KR20100037120A - Ｒｎａ 작용제의 양쪽성 컨주게이트를 포함하는 혼합 미쎌, 및 이의 용도 - Google Patents

Ｒｎａ 작용제의 양쪽성 컨주게이트를 포함하는 혼합 미쎌, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

RNA 간섭 작용제, 예컨대, 안티센스 RNA, 마이크로-RNA 및 siRNA의 전달을 위한 개선된 약제학적 제형을 개시한다. 제형은 iRNA 작용제와 신장된 친수성 쇄를 지니는 양쪽성 미쎌 형성 분자의 양쪽성 컨주게이트를 포함하는 혼합 미쎌을 사용한다. 세포내 표적에 대한 iRNA 작용제의 전달을 감소시키기 위해 약제학적 제형을 사용하는 방법, 및 제형 중의 iRNA 작용제의 세포외 뉴클레아제 변성을 감소시키기 위해 약제학적 제형을 사용하는 방법을 개시한다.

Description

ＲＮＡ 작용제의 양쪽성 컨주게이트를 포함하는 혼합 미쎌, 및 이의 용도{MIXED MICELLES INCLUDING AMPHIPATHIC CONJUGATES OF RNA AGENTS, AND USES THEREOF}
관련 출원
본원은 2007년 7월 6일에 출원된 미국 가특허 출원 제 60/948,433호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 약제 과학 분야, 특히 혼합 미쎌을 사용하는 제형, 구체적으로 RNA 작용제의 양쪽성 컨주게이트, 예컨대, siRNA를 포함하는 혼합 미쎌의 제형, 및 이의 용도와 관련되어 있다.
발명의 배경
많은 질환(예를 들어, 암, 조혈 장애(hematopoietic disorders), 엔도크린 장애, 및 면역 장애)이 특정 유전자 또는 유전자 군의 비정상 발현 또는 활성에서 기인한다. 유사하게, 질환은 단백질의 돌연변이형의 발현을 통해서, 뿐만 아니라 이들의 숙주의 유전체내로 통합된 바이러스 유전자의 발현으로부터 초래될 수 있다. 이러한 비정상 또는 외래 유전자들을 선택적으로 침묵시킬 수 있는 치료제의 혜택은 명백하다.
올리고뉴클레오티드 화합물은 의약에서 중요한 치료학적 응용을 갖는다. 올리고뉴클레오티드는 특정 질환에 관여하는 유전자들을 침묵시키는데 사용될 수 있다. 유전자-침묵은 번역을 억제시킴으로써 단백질의 형성을 막는다. 중요하게는, 유전자-침묵 작용제는 질환과 연관된 단백질의 기능을 억제시키는 전통적인 작은, 유기 화합물에 대한 전도유망한 대체물질(alternative)이다. 안티센스 RNA, 마이크로-RNA 및 작은 간섭 RNA(siRNA)는 유전자-침묵에 의해 상응하는 단백질의 형성을 막는 상이한 유형의 올리고뉴클레오티드들이다.
안티센스 방법학은 mRNA 또는 DNA에 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 13-30개 뉴클레오티드)의 상보적인 혼성화인데, 그리하여 이러한 세포내 핵산들의 정상적이고, 필수적인 기능들, 예컨대, 단백질의 합성이 방해된다. 혼성화는 RNA 또는 단일-가닥 DNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 왓슨-크릭 염기쌍을 통한 서열-특이적 수소 결합에 의해 이루어지며, 표적 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 방해한다.
마이크로-RNA는 개체내에서 자연적으로 생산되는 거대 그룹의 작은 RNA이고, 적어도 이들중 일부는 표적 유전자들의 발현을 조절한다. 마이크로-RNA는 리보뉴클레아제 다이서(Dicer)(Ambros et al. (2003), Current Biology 13(10):807-818)에 의해 대략 70개 뉴클레오티드 단일-가닥 헤어핀 전구체 전사체로부터 형성되는데, 상기 다이서는 상기 전구체를 절단시켜 21-23개 뉴클레오티드 이중-가닥 마이크로-RNA를 형성시킨다. 많은 경우에 있어서, 상기 마이크로-RNA는 종래 기능이 밝혀지지 않은 DNA 서열의 일부로부터 전사된다. 마이크로-RNA는 단백질로 번역되지 않으며, 오히려, 이들은 번역을 차단하는 특정 전령 RNA에 결합한다. 마이크로-RNA는 이들의 표적과 부정확하게 염기쌍을 이루어 번역을 억제하는 것으로 생각된다.
RNA 간섭 또는 "RNAi"는 이중-가닥 RNA(dsRNA)가 웜(worms)내로 도입될 때 유전자 발현을 차단한다는 관찰을 기술하기 위해 파이어(Fire)와 동료들에 의해 처음 만들어진 용어이다(Fire et al. (1998), Nature 391:806-811). 짧은 길이 dsRNA는 척추동물을 포함하는 많은 개체에서 유전자-특이적, 전사후 침묵을 유도하며, 유전자 기능 연구를 위한 새로운 도구를 제공하였다. RNAi는 침묵 트리거(trigger)와 상동성있는 전령 RNA를 파괴시키는 서열-특이적이고, 다구성요소(multicomponent) 뉴클레아제인, RNA-유도성 침묵 복합체(RISC)에 의해 매개된다.
dsRNA로의 처리는 무척추 개체에서 유전자 기능을 분석하기 위한 중요한 방법이 되어 왔다. 예를 들어, 드지토베바 등(Dzitoveva et al.)은 RNAi가 마취된 초파리(Drosophila)의 복부내로 dsRNA를 주입함으로써 성체 초파리(fruit flies)에서 유도될 수 있으며, 이 방법은 또한 중추 신경계에서 발현되는 유전자들을 표적으로 삼을 수 있다는 것을 보여주었다(Dzitoveva et al. (2001), Mol. Psychiatry 6(6):665-670). 도입유전자(transgenes) 및 내생성 유전자 둘 모두가 이들 각각의 dsRNA의 복부내 주입에 의해 성체 드로소필라에서 성공적으로 침묵되었다. 더욱이, 엘바쉬르 등(Elbashir et al.)은 dsRNA 가공 방향이 센스 또는 안티센스 표적 RNA가 siRNA-단백질 복합체에 의해 절단될 수 있는지 여부를 결정하는 증거를 제공하였다(Elbashir et al. (2001), Genes Dev. 15(2):188-200).
1998년에 RNA 간섭 (RNAi) 현상이 최초로 보고된 이래로(Fire et al. (1998), Nature 391: 806-811), 합성 siRNA의 용도에 기초하여 진단 및 치료 전략의 개발에 관심의 물결이 있었으며, 그 이유는 상기 siRNA들이 잠재적인 신규한 부류의 약제 약물로서 명확하게 드러났기 때문이다(Bumcrot et al. (2006), Nat. Chem. Biol. 2:711-719). 몇몇 RNAi-기반 생체내 전략들이 바이러스 감염증으로부터(Giladi et al. (2003), Mol. Ther. 8:769-776; Song et al. (2003), Nat. Med. 9:347-351) 암(Duxbury et al. (2003), Biochem. Biophys. Res. Commun. 311:786-792; Duxbury et al. (2004), Oncogene 23:1448-1456)과 심지어 신경학적 병태(Dorn et al. (2004), Nucleic Acids Res. 32:e49; Thakker et al. (2005), Mol. Psychiatry 10:782-789, 714)에 이르기까지 광범위한 병태의 치료에 관해 문헌으로 보고되었다.
나출형(Naked) siRNA는 정맥내로(Zender et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7797-7802), 척수강내로(Dorn et al. (2004), Nucleic Acids Res. 32:e49), 복강내로(Filleur et al. (2003), Cancer Res. 63:3919-3922), 적용가능한 경우, 표적 조직내로의 직접 주입으로(Zender et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7797-7802; Aharinejad et al. (2004), Cancer Res. 64:5378-5384; Lingor et al. (2005), Brain 128:550-558; Pille et al. (2005), Mol. Ther. 11:267-274) 투여되었다. 특히 수력학적(hydrodynamic) IV 주입의 경우, 간 조직에서, 상당한 수준의 활성이 보고되었다(Giladi et al. (2003), Mol. Ther. 8:769-776; Song et al. (2003), Nat. Med. 9:347-351; Zender et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7797-7802; Bradley et al. (2005), Pancreas 31:373-379; Hamar et al. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:14883-14888; Hino et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun. 340:263-267; Tompkins et al. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:8682-8686). siRNA의 생체내 용도에 관한 일반적인 과정은 최근에 검토되었고(Behlke (2006), Mol. Ther. 13:644-670), 신규한 RNAi-기반 치료제가 활발하게 개발중이다(Liu et al. (2007), Histol. Histopathol. 22:211-217). 불행하게도, 언급된 다수의 대안적인 경로의 적용성은 몇몇 조직에만 국한되고, 직접 주입의 경우, 용이하게 접근가능한 조직에 추가로 제한된다(Aigner (2006), J. Biomed. Biotechnol. 2006(4):71659). 추가로, 높은 용량 및 반복된 투여는 종종 활성을 위해 필요하다.
나출형 siRNA 접근법이 임상 적용을 위해 계속하여 추구되고 있으나, 실용적인 임상 치료법을 위한 siRNA 기반 전략의 적용에 있어서 현재 직면한 주요 난관은 의도된 작용 부위로의 siRNA의 효율적 전달에 관한 요구임이 점차적으로 받아들여 지고 있다(Aigner (2006), J. Biomed. Biotechnol. 2006(4):71659). 더 나은 안정성을 획득하고 조직-특이적 표적화(targeting)를 부여하기 위한 siRNA 분자의 화학적 변형(콜레스테릴 잔기를 이용한 이들의 변형을 포함함)이 약간의 관심을 끌었으나(Soutschek et al. (2004), Nature 432:173-178; Manoharan (2004), Curr. Opin. Chem. Biol. 8:570-579; Morrissey et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23:1002-1007), 주요 초점은 siRNA의 운반을 개선시키기 위한 캐리어 시스템의 용도에 있다. 붐코트 등(Bumcort et al.)에 의해 강조된 바와 같이, "효과적인 운반은 임상에서 RNAi의 성공적인 번역을 위한 가장 도전적인 잔존 고려사항이다"(Bumcort et al. (2006), Nat. Chem. Biol. 2:711).
개선된 siRNA 전달에 관한 접근법은, 바이러스 및 비바이러스 기반 전략 둘 모두를 탐구하면서, 이미 확립된 DNA 전달 분야로부터 훨씬 이해가능하게 차용되었다. 면역 반응 및 가능한 종양형성(oncogenesis)을 포함하는, DNA 기반 치료법에서 이미 확인된 바이러스 접근법의 결점은, 짧은 활동 지속시간 및 반복된 투여에대한 요구로 인해 siRNA의 전달을 잠재적으로 더 제한한다(Bartlett et al. (2006). Nucleic Acids Res. 34:322-333). 비바이러스 시스템은 디자인에 있어서 비교적 더 유연하며 더 쉽게 제형화된다. 반복 투여에 관한 잠재성은 개선된 생체적합성으로 인해 더 커지며, 비바이러스 시스템은 siRNA 생성물 또는 siRNA 이중나선 그 자체를 코딩하는 DNA 둘 모두를 운반하는데 사용될 수 있다.
폴리머-기반 siRNA 전달 시스템, 특히 폴리에틸렌이민(PEI)-기반 시스템은 활발하게 조사되었고(Aigner (2006), J. Biomed. Biotechnol. 2006(4):71659; Putnam et al. (2006), Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 23:137-164), 양이온성 폴리머, 특히 PEI는, 비록 그러한 캐리어의 독성이 여전히 문제거리이지만, 생체내에서 siRNA 활성의 효율을 개선시키는데 사용되어 약간의 성공을 거두었다(Ge et al. (2004), Proc. Natl. Acad. ScL USA 101:8676-8681; Leng et al. (2005), Cancer Gene Ther. 12:682-690; Urban-Klein et al. (2005), Gene Ther. 12:461-466; Yin et al. (2005), J. Mol. Cell. Cardiol. 39:681-689). 폴리머 나노입자가 또한 유력한 siRNA 캐리어로 고려되어 왔다(Toub et al. (2006), Pharmacother. 60:607-620). 폴리머 또는 금속 나노입자에 기반한 나노입자 캐리어 시스템이 siRNA 전달에 관해 탐구되었다(Schiffelers et al. (2004), Nucleic Acids Res. 32:e19; Derfus et al. (2007), Bioconjug. Chem. 18(5): 1391-6).
siRNA의 지질 캐리어는 자연적으로 많은 관심을 불러일으켰다(Spagnou et al. (2004), Biochemistry (Mosc). 43:13348-13356). 리포좀은 siRNA 치료제를 위한 가장 폭넓게 탐구된 비바이러스 시스템인 것으로 여겨진다(Aigner (2006), J. Biomed. Biotechnol. 2006(4):71659). siRNA의 리포좀 제형은 고형 종양(Landen et al. (2005), Cancer Res. 65:6910-6918), 전이 암(Yano et al. (2004), Clin. Cancer Res. 10:7721-7726) 및 포유 동물에서 다양한 다른 병태(Nogawa et al. (2005), J. Clin. Invest. 115:978-985)의 치료에 있어서 특정 유전자의 녹-다운(knock-down)을 개선시키는데 사용되었다. 약간의 성공을 거두었으나, 세포-투과 펩티드-매개 세포내 전달을 수반하는 리포좀-기반 siRNA 전달 시스템을 이용한 우리 자신의 경험(Zhang et al. (2006), J. Control. Release. 112:229-239)은, 재생산성 문제를 비롯한 제조 및 확장성(scalability)과 관련된 문제점과 연관되어 있었다. 또한 리간드-표적 나노캐리어-기반 siRNA 전달 시스템을 제조하기 위한 첫번째 시도가 소개되었다(Ikeda et al. (2006), Pharm. Res. 23: 1631-1640). 그러나, 현재까지 시험된 전략들중 어느 것도 임상적으로 유의미한 시스템을 야기시키지 못하였다.
siRNA는 최근에 등장한 다수의 공개된 예들로 유력한 항-바이러스 치료제로서 매우 효과적인 것으로 드러났다. 바이러스 유전체내의 표적들에 유도되는 siRNA 분자는 인플루엔자(Ge et al. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:8676-8681 ; Tompkins et al. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:8682-8686; Thomas et al. (2005), Expert Opin. Biol. Ther. 5:495-505 (2005)), 호흡기세포융합바이러스(RSV)(Bitko et al. (2005), Nat. Med. 11:50-55), B형 간염 바이러스(HBV)(Morrissey et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23: 1002-1007), C형 간염 바이러스(Kapadia (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2014-2018; Wilson et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2783-2788) 및 SARS 코로나바이러스(Li et al. (2005), Nat. Med. 11:944- 951)의 동물 모델에서 여러 자릿수(orders of magnitude)로 바이러스 타이터를 급격하게 감소시킨다. 또한, 연구는 현재 중추신경계 질환, 염증성 질환, 대사장애, 종양(oncology), 감염성 질환, 및 안구질환을 포함하는 다수의 질환의 치료를 위한 간섭 RNA 치료 작용제를 개발하기 위해 진행중이다.
