかの公知のアプローチには、負電荷のポリ核酸のイオン結合に対するポリカチオンの機能性が含まれるが；不十分に遮蔽されている場合、ポリカチオンは、インビボで毒性に対する懸念を引き起こすことができる（たとえば、血漿タンパク質または循環細胞との非特異的な相互作用により媒介される毒性）。公知のアプローチは、ミセルのコアに、イオン結合によりポリヌクレオチドを組み込んでいるが、かかるアプローチは、ミセルの安定性に強い影響を与えることができる。種々の公知のシステムは、(たとえば、レセプター媒介性エンドサイトーシスによる)特異的な方向性をもった細胞の取込みに対するターゲティングアプローチを想定しているが、これらのシステムは、他の必要な機能性を低下させることなく、かかる機能性をミセルに統合するのに効果的でなかった。
更に、種々の公知のアプローチは、一般に、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤の効果的な細胞内デリバリーのために必要な複合的で複雑な機能的特徴を組み込むのに十分に強固でない。たとえば、多くの公知のキャリアシステムは、天然に存在する部分、たとえば、脂質もしくはリン脂質(たとえば、ホスファチジルエタノールアミン)、ペプチドポリマー(たとえば、ポリヒスチジン)、またはポリサッカリドから形成され、これらは、典型的には、十分に保護されていないと生物学的分解を受けやすいか、あるいは、単純なホモポリマー(たとえば、ポリ酢酸などのポリエステル)から形成され、これらは、複合的な機能的特徴を組み込むため、かかる特徴を向上させる最適化のため、またはかかる特徴を対象の特定の適用に合わせる調整のため、少数のデザインのバリエーションしか提供しない。
更なる欠点として、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤の細胞内デリバリーのための公知のシステムは、容易に製造可能でない。複合的な機能的特徴を組み込むデリバリー輸送手段を得るための努力は、複雑で化学的に困難な合成により妨害され、たとえば、複数方向の化学的結合を伴い、これは、より大規模な生産で実現することが特に困難となり得る。
このため、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤の細胞内デリバリーのための改良された組成物および方法について、とりわけ、ポリマーミセルを用いたかかる薬剤の改良された細胞内デリバリーについて、当該技術分野に実体的な要求が残っている。
本発明は、より完全に以下で列挙される種々の側面において、異種性（heterogeneous）ポリマーミセル、異種性ポリマーミセルを含む組成物、かかるミセルおよびかかる組成物を調製するための方法、およびかかるミセルおよびかかる組成物を使用するための種々の方法を提供する。より詳細には、本発明の好ましい側面は、異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合した薬剤を含む組成物に関する。薬剤は、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤とすることができる。薬剤は、好ましくは、治療用薬剤、診断用薬剤、またはリサーチ用薬剤とすることができる。かかる組成物は、異種性ポリマーミセル、当該ミセルと結合した薬剤、および一または複数の薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物とすることができる。
かかる組成物は、好ましくは、真核細胞、たとえば、哺乳類(たとえばヒト)細胞への薬剤の細胞内デリバリーのために効果的である（およびそのための方法で使用することができる）。かかる組成物は、好ましくは、細胞内ターゲット（たとえば、細胞内で低分子干渉リボ核酸(siRNA)などのポリヌクレオチド薬剤と相互作用することができる、細胞の遺伝子発現に関与するターゲット）の活性を調節するために効果的である（およびそのための方法で使用することができる）。細胞内デリバリーのため、および/または細胞内ターゲットの活性を調節するために効果的な組成物は、複合的な機能的特徴または属性を必要とし、たとえば、(たとえば、細胞内デリバリーのためのエンドソームから細胞質へ薬剤を放出するための)膜不安定化活性、(たとえば、イオン結合または共有結合による)ポリヌクレオチドなどの薬剤を結合させるための能力、および他の機能性、たとえば遮蔽、ターゲティング、安定性の向上、架橋結合、調合物の向上が含まれ、これらのそれぞれが、本明細書で更に説明される。
異種性ポリマーミセルは、異種性(混合)ミセル集合体へと形成される個々に調製される別個の構成ポリマーの組合せにより、かかる種々の所望の機能的属性および特徴に有利に影響を及ぼすことができる。
一般に、異種性ポリマーミセルは、２つ以上の組成的に異なるポリマー、たとえば第１ポリマーおよび第１ポリマーとは組成的に異なる第２ポリマーなどを含む。第１または第２ポリマーの少なくとも一つ、好ましくは第１および第２ポリマーの各々が、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。異種性ミセルの一つのポリマーのみ(たとえば、第１ポリマー)が、ブロック共重合体である場合、もう一方のポリマー(たとえば、第２ポリマー)は、好ましくは疎水性ポリマー、たとえば疎水性ホモポリマーまたは疎水性ランダム共重合体である。各々の場合、異種性ミセルは、疎水性第２ポリマー(たとえばそのブロック)と疎水的相互作用により結合した、(たとえば第１)ブロック共重合体の疎水性ブロックを含むことができる。好ましくは、ミセルは、水性媒体（mediuim）において、生理学的に関連したpH(たとえばpH 7.4)で安定である。幾つかの態様において、異種性ポリマーミセルは、一または複数の追加の組成的に異なるポリマー、たとえば、第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々とは組成的に異なる第３ポリマーを含む。一般に、(たとえば、第１ポリマーおよび/または第２ポリマーの)ブロック共重合体の各ブロックは、ホモポリマーまたはランダム共重合体であり得、各々の場合、直鎖または非直鎖(たとえば分枝)であり、各々の場合、架橋結合しているかまたは架橋結合しておらず、一般に、(たとえば、制御されたリビングラジカル重合アプローチを用いた)重合可能なモノマーの重合に由来する一または複数のモノマー残基を含むことができる。
よって、本発明の異種性ポリマーミセルは、組成の多様性、アーキテクチャーの多様性および超分子の多様性など、潜在的な多様性に非常に富んでいる。非常に広範な市販の重合可能なモノマーを考慮すると、第１および第２ポリマーの各々（一または複数のブロックを含む）は、膨大な種類の化学組成を有することができ−これに対応して多種類の化学的特性または特徴、たとえば、相対的な疎水性または親水性、相対的なイオン性 (たとえば、陰イオン性、陽イオン性、中性(非荷電)、両性イオン性)、反応性官能基の有無 (たとえば、結合可能な部分)、環境感受特性の有無 (たとえば、熱感受性、pH感受性、化学的感受性、電磁的感受性)、および関連するまたは派生する物理的特性、たとえば、とりわけ溶解度、密度、粘度、熱安定性を有することができる。
また、異種性ポリマーミセルは、実質的なアーキテクチャーの多様性を提供し、これは、かかる組成の多様性を提供し、かかる組成の多様性と相乗的である。第１および第２の組成的に異なるポリマーは、それぞれ、種々の数のブロック (たとえば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上のブロック) および種々の全ポリマー長または分子量を含むマルチブロック共重合体とすることができ、各ポリマーは、相対的なブロック長または分子量、相対的なブロック(たとえば、特別な化学的特性または特徴を備えたブロック)の配置、および相対的なブロックの構造(たとえば、直鎖、分枝鎖、または巻きついている（involving）ブラシ、スター、または他のアーキテクチャー)において、独立に選択されたバリエーションを有することができる。
意義深いことに、かかるアーキテクチャーおよび基本的な組成の多様性の価値は、異種性ポリマーミセルにより実現され単独で有利である超分子の多様性によって、更に高まる。広範囲の超分子の構造および特性は、とりわけ複合的で並列的な機能性を必要とする複雑なシステムのために、組成的に異なるポリマーを用いて達成することができる。たとえば、組成物の特定の第１の(セットの)所望の属性は、第１ポリマーにより付与することができ、一方、組成物の異なる第２の（セットの）所望の属性は、組成的に異なる別の第２ポリマーにより提供することができ、必要な場合、組成物の更に異なる追加の（セットの）所望の属性は、組成的に異なる更なる第３ポリマーなどにより提供することができる。このため、異種性ポリマーミセルの超分子デザインは、デザイン選択の更なる独立した自由を含み、これは、たとえば、全集合数、相対的な集合数 (たとえば、異種性ミセルとともに含まれる第１、第２、第３などの組成的に異なるポリマーの各タイプの比)、粒子サイズ、溶解度(たとえば、水溶性溶解度)、安定性、調合可能性(formulatability)、生体適合性、デリバーされる薬剤との結合の性質および程度、および所望の機能的特性の相対的なバランスまたは超分子構造内のある種の機能的特性の物理的な位置もしくは配向に関して、超分子構造の選択および最適化のために適用することができる。
有利なことに、本発明は、異種性ポリマーミセルにより、薬剤、とりわけポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤の細胞内デリバリーのためのシステムに与えられる、組成、アーキテクチャーおよび超分子のデザインの柔軟性および制御を適用する。たとえば、異種性ポリマーミセルまたはかかるポリマーのある種のブロックは、膜不安定化ポリマー、たとえば環境感受性 (たとえばpH感受性) 膜不安定化ポリマーを含むことができ、これは、エンドサイトーシスの後に、エンドソーム膜から細胞内細胞質へ薬剤を放出させることができる。
異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、ポリヌクレオチドなどの薬剤を結合することができる。たとえば、ポリヌクレオチドまたは他の薬剤は、構成ポリマーの一または複数とイオン相互作用により、および/または構成ポリマーの一または複数に共有結合により、結合することができる。共有結合は、たとえば、結合可能な種 (すなわち反応性官能基部分) を有するモノマー残基により達成することができる。あるいは、親水性であるポリヌクレオチドなどの幾つかの薬剤は、ポリマーの一つの一端に共有結合により結合させることができ、これにより、かかる薬剤(たとえばポリヌクレオチド)は、本質的に末端結合ポリマーの親水性ブロックの構成要素となって機能することができる。
更に、異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、種々の遮蔽 (たとえば、調整、緩和または保護) 属性を提供することができる。たとえば、遮蔽は、代謝 (たとえば、酵素消化) に対する安定性を向上させるため、潜在的な毒性を媒介するため、薬物動態を向上させるため、所望の生体分布を向上させるためなど、立体遮蔽に効果的な種または部分を組込むことにより行うことができ；かかる遮蔽の機能性は、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤のデリバリーにとって実質的に重要であり得る。
異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、ターゲティング機能性を提供することができ、これにより、たとえば、ポリヌクレオチドなどの薬剤は、たとえば一または複数のターゲティング部分、種々の特異性を有する部分、たとえばポリサッカリドまたはオリゴサッカリドまたは特異的なターゲティングリガンドの共有結合により、対象の特定細胞タイプに特異的に向かうことができ、レセプター媒介性エンドサイトーシスに効果的である。
重要なことに、異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、ミセルの安定性、または他の重要なミセルのパラメーターまたは特性をもたらし維持するのに寄与することができる。たとえば、異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、ミセル自体の特性または属性のための機能性を有することができ、たとえば、とりわけ安定サイズ、形状、集合数、ミセル内の空間的考慮事項、ミセル内の立体的考慮事項などである。
異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、ほとんどまたはまったく機能性を有していない希釈(diluent)ポリマーとすることができる。
異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、架橋ポリマーまたはポリマーブロックとすることができ、これにより、異種性ミセルの構成ポリマーの幾つかまたは全ての共有結合が効果的に可能である。異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、(たとえば、他の同時投与される薬剤とともに、または特定の適用または環境のために)異種性ポリマーミセルの生体適合性を向上させるための機能性を有することができる。
異種性ポリマーミセルの構成ポリマーの一または複数、またはかかるポリマーのある種のブロックは、異種性ポリマーミセルおよび結合した薬剤 (たとえばポリヌクレオチド) を含む組成物を、たとえば、薬学的組成物または医薬 (たとえば治療用)、診断組成物 (たとえば診断用) またはリサーチ試薬組成物 (たとえばリサーチ用試薬として使用) に調合するための機能性を有する調合促進ポリマー(formulation-enhancing polymer)とすることができる。
有利なことに、異種性ポリマーミセルは、多機能性およびそれに関連した潜在的な固有の複雑性にもかかわらず、容易に製造可能である。このことは、必要な機能的属性が２つ以上の異なるポリマーに別々にもたらされるため、比較的複雑なシステムに対しても実現することができ、これにより、各々の単一の構成ポリマーの直接的で複雑でない製造が可能である。２つ以上の組成的に異なるポリマーの各々は、周知の重合プロセスを用いて独立に（たとえば大規模で）調製することができる。更に、本明細書で記載されるとおり、構成ポリマーからの異種性ポリマーミセルの形成は、本明細書に記載のプロトコールに基づいて容易に達成することができる。
したがって、本発明が、とりわけ、複合的な所望の機能的特徴を組み込むため、かかる特徴を向上させる最適化のため、またはかかる特徴を対象の特定の適用に合わせる調整のために、従来の公知のアプローチの多くの欠点を解消することを認識することができる。
本発明は、以下の段落においてより詳細に要約され、明細書の全体にわたって更に詳細に説明される。
したがって、第１の側面において、本発明は、異種性ポリマーミセルに関する。異種性ポリマーミセルは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマー、および第１ポリマーとは組成的に異なる第２ポリマーを含むことができる。第２ポリマーは、疎水性ポリマーとすることができるか、あるいは疎水性ブロックを含むブロック共重合体とすることができる。疎水性第２ポリマーまたは第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合することができる。好ましくは、第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。好ましくは、ミセルは、pH 7.4の水性媒体中で安定である。
本発明の第１の側面の第１の一般的態様において、第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つは、pH-依存性膜不安定化ポリマーであるか、または（たとえば、その構成ブロックとして）pH-依存性膜不安定化ポリマーを含む。
本発明の第１の側面の第２の一般的態様において、第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体であり、第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つの疎水性ブロックは、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含む。
本発明の第１の側面の第３の一般的態様において、異種性ポリマーミセルは、本発明の第３の側面の方法により調製される。
第２の側面において、本発明は、異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合した薬剤を含む組成物に関する。薬剤は、生体分子薬剤、たとえばポリヌクレオチドとすることができる。薬剤は、好ましくは、治療用薬剤、診断用薬剤およびリサーチ用試薬から選択することができる。一般に、異種性ポリマーミセルは、異種性ポリマーミセルは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマー、および第１ポリマーとは組成的に異なる第２ポリマーを含むことができる。第２ポリマーは、疎水性ポリマーとすることができるか、あるいは疎水性ブロックを含むブロック共重合体とすることができる。疎水性第２ポリマーまたは第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合することができる。好ましくは、第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。好ましくは、ミセルは、pH 7.4の水性媒体中で安定である。
本発明の第２の側面の第１の一般的態様において、第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つは、pH-依存性膜不安定化ポリマーであるか、または（たとえば、その構成ブロックとして）pH-依存性膜不安定化ポリマーを含む。好ましくは、薬剤はポリヌクレオチドである。好ましくは、第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。好ましくは、第１ポリマーの疎水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックは、それぞれ複数の疎水性モノマー残基を含む。
本発明の第２の側面の第２の一般的態様において、第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体であり、第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つの疎水性ブロックは、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含む。好ましくは、薬剤はポリヌクレオチドである。
本発明の第２の側面の第３の一般的態様において、組成物は、異種性ポリマーミセルおよび(非共有結合の)イオン相互作用により当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む。第１ポリマーの親水性ブロックは、ポリヌクレオチドとイオン結合して複数の陽イオン性モノマー残基を含む。第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。第１ポリマーの(i)親水性ブロックもしくは(ii)疎水性ブロック、または第２ポリマーの(iii)親水性ブロックもしくは(iv)疎水性ブロックの少なくとも一つのブロックは、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体ブロックである。好ましくは、かかるブロック(i)、(ii)、(iii)または(iv)の２つ以上、３つ以上、または各々は、ランダム共重合体である。好ましくは、第２ポリマーの親水性ブロックは、複数の中性 (非荷電) 親水性モノマー残基を含む。好ましくは、第１ポリマーの疎水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックは、それぞれ複数の疎水性モノマー残基を含む。
本発明の第２の側面の第４の一般的態様において、組成物は、異種性ポリマーミセルおよび第１ポリマーとの共有結合により当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む。(たとえば、ポリヌクレオチドが(i)第１ポリマーの疎水性ブロックまたは(ii)第１ポリマーの親水性ブロックに末端結合することを伴う配向により)ポリヌクレオチドが、(i)親水性ブロックであるかまたは(ii)第１ポリマーの親水性ブロックの構成部分であるように、ポリヌクレオチドは第１ポリマーに結合する。好ましくは、第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。好ましくは、第１ポリマーの疎水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックは、それぞれ複数の疎水性モノマー残基を含む。
本発明の第２の側面の第５の一般的態様において、組成物は、異種性ポリマーミセルおよび第１ポリマーとの共有結合により当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、第１ポリマーに結合して、ポリマーバイオ結合体を形成する。第１ポリマーの親水性ブロックは、連結部分を介してポリヌクレオチドに結合した(たとえば、結合種を有する)一または複数のモノマー残基を含む。一または複数のモノマー残基は、連結部分を介してポリヌクレオチドに結合した(たとえば、モノマー残基のペンダント部分として)結合種を有することができる。好ましくは、複数のポリヌクレオチドは、対応する複数のモノマー残基を介して第１ポリマーに共有結合する。好ましくは、第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。好ましくは、第１ポリマーの疎水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックは、それぞれ複数の疎水性モノマー残基を含む。
第３の側面において、本発明は、異種性ポリマーミセルを調製するための方法に関する。本発明は、好ましくは、その一般的態様の全ておよびその従属態様の全てを含む本発明の第１の側面の異種性ポリマーミセルを調製するための方法に関する。
第４の側面において、本発明は、異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合した薬剤を含む組成物を調製するための方法に関する。薬剤は、生体分子薬剤、たとえばポリヌクレオチドとすることができる。薬剤は、好ましくは、治療用薬剤、診断用薬剤およびリサーチ用試薬から選択することができる。かかる発明は、好ましくは、その一般的態様の全ておよびその従属態様の全てを含む本発明の第２の側面の組成物を調製するための方法に関する。
第５の側面において、本発明は、医薬の製造における異種性ポリマーミセルの使用に関する。かかる発明は、好ましくは、その一般的態様の全ておよびその従属態様の全てを含む本発明の第１の側面の異種性ポリマーミセルの使用に関する。
第６の側面において、本発明は、医薬の製造における、異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合した薬剤を含む組成物の使用に関する。薬剤は、生体分子薬剤、たとえばポリヌクレオチドとすることができる。薬剤は、好ましくは、治療用薬剤、診断用薬剤およびリサーチ用試薬から選択することができる。かかる発明は、好ましくは、その一般的態様の全ておよびその従属態様の全てを含む本発明の第２の側面の組成物を含む医薬の製造に関する。
第７の側面において、本発明は、薬剤の細胞内デリバリーのための方法に関する。薬剤は、生体分子薬剤、たとえばポリヌクレオチドとすることができる。薬剤は、好ましくは、治療用薬剤、診断用薬剤およびリサーチ用試薬から選択することができる。かかる発明は、好ましくは、その一般的態様の全ておよびその従属態様の全てを含む本発明の第２の側面の組成物の使用を伴う方法に関する。
第８の側面において、本発明は、細胞において細胞内ターゲットの活性を調節するための方法に関する。かかる発明は、好ましくは、その一般的態様の全ておよびその従属態様の全てを含む本発明の第２の側面の組成物の使用を伴う方法に関する。
一般的な好ましいものとして、各々の一般的態様を含む本発明の第１の側面、第２の側面、第３の側面、第４の側面、第５の側面、第６の側面、第７の側面および第８の側面のそれぞれについて、種々の発明は、以下から独立に選択される一または複数の特徴を更に含むことができる：
(a) 第１ポリマーの疎水性ブロック、並びに任意におよび好ましくは第２ポリマーの疎水性ブロックは、pH-依存性膜不安定化ポリマーとすることができる；
(b) 第１ポリマーの疎水性ブロック、並びに任意におよび好ましくは第２ポリマーの疎水性ブロックは、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含むことができ(任意に、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含むことができる)；
(c) 第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つ(または両方)の親水性ブロックは、複数の中性親水性モノマー残基を含むことができる；
(d) 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々は、重合可能なモノマーに由来するモノマー残基 (好ましくは、エチレン(ethlenically)不飽和の重合可能なモノマー (たとえば、アクリルモノマーまたはビニルモノマー))を含む；
(e) 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々は、非ペプチド性ポリマーである；
(f) 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々は、非脂質性である；
(g) 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々は、非サッカリドポリマーである；
(h) 第１ポリマーは、第２ポリマーに共有結合により架橋結合し、これによりポリマーミセルは、架橋されたポリマーミセルである；
(i) 第２ポリマーの親水性ブロックは、第１ポリマーの親水性ブロックとは組成的に異なる；
(j) 第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと実質的に同じ組成を有する；
(k) 薬剤はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドは、好ましくは干渉性RNAである；
(l) 異種性ポリマーミセルは、遮蔽部分を更に含む；および/または
(m) 異種性ポリマーミセルは、ターゲティング部分を更に含む。
本発明は、本明細書で提供される教示に基づいて当業者に認識されるように、種々の態様において、他の側面にも関する。
その一般的および好ましい態様を含む本発明の種々の側面の各々を規定する特徴を含む本発明の種々の特徴は、本発明の他の特徴と種々に組み合わせたり置換したりして使用することができる。特徴および利点は、本明細書で説明され、以下の詳細な説明から明らかになるでしょう。
図１Ａ〜１Ｃは、２つ以上の組成的に異なるブロック共重合体P1, P2… Pnから形成される異種性ポリマーミセルを描く略図(図１Ａ)、かかるブロック共重合体の化学的組成またはアーキテクチャー構造の違いを有する種々の態様を含む略図(図１Ｂ)、かかる異種性ミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドを含む組成物を描く略図(図１Ｃ)である。 図１Ｄは、かかる組成物に遮蔽機能性を組込むための種々のアプローチを伴う態様を含む略図(図１Ｄ)である。 図１Ｅは、かかる組成物にターゲティング機能性を組込むための種々のアプローチを伴う態様を含む略図(図１Ｅ)である。 図１Ｆは、遮蔽および/またはターゲティング機能性の統合のための好ましいアプローチを含む、かかる組成物のための好ましいアプローチを伴う態様を含む略図(図１Ｆ)である 図２は、リビングラジカル重合 (たとえば、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合) を用いて、ポリ(PEGMA)マクロCTAおよびDMAEMA、PAAおよびBMAモノマーから、ブロック共重合体 [PEGMA]-[DMAEMA / PAA / BMA]を調製するための反応スキームの略図である。 図３Ａ〜３Ｃは、ポリマー4.8、代表的な[PEGMA]-[DMAEMA / PAA / BMA]ブロック共重合体の特徴および特性を要約するデータを示し、これらは、第１ブロック [PEGMA] および第２ブロック [DMAEMA / PAA / BMA] についての数平均分子量Mnおよび多分散性指数 (PDI)、並びに第２ブロックのモノマー残基の相対的な組成を報告する表 (図３Ａ)、かかるポリマーについての1H NMRデータ (図３Ｂ)、並びに屈折率(RI)および光散乱(LS)検出器からのトレースを含む、かかるポリマーについてのゲル透過クロマトグラフィー(GPC)データ (図３Ｃ) を含む。 図４は、ブロック共重合体のアルファ端に結合した（たとえばターゲティング部分としての）ガラクトースを有するブロック共重合体を調製するためのリビングラジカル (RAFT) 重合に適した、アセチルで保護されたPEG化ガラクトース-[DMAEMA] マクロ-CTAを表す式である。 図５は、MAA(NHS)由来のモノマー残基またはMAA(NHS)を有するブロック共重合体と (アセチルで保護された、PEG化) アミン官能化ガラクトースとの反応により、(アセチルで保護された、PEG化)ガラクトース官能化ブロック共重合体を調製するための反応スキームの略図であり、これにより、かかるブロック共重合体は、そのモノマー残基に垂れ下がって結合した(たとえばターゲティング部分としての) (アセチルで保護された、PEG化)ガラクトースを含む。 図６Ａ〜６Ｃは、5’-アミノ-ジスルフィド修飾ポリヌクレオチド (図６Ａ) およびチオール化(thiolated)ポリヌクレオチド (図６Ｂ) を含む、NHS-含有ポリマーに結合可能な5’-修飾ポリヌクレオチド (たとえばsiRNA) を表す式、並びに2-エチルアミノ-ピリジルジスルフィドの構造を表す式である。 図７Ａおよび７Ｂは、組成的に異なる親水性ブロック（第１ポリマーはDMAEMA親水性ブロックを有し、第２ポリマーはPEGMA親水性ブロックを有する）および実質的に同じ疎水性ブロックを有するブロック共重合体を含む異種性ミセルM.4の1H NMR分析を示すグラフであり、これらは、有機溶媒CDCL3 (図７Ａ) および水性溶媒ジューテロ化リン酸緩衝液pH 7.4 (図７Ｂ) におけるNMRスペクトルを含む。 図８Ａおよび８Ｂは、２つの異種性ポリマーミセルについての、動的光散乱(DLS)による粒子サイズの決定に由来するデータを示すグラフであり、これらは、組成的に異なる親水性ブロック（第１ポリマーはDMAEMA親水性ブロックを有し、第２ポリマーはPEGMA親水性ブロックを有する）および実質的に同じ疎水性ブロックを有するブロック共重合体を含むミセルM.1 (図８Ａ)、並びに独立に、実質的に同じ親水性ブロックおよび組成的に異なる疎水性ブロック（第１ポリマーは[BMA / PAA / DMAEMA]疎水性ブロックを有し、第２ポリマーはBMA 疎水性ブロックを有する）を有するブロック共重合体を含むミセルM.2 (図８Ｂ) を含む。 図９は、DMAEMA親水性ブロックを有する単一のブロック共重合体4.6から本質的に構成される同種性ミセル、PEGMA親水性ブロック(およびポリマー4.6と実質的に同じ疎水性ブロック)を有する単一のブロック共重合体4.7から本質的に構成される別の同種性ミセル、並びにポリマー4.6およびポリマー4.7の様々な相対的な比を用いて形成された種々の異種性ミセル：M3.1 (95% / 5%)、M3.2 (90% / 10%)、M3.3 (80% / 20%)、M3.4 (50 % / 50%)、およびM3.5 (25% / 75%) についての、相対的な毒性およびポリヌクレオチド結合特性を要約する表である。 図１０は、単一のブロック共重合体4.1から本質的に構成される同種性ポリマーミセル (図１０でポリマー“P7-2”と称される)、並びに独立に、1:1の比のポリマー4.1およびポリマー4.2（組成的に異なる親水性ブロック（第１ポリマーはDMAEMA親水性ブロックを有し、第２ポリマーはPEGMA 親水性ブロックを有する）および実質的に同じ疎水性ブロックを有するブロック共重合体）を含む異種性ポリマーミセルM.4 (“MM 50/50”と称される) を、マウスに注入したことにより得られる組織選択的インビボ生体分布を示すグラフである。 図１１Ａおよび１１Ｂは、同種性および異種性ミセルと結合したsiRNAを含む組成物について、(未処理のHeLa細胞におけるGAPDHの発現に対して標準化して報告された) HeLa細胞におけるGAPDHの発現についてのノックダウン活性を示すグラフであり、同種性および異種性ミセルは、DMAEMA親水性ブロックを有する単一のブロック共重合体4.1から本質的に構成される同種性ミセル (図１１Ａおよび１１Ｂで“P7-2”と称される)、PEGMA親水性ブロックを有する単一のブロック共重合体4.8から本質的に構成される別の同種性ミセル (図１１Ａおよび１１Ｂで“PEGMA 100”と称される)、並びに様々な相対的な比のポリマー4.1およびポリマー4.8を用いて形成された異種性ポリマー混合ミセルM.5.1およびM.5.2 (図１１Ａおよび１１Ｂでそれぞれ、“MM 50/50”および“MM 25/75”と称される) を含む。
図面の種々の側面は、発明の詳細な説明とともに、以下において更に詳細に説明される。
発明の詳細な説明
本発明の種々の側面は、２以上の組成的に異なるポリマーを含む異種性ポリマーミセルに関する。本発明の好ましい側面は、異種性ポリマーミセルおよび該ミセルと結合した薬剤に向けられる。前記薬剤は、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤（biomolecular agent）であり得る。前記薬剤は、好ましくは、治療用薬剤、診断用薬剤、またはリサーチ用試薬であり得る。
発明の概要に記載したように、および以下の発明の詳細な説明により詳細に記載するように、本発明の異種性ポリマーミセルは、組成の多様性、アーキテクチャー（architectural）の多様性および超分子の多様性を含む実質的な多様性を有する。本発明は、異種性ポリマーミセルを介して得られる組成、アーキテクチャーおよび超分子の設計の融通性ならびに制御を、薬剤、特にポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤を細胞内デリバリーするためのシステムに適用する。重大なことに、このアプローチは、複数の望ましい特性および機能的特徴を細胞内デリバリーシステムに組み込むことを可能にする。
例えば、第１ポリマーもしくは第２ポリマーなどの異種性ポリマーミセルの１以上のポリマー、またはかかるポリマーのある種のブロックは、環境感受性（例えば、ｐＨ感受性）の膜不安定化ポリマーなどの膜不安定化ポリマーを含むことができ、それにより生じるエンドサイトーシスは、エンドソーム膜から細胞内の細胞質へと薬剤を放出する効果をもたらし得る。異種性ポリマーミセルを構成する１以上のポリマーまたはかかるポリマーのある種のブロックは、構成要素である１以上のポリマーとのイオン性相互作用を介して、および／または構成要素である１以上のポリマーとの共有結合性の結合を介して、ポリヌクレオチドなどの薬剤と結合することができる。さらに、異種性ポリマーミセルを構成する１以上のポリマーまたはかかるポリマーのある種のブロックは、種々の順列および組み合わせにおいてさらなる種々の望ましい機能的特性または特徴を提供することができ、非限定的な例としては以下のものが挙げられる：遮蔽（例えば、立体的な目的、薬剤の安定性の向上、潜在的な毒性の調節、薬物動態の向上、望ましい体内分布の向上のための、機能の調節、緩和または保護）；ターゲティング機能（例えば、ポリヌクレオチドなどの薬剤を、興味のある特定の細胞種に特異的に向けることを可能にする）；ミセルの安定性、または他の重要なミセルのパラメータもしくは性質の向上もしくは維持；架橋の特性（いくつかのまたは実質的にそれぞれの異種ミセルを構成するポリマーの共有結合を可能にする）；異種性ポリマーミセルの生体適合性の向上（例えば、他の同時投与される薬剤との適合性、または特別な適用もしくは環境に対する適合性）；組成物の調合；または希釈ポリマー（diluent polymer）。
さらに、異種性ポリマーミセルは、最適化によりかかる属性および特徴を向上させることが可能な設計の融通性を提供する。かかる設計の融通性により、かかる属性および特徴を興味のある特定の適用に対して調整し、または適合させることも可能である。重大なことに、かかる異種性ポリマーミセルは、別々の、それぞれ単独で調製された構成要素であるポリマーの組み合わせを集合させて、異種性のミセル集合体を形成することにより、多機能性の特性および特徴を達成することができる。結果として、構成要素である各ポリマーは、より簡単な合成法により、より直接的に調製することができるため（例えば、可能な場合、同じ範囲の特性および特徴を単一の構成要素であるポリマーに導入する同種ミセルと比較して）、一般的に製造性が向上する。
異種性ポリマーミセル−一般構造
図１Ａを参照すると、異種性ポリマーミセルは、第１ポリマーＰ１および第１ポリマーＰ１とは組成的に異なる第２ポリマーＰ２を含む、２以上の組成的に異なるポリマーを含む。異種性ミセルは、任意に、第３ポリマー、第４ポリマー、第５ポリマー、第６ポリマー、第７ポリマー、またはさらなる付加的なポリマー（無限に、一般的にＰｎと表される）などの１以上のさらなる組成的に異なるポリマーを含み、各付加的なポリマーは、第１ポリマーおよび第２ポリマーとは組成的に異なり、また、相互に組成的に異なる。それ故、いくつかの態様において、組成的に異なるポリマーＰ１、Ｐ２、・・・Ｐｎの数は、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上とすることができ、一般的に２〜約２０、好ましくは約２〜約１０、好ましくは２〜７とすることができ、あるいは、一般的に３〜約２０、好ましくは約３〜約１０、好ましくは３〜７とすることができる。
第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも１つ、および好ましくは第１ポリマーおよび第２ポリマーのそれぞれは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。（図１Ａ〜１Ｆに示すように、親水性ブロックは一般的に、不規則な波状の線分「〜〜〜〜」で表される一方、疎水性ブロックは一般的に、直線線分「−−−−」で表される。異種性ミセルの１つのポリマーのみ（例えば、第１ポリマー）がブロック共重合体である場合、好ましくは、疎水性ホモポリマーまたは疎水性ランダム共重合体などの疎水性ポリマーである。各場合において、異種性ミセルは、疎水性相互作用を介して疎水性第２ポリマー（例えば、第２ポリマーの疎水性ブロック）と結合した（例えば第１の）ブロック共重合体の疎水性ブロックを含むことができる。一般的に、ブロック共重合体の各ブロック（例えば、第１ポリマーのブロック、第２ポリマーのブロック等）は、ホモポリマーまたはランダム共重合体であり得る。各場合において、ブロック共重合体のブロックは、直鎖状または非直鎖状（例えば、分枝鎖状）であり得る。各場合において、ブロック共重合体のブロックは、架橋していても架橋していなくてもよい。架橋している場合、第１ポリマーおよび第２ポリマーは、好ましくは、各疎水性ブロックに含まれるモノマー残基（例えば、架橋結合可能な官能基を有する）を介して架橋する。各場合において、ブロックまたはブロック共重合体は、（例えば、制御されたリビング（living）ラジカル重合アプローチを用いる）重合可能なモノマーの重合に由来する１以上のモノマー残基を含む。
異種性ポリマーミセルを構成するブロック共重合体は、ジブロック共重合体またはより高次のブロック共重合体であり得る。例えば、各構成要素であるブロック共重合体は、独立して、２以上のブロック、または３以上のブロック、または４以上のブロック、または５以上のブロックを含むマルチブロック共重合体から選択することができる。いくつかの態様において、第１の構成要素であるブロックポリマーは、第２の構成要素であるブロック共重合体と異なる数のブロックを有することができる。例えば、第１ポリマーはトリブロック共重合体であってもよく、第２ポリマーは、ジブロック共重合体またはテトラブロック共重合体であってもよく、逆もまた同じである。各場合において、異種性ポリマーミセルの構成要素である少なくとも２つのブロック共重合体および好ましくは構成要素である各ブロック共重合体は、少なくとも１つの親水性ブロックおよび少なくとも１つの疎水性ブロックを含むことができる。
一般的に、組成的に異なるポリマー（例えば、第１ポリマーとは組成的に異なる第２ポリマー）は、重合プロセスにより生じる多分散性における違いとは別に、同定可能な組成上の違いを有する。
一般的に、組成的に異なる（例えば第２の）ポリマーは、他の（例えば第１の）ポリマーのモノマー残基とは異なる（化学的組成において異なる）１以上のモノマー残基を含むことができる。あるいは、組成的に異なるポリマー（例えば、第１ポリマーおよび第２ポリマー）は、２以上の同じ種のモノマー残基（同じ化学的組成を有する残基）を含むことができるが、ポリマー間で比較した場合に、かかる２以上の残基の相対的な比が異なる。図１Ｂを参照すると、異種性ポリマーミセルＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６は、それぞれが親水性ブロック（一般的に、ＡまたはＡ’と表される）および疎水性ブロック（一般的に、ＢまたはＢ’と表される）を有する第１ポリマーＰ１および第２ポリマーＰ２を、それぞれ含むことができる。ミセルＭ１に対する例として示したように、第２ポリマーの親水性ブロックＡ’は、第１ポリマーの親水性ブロックＡとは組成的に異なっていてもよい。あるいは、ミセルＭ２に対する例として示したように、第２ポリマーの疎水性ブロックＢ’は、第１ポリマーの疎水性ブロックＢとは組成的に異なっていてもよい。いくつかの態様（例えば、ミセルＭ１）において、第２ポリマーの親水性ブロックＡ’は、第１ポリマーの親水性ブロックＡとは組成的に異なり、第２ポリマーの疎水性ブロックＢは、第１ポリマーの疎水性ブロックＢと実質的に同じ組成を有する。いくつかの態様（例えば、ミセルＭ２）において、第２ポリマーの親水性ブロックＡは、第１ポリマーの親水性ブロックＡと実質的に同じ組成を有し、第２ポリマーの疎水性ブロックＢ’は、第１ポリマーの疎水性ブロックＢとは組成的に異なる。代替の態様（例えば、ミセルＭ３）において、第２ポリマーの親水性ブロックＡ’は、第１ポリマーの親水性ブロックＡとは組成的に異なり、第２ポリマーの疎水性ブロックＢ’は、第１ポリマーの疎水性ブロックＢとは組成的に異なる。
一般的に、組成的に異なる（例えば、第２の）ポリマーは、他の（例えば、第１の）ポリマーのポリマーアーキテクチャー（architecture）とは異なるポリマーアーキテクチャーを有することができる。例えば、第１および第２のブロック共重合体は、それぞれ、他の共重合体の対応するブロックに対して変化した分子量のブロックを有することができる。図１Ｂをさらに参照すると、異種性ポリマーミセルＭ４は、第２ポリマーの親水性ブロックＡよりも低い分子量の親水性ブロックＡと、第２ポリマーの疎水性ブロックＢと実質的に同じ分子量である第１ポリマーの疎水性ブロックＢを有する第１ポリマーを有することができる。逆に、ミセルＭ５により示されるように、第１ポリマーおよび第２ポリマーの親水性ブロックＡは、実質的に同じ分子量を有することができ、第１ポリマーは、第２ポリマーの疎水性ブロックＢよりも小さな分子量の疎水性ブロックＢを有することができる。他の態様において、例えばミセルＭ６において示されるように、第１ポリマーの親水性ブロックＡおよび第１ポリマーの疎水性ブロックＢは、それぞれ、第２ポリマーの対応する親水性ブロックＡおよび疎水性ブロックＢよりも小さな分子量を有することができる。好ましい態様において、第１ポリマーについての親水性ブロックと疎水性ブロックの数平均分子量の比（Ｍｎ親水性：Ｍｎ疎水性）１は、対応する第２ポリマーについての親水性ブロックと疎水性ブロックの数平均分子量の比（Ｍｎ親水性：Ｍｎ疎水性）２に対して、少なくとも０．１だけ変化させることができる。あるいは前記比は、少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．２５、または少なくとも０．３だけ変化させることができる。別の例として、代替のアーキテクチャー（architecture）は、一般的に、全体のポリマー分子量が異なる第１および第２のブロック共重合体を含むことができ、例えば、ブロック分子量の相対的な比が異なる（例えば、ミセルＭ４、ミセルＭ５）か、またはブロック分子量の相対的な比が実質的に同じである（例えば、ミセルＭ６）。いくつかの好ましい態様において、第１ポリマーのトータルの数平均分子量Ｍｎは、第２ポリマーのトータルの数平均分子量Ｍｎから少なくとも１０％変化させることができる。あるいは、前記トータルの分子量は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％または少なくとも３０％だけ変化させることができ、いくつかの態様において、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約１００％だけ変化させることができ、いくつかの態様において、少なくとも約１５０％または少なくとも約２００％だけ変化させることができる。かかる各場合において、ポリマーアーキテクチャー（architecture）が異なる組成的に異なるポリマーは、先行する段落に記載したとおり、同じまたは異なる構成要素であるモノマー残基を有することができる。
一般的に、異種性ポリマーミセルの構成要素であるポリマーについての親水性ブロックと疎水性ブロックの数平均分子量Ｍｎの比は、好ましくは、約２：１〜約１：９、好ましくは約３：２〜約１：７、好ましくは約３：２〜約１：５、好ましくは約３：２〜約１：４、好ましくは約１：１〜約１：５、好ましくは約１：１〜約１：４、好ましくは約１：１〜約１：３の範囲とすることができ、いくつかの態様において、約１：１〜１：２の範囲とすることができる。
一般的に、第１および第２ポリマーが、別の規準で（たとえば、それぞれの一または複数のモノマー残基の化学組成の差に基づいて）組成的に異なる場合、第１の構成ポリマーは、第２の構成ポリマーと同じポリマーアーキテクチャー（architecture）を有することができる。
一般的に、ミセルは、構成要素である両親媒性ポリマー（例えば、第１ポリマーおよび／または第２ポリマー）の集合により定義される粒子を意味する。ミセルは、一般的に、疎水性のコアおよび親水性の外殻を含むことができる。ミセルのコア領域は、構成要素であるブロック共重合体の疎水性ブロックを含むことができ、それは、少なくとも部分的に、大部分において、または実質的に、疎水性相互作用を介して会合することができる。好ましくは、第１ポリマーの疎水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックは、（例えば、疎水性相互作用を介して）会合し、関心のある媒体（medium）中で安定なミセルを形成する。
好ましくは、異種性ポリマーミセルは、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）および好ましくは生理学的に適切な温度（例えば、３７℃）において、水性媒体中で安定である。好ましくは、安定なミセルは、その環境において実質的に解離しない。ミセルの安定性は、例えば、１以上の物理的または化学的特徴、例えば、水力学的粒子サイズまたは臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の実質的な保持により実証することができる。例えば、異なる環境における相対的な安定性を測定する場合、別の環境におけるポリマーミセルは、好ましくは、基準となる環境（例えば、ｐＨ７．４、好ましくは３７℃の水溶液）における対応する水力学的粒子サイズの６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％以内の水力学的粒子サイズを有することができる。別の例として、別の環境におけるポリマーミセルは、好ましくは、基準となる環境（例えば、ｐＨ７．４、好ましくは３７℃の水溶液）における対応する臨界ミセル濃度の６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％以内の臨界ミセル濃度を有することができる。
一般的に、特に言及しない、または文脈から理解されない限り、正常または生理学的なｐＨ範囲は、約７．２〜約７．４である。
膜不安定化ポリマー
一般的に、異種性ポリマーミセルの第１ポリマーまたは第２ポリマーの１つ以上は、膜不安定化ポリマー（好ましくはｐＨ依存性の膜不安定化ポリマー）であり得るか、または膜不安定化ポリマーから本質的に構成され得るか、または膜不安定化ポリマーを含むことができる（例えば、ブロック共重合体のブロックなどの領域またはセグメントとしてのものも含む）。好ましい態様において、第１ポリマーの疎水性ブロックおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、膜不安定化ポリマー（好ましくはｐＨ依存性の膜不安定化ポリマー）であり得るか、または膜不安定化ポリマーから本質的に構成され得るか、または膜不安定化ポリマーを含むことができる。第１ポリマーもしくは第２ポリマーまたはそれらの疎水性ブロックは、好ましくは、少なくとも１つの膜破壊性ポリマーであり得るか、または少なくとも１つの膜破壊性ポリマーから本質的に構成され得るか、または少なくとも１つの膜破壊性ポリマーを含むことができる。
ここで提供される好ましいポリマーは、細胞性の膜不安定化ポリマーまたは膜破壊性ポリマーとすることができ（すなわち、細胞性膜を不安定化または破壊する）、細胞性膜の非限定的な例としては、細胞外膜、または細胞内膜、小胞、オルガネラ、エンドソーム、リポソーム、または赤血球の膜が挙げられる。好ましくは、ここに記載するポリマーが細胞性膜と接触する場合において、それは膜を不安定化または破壊し、膜の内側（例えば、エンドソームの内側）から細胞質の細胞内環境への物質輸送経路を提供する。特定の態様において、ここで提供されるポリマーは、溶血性である。特定の態様において、ここで提供されるポリマーは、エンドソーム透過性（endosomal-permeable）（薬剤（単独もしくはミセルと結合した）の放出を考慮して、透過性における変化に影響を与える）またはエンドソーム分解性（endosomolytic）である。特許請求の範囲に明白に記載していない理論により結合することなく、膜不安定化ポリマーは、細胞性膜（例えば、エンドソーム膜）の構造における変化（例えば、透過性の変化）を直接的または間接的に誘発し、異種性ポリマーミセルと結合した、または異種性ポリマーミセルから独立した薬剤（例えばポリヌクレオチド）が、かかる膜構造を通過することを可能にする−例えば、細胞に入るか、または細胞性小胞（例えば、エンドソーム）から出る。膜不安定化ポリマーは、（必ずしもそうではないが）膜破壊性ポリマーとすることができる。膜破壊性ポリマーは、直接的または間接的に、細胞性膜の溶解を誘発する（例えば、細胞性膜の集合の実質的な画分に対して観察されたように）。一般的に、ポリマーまたはミセルの膜不安定化または膜破壊性の性質は、種々の方法により評価され得る。１つの非限定的なアプローチにおいて、細胞性膜の構造における変化は、細胞性膜（例えば、エンドソーム膜）からの薬剤（例えば、ポリヌクレオチド）の放出を（直接的または間接的に）測定する分析における評価により観察することができ、例えば、かかる膜の外の環境におけるかかる薬剤の存在もしくは非存在、またはかかる薬剤の活性を測定することにより観察することができる。他の非限定的なアプローチには、例えば、関心のある細胞性膜に対する代用分析として、赤血球の溶解（溶血）を測定することが含まれる。本発明のポリマーにより影響を受ける細胞性膜は、エンドソーム膜であることが好ましい。