안티센스 RNA, 마이크로-RNA 및 siRNA, 기법의 진보에도 불구하고, 주요 난관중 하나는 이들 올리고뉴클레오티드의 세포내로의 세로내 전달이다. 특히, 생체내에 투여된 RNA를 급속하게 변성시키는 세포외 및 세포내 환경 둘 모두에서 상당한 뉴클레아제 활성이 존재한다. 그 결과, 피검체에 투여된 RNA의 단지 매우 적은 비율만이 세포내의 원하는 표적에 도달한다. 비록 광범위한 전달 전략이 당해 기술분야에서 조사되었지만(예를 들어, 하기 문헌 참조: Gilmore et al. (2006), Current Drug Delivery 3:147-145), 활성있고 임상적으로 허용가능한 안티센스 RNA, 마이크로-RNA 및 siRNA의 제조물을 제조하기 위한 많은 중요한 논쟁거리들이 여전히 미해결된 체 남아있고, RNA-기반 치료 작용제를 위한 단순하고, 범용성이며, 용이하게 제조되는 전달 시스템에 관한 요구가 여전히 잔존하고 있다.
발명의 요약
본 발명은, 부분적으로, 특별한 혼합 미쎌이 생산될 수 있다는 인식에 의존하는데, 상기 혼합 미쎌은 RNA 모이어티의 양쪽성 컨주게이트 및 방사상으로 뻗어있는(extending) 친수성 모이어티를 갖는 미쎌-형성 양쪽성 분자 둘 모두를 포함하고, 그리하여 상기 방사상으로 뻗어있는 친수성 모이어티가 상기 RNA 모이어티의 적어도 일부분을 에워싸거나 마스킹(masking)하는 층을 형성하고, 그에 따라 뉴클레아제에 의한 상기 RNA 모이어티의 절단을 입체적으로 방해하고 감소시킴으로서 siRNA의 생체내 안정성을 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 혼합 미쎌내의 친수성 층이 상기 RNA 모이어티를 실질적으로 에워싸거나 마스킹하기에 충분한 두께 및 밀도를 가지고 그로 인해 뉴클레아제에 의한 절단으로부터 상기 RNA 모이어티를 실질적으로 보호하는 혼합 미쎌을 제공한다. 그 결과, 본 발명은, 세포외 뉴클레아제에 의한 실질적으로 감소된 절단, 및 혈액, 뇌척수액 또는 국소 세포외 미세환경내에서 실질적으로 증가된 RNA 반감기를 동반하는, RNA를 세포내 치료 표적으로 전달하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 또한, 그러한 혼합 미쎌의 표면은 상기 iRNA-함유 미쎌이 원하는 표적 세포를 표적화하고/하거나 증강된 세포내 관통(penetration)을 제공하는 모이어티로 변형될 수 있다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은 (1) (a) 각각의 컨주게이트가 친수성 모이어티와 소수성 모이어티를 포함하는, 복수의 양쪽성 iRNA 컨주게이트로서, 상기 친수성 모이어티 각각이 상기 iRNA 작용제의 iRNA 모이어티를 포함하는, 복수의 양쪽성 iRNA 컨주게이트; (b) 각각의 미쎌-형성 양쪽성 분자가 친수성 모이어티 및 소수성 모이어티를 포함하는, 복수의 미쎌-형성 양쪽성 분자로서, 상기 친수성 모이어티 각각이 상기 혼합 미쎌의 중심으로부터 방사상으로 신장되는 하나 이상의 친수성 쇄를 포함하는, 복수의 미쎌-형성 양쪽성 분자;를 포함하는 혼합 미쎌; 및 (2) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 iRNA 작용제의 약제학적 제형을 제공한다.
약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄들은 상기 혼합 미쎌의 중심으로부터 방사상으로 뻗어 나간 친수성 층을 형성하고; 상기 양쪽성 iRNA 컨주게이트는 상기 혼합 미쎌내에 위치하여 상기 iRNA 모이어티의 표면중 적어도 일부가 상기 친수성 층 내부에 존재한다.
상기 약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 iRNA 모이어티의 표면중 어떠한 부분도 상기 친수성 층을 넘어서 바깥쪽으로 방사상으로 뻗어 나가지 아니한다.
상기 약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄들은 200 내지 500Å 사이의 평균 백본 길이를 지닌다. 다른 구체예들에서, 상기 복수의 쇄들은 100 내지 1,000Å, 및 50 내지 2,000Å 사이의 평균 백본 길이를 지닌다.
상기 약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄는 1,500 내지 5,000 g/mole 사이의 평균 분자량을 지닌다. 다른 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄는 500 내지 15,000 g/mole 사이, 및 1,000-10,000 g/mole 사이의 평균 분자량을 지닌다.
앞서 기술한 구체예들 중 일부 구체예들에서, 상기 미쎌-형성 양쪽성 분자의 소수성 모이어티는 장쇄 지방산, 인지질, 지질, 및 당지질의 라디칼들로부터 선택된다.
앞서 기술한 구체예들 중 일부 구체예들에서, 상기 양쪽성 iRNA 컨주게이트의 소수성 모이어티는 콜레스테롤, 장쇄 지방산, 지질, 인지질, 및 당지질의 라디칼들에서 선택된다.
앞서 기술한 구체예들 중 일부 구체예들에서, 상기 지방산은 부탄산, 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 테트라데칸산, 헥사데칸산, 옥타데칸산, 에이코산산(eicosanoic acid), 도코산산(docosanoic acid), 테트라코산산 및 이들의 불포화 동질체(congeners)에서 선택된다.
앞서 기술한 구체예들 중 일부 구체예들에서, 상기 인지질은 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티딜 글리세롤(PG), 포스파티딜 이노시톨(PI), 포스파티딜 세린(PS), 포스파티드산(PA), 및 스핑고미엘린에서 선택된다.
앞서 기술한 구체예들 중 일부 구체예들에서, 상기 당지질은 갈락토지질, 설포지질, 세레브로시드, 및 강글리오시드에서 선택된다.
앞서 기술한 구체예들 중 일부 구체예들에서, 상기 미쎌-형성 양쪽성 분자의 친수성 모이어티는 PEG, PEI, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 폴리옥사졸린, 폴리몰포린, 키토산, 및 수용성 펩티드의 라디칼들에서 선택된다. 앞서 기술한 구체예들 중 일부 구체예들에서, 상기 친수성 모이어티는 1,500 내지 5,000 g/mole 사이의 평균 분자량을 지니는 PEG 라디칼이다. 다른 구체예들에서, 상기 PEG 라디칼은 500 내지 15,000 g/mole, 및 1,000 내지 10,000 g/mole의 평균 분자량을 지닌다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 상기 약제학적 제형중 어느 하나로 상기 iRNA 작용제를 제형화시키고, 상기 약제학적 제형을 세포외로(extracellularly) 투여하고, 그리하여 세포내 표적으로 상기 iRNA 작용제의 전달이 약제학적으로 허용되는 담체 중의 상기 iRNA 작용제의 전달에 비해 증가되는, 세포내 표적에 대한 iRNA 작용제의 전달을 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원의 약제학적 제형 중 어느 하나로 상기 iRNA 작용제를 제형화시키고, 상기 약제학적 제형을 세포외로 투여함으로써, 그리하여 상기 약제학적 제형내의 상기 iRNA 작용제의 세포외 뉴클레아제 변성이 약제학적으로 허용되는 담체내 상기 iRNA 작용제의 변성에 비해 감소되는, iRNA 작용제의 세포외 뉴클레아제 변성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예들의 세부내용은 하기 첨부된 도면 및 상세한 설명에 기술되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면, 및 특허청구범위로부터 자명할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따라 제조된 siRNA-Chol/PEG-PE 미쎌의 크기 분포를 보여주는 그래프이다.
도 2는 Hoechst33342 핵 염색으로 염색된 MCF7(인간 유방 선암) 세포의 에피 형광 현미경사진(epifluorescence micrographs)이다. 도 2A와 2B: 2시간 동안 Cy3-siRNA-Chol/PEG2-PE 미쎌에 노출된 세포. 도 2C와 2D: 비처리된 세포. 도 2A와 2C: UV 채널. 도 2B와 2D: 레드(Red) 채널.
도 3은 Cy3-siRNA-Chol/PEG-PE 미쎌과 함께 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, Ex554, Em570에서 MCF7 세포(A)와 4T1 세포(B)를 측정하여 얻은 세포-결합 Cy3 형광을 보여주는 그래프이다. n=3.
도 4는 Col-SiRNA 및 Chol-SiRNA-PEG-PE 미쎌(siRNA 양 동일)과 함께 C166-GFP 마우스 내피 세포의 인큐베이션후 GFP 생산의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 5는 siRNA-콜레스테롤 합성을 위한 반응도식을 도시한다. 도 5A: 머캅틸-콜레스테롤의 제조. 도 5B: SPDP를 통한 머캅틸 콜레스테롤과 siRNA의 컨주게이션.
도 6은 Cy3-siRNA-콜레스테롤 합성을 위한 반응도식을 도시한다.
상세한 설명
1. 개요
본 발명은, 부분적으로, 특별한 혼합 미쎌이 생산될 수 있다는 인식에 의존하는데, 상기 혼합 미쎌은 RNA와 방사상으로 뻗어있는 친수성 모이어티를 갖는 미쎌-형성 양쪽성 분자의 양쪽성 컨주게이트를 포함하고, 그리하여 상기 방사상으로 뻗어있는 친수성 모이어티가 상기 RNA 모이어티의 적어도 일부분을 에워싸거나 마스킹하는 층을 형성하고, 그에 따라 뉴클레아제에 의한 상기 RNA 모이어티의 절단을 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 혼합 미쎌을 제공하는데, 상기 미쎌내의 친수성 층은 상기 RNA 모이어티를 실질적으로 에워싸거나 마스킹하는데 충분한 두께 및 밀도를 가지며 그리하여 뉴클레아제에 의한 절단으로부터 상기 모이어티들을 실질적으로 보호한다. 그 결과, 본 발명은 세포내의 치료 표적으로 RNA를 전달하는 개선된 방법을 제공하는데, 본 발명에 따르면 세포외 뉴클레아제에 의한 절단이 실질적으로 감소되며, 혈액, 뇌척수액, 또는 국소 세포외 미세환경내에서 RNA 반감기가 실질적으로 증가된다.
2. 참고문헌 및 정의
본원에 참조된 특허 및 과학 문헌은 당업계의 통상의 기술자에게 가용한 지식을 확립시킨다. 본원에서 인용된, 등록된 미국 특허, 접수된 특허출원, 공개된 외국 특허출원, 및 참고문헌은 각각이 구체적으로 개별적으로 지시되어 참고문헌으로써 통합된 것과 동일한 정도로 참고문헌으로써 본원에 통합된다.
본원에 사용된, 용어 "RNA 작용제"는 비변형된 리보핵산(RNA), 변형된 RNA, 또는 뉴클레오시드 대체물질(surrogate)을 의미한다.
RNA 작용제와 관련하여 사용된, 용어 "변형된"은 하기 변형들 중 하나 이상에 의해 자연적으로 생성된 리보핵산과 화학적 구조에 있어서 차이가 있는 분자를 의미한다: 포스포디에스테르 백본내 하나 이상의 원자들의 부가, 결실 또는 치환(예를 들어, 포스포디에스테르 결합의 포스포티오에이트 또는 펩티드 핵산 결합으로 대체); 리보오즈 단위내 하나 이상의 원자들의 부가, 결실 또는 치환(예를 들어, 리보오즈 단위의 데옥시리보오즈 단위로의 대체); 및 뉴클레오시드 염기 단위내의 하나 이상의 원자들의 부가, 결실 또는 치환(예를 들어, 염기 단위의, 본원에 기재된, 염기 유사체로의 대체). "변형된 RNA"를 설명할 때, 이 용어는 기술적으로 RNA가 아닌(예를 들어, 리보오즈가 대체되었기 때문) 분자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "뉴클레오시드 대체물질"는 리보포스페이트 백본이, 염기들을 정확한 공간적 관계로 제공하여 리보포스페이트 백본에서 보여지는 것과 실질적으로 유사한 혼성화를 가능케 하는, 비-리보포스페이트 컨스트럭트(예를 들어, 리보포스페이트 백본의 비하전된 모방체(mimics))로 대체된다는 점에서 자연적으로 생성되는 리보핵산과 상이한 분자를 의미한다.