膜不安定化ポリマーまたは膜破壊性ポリマーは、所望のｐＨで膜不安定化活性または膜破壊活性を有するｐＨ感受性ポリマーであり得る。いくつかの態様において、ここで提供される膜不安定化ポリマー（例えば、共重合体）または膜不安定化ブロック共重合体は、（例えば、水性媒体中において）エンドソームｐＨで膜を不安定化する。いくつかの態様において、膜不安定化ブロック共重合体は、約６．５以下のｐＨ、好ましくは約５．０〜約６．５の範囲のｐＨ、または約６．２以下のｐＨ、好ましくは約５．０〜約６．２のｐＨ、または約６．０以下のｐＨ、好ましくは約５．０〜約６．０の範囲のｐＨにおいて（例えば、水性媒体中で）、膜を不安定化する。
好ましくは、各場合において、膜不安定化ポリマーまたは膜破壊性ポリマーは、所望の量（例えば濃度）のポリマーで、膜不安定化活性または膜破壊活性を有することができる。非限定的な例として、膜不安定化ポリマーまたは膜破壊性ポリマーは、約０．５uｇ／ｍｌ〜約５０uｇ／ｍｌ、好ましくは約１uｇ／ｍｌ〜約３０uｇ／ｍｌ、およびいくつかの場合において、約５uｇ／ｍｌ〜約２５uｇ／ｍｌの範囲の濃度で有効であり得る。
一般的に、ポリマーの膜不安定化または膜破壊性の特徴は、当該分野で既知の適切な分析により測定することができる。例えば、ポリマーの膜不安定化活性または膜破壊活性は、インビトロの細胞アッセイにおいて測定することができる。エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性のポリマーは、インビトロの細胞アッセイにおいて決定することができる。溶血性ポリマーは、インビトロの細胞アッセイにおいて決定することができる。あるいは、例えば、ポリマーの膜不安定化活性または膜破壊活性は、非ヒト哺乳類アッセイプロトコルなどのインビボのアッセイプロトコルにおいて測定することができる。エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性のポリマーは、インビボのアッセイプロトコルにおいて決定することができる。溶血性ポリマーは、インビボのアッセイプロトコルにおいて決定することができる。
好ましくは、膜不安定化ポリマーは、インビトロまたはインビボの溶血性アッセイにより特徴付けることができる。好ましくは、例えば、膜不安定化ポリマーは、ｐＨ７．４におけるその溶血活性の少なくとも２倍の溶血活性をｐＨ６．２で有することができる。いくつかの場合において、膜不安定化ポリマーは、ｐＨ７．４におけるその溶血活性の少なくとも３倍の溶血活性をｐＨ５．８で有することができる。好ましいアプローチにおいて、膜不安定化ポリマーは、約７．４より高いｐＨにおいて、実質的に非溶血性であり得る。より特定の態様において、膜不安定化ポリマーは、約２０uｇ／ｍｌの濃度において、インビトロの細胞アッセイで、約５．８またはそれより低いｐＨにおいて溶血性であり得、約７．４より高いｐＨにおいて実質的に非溶血性であり得る。
あるいは、膜不安定化ポリマーは、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性に関するインビトロまたはインビボのアッセイにより特徴付けることができる。特に、膜不安定化ポリマーは、インビトロの細胞アッセイにおいて、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性であり得る。膜不安定化ポリマーは、インビボの非ヒト哺乳類アッセイにおいて、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である。
膜不安定化機能は、異種性ポリマーミセルに関しても特徴付けることができる。好ましくは、ポリマーミセルは、インビトロの細胞アッセイにおいて、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である。好ましくは、ポリマーミセルは、インビボの非ヒト哺乳類アッセイにおいて、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である。
膜不安定化機能は、異種性ポリマーミセルおよびポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤に関しても特徴付けることができる。例えば、ミセルまたは組成物のエンドソーム透過性またはエンドソーム分解性の特性は、インビトロの細胞アッセイにおいて遺伝子発現を評価することにより決定することができる。あるいは、かかる特性は、インビボの非ヒト哺乳類アッセイにおいて、組成物が遺伝子発現を調節するかどうかを評価することにより決定することができる。
さらに以下に記載するように、好ましい態様において、膜不安定化ポリマーまたは膜破壊性ポリマーは、第１ポリマーの疎水性ブロックおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックと関連して達成され得る。
好ましいポリマー−疎水性ブロック
好ましい態様において、第１ポリマーの疎水性ブロックおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、疎水性のポリマー鎖を含む。第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、複数の疎水性モノマー残基を含むことができる。疎水性モノマー残基は、疎水性種を有することができる。一般的に、疎水性種は、ポリマーまたはそのブロックの疎水性の性質に寄与する（すなわち、疎水性を増強する部分として貢献する）モノマー残基の構成部分であり得る。疎水性は、非極性溶媒と水の間の化合物の移動の自由エネルギーにより測定される化合物の物理学的性質を意味する、当該分野で周知の用語である（Hydrophobicity regained. Karplus P.A., Protein Sci., 1997, 6: 1302-1307）。特許請求の範囲に明確に記載されていない理論により結合されることなく、化合物の疎水性は、例えば、２つの非混和性の溶媒（例えば、オクタノールと水）の混合物の２つの相における化合物の濃度比として定義されるｌｏｇＰ値（分配係数（Ｐ）の対数）により測定することができる。疎水性を測定する実験的な方法ならびにｌｏｇＰ値のコンピュータ支援の計算方法は、既知である。本発明の疎水性種には、限定するものではないが、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、およびヘテロアリール基が含まれる。
疎水性モノマー残基は、一般的に、荷電していても荷電していなくてもよい。いくつかの態様には、中性である（荷電していない）疎水性モノマー残基が含まれる。いくつかの態様において、ポリマー鎖は、独立に、(C2-C8)アルキル、(C2-C8)アルケニル、(C2-C8)アルキニル、アリール、およびヘテロアリール（その各々が、任意に置換されていてもよい）から選択される疎水性種を有する複数のモノマー残基を含むことができる。ある態様において、複数のモノマー残基は、(C2-C8)アルキル-エタクリレート、(C2-C8)アルキル-メタクリレート、または(C2-C8)アルキル-アクリレート（その各々が、任意に置換されていてもよい）の重合に由来することができる。
好ましくは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、好ましくは、複数の陰イオン性モノマー残基をさらに含むことができる。従って、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含むことができる。陰イオン性モノマー残基は、プロトン化可能な陰イオン性種を含む、陰イオンに荷電した、または陰イオンに荷電可能な種を有することができる。荷電可能な種は、好ましくは、血清の生理学的ｐＨにおいて陰イオン性であり、不安定化または破壊される膜のｐＨ（例えば、エンドソームｐＨ）において実質的に中性であるか、または荷電しない。いくつかの好ましい態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、複数の陰イオン性疎水性モノマー残基を含むことができ、このモノマー残基は、疎水性種と、陰イオンに荷電した、または荷電可能な種の両方を含む。上述の態様の各々において、疎水性ブロックは、集合体において疎水性とみなすことができる。
陰イオン性モノマー残基は、好ましくは、プロトン化可能な陰イオン性種を含むことができる。集合体について考えると、ポリマー鎖に組み込まれる場合、かかる陰イオン性モノマー残基は、７．０より高いｐＨにおいて実質的に陰イオン性であり得、６．０またはそれより低いｐＨにおいて実質的に中性（非荷電）であり得る。好ましくは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロック（陰イオン性モノマー残基を含む）は、約５．８〜約７．０の範囲のｐＫａを有することができる。陰イオン性モノマー残基は、独立に、カルボン酸、スルホンアミド、ボロン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、リン酸、ホスフィン酸、および亜リン酸基、ならびにこれらの組み合わせから選択されるプロトン化可能な陰イオン性種を有する複数のモノマー残基を含むことができる。好ましい陰イオン性モノマー残基は、(C2-C8)アルキルアクリル酸の重合に由来することができる。
第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、好ましくは、複数の陽イオン性モノマー残基を含むことができ、またはさらに含むことができる。従って、例えば、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、複数の疎水性モノマー残基および複数の陽イオン性モノマー残基を含むことができる。あるいはおよび好ましくは、いくつかの態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、複数の疎水性モノマー残基、複数の陰イオン性モノマー残基および複数の陽イオン性モノマー残基を含むことができる。一般的に、陽イオン性モノマー残基は、プロトン化可能な陽イオン性種を含む、陽イオンに荷電した、または荷電可能な種を有することができる。荷電可能な種は、好ましくは、血清の生理学的ｐＨにおいて陽イオン性であり得る。いくつかの好ましい態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、疎水性種、陰イオンに荷電した、または荷電可能な種および陽イオンに荷電した、または荷電可能な種の種々の組み合わせを含む複数のモノマー残基を含むことができる。かかる態様において、以下にさらに説明するように、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、電荷が調節されてもよく（charge modulated）、好ましくは、電荷が平衡状態であり、実質的に全体として電荷が中性である。かかる上述の態様の各々において、疎水性ブロックは、集合体において疎水性とみなすことができる。
陽イオン性モノマー残基は、好ましくは、脱プロトン化可能な陽イオン性種を含むことができる。集合体について考えると、ポリマー鎖に組み込まれる場合、かかる陽イオン性モノマー残基は、７．０またはそれより低いｐＨにおいて実質的に陽イオン性であり得る。好ましくは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロック（陽イオン性モノマー残基を含む）は、約６．３〜約７．８の範囲のｐＫａを有することができる。陽イオン性モノマー残基は、独立に、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される種を有する複数のモノマー残基を含むことができる。好ましい陽イオン性モノマー残基は、各々のケースで任意に置換された、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来することができる。
一般的に、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、電荷が調節されてもよく、例えば、疎水性モノマー残基と共に、陰イオン性モノマー残基および陽イオン性モノマー残基の両方が含まれる。陰イオン性モノマー残基と陽イオン性モノマー残基の相対的な比は、所望の全体的な電荷特性を達成するように制御され得る。好ましい態様において、例えば、かかるポリマーまたはポリマー鎖は、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．２〜７．４）の水性媒体中で実質的に全体の電荷が中性である、電荷平衡であり得る。好ましくは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、ｐＨ７．４の水性媒体中で実質的に全体の電荷が中性であり得る。
好ましい態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、膜不安定化ポリマーまたは膜破壊性ポリマーであり得るか、または本質的にこれらから構成され得るか、またはこれらを含むことができる。好ましくは、例えば、第１のブロック共重合体および／または第２のブロック共重合体の疎水性ブロックは、膜不安定化または膜破壊性とすることができ、複数の疎水性モノマー残基、複数の陰イオン性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含む。上述の態様の各々において、疎水性ブロックは、集合体において疎水性とみなすことができる。膜不安定化または膜破壊性ポリマーは、先行する部分に記載した属性を有し得る。
本発明の好ましい態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、複数の疎水性モノマー残基、複数の陰イオン性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含む少なくとも１つのポリマー鎖であり得るか、または本質的にそのポリマー鎖から構成され得るか、またはそのポリマー鎖を含むことができ、前記残基は、ポリマー鎖の膜不安定化活性または膜破壊活性を増強するのに適した比で含まれる。例えば、限定することなく、かかる態様において、ｐＨ７．４において、疎水性：（陰イオン性＋陽イオン性）種の比が約１：３〜約３：１の範囲であり、陰イオン性：陽イオン性種の比が約１：０〜約１：４の範囲である。好ましい態様において、ｐＨ７．４において、疎水性：（陰イオン性＋陽イオン性）種の比が約１：２〜約２：１の範囲（例えば、約１：１）であり、陰イオン性：陽イオン性種の比が約４：１〜約１：４の範囲（例えば、約３：２〜約２：３、または例えば約１：１）である。
一般的および非限定的な例として、本発明の異種性ポリマーミセルは、第１および第２の組成的に異なるポリマーを含むことができ、その各々はブロック共重合体であり得る。図１Ｂおよびそれに関連する上記記述を参照すると、例えば、第１および第２のブロック共重合体のそれぞれは、共重合体の第１ブロックＡを規定する第１ポリマー鎖、および共重合体の第２疎水性ブロックＢを規定する膜破壊性の第２ポリマー鎖を含むことができる。例えば、かかるブロック共重合体のそれぞれは、共重合体の第１ブロックＡを規定する第１ポリマー鎖、および共重合体の第２疎水性ブロックＢを規定する第２ポリマー鎖を含むことができ、第２ポリマー鎖は、（i）複数の疎水性モノマー残基、および（ii）荷電可能な種を有する複数の陰イオン性モノマー残基を含み、荷電可能な種は、血清の生理学的ｐＨにおいて陰イオン性であり、エンドソームｐＨにおいて実質的に中性であるか、または荷電しない。別の方向付けにおいて、一般的にはあまり好ましくないアプローチであるが、ブロック共重合体は、好ましくは、共重合体の第１ブロックＡを規定する膜破壊性の第１ポリマー鎖と、共重合体の第２ブロックを規定する第２ポリマーとを含むことができる。例えば、ブロック共重合体は、共重合体の第１ブロックを規定する第１ポリマー鎖と、共重合体の第２疎水性ブロックＢを規定する第２ポリマー鎖を含むことができ、第１ポリマー鎖は、（i）（例えば、プロトンスポンジ効果を介して）膜不安定化に寄与する複数の陽イオン性モノマー残基と、（ii）複数の中性の（荷電していない）モノマー残基を含む。
一般的に、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を含む。以下により完全に記載するように、重合可能なモノマーは、好ましくは、アクリルモノマーまたはビニルモノマーなどのエチレン（ethylenically）不飽和モノマーである。好ましくは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、疎水性種および（プロトン化可能な）陰イオン性種を有する第１の重合可能なモノマーに由来する複数の第１モノマー残基と、任意に、（脱プロトン化可能な）陽イオン性種を有する第２の重合可能なモノマーに由来する複数の第２モノマー残基を含む。あるいは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、疎水性種を有する第１の重合可能なモノマーに由来する複数の第１モノマー残基と、（プロトン化可能な）陰イオン性種を有する第２の重合可能なモノマーに由来する複数の第２モノマー残基と、任意に、（脱プロトン化可能な）陽イオン性種を有する第３の重合可能なモノマーに由来する複数の第３モノマー残基を含むことができる。好ましくは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、重合可能なモノマーの制御された（すなわち、リビング）ラジカル重合に由来する複数のモノマー残基を含む。
第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックのさらなる側面および特徴を、重合に向けられた節と関連して、一般的に以下に示す。
好ましいポリマー−親水性ブロック
好ましい態様において、第１ブロック共重合体のブロックおよび／または第２ブロック共重合体のブロックは、親水性であるポリマー鎖を含むことができる。第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、一般的に、複数の親水性モノマー残基を含むことができる。親水性モノマー残基は、親水性種を有することができる。親水性種は、極性種であり得る。一般的に、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックを構成するモノマー残基は、厳密には重要でなく、中性（荷電していない）、陰イオン性、陽イオン性、または両性イオン性である親水性モノマー残基であり得るか、またはそれを含み得る。かかるモノマー残基を含む第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックの全体的な電荷特性は、中性（荷電していない）、陰イオン性、陽イオン性、または両性イオン性とすることができ、好ましくは、集合体において親水性とみなされる。
一般的に、且つ以下により具体的に記載するように、本発明の種々の態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、陽イオン性ポリマー鎖（例えば、陽イオン性親水性ポリマー鎖）であるか、または本質的に陽イオン性ポリマー鎖からなるか、または陽イオン性ポリマー鎖を含む。第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、複数の陽イオン性親水性モノマー残基などの複数の陽イオン性モノマー残基を含むことができる。陽イオン性モノマー残基は、脱プロトン化可能な陽イオン性種を含む、陽イオンに荷電した、または荷電可能な種を有することができる。荷電可能な種は、好ましくは、血清の生理学的ｐＨにおいて陽イオン性であり得る。以下に記載するように、電荷希釈が望ましい場合のいくつかの態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、複数の陽イオン性モノマー残基に加え、中性の親水性モノマー残基などの複数の中性モノマー残基をさらに含むことができる。かかる上述の態様の各々において、親水性ブロックは、集合体において親水性とみなすことができる。
陽イオン性モノマー残基は、好ましくは、脱プロトン化可能な陽イオン性種を含むことができる。集合体について考えると、ポリマー鎖に組み込まれる場合、かかる陽イオン性モノマー残基は、７．０またはそれより高いｐＨにおいて実質的に陽イオン性であり得る。好ましくは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロック（陽イオン性モノマー残基を含む）は、約６．３〜約７．８の範囲のｐＫａを有することができる。陽イオン性モノマー残基は、独立に、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される種を有する複数のモノマー残基を含むことができる。好ましい陽イオン性モノマー残基は、各ケースで任意に置換された、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来することができる。
一般的に、且つ以下により具体的に記載するように、本発明の種々の態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、中性（荷電していない）ポリマー鎖（例えば、中性（荷電していない）親水性ポリマー鎖）であるか、または本質的に中性ポリマー鎖からなるか、または中性ポリマー鎖を含む。第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、複数の中性（荷電していない）親水性モノマー残基、例えば中性（荷電していない）親水性モノマー残基、例えば中性極性モノマー残基を含むことができる。好ましい中性（荷電していない）モノマー残基は、ポリエチレングリコールメタクリレート(PEGMA) (例えば、化合物２に示したように１〜２０のエチレンオキシド単位を有するか、または４〜５のエチレンオキシド単位を有するか、または７〜８のエチレンオキシド単位を有する)、好ましくは、ＰＥＧ化メタクリル酸モノマー（例えば、CH3O(CH2O)2-20OC(O)C(CH3)=CH2 (PEGMA)）; ＰＥＧ化アクリル酸モノマー（例えば、CH3O(CH2O)2-20OC(O)C H=CH2 (PEGA)）; N-イソプロピルアクリルアミド (NIPAAM); 2-ヒドロキシエチルメタクリレート (HEMA); ヒドロキシプロピルメタクリレート (例えばN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリレート (HPMA)を含む種々の異性体)、2-(2',3',4',6'-テトラ-O-アセチル-b-D-ガラクトシルオキシ)エチルメタクリレート (AcGalEMA); 2-(b-D-ガラクトシルオキシ)エチルメタクリレート (GalEMA); ヒドロキシブチルメタクリレート(種々の異性体); ヒドロキシプロピルアクリレート (種々の異性体); ヒドロキシブチルアクリレート (種々の異性体); および特にアクリルアミドの重合に由来することができる。他のかかるモノマー残基は、重合に関連して以下に一般的に説明する。かかる上述の態様の各々において、親水性ブロックは、集合体において親水性とみなすことができる。
いくつかの好ましい態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、親水性種の種々の組み合わせを含む複数のモノマー残基を含むことができる。例えば、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、複数の陽イオン性モノマー残基および複数の中性（荷電していない）モノマー残基を含むことができる。かかる態様において、例えば、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックは、好ましくは、電荷が調節されてもよく（例えば、電荷が希釈される）、全体的な電荷においては実質的に全体的に陽イオン性であるが、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％（各場合においてモル％）の荷電していないモノマー残基を含む。かかる態様において、例えば、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、好ましくは、より電荷が希釈されてもよく、全体的な電荷においては実質的に全体的に陽イオン性であるが、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％（各場合においてモル％）の荷電していないモノマー残基を含み、全体として約１０％〜約７０％（モル％）の範囲の荷電していないモノマー残基を含む。かかる上述の態様の各々において、親水性ブロックは、集合体において親水性とみなすことができる。
別のアプローチにおいて、かかる電荷の調節は、例えば、集合して異種性ミセルを形成する第１ポリマーおよび第２ポリマーの相対的な量および数を変化させることにより、超分子アーキテクチャー（architecture）に基づいて行うことができる。例えば、第１ポリマーの親水性ブロックは、陽イオンに荷電した、または荷電可能な陽イオン性種を含む複数の陽イオン性親水性モノマー残基を含むことができ、第２ポリマーの親水性ブロックは、複数の中性親水性モノマー残基を含むことができる。かかる態様において、電荷の調節（例えば、種々の電荷希釈）は、第１ポリマー（陽イオン性親水性ブロックを有する）と第２ポリマー（中性親水性ブロックを有する）の相対的な比を変化させることにより実現され得る。例えば、かかる場合における第２ポリマーは、ポリマー全量（すなわち、第１ポリマーと第２ポリマーの合計量）の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％を構成することができる。かかる態様において、例えば、かかる場合における第２ポリマーは、ポリマー全量の少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、および全体としてポリマー全量の約１０％〜約７０％を構成することができる。かかる上述の態様の各々において、親水性ブロックは、集合体において親水性とみなすことができる。
一般的に、および以下にさらに詳細に説明するように、本発明の種々の態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、例えば、親水性ポリマー鎖のモノマー残基のペンダント部分としての結合可能な種（conjugatable species）（反応性官能基部分）を含む、ポリマー鎖を含む。第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、結合可能な種を有する複数のモノマー残基、好ましくは結合可能な種を有する親水性モノマー残基を含むことができ、各場合において、結合可能な種は、好ましくはモノマー残基のペンダント部分として含まれる。好ましい結合可能な種を有するモノマー残基は、メチルアクリル酸(MAA(NHS))のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、アクリル酸(AA(NHS))のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルメタクリレート(MAA(PNP))、ピリジルジスルフィドアクリレートモノマー(PDSA)、ピリジルジスルフィドメタクリレート(PDSM)、2-アミノエチルメタクリレート、ピリジルジスルフィドメタクリレートモノマー(PDSMA); グリシジルメタクリレート; グリシジルアクリレート; 3-アジドプロピルメタクリレート(AzPMA); トリメチルシリルプロパルギルメタクリレート(TMSPMA); またはアクリロニトリルの重合に由来することができる。他のかかるモノマー残基は、重合に関連して以下に一般的に記載する。かかる上述の態様の各々において、親水性ブロックは、集合体において親水性とみなすことができる。
本発明の種々の態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、（例えば、ポリヌクレオチドなどの薬剤の細胞内デリバリーのために）ポリマーミセルに対して重要である１以上の付加的な構成要素および／または機能的特徴を亢進するように調節されたポリマー鎖であるか、または本質的にかかるポリマー鎖からなるか、またはかかるポリマー鎖を含む。
好ましくは、例えば、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、ポリヌクレオチドなどの薬剤と結合することができる。例えば、ポリヌクレオチドまたは他の薬剤は、イオン性相互作用を介して第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックと結合することができる。ポリヌクレオチドに対して、第１ポリマーおよび第２ポリマーの少なくとも１つ（例えば、第１ブロック共重合体）および任意にその各々の親水性ブロックは、例えば陽イオン性親水性ポリマー鎖などの陽イオン性のポリマー鎖を含むことができる。第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、複数の陽イオン性モノマー残基を含むことができる。ポリヌクレオチドを含む組成物において、かかる複数の陽イオン性モノマー残基は、（その陰イオン性種を介して）ポリヌクレオチドとイオン結合することができる。いくつかの態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーのかかる親水性ブロックは、さらに、中性親水性モノマー残基などの複数の中性（荷電していない）モノマー残基を含むことができる。かかる荷電していないモノマー残基は、上述したように、電荷の調節（電荷の中和）のために使用することができる。かかる上述の態様の各々において、親水性ブロックは、集合体において親水性とみなすことができる。異種性ポリマーミセルとポリヌクレオチドの結合に関する他の側面は、ポリヌクレオチド含有組成物に関連して以下に記載する。
あるいは、ポリヌクレオチドまたは他の薬剤は、構成要素であるポリマーの１つ以上との共有結合を介して、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックと結合することができる。共有結合は、例えば、結合可能な種（すなわち、反応性官能基部分）を有するモノマー残基を介して達成され得る。それ故、かかる態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、結合可能な種を有する複数のモノマー残基、好ましくは結合可能な種を有する親水性モノマー残基を含むことができ、各場合において、結合可能な種は、好ましくはモノマー残基のペンダント部分として含まれる。異種性ポリマーミセルとポリヌクレオチドの結合に関する他の側面は、ポリヌクレオチド含有組成物に関連して以下に記載する。
親水性のポリヌクレオチドなどのいくつかの薬剤は、あるいは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックの末端に共有結合により結合することができ、かかる薬剤（例えば、ポリヌクレオチド）が末端結合（end-conjugated）ポリマーの親水性ブロックを本質的に構成し、かかる親水性ブロックとして機能することを可能にする。種々の既知の末端結合アプローチが当該分野で既知であり、本発明のこの態様に関して組み込むことができる。制御された（リビング）ラジカル重合アプローチは、ポリマー（例えば、以下に記載するようなＲＡＦＴ重合に由来するポリマー）のα末端またはω末端に、機能的な結合部分を提供する。例えば、限定することなく、結合可能部分は、構成要素であるポリマーを、結合可能部分（例えば、アジドまたはピリジルジスルフィド基）を含む連鎖移動剤の存在下で調製することにより、ポリマーのα末端またはω末端に提供され、結合可能基は、重合プロセスの条件に適合する。例えば、Heredia, K. L et al., Chem. Commun., 2008, 28, 3245-3247; See also Boyer et al., Direct Synthesis of Well-Defined Heterotelechelic Polymers for Bioconjugations Macromolecules, 2008, 41 (15), pp 5641-5650を参照されたい（例えば、対応する官能基を組み込む連鎖移動剤を用いて、α末端とω末端の両方に官能基を有するブロック共重合体を提供する）。結合可能なチオールω末端基を有する共重合体は、チオカルボニルチオマクロＣＴＡを還元し、結合可能な末端基としてチオール末端を形成することにより調製することができる。連鎖移動剤は、任意に、脱保護されて薬剤に結合することができるマスクされた結合可能基を含むことができる。異種性ポリマーミセルとポリヌクレオチドの結合に関する他の側面は、ポリヌクレオチド含有組成物に関連して以下に記載する。
第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、遮蔽部分であり得るか、または本質的に遮蔽部分から構成され得るか、または遮蔽部分を含むことができる。例えば、遮蔽は、中でも、立体遮蔽するために、代謝（例えば、酵素的分解）に対する安定性を増強するために、潜在的な毒性を調節するために、薬物動態を向上させるために、所望の生体分布を向上させるために有効な種または部分を組み込むことにより行うことができる。かかる遮蔽機能は、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤のデリバリーのためにかなり重要であり得る。一般的に、ポリヌクレオチド剤に関する態様において、遮蔽は、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックが、中性（荷電していない）親水性モノマー残基などの中性（荷電していない）モノマー残基を複数含む場合に有利に実現され得る。特に好ましい遮蔽アプローチについては、以下の遮蔽の節において詳細に説明する。
第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、例えば、異種性ミセルおよびそれに結合した薬剤（例えば、ポリヌクレオチド）を、関心のある特定の細胞種に向けるなどのターゲティング機能を提供することができる。ターゲティングは、例えば、多糖もしくはオリゴ糖または特定のターゲティングリガンドなどの、種々の特異性を有し、レセプターに媒介されるエンドサイトーシスに対して有効な部分を含む、１以上のターゲティング部分の共有結合により行うことができる。共有結合は、例えば、結合可能な種（すなわち、反応性官能基部分）を有するモノマー残基を介して達成され得る。それ故、かかる態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、結合可能な種を有する複数のモノマー残基、好ましくは結合可能な種を有する親水性モノマー残基を含むことができ、各場合において、好ましくは、結合可能な種はモノマー残基のペンダント部分として含まれる。ターゲティング部分は、結合可能な種を介して、および任意に連結部分を介して、親水性ブロックに共有結合させることができる。特に好ましいターゲティングアプローチは、以下のターゲティングの節において詳細に説明する。いくつかのアプローチにおいて、親水性であるターゲティング部分は、あるいは、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの疎水性ブロックの末端、または第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックの末端に共有結合により結合させることができ、各場合において、かかるターゲティング部分が末端結合ポリマーの親水性ブロックの全てまたは部分を本質的に構成し、機能することを許容する。種々の既知の末端結合アプローチは、当該分野で既知であり、本発明のこの態様に関して組み込むことができる。
ポリマー一般
上述した好ましい態様およびアプローチを否定することなく、以下の側面は、異種性ポリマーミセルの第１および第２の組成的に異なる構成要素であるポリマー、または第１ブロック共重合体もしくは第１ブロック共重合体とは組成的に異なる第２ブロック共重合体のいずれかのブロックに一般的にあてはまる。
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックのそれぞれは、重合を含むプロセスに由来する１以上の繰り返し単位（モノマー残基）を含むことができる。かかるモノマー残基は、任意に、重合後の反応（例えば、誘導体化）に由来する構造部分（または種）も含むことができる。モノマー残基は、ポリマーの構成部分であり、従って、ポリマーの構成単位とみなすことができる。一般的に、本発明のポリマーは、（直接的または付加的なプロセスを介して間接的に）１以上の重合可能なモノマーに由来する構成単位を含むことができる。
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックのそれぞれは、ホモポリマー（本質的に同じ化学的組成を有する単一種類のモノマーの重合に由来する）または共重合体（異なる化学的組成を有する２つ以上の異なるモノマーの重合に由来する）であり得る。共重合体であるポリマーは、ランダム共重合体鎖またはブロック共重合体鎖（例えば、ジブロック共重合体、トリブロック共重合体、より高次のブロック共重合体等）であり得る。いずれかの所定のブロック共重合体鎖は、当該分野で既知の方法により、慣例的に構成され、達成され得る。
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックのそれぞれは、直鎖状ポリマーまたは非直鎖状ポリマーであり得る。非直鎖状ポリマーは、例えば、分枝鎖状ポリマー、星状ポリマー、デンドリマーポリマーが含まれる種々のアーキテクチャー（architecture）を有することができ、架橋ポリマー、半架橋ポリマー、グラフトポリマー、およびこれらの組み合わせであり得る。
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックのそれぞれは、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合などの制御された（リビング）ラジカル重合により調製することができる。かかる方法およびアプローチは、一般的に当該分野で既知であり、ここでさらに説明する。あるいは、ポリマーは、通常のラジカル重合アプローチを含む通常の重合アプローチにより調製することができる。
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックのそれぞれは、好ましくは、一連の複数の個々の反応を含む段階的なアプローチ以外の方法（例えば、ペプチド合成またはオリゴヌクレオチド合成のために当該分野で既知の方法）により調製される。好ましくは、ポリマーまたはそのブロックは、非ペプチド性ポリマーである（アミノ酸ポリマー以外のポリマーからなる）。好ましくは、ここで特に述べる場合を除き、ポリマーまたはそのブロックは、非核酸ポリマー鎖である（核酸ポリマー以外のポリマーからなる）。一般的に、ポリマーまたはそのブロックは、非脂質性部分である（脂質性部分以外の構成要素である部分を有するポリマーからなる）。好ましくは、ポリマーまたはそのブロックは、非サッカリドポリマーである。対照的に、明確にするために、上記に記載したにもかかわらず、且つ上記の不利益とならないように、ターゲティング部分および／または本発明の他の生体分子薬剤は、アミノ酸ポリマー（例えば、ペプチド）または核酸ポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）または多糖であり得る。
一般的に、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合などの制御された（リビング）ラジカル重合により調製される異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックのそれぞれは、モノマー残基（繰り返し単位）以外の部分を含んでいてもよい。例えば、限定することなく、かかるポリマーは、ポリマー鎖のα末端またはω末端に重合プロセス依存性の部分を含んでいてもよい。典型的に、例えば、ＲＡＦＴ重合などの制御されたラジカル重合に由来するポリマー鎖は、そのα末端に共有結合したラジカル源（radical source）残基をさらに含んでいてもよい。例えば、ラジカル源残基はイニシエータ残基であってもよく、または、ラジカル源残基は可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）剤の脱離基であってもよい。典型的に、別の態様として、ＲＡＦＴ重合などの制御されたラジカル重合に由来するポリマーは、そのω末端と共有結合した連鎖移動残基をさらに含んでいてもよい。例えば、連鎖移動残基は、式-SC(=S)Z（式中のＺは、活性化基）を有するチオカルボニルチオ部分であり得る。典型的なＲＡＦＴ連鎖移動残基は、キサンテート、ジチオカルバメート、ジチオエステルおよびトリチオカルボネートから選択される連鎖移動剤の存在下でのラジカル重合に由来する。ポリマーのα末端もしくはω末端または異なるポリマーのブロック間にある前記プロセス関連部分は、例えば共有結合等に適した官能基を含み得るか、または共有結合等に適した官能基を含むように誘導体化され得る。
異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックのそれぞれのさらなる側面については、以下の段落に記載するが、ポリマーの繰り返し単位が由来する好ましい重合可能なモノマーを含む。
一般的に、および好ましくは、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーまたはかかるポリマーのブロックの１以上および好ましくはそれぞれが、エチレン不飽和モノマーに由来する繰り返し単位を含むことができる。「エチレン不飽和モノマー」という用語は、ここでは、少なくとも１つの炭素二重結合または三重結合を有する化合物として定義される。
好ましくは、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーまたはそのブロックは、重合可能なモノマーに由来するモノマー残基を含むことができる。好ましくは、かかる構成要素であるポリマーまたはそのブロックは、重合可能なモノマーの制御されたラジカル重合に由来するモノマー残基を含むことができる。
好ましい態様において、重合可能なモノマーは、アクリルモノマーまたはビニルモノマーなどのエチレン不飽和モノマーであり得る。好ましくは、重合可能なモノマーは、任意に置換されたアクリル酸、任意に置換されたアクリルアミド、および任意に置換されたアクリレートから選択されるアクリルモノマーであり得る。特に好ましい態様において、重合可能なモノマーは、任意にC1-C8アルキル置換されたアクリル酸、任意にC1-C8アルキル置換されたアクリルアミド、および任意にC1-C8置換されたアクリレートから選択され得る。
好ましくは、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーまたはそのブロックは、重合可能なモノマーに由来することができ、１．５以下、好ましくは約１．４以下の多分散指数を有することができ、いくつかの態様においては、約１．２以下、または約１．１以下、または１．０５以下の多分散性指数を有することができる。
好ましい態様において、重合可能なモノマーは、以下の式IIを有するモノマーであり得る。
Figure 2012500793
式中、R3は、水素、ヒドロキシル、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、R4は、陰イオン性種、陽イオン性種、中性種、疎水性種から選択される１つ以上の種を含む基である。
好ましくは、R4は、水素、-OR5、および-NR6R7からなる群より選択され、R5は、水素、任意に置換されたアルキル、アルコキシ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたプロポキシル化アルキル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールからなる群より選択され、R6およびR7は、それぞれ独立に、水素、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたポリオキシル化アルキル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールからなる群より選択される。
好ましくは、式IIのモノマーにおいて、R3は、水素およびメチルからなる群より選択され、R4は、-OR5および-NR6R7からなる群より選択され、R5は、水素、任意に置換されたC1-C3アルキル、アルコキシ、およびポリオキシル化アルキルからなる群より選択され、R6およびR7は、それぞれ独立に、水素、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択される。
エチレン不飽和モノマーのさらに好ましい非限定的な例は、アルキル(アルキル)アクリレート、アルキルメタクリレート、アルキルアクリル酸、N-アルキルアクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン、アリルアミン、アリルアンモニウム、ジアリルアミン、ジアリルアンモニウム、n-ビニルホルムアミド、ビニルエーテル、ビニルスルホネート、アクリル酸、スルホベタイン、カルボキシベタイン、ホスホベタイン、またはマレイン酸無水物である。
種々の態様において、ここに記載するポリマーを提供するのに適しているいずれかのモノマーは、本発明の効果を生じさせるために使用され得る。いくつかの態様において、ここで提供されるポリマーの調製において使用するのに適したモノマーには、非限定的な例により、以下に示すモノマーの１以上が含まれる：メチルメタクリレート、エチルアクリレート、プロピルメタクリレート（全ての異性体）、ブチルメタクリレート (全ての異性体)、2-エチルヘキシルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、メタクリル酸、ベンジルメタクリレート、フェニルメタクリレート、メタクリロニトリル、α-メチルスチレン、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート (全ての異性体)、ブチルアクリレート (全ての異性体)、2-エチルヘキシルアクリレート、イソボルニルアクリレート、アクリル酸、ベンジルアクリレート、フェニルアクリレート、アクリロニトリル、スチレン、グリシジルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート (全ての異性体)、ヒドロキシブチルメタクリレート (全ての異性体)、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、オリゴエチレングリコールメタクリレート、オリゴエチレングリコールアクリレート、イタコン酸無水物、イタコン酸、グリシジルアクリレート、2-ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート (全ての異性体)、ヒドロキシブチルアクリレート (全ての異性体)、N,N-ジメチルアミノエチルアクリレート、N,N-ジエチルアミノエチルアクリレート、トリエチレングリコールアクリレート、メタクリルアミド、N-メチルアクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-tert-ブチルメタクリルアミド、N-n-ブチルメタクリルアミド、N-メチロールアクリルアミド、N-エチロールアクリルアミド、ビニル安息香酸 (全ての異性体)、ジエチルアミノスチレン (全ての異性体)、α-メチルビニル安息香酸 (全ての異性体)、ジエチルアミノα-メチルスチレン (全ての異性体)、p-ビニルベンゼンスルホン酸、p-ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、トリエトキシシリルプロピルメタクリレート、トリブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシメチルシシルプロピルメタクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルメタクリレート、トリメトキシシリルプロピルアクリレート、トリエトキシシリルプロピルアクリレート、トリブトキシシリルプロピルアクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジエトキシメチルシリルアクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジメトキシシリルプロピルアクリレート、ジエトキシシリルプロピルアクリレート、ジブトキシシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルアクリレート、ビニルアセテート、ビニルブチレート、ビニルベンゾエート、ビニルクロリド、ビニルフルオリド、ビニルブロミド、マレイン酸無水物、N-アリールマレイミド、N-フェニルマレイミド、N-アルキルマレイミド、N-ブチルマレイミド、N-ビニルピロリドン、N-ビニルカルバゾール、ブタジエン、イソプレン、クロロプレン、エチレン、プロピレン、1,5-ヘキサジエン、1,4-ヘキサジエン、1,3-ブタジエン、1,4-ペンタジエン、ビニルアルコール、ビニルアミン、N-アルキルビニルアミン、アリルアミン、N-アルキルアリルアミン、ジアリルアミン、N-アルキルジアリルアミン、アルキレンイミン、アクリル酸、アルキルアクリレート、アクリルアミド、メタクリル酸、アルキルメタクリレート、メタクリルアミド、N-アルキルアクリルアミド、N-アルキルメタクリルアミド、スチレン、ビニルナフタレン、ビニルピリジン、エチルビニルベンゼン、アミノスチレン、ビニルイミダゾール、ビニルピリジン、ビニルビフェニル、ビニルアニソール、ビニルイミダゾール、ビニルピリジニル、ビニルポリエチレングリコール、ジメチルアミノメチルスチレン、トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート、トリメチルアンモニウムエチルアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、トリメチルアンモニウムエチルアクリレート、トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート、トリメチルアンモニウムプロピルアクリルアミド、ドデシルアクリレート、オクタデシルアクリレート、またはオクタデシルメタクリレートモノマー、あるいはこれらの組み合わせ。
いくつかの態様において、異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックのそれぞれは、例えば、種々の態様に関連して使用するための（例えば、ポリヌクレオチド含有組成物に関連して使用するための）、ある特定のモノマーおよびモノマーの組み合わせに由来することができる。かかる好ましいポリマーについて、以下に記載する。
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーのブロックの１以上は、上述したモノマーの変形を含む、官能性化（functionalized）モノマーに由来する繰り返し単位を含むことができる。ここで使用される官能化モノマーは、結合可能な種を含むことができ、例えば、マスク（保護）された、またはマスク（保護）されていない官能基（中でも例えば、薬剤（例えば、ポリヌクレオチド）、ターゲティング部分、遮蔽部分などの他の部分と、重合後に共有結合し得る基）を含むモノマーであり得る。かかる基の非限定的な例は、１級アミノ酸基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、アジド基、およびシアノ基である。いくつかの適切なマスキング（masking）基は、入手可能である（例えば、T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd edition) J. Wiley & Sons, 1991. P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994を参照されたい）。