본원에 사용된, 용어 "iRNA 작용제"는 표적 유전자, 바람직하게는 내생성 또는 병원균 표적 RNA의 발현을 하향 조절할 수 있는 RNA 작용제, 또는 상기 하향 조절할 수 있는 RNA 작용제로 절단될 수 있는 RNA 작용제를 의미한다. iRNA 작용제는 안티센스 RNA, 마이크로-RNA 및 siRNA를 포함한다. 이론에 의해 국한되는 것을 원하는 것은 아니나, iRNA 작용제는 표적 mRNA의 전사후 절단(때때로 당업계에서 RNAi로 지칭됨), 또는 전사전 또는 번역전 메카니즘을 포함하는, 다수의 메카니즘들 중 하나 이상에 의해 작용할 수 있다. iRNA 작용제는 단일 가닥을 포함하거나 하나 이상의 가닥(예를 들어, 이중-가닥 iRNA 작용제)을 포함할 수 있다. iRNA 작용제가 단일 가닥인 경우, 상기 작용제는 하나 이상의 포스페이트 기 또는 하나 이상의 포스페이트 기의 유사체를 포함하는 5' 변형을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
본원에 사용된, 용어 "양쪽성"은 친수성과 소수성 모이어티 둘 모두를 포함하는 의미이며, "양친매성(amphiphilic)"과 동의어이다. 양쪽성 분자는 적절한 온도 및 농도에서 수성 용액내에 분산될 때 미쎌을 형성할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "임계 미쎌 농도(critical micelle concentration)" 및 축약어 "CMC"는 미쎌이 수성 용액에서 자발적으로 형성되기 시작하는 양쪽성 화합물의 농도를 의미한다. "낮은" 임계 미쎌 농도은 10-5 M 이하이다.
본원에 사용된, 용어 "분자 백본 길이"는 결합 각에 관계없이, 분자내에서 가장 긴 원자들의 연속된 사슬을 구성하는 원자들 간의 결합 길이의 총합을 의미한다. 따라서, 단순히 일예로서, 이소부탄의 분자 백본 길이는 3개의 C-C 결합과 2개의 C-H 결합의 결합 길이의 총합이다(즉, 3 x 1.43 Å + 2 x 1.09 Å). 이러한 계산은 결합각과 분자가 2차 구조(예를 들어, 구상(globular) 구조)를 취할 수 있다는 사실을 모두 무시하기 때문에, 원 위치에서(in situ) 분자의 물리적 길이를 과평가한다. 그럼에도 불구하고, 이것은 siRNA 작용제와 본 발명의 목적을 위한 친수성 쇄의 상대적인 크기를 비교하기 위한 유용한 근사치가 된다.
본원에 사용된, 용어 "감소시키다"는 통계학적 중요성(즉, p < 0.1)을 성취시키는 소정 방법과 샘플 크기로 측정할 때, 참조 양에서 적어도 5%까지의 감소를 의미한다.
본원에 사용된, 용어 "증가시키다"는 통계학적 중요성을 성취시키는 소정 방법과 샘플 크기로 측정할 때, 참조 양에서 적어도 5%까지의 증가를 의미한다.
본원에 사용된, 변수에 관한 수치 범위의 열거는 본 발명이 그러한 범위내의 값들 중 임의 값과 동일한 변수로 실행될 수 있다는 것을 전달하기 위한 의도이다. 따라서, 태생적으로 불연속적인(discrete) 변수의 경우, 해당 변수는, 당해 수치 범위의 종결점을 포함하여, 상기 수치 범위 내의 임의의 정수값과 동일한 값일 수 있다. 유사하게, 태생적으로 연속적인 변수의 경우, 해당 변수는 당해 수치 범위의 종결점을 포함하여, 상기 수치 범위 내의 임의의 실수값과 동일한 값일 수 있다. 일예로, 비제한적으로, 0과 2 사이의 값을 갖는 것으로 기재된 변수는 당해 변수가 태생적으로 불연속적이면 0, 1 또는 2의 값을 가질 수 있고, 당해 변수가 태생적으로 연속적이면 0.0, 0.1, 0.01, 0.001, . . . , 0.9, 0.99, 0.999, 또는 0 이상(≥ 0) 2 이하(≤ 2)의 임의의 다른 실수값을 가질 수 있다.
달리 특별하게 지적하지 않는한, 본원에 사용된, 단어 "또는"은 "및/또는"의 포괄적인 의미로 사용되며 "어느 하나/또는"의 배제적인 의미로 사용되지 않는다.
3. iRNA 작용제의 양쪽성 컨주게이트를 포함하는 미쎌
미쎌은 콜로이드 용액으로 지칭되는 것을 형성하는 수성 매질에 분산된 양쪽성 분자의 회합체(aggregates)이다. 혼합 미쎌은 한 가지 이상의 양쪽성 분자 유형을 포함하는 미쎌이다. 흔히, 미쎌은 지방산(예를 들어, 소디움 스테아레이트) 및 인지질(예를 들어, 포스파티딜 에탄올아민)로부터 형성된다. 수성 용액에서, 미쎌은 주위를 에워싼 용매와 접촉하여 외부 표면에 친수성 "헤드(head)" 지역, 및 용매로부터 고립된, 미쎌 내부에 묻힌 소수성 "테일(tail)" 지역을 형성한다. 미쎌은 일반적으로 구체 형상이나, 이들은 유체이기 때문에, 수력학적 힘을 겪게 될 때 변형될 수 있다. 또한 다른 형상, 예컨대, 타원 및 실린더 형상이 가능한데, 구성 분자(들)의 분자 기하구조(geometry) 및 양쪽성 분자 농도(들), 온도, pH, 및 이온 강도와 같은 조건에 좌우된다.
본 발명은, 부분적으로, 양쪽성 컨주게이트의 일부로서 iRNA 모이어티를 포함하는 혼합 미쎌이 형성될 수 있다는 인식에 의존하며, 상기 미쎌을 형성하는 다른 양쪽성 분자는 친수성 층을 형성하는 방사상으로 뻗어있는 친수성 모이어티를 가지며, 그리하여 상기 iRNA 모이어티는 상기 친수성 층 내부에서 적어도 이들의 표면의 일부분과 함께 상기 혼합 미쎌내에 자리한다. 상기 친수성 층 내부의 상기 iRNA 모이어티의 이러한 위치(positioning)는 상기 iRNA 모이어티를 다른 분자로부터 차폐하며, 그리하여 상기 미쎌의 국소 미세환경내의 뉴클레아제에 의한 iRNA 모이어티의 변성을 감소시킨다.
iRNA 모이어티가 친수성 층 내부, 또는 상기 친수성 층 내부에 적어도 부분적으로 위치되도록 하기 위해, 상기 미쎌-형성 양쪽성 분자의 상기 친수성 모이어티 또는 헤드 지역은 상기 iRNA 모이어티를 적어도 부분저으로 에워싸거나 마스킹할 수 있는 친수성 층을 형성하기에 충분한 거리로 바깥쪽으로 방사상으로 뻗어나가야 한다. 따라서, 친수성 모이어티로서 카르복실 기만 지니는, 단순한, 비변형된 지방산(예를 들어, 스테아르산, 팔미트산)은 본 발명에서 유용하지 않다. 유사하게, 작은 친수성 모이어티를 지니는, 가장 단순한, 비변형된 인지질(예를 들어, 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티딜 세린(PS))은 본 발명에서 유용하지 않다. 오히려, 유용한 미쎌-형성 양쪽성 분자는 상기 혼합 미쎌의 중심부로부터 방사상으로 뻗어 나간 적어도 하나의 친수성 쇄를 포함한다. 이러한 친수성 쇄는 친수성 층을 형성하기 위해 그들 스스로 방사상으로 정렬할 수 있다.
친수성 쇄의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만 하기한 것들을 포함하는, 친수성 폴리머를 포함한다: 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 폴리옥사졸린, 폴리몰포린, 키토산, 및 수용성 펩티드. 이러한 친수성 폴리머는 다양한 길이일 수 있고, 반복되는 폴리머 단위의 개수로 결정될 수 있으며, 반복 단위의 개수(예를 들어, 44개의 에틸렌 글리콜 단위를 지니는 PEG), 그램/몰(grams/mole)의 분자량(예를 들어, 2000 그램/몰의 분자량을 갖는 PEG), 또는 분자 백본의 길이(예를 들어, 200 Å의 분자 백본을 갖는 PEG)로 기재될 수 있다.
당업계에 공지된 표준 화학을 사용하여, 작은 헤드 지역을 지니는 미쎌-형성 분자가 본 발명에 유용한 미쎌-형성 양쪽성 분자를 생성시키기 위해 친수성 쇄의 부가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 지방산 또는 인지질의 헤드 지역은 친수성 쇄와의 에스터화 또는 다른 공유결합 반응에 의해 공유결합적으로 변형될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 친수성 쇄, 예컨대, PEG는 스테아릴-PEG와 같은 양쪽성 분자를 형성하기 위해 스테아르산과 같은 지방산과, 또는 PE-PEG와 같은 양쪽성 분자를 형성하기 위해 PE와 같은 인지질과 함께 에스테르를 형성할 수 있다.
위에서 강조한 것과 같이, 본 발명에 유용하게 사용되기 위해, 상기 친수성 쇄는 상기 iRNA 모이어티를 적어도 부분적으로 에워싸거나 마스킹하는데 충분한 거리로 바깥쪽으로 방사상으로 뻗어나가야 한다. 그러므로, 상기 친수성 쇄의 요구되거나 요망되는 길이는 상기 iRNA 작용제의 크기의 함수이다. 따라서, iRNA 작용제가 미쎌 중심부로부터 아주 먼 거리로 바깥쪽으로 방사상으로 뻗어 나가면, 아주 먼 거리로 바깥쪽으로 뻗어 나가는 친수성 쇄를 지닌 미쎌-형성 양쪽성 분자를 사용하여 혼합 미쎌을 형성시키는 것이 요망될 수 있다.
이중-가닥의, 21-23 bp iRNA 모이어티를 포함하는, siRNA 및 마이크로-RNA 둘 모두의 경우, (리보포스페이트 백본을 따라 측정된) 분자 백본 길이는 대략 192-210 Å(즉, 뉴클레오티드 당 9.15 Å × 21-23개 뉴클레오티드)이다. 그러한 iRNA 모이어티는 이의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나에 의해 소수성 모이어티에 컨주게이션되면, 상기 iRNA 모이어티의 반대쪽 말단은 대략 192-210 Å까지 상기 혼합 미쎌의 소수성 코어로부터 바깥쪽으로 방사상으로 돌출될 것으로 기대될 수 있다. 상기 iRNA 모이어티가 임의 길이의 링커에 의해 상기 iRNA 컨주게이트이 소수성 모이어티에 부착되면, 상기 iRNA 모이어티는 상기 혼합 미쎌의 소수성 코어로부터 훨씬 더 멀리 돌출될 수 있다. 그러므로, siRNA 또는 마이크로-RNA 모이어티인 iRNA 모이어티의 경우, 상기 친수성 층은, 모든 측면상의 iRNA 모이어티를 에워싸거나 마스킹하기 위해, 최소한, 분자 백본 길이가 대략 192-210 Å이어야 한다. 링커가 상기 iRNA 모이어티를 훨씬 더 멀리 돌출되게 하면, 상응하여(commensurately) 더 긴 친수성 쇄가 사용되어야 한다. 그러나, RNA 작용제는 엑소뉴클레아제에 의해 이들의 말단으로부터 절단을 겪기 때문에, 상기 친수성 층이 더 멀리 뻗어 나가서, 그리하여 상기 친수성 쇄의 말단이 상기 iRNA 모이어티를 넘어서 뻗어 나가고, 상기 iRNA 모이어티의 말단은 상기 친수성 층의 내부에 완전히 마스킹되거나 묻히게 된다. 따라서, 예를 들어, 200-2,000 Å의 분자 백본 길이를 갖는 친수성 쇄가 본 발명에서 사용될 수 있다. 반면, 상기 iRNA 모이어티가 이의 유효 길이를 단축시키는 꼬인 배열을 취하는 경우, 부분적으로 에어쌓인 상기 iRNA 모이어티가 뉴클레아제에 의한 절단을 감소시키는데 충분한 경우, 또는 단지 뉴클레아제에 대한 부분적인 보호가 요구되는 경우, 더 짧은 친수성 쇄가 사용될 수 있다(예를 들어, 50-200 Å).
전형적으로 단일-가닥의, 13-30개 뉴클레오티드 iRNA 모이어티를 포함하는, 안티센스 RNA의 경우, (리보포스페이트 백본을 따라 측정한) 분자 백본 길이는 대략 119-275 Å(즉, 뉴클레오티드 당 9.15 Å × 13-30개 뉴클레오티드)이다. 그러므로, 안티센스 RNA 모이어티인 iRNA 모이어티의 경우, 특정 안티센스 RNA의 길이에 의존하여, 상기 친수성 층은 모든 측면상의 iRNA 모이어티를 에워싸거나 마스킹하기 위해, 최소한, 분자 백본 길이가 대략 119-275 Å이어야 한다. 앞에서와 같이, iRNA 컨주게이트의 iRNA 모이어티와 소수성 모이어티 사이의 링커의 존재는 친수성 층내에 더 긴 쇄를 필요로 할 수 있고, 위에서 설명한 이유로 더 긴 쇄(예를 들어, 300-2,000 Å) 또는 더 짧은 쇄(예를 들어, 50-200 Å)가 요망될 수 있다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은 (1) (a) 각각의 컨주게이트가 친수성 모이어티와 소수성 모이어티를 포함하는, 복수의 양쪽성 iRNA 컨주게이트로서, 상기 친수성 모이어티 각각이 상기 iRNA 작용제의 iRNA 모이어티를 포함하는, 복수의 양쪽성 iRNA 컨주게이트; (b) 각각의 양쪽성 분자가 친수성 모이어티 및 소수성 모이어티를 포함하는, 복수의 미쎌-형성 양쪽성 분자로서, 상기 친수성 모이어티 각각이 상기 혼합 미쎌의 중심으로부터 방사상으로 신장되는 하나 이상의 친수성 쇄를 포함하는, 복수의 미쎌-형성 양쪽성 분자;를 포함하는 혼합 미쎌; 및 (2) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 iRNA 작용제의 약제학적 제형을 제공한다.
상기 약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄는 상기 혼합 미쎌의 중심으로부터 방사상으로 뻗어 나간 친수성 층을 형성하고; 상기 양쪽성 iRNA 컨주게이트는 상기 혼합 미쎌내에 자리하여 상기 iRNA 모이어티의 표면의 적어도 일부분은 친수성 층 내부에 존재한다.
상기 약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 iRNA 모이어티의 표면의 어느 부분도 상기 친수성 층을 벗어나 바깥쪽으로 방사상으로 뻗어 나가지 않는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 약제학적 제형들 중 하나로 상기 iRNA 작용제를 제형화시키고, 상기 약제학적 제형을 투여함으로써, 그리하여 세포내 표적에 상기 iRNA 작용제의 전달이 약제학적으로 허용되는 담체중의 상기 iRNA 작용제의 전달에 비해 증가되는 세포내 표적으로 iRNA 작용제의 전달을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포내 표적으로 전달된 iRNA의 평균양은 10% 이상 증가되며, 일부 구체예들에서, 10% 내지 50% 증가되고, 일부 구체예들에서, 50% 내지 100% 증가되며, 일부 구체예들에서, 2배(x) 초과하여 증가된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 약제학적 제형들 중 하나로 상기 iRNA 작용제를 제형화시키고, 상기 약제학적 제형을 세포외로 투여함으로써, 그리하여 상기 약제학적 제형내의 상기 iRNA 작용제의 세포외 뉴클레아제 변성이 약제학적으로 허용되는 담체중의 상기 iRNA 작용제의 변성에 비해 감소되는, iRNA 작용제의 세포외 뉴클레아제 변성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 투여 1시간 이내에 뉴클레아제에 의해 변성되는 iRNA의 양은 10% 이상 감소되고, 일부 구체예들에서, 10% 내지 50% 감소되고, 일부 구체예들에서, 50% 내지 100% 감소되며, 일부 구체예들에서, 2배(x) 초과하여 감소된다.
4. 소수성 및 친수성 모이어티
폭넓게 다양한 단량체들이 본 발명에 사용하기 위한 폴리머 소수성 코어를 비롯한 폴리머 친수성 쇄를 구축하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Torchilin (2007), "Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives," Pharm Res. 24(1):1-16.
예를 들어, 이로만 국함됨이 없이, 프로필렌 옥사이드, 아스파르트산, β-벤조일-L-아스파테이트, γ-벤질-L-글루타메이트, 카프로락톤, D,L-락트산, 스퍼민(spermine), 및 다른 많은 것들이 표준 화학을 사용하여 소수성 모이어티를 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 단량체들 중 일부는 미쎌의 소수성 코어를 생산하는데 사용될 수 있는 소수성 폴리머 블록을 형성하며, 한편 다른 화합물(예를 들어, 리신, 스퍼민)은 소수성 정전기성 복합체를 형성하기 위해 반대로 하전된 소수성 물질에 결합할 수 있는 친수성 폴리머 블록을 형성하며, 상기 복합체는 미쎌의 코어를 형성할 수 있다. 폴리(오르쏘 에스테르) 및 PEG의 블록 공중합체는 약 10-4 g/ℓ의 CMC를 지니는 40-70 nm 미쎌을 형성하고 동결건조될 수 있다. 소수성 코어를 형성하는 마지막 성분과 함께, 모노메톡시-PEG, 폴리(2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트) 및 폴리(2-(디에틸아미노)에틸 메타크릴레이트)로 구성된 미쎌 형성 ABC-타입 트리블록 공중합체가 또한 사용될 수 있고 상기 코어내로 통합될 수 있는 용해도가 적은 화합물의 느린 방출을 가능케 할 수 있다. 폴리락톤-PEG 이중 및 삼중 블록 공중합체가 미쎌-형성 폴리머로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 20 nm 미쎌을 형성하는, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린-블록-폴리(엡실론-카프로락톤)이 사용될 수 있다. 소수성 기, 예컨대, 팔미토일이 이식된 키토산이 또한 약제학적 미쎌을 제조하는데 사용될 수 있고, 고도로 생체적합하다. 약제학적 미쎌을 제조하기 위해 사용될 수 있는 다른 물질은 PEG와 거대분자의 공중합체, 예컨대, 전갈형(scorpion-like) 폴리머 및 몇몇 별형(star-like) 및 코어-쉘(core-shell) 작제물을 포함한다. 인지질 잔기들은 또한 소수성 코어-형성 모이어티로서 성공적으로 사용될 수 있다.
친수성 폴리머 쇄(예를 들어, PEG)가 캡핑(capping)된 소수성 블록으로써 지질 모이어티의 사용은 관용적인 양친매성 폴리머 미쎌과 비요할 때 입자 안정성에 추가적인 이점을 제공할 수 있는데, 이는 미셀의 코어내 폴리머 쇄들 간의 소수성 상호작용의 증가에 상당히 기여할 수 있는, 2개의 극도로 소수성인 지방산 아실의 존재때문이다. 수용성 폴리머와 지질의 다양한 컨주게이트는 시중에서 구매가능하거나, 용이하게 합성될 수 있다. 디아실-지질-PEG 컨주게이트는 리포좀용 폴리머 표면-개질제(surface-modifiers)로서 조절된 약물 전달 분야에 도입되었다. 그러나, 상기 디아실-지질-PEG 분자 그 자체는 벌크한(bulky) 친수성(PEG) 부분과 매우 짧으나 매우 소수성인 디아실-지질 모이어티를 지니는 특징적인 양친매성 폴리머를 대표한다. 다른 PEG-함유 양친매성 블록-공중합체와 유사하게, 디아실-지질-PEG 컨주게이트는 수성 환경에서 미쎌을 형성한다. 일련의 PEG-포스파티딜에탄올아민(PEG-PE) 컨주게이트는 PE와 메톡시-EG 석시네이트의 히드록시석신이미드 에스테르(분자량 2 kDa, 5 kDa 및 2 kDa)를 사용하여 합성되었다. 모든 버전의 PEG-PE 컨주게이트는 7 내지 35 nm 크기의 미쎌을 형성한다. 개별 폴리머 쇄로의 분리(dissociation)가 대략 1 μg/ml의 폴리머 농도까지 연속적으로 희석된 PEG(5 kDa)-PE 샘플에 대한 크로마토그래피 후 발견되지 않았는데, 이는 마이크로몰 CMC 값에 부합하며, 이 값은 관용적인 계면활성제의 값보다 100배 이상 더 낮은 값이다. PEG 블록의 크기가 15 kDa을 초과하는 경우, PEG-PE 미쎌의 안정성은 감소하기 시작한다. 세제 또는 수-혼화성(water-miscible) 용매 제거 방법에 의한 지질-기반 미쎌의 제조는 매우 유사한 직경을 지닌 입자의 형성을 야기시킨다. 일반적으로, 그러한 미쎌은 구형 형상과 균일한 크기 분포를 지닌다. 또 다른 중요한 이슈는 PEG2000-PE 및 PEG5000-PE 미쎌이 혈장 중에서 48시간의 인큐베이션후에도 미쎌의 특징적인 크기를 유지한다는 것인데, 즉, PEG-PE 미쎌의 통합성이 비경구적 투여시 생물학적 유체의 성분들에 의해 즉각적으로 영향받아서는 아니된다는 것이다.
1,500 내지 8,000 Da 사이의 PVP 블록 크기는 지니는 양친매성 PVP-지질 컨주게이트가 또한 제조되었으며, 이 컨주게이트는 수성 환경에서 용이하게 미쎌을 형성한다. 형성된 미쎌의 CMC 값 및 크기는 PVP 블록의 길이에 좌우되며, 각각, 10-4 내지 10-6 M 및 5 내지 20 nm에서 달라진다. 유사한 지질화된 폴리머(올레산으로 치환된 폴리비닐 알코올)로부터 제조된 미쎌이 또한 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 양쪽성 미쎌-형성 분자는 PEG-PE 공중합체이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 에틸렌 옥사이드의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 포스파티딜 에탄올아민(PE)은 흔히 미생물 막의 주요 지질 성분이 된다. PE는 중성 또는 양쪽이온성(Zwitterionic) 인지질(적어도 pH 2 내지 7의 범위에서)이다. 동물 조직에서, 포스파티딜 에탄올아민은 디아실, 알킬아실 및 알켄일아실 형태로 존재하는 경향이 있다. 일반적으로, 동물 포스파티딜 에탄올아민은 다른 양쪽이온성 인지질, 포스파티딜 콜린보다 더 높은 비율의 아라키돈산 및 도코사헥산산을 함유하는 경향이 있다. 이러한 폴리불포화 성분들은 위치 sn-1에 가장 풍부한 포화 지방산으로 위치 sn-2에 집중된다.
위에서 강조한 것과 같이, 상기 약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄는 상기 혼합 미쎌의 중심으로부터 방사상으로 뻗어 나가는 친수성 층을 형성하고; 상기 양쪽성 iRNA 컨주게이트는 상기 혼합 미쎌내에 위치하여 상기 iRNA 모이어티의 표면의 적어도 일부가 상기 친수성 층 내부에 존재한다. 다른 구체예들에서, 상기 iRNA 모이어티의 표면의 일부분은 상기 친수성 층을 넘어서 바깥쪽으로 방사상으로 뻗어 나간다.
상기 약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄는 200 내지 500 Å 사이의 평균 백본 길이를 갖는다. 다른 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄는 100 내지 1,000 Å, 및 50 내지 2,000 Å의 평균 백본 길이를 갖는다.
상기 약제학적 제형의 일부 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄는 1,500 내지 5,000의 평균 분자량을 갖는다. 다른 구체예들에서, 상기 복수의 친수성 쇄는 500 내지 15,000, 및 1,000 내지 10,000의 평균 분자량을 갖는다.
앞서 언급한 것들 중 임의 것의 일부 구체예들에서, 상기 미쎌-형성 양쪽성 분자의 소수성 모이어티는 장쇄 지방산, 인지질, 지질, 및 당지질의 라디칼들로부터 선택된다.
앞서 언급한 것들 중 임의 것의 일부 구체예들에서, 상기 양쪽성 iRNA 컨주게이트의 소수성 모이어티는 콜레스테롤, 장쇄 지방산, 지질, 인지질, 및 당지질의 라디칼들로부터 선택된다.
앞의 구체예들 중 일부에서, 상기 지방산은 부탄산, 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 테트라데칸산, 헥사데칸산, 옥타데칸산, 에이코산산, 도코산산, 테트라코산산 및 이의 불포화된 동질체 중에서 선택된다.
앞의 구체예들 중 일부에서, 상기 인지질은 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜 이노시톨(PI), 포스파티딜 세린(PS), 포스파티드산(PA), 및 스핑고미엘린으로부터 선택된다.
앞의 구체예들 중 일부에서, 상기 당지질은 갈락토지질, 설포지질, 세레브로시드, 및 강글리오시드 중에서 선택된다.
앞서 언급한 것들 중 임의 것의 일부 구체예들에서, 상기 미쎌-형성 양쪽성 분자의 친수성 모이어티는 PEG, PEI, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 폴리옥사졸린, 폴리몰포린, 키토산, 및 수용성 펩티드의 라디칼들로부터 선택된다.
앞서 기술한 구체예들 중 일부 구체예들에서, 상기 친수성 모이어티는 1,500 내지 5,000 g/mole의 평균 분자량을 지니는 PEG 라디칼이다. 다른 구체예들에서, 상기 PEG 라디칼은 500 내지 15,000 g/mole, 및 1,000 내지 10,000 g/mole의 평균 분자량을 지닌다.
일부 구체예들에서, 상기 siRNA는 친유성(lipophilic) 모이어티, 예컨대, 콜레스테롤, 또 다른 지질 또는 인지질에 컨주게이션된다.
일부 바람직한 구체예들에서, 상기 전달 시스템은 PEG-PE 및 siRNA-지질 컨주게이트를 포함하는 혼합 미쎌이다.