ここで使用する場合、「ブロック」共重合体は、構造単位またはモノマー単位の１以上の下位の組み合わせ（sub-combination）を含む構造を意味する。いくつかの態様において、ブロック共重合体は、ジブロック共重合体、トリブロック共重合体またはより高次のブロック共重合体である。例えば、ジブロック共重合体は、２つのブロックを含むことができ；かかるポリマーの模式的な一般式は、以下のように表される：[Aa/Bb/Cc/ …]m - [Xx/Yy/Zz/ …]n；式中、各文字は、構造単位またはモノマー単位を意味し、構造単位に対する各添字は、特定のブロックにおけるその単位のモル分率を表し、３つの点は、各ブロックにさらなる構造単位が存在し得る（より少なくてもよい）ことを示し、ｍおよびｎは、ジブロック共重合体における各ブロックの分子量（または重量分率）を示す。かかる模式的表示により示されるように、いくつかの場合において、各構造単位の数および性質は、各ブロックについて別々に制御される。模式的表示は、各ブロックにおける構成単位の数または異なる種類の構成単位の数の間のいかなる関係も意味せず、且つかかる関係が推測されると解釈されるべきではない。模式的表示は、特定のブロック内の構成単位のいずれかの特定の数を表示するものでも、構成単位のいずれかの特定の配列を表示するものでもない。各ブロックにおいて、構成単位は、特に記載しない限り、全くランダムな配置で、交互にランダムな配置で、規則的に交互の配置で、規則的なブロック配置で、またはランダムなブロック配置で配置され得る。例えば、全くランダムな配列は、形態x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z…を有し得る。代表的な交互にランダムな配置は、形態x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z…を有してもよく、代表的な規則的に交互の配置は、形態x-y-z-x-y-z-x-y-z…を有してもよい。代表的な規則的なブロック配置は、以下の一般的な配置…x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x…を有してもよい一方、代表的なランダムなブロック配置は、以下の一般的な配置…x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-…を有してもよい。グラジエントポリマーにおいて、１以上のモノマー単位の含量は、ポリマーのα末端からω末端において、勾配の様式で増大または減少する。上述した一般的な例のいずれも、特定の近位の個々の構造単位もしくはブロックまたはブロックにおける構造単位の数もしくはブロックの数を意味するものではなく、本発明の高分子キャリアを形成するブロックコポリマーの実際の構造と関係のある、または前記実際の構造を限定するいずれかの様式として解釈されるべきではない。
ここで使用する場合、構造単位を囲う括弧は、構造単位自体がブロックを形成することを意味せず、かかる意味に解釈されるべきでもない。すなわち、大括弧内の構造単位は、ブロック内の他の構造単位といずれかの様式で、すなわち、全くランダムな配置で、交互にランダムな配置で、規則的に交互の配置で、規則的なブロック配置で、またはランダムなブロック配置で結合し得る。ここに記載するブロック共重合体は、任意に、交互ブロック共重合体、グラジエントブロック共重合体またはランダムブロック共重合体である。
ユニマー（unimer）またはモノブロックポリマーは、単一の重合ステップの合成産物である。モノブロックポリマーという用語は、ランダム共重合体（すなわち、２種以上のモノマーの重合産物）およびホモポリマー（すなわち、１種のモノマーの重合産物）などの共重合体を含む。
異種性ポリマーミセルを構成するポリマーまたはかかるポリマーのブロックのそれぞれの調製方法は、以下に示すが、一般的に、限定するものではないが、ここに記載するポリマーに適用可能である。
異種性ポリマーミセルを構成するポリマーまたはかかるポリマーの１つ以上は、異種性ミセルを構成するポリマーのいくつかまたは全ての共有結合を効率的に可能にする架橋ポリマーまたはポリマーブロックであり得る。いくつかの態様において、第１ポリマーは、組成的に異なる第２ポリマーと共有結合性に架橋し、それによりポリマーミセルは架橋ポリマーミセルとなる。架橋ポリマーミセルにおいて、好ましくは、第１ポリマーの疎水性ブロックは、第２ポリマーの疎水性ブロックと共有結合性に架橋する。架橋ポリマーミセルに対する１つのアプローチにおいて、第１ポリマーおよび第２ポリマーはそれぞれ、エチレンモノマーの制御されたラジカル重合に由来する複数のモノマー残基を含み、かかるモノマーの少なくとも１つは、二官能性（bis-functional）の架橋モノマーである。かかる態様において、架橋モノマーは、２以上の重合可能部分を含む。架橋モノマーは、エチレン不飽和架橋剤であり得る。エチレン不飽和架橋剤は、当該分野で既知であり、ブタジエンまたはオクタジエンなどのジエンを含むことができる。別のアプローチにおいて、架橋ポリマーミセルは、例えば、疎水性ブロック中に含まれる結合可能なモノマー残基の官能基を介して、好ましくは第１ポリマーの疎水性ブロックと第２ポリマーの疎水性ブロックの重合後架橋により調製され得る。非限定的な例として、架橋結合ポリマーミセルは、第１ポリマーと第２ポリマーとを架橋結合することにより形成することができ、第１ポリマーおよび第２ポリマーはそれぞれ、アミン（またはその他の）官能基を有する複数のモノマー残基を含み、（例えば、エピクロロヒドリンなどの架橋剤を用いて）かかる官能基を介して連結される。
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーまたはかかるポリマーのブロックの１つ以上は、ランダム共重合体またはランダム共重合体ブロックとすることができ、各場合において、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含む。好ましくは、第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも１つの少なくとも１つのブロックは、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である。特に、第１ポリマーの親水性ブロック、第１ポリマーの疎水性ブロック、第２ポリマーの親水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックから選択される少なくとも１つのブロックは、好ましくは、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体ブロックである。好ましくは、第１ポリマーの親水性ブロック、第１ポリマーの疎水性ブロック、第２ポリマーの親水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックから選択される少なくとも２つ、または少なくとも３つ、またはそれぞれのブロックは、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体ブロックである。好ましくは、第１ポリマーの第１ブロックは、２以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である。好ましくは、第１ポリマーの第２ブロックは、２以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である。好ましくは、第２ポリマーの第１ブロックは、２以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である。好ましくは、第２ポリマーの第２ブロックは、２以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である。
一般的に、単一のモノマー残基は、異なる官能性を有する複数の部分を含むことができ、例えば、疎水性種ならびに陰イオン性種を含むことができ、または例えば、疎水性種ならびに陽イオン性種を含むことができ、または例えば、陰イオン性種ならびに陽イオン性種を含むことができる。それ故、いくつかの態様において、ポリマーは、例えば、疎水性種および陰イオン性種（例えば、およそ中性のｐＨにおいて陰イオン性である種）を含む陰イオン性疎水性モノマー残基などのモノマー残基を含むポリマーであり得るか、またはかかるポリマーを含むことができる。
好ましいブロック共重合体
好ましくは、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーの１つ以上は、以下の式Iで表される２以上のブロックを含み得るか、または式Iで表される２以上のブロックから本質的に構成され得る、ブロック共重合体とすることができる：
Figure 2012500793
式中、
A0、A1、A2、A3およびA4は、それぞれ、-C-C-、-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)- および-O(C)bO-からなる群より選択され；
aは、１〜４の範囲の整数であり；
bは、２〜４の範囲の整数であり；
Y4は、水素、(1C-10C)アルキル、(3C-6C)シクロアルキル、O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、C(O)NR6(1C-10C)およびアリールからなる群より選択され、これらの何れかは、１または複数のフッ素基で任意に置換され；
Y0、Y1およびY2は、それぞれ独立に、共有結合、(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル-および-S(2C-10C)alkyl- -C(O)NR6(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され;
Y3は、共有結合、(1C-10C)アルキルおよび(6C-10C)アリールからなる群より選択され; R1-R5およびY0-Y4で完全には置換されていないA1-A4の四価の炭素原子は、適切な数の水素原子で完結しており；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、それぞれ独立に、水素、-CN、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらの何れかは、１または複数のフッ素原子で任意に置換されてもよく；
Q0は、生理学的ｐＨにおいて親水性であり、生理学的ｐＨにおいて少なくとも部分的に正に荷電する残基（例えば、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、ピリジル等）；生理学的ｐＨにおいて少なくとも部分的に負に荷電するが、より低いｐＨにおいてプロトン化を受ける残基（例えば、カルボキシル、スルホンアミド、ボロネート、ホスホネート、ホスフェート等）；生理学的ｐＨにおいて実質的に中性である（または荷電しない）残基（例えば、ヒドロキシ、ポリオキシル化アルキル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、チオール等）；生理学的ｐＨにおいて少なくとも部分的に両性イオン性である残基（例えば、生理学的ｐＨにおいてリン酸基およびアンモニウム基を含むモノマー残基）；結合可能または官能化可能な残基（例えば、アジド、アルキン、スクシンイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ピリジルジスルフィド等）；または水素からなる群より選択される残基であり；
Q1は、生理学的ｐＨにおいて親水性であり、生理学的ｐＨにおいて少なくとも部分的に正に荷電する残基（例えば、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、ピリジル等）；生理学的ｐＨにおいて少なくとも部分的に負に荷電するが、より低いｐＨにおいてプロトン化を受ける残基（例えば、カルボキシル、スルホンアミド、ボロネート、ホスホネート、ホスフェート等）；生理学的ｐＨにおいて実質的に中性である残基（例えば、ヒドロキシ、ポリオキシル化アルキル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、チオール等）；または生理学的ｐＨにおいて少なくとも部分的に両性イオン性である残基（例えば、生理学的ｐＨにおいてリン酸基およびアンモニウム基を含むモノマー残基）であり；
Q2は、生理学的ｐＨにおいて正に荷電する残基であり、限定するものではないが、アミノ、アルキルアミノ、アンモニウム、アルキルアンモニウム、グアニジン、イミダゾリル、およびピリジルが含まれ；
Q3は、生理学的ｐＨにおいて負に荷電するが、より低いｐＨにおいてプロトン化を受ける残基であり、限定するものではないが、カルボキシル、スルホンアミド、ボロネート、ホスホネート、およびホスフェートが含まれ；
mは、0〜1.0未満（例えば、0〜約0.49）の範囲の数であり；
nは、0より大きく1.0まで（例えば、約0.51〜約1.0）の範囲の数であり；
(m + n)の合計 = 1であり；
pは、約0.1〜約0.9 (例えば、約0.2〜約0.5)の範囲の数であり；
qは、約0.1〜約0.9 (例えば、約0.2〜約0.5)の範囲の数であり；
rは、0〜約0.8 (例えば、0〜約0.6)の範囲の数であり；
(p + q + r)の合計 = 1であり；
vは、約5〜約25 kDaの範囲であり；
wは、約5〜約50 kDaの範囲である。
いくつかの態様において、pおよびqで表されるモノマー残基の数または比は、互いに約30％、互いに約20％、または互いに約10％以内である。特定の態様において、pはqと実質的に同じである。ある態様において、少なくとも部分的に荷電するというのは、一般的に、微量より多い量の荷電した種を含むことをいい、例えば、少なくとも20％の残基が荷電し、少なくとも30％の残基が荷電し、少なくとも40％の残基が荷電し、少なくとも50％の残基が荷電し、少なくとも60％の残基が荷電し、または少なくとも70％の残基が荷電することを含む。
ある態様において、mは0であり、Q1は、生理学的pHにおいて親水性であり実質的に中性の（または荷電しない）残基である。いくつかの態様において、実質的に荷電していないというのは、例えば、5％未満が荷電し、3％未満が荷電し、または1％未満が荷電することを含む。ある態様において、mは0であり、Q1は、生理学的pHにおいて親水性であり少なくとも部分的に陽イオン性である残基である。ある態様において、mは0であり、Q1は、生理学的pHにおいて親水性であり少なくとも部分的に陰イオン性である残基である。ある態様において、m >0であり、n >0であり、Q0またはQ1の一方は、生理学的pHにおいて親水性であり少なくとも部分的に陽イオン性である残基であり、Q0またはQ1の他方は、生理学的pHにおいて親水性であり実質的に中性である残基である。ある態様において、m >0であり、n >0であり、Q0またはQ1の一方は、生理学的pHにおいて親水性であり少なくとも部分的に陰イオン性であり、Q0またはQ1の他方は、生理学的pHにおいて親水性であり実質的に中性である。ある態様において、m >0であり、n >0であり、Q1は、生理学的pHにおいて親水性であり少なくとも部分的に陽イオン性であり、Q0は、結合可能または官能化可能な残基である。ある態様において、m >0であり、n >0であり、Q1は、生理学的pHにおいて親水性であり実質的に中性であり、Q0は、結合可能または官能化可能な残基である。
好ましい態様において、異種性ポリマーミセルを構成するブロック共重合体の疎水性ブロックの１以上は、例えば、限定することなく、ブロック式１で表され、任意に１以上の対イオンを有するランダム共重合体ブロックであるポリマー鎖を含むことができる。
Figure 2012500793
ブロック式１の構成単位は、重合可能なモノマーであるN,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート (DMAEMA, またはここでは略号"D"とも表される)、プロピルアクリル酸 (PAA, またはここでは略号"P"とも表される)およびブチルメタクリレート (BMA, またはここでは略号"B"とも表される)に由来することができ、これらをそれぞれ以下に示す：
Figure 2012500793
ブロック式１により表されるポリマーブロックについて、p、qおよびrは、ポリマー鎖内の各構成単位のモル分率を表し、以下に示す値を有することができる。
異種性ポリマーミセルを構成する第１および第２ブロックの疎水性ブロックの１以上は、ブロック式１の鎖であり得るか、またはブロック式１の鎖を含むことができる。例えば、１つの態様において、第１および／または第２ポリマーは、膜破壊性ポリマーとしての式１の疎水性ブロックおよび１以上の付加的なブロックを含むブロック共重合体であり得る。かかるブロック共重合体は、例えば、以下の式１．１のポリマーにより表されるジブロック共重合体であり得る。
[A]v-[1]w １．１
式中、[A]は、第２ブロック（例えば、親水性ブロックまたは両親媒性ブロック）を意味し、文字vおよびwは、共重合体におけるそれぞれのブロックの独立に選択される分子量（数平均）を意味し、以下に示す値を有することができる。他の態様として、かかるブロック共重合体は、以下の式１．２のポリマーにより表されるトリブロック共重合体であり得る。
[A]v-[A']x-[1]w １．２
式中、[A]および[A']は、それぞれ、付加的なブロック（例えば、親水性ブロックまたは両親媒性ブロック）を意味し、文字v、xおよびwは、それぞれ、共重合体におけるそれぞれのブロックの独立に選択される分子量（数平均）を意味し、以下に示す値を有することができる。
好ましい非限定的な例において、異種性ポリマーミセルを構成する第１および／または第２ポリマーは、以下の式２として表される構造（適切な対イオンを有する）を有するブロックを含む２つ以上のブロックを有するブロック共重合体であり得る：
Figure 2012500793
化合物２の構成単位において、親水性ブロックは、重合可能なモノマーであるO-(C1-C6 アルキル)ポリエチレングリコール-メタクリレート (PEGMA) の重合に由来することができ、疎水性ブロックは、ポリマーブロック１に関して上述したように、重合可能なモノマーであるDMAEMA、PAA、およびBMAの共重合に由来することができる。文字p、qおよびrは、疎水性ブロック内の各構成単位のモル分率を意味し、以下に示す値を有することができる。文字vおよびwは、ブロック共重合体における各ブロックの分子量（数平均）を意味し、以下に示す値を有することができる。
好ましい異種性ポリマーミセルは、それぞれが親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含む２つ以上のブロックを有し、ブロック式３、４、５、６、７、８および９から選択される構造を有する、２つ以上の組成的に異なるブロック共重合体を含むことができる。
[DMAEMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ３
[PEGMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ４
[PEGMAm-/-DMAEMAn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ５
[PEGMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ６
[DMAEMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ７
[HPMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ８
[PEGMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ９
式中、Bは、ブチルメタクリレート残基であり;Pは、プロピルアクリル酸残基であり; D, DMAEMAは、それぞれジメチルアミノエチルメタクリレート残基であり; PEGMAは、ポリエチレングリコールメタクリレート残基であり（例えば、化合物２において例示される1〜20のエチレンオキシド単位、または4〜5のエチレンオキシド単位、または7〜8のエチレンオキシド単位を有する）; MAA(NHS)は、メチルアクリル酸-N-ヒドロキシスクシンイミド残基であり; HPMAは、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド残基であり; PDSMは、ピリジルジスルフィドメタクリレート残基である。
一般的に、ブロック式１、１．１、１．２および２〜９のブロックを含むブロック共重合体のそれぞれについて、m、n、p、q、r、w、xおよびvのそれぞれは、以下のとおりの数である：
pは、約0.1〜約0.9 (例えば、約0.2〜約0.5)の範囲の数であり;
qは、約0.1〜約0.9 (例えば、約0.2〜約0.5)の範囲の数であり;
rは、0〜約0.8 (例えば、0〜約0.6)の範囲の数であり;
(p + q + r)の合計 = 1であり;
vは、約5〜約25 kDaの範囲であり;
xは、約5〜約25 kDaの範囲であり;
wは、約5〜約50 kDaの範囲である。
いくつかの特定の態様において、上述した式においてw：vとして表される疎水性ブロックと親水性ブロックの数平均分子量の相対的な比は、約1:2〜約9:1、好ましくは約2:3〜約7:1、好ましくは約2:3〜約5:1、好ましくは約2:3〜約4:1、好ましくは約1:1〜約5:1、好ましくは約1:1〜約4:1、好ましくは約1:1〜約3:1の範囲であり、いくつかの態様において、約1:1〜約2:1である。
ブロック式１〜９のブロックを含む構成要素であるポリマーは、本発明に関する使用に適したポリマーの代表例である。構造的に関連したポリマー（例えば、分子量および／またはモノマー残基の比が変化したもの）を含む他のポリマーも使用することができる。いくつかの態様において、第１ブロック（示した通り）の構成単位は、中性 (例えば、PEGMA)、陽イオン性 (例えば、DMAEMA)、陰イオン性 (例えばPEGMA-NHSであり、NHSは酸またはアクリル酸に加水分解されている)、両性 (例えばDMAEMA-NHSであり、NHSは酸に加水分解されている)、または両性イオン性 (例えば、ポリ[2-メタクリロイルオキシ-2'トリメチルアンモニウムメチルホスフェート])であるか、またはこれらを含む第１ブロック（示した通り）をもたらすように制御される。いくつかの態様において、例えば [PEGMA-PDSM]-[B-P-D]などの、第１ブロック（示した通り）においてピリジルジスルフィド官能基を含むポリマーは、チオール化siRNAなどのチオール化生体分子薬剤と任意に反応させることにより、ポリマーsiRNA結合体を形成する。
重合
一般的に、本発明の異種性ポリマーミセルを構成するブロック共重合体は、いずれかの適切な方法で調製され得る。ここで提供されるポリマーを作製するために使用される適切な合成方法は、非限定的な例によると、陽イオン性、陰イオン性およびフリーラジカルの重合が含まれる。
好ましくは、上述のポリマーは、フリーラジカル重合により調製される。フリーラジカル重合プロセスが使用される場合、（i）モノマー、（ii）任意にコモノマー、および（iii）任意の源のフリーラジカルが、フリーラジカル重合をトリガーするために提供される。いくつかの態様において、高い温度に加熱することまたは光活性化することによりいくつかのモノマーは自己開始するため、フリーラジカルの源は任意である。ある場合において、重合混合物を形成した後、混合物を重合条件に供する。重合条件は、ここで述べるように、少なくとも１のモノマーが少なくとも１のポリマーの形成を引き起こす条件である。かかる条件は、任意に、いずれかの適切なレベルに変化され、非限定的な例として、温度、圧力、雰囲気、重合混合物中に使用される出発成分の割合および反応時間が含まれる。重合は、いずれかの適切な溶媒中で、例えば、溶液、分散、懸濁液、エマルジョンまたはバルクが含まれるいずれかの適切な様式で行われ得る。
いくつかの態様において、イニシエータが反応混合物中に存在する。ここに記載する重合プロセスにおいて有用である場合、いずれかの適切なイニシエータが任意に利用される。かかるイニシエータの非限定的な例には、１以上のアルキル過酸化物、置換アルキル過酸化物、アリール過酸化物、置換アリール過酸化物、アシル過酸化物、アルキルヒドロペルオキシド、置換アルキルヒドロペルオキシド、アリールヒドロペルオキシド、置換アリールヒドロペルオキシド、ヘテロアルキル過酸化物、置換へテロアルキル過酸化物、ヘテロアルキルヒドロペルオキシド、置換へテロアルキルヒドロペルオキシド、ヘテロアリール過酸化物、置換ヘテロアリール過酸化物、ヘテロアリールヒドロペルオキシド、置換ヘテロアリールヒドロペルオキシド、アルキル過酸エステル、置換アルキル過酸エステル、アリール過酸エステル、置換アリール過酸エステル、またはアゾ化合物が含まれる。特定の態様において、ベンゾイル過酸化物（BPO）および／またはＡＩＢＮがイニシエータとして使用される。
いくつかの態様において、重合は、制御された（リビング）ラジカル重合プロセスを用いてもたらされる。好ましい態様において、可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）アプローチが、エチレンモノマーからのポリマーの合成において使用される。RAFTは、フリーラジカル変性連鎖移動プロセスを含む。いくつかの態様において、ここで述べるポリマーを調製するためのRAFT法は、連鎖移動剤（CTA）を使用する。一般的に、ポリマーまたはポリマー鎖（例えば、ポリマーブロック）は、可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）剤の存在下における重合を含む方法により独立に誘導され得る。かかるRAFT剤は、一般的に式Y−RLを有することができ、式中のRLは脱離基であり、典型的に、相対的に弱い共有結合を介して連鎖移動部分であるＹと結合する。典型的に、Yは、ラジカル部分（例えば、反応開始条件下におけるイニシエータラジカル、またはラジカル重合条件下における生長（propagating）ポリマー鎖ラジカルPn・）から生成する、またはその存在下で生成するラジカル中間体部分-Y・-を形成することができる。
一般的に好ましい態様において、連鎖移動剤（CTA）は、チオカルボニルチオ部分を含むことができる。例えば、CTAは、活性化基Zおよび脱離基- RLと共有結合したチオカルボニルチオ部分-SC(=S)-を含むことができる。かかるCTAは、例えば、式RLSC(=S)Zを有する化合物により表され得る。
制御された（リビング）ラジカル重合において使用するための種々のかかるRAFT連鎖移動剤が既知であり、種々のキサンテート、ジチオカルバメート、ジオチオエステルおよびトリチオカルボナートが含まれる。例えば、参照により本願に組み込まれるMoad et al., The Chemistry of Radical Polymerization, 2d Ed., 第508〜514頁における表9.10〜9.18, Elsevier (2006)を参照されたい。多くの態様において、連鎖移動剤(CTA)は、マクロ分子連鎖移動剤(マクロ-CTA)であり得る。例えば、RAFT連鎖移動剤の連鎖移動部分Yは、ポリマー鎖Pnのω末端に組み込まれ、ポリマー化合物を含むマクロ-CTAを形成することができ、式Pn-Yで表される（かかる場合において、ポリマー鎖Pnは、マクロ分子連鎖移動剤の脱離基RLとして有効に機能することができる）。本発明の化合物に組み込まれる場合、-Yは、連鎖移動残基と呼ばれる。それ故、ラジカル重合に由来する本発明の化合物に関して、-Yは連鎖移動残基であり得る。連鎖移動残基は、連鎖重合条件下での制御された（リビング）ラジカル重合に由来することができる。かかる制御されたラジカル重合反応は、例えば、RAFT剤 (例えばY-RL)またはマクロ-CTA (例えばPn-Y)などの連鎖移動剤(CTA)の存在下で行うことができる。連鎖移動残基-Yは、典型的に、ポリマーのω末端（マクロCTA中に含まれる場合、鎖伸長部分のリビング末端とも称する）に共有結合する。連鎖移動剤-Yは、好ましくは、式-SC(=S)Zを有するチオカルボニルチオ部分であり得、式中のZは活性化基である。
連鎖移動残基Yを切断および／または誘導体化し、連鎖移動残基誘導体を形成するための種々のアプローチが既知である。例えば、参照により本願に組み込まれるMoad et al., The Chemistry of Radical Polymerization, 2d Ed., pp. 538 to 539, Elsevier (2006)を参照されたい。また、チオカルボニルチオ制御移動剤の切断について開示しているCharmotらに対する米国特許第6,619,409号も参照されたい。誘導体化された連鎖移動剤は、任意に連結部分を介して、ポリヌクレオチドなどの１つ以上の生体分子薬剤とポリマーを効率的に結合させるために使用することができる。
RAFT剤が好ましく使用されるが、他の制御された（リビング）ラジカル重合法も、本発明に関して適している。例えば、参照により本願に組み込まれるMoad et al., The Chemistry of Radical Polymerization, Elsevier (2006)を参照されたい。特に、原子移動ラジカル重合 (ATRP) および安定フリーラジカル重合 (SFRP)アプローチが適している。See Moad et al., Id.を参照されたい。
重合プロセスは、いずれかの適切な様式で、リビングモード（living mode）で行われ、非限定的な例として、原子移動ラジカル重合 (ATRP)、ニトロキシド媒介リビングフリーラジカル重合 (NMP)、開環重合 (ROP)、デジェネレイティブ移動 (退化的移動；DT)、または可逆的付加開裂連鎖移動 (RAFT)が挙げられる。通常のおよび／またはリビング／制御された重合法を使用する場合、限定するものではないが、ブロック共重合体、グラフト共重合体、星状共重合体およびグラジエント共重合体などの種々のポリマーアーキテクチャー（architecture）が作られ、それにより、モノマー単位は、鎖中に統計学的に分布するか、または勾配の様式で分布し、あるいはブロック配列もしくはペンダントグラフト（pendant graft）でホモ重合する。
一般的に、構成要素であるポリマーまたはそのブロックは、低い多分散性指数（ＰＤＩ）を有するか、または鎖長が異なる。多分散性指数（ＰＤＩ）は、例えばポリマー鎖の重量平均分子量をその数平均分子量で割ることにより、いずれかの適切な様式で決定することができる。１に近い多分散性の値は、ラジカルリビング重合を用いて達成可能である。分子量および多分散性を決定する方法は、例えば、限定するものではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱法、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化クロマトグラフィーおよびエレクトロスプレーマスクロマトグラフィーが、当該分野で周知である。いくつかの態様において、ここで提供されるポリマー化合物のブロック共重合体は、２．０未満、または１．５未満、または１．４未満、または１．３未満、または１．２未満の多分散指数（ＰＤＩ）を有する。
一般的に、ここに記載する重合プロセスは、任意に、いずれかの適切な溶媒またはその混合物において生じる。適切な溶媒には、水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、アセトニトリル、ヘキサメチルホスホラミド、酢酸、ギ酸、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジオキサン、メチレンクロリド、エーテル（例えばジエチルエーテル）、クロロホルム、および酢酸エチルが含まれる。１つの側面において、溶媒には、水、および水とＤＭＦなどの水混和性有機溶媒との混合物が含まれる。
一般的に、ここに記載する重合プロセスは、重合反応に対して効果的な温度で行うことができる。温度は、他の反応条件に基づいて、およびそれを考慮して変化させることができ、他の反応条件には、例えば、溶媒、重合（または共重合）させるモノマー（またはコモノマー）、連鎖移動剤、熱移動（発熱制御）、反応動力学、および反応熱力学に関する選択を含むが含まれる。典型的な温度範囲には、一般的に、約2℃〜約200℃、好ましくは約20℃〜約110℃、いくつかの態様において約40℃〜約90℃、または約50℃〜約80℃の温度範囲を含むことができる。
一般的に、ここに記載する重合プロセスは、重合反応に対して効果的な圧力で行うことができる。一般的に、反応圧力は厳密に重要ではなく、約1 atm以上（例えば、1 atm〜約10 atmの範囲）またはより低い圧力（例えば1 atm未満）の外界圧力であり得る。
一般的に、ここに記載する重合プロセスは、重合反応に対して効果的な反応雰囲気下で行うことができる。例えば、重合は、不活性ガス雰囲気下（例えば、Ar、N2）または周囲大気下で行うことができる。
一般的に、ここに記載する重合プロセスは、連鎖移動剤（リビング連鎖移動部分または基）およびモノマーを重合反応に対して効果的な種々のモル比で使用して行うことができる。例えば、重合は、連鎖移動剤（基）とモノマーのモル比を、約1:1〜約1:10,000、好ましくは約1:5〜約1:5000、および最も好ましくは約1:10〜約1:2000の範囲にして行うことができる。いくつかの態様において、前記モル比は、約1:10〜約1:1500の範囲であり得る。
一般的に、ここに記載する重合プロセスは、溶媒中のモノマー濃度を、約5重量％〜約95重量％、好ましくは約10重量％〜約90重量％固体、およびいくつかの態様において約20重量％〜約80重量％固体（各場合において、溶液の全重量に対する値である）にして行うことができる。
一般的に、ここに記載する重合プロセスは、重合反応に対して効果的な種々のモル比で連鎖移動剤（リビング連鎖移動部分または基）およびイニシエータを使用して行うことができる。例えば、重合は、連鎖移動剤（基）とイニシエータのモル比を、約1:2〜約50:1、好ましくは約1:1〜約40:1、いくつかの態様において約2:1〜約30:1の範囲にして行うことができる。
一般的に、ここに記載する重合プロセスは、重合反応に対して効果的な種々の反応時間で行うことができる。例えば、重合は、約0.5時間〜約96時間、好ましくは約1時間〜約72時間、より好ましくは約1時間〜約36時間、いくつかの態様において約2時間〜約24時間、または約3時間〜約12時間の範囲の反応時間にわたって行うことができる。
一般的に、上記条件および当該分野で既知の他の因子は、目的の重合反応をもたらすように使用することができる。一般的に、例えば、参照として本願に組み込まれるMoad et al., The Chemistry of Radical Polymerization, 2d Ed., Elsevier (2006)を参照されたい。
ポリヌクレオチド含有組成物
一般的に、ポリヌクレオチド含有組成物は、異種性ポリマーミセルおよび該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含むことができる。
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーの１つ以上、またはかかるポリマーのある種のブロックは、ポリヌクレオチドと結合させることができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ポリマーの１つ以上と非共有結合性に（例えば、イオン性に）結合するか、または共有結合性の連結部分を介して結合し、好ましくは、第１および／または第２ポリマーの親水性ブロックを介して結合する。
ポリヌクレオチドなどの薬剤は、異種性ポリマーミセルを構成する第１および第２ポリマーの少なくとも１つと非共有結合させることができる。非共有結合には、静電気的相互作用（イオン結合）、疎水性相互作用、親和性相互作用、またはこれらの組み合わせが含まれる。ある態様において、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーおよび／または薬剤に、かかる非共有結合の相互作用に影響を及ぼし得る化学的部分を提供することができる。例えば、構成要素であるポリマーは、ポリヌクレオチドなどの負に荷電した薬剤とイオン結合するために、陽イオン性のモノマー残基を含むことができる。例えば、構成要素であるポリマーは、細胞内にデリバーされるべき薬剤に対して親和性を有し、または例えば、薬剤に共有結合する結合対の構成要素（例えば、エピトープ）に対する親和性を有する、結合対の別の構成要素である種を有するモノマー残基を含むか、または結合対の別の構成要素（例えば、抗体）と（例えば、結合可能なペンダント部分を介して）共有結合する種を有するモノマー残基を含むことができる。結合対は既知であり、アリールボロン酸−サリチルヒドロキサム酸、ロイシンジッパーまたは他のペプチドモチーフ等のものが含まれ得る。構成要素であるポリマー／薬剤において正電荷／負電荷の間のイオン性相互作用を生じさせるための部分（例えば、重合可能なモノマー）も既知であり、ここではポリマーの節と関連して論じる。他のタイプの非共有結合性の化学結合は、同様に当該分野で既知である。さらに、いくつかの態様において、二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリマーまたは異種性ポリマーミセルと結合し、例えば複合体を形成する。いくつかの態様において、ポリマーまたは異種性ポリマーミセルは、異種性ポリマーミセルの構成要素（例えばポリマー）と結合（例えば、共有結合）した副溝結合剤または插入剤を介して、核酸と結合する（例えば、複合体を形成する）。
例えば１つのアプローチにおいて、ポリヌクレオチドは、イオン性相互作用を介して構成要素であるポリマーの１つ以上またはそのブロックと結合させることができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、異種性ミセルのコアを規定する疎水性ブロック以外のブロックと結合する。図１Ｃを参照すると、例えば、異種性ポリマーミセルＭ７は、第１ポリマーＰ１と第１ポリマーとは組成的に異なる第２ポリマーＰ２を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含む。第１ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。親水性ブロックは、ポリヌクレオチドとイオン結合した複数の陽イオン性モノマー残基を含む。第２ポリマーは、親水性ブロックと疎水性ブロックを含むブロック共重合体であり、第２ポリマーの疎水性ブロックは第１ポリマーの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセル（例えば、ｐＨ７．４の水性媒体中で）を形成する。この態様において、好ましくは、第１ポリマーの親水性ブロックまたは疎水性ブロックの少なくとも１つ、および付加的にまたは代わりに、第２ポリマーの親水性ブロックまたは疎水性ブロックの少なくとも１つは、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体ブロックである。
このイオン結合アプローチにおいて、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、好ましくは、複数の陽イオン性モノマー残基、好ましくは陽イオン性親水性モノマー残基をさらに含むことができる。陽イオン性モノマー残基は、特に、親水性ブロックに関して一般的に記載したように選択することができる。非限定的な例として、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーは、例えば以下のブロック式３で表され、膜不安定化ブロックと陽イオン性親水性ブロックを含むブロック共重合体を含むことができる。
[DMAEMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ３
これについては、好ましいポリマーに向けられた節において、既により詳細に記載されている。
このイオン結合アプローチのいくつかの別の態様において、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、複数の陽イオン性モノマー残基および複数の中性（荷電していない）モノマー残基を含むことができる。かかる態様において、例えば、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、好ましくは、電荷の調節（例えば、電荷希釈）をされてもよく、実質的に、全電荷において全体的に陽イオン性になる。非限定的な例として、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーは、親水性ブロックおよび膜不安定化疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含むことができ、親水性ブロックは、中性親水性モノマー残基および陽イオン性親水性モノマー残基を含み、例えば以下のブロック式５で表される。
[PEGMAm-/-DMAEMAn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ５
これについては、好ましいポリマーに向けられた節において、既により詳細に記載されている。
ポリヌクレオチドのイオン結合ならびに電荷の調節の両方を達成するための別のアプローチにおいて、荷電していない中性の「電荷希釈」は、第２ポリマーの親水性ブロックにおいて達成される。非限定的な例として、第１ポリマーは、陽イオン性親水性ブロックおよび膜不安定化疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含むことができ、例えば以下のブロック式３で表され、親水性ブロックは、陽イオン性親水性モノマー残基を含む。第２ポリマーは、中性親水性ブロックおよび膜不安定化疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含むことができ、例えば以下のブロック式４で表され、親水性ブロックは、中性親水性モノマー残基を含む。
[DMAEMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ３
[PEGMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ４
これらそれぞれについては、好ましいポリマーに向けられた節において、既により詳細に記載されている。
一般的に、薬剤がポリヌクレオチドである態様において、組成物は、異種性ポリマーミセルおよびイオン性相互作用を介してミセルに結合したポリヌクレオチドを含むことができる。異種性ポリマーミセルとポリヌクレオチド剤（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNA）の間の結合（例えば、複合体形成）は、構成要素であるポリマー（例えば、ポリマーにおける全体的な電荷または電荷密度）とポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドにおける全体的な電荷または電荷密度）の種々の望ましい電荷比で達成することができ、例えば、1：2〜32：1の範囲、好ましくは1：1〜16：1の範囲の電荷比が含まれる。特定の態様において、異種性ポリマーミセルとポリヌクレオチド（例えば、siRNA）の間の複合体は、2:1〜8:1の範囲、または3:1〜6:1の電荷比を含むことができ、いくつかの態様においては、約4:1の電荷比であり得る。それ故、好ましい態様において、異種性ポリマーミセルの外殻領域に存在する陽イオン性電荷の数と細胞にデリバーされるべき薬剤（例えば、ポリヌクレオチド剤）に存在する陰イオン性電荷の数の比は、約1:2〜約32:1、約1:1〜約16:1、約2:1〜約8:1、約3:1〜約6:1の範囲とすることができ、いくつかの場合において、約4:1〜約12:1、約2:1〜約4:1の範囲、または約8:1であり得る。いくつかの態様において、陰イオン性薬剤（例えば、ポリヌクレオチド）は、異種性ポリマーミセルを形成するブロック共重合体のポリカチオンブロックにより電荷が中和されてもよい。例えば、いくつかの非限定的な例において、生理学的pHにおいて約40の負電荷を含む20塩基対のポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNA）は、陽イオン性親水性ブロック（例えば、ポリDMAEMA, 約80モノマー単位長, MW=11,680, 約7.4のpKa）を含む異種性ポリマーミセル（例えば、ミセル）と結合（例えば、複合体形成）することができる。このpHにおいて、ポリDMAEMAは、約40の負電荷を含み、その結果として、全体の電荷が実質的に正味中性であるポリヌクレオチド−外殻ブロック結合（例えば、複合体形成）が生じる。ある場合において、多数の過剰な正電荷を避けることは、インビトロおよびインビボでの毒性を低減する助けとなる。いくつかの態様において、治療剤、（例えば、オリゴヌクレオチドまたはsiRNA）は、ここで提供される異種性ポリマーミセル（例えば、ミセル）の正に荷電した外殻と自発的に結合する。
あるいは、ポリヌクレオチドなどの薬剤は、異種性ポリマーミセルと共有結合させることができる。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドなどの薬剤は、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーまたはそのブロックに化学的に結合する。薬剤は、ポリマーの側鎖またはポリマーの末端（例えば、α末端またはω末端）に対する結合ペンダントであってもよく、各場合において、例えば、ポリマー残基（制御剤または他の重合試薬の残基を含む）の結合可能部分（conjugatable moiety）を介して、および各場合において任意に、連結部分（linking moiety）を介して結合する。
一般的に、ポリヌクレオチドの結合を達成するための特定のアプローチは、厳密に重要ではない。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドなどの薬剤は、既に形成された異種性ポリマーミセルに結合させることができる。あるいは、ポリヌクレオチドなどの薬剤は、異種性ポリマーミセルが形成される前に構成要素であるポリマーに結合させることができる。構成要素であるポリマーと薬剤の間の共有結合は、開裂可能であっても開裂可能でなくてもよい。開裂可能な結合には、例えば、ジスルフィド結合（例えば、細胞質の還元環境において開裂するジスルフィド結合）を含むことができる。適切な化学的結合方法には、限定するものではないが、アミン-カルボキシルリンカー、アミン-スルフヒドリルリンカー、アミン-糖リンカー、アミン-ヒドロキシルリンカー、アミン-アミンリンカー、カルボキシル-スルフヒドリルリンカー、カルボキシル-糖リンカー、カルボキシル-ヒドロキシルリンカー、カルボキシル-カルボキシルリンカー、スルフヒドリル-糖リンカー、スルフヒドリル-ヒドロキシルリンカー、スルフヒドリル-スルフヒドリルリンカー、糖-ヒドロキシルリンカー、糖-糖リンカー、およびヒドロキシル-ヒドロキシルリンカーを含むことができる。いくつかの態様において、結合は、pH感受性の結合およびリンカーを用いて行われ、限定するものではないが、ヒドラゾンおよびアセタール結合が含まれる。種々の他の結合化学が利用可能である（例えば、Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998およびその中の章を参照されたい)。
ポリヌクレオチドは、共有結合を介して、任意に連結部分を介して、構成要素であるポリマーの１以上と結合させることができる。共有結合は、例えば、結合可能な種（すなわち、反応性の官能基部分）を有するモノマー残基を介して行うことができる。再び図１Ｃを参照すると、例えば、異種性ポリマーミセルM10は、第１ポリマーP1、および第１ポリマーP1とは組成的に異なる第２ポリマーP2を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含む。第１ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。ポリヌクレオチドは、好ましくは親水性ブロックのモノマー残基のペンダント部分を介して、第１ポリマーの親水性ブロックに共有結合し、その結果としてポリマーバイオ結合体（polymer bioconjugate）を形成する。第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ブロックの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセルを形成する（例えば、pH 7.4の水性媒体において）。
かかるアプローチについて一般的に、第１ポリマーは、ポリヌクレオチドの3’端、あるいはポリヌクレオチドの5’端に共有結合する。
かかるアプローチについて一般的に、ポリヌクレオチドは、連結部分を介して、ポリマーミセルまたはそれを構成するポリマーに結合させることができる。連結部分は、以下により詳細に説明するが、一般的に、共有結合、または２以上の官能基を含む多官能部分に由来する部分を含むことができる。連結部分は、pH感受性の不安定な部分であり得る。連結部分は、好ましくは、血清pHで安定であり、エンドソームpHにおいて酸に不安定である。連結部分は、ジスルフィドであり得る。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、好ましくは親水性ブロックのモノマー残基のペンダント部分を介して、第１ポリマーの親水性ブロックに共有結合する。第１ポリマーは、例えば以下のブロック式６、７、８または９の１つ（以上）により表され、親水性ブロックおよび膜不安定化疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含むことができ、親水性ブロックは、結合可能部分を有するモノマー残基を含む。第２ポリマーは、中性親水性ブロックおよび膜不安定化疎水性ブロックを含むブロック共重合体を含むことができ、例えば以下のブロック式４で表され、親水性ブロックは、中性親水性モノマー残基を含む。
[PEGMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ４
[PEGMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ６
[DMAEMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ７
[HPMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ８
[PEGMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w ９
これらそれぞれについては、好ましいポリマーに向けられた節において、既により詳細に記載されている。
さらなるアプローチにおいて、ポリヌクレオチドは、ポリマーの１つの末端に対する共有結合により、異種性ポリマーミセルと結合させることができ、かかるポリヌクレオチドが、疎水性ブロックを含む末端結合ポリマーの親水性ブロックを本質的に構成し、かかる親水性ブロックを規定することを可能にする。図１Ｃをさらに参照すると、例えば、異種性ポリマーミセルM8は、第１ポリマーP1、および第１ポリマーP1とは組成的に異なる第２ポリマーP2を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含む。第１ポリマーは、連結部分を介して疎水性部分の末端に共有結合したポリヌクレオチドを含むブロック共重合体であり、ポリヌクレオチドは、本質的に親水性ブロックを規定する。第２ポリマーは、第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセルを形成する（例えば、pH 7.4の水性媒体において）。
再び図１Ｃを参照すると、例えば、異種性ポリマーミセルM9は、第１ポリマーP1、および第１ポリマーP1とは組成的に異なる第２ポリマーP2を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含む。第１ポリマーは、疎水性ブロックおよび親水性ブロックを含むブロック共重合体であり、連結部分を介して親水性ブロックの末端に共有結合したポリヌクレオチドを有し、ポリヌクレオチドと親水性ブロックが一緒になって、本質的に親水性ブロックとなり得るか、または親水性ブロックを規定してもよい。第２ポリマーは、第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセルを形成する（例えば、pH 7.4の水性媒体において）。
かかるアプローチについて一般的に、第１ポリマーは、ポリヌクレオチドの3’端、あるいはポリヌクレオチドの5’端に共有結合する。