5. 이중-가닥 iRNA 작용제 및 모이어티
siRNA 및 마이크로-RNA를 포함하는, 이중-가닥 RNA(dsRNA)는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 과정을 통해 mRNA의 서열-특이적 침묵을 유도한다. 상기 과정은, 포유동물 및 기타 척추동물을 포함한, 폭넓게 다양한 개체들에서 일어난다.
dsRNA의 21-23 nt 단편들이, 예를 들어, RNA 변성을 초래함으로써, RNA 침묵의 서열-특이적 매개자임이 입증되었다. 이론으로 국한시키려는 의도는 없으나, 이러한 21 -23 nt 단편들내에 존재하는, 단순히 특정 길이의 상기 단편일 수 있는, 분자 신호가 RNAi를 매개하는 세포 인자들을 모집할 수 있다.
표적 가닥과의 상보성, 또는 상동성의 정도는 안티센스 가닥에서 가장 중요하다. 완벽한 상보성이 종종 요망되지만, 특히 안티센스 가닥에서 요망되나, 일부 구체예들은, 특히 안티센스 가닥내에, (표적 RNA와 관련하여) 하나 이상, 바람직하게는 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 더 적은 미스매치를 포함할 수 있다. 이 미스매치, 특히 안티센스 가닥내의 미스매치는 말단 영역내에서 가장 용인되며 존재하는 경우 바람직하게는 말단 영역 또는 영역들, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 말단의 6개, 5개, 4개, 또는 3개 뉴클레오티드 내부에 존재한다. 센스 가닥은 단지 분자의 전반적인 이중 가닥 특성을 유지하기 위해 안티센스 가닥과 충분히 상보적일 필요가 있다.
본원의 도처에 논의된 것과 같이, iRNA 작용제는 종종 변형될 것이다. iRNA 작용제의 단일 가닥 영역은 종종 변형되거나 뉴클레오시드 대체물질를 포함할 것인데, 예를 들어, 헤어핀 구조의 쌍을 이루지 않은 영역 또는 영역들, 예를 들어, 2개의 상보적인 영영들을 연결시키는 영역은 변형 또는 뉴클레오시드 대체물질를 지닐 수 있다. 예를 들어, 엑소클레아제에 대하여, iRNA 작용제의 하나 이상의 3'- 또는 5'-말단을 안정화시키거나 안티센스 RNA 작용제의 RISC로의 진입을 우호적이게 하기 위한 변형이 또한 선호된다. 변형은 C3(또는 C6, C7, C12) 아미노 링커, 티올 링커, 카르복실 링커, 비-뉴클에오티드성 스페이서(C3, C6, C9, C12, 무염기성(abasic), 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜), 특정 비오틴 또는 포스포라미다이트(phosphoramidites)로서 오며 또 다른 DMT로 보호된 히드록실 기를 지니는 플루오레신 시약을 포함할 수 있다. RNA 합성이 진행되는 동안 다수의 커플링을 가능케 한다.
예시적인 변형은 하기를 포함한다:
(a) 백본 변형, 예를 들어, P의 S로 대체, 또는 알킬 또는 알일(예를 들어, Me)로 치환된 P, 및 디티오에이트(S-P=S)를 포함하는, 백본 P의 변형; 이러한 변형은 뉴클레아제 내성을 촉진시키는데 사용될 수 있다;
(b) 2'-0 알킬, 예를 들어, 2'-0Me, 3'-O 알킬, 예를 들어, 3'-0Me(말단 및/또는 내부 위치에서); 이러한 변형은 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 결합을 향상시키는데 사용될 수 있으며, 3' 변형은 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피시키기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 사용될 수 있다;
(c) 2'-5' 연결(2'-H, 2'-OH 및 2'-0Me로 및 P=O 또는 P=S로); 이러한 변형은 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 결합을 억제시키는데 사용될 수 있거나, RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피시키기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 사용될 수 있다;
(d) L 당(예를 들어, 2'-H, 2'-OH 및 2'-0Me를 지니는 L-리보오스, L-아라비노스); 이러한 변형은 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 결합을 억제시키는데 사용될 수 있거나, RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피시키기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 사용될 수 있다;
(e) 변형된 당(예를 들어, 잠긴 핵산(locked nucleic acids, LNA's), 헥소오스 핵산(hexose nucleic acids, HNA's) 및 시클로헥센 핵산(cyclohexene nucleic acids, CeNA's)); 이러한 변형은 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 결합을 억제시키는데 사용될 수 있거나, RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피시키기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 사용될 수 있다;
(f) 뉴클레오염기 변형(예를 들어, C-5 변형된 피리미딘, N-2 변형된 퓨린, N-7 변형된 퓨린, N-6 변형된 퓨린), 이러한 변형은 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 결합을 향상시키는데 사용될 수 있다;
(g) 양이온성 기 및 양쪽성이온성 기(바람직하게는 말단에서), 이러한 변형은 뉴클레아제 내성을 촉진시키는데 사용될 수 있다;
(h) 컨주게이트 기(바람직하게는 말단 위치에서), 예를 들어, 나프록센, 비오틴, 콜레스테롤, 이부프로펜, 폴산, 펩티드, 및 카보하이드레이트; 이러한 변형은 뉴클레아제 내성을 촉진시키거나 분자를 표적으로 삼도록 하기 위해 사용될 수 있거나, RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피시키기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 사용될 수 있다.
다수의 비대칭 변형이 센스 및 안티센스 서열 중 어느 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있다. 서열은 적어도 2개, 4개, 6개, 8개, 또는 그 이상의 변형을 지닐 수 있으며 서열의 단량체의 전부 또는 실질적으로 전부가 변형될 수 있다.
6. 리간드-컨주게이트, 캐리어 및 표적화
특정 세포 유형에 본 발명의 약제학적 조성물을 표적화하기 위해, 약제학적 조성물의 반감기를 증가시키기 위해(예를 들어, 전신 순환에서, 또는 림프계 공간내에서), 약제학적 조성물의 생체이용성을 증가시키기 위해, 및/또는 약제학적 조성물의 세포-투과/섭취를 증가시키기 위해, 약제학적 조성물은 (a) iRNA 작용제에 결합되고/거나, (b) 별개의 소수성 모이어티 또는 양쪽성 모이어티에 결합되고 혼합 미쎌내에 포함되고/거나, (c) 친수성 층의 친수성 쇄에 결합된 리간드, 담체 또는 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예들에서, 상기 리간드, 담체 또는 표적화 모이어티는 상기 친수성 층의 친수성 쇄에 결합되고, 바람직하게는 친수성 쇄의 말단에 결합되고, 그리하여 용매 또는 세포외 미세환경에 노출되고, 접근가능하다. 예를 들어, 친수성 쇄의 먼 쪽의 끝부분(distal tips)은 이로만 국한되는 것은 아니지만, PEG와 다른 가용성 블록-형성 폴리머와 함께 사용될 수 있는 p-니트로페닐(pNP) 카르보닐 기를 포함하는 다양한 공지의 화학에 의해 활성화될 수 있다.
따라서, iRNA 작용제, 양쪽성 모이어티 및/또는 친수성 쇄는 리간드-컨주게이션된 단량체 소단위체를 함유하거나 비함유할 수 있다. 담체(일부 구체예들에서 "링커"로 지칭됨)는 고리 또는 비고리 모이어티이 수 있으며 2개의 "백본 부착 지점"(예를 들어, 히드록실 기) 및 리간드를 포함한다. 리간드는 직접적으로 담체에 부착(예를 들어, 컨주게이션)될 수 있거나 개입 테더(intervening tether)(예를 들어, 하나 이상의 원자들의 비고리 쇄; 또는 뉴클레오염기, 예를 들어, 하나 이상의 화학적 변형(예를 들어, 특이 염기)을 지니거나 지니지 않는 자연적으로 생성되는 뉴클레오염기; 또는 범용 염기)에 의해 담체에 간접적으로 부착(예를 들어, 컨주게이션)될 수 있다. 한 구체예에서, 담체는 히드록시프롤린올이다.
iRNA 작용제에 결합될 때, 리간드-컨주게이션된 소단위체는 iRNA 분자의 5' 또는 3' 말단 소단위체일 수 있다. 대안적으로, 상기 리간드-컨주게이션된 단량체 소단위체는 내부 위치를 점유할 수 있다. 하나 이상의 리간드-컨주게이션된 단량체 소단위체는 iRNA 작용제내에 존재할 수 있다. 속박된 리간드-컨주게이션된 단량체 소단위체(예를 들어, 친유성 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤이 상기 담체에 속박된 소단위체)의 통합을 위한 바람직한 위치는 센스 가닥의 3' 말단, 5' 말단, 또는 내부 위치에 존재한다.
일부 구체예들에서, 리간드는 통합되는 iRNA 작용제의 분포, 표적화 또는 생존시간(lifetime)을 변형시킨다. 일부 구체예들에서, 리간드는, 예를 들어, 이와 같은 리간드가 결여된 종과 비교하여, 선별된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어, 신체의 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 지역에 대한 향상된 친화력을 제공한다.
리간드는 운송, 혼성화, 및 특이성 특성(specificity properties)을 개선시킬 수 있고, 또한 결과적으로 얻은 천연 또는 변형된 올리고리보뉴클레오티드, 또는 본원에 기재된 단량체 및/또는 천연 또는 변형된 리보뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함하는 폴리머 분자의 뉴클레아제 내성을 개선시킬 수 있다.
리간드는 일반적으로, 예를 들어, 유입(uptake) 향상을 위한, 치료학적 개질자; 예를 들어, 분포 모니터링을 위한, 진단 화합물 또는 리포터 기; 교차-연결 작용제; 뉴클레아제-내성 부여 모이어티; 및 천연 또는 특이 뉴클레오염기를 포함할 수 있다. 일반적인 예는 친유기(lipophiles), 지질, 스테로이드(예를 들어, 우바올(uvaol, 헤시제닌(hecigenin), 디오스제닌(diosgenin)), 테르펜(terpenes)(예를 들어, 트리테르펜, 예를 들어, 사르사사포제닌(sarsasapogenin), 프리에델린(Friedelin), 에피프리에델라놀(epifriedelanol) 유도체화된 리토콜산), 비타민(예를 들어, 폴산, 비타민 A, 비오틴, 피리독살), 탄수화물, 단백질, 단백질 결합 작용제, 인테그린 표적화 분자, 폴리양이온(poly양이온성s), 펩티드, 폴리아민, 및 펩티드 모방체를 포함한다.
리간드는 자연적으로 생성된 물질, (예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도지질단백질(LDL), 또는 글로빈); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란(pullulan), 키틴, 키토산, 이눌린(inulin), 시클로덱스트린 또는 히알루론산); 아미노산, 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 재조합 또는 합성 분자, 예컨대, 합성 폴리머, 예를 들어, 하성 폴리아미노산을 포함할 수 있다. 그러한 폴리머의 일예는 폴리아미노산, 예컨대, 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 및 스티렌-말레산 안하이드라이드 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레익 안하이드라이드 공중합체, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 폴리머, 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 일예는 하기를 포함한다: 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 모이어티, 예를 들어, 양이온성 지질, 양이온성 포피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 나선 펩티드.
리간드는 또한 표적화 기, 예를 들어, 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는, 세포 또는 조직 표적화 작용제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 항체를 포함할 수 있다. 표적화 기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 당쇄부가된(glycosylated) 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다.
리간드의 다른 일예는 염료, 삽입성(intercalating) 작용제(예를 들어, 아크리딘), 교차-링커(예를 들어, 프소라렌(psoralene), 마이토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 삽피린(sapphyrin)), 폴리시클릭 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 글리세롤(예를 들어, 에스테르 및 이의 에테르, 예를 들어, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬; 예를 들어, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 1,3-비스-O(옥타데실)글리세롤), 제리닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 컨주게이트(예를 들어, 안테나페디아(antennapedia) 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화 작용제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사능표지된 마커, 효소, 햅텐(예를 들어, 비오틴), 운송/흡수 촉진제(facilitators)(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 폴산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 컨주게이트, 테트라-아자마크로시클(azamacrocycles)의 Eu3+ 복합체, 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
예를 들어, 염료는 본 발명의 약제학적 제형에 컨주게이션되어 이미지화 작용제로서 역할할 수 있다. 그러한 이미지화 작용제는 표적화된 세포에 의해 본 발명의 iRNA 작용제의 유입을 검출하는데, 본 발명의 약제학적 제형의 약동학을 연구하는데 유용하다. 그러한 이미지화 작용제는, 예를 들어, 친수성 층의 친수성 쇄에 킬레이트화 기를 컨주게이션시킴으로써, 감마 또는 NMR 이미지화용 킬레이트화 기에 중금속(예를 들어, 111In, 99Tc, Gd, Mn, Fe)을 킬레이트화시킴으로써 생산될 수 있다. 본원에서 강조된 대로, 형광 염료(예를 들어, Cy3)는 또한 약제학적 제형에 컨주게이션될 수 있다. 따라서, 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 혼합 미쎌의 유입, 위치화(localization), 및/또는 약동학을 검출 또는 이미지화하기 위한 방법 및 생산물을 제공한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩티드, 예를 들어, 코-리간드, 또는 항체, 예를 들어, 암 세포, 내피 세포, 또는 골 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는, 항체에 대한 특이적인 친화력을 지니는 분자일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬과 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 비-펩티드성 종, 예컨대, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자(cofactors), 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 또는 다가 푸코오스를 포함할 수 있다. 리간드는, 예를 들어, 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나아제의 활성인자, NF-κB의 활성인자를 포함할 수 있다.