かかるアプローチについて一般的に、ポリヌクレオチドは、連結部分を介して、ポリマーミセルまたはそれを構成するポリマーに結合させることができる。連結部分は、以下により詳細に説明するが、一般的に、共有結合、または２以上の官能基を含む多官能部分に由来する部分を含むことができる。連結部分は、pH感受性の不安定部分であり得る。連結部分は、好ましくは、血清pHで安定であり、エンドソームpHにおいて酸に不安定である。連結部分は、ジスルフィドであり得る。
ポリヌクレオチドと異種性ポリマーミセルを構成するポリマーとの結合に関する態様において、１つの例示的なアプローチは、以下のステップを含むプロセスを含むことができる：（１）いずれかの適切な活性化試薬（非限定的な例は、1-エチル-3,3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド (EDAC)、N-ヒドロスクシンイミド (NHS) およびジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC)、HOBt (1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、p-ニトロフェニルクロロホルメート、カルボニルジイミダゾール (CDI)、およびN,N'-ジスクシンイミジルカルボナート (DSC)）を使用して、オリドヌクレオチドの修飾可能な末端基（例えば、5'-または3'-ヒドロキシル)を活性化することと、（２）ブロックコポリマーとオリゴヌクレオチドの末端を共有結合させること。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの5’端または3'端の修飾可能な基は、ブロック共重合体との結合前に、他の官能基で置換される。例えば、ヒドロキシル基 (--OH) は、スルフヒドリル基(--SH)、カルボキシル基(--COOH)、アミン基(--NH2)を有するリンカーで任意に置換される。別の代表的なアプローチにおいて、１以上の塩基に導入された官能基を含むオリゴヌクレオチド（例えば、5-アミノアルキルピリミジン）は、ユニマーであるか、または異種性ポリマーミセル中に存在する構成要素であるポリマー（例えば、ブロック共重合体）に結合させることができ、ここではいずれかの適切な方法により、活性化剤または反応性の二官能性リンカー（bifunctional linker）を用いて提供される。種々のかかる活性化剤および二官能性リンカーは、シグマ、ピアス、インビトロゲン等の供給業者から商業的に入手可能である。
一般的に、上述したポリヌクレオチド含有組成物のそれぞれは、遮蔽部分または種（shielding moiety or species）を有する１以上のポリマーをさらに含むことができる。例えば、異種性ポリマーミセルおよびミセルに結合したポリヌクレオチドは、以下の節でより詳細に説明するように、遮蔽種を有する複数のモノマー残基を含むことができる。
一般的に、上述したポリヌクレオチド含有組成物のそれぞれは、ターゲティング部分または種を有する１以上のポリマーをさらに含むことができる。例えば、異種性ポリマーミセルおよびミセルに結合したポリヌクレオチドは、以下の節でより詳細に説明するように、ターゲティング部分（例えば、ターゲティングリガンド）に共有結合するための結合可能な種を有する複数のモノマー残基を含むことができる。
好都合に、異種性ポリマーミセルは、（i）制御可能に変化する（調整可能な）ブロック共重合体組成（例えば、第１ポリマーと第２ポリマーまたは例えばその親水性ブロックなどのそれらのブロックを比較した場合）、（ii）制御可能に変化する（調整可能な）親水性ブロックと疎水性ブロックの相対分子量比（例えば、第１ポリマーと第２ポリマーを比較した場合）、および派生的に、制御可能に変化する（調整可能な）相対的なブロック分子量（例えば、２つ以上のポリマーの対応するブロックの間で比較した場合の親水性ブロック長）、（iii）制御可能に変化する（調整可能な）ポリマーの全分子量（例えば、２つ以上のポリマーの間で比較した場合、変化した相対的な全体鎖長を生じる）、ならびに（iv）第１ブロック共重合体と第２ブロック共重合体および／または付加的な（ブロック共）重合体の量（すなわち、モル）の相対的な比を有すると理解され得る。かかる制御された可変性は、例えば、ミセル特性（例えば、集合数（aggregation number）、粒子サイズ、表面電化、溶解性等）の最適化、および望ましい機能（例えば、遮蔽の最適化、および／またはターゲティングの最適化、および／または（低減された）毒性プロフィールの最適化、および／または薬物動態学的特性の最適化、および／または（望ましい）生体分布プロフィールの最適化等）を提供するために使用することができる。かかるパラメータなどは、ポリヌクレオチド（例えばsiRNA）などの薬剤をデリバーするためのポリマーミセルデリバリー媒体としての、治療その他の目的に対する効果的な使用のために重要であり得る。
一般的に、例えば、第１ブロック共重合体と第２ブロック共重合体の種々の選択された比が、異種性ポリマーミセルにおいて実行され得る。例えば、第１ポリマーと第２ポリマーの相対的な比は、かかるポリマーの組成における変化と組み合わせて、ミセルにおける所望の化学的特性または物理的特性の設定を達成するために、制御可能に変化させることができる。非限定的な例として、異種性（混合）ポリマーミセルは、例えば膜不安定化ブロックなどの、組成的に異なる親水性ブロックを有し、それぞれが実質的に同じ疎水性ブロックを有する２つ以上のブロック共重合体から形成することができる。例えば、特に、第１ブロック共重合体は、本質的に陽イオン性親水性モノマー残基（例えば、DMAEMA）からなる親水性ブロックを有することができ、第２ブロック共重合体は、本質的に中性親水性モノマー残基（例えば、PEGMA）からなる親水性ブロックを有することができる。かかる第１および第２ポリマーは、種々の所望のモル比（例えば、2：1、1：1．1：2）で混合され、対応する相対的な陽イオン性電荷を有する親水性外殻を有する異種性ポリマーミセルを形成することができる。この例において、電荷は、ミセルの陽イオン性外殻ブロック対中性外殻ブロックの相対量を変化させることにより調節される。
一般的に、限定することなく、所定の第１ポリマー重合体または第２ブロック共重合体内のブロックの相対分子量、モノマー単位の数、およびブロックの組成を変化させることにより、ミセルの安定性および生物学的機能性が達成され得る。
いくつかの態様において、一般的に、実質的に同じ疎水性ブロック（例えば、膜不安定化疎水性ブロック）および組成的に異なる親水性ブロック（例えば、１つ（一連）の機能的性質または属性をもたらすモノマー単位を含む１つの親水性ブロックと、別の（一連の）（同じ、付加的な、または異なる、直行性に相補的な）機能的性質または属性をもたらすモノマー単位を含む別の親水性ブロック）を有する２つのブロック共重合体を含有する混合ミセルを調製することが好ましい。例えば、（例えば、第１ポリマーの）１つの親水性ブロックは、ポリヌクレオチド結合（例えば、共有結合またはイオン結合）をもたらすことができ、（例えば、第２ポリマーの）他の親水性ブロックは、遮蔽および／またはターゲティングまたは他の機能をもたらすことができる。
図１Ｆを参照すると、一般的な例として、好ましいポリヌクレオチド含有組成物は、異種性ポリマーミセル(例えば、M7G、M7H、M7I、M10G、M10H、およびM10I)ならびにそれに結合したポリヌクレオチドを含むことができる。かかるミセルのそれぞれは、第１ポリマーP1および第１ポリマーP1とは組成的に異なる第２ポリマーP2を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含むことができる。第１ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロック（例えば、膜不安定化疎水性ブロック）を含むブロック共重合体である。ポリヌクレオチドは、（例えば、イオン結合を介して(M7G、M7H、M7I)または共有結合性のペンダント結合を介して (M10G 、M10H、M10I))第１ポリマーの親水性ブロックと結合する。第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロック（例えば、膜不安定化疎水性ブロック）を含むブロック共重合体である。第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセルを形成する（例えば、pH 7.4の水性媒体において)。
示した種々の態様の中で、第１ポリマーP1および第２ポリマーP2の親水性ブロックは、ポリヌクレオチド結合、遮蔽、および／またはターゲティング機能を提供することができる。
ポリヌクレオチドのイオン結合を含む態様において(M7G, M7H,M7I)、第１ポリマーP1の親水性ブロックは、ポリヌクレオチドとのイオン結合のための複数の陽イオン性モノマー残基を含むことができる。遮蔽は、例えば、第２ポリマーの親水性ブロックを介して (M7G, M7H , M7I)および／または第１ポリマーの親水性ブロックを介して (M7I)提供されてもよく、例えば、かかる親水性ブロックは、遮蔽オリゴマーまたはポリマーを含むペンダント基などの遮蔽剤Sを有するモノマー残基を含む。ターゲティングは、例えば、第２ポリマーの親水性ブロックを介して(M7H)および／または第３ポリマーP3の親水性ブロックを介して(M7I)提供されてもよく、例えば、かかる親水性ブロックは、例えばエンドサイトーシスを媒介するためのリガンドなどの、ターゲティング剤Tと共有結合するための結合可能な種を有するモノマー残基を含む。
ポリヌクレオチドの共有結合を含む態様において (M10G, M10H,M10I)、第１ポリマーP1の親水性ブロックは、連結部分Lを介してポリヌクレオチドと共有結合するための結合可能な種を有する複数のモノマー残基を含むことができる。遮蔽は、例えば、第２ポリマーの親水性ブロックを介して(M10G, M10H,M10I) および／または第１ポリマーの親水性ブロックを介して (M10G, M10H,M10I)提供されてもよく、例えば、かかる親水性ブロックは、遮蔽オリゴマーまたはポリマーを含むペンダント基などの遮蔽剤Sを有するモノマー残基を含む。ターゲティングは、例えば、第２ポリマーの親水性ブロックを介して(M10H)および／または第３ポリマーP3の親水性ブロックを介して(M10I)提供されてもよく、例えば、かかる親水性ブロックは、例えばエンドサイトーシスを媒介するためのリガンドなどの、ターゲティング剤Tと共有結合するための結合可能な種を有するモノマー残基を含む。
対象となる適用のための種々の所望の機能的特性および属性を統合するために、多くの他の置換えを実現することができる。上述の態様は、例示的であり、具体的にクレームされる範囲を除いて、本発明の範囲を限定するものではない。
ポリヌクレオチド
本発明の好ましい組成物は、異種性ポリマーミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドを含む。一般的に、ポリヌクレオチドは、ポリ核酸であり得る。ある態様において、ポリヌクレオチドは、治療（予防を含む）用薬剤、診断用薬剤またはリサーチ用試薬であり得る。
好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド、遺伝子発現モジュレータ、ノックダウン剤、siRNA、RNAi剤、ダイサー基質（dicer substrate）、miRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアプタマーであり得る。他の特定の態様において、治療用薬剤は、aiRNA (Asymmetric RNA duplexes mediate RNA interference in mammalian cells. Xiangao Sun, Harry A Rogoff , Chiang J Li Nature Biotechnology 26, 1379 - 1382 (2008))である。
ポリヌクレオチドは、核酸ポリマーである。ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、約7〜約200のヌクレオチドモノマー単位を含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖核酸ポリマーならびに二本鎖核酸ポリマー、またはより高次の（例えば、三本鎖）核酸ポリマーを含むことができる。ポリヌクレオチドは、リボ核酸（RNA）ポリマーであり得る。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（DNA）ポリマーであり得る。
ここで言及する場合、ポリヌクレオチド（または関連する用語である「ヌクレオチド」、「核酸」、「DNA」、「RNA」および／または同様の用語）には、例えば、修飾された骨格を有する核酸ポリマーのアナログなどの核酸アナログが含まれ、限定するものではないが、ペプチド核酸(PNA)、ロックされた（locked）核酸 (LNA)、ホスホノ-PNA、モルフォリノ核酸、または修飾されたリン酸基(例えば、ホスホロチオエート、ホスホネート、5'-N-ホスホラミダイト結合) を有する核酸が含まれる。
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドモノマー単位の（例えば、段階的な）結合に由来する複数の残基を含むことができる。ヌクレオチドモノマー単位は、リン酸化ヌクレオシドである。ヌクレオシドは、単糖（例えば、ペントース、ヘキソース）ならびに塩基、単糖ミメティック（monosaccharide mimetics）および単糖アナログを含むことができ、単糖アナログには、例えば、ヒドロキシル基をハロゲン、メトキシ、水素もしくはアミノ基で置換することにより、あるいは付加的なヒドロキシル基をエステル化することにより修飾された単糖が含まれる。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、天然のヌクレオシドリン酸塩（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジンリン酸塩）であるか、またはこれらを含む。いくつかの態様において、塩基には、種々の核酸中に天然に存在するいずれかの塩基、ならびにかかる天然に存在する塩基の類似体、および/またはかかる天然に存在する塩基に類似の、または構造的および／または機能的に類似の他の修飾物が含まれる。修飾された塩基または誘導体化された塩基の非限定的な例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキュエオシン（queosine）、イノシン（inosine）、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキュエオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メトキシチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、2-アミノアデニン、ピロロピリミジン、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。ヌクレオシド塩基には、ジフルオロトリル、ニトロインドリル、ニトロピロリル、またはニトロイミダゾリルなどの一般的な核酸塩基も含まれる。ヌクレオチドには、標識を有する、または脱塩基を含む（すなわち塩基を欠いている）モノマーであるヌクレオチドも含まれる。核酸配列は、特に示さない限り、5’から3’の方向に表される。
RNA干渉（RNAi）は、実質的にターゲティングRNAと相補的な部分も含む少なくとも部分的に二本鎖のRNAにより媒介される、遺伝子発現の配列特異的な阻害および／またはターゲティングメッセンジャーRNA（mRNA）およびタンパク質のレベルの減少を意味する。干渉RNA剤またはRNAi剤は、RNAiメカニズムを介して遺伝子発現の阻害を媒介するオリゴヌクレオチドを意味し、限定するものではないが、siRNA、ミクロRNA (miRNA)、短ヘアピンRNA (short hairpin RNA; shRNA)、非対称干渉RNA (asymmetrical interfering RNA; aiRNA)、ダイサー基質およびこれらの前駆体が含まれる。
短干渉RNA（short interfering RNA; siRNA）は、約15〜50塩基対の長さであり、任意に、0〜2の一本鎖の突出部分をさらに含むヌクレオチド二本鎖を意味する。siRNAの１つの鎖には、相補的な様式でターゲティングRNAとハイブリダイズする部分が含まれる。いくつかの態様において、siRNAとターゲティングRNAのターゲティング部分との間の１つ以上のミスマッチが存在してもよい。いくつかの態様において、siRNAは、ターゲティング転写物の分解を引き起こすことにより、遺伝子発現の阻害を媒介する。
一般的に、ヌクレオチドは、天然の供給源から得られてもよいし、組換え発現系を用いて作製され、任意に精製されてもよいし、化学的に合成されるなどしてもよい。
特定のポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド含有組成物に対する特定の適用については、以下の生体分子薬剤および治療的使用に一般的に向けられた節において、より詳細に説明する。
遮蔽剤
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマー、またはかかるポリマーの１つ以上は、１つ以上の遮蔽剤および／または可溶化剤を含むことができる。遮蔽剤は、ポリマー鎖の安定性を改善するのに有効であってもよいし、治療用薬剤（例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド等）の立体遮蔽に対して有効であってもよい。遮蔽剤は、血漿における酵素消化に対する治療用薬剤（例えば、ポリヌクレオチドまたはペプチド等）の安定性の向上に対して有効であってもよい。遮蔽剤は、ある種の組成物（例えば、ポリヌクレオチドを含む組成物）の毒性を低減するのに有効であってもよい。いくつかの態様において、遮蔽剤は、複数の中性親水性モノマー残基を含むポリマーであり得る。遮蔽ポリマーは、ポリマーの末端基を介して、またはポリマーの１つ以上のモノマー残基のペンダント官能基を介して、膜不安定化ブロックコポリマーに共有結合させることができる。いくつかの態様において、ポリマー鎖の複数のモノマー残基は、遮蔽種；好ましくは、（遮蔽モノマー残基が由来する）重合可能なモノマーに由来するペンダント部分である遮蔽種を有することができる。例えば、ポリマーは、遮蔽オリゴマーを含むペンダント基を有する複数のモノマー残基を含むことができる。
好ましい遮蔽／可溶化ポリマーは、ポリエチレングリコール（PEG）オリゴマー（例えば、20以下の繰り返し単位を有する）またはポリマー（例えば、20より多い繰り返し単位を有する）であり得る。ある態様において、ブロック共重合体の１つのブロックは、例えば、共重合体の膜不安定化ブロックのα末端またはω末端に共有結合した、ポリエチレングリコール（PEG）オリゴマーまたはポリマーであり得るか、またはそれを含むことができる。別の態様において、ポリエチレングリコール（PEG）オリゴマーまたはポリマーは、ポリエチレングリコールオリゴマーまたはポリマーとの直接的または間接的な結合に適した官能基を含む種を有する結合モノマー残基を介してポリマーと共有結合させることができる。別の態様において、モノマー残基は、モノマーに対するポリエチレングリコールオリゴマーペンダント（例えば、上述のPEGMA）を含む重合可能なモノマーに由来することができる。
１つの一般的アプローチにおいて、PEG鎖またはブロックは、膜不安定化ポリマー鎖に共有結合する。かかる態様に対して、例えば、PEG鎖またはブロックは、約1,000〜約30,000の範囲の分子量を有することができる。いくつかの態様において、PEGは、ブロック共重合体の第２ブロックとして有効である（すなわち、ブロック共重合体の第２ブロックに組み込まれる）。例えば、PEGは、膜不安定化ポリマーを含むブロックと共有結合した第２ブロックであり得る。いくつかの態様において、PEGは、ブロック共重合体末端基、またはポリマー化合物中に存在する１以上のペンダント修飾可能基に結合し、例えば、ポリマー（例えば、ブロック共重合体）のブロック（例えば、第２ブロック）の親水性セグメント内の修飾可能基に結合する。一例として、共重合体のブロックは、以下の式Vの繰り返し単位を有する遮蔽ポリマーであり得るか、または前記遮蔽ポリマーに結合させることができる。
Figure 2012500793
式中、R1およびR2は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3 アルキルからなる群より選択され、約1,000〜約30,000 kDの範囲の分子量を有する。
例えば、図１Ｄを参照すると、異種性ポリマーミセルM7C、M8B、M9B、およびM10C は、それぞれ、第１ポリマーP1および第１ポリマーP1とは組成的に異なる第２ポリマーP2を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含むことができる。第１ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。ポリヌクレオチドは、第１ポリマーの親水性ブロックに結合する（例えば、イオン結合 (M7C)、共有ペンダント結合(M10C )、共有末端結合 (M8B, M9B)を介して）。第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。第２ポリマーの親水性ブロックは、中性、親水性ポリマーなどの遮蔽ポリマーであり得る。第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセルを形成する（例えば、pH 7.4の水性媒体中において）。
別のアプローチにおいて、モノマー残基は、PEGオリゴマーを含む重合可能なモノマーに由来し、例えば、かかるモノマー残基は、重合の間にポリマーまたはブロック共重合体の１つ以上のブロックに組み込むことができる。好ましい態様において、モノマー残基は、以下の式Iで表されるオリゴマーを含むペンダント基を有する重合可能なモノマーに由来することができる。
Figure 2012500793
式中、R1およびR2は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、nは、2〜20の範囲の整数である。
好ましい態様において、ポリマー鎖は、以下の式IIIを有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を含むことができる。
Figure 2012500793
式中、
Xは、独立に、O、NR9、およびSからなる群より選択され、
R1、R2およびR3は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、
Nは、2〜20の範囲の整数であり、
R8は、水素、ハロゲン、任意に置換されたC1-C3アルキル、およびターゲティング部分からなる群より選択され、これらは、任意に連結部分を介して連結され、
R9は、水素、および任意に置換されたC1-C5アルキルからなる群より選択される。
好ましい態様において、ポリマー鎖は、以下の式IVを有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を含むことができる。
Figure 2012500793
式中
R1、R2およびR3は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、
Nは、2〜20の範囲の整数であり、
R8は、水素、ハロゲン、任意に置換されたC1-C3アルキル、およびターゲティング部分からなる群より選択され、これらは任意に、連結部分を介して連結される。
例えば、さらに図１Ｄを参照すると、異種性ポリマーミセルM7A、M7B、M8A、M9A、M10A、およびM10B は、それぞれ、第１ポリマーP1および第１ポリマーP1とは組成的に異なる第２ポリマーP2を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含むことができる。第１ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。ポリヌクレオチドは、第１ポリマーの親水性ブロックに結合する（例えば、イオン結合 (M7A、M7B)、共有ペンダント結合(M10A、M10B)、共有末端結合 (M8A、M9A)を介して）。第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。第１ポリマーの親水性ブロック (M7A、M10A)および／または第２ポリマーの親水性ブロック (M7B、M8A、M9A、M10B) は、遮蔽オリゴマーまたはポリマーなどの遮蔽剤を含むペンダント基を有する重合可能なモノマーに由来するモノマー残基を含むことができる。第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセルを形成する（例えば、pH 7.4の水性媒体において）。
かかる好ましい態様において、ポリマー鎖は、遮蔽オリゴマーを含むペンダント基を有するモノマー残基を少なくとも約10重量％含むランダム共重合体であるセグメントまたはブロック中に、遮蔽種（例えば、式I、III、IVまたはその他）を有する重合可能なモノマーに由来する複数の遮蔽モノマー残基を含むことができる。好ましくは、ランダム共重合体は、遮蔽オリゴマーを含むペンダント基を有するモノマー残基を少なくとも約20重量％含むことができる。好ましくは、ランダム共重合体は、遮蔽オリゴマーを含むペンダント基を有するモノマー残基を少なくとも約30重量％含むことができる。
ターゲティング
一般的に、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーまたはかかるポリマーのブロックの１つ以上は、ターゲティング部分を含むことができる。かかるターゲティング部分は、エンドサイトーシスを媒介するのに有効な１以上のレセプターに対して親和性を有するリガンドであり得る。一般的に、ターゲティング部分は、第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックに共有結合する。
一般的に、ある態様において、ここに記載するミセルを構成する重合ポリマーは、少なくとも１つのターゲティング部分（例えば、特定の細胞または細胞の種類をターゲティングにする部分）を含む。ターゲティング部分は、興味のある１つ以上の生物学的レセプターまたは他の化合物または細胞表面に結合することができ、および／またはそれらに対して特定の親和性を有することができる。いくつかの好ましい態様において、ターゲティング部分は、細胞取り込み（例えば、エンドサイトーシスを介して）を媒介するのに有効な１つ以上のレセプターに対して親和性を有するリガンドであり得る。
ある場合において、ポリマー化合物の細胞取り込みの効率は、異種性ミセルを構成する第１および／または第２ポリマーに共有結合したターゲティング部分を組み込むことにより増強される。細胞取り込みに関して、ターゲティング部分（ターゲティング剤）は、一般的または選択的に、細胞（例えば、分泌細胞）の表面を認識する薬剤である。いくつかの態様において、ターゲティング部分は、細胞表面の抗原を認識し、ターゲティング細胞の表面におけるレセプターに結合する。適切なターゲティング部分の非限定的な例には、抗体、抗体様分子、またはRGD含有ペプチド等のインテグリン結合ペプチドなどのペプチド、葉酸塩（folate）等のビタミンなどの小分子、ラクトースおよびガラクトースのなどの糖、または他の小分子が含まれる。細胞表面の抗原は、タンパク質、糖、脂質または細胞表面上の他の抗原などの細胞表面分子が含まれる。特定の態様において、細胞表面抗原は、内部移行を受ける。ここで提供されるポリマー化合物のターゲティング部分によりターゲティングにされる細胞表面抗原の例には、限定するものではないが、トランスフェリンレセプタータイプ1および2、EGFレセプター、HER2/Neu、VEGFレセプター、インテグリン、NGF、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、およびアシアロ糖タンパク質レセプターが含まれる。
以下により詳細に説明するように、種々の態様において、ターゲティング部分は、好ましくは例えば鎖伸長残基モノマー単位の側鎖を介して、ポリマー化合物（例えば、ブロック共重合体化合物）に共有結合させてもよく、または組み込まれてよく、好ましくは各場合において、鎖伸長部分は、ポリマー化合物の末端またはポリマー化合物の２つのポリマー鎖の間に提供される。ターゲティング部分のポリマー鎖への結合は、適切な様式で達成されてもよく、例えば、限定するものではないが、以下に示す連結部分を含む多くの結合化学のアプローチのいずれか１つにより行われ得る。
別の態様において、ターゲティングリガンドがポリマー鎖のモノマー残基に結合し、結果として得られる化合物は、ここに記載されるポリマー（例えば、ブロック共重合体）の重合合成において使用される。いくつかの態様において、ターゲティング部分は、第１ブロック共重合体のブロック、または第２ブロック共重合体のブロックに共有結合する。いくつかの態様において、ターゲティング部分は、siRNAのセンスまたはアンチセンス鎖に結合し、ポリマー化合物と共有結合性または非共有結合性に会合する。ある態様において、ターゲティング剤は、センスまたはアンチセンス鎖の5’または3’端に結合する。
好ましくは、ターゲティング部分は、連結部分を介して、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーの親水性ブロックに共有結合する。好ましいアプローチにおいて、第１ポリマーおよび／または第２ポリマーの親水性ブロックは、結合可能部分（例えば、官能基）を有するモノマー残基を含むことができる。ターゲティング部分は、かかる結合可能部分を介して、任意に連結部分を介して、異種性ポリマーミセルの第１または第２ポリマーの親水性ブロックに共有結合させることができる。
例えば、さらに図１Ｅを参照すると、異種性ポリマーミセルM7D、M7E、M8C、M9C、M10D、およびM10E は、それぞれ、第１ポリマーP1および第１ポリマーP1とは組成的に異なる第２ポリマーP2を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含むことができる。第１ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。ポリヌクレオチドは、第１ポリマーの親水性ブロックに結合する（例えば、イオン結合 (M7D、M7E)、共有ペンダント結合(M10D、M10E)、共有末端結合 (M8C、M9C)を介して）。第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。第１ポリマーの親水性ブロック (M7D、M10D)および／または第２ポリマーの親水性ブロック (M7E、M8E、M9C、M10E) は、結合可能部分（例えば、官能基）を有するモノマー残基を含むことができ、ターゲティング部分（T）は、親水性ブロックに共有結合させることができる。第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセルを形成する（例えば、pH 7.4の水性媒体において）。
例えば、図１Ｅを参照すると、異種性ポリマーミセルM7F、M8D、M9D、およびM10F は、それぞれ、第１ポリマーP1および第１ポリマーP1とは組成的に異なる第２ポリマーP2を含む、２つ以上の組成的に異なるポリマーを含むことができる。第１ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。ポリヌクレオチドは、第１ポリマーの親水性ブロックに結合する（例えば、イオン結合 (M7F)、共有ペンダント結合(M10F)、共有末端結合 (M8D、M9D)を介して）。第２ポリマーは、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である。第２ポリマーの親水性ブロックは、ターゲティング部分であってもよく、またはターゲティング部分に共有末端結合してもよい。第２ポリマーの疎水性ブロックは、第１ポリマーの疎水性ブロックと結合し、安定な異種性ミセルを形成する（例えば、pH 7.4の水性媒体において）。
連結部分
一般的に、生体分子薬剤は、１つ以上の連結部分を介して鎖伸長部分と結合させることができる。
連結部分は、共有結合であり得る。
連結部分は、ヒドロカルビル（hydrocarbyl）、置換ヒドロカルビル、ヘテロヒドロカルビルまたは置換へテロヒドロカルビルなどの多官能性（例えば、二官能性）部分であってもよく、各場合において、2つ以上の反応性官能基を含んでもよい。例えば、連結部分は、ジスルフィド連結部分Lであり得る。例えば、連結部分は、酸に不安定な連結部分Lであり得る。いくつかの好ましい態様において、連結部分Lは、エンドソームpHにおいて酸に不安定である少なくとも１つの結合を含むことができる。
いくつかの態様において、生体分子薬剤（例えば、オリゴヌクレオチド）は、適切な化学的結合アプローチにより、ポリマー化合物の伸長部分に結合する。いくつかの態様において、伸長部分と生体分子薬剤の間の共有結合は、任意に、開裂可能でないか、または開裂可能であってよい。ある態様において、１つ以上のRNAi剤（例えば、ダイサー基質）の前駆体が、開裂可能でない結合によりポリマーミセルに結合する。いくつかの態様において、１つ以上のRNAiが、開裂可能な結合を介して結合する。ある態様において、かかるアプローチにおいて使用される開裂可能な結合の非限定的な例には、ジスルフィド結合（例えば、細胞質の還元環境において解離するジスルフィド結合）が含まれる。
連結部分には、例えば、アミン-カルボキシルリンカー、アミン-スルフヒドリルリンカー、アミン-糖リンカー、アミン-ヒドロキシルリンカー、アミン-アミンリンカー、カルボキシル-スルフヒドリルリンカー、カルボキシル-糖リンカー、カルボキシル-ヒドロキシルリンカー、カルボキシル-カルボキシルリンカー、スルフヒドリル-糖リンカー、スルフヒドリル-ヒドロキシルリンカー、スルフヒドリル-スルフヒドリルリンカー、糖-ヒドロキシルリンカー、糖-糖リンカー、およびヒドロキシル-ヒドロキシルリンカーを含むことができる。特定の態様において、「クリック（click）」ケミストリーは、ここに提供されるポリマー化合物（例えば、ブロック共重合体）にターゲティングリガンドなどのバイオ結合体を結合させるために使用される（「クリック」反応の例については、Wu, P.; Fokin, V. V., Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17を参照されたい）。多くの種類の結合化学が、任意に利用される（例えば、Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998 およびその中の章を参照されたい）。いくつかの態様において、結合は、pH感受性の結合およびリンカーを用いても行われ、限定するものではないが、ヒドラゾンおよびアセタール結合が含まれる。いずれかの他の適切な結合方法も任意に利用され、例えば、多くの種類の結合化学が利用可能である（例えば、Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998 およびその中の章を参照されたい）。
ミセルおよびポリヌクレオチド含有組成物の調製
一般的に、異種性ポリマーミセルは、第１変性媒体中に第１ポリマーおよび組成的に異なる第２ポリマーを提供し、第１ポリマーおよび第２ポリマーの異種性混合物を形成し、その後、異種性混合物を第２水性媒体中に移す（例えば、希釈、透析）ことにより調製することができる。第１ポリマーの疎水性ブロックを、水性媒体中で第２ポリマーの疎水性ブロックと結合させ、異種性ミセルを形成する。
一般的に、異種性ポリマーミセルおよび該ミセルに結合したポリヌクレオチドを含む組成物は、第１変性媒体中に第１ポリマーおよび組成的に異なる第２ポリマーを提供し、第１ポリマーおよび第２ポリマーの異種性混合物を形成し、その後、異種性混合物を第２の水性媒体中に移す（例えば、希釈、透析）ことにより調製することができる。第１ポリマーの疎水性ブロックを、水性媒体中で第２ポリマーの疎水性ブロックと結合させ、異種性ミセルを形成する。ポリヌクレオチドは、異種性ミセル形成の前または後に、かかる異種性ポリマーミセルまたは第１もしくは第２ブロック共重合体の少なくとも１つと結合させることができる。
第１変性媒体は、好ましくは、C1-C4アルコールなどのアルコールを含む。第１変性媒体は、C1-C4 アルコールなどのアルコールを、例えば少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約40％、好ましくは少なくとも約50％、およびいくつかの態様においてより高いパーセンテージ、例えば少なくとも約70％または100％（例えば、純粋なC1-C4 アルコールなどの純粋なアルコール）の濃度の（例えば、H2Oとの）共溶媒として含むことができる。
第２水性媒体は、pH緩衝化水性媒体であり得る。好ましくは、第２水性媒体は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）などのリン酸緩衝化水性媒体であり得る。
ポリヌクレオチド含有組成物が、少なくとも１つのポリマー（例えば第１のポリマー）における陽イオン性親水性ブロックとイオン結合したポリヌクレオチドを含む態様について、一般的に、多数の適切なアプローチが、異種性ポリマーミセルおよびそれに結合したポリヌクレオチドを含む組成物を調製するために有効であり得る。かかるアプローチのそれぞれにおいて、少なくとも１つのポリマー（例えば、第１ポリマー）は、複数の陽イオン性モノマー残基を含む親水性ブロックを含む。
かかるアプローチの１つにおいて、第１および第２ポリマーを最初に結合させ（例えば、より厳しい変性条件下で）、その後ポリヌクレオチドを加える（例えば、より厳しくない変性条件下で）。より具体的には、第１ポリマーおよび第２ポリマーの異種性混合物は、第１変性媒体中で形成される。第１変性媒体を、pH緩衝化水性媒体で一部希釈し、ポリヌクレオチドを、一部希釈された第１媒体に提供し、一部希釈された第１媒体において、親水性ブロックの陽イオン性モノマー残基と結合させる。一部希釈された第１媒体は、その後、pH緩衝化水性媒体でさらに希釈されてもよい（例えば、透析を介して）。
別のアプローチにおいて、ポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリマーを最初に結合させ（例えば、中程度の厳しさの変性条件下で）、その後、他のポリマーを加える（例えば、同じ中程度の条件下で）。特に、第１ポリマーおよびポリヌクレオチドは、第１媒体に提供される。好ましくは、第１媒体は、少なくとも30％且つ約70％以下のC1-C4 アルコールなどのアルコールを含む。ポリヌクレオチドは、第１媒体中で、第１ポリマーの親水性ブロックの陽イオン性モノマー残基と結合させる。第２ポリマーは、その後、第１媒体に提供され、第１ポリマー、それに結合したポリヌクレオチド、および第２ポリマーを含む異種性混合物を第１媒体中で形成する。第１媒体は、その後、pH緩衝化水性媒体などの水性媒体で希釈されてもよい。
さらなるアプローチにおいて、ポリヌクレオチドは、異種性ポリマーミセルの形成後に、第１および／または第２ブロック共重合体の陽イオン性親水性ブロックと結合させることができる。例えば、異種性ポリマーミセルは、例えば、実質的に上述したように形成され得る。その後、ポリヌクレオチドとポリマーミセルをpH緩衝化水性媒体などの水性媒体中で混合することによりポリヌクレオチドをポリマーミセルに結合させ、その後、任意に希釈または透析される（例えば、pH7.4のPBSに対して）。
一般的に、第１および／または第２ブロック共重合体との共有結合により、ポリヌクレオチドが異種性ポリマーミセルに共有結合した態様に対するポリヌクレオチド含有組成物を調製するための種々のアプローチも存在する。かかるアプローチのそれぞれにおいて、混合ポリマーミセルおよびそれに結合したポリヌクレオチドを含む組成物は、２つの組成的に異なるブロック共重合体から形成されてもよく、第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも１つは、結合可能なモノマー残基（例えば、MAA(NHS)モノマー残基）を含む親水性ブロックを有する。
１つのアプローチにおいて、例えば、ポリヌクレオチド含有組成物は、実質的に上述したように最初に異種性ポリマーミセルを形成し、続いてポリヌクレオチドと異種性ポリマーミセルを結合させることにより調製することができる。
別のアプローチにおいて、ポリヌクレオチド含有組成物は、最初にポリヌクレオチド結合ブロック共重合体を形成し、続いて、実質的に上述したように異種性ポリマーミセルを形成することにより調製することができる。
意義深いことに、異種性ポリマーミセルまたはかかる混合性ミセルを含有する組成物の超分子特性は、それらを調製する間に制御され得る。
例えば、一般的に、第１ポリマーと第２ポリマーの相対的な比は、かかるポリマーの組成におけるバリエーションと組み合わせて、ミセルの望ましい一連の化学的または物理的性質を達成するために制御可能に変化させることができる。非限定的な例として、異種性（混合）ポリマーミセルは、例えば膜不安定化ブロックなどの、組成的に異なる親水性ブロックを有し、それぞれが実質的に同じ疎水性ブロックを有する2つ以上のブロック共重合体から形成することができる。特に、例えば、第１ブロック共重合体は、陽イオン性親水性モノマー残基（例えば、DMAEMA）から本質的になる親水性ブロックを有することができ、第２ブロック共重合体は、中性親水性モノマー残基（例えば、PEGMA）から実質的になる親水性ブロックを有することができる。かかる第１および第２ポリマーは、種々の所望のモル比（例えば、2：1、1：1、1：2）で結合させ、対応する相対的な陽イオン性電荷を有する親水性外殻を有する異種性ミセルを形成することができる。この例において、電荷は、ミセルの陽イオン性外殻ブロックと中性外殻ブロックの相対量を変化させることにより調節されている。
それ故、上記でさらに詳細に説明したように、異種性ポリマーミセルは、（i）制御可能に変化する（調整可能な）ブロック共重合体組成（例えば、親水性ブロック間で比較した場合）、（ii）制御可能に変化する（調整可能な）親水性ブロックと親水性ブロックの相対的な比（例えば、親水性ブロック間で比較した場合に、相対的な親水性鎖の長さを変化させることにより生じる）、（iii）制御可能に変化する（調整可能な）ポリマーの全分子量（例えば、ポリマー間で比較した場合に、相対的な全鎖長を変化させることにより生じる）、および（iv）制御可能に変化する（調整可能な）第１ブロック共重合体と第２ブロック共重合体（または付加的なブロック共重合体）のポリマー分子数の相対的な比を有することで達成され得る。
ミセル特性
異種性ポリマーミセル、それを構成するポリマー、並びにかかる異種性ポリマーミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドなどの薬剤を含む組成物を含む本発明の種々の側面は、興味のある特定の適用に対して制御可能に変化させる（すなわち調整する）ことができるある種の特性を有することができるか、および／またはその特性により特徴付けることができる。
ミセル特性、構成要素であるポリマーの特性、および組成上の特性は、一般的に相互に関係があり、かかる特性の１つは、別のかかる特性に影響を与えてもよく；それぞれの場合において、かかる特性のいずれかは、他の特性に直接的または間接的に影響を与えてもよく、かかる特性の非限定的な例として、製剤特性、薬物動態学的特性、生体分布特性、および／または生物学的特性等が含まれる。
以下の特性および鍵となるパラメータは例示であり、異種性ポリマーミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物において使用される異種性ポリマーミセルに対して一般的に好ましい。かかる特性は例として列挙され、特に１以上の請求項に具体的に記載した範囲を除き、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明の異種性ポリマーミセルは、種々のミセル特性を有することができるか、および／またはそのミセル特性により特徴付けることができる。かかる特性には、例えば、臨界ミセル濃度、集合数、粒子サイズ、および溶解性等を含むことができる。
一般的に、異種性ポリマーミセルは、好ましくは、約0.2ug/ml〜約20ug/mlの範囲、好ましくは約0.5ug/ml〜約10ug/mlの範囲の臨界ミセル濃度（CMC）を有することができる。いくつかの態様において、臨界ミセル濃度は、約1ug/ml〜約5ug/mlの範囲とすることができる。
一般的に、異種性ポリマーミセルは、好ましくは、ミセル当り約10〜約100のトータル鎖の範囲、好ましくはミセル当り約20〜約60鎖の範囲である集合数を有することができる。いくつかの態様において、集合数は、ミセル当り約30〜50鎖の範囲とすることができる。
一般的に、異種性ポリマーミセルは、約5 nm〜約500 nmの範囲、好ましくは約10 nm〜約200 nmの範囲の粒子サイズを有することができる。いくつかの態様において、粒子サイズは、約20 nm〜約100 nmの範囲とすることができる。
一般的に、異種性ポリマーミセル（集合ミセルとして考える）の分子量は、約0.5×106 〜約3.6×106ダルトンの範囲、好ましくは約0.75×106〜約2.0×106ダルトンの範囲の数平均分子量Mnを有することができる。いくつかの態様において、トータルの数平均分子量Mnは、約1.0×106〜約1.5×106の範囲とすることができる。
一般的に、異種性ポリマーミセルは、生理学的に適切な媒体などの水性媒体において可溶性であり得る。一般的に、異種性ポリマーミセルは、約1 mg/ml〜約200 mg/mlの範囲、好ましくは約5 mg/ml〜約150 mg/mlの範囲の溶解度を有することができる。いくつかの態様において、異種性ポリマーミセルは、約10 mg/ml〜約100 mg/mlの範囲、または約20 mg/ml〜約50 mg/mlの範囲の溶解度を有することができる。
構成要素であるブロック共重合体を含む構成要素であるポリマーは、1つ以上のミセル特性に影響を及ぼし得る種々の特性を有することができるか、および／またはその特性により特徴付けることができる。例えば、かかる特性には、構成要素であるポリマーに対するトータルの数平均分子量、構成要素であるポリマーにおける親水性ブロックと疎水性ブロックの相対的な数平均分子量Mn、疎水性の相対的な程度、構成要素であるポリマー（全体として考える）またはその各ブロックの多分散性指数等を含むことができる。
構成要素であるポリマーに対するトータルの数平均分子量（ポリマー全体として考え、あるいは構成要素であるブロック共重合体内のブロック分子量の合計により特徴付けられる）は、一般的に、約5,000〜約100,000ダルトン、および好ましくは約10,000〜約90,000ダルトンの範囲の数平均分子量Mnであり得る。いくつかの態様において、トータルの数平均分子量Mnは、約15,000〜約80,000ダルトンの範囲、または約15,000ダルトン〜約75,000ダルトンの範囲であり得る。好ましい態様において（例えば、ポリヌクレオチド含有組成物に関して）、限定することなく、異種性ポリマーミセルを構成するブロック共重合体は、約5,000〜約20,000ダルトンの範囲の数平均分子量Mnを有する親水性ブロックと、約10,000〜約60,000ダルトンの範囲の数平均分子量Mnを有する疎水性ブロックを含むことができる。
構成要素であるブロック共重合体の親水性ブロックと疎水性ブロックの数平均分子量Mnの相対的な比は、一般的に、約2:1〜約1:9の範囲、好ましくは約3:2〜約1:7の範囲、好ましくは約3:2〜約1:5の範囲、好ましくは約3:2〜約1:4の範囲、好ましくは約1:1〜約1:5の範囲、好ましくは約1:1〜約1:4の範囲、好ましくは約1:1〜約1:3の範囲であり得、いくつかの態様において約1:1〜約1:2の範囲であり得る。他の好ましい範囲は、異種性ポリマーミセルの一般構造に関して上述した通りである。
構成要素であるブロック共重合体またはその疎水性ブロックは、特徴的な相対的な疎水性度を有することができる。疎水性は、例えば疎水性ブロックのπ値または上述されるとおり他の適切な尺度により表すことができる。
構成要素である第１ポリマーおよび第２ポリマーのそれぞれ、またはそれらの各ブロックは、1.0〜約2.0の範囲、好ましくは1.0〜約1.7の範囲、好ましくは1.0〜約1.4の範囲、いくつかの態様において1.0〜約1.2の範囲、または1.0〜約1.1の範囲、または1.0〜1.05の範囲の多分散性指数を有することができる。
例えば、組み合わせて考えると、異種性ポリマーミセルおよび／またはその構成要素であるポリマー（またはそのブロック）は、好ましくは、以下に示す群から選択される特性の１つ以上を含むことができる：（i）ミセル当り約20〜約60鎖の範囲の集合数; (ii) 約0.5ug/ml〜約10ug/mlの範囲の臨界ミセル濃度CMC、および(iii)約1：1.5〜約1：6の範囲の親水性ブロックと疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比。
好ましくは、例えば、組み合わせて考えると、異種性ポリマーミセルおよび／またはその構成要素であるポリマー（またはそのブロック）は、以下に示す群から選択される特性の１つ以上を含むことができる：（i）ミセル当り約30〜約50鎖の範囲の集合数; (ii) 約1 ug/ml〜約5 ug/mlの範囲の臨界ミセル濃度CMC、および(iii)約1：2〜約1：4の範囲の親水性ブロックと疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比。
かかる異種性ポリマーミセルおよびそれに結合したポリヌクレオチドなどの薬剤を含む組成物は、興味のある特定の適用に対して制御可能に変化させることができる（すなわち、調整可能な）ある種の特性を有することができるか、および／またはかかる特性により特徴付けることができる。
例えば、各ミセルに結合するポリヌクレオチドの数は、約1〜約10,000の範囲、好ましくは約4〜約5,000の範囲、または約15〜約3,000の範囲であり得る。いくつかの態様において、約30〜約2,500のポリヌクレオチドを各ミセルと結合させることができる。
生体分子薬剤
本発明の組成物は、異種性ポリマーミセルおよびそれに結合した薬剤を含むことができる。薬剤は、生体分子薬剤であり得る。薬剤は、リサーチ用試薬、診断用薬剤、もしくは治療用薬剤、またはこれらの組み合わせであり得る。
一般的に、生体分子薬剤（例えば、治療用薬剤、診断用薬剤、リサーチ用試薬に適した薬剤）は、ポリ核酸（例えば、ポリヌクレオチド）、ポリアミン酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）、炭水化物（例えば、多糖）、または小分子医薬などの小有機分子（例えば、約1000 g/mol未満または約500 g/mol未満の分子量）であり得る。
一般的に、いくつかの態様において、治療用薬剤などの薬剤は、ミセルを構成するポリマーの親水性ブロックと結合する（例えば、治療用薬剤が、実質的に異種性ポリマーミセルの外殻に存在するように）。他の態様において、薬剤は、例えば異種性ポリマーミセルの疎水性ブロックなどの、構成要素であるブロック共重合体の他のブロックと結合させることができる（例えば、治療剤が、異種性ポリマーミセルのコアに存在するように）。他の態様において、薬剤は、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーの末端領域と結合させることができる（例えば、構成要素であるポリマーの親水性ブロックに共有末端結合する。）（それにより、例えば、薬剤の一部は、実質的に異種性ポリマーミセルの表面上または表面近くに存在し得る。）。
一般的に、異種性ポリマーミセルと結合する薬剤の量は、厳密には重大でなく、興味のある特定の適用に対して決定することができる。一般的に、異種性ポリマーミセルおよびそれに結合した薬剤を含む組成物は、薬剤、結合の様式（例えば、共有結合または非共有結合）、および興味のある適用に依存して、種々の範囲で薬剤を含むことができる。典型的な一般的範囲には、ミセル当り例えば1〜5、5〜250、5〜1000、または250〜1000の薬剤を含むことができる。それ故、一般的に、ミセル当りの薬剤の数は、ミセル当り少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、または少なくとも50のポリヌクレオチドなどの薬剤であり得る。異種性ポリマーミセルおよび薬剤を含む組成物において、ミセル当りの薬剤の量は、薬剤含有ミセルのサンプル集合について測定された平均に基づいて決定することができる。
特定の態様において、薬剤は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、遺伝子発現モジュレータ、ノックダウン剤、siRNA、RNAi剤、ダイサー基質、miRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアプタマーである。他の特定の態様において、治療用薬剤は、aiRNAである (Asymmetric RNA duplexes mediate RNA interference in mammalian cells. Xiangao Sun, Harry A Rogoff , Chiang J Li Nature Biotechnology 26, 1379 - 1382 (2008))。
いくつかの態様において、ここに記載される組成物は、異種性ポリマーミセルおよびそれに結合したポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、真核細胞（例えば、哺乳類細胞）などの細胞における発現を機能的に促進し、減少させ、または調節する。ポリヌクレオチドは、哺乳類の発現ベクターであり得る。ポリヌクレオチドは、ヒト細胞等の哺乳類細胞などの細胞における内因性遺伝子配列を修復する活性を有することができる。ポリヌクレオチドは、遺伝子発現モジュレータであり得る。
いくつかの態様において、異種性ポリマーミセルおよびポリヌクレオチドを含む組成物は、遺伝子治療のために使用される。遺伝子治療による疾患および障害の治療は、一般的に、新規の遺伝情報を細胞にデリバーすることを含む。「遺伝子治療ベクター」は、任意に哺乳類発現ベクター内に、送達されるべき新規の遺伝物質を含む。異種性ポリマーミセルの使用は、免疫応答の調節などのいくつかの他の望ましい効果をもたらすように、遺伝子置換、遺伝子発現の阻害、遺伝子修復もしくは遺伝子増強、または遺伝子導入のためにポリヌクレオチド（例えばDNA）配列をデリバーすることを含む。遺伝子発現の阻害は、いずれかの適切な様式で達成され、非限定的な例として、shRNAsまたは他のRNAi剤を発現する細胞中に遺伝子カセットを発現させることを含む。
ある態様において、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド遺伝子発現モジュレータである。さらなる態様において、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドノックダウン剤である。特定の態様において、ポリヌクレオチドは、RNAi剤、ダイサー基質、またはsiRNAである。
いくつかの側面において、ここで提供される異種性ポリマーミセルは、２種類以上のオリゴヌクレオチド剤を含み、該オリゴヌクレオチド剤は、同じ疾患または異なる疾患の異なる遺伝子をサイレンシングさせる（silence）。
ある態様において、治療用薬剤は、タンパク質、ペプチド、主に負の(dominant-negative)タンパク質、酵素、抗体、または抗体断片である。
いくつかの態様において、治療用薬剤は、タンパク質の薬剤である。タンパク質の治療用薬剤（例えば、ポリペプチド）とここで提供される異種性ポリマーミセルとの結合は、タンパク質の治療用薬剤（例えば、ポリヌクレオチド）の1以上の官能基と、異種性ポリマーミセルに存在する（例えば、異種性ポリマーミセルの外殻または外殻ブロックのモノマー単位に存在する）1以上の官能基の化学反応による種々の結合プロセスによって達成される。通常含まれるポリペプチド官能基には、限定するものではないが、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、またはカルボキシル基が含まれる。かかる基は、末端基として存在することができるか、またはアミノ酸側鎖上に存在することができる。いくつかの態様において、タンパク質治療剤は、例えば「クリック」ケミストリーを介した結合のためのアジド基などの、部位特異的な結合の形成に対する特定の官能基を含む非天然アミノ酸を含むように設計される。
いくつかの態様において、治療剤は、炭水化物、または多糖である。
いくつかの態様において、治療剤は小有機分子であり得、約10,000 g/mol未満または約5,000 g/mol未満、およびいくつかの場合において約2,000 g/mol未満または約1,000 g/mol未満の分子量を有する有機分子であり得る。かかる小有機分子は、医薬（例えば、活性医薬成分 (API)である物質）であり得る。いくつかの場合において、本発明は、そのサイズ（例えば、>500g/molの分子量）、電荷、または他の物理化学的特性によって、それ自体は細胞に入ることができないか、またはあまり入ることができない小有機分子の細胞内デリバリーに対して特に有利である。
いくつかの態様において、小分子医薬は、疎水性医薬であり得る。本発明には、異種性ポリマーミセルおよびそれに結合した疎水性医薬（例えば、小分子疎水性薬）を含む組成物が含まれる。疎水性医薬は、例えば、異種性ポリマーミセルを構成するポリマーの1つ以上の疎水性ブロックと結合させることができる（例えば、異種性ポリマーミセルのコアに実質的に存在させることができる）。
上述の態様のいずれかにおいて、ポリヌクレオチド剤、ポリアミノ酸剤、多糖剤または小有機分子剤を含む薬剤は、好ましくはそれを必要とするヒト被検体などの哺乳類被検体におけるある状態の予防または治療のための治療用薬剤であり得る。
いくつかの態様において、組成物は、ここで提供される異種性ポリマーミセルおよびそれに結合した診断用薬剤を含む。いくつかの態様において、診断用薬剤は、診断用イメージング剤であり、例えば限定するものではないが、ポジション放出断層撮影（PET）剤、コンピュータ断層撮影（CT）剤、磁気共鳴映像（MRI）剤、核磁気映像（NMI）剤、蛍光透視剤および超音波造影剤が含まれる哺乳類の血管系のイメージングにおいて有用な薬剤が含まれる。かかる診断用薬剤には、123I、125I、131I等を含むヨウ素 (I)、バリウム (Ba)、ガドリニウム (Gd)、99Tcを含むテクネチウム (Tc)、31Pを含むリン (P)、鉄 (Fe)、マンガン (Mn)、タリウム (Tl)、51Crを含むクロム (Cr)、14Cを含むカーボン (C)等の元素の放射性同位元素が含まれる。他の態様において、診断用薬剤は、標識された核酸プローブ（例えば、放射標識または蛍光標識されたプローブ）、および細胞において発現した場合に容易に検出可能なタンパク質（限定するものではないが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等）をコードするマーカー遺伝子である。いくつかの態様において、診断用薬剤と異種性ポリマーミセルを構成する１以上のポリマーとの共有結合は、種々の結合プロセスにより達成される。他の態様において、診断用薬剤は、異種性ポリマーミセルを形成するブロック共重合体に導入されたキレート残基（例えば、カルボン酸残基）と複合体を形成することにより、ここで提供される異種性ポリマーミセルと非共有結合する。いくつかの態様において、放射標識されたモノマー（例えば、14C-標識モノマー）は、異種性ポリマーミセルのポリマー骨格（例えば、ミセルの外殻ブロックまたはコアブロック）に導入される。いくつかの態様において、診断用薬剤と結合した異種性ポリマーミセルは、ターゲティング部分を含む。いくつかの態様において、診断用薬剤と結合した異種性ポリマーミセルは、遮蔽部分を含む。
いくつかの態様において、組成物は、ここで提供される異種性ポリマーミセルおよびそれに結合したリサーチ用薬剤を含む。
薬学的組成物
異種性ポリマーミセルおよび生体分子薬剤（例えば、ポリヌクレオチド）などの薬剤を含む組成物は、薬学的組成物であり得る。かかる薬学的組成物は、例えば、異種性ポリマーミセル、ポリヌクレオチドなどの生体分子薬剤、および薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。
治療的用途
異種性ポリマーミセルおよびポリヌクレオチドなどの薬剤を含む組成物は、種々の方法で使用することができる。
一般に、かかる組成物は、たとえば、ポリヌクレオチドなどの薬剤の細胞内デリバリーのための方法で使用することができる。異種性ポリマーミセルおよびそれと結合した薬剤 (たとえばポリヌクレオチド) を含む組成物は、第１のpHの媒体において、(たとえば、方向性ターゲティングを介して)細胞表面に露出させ、細胞表面と接触させることができる。組成物は、たとえばエンドサイトーシスにより、幾つかの態様ではレセプター媒介性エンドサイトーシスにより、細胞内でエンドソーム膜に取り込まれる。エンドソーム膜は、(たとえば、膜不安定化ポリマーである構成ポリマーまたはそのブロックにより)不安定化され、これにより、組成物または薬剤(たとえばポリヌクレオチド)を細胞の細胞質ゾルにデリバーする。媒体は、インビトロ媒体とすることができる。媒体は、生理学的媒体などのインビトロ媒体とすることができる。
一般に、たとえば、かかる組成物は、細胞において細胞内ターゲットの活性を調節するために使用することができる。ポリヌクレオチドなどの薬剤は、直前の段落に記載される方法に従って、細胞の細胞質ゾルにデリバーすることができる。薬剤(たとえばポリヌクレオチド) を、細胞内ターゲットと相互作用させ、これにより細胞内ターゲットの活性を調節する。
より具体的には、たとえば、幾つかの態様では、本明細書で提供される異種性ポリマーミセル (たとえばミセル) を含む組成物は、高血漿レベルのコレステロール、アポリポ蛋白質b、および/またはLDLコレステロールに関連した、および/またはこれにより引き起こされる障害、たとえば高コレステロール血症に対する危険があるか、またはこれに罹患している被検体を治療する際に有用である。幾つかの態様において、治療は、異種性ポリマーミセルおよびそれと結合した治療用薬剤 (たとえばオリゴヌクレオチド薬剤) を提供することを含み、ここで治療用薬剤は、かかる症状を促進する遺伝子または遺伝子産物を(たとえば切断により)サイレンシングさせる（silence）。幾つかの態様において、治療用薬剤 (たとえばオリゴヌクレオチドまたはRNAi薬剤) は、低比重リポタンパク質(LDLR) レベルおよび機能の調節を担うプロタンパク質コンバターゼサブチリシン/ケキシン9 (PCSK9) 遺伝子をサイレンシングさせ、このため、かかる治療用薬剤を含む異種性ポリマーミセルは、望ましくないPCSK9発現により特徴づけられる障害、たとえば、高血漿レベルのコレステロール、アポリポ蛋白質b、および/またはLDLコレステロールに関連した、および/またはこれにより引き起こされる障害、たとえば高コレステロール血症を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用される。幾つかの態様において、異種性ポリマーミセルは、PCSK9を発現する細胞に、PCSK9-サイレンシングポリヌクレオチド薬剤(たとえばsiRNA)をデリバーする。幾つかの態様において、細胞は肝細胞である。
幾つかの態様において、本明細書で提供される異種性ポリマーミセル (たとえばミセル) は、望ましくない細胞増殖 (たとえば悪性または非悪性の細胞増殖) に対する危険があるか、またはそれに罹患している被検体を治療する際に有用である。治療は、異種性ポリマーミセルおよび治療用薬剤 (たとえばオリゴヌクレオチド薬剤) を含む組成物であって、治療用薬剤が、望ましくない細胞増殖を促進する遺伝子または遺伝子産物を(たとえば切断により)サイレンシングさせることができる組成物を提供すること；および治療的に有効な量の異種性ポリマーミセルを被検体 (たとえばヒト被検体) に投与することを含む。幾つかの態様において、治療用薬剤は、遺伝子に対して相同性があり、遺伝子を(たとえば切断により)サイレンシングさせることができるポリヌクレオチド(たとえばオリゴヌクレオチド)である。
ある態様において、遺伝子は、増殖因子または増殖因子レセプター遺伝子、ホスファターゼ、キナーゼ、たとえば蛋白質チロシン、セリンまたはトレオニンキナーゼ遺伝子、アダプター蛋白質遺伝子、G蛋白質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、または転写因子をコードする遺伝子であるが、これらに限定されない。幾つかの例において、組成物は、異種性ポリマーミセル、および肺、膵臓、肝臓、腎臓、卵巣、筋肉、皮膚、乳房、結腸、胃などを含むがこれらに限定されない特定の組織または器官で発現される遺伝子をサイレンシングさせるポリヌクレオチドを含む。
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、以下の遺伝子の一または複数をサイレンシングさせる：PDGFベータ遺伝子、これにより、望ましくないPDGFベータ発現により特徴づけられる障害、たとえば精巣および肺の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；Erb-B遺伝子 (たとえばErb-B-2またはErb-B-3)、これにより、望ましくないErb-B発現により特徴づけられる障害、たとえば乳房または肺の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；Src遺伝子、これにより、望ましくないSrc発現により特徴づけられる障害、たとえば結腸の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；CRK遺伝子、これにより、望ましくないCRK発現により特徴づけられる障害、たとえば結腸および肺の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる：GRB2遺伝子、これにより、望ましくないGRB2発現により特徴づけられる障害、たとえば扁平上皮癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；RAS遺伝子、これにより、望ましくないRAS発現により特徴づけられる障害、たとえば膵臓、結腸および肺の癌、および慢性白血病を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；MEKK遺伝子、これにより、望ましくないMEKK発現により特徴づけられる障害、たとえば扁平上皮癌、黒色腫または白血病を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；JNK遺伝子、これにより、望ましくないJNK発現により特徴づけられる障害、たとえば膵臓または乳房の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；RAF遺伝子、これにより、望ましくないRAF発現により特徴づけられる障害、たとえば肺癌または白血病を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；Erk1/2遺伝子、これにより、望ましくないErk1/2発現により特徴づけられる障害、たとえば肺癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；PCNA(p21)遺伝子、これにより、望ましくないPCNA発現により特徴づけられる障害、たとえば肺癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；MYB遺伝子、これにより、望ましくないMYB発現により特徴づけられる障害、たとえば結腸癌または慢性骨髄性白血病を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；c-MYC遺伝子、これにより、望ましくないc-MYC発現により特徴づけられる障害、たとえばバーキットリンパ腫または神経芽細胞腫を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；JUN遺伝子、これにより、望ましくないJUN発現により特徴づけられる障害、たとえば卵巣、前立腺または乳房の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；FOS遺伝子、これにより、望ましくないFOS発現により特徴づけられる障害、たとえば皮膚または前立腺の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；BCL-2遺伝子、これにより、望ましくないBCL-2発現により特徴づけられる障害、たとえば肺もしくは前立腺の癌または非ホジキンリンパ腫を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；Cyclin D遺伝子、これにより、望ましくないCyclin D発現により特徴づけられる障害、たとえば食道および結腸の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；VEGF遺伝子、これにより、望ましくないVEGF発現により特徴づけられる障害、たとえば食道および結腸の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；EGFR遺伝子、これにより、望ましくないEGFR発現により特徴づけられる障害、たとえば乳癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；Cyclin A遺伝子、これにより、望ましくないCyclin A発現により特徴づけられる障害、たとえば肺および子宮頸部の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；Cyclin E遺伝子、これにより、望ましくないCyclin E発現により特徴づけられる障害、たとえば肺および乳房の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；WNT-1遺伝子、これにより、望ましくないWNT-1発現により特徴づけられる障害、たとえば基底細胞癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；ベータ-カテニン（beta-catenin）遺伝子、これにより、望ましくないベータ-カテニン発現により特徴づけられる障害、たとえば腺癌または肝細胞癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；c-MET遺伝子、これにより、望ましくないc-MET発現により特徴づけられる障害、たとえば肝細胞癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；PKC遺伝子、これにより、望ましくないPKC発現により特徴づけられる障害、たとえば乳癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；NFKB遺伝子、これにより、望ましくないNFKB発現により特徴づけられる障害、たとえば乳癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；STAT3遺伝子、これにより、望ましくないSTAT3発現により特徴づけられる障害、たとえば前立腺癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；サーバイビン(survivin)遺伝子、これにより、望ましくないサーバイビン発現により特徴づけられる障害、たとえば子宮頸部または膵臓の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；Her2/Neu遺伝子、これにより、望ましくないHer2/Neu発現により特徴づけられる障害、たとえば乳癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；トポイソメラーゼI遺伝子、これにより、望ましくないトポイソメラーゼI発現により特徴づけられる障害、たとえば卵巣および結腸の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；トポイソメラーゼIIアルファ遺伝子、これにより、望ましくないトポイソメラーゼII発現により特徴づけられる障害、たとえば乳房および結腸の癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる。
他の態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、以下の遺伝子の一つにおける変異をサイレンシングさせる：p73遺伝子、これにより、望ましくないp73発現により特徴づけられる障害、たとえば結腸直腸の腺癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；p21(WAF1/CIP1)遺伝子、これにより、望ましくないp21(WAF1/CIP1)発現により特徴づけられる障害、たとえば肝臓癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；p27(KIP1)遺伝子、これにより、望ましくないp27(KIP1)発現により特徴づけられる障害、たとえば肝臓癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；PPM1D遺伝子、これにより、望ましくないPPM1D発現により特徴づけられる障害、たとえば乳癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；RAS遺伝子、これにより、望ましくないRAS発現により特徴づけられる障害、たとえば乳癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；カベオリン(caveolin)I遺伝子、これにより、望ましくないカベオリンI発現により特徴づけられる障害、たとえば食道扁平上皮癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；MIB I遺伝子、これにより、望ましくないMIB I発現により特徴づけられる障害、たとえば男性乳癌(MBC)を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；MTAI遺伝子、これにより、望ましくないMTAI発現により特徴づけられる障害、たとえば卵巣癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；M68遺伝子、これにより、望ましくないM68発現により特徴づけられる障害、たとえば食道、胃、結腸、および直腸のヒト腺癌を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる。
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、癌抑制遺伝子における変異をサイレンシングさせ、これにより、化学療法と組合せてアポトーシス活性を促進する方法として使用することができる。幾つかの態様において、癌抑制遺伝子は、以下の癌抑制遺伝子の一または複数から選択される：p53癌抑制遺伝子、p53ファミリーのメンバーDN-p63、pRb癌抑制遺伝子、APC1癌抑制遺伝子、BRCA1癌抑制遺伝子、PTEN癌抑制遺伝子。
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、以下の融合遺伝子の一つをサイレンシングさせる：mLL融合遺伝子、たとえばmLL-AF9、これにより、望ましくないmLL融合遺伝子発現により特徴づけられる障害、たとえば急性白血病を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；BCR/ABL融合遺伝子、これにより、望ましくないBCR/ABL融合遺伝子発現により特徴づけられる障害、たとえば急性および慢性白血病を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；TEL/AML1融合遺伝子、これにより、望ましくないTEL/AML1融合遺伝子発現により特徴づけられる障害、たとえば小児急性白血病を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；EWS/FLI1融合遺伝子、これにより、望ましくないEWS/FLI1融合遺伝子発現により特徴づけられる障害、たとえばユーイング肉腫を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；TLS/FUS1融合遺伝子、これにより、望ましくないTLS/FUS1融合遺伝子発現により特徴づけられる障害、たとえば粘液性脂肪肉腫を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；PAX3/FKHR融合遺伝子、これにより、望ましくないPAX3/FKHR融合遺伝子発現により特徴づけられる障害、たとえば粘液性脂肪肉腫を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；AML1/ETO融合遺伝子、これにより、望ましくないAML1/ETO融合遺伝子発現により特徴づけられる障害、たとえば急性白血病を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる。
ここで幾つかの側面において、異種性ポリマーミセルおよび薬剤、たとえばポリヌクレオチドを含む組成物は、脈管形成阻害により利益を得ることができる疾患または障害、たとえば癌または網膜変性に対する危険があるか、またはそれに罹患している被検体、たとえばヒトを治療するための治療用薬剤を提供する。治療は、オリゴヌクレオチド薬剤を含む異種性ポリマーミセルであって、前記オリゴヌクレオチド薬剤が、脈管形成を媒介する遺伝子(たとえば、VEGF-R1、VEGF-R2またはこれらレセプター経路のシグナリング蛋白質をコードする遺伝子)に対して相同性があり、および/またはそれをたとえば切断によりサイレンシングさせることができる異種性ポリマーミセルを提供すること；および治療的に有効な投薬量の、オリゴヌクレオチド薬剤を含む前記異種性ポリマーミセルを被検体 (たとえばヒト被検体) に投与することを含む。
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、以下の遺伝子の一つをサイレンシングさせる：アルファvインテグリン遺伝子、これにより、望ましくないアルファVインテグリンにより特徴づけられる障害、たとえば脳腫瘍または上皮由来の腫瘍を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；Flt-1レセプター遺伝子、これにより、望ましくないFlt-1レセプターにより特徴づけられる障害、たとえば癌および慢性関節リウマチを有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる；チューブリン遺伝子、これにより、望ましくないチューブリンにより特徴づけられる障害、たとえば癌および網膜新生血管を有するか、またはそれに対する危険がある被検体を治療するために使用することができる。
幾つかの側面において、異種性ポリマーミセルおよびオリゴヌクレオチド薬剤を含む組成物は、ウイルスに感染しているか、あるいはウイルス感染に関連した障害または疾患に対する危険があるか、またはそれに罹患している被検体を治療する方法に関連がある。当該方法は、オリゴヌクレオチド薬剤を含む異種性ポリマーミセルであって、前記オリゴヌクレオチド薬剤が、ウイルス遺伝子またはウイルスの機能を媒介する細胞遺伝子に対して相同性があり、および/またはそれをたとえば切断によりサイレンシングすることができる異種性ポリマーミセルを提供すること；および治療的に有効な用量の前記オリゴヌクレオチド薬剤を被検体、たとえばヒト被検体に投与することを含む。
幾つかの態様において、異種性ポリマーミセルおよびオリゴヌクレオチド薬剤を含む組成物は、ヒトパピローマウイルス(HPV)に感染しているか、あるいはHPVにより媒介される障害、たとえば子宮頸癌に対するリスクがあるか、またはそれに罹患している被検体を治療する際に有用である。
幾つかの態様において、組成物は、異種性ポリマーミセル、およびHPV遺伝子の発現をサイレンシングして低下させるオリゴヌクレオチド薬剤を含む。幾つかの態様において、HPV遺伝子は、E2、E6、またはE7の群から選択される。
別の態様において、HPV複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。
幾つかの態様において、組成物は、異種性ポリマーミセル、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染しているか、あるいはHIVにより媒介される障害、たとえば後天性免疫不全症候群(AIDS)に対するリスクがあるか、またはそれに罹患している患者を治療する際に有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。幾つかの態様において、HIV遺伝子の発現を低下させる。他の態様において、HIV遺伝子は、CCR5、Gag、またはRevである。幾つかの態様において、HIV複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。幾つかの態様において、遺伝子はCD4またはTsg101である。
幾つかの態様において、組成物は、異種性ポリマーミセル、およびＢ型肝炎ウイルス(HBV)に感染しているか、あるいはHBVにより媒介される障害、たとえば肝硬変症および肝細胞癌に対するリスクがあるか、またはそれに罹患している患者を治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。一つの態様において、HBV遺伝子の発現を低下させる。他の態様において、ターゲットとされるHBV遺伝子は、HBVコアタンパク質のテール領域、pre-cregious (pre-c) 領域、またはcregious (c) 領域の群の一つをコードする。他の態様において、ターゲットとされるHBV-RNA配列は、ポリ(A)テールから構成される。幾つかの態様において、HBV複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。
幾つかの態様において、組成物は、異種性ポリマーミセル、および以下のウイルスから選択されるウイルスに感染しているか、あるいはそれにより媒介される障害に対するリスクがあるか、またはそれに罹患している患者を治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む：Ａ型肝炎ウイルス(HAV)；Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)；Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨ型肝炎を含む肝炎ウイルス株の群の何れか；呼吸器系合胞体ウイルス(RSV)；ヘルペスサイトメガロウイルス(CMV)；ヘルペスエプスタイン-バーウイルス(EBV)；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)；JCウイルス(JCV)；ミクソウイルス(たとえば、インフルエンザを引き起こすウイルス)、ライノウイルス(たとえば、感冒を引き起こすウイルス)、またはコロナウイルス(たとえば、感冒を引き起こすウイルス)；セントルイス脳炎フラビウイルス；ダニ媒介脳炎フラビウイルス；マリーバレー脳炎フラビウイルス；デング熱フラビウイルス；シミアンウイルス40(SV40)；脳心筋炎ウイルス(EMCV)；麻疹ウイルス(MV)；水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)；アデノウイルス(たとえば、気道感染症を引き起こすウイルス)；ポリオウイルス；またはポックスウイルス(痘瘡を引き起こすポックスウイルス)。幾つかの態様において、これらウイルスの複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。
幾つかの態様において、組成物は、異種性ポリマーミセル、および単純ヘルペスウイルス (HSV) に感染しているか、あるいはHSVにより媒介される障害、たとえば主に免疫障害を持つ患者における、たとえば陰部ヘルペスおよび単純ヘルペス、並びに致命的または視力障害の疾患に対するリスクがあるか、またはそれに罹患している患者を治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。幾つかの態様において、HSV遺伝子の発現を低下させる。他の態様において、ターゲットとされるHSV遺伝子は、DNAポリメラーゼまたはヘリカーゼ−プライマーゼをコードする。幾つかの態様において、HSV複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。
幾つかの態様において、組成物は、異種性ポリマーミセル、および西ナイルウイルスに感染しているか、あるいは西ナイルウイルスにより媒介される障害に対するリスクがあるか、またはそれに罹患している患者を治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。幾つかの態様において、西ナイルウイルス遺伝子の発現を低下させる。他の好ましい態様において、西ナイルウイルス遺伝子は、E、NS3、またはNS5を含む群から選択される。幾つかの態様において、西ナイルウイルスの複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。
幾つかの態様において、異種性ポリマーミセルは、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)に感染している患者、あるいはこのウイルスに関連した疾患または障害、たとえば白血病またはミエロパシーを治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。幾つかの態様において、HTLV遺伝子の発現を低下させる。幾つかの態様において、HTLV1遺伝子は、Tax転写アクチベーターである。幾つかの態様において、HTLV複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。
幾つかの側面において、組成物は、異種性ポリマーミセル、および病原体、たとえば細菌、アメーバ、寄生生物、または真菌の病原体に感染した被検体を治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。治療方法は、オリゴヌクレオチド薬剤を含む異種性ポリマーミセルであって、前記オリゴヌクレオチドが、病原体の遺伝子または病原体の増殖に関与する遺伝子に対して相同性があり、それをたとえば切断によりサイレンシングさせることができる異種性ポリマーミセルを提供すること；および治療的に有効な用量の前記オリゴヌクレオチド薬剤を被検体、たとえばヒト被検体に投与することを含む。ターゲット遺伝子は、病原体の増殖、細胞壁の合成、蛋白質の合成、転写、エネルギー代謝、たとえばクレブス回路、または毒素の産生に関与する遺伝子から選択することができる。
このため、幾つかの態様において、組成物は、異種性ポリマーミセル、およびマラリアを引き起こすマラリア原虫(plasmodium)に感染した患者を治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。幾つかの態様において、マラリア原虫遺伝子の発現を低下させる。他の態様において、遺伝子は、先端膜抗原１(apical membrane antigen 1) (AMA1)である。幾つかの態様において、マラリア原虫の複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。
幾つかの態様において、異種性ポリマーミセルは、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・リプレ(Mycobacterium leprae)、ストレプトコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)に感染した患者、あるいはこれら病原体の何れかと関連した疾患または障害を治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。幾つかの態様において、細菌遺伝子および/またはこれら細菌の複製に必要なヒト遺伝子の発現を低下させる。
幾つかの態様において、異種性ポリマーミセルおよびここで提供される薬剤を含む組成物により治療される疾患は、全身性であってもよいし、特定の組織、たとえば肺、皮膚、肝臓、乳房、腎臓、膵臓、CNSなどに存在してもよい。ある側面において、オリゴヌクレオチドは、代謝疾患または障害、たとえば糖尿病、肥満症などを媒介するか、またはそれに関与する遺伝子をサイレンシングさせる。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、肺の疾患または障害、たとえば慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症、または肺癌を媒介するか、またはそれに関与する遺伝子をサイレンシングさせる。本明細書で幾つかの側面において、異種性ポリマーミセルは、望ましくない免疫応答、たとえば炎症性疾患もしくは障害、または自己免疫疾患もしくは障害により特徴づけられる疾患または障害に対する危険があるか、またはそれに罹患している被検体、たとえばヒトを治療する方法に有用な、および/または当該方法に関連したオリゴヌクレオチド薬剤を含む。当該方法は、オリゴヌクレオチド薬剤を含む異種性ポリマーミセルであって、前記オリゴヌクレオチド薬剤が、望ましくない免疫応答を媒介する遺伝子に対して相同性があり、および/またはそれをたとえば切断によりサイレンシングさせることができる異種性ポリマーミセルを提供すること；および前記オリゴヌクレオチド薬剤を被検体、たとえばヒト被検体に投与することを含む。幾つかの態様において、疾患または障害は、虚血または再灌流傷害、たとえば、急性心筋梗塞、不安定狭心症、心肺バイパス、外科的介入、たとえば血管形成術、たとえば経皮経管冠状動脈形成術、移植された器官または組織に対する応答、たとえば移植された心臓または脈管の組織；または血栓崩壊と関連した虚血または再灌流傷害である。他の態様において、疾患または障害は、再狭窄、たとえば、外科的介入、たとえば血管形成術、たとえば経皮経管冠状動脈形成術と関連した再狭窄である。他の態様において、疾患または障害は、炎症性腸疾患、たとえばクローン病または潰瘍性大腸炎である。幾つかの態様において、疾患または障害は、感染または傷害と関連した炎症である。他の態様において、疾患または障害は、喘息、アレルギー、狼瘡、多発性硬化症、糖尿病、たとえばII型糖尿病、関節炎、たとえばリウマチ様または乾癬性の関節炎である。ある態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、インテグリンまたはその共通リガンド(co-ligand)、たとえばVLA4、VCAM、ICAMをサイレンシングさせる。他の態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、セレクチンまたはその共通リガンド(co-ligand)、たとえばP-セレクチン、E-セレクチン(ELAM)、I-セレクチン、P-セレクチン糖蛋白質-1(PSGL-1)をサイレンシングさせる。ある態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、補体系の構成成分、たとえばC3、C5、C3aR、C5aR、C3コンバターゼ、およびC5コンバターゼをサイレンシングさせる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、ケモカインまたはそのレセプター、たとえばTNFI、TNFJ、IL-1I、IL-1J、IL-2、IL-2R、IL-4、IL 4R、IL-5、IL-6、IL-8、TNFRI、TNFRII、IgE、SCYA11、およびCCR3をサイレンシングさせる。他の態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、GCSF、Gro1、Gro2、Gro3、PF4、MIG、プロ血小板塩基性タンパク質(Pro-Platelet Basic Protein (PPBP))、MIP-1I、MIP-1J、RANTES、MCP-1、MCP-2、MCP-3、CMBKR1、CMBKR2、CMBKR3、CMBKR5、AIF-1、またはI-309をサイレンシングさせる。
幾つかの側面において、組成物は、異種性ポリマーミセル、および神経疾患もしくは障害に対する危険があるか、またはそれに罹患している被検体、たとえばヒトを治療するために有用なオリゴヌクレオチド薬剤を含む。方法は、オリゴヌクレオチド薬剤を含む異種性ポリマーミセルであって、前記オリゴヌクレオチドが、神経疾患もしくは障害を媒介する遺伝子に対して相同性があり、および/またはそれをたとえば切断によりサイレンシングさせることができる異種性ポリマーミセルを提供すること；および治療的に有効な用量の前記オリゴヌクレオチド薬剤を被検体、たとえばヒトに投与することを含む。幾つかの態様において、疾患または障害は、アルツハイマー病またはパーキンソン病である。ある態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、アミロイドファミリー遺伝子、たとえばAPP；プレセニリン(presenilin)遺伝子、たとえばPSEN1およびPSEN2、またはI-シヌクレイン(synuclein)をサイレンシングさせる。他の態様において、疾患または障害は、神経変性トリヌクレオチドリピート病、たとえばハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(dentatorubral pallidoluysian atrophy)または脊髄小脳失調症、たとえばSCA1、SCA2、SCA3 (マチャド−ジョセフ病)、SCA7またはSCA8である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、HD、DRPLA、SCA1、SCA2、MJD1、CACNL1A4、SCA7、またはSCA8をサイレンシングさせる。
ある側面において、組成物は、異種性ポリマーミセル、および２以上の遺伝子を切断またはサイレンシングすることができるオリゴヌクレオチド薬剤を含む。これらの態様において、オリゴヌクレオチド薬剤は、２以上の遺伝子に見出される配列、たとえばこれら遺伝子の間で保存された配列に対して十分なホモロジーを有するように選択される。このため、幾つかの態様において、かかる配列をターゲットとするオリゴヌクレオチド薬剤は、遺伝子の全コレクションを効果的にサイレンシングする。
以下の実施例は、本発明の種々の例示的態様、並びに合成方法および種々の生物学的および他の活性パラメーターを提供する。しかし、実施例は、本発明の態様の幾つかのみに関して詳細を提供し、限定することを意図しない。
以下の実施例において、種々の公知の頭字語および簡略表記を用いて、種々のモノマーまたはかかるモノマーの重合に由来するモノマー残基を記載する。別途記載した場合を除き、限定することなく：「ＢＭＡ」（または対応する簡略表記としての文字「Ｂ」）は、ブチルメタクリレートまたはそれに由来するモノマー残基を表し；「ＤＭＡＥＭＡ」（または対応する簡略表記としての文字「Ｄ」）は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートまたはそれに由来するモノマー残基を表し；「Ｇａｌ」は、ガラクトース（任意にヒドロキシル保護部分（たとえばアセチル）を含む）またはそれに由来するｐｅｇ化した（pegylated）誘導体（下記のとおり）を指し；「ＭＡＡ」は、メチルアクリル酸またはそれに由来するモノマー残基を表し；「ＮＨＳ」は、Ｎ−ヒドロキシル−スクシンイミドまたはそれに由来するモノマー残基を表し；「ＰＡＡ」（または対応する簡略表記としての文字「Ｐ」）は、２−プロピルアクリル酸またはそれに由来するモノマー残基を表し、「ＰＥＧＭＡ」は、ｐｅｇ化したメタクリルモノマー、メトキシ−(ＣＨ２Ｏ)７−８−メチルメタクリレート、またはこれに由来するモノマー残基を指す。各々の場合において、任意のかかる記号表示は、モノマー（全ての塩またはそのイオン化類似体を含む）、またはモノマーの重合に由来するモノマー残基（全ての塩またはそのイオン化類似体を含む）を示し、示された特定の形態は、文脈により当業者に明らかである。
例１：可逆的付加開裂連鎖移動 (RAFT) 重合によるブロック共重合体の調製のための一般的合成手順
例１．１ ブロック共重合体 [DMAEMA]-[DMAEMA / PAA / BMA] の調製
Ａ．RAFT連鎖移動剤(CTA)
連鎖移動剤(CTA)、4-シアノ-4-(エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸 (ECT)（以下のＲＡＦＴ重合に利用される）の合成は、Moad et al., Polymer, 2005, 46(19): 8458-68による手順から適合させた。要約すると、エタンチオール(4.72 g, 76 mmol)を10分間にわたって、ジエチルエーテル(150 ml)中の水素化ナトリウム(油中60％)(3.15 g, 79 mmol)の攪拌懸濁液に、0℃で添加した。その後、溶液を、二硫化炭素(6.0 g, 79 mmol)の添加前に10分間攪拌した。粗製S-エチルトリチオカルボン酸ナトリウム(7.85 g, 0.049 mol)を濾過により回収し、ジエチルエーテル(100 mL)中に懸濁し、ヨウ素(6.3 g, 0.025 mol)と反応させた。１時間後、溶液を濾過し、チオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。その後、粗製ビス(エチルスルファニルチオカルボニル)ジスルフィドをロータリーエバポレーションにより単離した。ビス-(エチルスルファニルチオカルボニル)ジスルフィド(1.37 g, 0.005 mol)および4,4’-アゾビス(4-シアノペンタン酸)(2.10 g, 0.0075 mol)の酢酸エチル(50 mL)溶液を、18時間、還流下で加熱した。溶媒のロータリーエバポレーションの後、粗製4-シアノ-4 (エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸(ECT)を、固定相としてシリカゲル、溶出液として50:50酢酸エチルへキサンを用いてカラムクロマトグラフィーにより単離した。
Ｂ．ポリ(N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート)マクロ連鎖移動剤 (ポリDMAEMAマクロCTA)
DMAEMAのRAFT重合は、ECTおよび2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(V-70)(Wako chemicals)をラジカルイニシエータとして用いて、18時間かけて窒素雰囲気下で、DMF中30℃で行った。初期のモノマー対ＣＴＡの比([CTA]0/[M]0)は、100％変換での理論上のMnが10,000(g/ml)となるものであった。初期のＣＴＡ対イニシエータの比([CTA]o/[I]o)は、10:1であった。得られたポリDMAEMAマクロ連鎖移動剤は、50:50 v:vジエチルエーテル/ペンタンに沈殿させることにより単離した。得られたポリマーは、アセトンに再溶解させ、その後ペンタン(x3)に沈殿させ、真空中で一晩乾燥させた。
Ｃ．ポリ(DMAEMA)マクロCTAから調製したブロック共重合体 [DMAEMA]-[DMAEMA / PAA / BMA]
所望の化学量論的な量のN,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート (DMAEMA)、プロピルアクリル酸 (PAA)、およびブチルメタクリレート (BMA)を、N,N-ジメチルホルムアミドに溶解したポリ(DMAEMA)マクロCTAに添加した（溶媒に対して25 wt％のモノマーおよびマクロCTA）。全ての重合について、[M]o/[CTA]oおよび[CTA]o/[I]oは、それぞれ250:1および10:1であった。V70の添加後、溶液を窒素で30分間パージし、18時間かけて30℃で反応させ、含有されるモノマーを共重合させて[DMAEMA / PAA / BMA]ランダム共重合体ブロックを形成した。得られたジブロック共重合体は、50:50 v:vジエチルエーテル/ペンタンに沈殿させることにより単離した。その後、沈殿したポリマーは、アセトンに再溶解させ、その後ペンタン(x3)に沈殿させ、真空中で一晩乾燥させた。
ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)を用いて、DMF中のポリ(DMAEMA)マクロCTAおよび[DMAEMA]-[DMAEMA / PAA / BMA]ジブロック共重合体の各々の分子量および多分散性(PDI, Mw/Mn)を、ポリメチルメタクリレートのスタンダードに対して決定した（Viscotek GPCmax VE2001および屈折計VE3580 (Viscotek, Houston, TX) に直列に連結したSEC Tosoh TSK-GEL R-3000およびR-4000カラム (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA)）。1.0 wt％ LiBrを含有するHPLC-グレードDMFを、移動相として使用した。
表１．１Ａおよび表１．１Ｂは、ここに記載されるとおり調製され、種々の相対的な比の分子量(親水性ブロック：疎水性ブロック)を有し、RAFT合成されたポリマーの疎水性ブロックの種々の組成のモノマー残基を有する、[DMAEMA]-[DMAEMA / PAA / BMA]ブロック共重合体を要約する。
表１．１Ａおよび１．１Ｂにおいて、文字「D」は、DMAEMA(またはDMAEMAに由来するモノマー残基)を表し、「P」は、PAA(またはPAAに由来するモノマー残基)を表し、「B」は、BMA(またはBMAに由来するモノマー残基)を表す。表１．１Ａに関して、ここで参照されるポリマーは、種々の記号表示により、幾つかの先に出願された先願で以前に参照され、それぞれは、かかるポリマーが「P7」ポリマーと一般に称されるポリマーのクラスのメンバーであることを示す。たとえば、P7ポリマーであるP7v6は、「P7v6」および「PRx0729v6」として、かかる先願の一または複数において以前に参照されている。表１．１Ｂにおいて、粒子サイズは、例５に実質的に記載されるとおり動的光散乱により決定した。
Figure 2012500793
Figure 2012500793
例１．２：ブロック共重合体 [PEGMA]-[DMAEMA / PAA / BMA] の調製
Ａ．RAFT連鎖移動剤(CTA)
連鎖移動剤(CTA)、4-シアノ-4-(エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸 (ECT) は、例１．１Ａに記載されるとおり調製した。
Ｂ．ポリ(メトキシ-(CH 2 O) 7-8 -メチル)メタクリレート)マクロ連鎖移動剤 (ポリPEGMAマクロCTA)
ポリPEGMAマクロCTAは、(DMAEMAの代わりにPEGMAを使用して)例１．１Ｂに実質的に記載されるとおりメトキシ-(CH2O)7-8-メチル)メタクリレート (PEGMA) モノマーのRAFT重合により調製した。
Ｃ．ポリ(PEGMA)マクロCTAからの[PEGMA]-[DMAEMA / PAA / BMA]のブロック共重合体
所望の化学量論的な量のDMAEMA、PAA、およびBMAを、N,N-ジメチルホルムアミドに溶解したポリ(PEGMA)マクロCTAに添加した（溶媒に対して25 wt％のモノマーおよびマクロCTA）。全ての重合について、[M]o/[CTA]oおよび[CTA]o/[I]oは、それぞれ250:1および10:1であった。AIBNの添加後、溶液を窒素で30分間パージし、6〜12時間かけて68℃で反応させ、含有されるモノマーを共重合させて、図２に図式的に示されるとおり[DMAEMA / PAA / BMA]ランダム共重合体ブロックを形成した。得られたジブロック共重合体は、50:50 v:vジエチルエーテル/ペンタンに沈殿させることにより単離した。その後、沈殿したポリマーは、アセトンに再溶解させ、その後ペンタン(x3)に沈殿させ、真空中で一晩乾燥させた。
ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)を用いて、DMF中のポリ(PEGMA)マクロCTAおよび[PEGMA]-[DMAEMA / PAA / BMA]ジブロック共重合体の各々の分子量および多分散性(PDI, Mw/Mn)を、Viscotek GPCmax VE2001および屈折計VE3580 (Viscotek, Houston, TX)を使用して決定した。1.0 wt％ LiBrを含有するHPLC-グレードDMFを、移動相として使用した。CDCl3におけるNMRスペクトロスコピーを用いて、ポリマー構造を確認し、第２の疎水性ブロック [DMAEMA / PAA / BMA] の組成を計算した。