리간드는, 예를 들어, 세포의 세포골격을 붕괴시킴으로써, 예를 들어, 세포의 미세소관, 미세필라민트, 및/또는 중간 필라민트를 붕괴시킴으로써, 예를 들어, 세포내로의 iRNA 작용제의 섭취를 증가시킬 수 있는 물질(예를 들어, 약물)일 수 있다. 상기 약물은, 예를 들어, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드(japlakinolide), 팔로이딘, 스윈홀리드 A, 인다노신, 또는 미오서빈(myoservin)일 수 있다.
리간드는, 예를 들어, 염증 반응을 활성화시킴으로써 세포내로 iRNA 작용제의 유입을 증가시킬 수 있다. 그러한 효과를 지닐 수 있는 대표적인 리간드는 종양 괴사 인자 알파(TNFalpha), 인터루킨-1 베타, 또는 감마 인터페론을 포함한다.
일 양상에서, 상기 리간드는 지질 또는 지질-기반 분자이다. 그러한 지질 또는 지질-기반 분자는 바람직하게는 혈청 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합한다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어, 신체의 비신장 표적 조직에 대한 컨주게이트의 분배를 가능케 한다. 예를 들어, 표적 조직은, 간의 간의 유조직(parenchymal) 세포를 포함하는, 간일 수 있다. 또한 HSA에 결합할 수 있는 다른 분자가 리간드로 사용될 수 있다. 예를 들어, 네프록신 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질-기반 리간드는 (a) 컨주게이트의 변성에 대한 내성을 증가시키고/거나, (b) 표적 세포 또는 세포 막내로의 표적화 또는 운송을 증가시키고/거나, (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA에 대한 결합을 조정시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 상기 리간드는 표적 세포(예를 들어, 증식하는 세포)에 의해 받아들여 지는, 모이어티(예를 들어, 비타민)이다. 이들은 특히 악성 또는 비악성 유형, 예를 들어, 암 세포의, 원치않는 세포 증식에 의해 특징지워지는 장애를 치료하는데 유용하다. 대표적인 비타민은 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 다른 대표적인 비타민은, B 비타민, 예를 들어, 폴산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 다른 비타민 또는 암세포에 의해 받아들여 지는 영양물질을 포함한다. 또한 HSA 및 저밀도지질단백질(LDL)이 포함된다.
또 다른 양상에서, 리간드는 세포-침투제 또는 세포-투과제이다. 예를 들어, 문헌[Torchilin (2008), Adv Drug Deliv Rev. 60(4-5):548-58]은 약제학적 나노캐리어의 Tat 펩티드-매개 세포내 전달을 개시하고 있다. 일부 구체예들에서, 상기 작용제는 양쪽성이다. 대표적인 작용제는 TAT, 안테노페디아, 페네트라틴, 또는 아르기닌 올리고머(예를 들어, R8 또는 R9)과 같은 펩티드를 포함한다. 상기 작용제가 펩티드인 경우, 이것은, 펩티딜미메틱 또는 인버토머(invertomer)와 같이, 변형될 수 있거나, 비-펩티드 또는 슈도-펩티드 연결, 또는 D-아미노산의 사용을 포함할 수 있다. 나선 작용제(helical agent)는 알파-나선 작용제일 수 있는데, 일부 구체예들에서, 상기 알파-나선 작용제는 친유성 및 소유성(lipophobic) 상을 지닐 수 있다.
증식하는 세포내에 풍부하게 존재하는 마커를 표적으로 삼는 펩티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, RGD 함유 펩티드 및 펩티도미메틱은 암 세포, 특히, Iv-θ3 인테그린을 나타내는 세포를 표적으로 삼을 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 RGD 펩티드, RGD를 함유하는 고리 펩티드, D-아미노산을 포함하는 RGD 펩티드, 뿐만 아니라, 합성 RGD 모방체를 사용할 수 있다. RGD와 더불어, 통상의 기술자는 Iv-θ3 인테그린 리간드를 표적으로 삼는 다른 모이어티를 사용할 수 있다. 일반적으로, 그러한 리간드는 증식하는 세포 및 혈관생성(angiogenesis)을 조절하는데 사용될 수 있다. 이러한 유형의 컨주게이트는 PECAM-I, VEGF, 또는 암 유전자, 예를 들어, 본원에 기재된 암 유전자를 표적으로 삼는 약제학적 조성물을 포함한다.
당, 예를 들어, 갈락토오스 및/또는 이의 유사체를 포함하는 표적화 작용제가 또한 유용할 수 있다. 이러한 작용제는, 특히, 간의 유조직 세포르 표적으로 삼는다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 각자 서로에 대해 약 15 Å의 간격을 둔, 1개 이상 또는 바람직하게는 2개 또는 3개 갈락토오스 모이어티를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는, 대안적으로, 갈락토오스와 커플링된 글루코오스인, 락토오스(예를 들어, 3개의 락토오스 모이어티)일 수 있다. 표적화 모이어티는 또한 N-아세틸-갈락토사민, N-Ac-글루코사민일 수 있다. 만노오스 또는 만노오스-6-포스페이트 표적화 모이어티는 대식세포 표적화를 위해 사용될 수 있다.
리간드는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 펩티토미메틱(올리고펩티도미메틱으로도 지칭됨)은 천연 펩티드와 유사한 정의된 3차원 구조로 폴딩될 수 있는 분자이다. 본 발명의 약제학적 조성물에 대한 펩티드 및 펩티도미메틱의 부착은 조성물의 약동학적 분배에 영향을 미칠 수 있는데, 예컨대, 세포 인식 및 흡착을 향상시킴으로써 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 또는 펩티도미메틱 모이어티는 약 5 내지 50 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은, 예를 들어, 세포 침투 펩티드, 양이온성 펩티드, 양쪽성 펩티드, 또는 소수성 펩티드(예를 들어, Tyr, Trp 또는 Phe로 주로 이루어짐)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 구속된(constrained) 펩티드 또는 가교된 펩티드일 수 있다.
RGD 펩티드 모이어티는 종양 세포, 예컨대, 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포(Zitzmann et al. (2002), Cancer Res. 62:5139-43)를 표적으로 삼는데 사용될 수 있다. RGD 펩티드는 폐, 신장, 지라, 또는 간을 포함하는 다양한 다른 조직의 종양의 표적화를 촉진할 수 있다(Aoki et al. (2001), Cancer Gene Therapy 8:783-787). 일부 구체예들에서, RGD 펩티드는 선형 또는 고리형일 수 있으며, 변형될 수 있는데, 예를 들어, 특정 조직에 표적화를 촉진시키기 위해 당쇄부가 또는 메틸화될 수 있다. 예를 들어, 당쇄부가된 RGD 펩티드는 αvβ3 를 발현하는 종양 세포에 약제학적 조성물을 전달할 수 있다(Haubner et al. (2001), J. Nucl. Med. 42:326-336).
"세포 침투 펩티드"는 세포, 예컨대, 미생물 세포(예를 들어, 박테리아 또는 진균 세포) 또는 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포)를 침투할 수 있다. 미생물 세포-침투 펩티드는, 예를 들어, α-나선 선형 펩티드(예를 들어, LL-37 또는 세포핀(Ceropin) P1), 이황화결합-함유 펩티드(예를 들어, α-데펜신, β-데펜신 또는 박테네신(bactenecin)), 또는 단지 하나 또는 두개의 우세한 아미노산만 함유하는 펩티드(예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘)일 수 있다. 세포 침투 펩티드는 또한 핵 위치화 신호(nuclear localization signal, NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 침투 펩티드는 이분된(bipartite) 양쪽성 펩티드, 예컨대, HIV-1 gp4 및 SV40 거대 T 항원의 NLS의 융합 펩티드 도메인에서 유래된, MPG일 수 있다(Simeoni et al. (2003), Nucleic Acids Res. 31:2717-2724).
일부 구체예들에서, 리간드는 치환된 아민, 예를 들어, 디메틸아미노일 수 있다. 특정 구체예들에서, 치환된 아민은, 예를 들어, 4급화, 예를 들어, 양성자화 또는 알킬화에 의해, 양이온성이 부여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 치환된 아민은 비교적 소수성 쇄, 예를 들어, 알킬렌 쇄의 말단 위치에 존재할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 리간드는 하기 트리테르펜 중 하나일 수 있다:
Figure pct00001
.
일부 구체예들에서, 리간드는 콜레스테롤 또는 또 다른 지질 또는 인지질이다.
iRNA 작용제는 하기를 포함한다: 인터페론 반응을 촉발시키는데 충분히 긴 분자(리보뉴클레아제 다이서에 의해 절단될 수 있고(Bernstein et al. (2001), Nature 409:363-366) RISC(RNAi-유도 침묵 복합체)를 진입시킬 수 있음); 및, 인터페론 반응을 촉발시키지 못할 정도로 충분히 짧은 분자(분자는 또한 다이서에 의해 절단되고/거나 RISC가 진입될 수 있음), 예를 들어, RISC 내로의 진입을 가능케하는 크기인 분자, 예를 들어, 다이서-절단 생성물과 닮은 분자. 인터페론 반응을 촉발시키지 못할 정도로 충분히 짧은 분자는 본원에서 sRNA 작용제 또는 더 짧은 iRNA 작용제로 지칭된다. 본원에 사용된, "sRNA 작용제 또는 더 짧은 iRNA 작용제"는 iRNA 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNA 작용제 또는 단일 가닥 작용제를 의미하는데, 이것은 충분히 짧아서 인간 세포내에서 해로운 인터페론 반응을 유발하지 아니하며, 예를 들어, 이것은 60개 이하, 바람직하게는, 50개, 40개, 또는 30개 뉴클레오티드 쌍의 이중나선 지역을 지닌다. sRNA 작용제, 또는 이의 절단 생성물은, 표적 유전자, 예를 들어, 표적 RNA, 바람직하게는, 내생성 또는 병원균 표적 RNA에 관하여 RNAi를 유도함으로써, 표적 유전자를 하향 조절시킬 수 있다.
sRNA 작용제의 각 가닥은 30개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 또는 20개 이하의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 가닥은 바람직하게는 19개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 각각의 가닥은 21개 내지 25개 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는 sRNA 작용제는 17개, 18개, 19개, 29개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 뉴클레오티드 쌍의 이중나선 영역, 및 2-3 뉴클레오티드의, 하나 이상의 돌출(overhangs), 바람직하게는 하나 또는 2개의 3' 돌출을 지닌다.
표적 RNA에 대한 상동성 및 표적 유전자를 하향 조절시키는 활성 이외에, iRNA 작용제는 하기 특성들 중 하나 이상을 지닐 수 있다:
(1) 단일 가닥인 경우, iRNA 작용제는 하나 이상의 포스페이트 기 또는 포스페이트 기의 하나 이상의 유사체를 포함하는 5' 변형을 지닐 수 있다;
(2) 심지어 매우 많은 수의 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오시드 전부에 대한, 변형에도 불구하고, iRNA 작용제는, 표적, 예를 들어, 표적 RNA의 절단에 의한, 표적의 하향 조절을 가능케 하는데 충분한 상동성 표적 RNA와의 올바른 염기 찍지음을 형성하고 이중나선 구조를 형성할 수 있도록 하기 위해 적당한 3차원 프레임워크내의 염기(또는 변형된 염기)를 제시할 수 있는 안티센스 가닥을 지닌다;
(3) 심지어 매우 많은 수의 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오시드 전부에 대한, 변형에도 불구하고, iRNA 작용제는, 여전히 "RNA-유사" 특성들을 지니는데, 즉, iRNA 작용제는, 완전히 독점적이지 않거나, 심지어 부분적으로, 리보뉴클레오티드-기반 내용물의, RNA 분자의 전반적인 구조적, 화학적 및 물리적 특성들을 보유할 수 있다. 예를 들어, iRNA 작용제는 뉴클레오티드 당 전부가, 예를 들어, 2' 히드록실 대신 T 플루오로를 함유하는, 센스 및/또는 안티센스 가닥을 함유할 수 있다. 이 데옥시리보뉴클레오티드-함유 작용제는 여전히 RNA-유사 특성들을 나타낼 것으로 기대될 수 있다. 이론으로 국한되는 것은 원치 아니하나, 전기음성 플루오린은 리보오스의 C2' 위치에 부착된 경우 축 방향을 선호한다. 플루오린의 이러한 공간 선호는, 차례로, 당이 Cy-엔도 구김(pucker)을 취하도록 강제한다. 이것은 RNA 분자에서 관찰된 것과 동일한 주름 양상(puckering mode)이고 RNA-특징적 A-패밀리 타입 나선을 야기시킨다. 또한, 플루오린이 우수한 수소 결합 억셉터이기 때문에, 플루오린은 RNA 구조를 안정화시키는 것으로 알려진 물 분자와 동일한 수소 결합 상호작용에 참여할 수 있다. (일반적으로, 2' 당 위치에서 변형된 모이어티가 데옥시리보뉴클레오티드의 H 모이어티 보다 리보뉴클레오티드의 OH 모이어티에 특징적인 H-결합내로 도입될 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 일부 구체예들에서 iRNA 작용제는, 이의 당의 전부, 또는 적어도 50, 75, 80, 85, 90, 또는 95%에서 C3-엔도 주름을 나타내고; RNA-특징적인 A-패밀리-유형 나선을 야기시킬 수 있는 충분한 양의 이의 당으로 Cy-엔도 주름을 나타내고; Cy-엔도 주름 구조가 아닌 20개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 이하의 당을 지닐 수 있다. 이러한 제약은 안티센스 가닥에서 바람질할 수 있다;
(4) 변형의 특성과 관계없이, 그리고 RNA 작용제가, 특히, 돌출 또는 다른 단일 가닥 영역내에, 데옥시뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시뉴클레오티드를 함유할 지라도, DNA 분자, 또는 분자내 뉴클레오티드의 50, 60, 또는 70% 이상, 또는 이중나선 영역내의 뉴클레오티드의 50, 60, 또는 70% 이상이 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 2' 위치에서 데옥시인 변형된 데옥시리보뉴클레오티드인, 임의의 분자는 RNA 작용제의 정의로부터 배제되는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 사용된, "단일 가닥 iRNA 작용제"는 단일 분자를 구성하는 iRNA 작용제이다. 이것은 내부-가닥 짝지음으로 형성된, 이중나선 영역을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 이것은 헤어핀 또는 팬핸들(pan-handle)이거나 이를 포함할 수 있다. 단일 가닥 iRNA 작용제는 바람직하게는 표적 분자와 관련하여 안티센스이다. 바람직한 구체예들에서, 단일 가닥 iRNA 작용제는 5' 인산화되거나 5' 프라임 말단에서 포스포릴 유사체를 포함한다. 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개 유전자 침묵과 양립가능한 변형을 포함한다. 적합한 변형은 하기를 포함한다: 5'-모노포스페이트 ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-di포스페이트 ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트 ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡 (7-메틸화되거나 비메틸화된) (7m-G-0-5'-(H0)(0)P-0-(H0)(0)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp), 및 임의의 변형되거나 비변형된 뉴클레오티드 캡 구조 (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트 (포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트 (포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트 ((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황 대체된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트(예를 들어 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트 등), 5'-포스포르아미데이트 ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트(R=알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-알킬에테르포스포네이트(R=알킬에테르=메톡시메틸 (MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-)의 임의의 추가 조합. (이러한 변형은 또한 이중 가닥 iRNA의 안티센스 가닥으로 사용될 수 있다.)