図３Ａは、ここに記載されるとおり調製された代表的な [PEGMAw]-[DMAEMA / PAA / BMA] ブロック共重合体、ポリマー4.8の特徴を要約し（図３Ａで「P7-PEGMA 100」とも称される）、ここで表記「PEGMAw」における「w」の添字は、メタクリレートモノマー残基から垂れ下がったポリエチレングリコール繰返し単位の数を指す。この文脈において、たとえば、ブロック表記 [PEGMAw]（ここでw= 7-8）は、ポリ(メトキシ-(CH 2 O) 7-8 -メチル)メタクリレートに由来するモノマー残基を含むブロックを指す(図２参照)。図３Ａは、親水性第１ブロック [PEGMAw] および疎水性第２ブロック [DMAEMA / PAA / BMA] についての数平均分子量Mnおよび多分散性指数 (PDI)、並びにこのポリマーの第２ブロックのモノマー残基の相対的な組成を報告する。図３Ｂは、ポリマーP7-PEGMA 100についての1H NMRデータを示し、かかるデータは、例５に実質的に記載されるとおり得られる。図３Ｃは、上記で記載されるとおり得られたGPCデータを示し、屈折率(RI)および光散乱(LS)検出器からのトレースを含む。
例２および例３：ターゲティングリガンドおよびポリヌクレオチドをブロック共重合体に結合するための方法
例２および例３は、代表的なターゲティングリガンド (たとえばガラクトース) を、アルファ端-ターゲティング部分としてブロック共重合体に結合する、または(付加的もしくは択一的に)代表的な結合可能なモノマー残基 (たとえばMAA(NHS)) の一または複数のペンダント部分を介してターゲティングリガンドを結合するための方法を実証する。また、例３は、ポリヌクレオチド (たとえばsiRNA、たとえば対象の治療剤として) をブロック共重合体に結合することを実証する。要約すると：(1) ブロック共重合体は、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)(Chiefari et al. Macromolecules. 1998;31(16):5559-5562)重合を用いて調製した。具体的には、ガラクトースでアルファ端が官能化されたジブロック共重合体は、離脱基RL置換基としてガラクトースを有する連鎖移動剤を用いて形成した。(2) ジブロック共重合体の第１親水性ブロックは、メチルアクリル酸-N-ヒドロキシスクシンイミド (MAA(NHS))を含有する共重合体として調製し、ここで、ガラクトース-PEG-アミンをNHS基に結合するか、またはアミノ-ジスルフィドsiRNAをNHSに結合するか、あるいはピリジルジスルフィドアミンをNHS基と反応させてピリジルジスルフィドを形成し、これをその後チオール化RNAと反応させてポリマーとRNAの結合体を形成した。
例２．１：ガラクトース-PEG-アミンおよびガラクトース-CTAの調製
下記スキーム１は、ガラクトース-PEG-アミン (化合物3) およびガラクトース-CTA (連鎖移動剤)(化合物4)のための合成スキームを図示する。
Ａ．化合物１：
ペンタアセテートガラクトース (10 g, 25.6 mmol) および2-[2-(2-クロロエトキシ)エトキシ]エタノール (5.6 mL, 38.4 mmol) を、ドライCH2Cl2 (64 mL)に溶解し、反応混合物をRTで1時間撹拌した。BF3.OEt2 (9.5 ml,76.8 mmol)を、氷浴中で1時間にわたって前記混合物に滴下した。反応混合物を室温(RT)で48時間撹拌した。反応後、30 mLのCH2Cl2を添加して反応を希釈した。有機層を飽和NaHCO3(aq)で中和し、塩水により洗浄し、その後MgSO4により乾燥させた。CH2Cl2を減圧下で除去して、粗生成物を得た。粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、中間生成物(化合物１)を淡黄色の油として得た。収率：55％ TLC（I2およびp-アニスアルデヒド)：EA/Hex：1/1 (Rf：β= 0.33；α= 0.32；未反応S.M 0.30)。
Ｂ．化合物２：
化合物１ (1.46 g, 2.9 mmol) をドライDMF (35 mL) に溶解し、NaN3 (1.5 g, 23.2 mmol) をRTで混合物に添加した。反応混合物を85〜90℃に一晩加熱した。反応後、EA (15 mL) を溶液に添加し、水 (50 mL) を用いて有機層を5回洗浄した。有機層をMgSO4により乾燥させ、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２を無色の油として得た。収率：80％、TLC (I2およびp-アニスアルデヒド)：EA/Hex：1/1 (Rf：0.33)。
Ｃ．化合物３：
化合物２ (1.034 g, 2.05 mmol) をMeOH (24 mL) に溶解し、N2で10分間バブリングし、その後Pd/C (10％) (90 mg) およびTFA (80μL)を前記溶液に添加した。反応混合物を再びH2で30分間バブリングし、その後反応をRTでH2下においてさらに３時間撹拌した。Pd/Cをセライトにより除去し、MeOHを蒸発させて、化合物３を粘着性ゲルとして得た。化合物３は、さらに精製することなく使用することができる。収率：95％。TLC (p-アニスアルデヒド）：MeOH/CH2Cl2：1/4 (Rf：0.05)。
Ｄ．化合物４：
ECT (0.5 g, 1.9 mmol)、NHS (0.33 g, 2.85 mmol) およびDCC (0.45 g, 2.19 mmol) を、0℃でCHCl3 (15 mL) に溶解した。反応混合物をRTで一晩、継続して撹拌した。CHCl3 (10 mL) 中の化合物３ (1.13 g, 1.9 mmol) およびTEA (0.28 mL, 2.00 mmol) を、0℃で前記反応にゆっくり添加した。反応混合物をRTで一晩、継続して撹拌した。CH3Clを減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物４を黄色のゲルとして得た。収率 (35％)。TLC：MeOH/ CH2Cl2：1/9 (Rf：0.75)。
Figure 2012500793
例２．２：共重合体 [DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA] の合成
Ａ．DMAEMAマクロCTAの合成
重合(表２．２Ａ)：20 mLガラスバイアル（隔壁キャップ（septa cap）を備える）に、33.5 mg ECT (RAFT CTA)、2.1 mg AIBN (メタノールから2回再結晶させた)、3.0 g DMAEMA (Aldrich, 98%,使用する直前に小さいアルミナカラムを通過させ、阻害剤を除去した)、および3.0 g DMF (阻害剤を含まず、高純度) を添加した。ガラスバイアルを隔壁キャップで閉じ、ドライ窒素で30分間パージした（撹拌しながら氷浴中で行った）。反応バイアルを、予め加熱した反応ブロックに70℃で置いた。反応混合物を2時間40分撹拌した。隔壁キャップを開け、混合物を氷浴中のバイアルで2〜3分間撹拌して、重合反応を停止させた。
精製：3 mLのアセトンを反応混合物に添加した。300 mLビーカーに、240 mLへキサンおよび60 mLエーテル (80/20 (v/v)) を添加し、撹拌しながら反応混合物をビーカーに一滴ずつ加えた。最初に、これにより、濁った溶液を遠心沈降させることにより回収される油を生成させた；収率 = 1.35 g (45％)。アセトン溶液からヘキサン/エーテル(80/20 (v/v))混合溶媒で、数回沈殿を行った（たとえば6回）。最後に、ポリマーをRTで８時間、真空下で乾燥させた；収率 = 1 g。まとめ：(45％ conv.で、Ｍn,理論 = 11,000 g/mol)。
Figure 2012500793
Ｂ．DMAEMAマクロCTAからのブロック共重合体 [DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]の合成
全ての化学物質および試薬は、特に示さない限り、Sigma-Aldrich Companyから購入した。ブチルメタクリレート (BMA)(99%)、2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート (DMAEMA)(98%)は、塩基性アルミナのカラム (150メッシュ) に通して、重合阻害剤を除去した。2-プロピルアクリル酸 (PAA)(>99%) は、阻害剤なしで購入し、そのまま使用した。アゾビスイソブチロニトリル (AIBN)(99%) は、メタノールから再結晶させ、真空下で乾燥させた。例２．２Ａで上述した通り、DMAEMAマクロCTAを合成し、精製した (Mn〜10000；DI〜1.3；>98%)。N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)(99.99%)(EMDから購入) は試薬グレードであり、そのまま使用した。ヘキサン、ペンタンおよびエーテルはEMDから購入し、それらはポリマー精製のためにそのまま使用した。
重合：BMA (2.1 g, 14.7 mmoles)、PAA (0.8389 g, 7.5 mmoles)、DMAEMA (1.156 g, 7.35 mmoles)、DMAEMAマクロCTA (0.8 g, 0.0816 mmoles)、AIBN (1.34 mg, 0.00816 mmoles; CTA:AIBN 10:1) およびDMF (5.34 ml)を、密封バイアルに窒素下で添加した。使用したCTA：モノマーの比は、(50％の変換を仮定して) 1:360であった。モノマー濃度は3 Mであった。その後、混合物に窒素を30分間バブリングすることにより混合物を脱気し、その後、ヒーターブロックに置いた（温度計：67℃；ディスプレイ：70-71；撹拌スピード300-400 rpm)。反応を６時間続行し、その後、バイアルを氷中に置き、混合物を空気に晒すことにより反応を停止させた。
精製：ポリマーの精製は、アセトン/DMF 1:1からヘキサン/エーテル 75/25へと行った (3回)。得られたポリマーを少なくとも18時間真空下で乾燥させた。NMRスペクトルは、高純度のポリマーを示した。ビニル基は観察されなかった。ポリマーを、エタノールからダブル脱イオン水に対して4日間透析を行い、その後凍結乾燥させた。ポリマーを、以下の条件を用いてゲル透過クロマトグラフィー(GPC)により分析した：溶媒：DMF/LiBr 1％。流速：0.75 ml/min。注入体積：100μl。カラム温度：60℃。ポリ(スチレン)を用いて検出器を校正した。得られたポリマーのGPC分析：Mn=40889 g/mol。PDI=1.43。dn/dc=0.049967。
例２．３．gal-[DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]の合成
合成は、記載される点を除いて、例２．２に実質的に記載されるとおり行った。まず、連鎖移動剤としてECTの代わりにガラクトース-CTA (例２．１、cpd 4）を使用したことを除いて、例２．２Ａに実質的に記載されるとおりガラクトース-DMAEMAマクロ-CTAを調製し、アルファ端がガラクトースで官能化されたポリDMAEMAを得た (図４)。その後、例２．２．Ｂに実質的に記載されるとおり、ガラクトース-[DMAEMA]-マクロ-CTAを使用して、第２ブロック [BMA-PAA-DMAEMA]を合成した。合成後、100 mM重炭酸ナトリウム緩衝液 (pH 8.5) 中で2時間インキュベーションすることにより、ガラクトース上のアセチル保護基を除去し、その後、透析および凍結乾燥を行った。NMRスペクトロスコピーを用いて、ポリマー上の脱保護されたガラクトースの存在を確認した。
例２．４．ブロック共重合体 [PEGMA/ MAA(NHS)]-[BMA / PAA / DMAEMA] およびDMAEMA-MMA(NHS)-[BMA / PAA / DMAEMA] の調製
ポリマーの合成は、例２．２に実質的に記載されるとおり行った。
要約すると、PEGMAおよびMAA(NHS)モノマーを用いて、モノマー供給比を制御して第１ [PEGMA / MAA(NHS)] ブロックを調製して、種々の所望の組成の [PEGMA/ MAA(NHS)]-[BMA/ PAA/ DMAEMA] ポリマーを得た。代表的なブロック共重合体として、たとえば、第１ブロック中のモノマーの共重合比は、たとえば70：30 (PEGMA：MAA(NHS))であった。
DMAEMAおよびMAA(NHS)モノマーを用いて、モノマー供給比を制御して第２ポリマーの [DMAEMA / MMA(NHS)] 第１ブロックを同様に調製して、種々の所望の組成の [DMAEMA / MAA(NHS)]-[BMA/ PAA/ DMAEMA] ポリマーを得た。代表的なブロック共重合体として、たとえば、第１ブロック中のモノマーの共重合比は、たとえばDMAEMA：MAA(NHS)について70：30とすることができる。
例３．１．ブロック共重合体 (i) [DMAEMA / MAA(NHS)]-[BMA / PAA / DMAEMA] または(ii) [PEGMA / MAA(NHS)]-[BMA / PAA / DMAEMA] へのガラクトース-PEG-アミンの結合による、ガラクトース官能化ブロック共重合体 (i) [DMAEMA / MAA(Gal)]-[BMA / PAA / DMAEMA] または(ii) [PEGMA-MAA(Gal)]-[BMA-PAA-DMAEMA] の作成
図５は、ガラクトース官能化ブロック共重合体 (i) [DMAEMA/MAA(Gal)]-[BMA / PAA / DMAEMA] または(ii) [PEGMA-MAA(Gal)]-[BMA / PAA / DMAEMA] の調製を図示する。ポリマー [DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] または [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] (各々の場合において[B-P-D]は、[BMA / PAA / DMAEMA] ブロックを表す簡略表記である) を、例２．４に実質的に記載されるとおり調製し、1〜20 mg/mlの濃度でDMF中に溶解させた。例２．１ (cpd 3) に記載されるとおり調製されたガラクトース-PEG-アミンは、1〜2当量のトリエチルアミンで中和し、5対1のアミン対ポリマーの比で反応混合物に添加した。反応は、35℃で6〜12時間行い、その後、同体積のアセトンを添加し、脱イオン水に対して1日透析を行い、凍結乾燥させた。
例３．２．[PEGMA-MAA(NHS)]-[BMA / PAA / DMAEMA] へのsiRNAの結合による、ブロック共重合体 [PEGMA-MAA(RNA)]-[BMA/PAA/DMAEMA] の作成
図６Ａおよび図６Ｂは、NHS-含有ポリマー、たとえば例２．４に記載されるとおり調製されるブロック共重合体に結合可能な5’-修飾siRNAの構造を示す。図６Ｃは、NHS-含有ポリマーを誘導体化するのに適した2-エチルアミノ-ピリジルジスルフィドの構造を示し、これにより、チオール化RNA (図６Ｂ) を結合するためのジスルフィド反応性基を提供する。
Ａ．NHS-含有ブロック共重合体とアミノ-ジスルフィド-siRNAとの反応
(予言的(prophetic))NHS-含有ブロック共重合体 (たとえば、例２．４のとおり調製される) を、アミノ-ジスルフィド-siRNA (たとえば図６Ａ) と反応させる。反応は、有機溶媒(たとえば、DMFまたはDMSO、または混合溶媒DMSO/緩衝液 pH 7.8)からなる標準的な条件下において、35℃で4〜8時間行い、その後、同体積のアセトンを添加し、脱イオン水に対して1日透析を行い、凍結乾燥させる。
Ｂ．NHS-含有ブロック共重合体と、ピリジル-ジスルフィド-アミンとの反応および チオール化siRNAとの反応 (予言的)
ピリジル-ジスルフィド-アミンとNHS含有ポリマー (例２．４のとおり調製される) との反応 (図６Ｃ)は、例３に実質的に記載されるとおり行われる。その後、凍結乾燥されたポリマーは、エタノール中に50 mg/mlで溶解させ、pH 8の重炭酸ナトリウム緩衝液で10倍希釈した。チオール化siRNA (図６Ｂ)を、35℃で4〜8時間、ポリマーのNHS基に対して2〜5モル過剰で反応させ、その後、リン酸緩衝液pH 7.4に対して透析を行った。
例３．３．siRNAとブロック共重合体 (たとえば[PEGMA/DMAEMA]-[BMA/PAA/DMAEMA])とのイオン結合
負電荷のsiRNAは、例４および例６で更に完全に記載されるとおり、陽イオン性モノマー残基 (たとえばDMAEMAの重合に由来する) とイオン結合させた。siRNA対ポリマーの種々の所望の比を評価した；各々を、所望のpH (たとえば生理学的関連のpH) の所望の緩衝液中で混合した。
例４：異種性ポリマーミセルの調製；異種性ポリマーミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドの組成物
それぞれが少なくとも２つの組成的に異なるブロック共重合体を含む種々の異種性 (混合) ポリマーミセルを調製した。第１および第２ブロック共重合体の各々は、主に親水性の外殻ブロックおよび主に疎水性のコアブロックを含んでいた。第１および第２ブロック共重合体は、変性溶媒条件下において規定の比で混合し、その後、水性溶媒条件に移し、異種性 (混合) ポリマーミセルを形成するために結合させた。ここで開示される種々の例において、相対的な分子量、モノマー単位の数、および所定の第１ポリマー共重合体または第２ブロック共重合体内のブロックの組成を変化させて、ミセルの安定性および生物学的機能性を達成した。ここで開示される幾つかの例において、実質的に同じ疎水性ブロックを有し、組成的に異なる親水性ブロック (たとえば、一つの親水性ブロックは、DMAEMAに由来するモノマー単位を含み、もう一つの親水性ブロックは、PEGMAに由来するモノマー単位を含む) を有する２つのブロック共重合体を含有する混合ミセルを、第１ブロック共重合体と第２ブロック共重合体とを種々の選択される比(たとえば50：50の比)で形成し、これにより、かかる混合ミセルの陽イオン性表面電荷密度を調整し（たとえば、DMAEMAに由来するモノマー残基などから本質的になる親水性ブロックを有する異種性ミセルに対して低減し)、（たとえば、この模範的態様において、PEGMAに由来するモノマー単位を含む親水性ブロックを有するブロック共重合体を含めることにより）部分的に遮蔽した。よって、これらの例は、(i) (たとえば親水性ブロックの間で比較した場合の) 種々の(調整可能な)ブロック共重合体の組成、(ii) 親水性ブロックと疎水性ブロックとの種々の(調整可能な)相対的な比 (これは、たとえば、親水性ブロックの間で比較した場合、たとえば、上記の例では、一つのブロック共重合体のPEGMAブロックと別のブロック共重合体のDMAEMAブロックとの間で比較した場合の、種々の相対的な親水性鎖の長さという結果につながる)、および(iii) 第１ブロック共重合体と第２ブロック共重合体とのポリマー分子の数の種々の(調整可能な)相対的な比を有する異種性ミセルを実証する。これ以降の例で実証されるとおり、ミセル表面電荷および遮蔽の最適化は、たとえば治療または他の目的のためのポリヌクレオチド(たとえばsiRNA)に対するポリマーミセルデリバリー輸送手段のインビボ効力およびインビボ毒性に影響を及ぼす重要な因子であると決定された。
Ａ．ブロック共重合体の合成
種々の組成的に異なるブロック共重合体を、以下のとおり調製した。
Ａ．１ DMAEMA陽イオン性親水性ブロック (MW=14,000)、および示される％モル比でBMA、PAA、およびDMAEMAのランダム共重合体から構成される疎水性ブロック (MW=30,000)を含むポリマー4.1と称されるブロック共重合体
[D]14K-[B50-P25-D25]30K (4.1)
は、例２．２で実質的に記載されるとおりRAFT重合により調製した。幾つかの例においてポリマー4.1は、代わりに、本明細書でポリマーP7-2と称される。
親水性ブロックと疎水性ブロックとの相対的な分子量比が異なるがポリマー4.1と同様に構成されるポリマー4.6と称される別のブロック共重合体
[D]10K-[B50-P25-D25]30K (4.6)
は、ポリマー4.1と実質的に同じ手法で調製した。幾つかの例においてポリマー4.6は、代わりに、本明細書でポリマーP7-4と称される。
Ａ．２．PEGMA中性極性親水性ブロック (MW=24,000)、および示される％モル比でBMA、PAA、およびDMAEMAのランダム共重合体から構成される疎水性ブロック (MW=30,000)を含むポリマー4.2と称されるブロック共重合体
[PEGMA]24K-[B50-P25-D25]30K (4.2)
は、ポリDMAEMAマクロCTAの代わりにポリPEGMAマクロCTAを使用し、DMAEMAの代わりにPEGMAを使用して例１．１Ｂで実質的に記載したとおりメトキシ-(CH 2 O) 7-8 -メチル)メタクリレート(PEGMA)モノマーのRAFT重合により調製したことを除いて、例２．２で実質的に記載されるとおりRAFT重合により調製した。
親水性ブロックと疎水性ブロックとの相対的な分子量比が異なるがポリマー4.2と同様に構成されるポリマー4.7および4.8と称される追加のブロック共重合体
[PEGMA]18K-[B50-P25-D25]30K (4.7)[PEGMA]40K-[B53-P26-D21]60K (4.8)
は、ポリマー4.2と実質的に同じ手法で調製した。ポリマー4.8は、本明細書で「P7-PEGMA-100」とも称される。
Ａ．３．DMAEMA 陽イオン性親水性ブロック (MW=14,000)、およびBMAのホモポリマーから構成される疎水性ブロック (MW=30,000) を含むポリマー4.3と称されるブロック共重合体
[D]14K-[B]30K (4.3)
は、疎水性ブロックを(BMA、PAAおよびDMAEMAのランダム共重合体としてでなく)BMAのホモポリマーとして調製したことを除いて、例２．２で実質的に記載されるとおりRAFT重合により調製した。
Ａ．４．70:30モル比のPEGMA:MAA(NHS)モノマーでPEGMAおよびMAA(NHS)のランダム共重合体から構成される親水性ブロック (MW=24,000)、および示される％モル比でBMA、PAA、およびDMAEMAのランダム共重合体から構成される疎水性ブロック (MW=30,000) を含むポリマー4.4と称されるブロック共重合体
[PEGMA70-MAA(NHS)30]24K-[B50-P25-D25]30K (4.4)
は、例２．４で実質的に記載されるとおりRAFT重合により調製した。
例４．Ａ．４に記載されるブロック共重合体は、例３．１(ガラクトース-官能化ブロック共重合体) および例３．２(siRNA-結合ブロック共重合体) に記載されるとおり、ターゲティングリガンド (たとえばガラクトース) またはポリヌクレオチド (たとえばsiRNA)（各々の場合、好ましくは遊離のアミノ基 (たとえばガラクトサミン、たとえばアミノ修飾siRNA) を含有する）を、NHSエステルに結合することにより更に修飾して、それぞれ、ポリマー4.4.1および4.4.2と称されるブロック共重合体を形成することができる：
[PEGMA70-MAA(Gal)30]24K-[B50-P25-D25]30K (4.4.1)
[PEGMA70-MAA-(RNA)30]24K-[B50-P25-D25]30K (4.4.2)。
Ａ．５．70:30モル比のPEGMA:DMAEMAモノマーでPEGMAおよびDMAEMAのランダム共重合体から構成される陽イオン性の遮蔽された親水性ブロック[PEGMA/ DMAEMA] (MW=24,000)、および示される％モル比でBMA、PAA、およびDMAEMAのランダム共重合体から構成される疎水性ブロック (MW=30,000) を含むポリマー4.5と称されるブロック共重合体
[PEGMA70-DMAEMA30]24K-[B50-P25-D25]30K (4.5)
は、ポリDMAEMAマクロCTAの代わりにポリ[PEGMA / DMAEMA]マクロCTAを使用し、（DMAEMAとともにコモノマーとしてPEGMAを使用して）例１．１Ｂで実質的に記載されるとおりメトキシ-(CH2O)7-8-メチル)メタクリレート(PEGMA)モノマーおよびDMAEMAモノマーのRAFTランダム共重合により調製したことを除いて、例２．２で実質的に記載されるとおりRAFT重合により調製した。参考のために、この例のブロック共重合体を表４．Ａに要約する(種々の他の例または図面で使用される代わりの呼称を含む)。
Figure 2012500793
Ｂ．混合ポリマーミセル調合物；混合ポリマーミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドを含む組成物
異種性ポリマーミセルは、以下の手順に従って、マイナーな変化(たとえば、異なるブロック共重合体の置換：第１ブロック共重合体と第２ブロック共重合体の相対的な比の変化など)を加えて、例４．Ａの上記ブロック共重合体の種々の組合せの間で形成した。
一般に、異種性ミセルは、第１ブロック共重合体および第２ブロック共重合体 (第１ポリマーとは組成的に異なる) を変性媒体中に提供して、第１ポリマーおよび第２ポリマーの異種性混合物を形成することにより調製した。その後、異種性混合物を、第２水性媒体に移し、第１および第２共重合体の疎水性ブロックを、当該水性媒体において結合させて、異種性ミセルを形成する。ポリヌクレオチドは、かかる異種性ポリマーミセルと、あるいは第１または第２ブロック共重合体の少なくとも一つと、異種性ミセルの形成前または形成後の何れかにおいて結合させることができる。
Ｂ．１ 代表的な例として、異種性 (混合) ポリマーミセルを、組成的に異なる親水性ブロックを有し、それぞれが同じ疎水性ブロックを有する２つのブロック共重合体から形成した。具体的には、たとえば、DMAEMA親水性ブロックから構成される第１ブロック共重合体 (たとえばポリマー4.1) およびPEGMA親水性ブロックから構成される第２ブロック共重合体 (たとえばポリマー4.2) を、第１ポリマーと第２ポリマーを所望の比 (たとえば1:1) で混合して、好ましくはたとえば、対応する量の第１および第２ブロック共重合体を100％エタノール中で混合し、その後、PBS pH 7.4で20倍希釈するか、またはPBS pH 7.4に対して透析を行うことにより、(たとえば50%) DMAEMAおよび (たとえば50%) PEGMA (または他の所望の比) のポリマーブロックを含む親水性外殻を有する異種性ミセルを形成した。
Ｂ．２ 別の代表的な例として、異種性 (混合) ポリマーミセルを、それぞれが同じまたは組成的に異なる親水性ブロックを有し、組成的に異なる疎水性ブロックを有する２つのブロック共重合体から形成した。具体的には、たとえば、[BMA / PAA / DMAEMA]疎水性ブロックから構成される第１ブロック共重合体 (たとえばポリマー4.1) および[BMA]疎水性ブロックから構成される第２ブロック共重合体 (たとえばポリマー4.3) を、第１ポリマーと第２ポリマーを所望の比 (たとえば1:1) で混合して、好ましくはたとえば、所望の対応する量の第１および第２ブロック共重合体を100％エタノール中で混合し、その後、PBS pH 7.4で20倍希釈するか、またはPBS pH 7.4に対して透析を行うことにより、(たとえば50%) BMAおよび (たとえば50%) [BMA / PAA / DMAEMA] (たとえば、ポリマー4.1およびポリマー4.3の各々において[50% BMA / 25% PAA / 25% DMAEMA]) (または他の所望の比) のポリマーブロックを含む疎水性コアを有する異種性ミセルを形成した。
Ｂ．３．更なる代表的な例として、ポリヌクレオチド (たとえばsiRNA) をポリマーミセルと結合させた。
Ｂ．３．１．一つのアプローチにおいて、ポリヌクレオチドを、混合ミセルの形成と実質的に同時に、第１および/または第２ブロック共重合体の陽イオン性親水性ブロックと結合させた。たとえば、混合ポリマーミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドを含む組成物は、所望の相対的な量の第１および第２ブロック共重合体を100％エタノール中で混合し、その後、0.5 M NaCl-PBS pH 7.4中にポリヌクレオチド (たとえばsiRNA) を含む同体積の溶液を用いて50％エタノールに希釈することにより、２つの組成的に異なるブロック共重合体 [ここで、ブロック共重合体の少なくとも一つは、陽イオン性親水性ブロックを有する (たとえば、DMAEMAモノマー残基をその親水性ブロックに含む第１ブロック共重合体 (たとえばポリマー4.1、ポリマー4.3、ポリマー4.5))] をポリヌクレオチド (たとえばsiRNA) と配合し、その後、更にPBS pH 7.4で10倍希釈するか、またはPBS pH 7.4に対して透析を行うことから形成することができる。
Ｂ．３．２．あるいは、別のアプローチにおいて、ポリヌクレオチドを、異種性ポリマーミセルの形成前に、第１および/または第２ブロック共重合体の少なくとも一つの陽イオン性親水性ブロックと結合させた。たとえば、混合ポリマーミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドを含む組成物は、２つの組成的に異なるブロック共重合体 [ここで、第１ポリマーは、陽イオン性親水性ブロックを有する(たとえば、DMAEMAモノマー残基をその親水性ブロックに含む (たとえばポリマー4.1、ポリマー4.3、ポリマー4.5))] を、まず50％エタノール中でポリヌクレオチド (たとえばsiRNA) と配合し、その後、50％エタノール中の第２ポリマーを添加し、その後、PBS pH 7.4で10倍希釈するか、またはPBS pH 7.4に対して透析を行うことから形成することができる。
Ｂ．３．３．更なるアプローチにおいて、異種性ポリマーミセルの形成後に、ポリヌクレオチドを、第１および/または第２ブロック共重合体の少なくとも一つの陽イオン性親水性ブロックと結合させた。たとえば、異種性ポリマーミセルを、例Ｂ．１または例Ｂ．２で実質的に先に述べたとおり形成した。その後、ポリヌクレオチド (たとえばsiRNA) をPBS pH 7.4中でポリマーミセルと混合し、その後PBS pH 7.4に対して透析を行うことにより、ポリヌクレオチドを異種性ポリマーミセルと結合させた。
Ｂ．３．４．異なるアプローチにおいて、ポリヌクレオチドを、第１および/または第２ブロック共重合体に共有結合させることにより、異種性ポリマーミセルと共有結合させた。たとえば、混合ポリマーミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドを含む組成物は、２つの組成的に異なるブロック共重合体 [ここで、第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つは、結合可能なモノマー残基を含む親水性ブロックを有する(たとえば、MAA(NHS)モノマー残基を含む (たとえばポリマー4.4))] から、たとえば、(i)例Ｂ．１または例Ｂ．２で実質的に先に述べたとおり、まず異種性ポリマーミセルを形成し、その後、(たとえば、例３．２に記載したとおり)ポリヌクレオチドの結合を行うことにより、あるいは(ii)(たとえば、例３．２に記載したとおり)まずポリヌクレオチド結合ブロック共重合体を形成し、その後、例Ｂ．１または例Ｂ．２で実質的に先に述べたとおり異種性ポリマーミセルの形成を行うことにより、形成することができる。表４．Ｂ．１は、ここで記載されるとおり調製された種々の異種性ミセルを要約する。
Figure 2012500793
表４．Ｂ．２は、ここで記載されるとおり調製することができる種々の予言的な(prophetic)追加の異種性ミセルを要約する。
Figure 2012500793
代わりの異種性ミセル、およびかかるミセルおよびそれと結合したポリヌクレオチドを含む組成物は、たとえば、異種性ミセルPM.1、PM.2、PM.3においてガラクトース(Gal)と置換される、(追加または代わりの) 他のターゲティングリガンド (たとえば葉酸塩(folate)) を含むことができる。
例５：異種性ポリマーミセルの物理的特性決定
この例は、プロトン核磁気共鳴(1H NMR)スペクトロスコピーおよび動的光散乱(DLS)を用いて異種性ミセルの特性を決定し、たとえば、組成的に異なるポリマーを変性溶媒中で配合し、その後、水溶液に移した際にこれらポリマーを結合させて混合ミセル構造を形成することにより、異種性ミセルが調製されたことを実証する。
Ａ．混合ミセルの1H NMR分析。一般に、1H NMRスペクトルは、Bruker AV301核磁気共鳴装置で、ジューテロ化クロロホルム (CDCl3)、ジューテロ化水 (D2O)、またはジューテロ化リン酸緩衝液中で25℃において記録した。ジューテリウムロック (CDCl3, D2O) を使用し、化学シフトは、(CDCl3について)テトラメチルシランおよび(D2Oについて)3-(トリメチルシリル)プロピオン-2,2,3,3-d4酸、ナトリウム塩からppmで決定した。ポリマー濃度は典型的に6 mg/mlであった。
図７Ａおよび図７Ｂは、組成的に異なる親水性ブロック（第１ポリマーはDMAEMA 親水性ブロックを有し、第２ポリマーはPEGMA 親水性ブロックを有する）および実質的に同じ疎水性ブロックを有するブロック共重合体を含む異種性ミセルM.4の1H NMR分析を示す。
Figure 2012500793
有機溶媒CDCL3におけるNMRスペクトル (図７Ａ、左パネル) は、すべてのプロトン共鳴が可視的であり、非ミセル状態のポリマーのポリマー組成と一致する値を占め、その値に統合されることを示す。水性溶媒ジューテロ化リン酸緩衝液pH 7.4におけるNMRスペクトル (図７Ｂ、右パネル) は、コアブロックにおいて疎水性残基と結合したプロトンが、遮蔽された疎水性ミセルコアの形成と一致して、大きく抑制されることを示す。対照的に、PEGMAプロトンおよびDMAEMAプロトンに関連する統合は、PEGMAおよびDMAEMAが何れも水に晒されていることを示す。
Ｂ．混合ミセルのDLS分析。一般に、ポリマーミセルの粒子サイズは、Malvern Zetasizer Nano ZS装置を用いて、動的光散乱(DLS)により測定した。粒子サイズは、装置の粒子サイジングソフトウェア(Particle Sizing Software)を用いて計算した。
図８Ａおよび８Ｂは、２つの異種性ポリマーミセルについての粒子サイズの決定データを示す：(1)組成的に異なる親水性ブロック（第１ポリマーはDMAEMA親水性ブロックを有し、第２ポリマーはPEGMA 親水性ブロックを有する）、および実質的に同じ疎水性ブロックを有するブロック共重合体を含むミセルM.1 (図８Ａ)：
Figure 2012500793
および独立に、(2)実質的に同じ親水性ブロックおよび組成的に異なる疎水性ブロック (第１ポリマーは[BMA / PAA / DMAEMA] 疎水性ブロックを有し、第２ポリマーはBMA疎水性ブロックを有する)を有するブロック共重合体を含むミセルM.2 (図８Ｂ)：
Figure 2012500793
比較のために、３つの別々の対応する同種性ミセルについて、粒子サイズを独立に決定した：代表的な式
[D]14K-[B50-P25-D25]30K (4.1)
を有する単一のブロック共重合体4.1から本質的になる一つの同種性ミセル、
および独立に、代表的な式
[PEGMA]24K-[B50-P25-D25]30K (4.2)
を有する単一のブロック共重合体4.2から本質的になる別の同種性ミセル、
および独立に、代表的な式
[D]14K-[B]30K (4.3)
を有する単一のブロック共重合体4.3から本質的になる第３の同種性ミセル。
DLS分析は、ポリマー4.1から調製された同種性ポリマーミセルの粒子サイズが50 nmであること(データ示さず)、およびポリマー4.2から調製された同種性ポリマーミセルの粒子サイズが35 nmであること(データ示さず)を示した。相対的に、(1:1の比のポリマー4.1および4.2から形成された)混合ミセルM.1についての粒子サイズは、約44 nm (z-平均直径) という中間値を有することが決定された(図８Ａ、上のパネル)。別の分析において、DLSは、疎水性ブロックにBMAのみを含有するポリマー4.3が、200 nmより大きいサイズの粒子を含む混濁水溶液を形成することを実証した(データ示さず)。しかし、混合ミセルM.2を、1:1の比のポリマー4.1および4.3から調合すると、透明な(非混濁)水溶液が得られ、これにより、約50 nmの粒子サイズを有し、実質的に均一なサイズを有する異種性ミセルが得られた(図８Ｂ、下のパネル)。
例６：異種性ポリマーミセルの生物学的特性決定
この例は、(i) ポリヌクレオチドを効果的に結合し、(ii) ポリカチオン媒介性毒性について効果的に遮蔽し、(iii) 組織選択的なインビボ分布を有し、(iv) 遺伝子発現活性を効果的に調節する異種性ポリマーミセルが調製されたことを実証する。特に、これらの例は、本発明の異種性ミセルが、様々な生物学的特性を有する種々の異種性ポリマーミセルを獲得するために、(たとえば、ポリマー組成、ポリマーアーキテクチャー(architecture)、および超分子組成について)制御可能に調整できることを実証する。
実験は、異なる生物学的特性を有する異種性ポリマーミセルを、ブロック共重合体の組成、ポリマーアーキテクチャー(architecture)および超分子 (たとえばミセル) 組成などの側面の制御されるバリエーションに基づいて評価するために実施した。種々のブロック共重合体の組成は、たとえば、構成成分のブロック共重合体の親水性ブロックの化学組成に関して評価され、これは、水性環境に晒されるミセルの外殻を集合的に形成している。特に、外殻形成親水性ブロック内にポリカチオンモノマー残基 (たとえばDMAEMA) を含有する異種性ポリマーミセルは、siRNAなどのポリ核酸を効率よく結合することが示され、有利なことに、かかるポリカチオン組成は、外殻形成親水性ブロック内に中性親水性モノマー残基 (たとえばPEGMA) を含有するポリマーミセルで効果的に遮蔽されることが示され、これにより、潜在的な毒性を効果的に媒介する。特に、これらの実験は、かかるポリヌクレオチド結合機能性および遮蔽機能性が、ポリヌクレオチド (たとえばsiRNA) デリバリーに効果的な異種性ポリマーミセルにおいて、他の重要な機能性、たとえば組織選択的デリバリー、およびたとえばエンドソーム膜不安定化活性と効果的に組合せられることを示す。代表的な実験は、ここで更に詳細に説明される。
Ａ．混合ポリマーミセルの毒性およびRNA結合分析。一般に、ポリヌクレオチド (たとえばRNA) 結合は、Cardoso ALC et al., J Gene Medicine 2007; 9: 170-183)に記載される方法により決定した。一般に、毒性は、種々の濃度のポリマーミセル組成物 (またはコントロール組成物) を正常な健康なマウスに尾部静脈を介して注入し、マウスに致死的であると観察される(たとえばポリマーまたはミセルの)最小用量を決定することを含むプロトコールにより決定した。
図９は、２つの別個の同種性ミセル：代表的な式
[D]10K-[B50-P25-D25]30K (4.6)
を有する単一のブロック共重合体4.6から本質的になる一つの同種性ミセル、
および独立に、代表的な式
[PEGMA]18K-[B50-P25-D25]30K (4.7)
を有する単一のブロック共重合体4.7から本質的になる別の同種性ミセルについて、
並びに、様々な相対的な比のポリマー4.6およびポリマー4.7を用いて形成された種々の混合ミセル：M3.1 (95% / 5%)、M3.2 (90% / 10%)、M3.3 (80% / 20%)、M3.4 (50 % / 50%)、およびM3.5 (25% / 75%) について、
相対的な毒性およびポリヌクレオチド結合特性を要約する表を示す。単一のブロック共重合体4.6から本質的になり、親水性陽イオン性DMAEMAモノマー残基のみをその外殻に本質的に含有する同種性ポリマーミセルは、比較的高いRNA結合 (約3.75 ug/mlポリマーのIC50) および比較的高い毒性 (約15 mg/kgの中程度の用量のポリマーで観察可能) を示す。対照的に、単一のブロック共重合体4.7から本質的になり、親水性中性PEGMAモノマー残基のみをその外殻に本質的に含有する同種性ポリマーミセルは、マウスで試験した最大用量において、観察可能な毒性を示さず、アッセイの感度の範囲内でRNA結合を示さなかった。特に、混合ポリマーミセルM.1、M.2、M.3、M.4およびM.5の分析は、様々なRNA-結合 (約5.0〜約16.0 ug/mlのポリマーミセルの範囲のIC50)、および様々な観察される毒性 (約15 mg/kg〜＞50 mg/kg のポリマーミセルの範囲の用量) を示し、かかる範囲は、異種性ミセルに含まれる共重合体の種々の相対的な比に対応する。非限定的な例として、1:1の比のポリマー4.6：4.7を含む異種性ミセルは、インビボで比較的低い毒性 (約20 mg/kg ポリマーミセル) を示し、低いが効果的なsiRNA結合 (約8.6 ug/mlのポリマーミセルのIC50) を保持する。
Ｂ．混合ポリマーミセルの選択的なインビボ生体分布。図１０は、ここで記載されるとおり調製された混合ポリマーミセルが、siRNAの組織方向性デリバリーに対して分化した選択性を有することを実証する。
単一のブロック共重合体4.1から本質的になる同種性ポリマーミセル (図１０でポリマー「P7-2」と称される) の調製物
([D]14K-[B50-P25-D25]30K) 4.1
(11.2 mg/kgの濃度で投薬)、および独立に、1:1の比のポリマー4.1およびポリマー4.2を含む異種性ポリマーミセルM.4
Figure 2012500793
(15 mg/kgの濃度で投薬) をマウスに注入した。同種性ポリマーミセルは、肝臓よりも肺に、（より高い毒性で）siRNAの比較的高いデリバリーを示したが、対照的に、混合ポリマーミセルM.1は、肺よりも肝臓に、（より低い毒性で）siRNAの比較的高いデリバリーを示した。
Ｃ．混合ポリマーミセルをsiRNAと配合して含む組成物についてのインビトロ遺伝子サイレンシング活性
図１１Ａおよび１１Ｂは、ここで記載されるとおり調製された混合ポリマーミセルが、幾つかの調合条件下において、遺伝子発現活性をノックダウンするのに効果的であることを実証する。異種性ポリマーミセルおよび結合したポリヌクレオチド (たとえば、GAPDH遺伝子発現に対してノックダウン活性を有することが知られているsiRNA) を含む組成物のノックダウン (KD) 活性を決定した。
具体的には、２つの別個の同種性ミセル：代表的な式
[D]14K-[B50-P25-D25]30K (4.1)
を有する単一のブロック共重合体4.1から本質的になる一つの同種性ミセル(図１１でミセル「P7-2」と称される)、および独立に、代表的な式
[PEGMA]40K-[B53-P26-D21]60K (4.8)
を有する単一のブロック共重合体4.8から本質的になる別の同種性ミセル (図１１でミセル「PEGMA 100」と称される) を、評価した。また、異なる相対的な比のポリマー4.1およびポリマー4.8を用いて形成した異種性ミセル、M5.1 (50% / 50%)(図１１でミセル「MM 50/50」と称される) およびM5.2 (25% / 75%)(図１１でミセル「MM 25/75」と称される) を評価した。
また、siRNA-調合プロトコールのバリエーションを評価した。実験の第１セットにおいて(図１１Ａ、左パネル)、siRNAを、独立に、上述の同種性ポリマーミセル (同種性-4.1-ミセル；同種性-4.8-ミセル) および異種性ポリマーミセル (M5.1およびM5.2) の各々と、例Ｂ．３．１に実質的に記載されるとおり、各々の場合において25 nM siRNAおよび関連の説明文で示される濃度の全ポリマーを用いて結合させた。実験の第２セットにおいて(図１１Ｂ、右パネル)、siRNAを、独立に、上述の同種性ポリマーミセル (同種性-4.1ミセル；同種性-4.8ミセル) および異種性ポリマーミセル (M5.1) の各々と、例Ｂ．３．２に実質的に記載されるとおり、各々の場合において14 nM〜112 nMの範囲の種々の量のsiRNAを、4.2 ug/ml〜33 ug/mlの範囲の種々の濃度の全ポリマーと配合して用いて (図１１で具体的に詳述されるとおり) 結合させた。
ノックダウンアッセイは、ポリマー：siRNA複合体の処理から24時間後に特定の遺伝子発現を測定した。評価される同種性または異種性ポリマーミセルおよびGAPDH-調節siRNA (またはネガティブコントロールsiRNA−GAPDH遺伝子発現に対するノックダウン活性を欠く非活性なsiRNA (データ示さず)) を、最終トランスフェクション濃度に対して5倍の種々の濃度を得るために25 uL中で混合して、10% FBSを含有する100 uLの通常培地でHeLa細胞に添加する前30分間にわたって複合体を形成させた。最終siRNAおよびポリマー濃度を、図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるとおり評価した。全RNAを処理から24時間後に単離し、GAPDH発現を、定量的PCRにより、２つの内部標準化遺伝子RPL13AおよびHPRTに対して測定した。
図１１Ａおよび１１Ｂの結果は、同種性-4.1-ミセル、同種性-4.8-ミセル、および異種性ポリマー混合ミセルM.5.1、およびM.5.2の各々と結合させたsiRNAを含む組成物のノックダウン活性を比較し、各々の場合において、未処理のHeLa細胞におけるGAPDHの発現に対して標準化した。
中性PEGMAモノマー残基から本質的になる親水性外殻を有する同種性-4.8-ミセル (図１１Ａおよび１１Ｂで「PEGMA 100」と称される) は、ノックダウン活性をほとんどまたは全く示さなかったが、陽イオン性DMAEMAモノマー残基から本質的になる親水性外殻を有する同種性-4.1-ミセル (図１１Ａおよび１１Ｂで「P7-2」と称される) は、相当なノックダウン活性を示した。これらの観察された結果は、例６．Ａ (図９) で観察される、実質的に類似のポリマー4.7 (結合なし) および4.6 (IC50 3.75 ug/ml)から形成された同種性ミセルについて決定したsiRNA結合と一致している。
等モル量の陽イオン性 DMAEMAおよび中性PEGMAモノマー残基から本質的になる親水性外殻を有するブロック共重合体4.1および4.8 (50% / 50%) を含む混合ポリマーミセルM5.1 (図１１Ａおよび１１Ｂで「MM 50/50」と称される) は、同種性-4.1-ミセル (図１１Ａおよび１１Ｂで「P7-2」と称される) と実質的に類似のノックダウン活性を有する。しかしながら、特に、異種性ミセルM5.1は、同様に構成される異種性ミセルM.3.4 (非毒性用量、少なくとも20 mg/kg) および例６．Ａ (図９) で観察されるポリマー4.6から形成される同種性ミセル (非毒性用量＜11.5 mg/kg) についてのインビボ毒性データに基づいて、同種性-4.1-ミセルと比較してインビボ毒性が低下することが予測される。したがって、これらデータは、異種性ミセルおよびそれと結合したsiRNAを含む組成物が、(共通の構成ポリマーから形成された同種性ミセルに対して) 低下した毒性を示して、遺伝子発現のsiRNA-媒介性阻害について有意な活性を有することを実証する。
ここでの種々の実施例は、例示的と考えるべきであり、本発明の範囲を規定しない。
ここでの種々の実施例は、例示的と考えるべきであり、本発明の範囲を規定しない。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマー、および
第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
を含み、
第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つが、pH依存性、膜不安定化ポリマーであるかまたはそれを含む、組成物。
［２］ 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマー、および
第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
を含み、
第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つの疎水性ブロックが、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含む、組成物。
［３］ 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマーであって、親水性ブロックが、ポリヌクレオチドとイオン結合して複数の陽イオン性モノマー残基を含む第１ポリマー、および
第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
を含み、
第１ポリマーの親水性ブロック、第１ポリマーの疎水性ブロック、第２ポリマーの親水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックから選択される少なくとも一つのブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体ブロックである、組成物。
［４］ 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマーであって、親水性ブロックが、ポリヌクレオチドであるかまたはそれを含み、疎水性ブロックが、複数の疎水性モノマー残基を含む第１ポリマー、および
第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
を含む、組成物。
［５］ 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマーと共有結合したポリヌクレオチドを含むポリマーバイオ結合体（polymer bioconjugate）であって、親水性ブロックが、連結部分を介してポリヌクレオチドに結合した結合種を有する一または複数のモノマー残基を含む、ポリマーバイオ結合体、および
第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
を含む、組成物。
［６］ 第１ポリマーが、pH依存性、膜不安定化ブロック共重合体である、［１］〜［５］の何れかに記載の組成物。
［７］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、pH依存性、膜不安定化ブロック共重合体を含む、［１］〜［５］の何れかに記載の組成物。
［８］ 第２ポリマーが、pH依存性、膜不安定化ブロック共重合体である、［１］〜［７］の何れかに記載の組成物。
［９］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、pH依存性、膜不安定化ブロック共重合体を含む、［１］〜［７］の何れかに記載の組成物。
［１０］ 膜不安定化ポリマーが、pH 7.4におけるその溶血活性の少なくとも２倍の溶血活性をpH 6.2で有する、［６］〜［９］の何れかに記載の組成物。
［１１］ 膜不安定化ポリマーが、pH 7.4におけるその溶血活性の少なくとも３倍の溶血活性をpH 5.8で有する、［６］〜［９］の何れかに記載の組成物。
［１２］ 膜不安定化ポリマーが、約7.0より高いpHにおいて実質的に非溶血性である、［６］〜［１１］の何れかに記載の組成物。
［１３］ 約20 ug/mlのポリマー濃度において、膜不安定化ポリマーが、インビトロの細胞アッセイで、約5.8またはそれより低いpHにおいて溶血性であり、約7.4より高いpHにおいて実質的に非溶血性である、［６］〜［９］の何れかに記載の組成物。
［１４］ 膜不安定化ポリマーが、インビトロの細胞アッセイで、エンドソーム透過性（endosomal-permeable）またはエンドソーム分解性（endosomalytic）である、［１］および［６］〜［１３］の何れかに記載の組成物。
［１５］ 膜不安定化ポリマーが、インビボの非ヒト哺乳類アッセイで、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である、［１］および［６］〜［１３］の何れかに記載の組成物。
［１６］ ポリマーミセルが、インビトロの細胞アッセイで、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である、［１］〜［１５］の何れかに記載の組成物。
［１７］ ポリマーミセルが、インビボの非ヒト哺乳類アッセイで、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である、［１］〜［１５］の何れかに記載の組成物。
［１８］ 組成物が、インビトロの細胞アッセイで遺伝子発現を調節する、［１］〜［１６］の何れかに記載の組成物。
［１９］ 組成物が、インビボの非ヒト哺乳類アッセイで遺伝子発現を調節する、［１］〜［１６］の何れかに記載の組成物。
［２０］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含む、［３］〜［１９］の何れかに記載の組成物。
［２１］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含む、［１］〜［２０］の何れかに記載の組成物。
［２２］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含む、［１］〜［２１］の何れかに記載の組成物。
［２３］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含む、［１］〜［２２］の何れかに記載の組成物。
［２４］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の陽イオン性モノマー残基、および複数の疎水性モノマー残基を含み、疎水性ブロックが、pH 7.4の水性媒体中で実質的に中性の全体的な電荷を有する、［１］〜［２３］の各々に記載の組成物。
［２５］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の陽イオン性モノマー残基、および複数の疎水性モノマー残基を含み、疎水性ブロックが、pH 7.4の水性媒体中で実質的に中性の全体的な電荷を有する、［１］〜［２４］の各々に記載の組成物。
［２６］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、7.0より高いpHにおいて陰イオン性であり、かつ6.0またはそれより低いpHにおいて中性である（荷電していない）複数のモノマー残基を含む、［１］〜［２５］の各々に記載の組成物。
［２７］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、7.0またはそれより高いpHにおいて陰イオン性であり、かつ6.0またはそれより低いpHにおいて中性である（荷電していない）複数のモノマー残基を含む、［１］〜［２６］の各々に記載の組成物。
［２８］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基を含み、5.8〜7.0の範囲のpKaを有する、［１］〜［２７］の各々に記載の組成物。
［２９］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基を含み、5.8〜7.0の範囲のpKaを有する、［１］〜［２８］の各々に記載の組成物。
［３０］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、カルボン酸、スルホンアミド、ボロン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、リン酸、ホスフィン酸、および亜リン酸基、並びにこれらの組み合わせから選択されるプロトン化可能な（protonatable）陰イオン性種（species）を有する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［２９］の各々に記載の組成物。
［３１］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、カルボン酸、スルホンアミド、ボロン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、リン酸、ホスフィン酸、および亜リン酸基、並びにこれらの組み合わせから選択されるプロトン化可能な陰イオン性種を有する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［３０］の各々に記載の組成物。
［３２］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、(C2-C8)アルキルアクリル酸の重合に由来する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［３１］の各々に記載の組成物。
［３３］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、(C2-C8)アルキルアクリル酸の重合に由来する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［３２］の各々に記載の組成物。
［３４］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の中性(荷電していない)疎水性モノマー残基を含む、［１］〜［３３］の各々に記載の組成物。
［３５］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の中性(荷電していない)疎水性モノマー残基を含む、［１］〜［３４］の各々に記載の組成物。
［３６］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、各々のケースで任意に置換されたC2-C8アルキル、C2-C8アルケニル、C2-C8アルキニル、アリール、およびヘテロアリールから選択される疎水性種を有する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［３５］の各々に記載の組成物。
［３７］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、各々のケースで任意に置換されたC2-C8アルキル、C2-C8アルケニル、C2-C8アルキニル、アリール、およびヘテロアリールから選択される疎水性種を有する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［３６］の各々に記載の組成物。
［３８］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、各々のケースで任意に置換された(C2-C8)アルキル-エタクリレート、(C2-C8)アルキル-メタクリレート、または(C2-C8)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［３７］の各々に記載の組成物。
［３９］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、各々のケースで任意に置換された(C2-C8)アルキル-エタクリレート、(C2-C8)アルキル-メタクリレート、または(C2-C8)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［３８］の各々に記載の組成物。
［４０］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含む、［１］〜［３９］の各々に記載の組成物。
［４１］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含む、［１］〜［４０］の各々に記載の組成物。
［４２］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、6.3〜7.8の範囲のpKaを有する、［１］〜［４１］の各々に記載の組成物。
［４３］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、6.3〜7.8の範囲のpKaを有する、［１］〜［４２］の各々に記載の組成物。
［４４］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される種を有する複数のモノマー残基を更に含む、［１］〜［４３］の各々に記載の組成物。
［４５］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される種を有する複数のモノマー残基を更に含む、［１］〜［４４］の各々に記載の組成物。
［４６］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、各ケースで任意に置換された、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［４５］の各々に記載の組成物。
［４７］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、各ケースで任意に置換された、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［４６］の各々に記載の組成物。
［４８］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の疎水性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含み、pH 7.4において：(i)疎水性：(陰イオン性＋陽イオン性)種の比が、約1:3〜約3:1の範囲であり、(ii)陰イオン性：陽イオン性種の比が、約1:0〜約1:4の範囲である、［１］〜［４７］の各々に記載の組成物。
［４９］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の疎水性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含み、pH 7.4において：(i)疎水性：(陰イオン性＋陽イオン性)種の比が、約1:3〜約3:1の範囲であり、(ii)陰イオン性：陽イオン性種の比が、約1:0〜約1:4の範囲である、［１］〜［４８］の各々に記載の組成物。
［５０］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の疎水性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含み、pH 7.4において：(i)疎水性：(陰イオン性＋陽イオン性)種の比が、約1:2〜約2:1の範囲であり、(ii)陰イオン性：陽イオン性種の比が、約4:1〜約1:4の範囲である、［１］〜［４９］の各々に記載の組成物。
［５１］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の疎水性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含み、pH 7.4において：(i)疎水性：(陰イオン性＋陽イオン性)種の比が、約1:2〜約2:1の範囲であり、(ii)陰イオン性：陽イオン性種の比が、約4:1〜約1:4の範囲である、［１］〜［５０］の各々に記載の組成物。
［５２］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、プロトン化可能な陰イオン性種および疎水性種を有する第１の重合可能なモノマーに由来する複数の第１モノマー残基、および任意に脱プロトン化可能な陽イオン性種を有する第２の重合可能なモノマーに由来する複数の第２モノマー残基を含む、［１］〜［５１］の各々に記載の組成物。
［５３］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、プロトン化可能な陰イオン性種および疎水性種を有する第１の重合可能なモノマーに由来する複数の第１モノマー残基、および任意に脱プロトン化可能な陽イオン性種を有する第２の重合可能なモノマーに由来する複数の第２モノマー残基を含む、［１］〜［５２］の各々に記載の組成物。
［５４］ ［保留］
［５５］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含む、［１］、［２］、［３］および［５］〜［５４］の各々に記載の組成物。
［５６］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を、ポリヌクレオチドとイオン結合して含む、［１］、［２］、［３］および［５］〜［５４］の各々に記載の組成物。
［５７］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、6.3〜7.8の範囲のpKaを有する、［５５］および［５６］の各々に記載の組成物。
［５８］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される種を有する複数のモノマー残基を含む、［５５］〜［５７］の各々に記載の組成物。
［５９］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、各ケースで任意に置換された、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、［５５］〜［５７］の各々に記載の組成物。
［６０］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性親水性モノマー残基を更に含む、［５５］〜［５９］の各々に記載の組成物。
［６１］ ［保留］
［６２］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、ポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドが、連結部分を介して第１ポリマーの疎水性ブロックに共有結合している、［１］、［２］、［４］および［６］〜［５４］の各々に記載の組成物。
［６３］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、ポリヌクレオチドの３’端に共有結合している、［６２］に記載の組成物。
［６４］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、ポリヌクレオチドの５’端に共有結合している、［６２］に記載の組成物。
［６５］ 連結部分が共有結合である、［６２］〜［６４］の何れかに記載の組成物。
［６６］ 連結部分が、２つ以上の反応性官能基を含む多官能部分に由来する、［６２］〜［６４］の何れかに記載の組成物。
［６７］ 連結部分が、pH感受性の不安定な（labile）部分である、［６２］〜［６６］の何れかに記載の組成物。
［６８］ 連結部分が、血清pHで安定であり、エンドソーム（endosomal）pHで酸に不安定である、［６２］〜［６６］の何れかに記載の組成物。
［６９］ 連結部分が、pH 7.4で安定であり、pH 6.0で酸に不安定である、［６２］〜［６６］の何れかに記載の組成物。
［７０］ 連結部分がジスルフィドである、［６２］〜［６６］の何れかに記載の組成物。
［７１］ ［保留］
［７２］ 連結部分を介して第１ポリマーに共有結合したポリヌクレオチドを含むポリマーバイオ結合体を含む、［１］、［２］および［５］〜［６１］の各々に記載の組成物。
［７３］ ポリヌクレオチドが、連結部分を介して第１ポリマーの親水性ブロックに共有結合している、［７２］に記載の組成物。
［７４］ 第１ポリマーが、ポリヌクレオチドの３’端に共有結合している、［７２］および［７３］の各々に記載の組成物。
［７５］ 第１ポリマーが、ポリヌクレオチドの５’端に共有結合している、［７２］および［７３］の各々に記載の組成物。
［７６］ 連結部分が共有結合である、［７２］〜［７５］の何れかに記載の組成物。
［７７］ 連結部分が、２つ以上の反応性官能基を含む多官能部分に由来する、［７２］〜［７５］の何れかに記載の組成物。
［７８］ 連結部分が、pH感受性の不安定な（labile）部分である、［７２］〜［７７］の何れかに記載の組成物。
［７９］ 連結部分が、血清pHで安定であり、エンドソーム（endosomal）pHで酸に不安定である、［７２］〜［７７］の何れかに記載の組成物。
［８０］ 連結部分が、pH 7.4で安定であり、pH 6.0で酸に不安定である、［７２］〜［７７］の何れかに記載の組成物。
［８１］ 連結部分がジスルフィドである、［７２］〜［７７］の何れかに記載の組成物。
［８２］ ［保留］
［８３］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性親水性モノマー残基を含む、［１］〜［８２］の各々に記載の組成物。
［８４］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性親水性モノマー残基を含む、［１］〜［８３］の各々に記載の組成物。
［８５］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の陰イオン性親水性モノマー残基を含む、［１］〜［８４］の各々に記載の組成物。
［８６］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の両性イオン性親水性モノマー残基を含む、［１］〜［８５］の各々に記載の組成物。
［８７］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、ターゲティング部分を含む、［１］〜［８６］の各々に記載の組成物。
［８８］ 連結部分を介して第２ポリマーの親水性ブロックに共有結合した１つ以上のターゲティング部分を更に含む、［１］〜［８７］の各々に記載の組成物。
［８９］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、連結部分を介して第２ポリマーの疎水性ブロックに共有結合したターゲティング部分から本質的になる、［１］〜［８７］の各々に記載の組成物。
［９０］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、ポリヌクレオチドとイオン結合して複数の陽イオン性モノマー残基を含み、第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性極性残基を含む、［５５］〜［６１］の各々に記載の組成物。
［９１］ ［保留］
［９２］ 第１ポリマーの親水性ブロックがポリヌクレオチドであり、第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性極性残基を含む、［６２］〜［７１］の各々に記載の組成物。
［９３］ ［保留］
［９４］ ポリヌクレオチドが、第１ポリマーに共有結合しており、第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性極性残基を含む、［７２］〜［８２］の各々に記載の組成物。
［９５］ ［保留］
［９６］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、遮蔽種（shielding species）を有する複数のモノマー残基を(更に)含む、［１］〜［９５］の各々に記載の組成物。
［９７］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、遮蔽オリゴマー（shielding oligomer）を含むペンダント基を有する複数のモノマー残基を(更に)含む、［９６］に記載の組成物。
［９８］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、遮蔽ポリマー（shielding polymer）である、［９６］に記載の組成物。
［９９］ 遮蔽種が、ポリヌクレオチドの立体遮蔽（steric shielding）に効果的である、［９６］〜［９８］の各々に記載の組成物。
［１００］ 遮蔽種が、血漿における酵素消化に対するポリヌクレオチドの安定性を向上させるのに効果的である、［９６］〜［９９］の各々に記載の組成物。
［１０１］ 遮蔽種が、インビボで組成物の毒性を低減するのに効果的である、［９６］〜［１００］の各々に記載の組成物。
［１０２］ 遮蔽種が、インビボで組成物の薬物動態または生体分布（biodistribution）を向上させるのに効果的である、［９６］〜［１００］の各々に記載の組成物。
［１０３］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性親水性モノマー残基を(更に)含む、［１］〜［１０２］の各々に記載の組成物。
［１０４］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、式I
Figure 2012500793
 （ここでR1およびR2は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、nは、2〜20の範囲の整数である）のオリゴマーを含むペンダント基を有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［１０３］の各々に記載の組成物。
［１０５］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、式III
Figure 2012500793
 （ここで
Xは、独立に、O、NR9、およびSからなる群より選択され、
R1、R2およびR3は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、
nは、2〜20の範囲の整数であり、
R8は、水素、ハロゲン、任意に置換されたC1-C3アルキル、およびターゲティング部分からなる群より選択され、これらは、任意に連結部分を介して連結され、
R9は、水素、および任意に置換されたC1-C5アルキルからなる群より選択される）
を有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を(更に)含む、［１］〜［１０４］の各々に記載の組成物。
［１０６］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、式IV
Figure 2012500793
 （ここで
R1、R2およびR3は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、
nは、2〜20の範囲の整数であり、
R8は、水素、ハロゲン、任意に置換されたC1-C3アルキル、およびターゲティング部分からなる群より選択され、これらは、任意に連結部分を介して連結される）
を有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を含む、［１］〜［１０５］の各々に記載の組成物。
［１０７］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、遮蔽オリゴマーを含むペンダント基を有する少なくとも約10重量％のモノマー残基を含むランダム共重合体である、［５５］〜［６１］および［７２］〜［９５］の各々に記載の組成物。
［１０８］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、少なくとも約10重量％の中性親水性モノマー残基を含むランダム共重合体である、［５５］〜［６１］および［７２］〜［９５］の各々に記載の組成物。
［１０９］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、［１０４］に記載される式Iのオリゴマーを含むペンダント基を有する少なくとも約10重量％のモノマー残基を含むランダム共重合体である、［５５］〜［６１］および［７２］〜［９５］の各々に記載の組成物。
［１１０］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、［１０５］または［１０６］にそれぞれ記載される式IIIまたは式IVの重合可能なモノマーに由来する少なくとも約10重量％のモノマー残基を含むランダム共重合体である、［５５］〜［６１］および［７２］〜［９５］の各々に記載の組成物。
［１１１］ 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、少なくとも約10重量％の陽イオン性モノマー残基を更に含むランダム共重合体である、［１０６］〜［１０９］の各々に記載の組成物。
［１１２］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、式V
Figure 2012500793
 （ここでR1およびR2は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択される）の繰返し単位を有し、約1,000〜約30,000の範囲の分子量を有する遮蔽ポリマーである、［１］〜［１１１］の各々に記載の組成物。
［１１３］ 第１ポリマーの親水性ブロックが、ポリヌクレオチドとイオン結合して複数の陽イオン性モノマー残基を含む、［９６］〜［１１１］の各々に記載の組成物。
［１１４］ 第１ポリマーの親水性ブロックがポリヌクレオチドであり、第２ポリマーの親水性ブロックが、［９６］〜［１１２］の一または複数に記載されるとおり特徴づけられる、［９６］〜［１１２］の各々に記載の組成物。
［１１５］ 第１ポリマーが、第１ポリマーに共有結合したポリヌクレオチドを含むポリマーバイオ結合体であり、第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、［９６］〜［１１２］の一または複数に記載されるとおり特徴づけられる、［９６］〜［１１２］の各々に記載の組成物。
［１１６］ 第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つが、ジブロック共重合体である、［１］〜［１１５］の各々に記載の組成物。
［１１７］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、ジブロック共重合体である、［１］〜［１１５］の各々に記載の組成物。
［１１８］ 第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つが、３つ以上のブロックを含むマルチブロック共重合体である、［１］〜［１１５］の各々に記載の組成物。
［１１９］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、３つ以上のブロックを含むマルチブロック共重合体である、［１］〜［１１５］の各々に記載の組成物。
［１２０］ 第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つが含む少なくとも一つのブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、［１］〜［１１９］の各々に記載の組成物。
［１２１］ 第１ポリマーの第１ブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、［１］〜［１２０］の各々に記載の組成物。
［１２２］ 第１ポリマーの第２ブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、［１］〜［１２１］の各々に記載の組成物。
［１２３］ 第２ポリマーの第１ブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、［１］〜［１２２］の各々に記載の組成物。
［１２４］ 第２ポリマーの第２ブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、［１］〜［１２３］の各々に記載の組成物。
［１２５］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、重合可能なモノマーに由来するモノマー残基を含む、［１］〜［１２４］の各々に記載の組成物。
［１２６］ 重合可能なモノマーが、エチレン（ethlenically）不飽和モノマーである、［１２５］に記載の組成物。
［１２７］ 重合可能なモノマーが、アクリルモノマーまたはビニルモノマーである、［１２５］に記載の組成物。
［１２８］ 重合可能なモノマーが、任意に置換されたアクリル酸、任意に置換されたアクリルアミド、および任意に置換されたアクリレートから選択されるアクリルモノマーである、［１２５］に記載の組成物。
［１２９］ 重合可能なモノマーが、任意にC1-C8アルキル-置換されたアクリル酸、任意にC1-C8アルキル-置換されたアクリルアミド、および任意にC1-C8アルキル-置換されたアクリレートから選択される、［１２５］に記載の組成物。
［１３０］ 重合可能なモノマーが、式II
Figure 2012500793
 （ここで
R3は、水素、ヒドロキシル、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、
R4は、陰イオン性種、陽イオン性種、中性種、疎水性種から選択される一または複数の種を含む基である）
を有するモノマーである、［１２５］に記載の組成物。
［１３１］ R4は、水素、-OR5、および-NR6R7からなる群より選択され、
R5は、水素、任意に置換されたアルキル、アルコキシ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたポリオキシル化アルキル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールからなる群より選択され、
R6およびR7は、それぞれ独立に、水素、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたポリオキシル化アルキル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールからなる群より選択される、
［１３０］に記載の組成物。
［１３２］ R3は、水素およびメチルからなる群より選択され、
R4は、-OR5、および-NR6R7からなる群より選択され、
R5は、水素、任意に置換されたC1-C3アルキル、アルコキシ、アルコキシ、およびポリオキシル化アルキルからなる群より選択され、
R6およびR7は、それぞれ独立に、水素、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択される、
［１３０］に記載の組成物。
［１３３］ ［保留］
［１３４］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、重合可能なモノマーの制御されたラジカル重合に由来するモノマー残基を含む、［１］〜［１３３］の各々に記載の組成物。
［１３５］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、1.5以下の多分散性指数を有する、［１］〜［１３４］の各々に記載の組成物。
［１３６］ 第１ポリマーが、第２ポリマーに共有結合により架橋結合し、これによりポリマーミセルが、架橋されたポリマーミセルである、［１］〜［１３５］の各々に記載の組成物。
［１３７］ 第１ポリマーの疎水性ブロックが、第２ポリマーの疎水性ブロックに共有結合により架橋結合する、［１］〜［１３６］の各々に記載の組成物。
［１３８］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーが、それぞれ、エチレン（ethlenic）モノマーの制御されたラジカル重合に由来する複数のモノマー残基を含み、少なくとも一つのかかるモノマーが、二官能性架橋モノマーである、［１］〜［１３７］の各々に記載の組成物。
［１３９］ 第１ポリマーまたは第２ポリマーが、式IA
Figure 2012500793
 （ここで
A0、A1、A2、A3およびA4は、それぞれ独立に、-CH2-、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)- および -O(C)bO-からなる群より選択され、
aは、1〜4の範囲の独立に選択された整数であり、
bは、2〜4の範囲の独立に選択された整数であり、
mは、0〜1.0未満 [好ましくは0〜約0.49]の範囲であり；
nは、0より大きく約1.0まで [好ましくは約0.51〜1.0]の範囲であり、
(m + n)の合計 = 1であり、
pは、約0.1〜約0.9の範囲であり、
qは、約0.1〜約0.9の範囲であり、
rは、0〜約0.8の範囲であり、
(p + q + r)の合計 = 1であり、
Y0、Y1およびY2は、それぞれ独立に、共有結合、(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル- および -S(2C-10C)アルキル- -C(O)NR6(2C-10C) アルキル-からなる群より選択され；
Y3は、共有結合、(1C-10C)アルキルおよび(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
Y4は、水素、(1C-10C)アルキル、(3C-6C)シクロアルキル、O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、C(O)NR6(1C-10C)およびアリールからなる群より選択され、これらの何れかは一または複数のフッ素基で任意に置換され；
R1-R5およびY0-Y4で完全には置換されていないA0-A4の四価の炭素原子は、原子価に適切な数の水素原子で置換され；
R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立に、水素、-CN、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらの何れかは一または複数のフッ素原子で任意に置換されてもよく；
Q0は、水素、親水性種(生理学的pHにおいて)；結合可能な（conjugatable）種および官能性種からなる群より選択され、
Q1は、生理学的pHにおいて親水性である種であり;
Q2は、生理学的pH において正に荷電している種であり；
Q3は、生理学的pHにおいて負に荷電している種であるが、より低いpHにおいてプロトン化を受け；
vは、約5〜約25 kDaであり；
wは、約5〜約50 kDaである）
のブロック共重合体である、［１］〜［１３９］の各々に記載の組成物。
［１４０］ 第１ポリマーまたは第２ポリマーが、式VI：
Figure 2012500793
 （ここで
A0、A1、A2、A3およびA4は、それぞれ独立に、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)- および -O(C)bO- からなる群より選択され；ここで
aは、1〜4の範囲の独立に選択された整数であり、
bは、2〜4の範囲の独立に選択された整数であり、
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10 および R11は、それぞれ独立に、水素、(1C-5C)アルキル、(3C-6C)シクロアルキルおよびフェニルからなる群より選択され、これらの何れかは一または複数のフッ素原子で任意に置換されてもよく；
Y0およびY4は、それぞれ独立に、水素、(1C-10C)アルキル、(3C-6C)シクロアルキル、O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキルおよびフェニルからなる群より選択され、これらの何れかは一または複数のフッ素基で任意に置換され；
Y1およびY2は、それぞれ独立に、共有結合、(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル- および -S(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され;
Y3は、共有結合、(1C-5C)アルキルおよびフェニルからなる群より選択され；
ここで、R1-R5およびY0-Y4で完全には置換されていないA1-A4の四価の炭素原子は、適切な数の水素原子で完備され；
Zは、生理学的に許容可能な対イオンであり、
mは、0〜約0.49であり、nは、約0.51〜約1.0であり、(m + n)の合計 = 1であり、
pは、約0.2〜約0.5であり、qは、約0.2〜約0.5であり、pは、qと実質的に同じであり、
rは、0〜約0.6であり、(p + q + r)の合計 = 1であり、
vは、約5〜約25 kDaであり；
wは、約5〜約25 kDaである）
のブロック共重合体である、［１］〜［１４０］の各々に記載の組成物。
［１４１］ ［保留］
［１４２］ ［保留］
［１４３］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、非ペプチド性ポリマーである、［１］〜［１４２］の各々に記載の組成物。
［１４４］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、非脂質性である、［１］〜［１４３］の各々に記載の組成物。
［１４５］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、非サッカリドポリマーである、［１］〜［１４４］の各々に記載の組成物。
［１４６］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、第１ポリマーの親水性ブロックとは組成的に異なる、［１］〜［１４５］の各々に記載の組成物。
［１４７］ 第２ポリマーの疎水性ブロックが、第１ポリマーの疎水性ブロックとは組成的に異なる、［１］〜［１４５］の各々に記載の組成物。
［１４８］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、第１ポリマーの親水性ブロックとは組成的に異なり、第２ポリマーの疎水性ブロックが、第１ポリマーの疎水性ブロックと実質的に同じ組成を有する、［１］〜［１４５］の各々に記載の組成物。
［１４９］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、第１ポリマーの親水性ブロックと実質的に同じ組成を有し、第２ポリマーの疎水性ブロックが、第１ポリマーの疎水性ブロックとは組成的に異なる、［１］〜［１４５］の各々に記載の組成物。
［１５０］ 第２ポリマーの親水性ブロックが、第１ポリマーの親水性ブロックとは組成的に異なり、第２ポリマーの疎水性ブロックが、第１ポリマーの疎水性ブロックとは組成的に異なる、［１］〜［１４５］の各々に記載の組成物。
［１５１］ 第１ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量の比（Mn 親水性：Mn 疎水性）1が、第２ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量の対応する比（Mn 親水性：Mn 疎水性）2と少なくとも0.1異なる、［１］〜［１５０］の各々に記載の組成物。
［１５２］ 第１ポリマーのトータルの数平均分子量Mnが、第２ポリマーのトータルの数平均分子量Mnと少なくとも10％異なる、［１］〜［１５１］の各々に記載の組成物。
［１５３］ 第２ポリマーが、第１ポリマーのモノマー残基と異なる一または複数のモノマー残基を含む、［１］〜［１５２］の何れかに記載の組成物。
［１５４］ 第１ポリマーおよび第２ポリマーが、それぞれ、同一の２つ以上のモノマー残基を含み、第２ポリマーについてのかかる２つ以上のモノマー残基の相対的な比が、第１ポリマーについての同一のかかる２つ以上のモノマー残基の相対的な比と異なる、［１］〜［１５２］の何れかに記載の組成物。
［１５５］ 第２ポリマーが、第１ポリマーのポリマーアーキテクチャー（polymeric architecture）と異なるポリマーアーキテクチャーを有する、［１］〜［１５４］の各々に記載の組成物。
［１５６］ 第２ポリマーが、多分散性以外により第１ポリマーと異なる、［１］〜［１５５］の各々に記載の組成物。
［１５７］ 一または複数の陰イオン性モノマー残基を必要とする範囲の（as and to the extent requiring）［１］〜［１５６］の各々に記載の組成物であって、かかる陰イオン性モノマー残基が、プロトン化可能な陰イオン性種などの、陰イオンに荷電した、または荷電可能な種を含む、組成物。
［１５８］ 一または複数の陽イオン性モノマー残基を必要とする範囲の［１］〜［１５７］の各々に記載の組成物であって、かかる陽イオン性モノマー残基が、脱プロトン化可能な陽イオン性種などの、陽イオンに荷電した、または荷電可能な種を含む、組成物。
［１５９］ 一または複数の疎水性モノマー残基または親水性モノマー残基を必要とする範囲の［１］〜［１５８］の各々に記載の組成物であって、かかるモノマー残基が、それぞれ疎水性種または親水性種を含む、組成物。
［１６０］ ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、［１］〜［１５９］の各々に記載の組成物。
［１６１］ ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチド遺伝子発現モジュレーターである、［１］〜［１６０］の各々に記載の組成物。
［１６２］ ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドアプタマーである、［１］〜［１６１］の各々に記載の組成物。
［１６３］ ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドノックダウン剤である、［１］〜［１６２］の各々に記載の組成物。
［１６４］ ポリヌクレオチドが干渉RNAである、［１］〜［１６３］の各々に記載の組成物。
［１６５］ ポリヌクレオチドが、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ダイサー基質、miRNA、aiRNAまたはshRNAから選択されるオリゴヌクレオチドである、［１］〜［１６４］の各々に記載の組成物。
［１６６］ ポリヌクレオチドがsiRNAである、［１］〜［１６５］の各々に記載の組成物。
［１６７］ ターゲティング部分を更に含む、［１］〜［１６６］の何れかに記載の組成物。
［１６８］ ターゲティング部分を含む［１］〜［１６７］の何れかに記載の組成物であって、ターゲティング部分が、エンドサイトーシスを媒介するのに有効な一または複数のレセプターに対する親和性を有するリガンドである、組成物。
［１６９］ ターゲティング部分を含む［１］〜［１６８］の何れかに記載の組成物であって、ターゲティング部分が、第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックに共有結合している、組成物。
［１７０］ ［保留］
［１７１］ ［１］〜［１７０］の各々に記載の組成物であって、ポリマーミセルが、(i)第１ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比が約 2:1〜約 1:9の範囲であること、および(ii)第２ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比が約 2:1〜約 1:9の範囲であることにより特徴づけられる、組成物。
［１７２］ ［１７１］に記載の組成物であって、(i)第１ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比が約 1:1〜約 1:3の範囲であり、(ii)第２ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比が、約 1:1〜約 1:3である、組成物。
［１７３］ ［１］〜［１７２］の各々に記載の組成物であって、ポリマーミセルが、第１ポリマーおよび第２ポリマーのミセルあたりトータルで約 10〜約 100鎖の範囲の集合数により特徴づけられる、組成物。
［１７４］ ［１７３］に記載の組成物であって、ポリマーミセルが、第１ポリマーおよび第２ポリマーのミセルあたりトータルで約 20〜約 60鎖の範囲の集合数により特徴づけられる、組成物。
［１７５］ ［１］〜［１７４］の各々に記載の組成物であって、ポリマーミセルが、約 0.2 ug/ml〜約 20 ug/mlの範囲の臨界ミセル濃度CMCにより特徴づけられる、組成物。
［１７６］ ［１７５］に記載の組成物であって、ミセルが、約 0.5 ug/ml〜約 10 ug/mlの範囲の臨界ミセル濃度CMCにより特徴づけられる、組成物。
［１７７］ ［保留］
［１７８］ ［１］〜［１７７］の各々に記載の組成物であって、第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、約 1.0〜約 1.7の範囲の多分散性指数を有する、組成物。
［１７９］ ［１］〜［１７８］の各々に記載の組成物であって、ブロック共重合体が、約 1.0〜約 1.4の範囲の多分散性指数を有する、組成物。
［１８０］ ［保留］
［１８１］ 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含み、［１］〜［１８０］の何れか１項により特徴づけられる組成物を調製するための方法であって、
第１ポリマーおよび第１ポリマーとは組成的に異なる第２ポリマーを第１変性媒体中に提供して、第１ポリマーおよび第２ポリマーの異種性混合物を形成し、ここで第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々は、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体であること、
異種性混合物を第２水性媒体に移すこと、
第１ポリマーの疎水性ブロックを、当該水性媒体において第２ポリマーの疎水性ブロックと結合させて、第１ポリマーおよび第２ポリマーを含む異種性ミセルを形成すること、および
ポリヌクレオチドを、第１ポリマー、第２ポリマーまたは異種性ミセルの少なくとも一つと結合させること
を含む方法。
［１８２］ ［１８１］に記載の方法であって、第１変性媒体が少なくとも30％ C1-C4アルコールを含み、第２水性媒体がpH-緩衝化水性媒体である、方法。
［１８３］ ［１８１］および［１８２］の各々に記載の方法であって、第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、当該方法が、
第１ポリマーおよび第２ポリマーを含む異種性混合物を、第１変性媒体中に形成すること、
第１媒体をpH-緩衝化水性媒体で一部希釈すること、
ポリヌクレオチドを、一部希釈された第１媒体に提供して、ポリヌクレオチドを、一部希釈された第１媒体において第１ポリマーの親水性ブロックの陽イオン性モノマー残基と結合させること、および
一部希釈された第１媒体を、pH-緩衝化水性媒体で更に希釈すること
を更に含む方法。
［１８４］ ［１８１］および［１８２］の各々に記載の方法であって、第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、当該方法が、
第１ポリマーおよびポリヌクレオチドを第１媒体に提供し、ここで第１媒体は、少なくとも30％、約70％以下のC1-C4アルコールを含むこと、
ポリヌクレオチドを、第１媒体において第１ポリマーの親水性ブロックの陽イオン性モノマー残基と結合させること、
第２ポリマーを第１媒体に提供して、第１媒体において第１ポリマーおよび第２ポリマーを含む異種性混合物を形成すること、および
第１媒体をpH-緩衝化水性媒体で希釈すること
更に含む方法。
［１８５］ 第２水性媒体がリン酸緩衝生理食塩水である、［１８１］〜［１８６］の各々に記載の方法。
［１８６］ ［１８１］〜［１８５］の各々に記載に方法により調製される組成物。
［１８７］ ［１］〜［１８０］および［１８６］の何れかに記載の組成物、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
［１８８］ 医薬の製造における［１］〜［１８０］および［１８６］の何れかに記載の組成物の使用。
［１８９］ ポリヌクレオチドの細胞内デリバリーのための方法であって、
異種性ポリマーミセルおよびこれと結合したポリヌクレオチドを含む［１］〜［１８０］および［１８６］の何れかに記載の組成物を提供すること、
組成物を、第１pHの媒体において細胞表面と接触させること、
組成物を、エンドサイトーシスにより細胞内のエンドソーム膜に導入すること、
エンドソーム膜を不安定化し、これにより組成物またはポリヌクレオチドを細胞のサイトゾルへデリバーすること
を含む方法。
［１９０］ 細胞において細胞内ターゲットの活性を調節するための方法であって、
ポリヌクレオチドを、［１８９］の方法に従って細胞のサイトゾルへデリバーすること、
ポリヌクレオチドを細胞内ターゲットと相互作用させ、これにより細胞内ターゲットの活性を調節すること
を含む方法。

Claims (190)

  1. 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
    親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマー、および
    第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
    を含み、
    第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つが、pH依存性、膜不安定化ポリマーであるかまたはそれを含む、組成物。
  2. 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
    親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマー、および
    第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
    を含み、
    第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つの疎水性ブロックが、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含む、組成物。
  3. 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
    親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマーであって、親水性ブロックが、ポリヌクレオチドとイオン結合して複数の陽イオン性モノマー残基を含む第１ポリマー、および
    第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
    を含み、
    第１ポリマーの親水性ブロック、第１ポリマーの疎水性ブロック、第２ポリマーの親水性ブロックおよび第２ポリマーの疎水性ブロックから選択される少なくとも一つのブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体ブロックである、組成物。
  4. 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
    親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマーであって、親水性ブロックが、ポリヌクレオチドであるかまたはそれを含み、疎水性ブロックが、複数の疎水性モノマー残基を含む第１ポリマー、および
    第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
    を含む、組成物。
  5. 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含む組成物であって、ミセルが、
    親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第１ポリマーと共有結合したポリヌクレオチドを含むポリマーバイオ結合体（polymer bioconjugate）であって、親水性ブロックが、連結部分を介してポリヌクレオチドに結合した結合種を有する一または複数のモノマー残基を含む、ポリマーバイオ結合体、および
    第１ポリマーとは組成的に異なり、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体である第２ポリマーであって、ミセルがpH 7.4の水性媒体中で安定であるように、第２ポリマーの疎水性ブロックが第１ポリマーの疎水性ブロックと結合している第２ポリマー
    を含む、組成物。
  6. 第１ポリマーが、pH依存性、膜不安定化ブロック共重合体である、請求項１〜５の何れかに記載の組成物。
  7. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、pH依存性、膜不安定化ブロック共重合体を含む、請求項１〜５の何れかに記載の組成物。
  8. 第２ポリマーが、pH依存性、膜不安定化ブロック共重合体である、請求項１〜７の何れかに記載の組成物。