단일 가닥 iRNA 작용제는 이것이 RISC에 들어가고 표적 mRNA의 RISC 매개 절단에 참여할 수 있게 충분히 길어야만 한다. 단일 가닥 iRNA 작용제는 14개 이상, 더 바람직하게는, 15개, 20개, 25개, 29개, 35개, 40개, 또는 50개 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는 200개, 100개, 또는 60개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
헤어핀 iRNA 작용제는 17개, 18개, 19개, 29개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 이상의 뉴클레오티드 쌍의 이중나선 영역을 지닐 것이다. 이중나선 영역은 바람직하게는 200개, 100개, 또는 50개 이하의 길이일 것이다. 이중나선 영역을 위한 바람직한 길이 범위는 15 내지 30개, 17 내지 23개, 19 내지 23개, 및 19 내지 21개 뉴클레오티드 쌍 길이다. 헤어핀은, 바람직하게는, 헤어핀의 3', 및 바람직하게는 헤어핀의 안티센스 측부(side)에 단일 가닥 돌출 또는 말단 짝지워지 않은 영역을 지닐 것이다. 바람직한 돌출은 2 내지 3개 뉴클레오티드 길이이다.
본원에 사용된, "이중 가닥(ds) iRNA 작용제"는, 쇄간(interchain) 혼성화가 이중나선 구조의 영역을 형성할 수 있는 하나 이상, 바람직하게는 2개의 가닥을 포함하는 iRNA 작용제이다.
이중 가닥 iRNA 작용제의 안티센스 가닥은 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 25개, 29개, 40개, 또는 60개 이상의 뉴클레오티드 길이이어야 한다. 상기 안티센스 가닥은 200개, 100개, 또는 50개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직한 범위는 17 내지 25개, 19 내지 23개, 및 19 내지 21개 뉴클레오티드 길이이다.
이중 가닥 iRNA 작용제의 센스 가닥은 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 25개, 29개, 40개, 또는 60개 이상의 뉴클레오티드 길이이어야 한다. 상기 센스 가닥은 200개, 100개, 또는 50개 이하의 뉴클레오티드 길이이어야 한다. 바람직한 범위는 17 내지 25개, 19 내지 23개, 및 19 내지 21개 뉴클레오티드 길이이다.
이중 가닥 iRNA 작용제의 이중 가닥 부분은 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 29개, 40개, 또는 60개 이상의 뉴클레오티드 쌍 길이이어야 한다. 상기 이중 가닥 부분은 200개, 100개, 또는 50개 이하의 뉴클레오티드 쌍 길이이어야 한다. 바람직한 범위는 15 내지 30개, 17 내지 23개, 19 내지 23개, 및 19 내지 21개 뉴클레오티드 쌍 길이.
다수의 구체예들에서, ds iRNA 작용제는 충분히 거대하여 이것은 내생성 분자, 예를 들어, 다이서에 의해 절단되어 더 작은 ds iRNA 작용제, 예를 들어, sRNAs 작용제를 생산할 수 있다.
ds iRNA 작용제가 해당 분자의 한쪽 또는 양쪽 말단에 단일 가닥 또는 짝지워지지 않은 지역을 포함하도록 센스 및 안티센스 가닥이 선택되는 것이 바람직하다. 따라서, ds iRNA 작용제는 센스 및 안티센스 가닥을 함유하는데, 돌출, 예를 들어, 하나 또는 2개의 5' 또는 3' 돌출, 바람직하게는 2 내지 3개 뉴클레오티드의 3' 돌출을 함유하도록 쌍을 이루는 것이 바람직할 수 있다. 대부분의 구체예들은 3' 돌출을 지닐 것이다. 바람직한 sRNA 작용제는 각 말단에 1 또는 바람직하게는 2 또는 3개 뉴클레오티드 길이의, 단일-가닥 돌출, 바람직하게는, 3' 돌출을 지닐 것이다. 상기 돌출은 한 가닥이 다른 가닥보다 더 긴 결과이거나, 동일한 길이의 2 가닥이 비틀린 결과일 수 있다. 5' 말단이 바람직하게는 인산화된다.
이중나선 영역의 바람직한 길이는, 예를 들어, 위에 논의된 sRNA 작용제 범위내에서, 15 내지 30개, 가장 바람직하게는 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 및 23개 뉴클레오티드 길이이다. sRNA 작용제는 길이와 구조에 있어서 긴 dsRNA로부터 천연 다이서 가공된 생성물과 유사할 수 있다. sRNA 작용제의 2 가닥이 연결, 예를 들어, 공유적으로 연결된 구체예들이 또한 포함된다. 헤어핀, 또는 필요한 이중 가닥 영역, 및 바람직하게는 31개 돌출을 제공하는 다른 단일 가닥 구조가 본 발명에 속한다.
ds iRNA 작용제 및 sRNA 작용제를 포함하는, 본원에 기재된 분리된 iRNA 작용제는 표적 RNA, 예를 들어, mRNA, 예를 들어, 단백질을 엔코딩하는 유전자의 전사체의 침묵을 매개할 수 있다. 편의상, 그러한 mRNA는 또한 침묵될 mRNA로 본원에서 지칭된다. 그러한 유전자는 또한 표적 유전자로서 지칭된다. 일반적으로, 침묵될 RNA는 내생성 유전자 또는 병원균 유전자이다. 또한, mRNA 이외의 RNA, 예를 들어, tRNAs, 및 바이러스 RNA가 또한 표적화될 수 있다.
본원에 사용된, 어구 "RNAi를 매개하다"는 서열 특이적 방식으로 표적 RNA를 침묵시키는 능력을 의미한다. 이론으로 제한되는 것을 바라지는 아니하나, 침묵은 RNA 기구 또는 과정 및 가이드 RNA, 예를 들어, 21 내지 23개 뉴클레오티드의 sRNA 작용제를 사용한다.
본원에 사용된, "특이적으로 혼성화할 수 있는" 및 "상보적인"은 안정적이고 특이적인 결합이 본 발명의 화합물과 표적 RNA 분자 사이에 일어나도록 하기에 충분한 정도의 상보성을 제시하기 위해 사용된다. 특정 결합은 특정 결합이 요망되는 조건하에서, 즉, 생체내 검정 또는 치료학적 치료의 경우, 또는 시험관내 검정의 경우의 생리학적 조건하에서, 상기 검정이 수행되는 조건하에서, 비-표적 서열에 올리고머 화합물의 비특이적 결합을 회피하도록 하는데 충분한 정도의 상보성을 필요로 한다. 비-표적 서열은 전형적으로 5개 이상의 뉴클레오티드가 차이난다.
한 구체예에서, iRNA 작용제는 표적 RNA, 예를 들어, 표적 mRNA에 "충분히 상보적"이고 그래서 상기 iRNA 작용제는 표적 mRNA에 의해 엔코딩된 단백질의 생산을 침묵시킨다. 또 다른 구체예에서, 상기 iRNA 작용제는 표적 RNA에 "정확하게 상보적"인데(RRMS 함유 소단위체(들)을 배제함), 예를 들어, 상기 표적 RNA 및 상기 iRNA 작용제는 바람직하게는 정확한 상보성 영역내의 왓슨-크릭 염기쌍으로 전적으로 구성된 하이브리드를 형성하도록 어닐링된다. "충분히 상보적인" 표적 RNA는 표적 RNA에 정확하게 상보적인 (예를 들어, 10개 이상의 뉴클레오티드의) 내부 영역을 포함할 수 있다. 더욱이, 일부 구체예들에서, iRNA 작용제는 단일-뉴클레오티드 차이를 특이적으로 구별한다. 이 경우, iRNA 작용제는 정확한 상보성이 단일-뉴클레오티드 차이(의, 예를 들어, 7개 뉴클레오티드 이내)를 해당 영역내에서 발견되면 RNAi만을 매개한다.
본원에 사용된, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 바람직하게는 100개, 200개, 300개, 또는 400개 이하의 뉴클레오티드 길이의 핵산 분자(RNA 또는 DNA)를 의미한다.
본원에 논의된 RNA 작용제는 달리 비변형된 RNA를 비롯한, 예를 들어, 효능을 개선시키기 위해, 변형된 RNA, 및 뉴클레오시드 대체물질의 폴리머를 포함한다. 비변형된 RNA는 핵산의 성분들, 즉, 당, 염기, 및 포스페이트 모이어티가 자연에서, 바람직하게는 인간 신체에서 자연적으로 생겨나는 것과 동일 또는 본질적으로 동일한 분자를 의미한다. 종래 기술은 드물거나 특이하나, 자연적으로 생겨나는 변형된 RNA로서 RNA를 설명하였다. 예를 들어, 하기 문헌[Limbach et al. (1994), Nucleic Acids Res. 22: 2183-2196] 참고 바람. 종종 변형된 RNA로 지칭되는, 그러한 드물거나 특이한 RNA(분명히 이들이 전형적으로 전사후 변형의 결과이기 때문임)는 본원에 사용된 용어 비변형된 RNA에 속한다.
참고문헌
일반적인 참고문헌
본 발명에 따라 사용된 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고리보뉴클레오시드는 고체상 합성을 이용할 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조 바람: "Oligonucleotides synthesis, a practical approach", Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (특히, 제 1장, 올리고리보뉴클레오티드 합성의 현대적 기계-보조 방법, 제 2장, 올리고리보뉴클레오티드 합성, 제 3장, 2'-O-메틸올리고리보뉴클레오티드: 합성 및 응용, 제 4장, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, 제 5장, 올리고뉴클레오티드 포스포로디티오에이트의 합성, 제 6장, 올리고-2'-데옥시리보뉴클레오시드 메틸포스포네이트의 합성, 및 제 7장, 변형된 염기를 함유하는 올리고데옥시뉴클레오티드. 다른 특별히 유용한 합성 절차, 시약, 블록킹 기 및 반응 조건은 문헌[Martin, P., Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504; Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311 및 Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194] 또는 상기 문헌들내에서 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
WO 00/44895, WO01/75164, 또는 WO02/44321에 기재된 변형은 본원에 사용될 수 있다.
포스페이트 기에 관한 참고문헌
포스포네이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조법은 미국 특허 제5,508,270호에 기재되어 있다. 알킬 포스포네이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조법은 미국 특허 제4,469,863호에 기재되어 있다. 포스포르아미다이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조법은 미국 특허 제5,256,775호 또는 미국 특허 제5,366,878호에 기재되어 있다. 포스포트리에스테르 올리고리보뉴클레오티드의 제조법은 미국 특허 제5,023,243호에 기재되어 있다. 보라노 포스페이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조법은 미국 특허 제5,130,302호 및 제5, 177,198호에 기재되어 있다. 3'-데옥시-3'-아미노 포스포르아미데이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조법은 미국 특허 제5,476,925호에 기재되어 있다. 3'-데옥시-3'-메틸렌포스포네이트 올리고리보뉴클레오티드는 문헌[An, H, et al. J. Org. Chem. 2001 , 66, 2789-2801]에 기재되어 있다. 황이 브릿지된 뉴클레오티드의 제조법은 문헌[Sproat et al. Nucleosides Nucleotides 1988, 7,651 및 Crosstick et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4693]에 기재되어 있다.