  9. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、pH依存性、膜不安定化ブロック共重合体を含む、請求項１〜７の何れかに記載の組成物。
  10. 膜不安定化ポリマーが、pH 7.4におけるその溶血活性の少なくとも２倍の溶血活性をpH 6.2で有する、請求項６〜９の何れかに記載の組成物。
  11. 膜不安定化ポリマーが、pH 7.4におけるその溶血活性の少なくとも３倍の溶血活性をpH 5.8で有する、請求項６〜９の何れかに記載の組成物。
  12. 膜不安定化ポリマーが、約7.0より高いpHにおいて実質的に非溶血性である、請求項６〜１１の何れかに記載の組成物。
  13. 約20 ug/mlのポリマー濃度において、膜不安定化ポリマーが、インビトロの細胞アッセイで、約5.8またはそれより低いpHにおいて溶血性であり、約7.4より高いpHにおいて実質的に非溶血性である、請求項６〜９の何れかに記載の組成物。
  14. 膜不安定化ポリマーが、インビトロの細胞アッセイで、エンドソーム透過性（endosomal-permeable）またはエンドソーム分解性（endosomalytic）である、請求項１および６〜１３の何れかに記載の組成物。
  15. 膜不安定化ポリマーが、インビボの非ヒト哺乳類アッセイで、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である、請求項１および６〜１３の何れかに記載の組成物。
  16. ポリマーミセルが、インビトロの細胞アッセイで、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である、請求項１〜１５の何れかに記載の組成物。
  17. ポリマーミセルが、インビボの非ヒト哺乳類アッセイで、エンドソーム透過性またはエンドソーム分解性である、請求項１〜１５の何れかに記載の組成物。
  18. 組成物が、インビトロの細胞アッセイで遺伝子発現を調節する、請求項１〜１６の何れかに記載の組成物。
  19. 組成物が、インビボの非ヒト哺乳類アッセイで遺伝子発現を調節する、請求項１〜１６の何れかに記載の組成物。
  20. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含む、請求項３〜１９の何れかに記載の組成物。
  21. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の疎水性モノマー残基および複数の陰イオン性モノマー残基を含む、請求項１〜２０の何れかに記載の組成物。
  22. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含む、先行する請求項の何れかに記載の組成物。
  23. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含む、先行する請求項の何れかに記載の組成物。
  24. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の陽イオン性モノマー残基、および複数の疎水性モノマー残基を含み、疎水性ブロックが、pH 7.4の水性媒体中で実質的に中性の全体的な電荷を有する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  25. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の陽イオン性モノマー残基、および複数の疎水性モノマー残基を含み、疎水性ブロックが、pH 7.4の水性媒体中で実質的に中性の全体的な電荷を有する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  26. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、7.0より高いpHにおいて陰イオン性であり、かつ6.0またはそれより低いpHにおいて中性である（荷電していない）複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  27. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、7.0またはそれより高いpHにおいて陰イオン性であり、かつ6.0またはそれより低いpHにおいて中性である（荷電していない）複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  28. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基を含み、5.8〜7.0の範囲のpKaを有する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  29. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基を含み、5.8〜7.0の範囲のpKaを有する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  30. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、カルボン酸、スルホンアミド、ボロン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、リン酸、ホスフィン酸、および亜リン酸基、並びにこれらの組み合わせから選択されるプロトン化可能な（protonatable）陰イオン性種（species）を有する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  31. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、カルボン酸、スルホンアミド、ボロン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、リン酸、ホスフィン酸、および亜リン酸基、並びにこれらの組み合わせから選択されるプロトン化可能な陰イオン性種を有する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  32. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、(C2-C8)アルキルアクリル酸の重合に由来する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  33. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、(C2-C8)アルキルアクリル酸の重合に由来する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  34. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の中性(荷電していない)疎水性モノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  35. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の中性(荷電していない)疎水性モノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  36. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、各々のケースで任意に置換されたC2-C8アルキル、C2-C8アルケニル、C2-C8アルキニル、アリール、およびヘテロアリールから選択される疎水性種を有する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  37. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、各々のケースで任意に置換されたC2-C8アルキル、C2-C8アルケニル、C2-C8アルキニル、アリール、およびヘテロアリールから選択される疎水性種を有する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  38. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、各々のケースで任意に置換された(C2-C8)アルキル-エタクリレート、(C2-C8)アルキル-メタクリレート、または(C2-C8)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  39. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、各々のケースで任意に置換された(C2-C8)アルキル-エタクリレート、(C2-C8)アルキル-メタクリレート、または(C2-C8)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  40. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  41. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を更に含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  42. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、6.3〜7.8の範囲のpKaを有する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  43. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、6.3〜7.8の範囲のpKaを有する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  44. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される種を有する複数のモノマー残基を更に含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  45. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される種を有する複数のモノマー残基を更に含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  46. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、各ケースで任意に置換された、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  47. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、各ケースで任意に置換された、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  48. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の疎水性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含み、pH 7.4において：(i)疎水性：(陰イオン性＋陽イオン性)種の比が、約1:3〜約3:1の範囲であり、(ii)陰イオン性：陽イオン性種の比が、約1:0〜約1:4の範囲である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  49. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の疎水性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含み、pH 7.4において：(i)疎水性：(陰イオン性＋陽イオン性)種の比が、約1:3〜約3:1の範囲であり、(ii)陰イオン性：陽イオン性種の比が、約1:0〜約1:4の範囲である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  50. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の疎水性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含み、pH 7.4において：(i)疎水性：(陰イオン性＋陽イオン性)種の比が、約1:2〜約2:1の範囲であり、(ii)陰イオン性：陽イオン性種の比が、約4:1〜約1:4の範囲である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  51. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、複数の陰イオン性モノマー残基、複数の疎水性モノマー残基、および任意に複数の陽イオン性モノマー残基を含み、pH 7.4において：(i)疎水性：(陰イオン性＋陽イオン性)種の比が、約1:2〜約2:1の範囲であり、(ii)陰イオン性：陽イオン性種の比が、約4:1〜約1:4の範囲である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  52. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、プロトン化可能な陰イオン性種および疎水性種を有する第１の重合可能なモノマーに由来する複数の第１モノマー残基、および任意に脱プロトン化可能な陽イオン性種を有する第２の重合可能なモノマーに由来する複数の第２モノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  53. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、プロトン化可能な陰イオン性種および疎水性種を有する第１の重合可能なモノマーに由来する複数の第１モノマー残基、および任意に
    脱プロトン化可能な陽イオン性種を有する第２の重合可能なモノマーに由来する複数の第２モノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  54. ［保留］
  55. 第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含む、請求項１、２、３および５〜５４の各々に記載の組成物。
  56. 第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を、ポリヌクレオチドとイオン結合して含む、請求項１、２、３および５〜５４の各々に記載の組成物。
  57. 第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、6.3〜7.8の範囲のpKaを有する、請求項５５および５６の各々に記載の組成物。
  58. 第１ポリマーの親水性ブロックが、非環式アミン、非環式イミン、環式アミン、環式イミン、および窒素含有ヘテロアリールからなる群より選択される種を有する複数のモノマー残基を含む、請求項５５〜５７の各々に記載の組成物。
  59. 第１ポリマーの親水性ブロックが、各ケースで任意に置換された、(N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-エタクリレート、N,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-メタクリレート、またはN,N-ジ(C1-C6)アルキル-アミノ(C1-C6)アルキル-アクリレートの重合に由来する複数のモノマー残基を含む、請求項５５〜５７の各々に記載の組成物。
  60. 第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性親水性モノマー残基を更に含む、請求項５５〜５９の各々に記載の組成物。
  61. ［保留］
  62. 第１ポリマーの親水性ブロックが、ポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドが、連結部分を介して第１ポリマーの疎水性ブロックに共有結合している、請求項１、２、４および６〜５４の各々に記載の組成物。
  63. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、ポリヌクレオチドの３’端に共有結合している、請求項６２に記載の組成物。
  64. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、ポリヌクレオチドの５’端に共有結合している、請求項６２に記載の組成物。
  65. 連結部分が共有結合である、請求項６２〜６４の何れかに記載の組成物。
  66. 連結部分が、２つ以上の反応性官能基を含む多官能部分に由来する、請求項６２〜６４の何れかに記載の組成物。
  67. 連結部分が、pH感受性の不安定な（labile）部分である、請求項６２〜６６の何れかに記載の組成物。
  68. 連結部分が、血清pHで安定であり、エンドソーム（endosomal）pHで酸に不安定である、請求項６２〜６６の何れかに記載の組成物。
  69. 連結部分が、pH 7.4で安定であり、pH 6.0で酸に不安定である、請求項６２〜６６の何れかに記載の組成物。
  70. 連結部分がジスルフィドである、請求項６２〜６６の何れかに記載の組成物。
  71. ［保留］
  72. 連結部分を介して第１ポリマーに共有結合したポリヌクレオチドを含むポリマーバイオ結合体を含む、請求項１、２および５〜６１の各々に記載の組成物。
  73. ポリヌクレオチドが、連結部分を介して第１ポリマーの親水性ブロックに共有結合している、請求項７２に記載の組成物。
  74. 第１ポリマーが、ポリヌクレオチドの３’端に共有結合している、請求項７２および７３の各々に記載の組成物。
  75. 第１ポリマーが、ポリヌクレオチドの５’端に共有結合している、請求項７２および７３の各々に記載の組成物。
  76. 連結部分が共有結合である、請求項７２〜７５の何れかに記載の組成物。
  77. 連結部分が、２つ以上の反応性官能基を含む多官能部分に由来する、請求項７２〜７５の何れかに記載の組成物。
  78. 連結部分が、pH感受性の不安定な（labile）部分である、請求項７２〜７７の何れかに記載の組成物。
  79. 連結部分が、血清pHで安定であり、エンドソーム（endosomal）pHで酸に不安定である、請求項７２〜７７の何れかに記載の組成物。
  80. 連結部分が、pH 7.4で安定であり、pH 6.0で酸に不安定である、請求項７２〜７７の何れかに記載の組成物。
  81. 連結部分がジスルフィドである、請求項７２〜７７の何れかに記載の組成物。
  82. ［保留］
  83. 第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性親水性モノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  84. 第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性親水性モノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  85. 第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の陰イオン性親水性モノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  86. 第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の両性イオン性親水性モノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  87. 第２ポリマーの親水性ブロックが、ターゲティング部分を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  88. 連結部分を介して第２ポリマーの親水性ブロックに共有結合した１つ以上のターゲティング部分を更に含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  89. 第２ポリマーの親水性ブロックが、連結部分を介して第２ポリマーの疎水性ブロックに共有結合したターゲティング部分から本質的になる、請求項１〜８７の各々に記載の組成物。
  90. 第１ポリマーの親水性ブロックが、ポリヌクレオチドとイオン結合して複数の陽イオン性モノマー残基を含み、第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性極性残基を含む、請求項５５〜６１の各々に記載の組成物。
  91. ［保留］
  92. 第１ポリマーの親水性ブロックがポリヌクレオチドであり、第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性極性残基を含む、請求項６２〜７１の各々に記載の組成物。
  93. ［保留］
  94. ポリヌクレオチドが、第１ポリマーに共有結合しており、第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性極性残基を含む、請求項７２〜８２の各々に記載の組成物。
  95. ［保留］
  96. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、遮蔽種（shielding species）を有する複数のモノマー残基を(更に)含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  97. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、遮蔽オリゴマー（shielding oligomer）を含むペンダント基を有する複数のモノマー残基を(更に)含む、請求項９６に記載の組成物。
  98. 第２ポリマーの親水性ブロックが、遮蔽ポリマー（shielding polymer）である、請求項９６に記載の組成物。
  99. 遮蔽種が、ポリヌクレオチドの立体遮蔽（steric shielding）に効果的である、請求項９６〜９８の各々に記載の組成物。
  100. 遮蔽種が、血漿における酵素消化に対するポリヌクレオチドの安定性を向上させるのに効果的である、請求項９６〜９９の各々に記載の組成物。
  101. 遮蔽種が、インビボで組成物の毒性を低減するのに効果的である、請求項９６〜１００の各々に記載の組成物。
  102. 遮蔽種が、インビボで組成物の薬物動態または生体分布（biodistribution）を向上させるのに効果的である、請求項９６〜１００の各々に記載の組成物。
  103. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、複数の中性親水性モノマー残基を(更に)含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  104. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、式I
    Figure 2012500793
     （ここでR1およびR2は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、nは、2〜20の範囲の整数である）のオリゴマーを含むペンダント基を有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  105. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、式III
    Figure 2012500793
     （ここで
    Xは、独立に、O、NR9、およびSからなる群より選択され、
    R1、R2およびR3は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、
    nは、2〜20の範囲の整数であり、
    R8は、水素、ハロゲン、任意に置換されたC1-C3アルキル、およびターゲティング部分からなる群より選択され、これらは、任意に連結部分を介して連結され、
    R9は、水素、および任意に置換されたC1-C5アルキルからなる群より選択される）
    を有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を(更に)含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  106. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、式IV
    Figure 2012500793
     （ここで
    R1、R2およびR3は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、
    nは、2〜20の範囲の整数であり、
    R8は、水素、ハロゲン、任意に置換されたC1-C3アルキル、およびターゲティング部分からなる群より選択され、これらは、任意に連結部分を介して連結される）
    を有する重合可能なモノマーに由来する複数のモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  107. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、遮蔽オリゴマーを含むペンダント基を有する少なくとも約10重量％のモノマー残基を含むランダム共重合体である、請求項５５〜６１および７２〜９５の各々に記載の組成物。
  108. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、少なくとも約10重量％の中性親水性モノマー残基を含むランダム共重合体である、請求項５５〜６１および７２〜９５の各々に記載の組成物。
  109. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、先行する請求項１０４に記載される式Iのオリゴマーを含むペンダント基を有する少なくとも約10重量％のモノマー残基を含むランダム共重合体である、請求項５５〜６１および７２〜９５の各々に記載の組成物。
  110. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、先行する請求項１０５または１０６にそれぞれ記載される式IIIまたは式IVの重合可能なモノマーに由来する少なくとも約10重量％のモノマー残基を含むランダム共重合体である、請求項５５〜６１および７２〜９５の各々に記載の組成物。
  111. 第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、少なくとも約10重量％の陽イオン性モノマー残基を更に含むランダム共重合体である、請求項１０６〜１０９の各々に記載の組成物。
  112. 第２ポリマーの親水性ブロックが、式V
    Figure 2012500793
     （ここでR1およびR2は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択される）の繰返し単位を有し、約1,000〜約30,000の範囲の分子量を有する遮蔽ポリマーである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  113. 第１ポリマーの親水性ブロックが、ポリヌクレオチドとイオン結合して複数の陽イオン性モノマー残基を含む、請求項９６〜１１１の各々に記載の組成物。
  114. 第１ポリマーの親水性ブロックがポリヌクレオチドであり、第２ポリマーの親水性ブロックが、請求項９６〜１１２の一または複数に記載されるとおり特徴づけられる、請求項９６〜１１２の各々に記載の組成物。
  115. 第１ポリマーが、第１ポリマーに共有結合したポリヌクレオチドを含むポリマーバイオ結合体であり、第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックが、請求項９６〜１１２の一または複数に記載されるとおり特徴づけられる、請求項９６〜１１２の各々に記載の組成物。
  116. 第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つが、ジブロック共重合体である、請求項１〜１１５の各々に記載の組成物。
  117. 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、ジブロック共重合体である、請求項１〜１１５の各々に記載の組成物。
  118. 第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つが、３つ以上のブロックを含むマルチブロック共重合体である、請求項１〜１１５の各々に記載の組成物。
  119. 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、３つ以上のブロックを含むマルチブロック共重合体である、請求項１〜１１５の各々に記載の組成物。
  120. 第１ポリマーまたは第２ポリマーの少なくとも一つが含む少なくとも一つのブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  121. 第１ポリマーの第１ブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  122. 第１ポリマーの第２ブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  123. 第２ポリマーの第１ブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  124. 第２ポリマーの第２ブロックが、２つ以上の組成的に異なるモノマー残基を含むランダム共重合体である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  125. 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、重合可能なモノマーに由来するモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  126. 重合可能なモノマーが、エチレン（ethlenically）不飽和モノマーである、請求項１２５に記載の組成物。
  127. 重合可能なモノマーが、アクリルモノマーまたはビニルモノマーである、請求項１２５に記載の組成物。
  128. 重合可能なモノマーが、任意に置換されたアクリル酸、任意に置換されたアクリルアミド、および任意に置換されたアクリレートから選択されるアクリルモノマーである、請求項１２５に記載の組成物。
  129. 重合可能なモノマーが、任意にC1-C8アルキル-置換されたアクリル酸、任意にC1-C8アルキル-置換されたアクリルアミド、および任意にC1-C8アルキル-置換されたアクリレートから選択される、請求項１２５に記載の組成物。
  130. 重合可能なモノマーが、式II
    Figure 2012500793
     （ここで
    R3は、水素、ヒドロキシル、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択され、
    R4は、陰イオン性種、陽イオン性種、中性種、疎水性種から選択される一または複数の種を含む基である）
    を有するモノマーである、請求項１２５に記載の組成物。
  131. R4は、水素、-OR5、および-NR6R7からなる群より選択され、
    R5は、水素、任意に置換されたアルキル、アルコキシ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたポリオキシル化アルキル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールからなる群より選択され、
    R6およびR7は、それぞれ独立に、水素、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたポリオキシル化アルキル、任意に置換されたアリール、および任意に置換されたヘテロアリールからなる群より選択される、
    請求項１３０に記載の組成物。
  132. R3は、水素およびメチルからなる群より選択され、
    R4は、-OR5、および-NR6R7からなる群より選択され、
    R5は、水素、任意に置換されたC1-C3アルキル、アルコキシ、アルコキシ、およびポリオキシル化アルキルからなる群より選択され、
    R6およびR7は、それぞれ独立に、水素、および任意に置換されたC1-C3アルキルからなる群より選択される、
    請求項１３０に記載の組成物。
  133. ［保留］
  134. 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、重合可能なモノマーの制御されたラジカル重合に由来するモノマー残基を含む、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  135. 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、1.5以下の多分散性指数を有する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  136. 第１ポリマーが、第２ポリマーに共有結合により架橋結合し、これによりポリマーミセルが、架橋されたポリマーミセルである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  137. 第１ポリマーの疎水性ブロックが、第２ポリマーの疎水性ブロックに共有結合により架橋結合する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  138. 第１ポリマーおよび第２ポリマーが、それぞれ、エチレン（ethlenic）モノマーの制御されたラジカル重合に由来する複数のモノマー残基を含み、少なくとも一つのかかるモノマーが、二官能性架橋モノマーである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  139. 第１ポリマーまたは第２ポリマーが、式IA
    Figure 2012500793
     （ここで
    A0、A1、A2、A3およびA4は、それぞれ独立に、-CH2-、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)- および -O(C)bO-からなる群より選択され、
    aは、1〜4の範囲の独立に選択された整数であり、
    bは、2〜4の範囲の独立に選択された整数であり、
    mは、0〜1.0未満 [好ましくは0〜約0.49]の範囲であり；
    nは、0より大きく約1.0まで [好ましくは約0.51〜1.0]の範囲であり、
    (m + n)の合計 = 1であり、
    pは、約0.1〜約0.9の範囲であり、
    qは、約0.1〜約0.9の範囲であり、
    rは、0〜約0.8の範囲であり、
    (p + q + r)の合計 = 1であり、
    Y0、Y1およびY2は、それぞれ独立に、共有結合、(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル- および -S(2C-10C)アルキル- -C(O)NR6(2C-10C) アルキル-からなる群より選択され；
    Y3は、共有結合、(1C-10C)アルキルおよび(6C-10C)アリールからなる群より選択され；
    Y4は、水素、(1C-10C)アルキル、(3C-6C)シクロアルキル、O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキル、C(O)NR6(1C-10C)およびアリールからなる群より選択され、これらの何れかは一または複数のフッ素基で任意に置換され；
    R1-R5およびY0-Y4で完全には置換されていないA0-A4の四価の炭素原子は、原子価に適切な数の水素原子で置換され；
    R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、独立に、水素、-CN、アルキル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、これらの何れかは一または複数のフッ素原子で任意に置換されてもよく；
    Q0は、水素、親水性種(生理学的pHにおいて)；結合可能な（conjugatable）種および官能性種からなる群より選択され、
    Q1は、生理学的pHにおいて親水性である種であり;
    Q2は、生理学的pH において正に荷電している種であり；
    Q3は、生理学的pHにおいて負に荷電している種であるが、より低いpHにおいてプロトン化を受け；
    vは、約5〜約25 kDaであり；
    wは、約5〜約50 kDaである）
    のブロック共重合体である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  140. 第１ポリマーまたは第２ポリマーが、式VI：
    Figure 2012500793
     （ここで
    A0、A1、A2、A3およびA4は、それぞれ独立に、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)- および -O(C)bO- からなる群より選択され；ここで
    aは、1〜4の範囲の独立に選択された整数であり、
    bは、2〜4の範囲の独立に選択された整数であり、
    R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10 および R11は、それぞれ独立に、水素、(1C-5C)アルキル、(3C-6C)シクロアルキルおよびフェニルからなる群より選択され、これらの何れかは一または複数のフッ素原子で任意に置換されてもよく；
    Y0およびY4は、それぞれ独立に、水素、(1C-10C)アルキル、(3C-6C)シクロアルキル、O-(1C-10C)アルキル、-C(O)O(1C-10C)アルキルおよびフェニルからなる群より選択され、これらの何れかは一または複数のフッ素基で任意に置換され；
    Y1およびY2は、それぞれ独立に、共有結合、(1C-10C)アルキル-、-C(O)O(2C-10C)アルキル-、-OC(O)(1C-10C)アルキル-、-O(2C-10C)アルキル- および -S(2C-10C)アルキル-からなる群より選択され;
    Y3は、共有結合、(1C-5C)アルキルおよびフェニルからなる群より選択され；
    ここで、R1-R5およびY0-Y4で完全には置換されていないA1-A4の四価の炭素原子は、適切な数の水素原子で完備され；
    Zは、生理学的に許容可能な対イオンであり、
    mは、0〜約0.49であり、nは、約0.51〜約1.0であり、(m + n)の合計 = 1であり、
    pは、約0.2〜約0.5であり、qは、約0.2〜約0.5であり、pは、qと実質的に同じであり、
    rは、0〜約0.6であり、(p + q + r)の合計 = 1であり、
    vは、約5〜約25 kDaであり；
    wは、約5〜約25 kDaである）
    のブロック共重合体である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  141. ［保留］
  142. ［保留］
  143. 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、非ペプチド性ポリマーである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  144. 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、非脂質性である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  145. 第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、非サッカリドポリマーである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  146. 第２ポリマーの親水性ブロックが、第１ポリマーの親水性ブロックとは組成的に異なる、請求項１〜１４５の各々に記載の組成物。
  147. 第２ポリマーの疎水性ブロックが、第１ポリマーの疎水性ブロックとは組成的に異なる、請求項１〜１４５の各々に記載の組成物。
  148. 第２ポリマーの親水性ブロックが、第１ポリマーの親水性ブロックとは組成的に異なり、第２ポリマーの疎水性ブロックが、第１ポリマーの疎水性ブロックと実質的に同じ組成を有する、請求項１〜１４５の各々に記載の組成物。
  149. 第２ポリマーの親水性ブロックが、第１ポリマーの親水性ブロックと実質的に同じ組成を有し、第２ポリマーの疎水性ブロックが、第１ポリマーの疎水性ブロックとは組成的に異なる、請求項１〜１４５の各々に記載の組成物。
  150. 第２ポリマーの親水性ブロックが、第１ポリマーの親水性ブロックとは組成的に異なり、第２ポリマーの疎水性ブロックが、第１ポリマーの疎水性ブロックとは組成的に異なる、請求項１〜１４５の各々に記載の組成物。
  151. 第１ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量の比（Mn 親水性：Mn 疎水性）1が、第２ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量の対応する比（Mn 親水性：Mn 疎水性）2と少なくとも0.1異なる、請求項１〜１５０の各々に記載の組成物。
  152. 第１ポリマーのトータルの数平均分子量Mnが、第２ポリマーのトータルの数平均分子量Mnと少なくとも10％異なる、請求項１〜１５１の各々に記載の組成物。
  153. 第２ポリマーが、第１ポリマーのモノマー残基と異なる一または複数のモノマー残基を含む、請求項１〜１５２の何れかに記載の組成物。
  154. 第１ポリマーおよび第２ポリマーが、それぞれ、同一の２つ以上のモノマー残基を含み、第２ポリマーについてのかかる２つ以上のモノマー残基の相対的な比が、第１ポリマーについての同一のかかる２つ以上のモノマー残基の相対的な比と異なる、請求項１〜１５２の何れかに記載の組成物。
  155. 第２ポリマーが、第１ポリマーのポリマーアーキテクチャー（polymeric architecture）と異なるポリマーアーキテクチャーを有する、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  156. 第２ポリマーが、多分散性以外により第１ポリマーと異なる、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  157. 一または複数の陰イオン性モノマー残基を必要とする範囲の（as and to the extent requiring）先行する請求項の各々に記載の組成物であって、かかる陰イオン性モノマー残基が、プロトン化可能な陰イオン性種などの、陰イオンに荷電した、または荷電可能な種を含む、組成物。
  158. 一または複数の陽イオン性モノマー残基を必要とする範囲の先行する請求項の各々に記載の組成物であって、かかる陽イオン性モノマー残基が、脱プロトン化可能な陽イオン性種などの、陽イオンに荷電した、または荷電可能な種を含む、組成物。
  159. 一または複数の疎水性モノマー残基または親水性モノマー残基を必要とする範囲の先行する請求項の各々に記載の組成物であって、かかるモノマー残基が、それぞれ疎水性種または親水性種を含む、組成物。
  160. ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  161. ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチド遺伝子発現モジュレーターである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  162. ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドアプタマーである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  163. ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドノックダウン剤である、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  164. ポリヌクレオチドが干渉RNAである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  165. ポリヌクレオチドが、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ダイサー基質、miRNA、aiRNAまたはshRNAから選択されるオリゴヌクレオチドである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  166. ポリヌクレオチドがsiRNAである、先行する請求項の各々に記載の組成物。
  167. ターゲティング部分を更に含む、先行する請求項の何れかに記載の組成物。
  168. ターゲティング部分を含む先行する請求項の何れかに記載の組成物であって、ターゲティング部分が、エンドサイトーシスを媒介するのに有効な一または複数のレセプターに対する親和性を有するリガンドである、組成物。
  169. ターゲティング部分を含む先行する請求項の何れかに記載の組成物であって、ターゲティング部分が、第１ポリマーの親水性ブロックまたは第２ポリマーの親水性ブロックに共有結合している、組成物。
  170. ［保留］
  171. 先行する請求項の各々に記載の組成物であって、ポリマーミセルが、(i)第１ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比が約 2:1〜約 1:9の範囲であること、および(ii)第２ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比が約 2:1〜約 1:9の範囲であることにより特徴づけられる、組成物。
  172. 直前の請求項に記載の組成物であって、(i)第１ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比が約 1:1〜約 1:3の範囲であり、(ii)第２ポリマーについての親水性ブロック対疎水性ブロックの数平均分子量Mnの比が、約 1:1〜約 1:3である、組成物。
  173. 先行する請求項の各々に記載の組成物であって、ポリマーミセルが、第１ポリマーおよび第２ポリマーのミセルあたりトータルで約 10〜約 100鎖の範囲の集合数により特徴づけられる、組成物。
  174. 直前の請求項に記載の組成物であって、ポリマーミセルが、第１ポリマーおよび第２ポリマーのミセルあたりトータルで約 20〜約 60鎖の範囲の集合数により特徴づけられる、組成物。
  175. 先行する請求項の各々に記載の組成物であって、ポリマーミセルが、約 0.2 ug/ml〜約 20 ug/mlの範囲の臨界ミセル濃度CMCにより特徴づけられる、組成物。
  176. 直前の請求項に記載の組成物であって、ミセルが、約 0.5 ug/ml〜約 10 ug/mlの範囲の臨界ミセル濃度CMCにより特徴づけられる、組成物。
  177. ［保留］
  178. 先行する請求項の各々に記載の組成物であって、第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々が、約 1.0〜約 1.7の範囲の多分散性指数を有する、組成物。
  179. 先行する請求項の各々に記載の組成物であって、ブロック共重合体が、約 1.0〜約 1.4の範囲の多分散性指数を有する、組成物。
  180. ［保留］
  181. 異種性ポリマーミセルおよび当該ミセルと結合したポリヌクレオチドを含み、請求項１〜１８０の何れか１項により特徴づけられる組成物を調製するための方法であって、
    第１ポリマーおよび第１ポリマーとは組成的に異なる第２ポリマーを第１変性媒体中に提供して、第１ポリマーおよび第２ポリマーの異種性混合物を形成し、ここで第１ポリマーおよび第２ポリマーの各々は、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロック共重合体であること、
    異種性混合物を第２水性媒体に移すこと、
    第１ポリマーの疎水性ブロックを、当該水性媒体において第２ポリマーの疎水性ブロックと結合させて、第１ポリマーおよび第２ポリマーを含む異種性ミセルを形成すること、および
    ポリヌクレオチドを、第１ポリマー、第２ポリマーまたは異種性ミセルの少なくとも一つと結合させること
    を含む方法。
  182. 請求項１８１に記載の方法であって、第１変性媒体が少なくとも30％ C1-C4アルコールを含み、第２水性媒体がpH-緩衝化水性媒体である、方法。
  183. 請求項１８１および１８２の各々に記載の方法であって、第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、当該方法が、
    第１ポリマーおよび第２ポリマーを含む異種性混合物を、第１変性媒体中に形成すること、
    第１媒体をpH-緩衝化水性媒体で一部希釈すること、
    ポリヌクレオチドを、一部希釈された第１媒体に提供して、ポリヌクレオチドを、一部希釈された第１媒体において第１ポリマーの親水性ブロックの陽イオン性モノマー残基と結合させること、および
    一部希釈された第１媒体を、pH-緩衝化水性媒体で更に希釈すること
    を更に含む方法。
  184. 請求項１８１および１８２の各々に記載の方法であって、第１ポリマーの親水性ブロックが、複数の陽イオン性モノマー残基を含み、当該方法が、
    第１ポリマーおよびポリヌクレオチドを第１媒体に提供し、ここで第１媒体は、少なくとも30％、約70％以下のC1-C4アルコールを含むこと、
    ポリヌクレオチドを、第１媒体において第１ポリマーの親水性ブロックの陽イオン性モノマー残基と結合させること、
    第２ポリマーを第１媒体に提供して、第１媒体において第１ポリマーおよび第２ポリマーを含む異種性混合物を形成すること、および
    第１媒体をpH-緩衝化水性媒体で希釈すること
    更に含む方法。
  185. 第２水性媒体がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１８１〜１８６の各々に記載の方法。
  186. 請求項１８１〜１８５の各々に記載に方法により調製される組成物。
  187. 請求項１〜１８０および１８６の何れかに記載の組成物、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
  188. 医薬の製造における請求項１〜１８０および１８６の何れかに記載の組成物の使用。
  189. ポリヌクレオチドの細胞内デリバリーのための方法であって、
    異種性ポリマーミセルおよびこれと結合したポリヌクレオチドを含む請求項１〜１８０および１８６の何れかに記載の組成物を提供すること、
    組成物を、第１pHの媒体において細胞表面と接触させること、
    組成物を、エンドサイトーシスにより細胞内のエンドソーム膜に導入すること、
    エンドソーム膜を不安定化し、これにより組成物またはポリヌクレオチドを細胞のサイトゾルへデリバーすること
    を含む方法。
  190. 細胞において細胞内ターゲットの活性を調節するための方法であって、
    ポリヌクレオチドを、請求項１８９の方法に従って細胞のサイトゾルへデリバーすること、
    ポリヌクレオチドを細胞内ターゲットと相互させ、これにより細胞内ターゲットの活性を調節すること
    を含む方法。
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