당 기에 관한 참고문헌
2' 변형에 대한 변형은 문헌[Verma et al. (1998), Annu. Rev. Biochem. 67:99-134] 및 상기 문헌내의 모든 참고문헌에서 찾아 볼 수 있다. 리보오스에 대한 특이적 변형은 하기 참고문헌들에서 찾아 볼 수 있다: 2'-플루오로(Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841), T-MOE(Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938), "LNA" (Wengel, J. Ace. Chem. Res. 1999, 32, 301-310).
포스페이트 기의 치환에 관한 참고문헌
MMI가 연결된 올리고리보뉴클레오시드로도 확인되는, 메틸렌메틸이미노가 연결된 올리고리보뉴클레오시드, MDH가 연결된 올리고리보뉴클레오시드로도 확인되는, 메틸렌디메틸히드라조가 연결된 올리고리보뉴클레오시드 및, 아미드-3가 연결된 올리고리보뉴클레오시드로도 본원에서 확인되는, 메틸렌카르보닐아미노가 연결된 올리고뉴클레오시드, 및 아미드-4가 연결된 올리고리보뉴클레오시드로도 본원에서 확인되는, 메틸렌아미노카르보닐이 연결된 올리고뉴클레오시드를 비롯한, 예를 들어, 교대되는(alternating) MMI 및 PO 또는 PS 연결을 지니는, 혼합된 백본 화합물이 미국 특허 제5,378,825호, 제5,386,023호, 제5,489,677호 및 공개된 PCT 출원 제PCT/US92/04294호 및 PCT/US92/04305호(각각, WO 92/20822호 및 WO 92/20823로 공개됨)에 기재된 대로 제조될 수 있다. 포름아세탈 미 티오포름아세탈이 연결된 올리고리보뉴클레오시드가 미국 특허 제5,264,562호 및 제5,264,564호에 기재된 대로 제조될 수 있다. 에틸렌 옥사이드가 연결된 올리고리보뉴클레오시드가 미국 특허 제5,223,618호에 기재된 대로 제조될 수 있다. 실옥산 대체가 문헌Cormier, J.F. et al. Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4583]에 기재되어 있다. 카보네이트 대체가 문헌[Tittensor, J.R. J. Chem. Soc. C 1971, 1933]에 기재되어 있다. 카르복시메틸 대체가 문헌Edge, M.D. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1991]에 기재되어 있다. 카바메이트 대체가 문헌[Stirchak, E.P. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 6129]에 기재되어 있다.
포스페이트-리보오즈 백본의 대체에 관한 참고문헌
시클로부틸 당 대체물질 화합물은 미국 특허 제5,359,044호에 기재된 대로 제조될 수 있다. 피롤리딘 당 대체물질은 미국 특허 제5,519,134호에 기재된 대로 제조될 수 있다. 몰포리노 당 대체물질은 미국 특허 제5,142,047호 및 제5,235,033호와, 기타 관련 특허 문헌에 기재된 대로 제조될 수 있다. 펩티드 핵산(PNAs)는 그 자체로 공지되어 있고 문헌[[Peptide Nucleic Acids(PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23]에 설명된 다양한 절차들 중 임의의 절차에 따라서 제조될 수 있다. 이들은 또한 미국 특허 제5,539,083호에 따라 제조될 수 있다.
말단 변형에 관한 참고문헌
말단 변형은 문헌[Manoharan, M. et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12, 103-128 (2002)] 및 상기 문헌내의 참고문헌들에 기재되어 있다.
염기에 관한 참고문헌
N-2 치환 퓨린 뉴클레오시드 아미다이트는 미국 특허 제5,459,255호에 기재된 대로 제조될 수 있다. 3-데아자 퓨린 뉴클레오시드 아미다이트는 미국 특허 제5,457,191호에 기재된 대로 제조될 수 있다. 5,6-치환된 피리미딘 뉴클레오시드 아미다이트는 미국 특허 제5,614,617호에 기재된 대로 제조될 수 있다. 5-프로피닐 피리미딘 뉴클레오시드 아미다이트는 미국 특허 제5,484,908호에 기재된 대로 제조될 수 있다. 추가적인 참고문헌들은 염기 변형에 관한 상기 섹션에 개시되어 있을 수 있다.
7. 전달 모듈
본 발명의 약제학적 조성물은 모듈 복합체를 특징으로 하는 전잘 작용제와 복합체를 이룰 수 있다. 복합체는 하기한 것들 중 하나 이상((바람직하게는, 2개 이상, 또는 더 바람직하게는 전부)에 연결된 담체 물질(담체 물질)을 포함할 수 있다: (a) 축합제(condensing agent)(예를 들어, 이온 또는 정전기 상호작용을 통해, 핵산을, 유인, 예를 들어, 결합시킬 수 있는 작용제); (b) 융합유도제(fusogenic agent)(예를 들어, 세포막, 예를 들어, 엔도좀막을 통해 융합 및/또는 운송시킬 수 있는 물질); 및 (c) 표적화 기, 예를 들어, 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는, 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 항체.
따라서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 모듈 복합체에 연결, 예를 들어, 커플링되거나 결합될 수 있다. 약제학적 조성물은 상기 복합체의 상기 응축제와 상호작용할 수 있고, 상기 복합체는 예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 iRNA 작용제를 세포로 운반하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 복합체는 iRNA 작용제를 전달할 필요가 있는 피검체에게 iRNA 작용제를 전달하는데 사용될 수 있는데, 예를 들어, iRNA 작용제를 장애, 예를 들어, 본원에 기재된 장애, 예컨대, 신장의 질환 또는 장애를 지니는 피검체에게 전달하기 위해 사용될 수 있다.
융합유도제 및 응축제는 상이한 작용제이거나 하나이고 동일한 작용제일 수 있다. 예를 들어, 폴리아미노 쇄, 예를 들어, 폴리에틸렌이민(PEI)가 융합유도제 및/또는 응축제일 수 있다.
전달제는 모듈 복합체일 수 있다. 예를 들어, 상기 복합체는 하기한 것들 중 하나 이상(바람직하게는 2개 이상, 더 바람직하게는 3개 전부)에 연결된 담체 물질을 포함할 수 있다:
(a) 축합제(예를 들어, 이온 상호작용을 통해, 핵산 유인, 예를 들어, 결합시킬 수 있는 물질),
(b) 융합유도제(예를 들어, 세포막, 예를 들어, 엔도좀막을 통해 융합 및/또는 운송될 수 있는 물질), 및
(c) 표적화 기, 예를 들어, 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는, 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 항체. 표적화기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토스아민, N-아세틸-글루코사민, 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 당쇄부가된 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리 아스파테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B 12, 비오틴, 네프록신(Neproxin), 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체.
7.1 담체 물질
본원에 기재된 모듈 복합체의 담체 물질은 하기한 것들 중 하나 이상의 부착을 위한 지질이 될 수 있다: 축합제, 융합유도제, 및 표적화기. 담체 물질은 바람직하게는 내생성 효소 활성이 결여되어 있을 것이다. 상기 물질은 바람직하게는 생물학적 분자, 바람직하게는 거대분자일 것이다. 폴리머 생물학적 캐리어가 선호된다. 또한 담체 분자는 생분해성인 것이 바람직할 수 있다.
상기 담체 물질은 자연적으로 생성된 물질, 예컨대, 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지단백질(LDL), 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시크로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질일 수 있다. 담체 분자는 또한 재조합 또는 합성 분자, 예컨대, 합성 폴리머, 예를 들어, 합성 폴리아미노산일 수 있다. 합성 폴리머의 일예는 폴리아미노산, 예컨대, 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 및 스티렌-말레산 안하이드라이드 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레익 안하이드라이드 공중합체, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 폴리머, 또는 폴리포스파진일 수 있다. 다른 유용한 담체 분자는 관용적인 방법들로 확인될 수 있다.
담체 물질은 하기한 것들 중 하나 이상에 의해 특징지워질 수 있다: (a) 크기아 1 Da 이상임; (b) 5개 이상의 하전된 기, 바람직하게는 5 내지 5000개의 하전된 기를 지님; (c) 복합체내에 융합유도제에 대한 담체 물질이 적어도 1:1의 비율로 존재함; (d) 복합체내의 축합제에 대한 담체 물질이 적어도 1:1의 비율로 존재함; (e) 복합체내의 표적화제에 대한 담체 물질이 적어도 1:1의 비율로 존재함.
7.2 융합유도제
본원에 기재된 모듈 복합체의 융합유도제는, 예를 들어, pH 환경에 따라서, 반응하여 전하가 변하는 물질일 수 있다. 엔도좀의 pH 조우시, 융합유도제는 물리적 변화, 예를 들어, 엔도좀막의 투과성을 파괴 또는 증가시키는 삼투압 특성에서의 변화를 초래할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 융합유도제는, 전하를 변화시키는데, 예를 들어, 생리학적 범위보다 더 낮은 pH에서, 양성자화된다. 예를 들어, 상기 융합유도제는 pH 4.5-6.5에서 양성자화될 수 있다. 상기 융합유도제는, 상기 복합체가 세포에 의해, 예를 들어, 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 유입된 후 세포의 세폴질내로 iRNA 작용제를 방출시키는 역할을 할 수 있으며, 그로인해 세포내 상기 iRNA 작용제의 세포내 농도가 증가된다.
일부 구체예들에서, 상기 융합유도제는, 특정 pH 범위에 노출된 경우, 예를 들어, 전하, 예를 들어, 양성자화 있어서, 변화를 겪게 될 모이어티, 예를 들어, 아미노기를 지닐 수 있다. 융합유도제의 전하에서의 변화는, 소포(vesicle), 예를 들어, 세포내(endocytic) 소포, 예를 들어, 엔도좀내에서, 변화, 예를 들어, 삼투 변화를 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, 엔도좀의 pH 환경에 노출시, 상기 융합유도제는 엔도좀 막의 공극도(porosity)(바람직하게는 엔도좀 막을 파열시키기 위해)를 증가시키는데 실질적으로 충분한 용해도 또는 삼투 변화를 초래할 것이다.
융합유도제는 폴리머, 예컨대, 폴리아미노 쇄, 예를 들어, 폴리에틸렌이민(PEI)일 수 있다. PEI는 선형, 분지형, 합성 또는 천연의 것일 수 있다. PEI는, 예를 들어, 알킬 치환 PEI, 또는 지질 치환 PEI일 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 융합유도제는 폴리히스티딘, 폴리이미다졸, 폴리피리딘, 폴리프로필렌이민, 멜리틴, 또는 폴리아세탈 물질, 예를 들어, 양이온성 폴리아세탈일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 융합유도제는 알파 헬리컬 구조를 지닐 수 있다. 상기 융합유도제는 막 붕괴제(disruptive agent), 예를 들어, 멜리틴(mellittin)일 수 있다.
융합유도제는 하기 특성들 중 하나 이상을 지닐 수 있다: (a) 크기가 1 Da 이상임; (b) 10개 이상의 하전된 기, 바람직하게는 10 내지 5000개의 하전된 기, 더 바람직하게는 50 내지 1000개의 하전된 기를 지님; (c) 복합체내에 담체 물질에 대한 융합유도체는 적어도 1:1의 비율로 존재함; (d) 복합체내의 축합제에 대한 융합유도체는 적어도 1:1의 비율로 존재함; (e) 복합체내의 표적화제에 대한 융합유도체는 적어도 1:1의 비율로 존재함.
다른 적합한 융합유도제는 당업계의 통상의 기술자에 의해 시험 및 확인될 수 있다. pH 환경에 의존하여, 예를 들어, 반응하여 전하를 변화시키는 화합물을 활성은, 관용적인 방법들, 예를 들어, 세포내 검정에 의해 시험될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 세포와 결합되거나 접촉되며, 세포는, 예를 들어, 엔도시토시스에 의해, 시험 화합물을 받아들이게 된다. 엔도좀 제조물은 이후 접촉된 세포로부터 이루어질 수 있고 상기 엔도좀 제조물은 대조군 세포로부터의 엔도좀 제조와 비교될 수 있다. 전하, 예를 들어, 상기 접촉 세포 대 대조군 세포로부터의 엔도좀 분획에서의 감소는 시험 호합물이 융합유도제로서 기능할 수 있다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 접촉 세포 및 대조군 세포는, 세포내 엔도좀 개체군에서의 차이를 결정하기 위해, 현미경, 예를 들어, 광학 현미경 또는 전자 현미경에 의해, 평가될 수 있다. 시험 화합물은 표지될 수 있다. 검정의 또 다른 유형에서, 본원에 기재된 모듈 복합체는 하나 이상의 시험 또는 추정 융합유도제를 사용하여 제작된다. 모듈 복합체는 iRNA 대신 표지된 핵산을 사용하여 제작될 수 있다. pH 환경에 의존하여, 예를 들어, 반응하여 전하를 변화시키는 융합유도제의 활성은, 일단 상기 모듈 복합체가 세포에 의해 유입되면, 상기한 것과 같이, 엔도좀 제조물의 제조, 또는 현미경 기술에 의해 평가될 수 있다. 2단계 검정이 또한 수행될 수 있는데, 여기서 첫번째 검정은, pH 환경에 의존하여, 예를 들어, 전하를 변화시키기 위해, 반응하는 단독의 시험 화합물의 활성을 평가하며; 두번째 검정은 pH 환경에 의존하여, 예를 들어, 전하를 변화시키기 위해, 반응하는 시험 화합물을 포함하는 모듈 복합체의 활성을 평가한다.
7.3 축합제
본원에 기재된 모듈 복합체의 축합제는 (a) 축합시키기 위해, 예를 들어, 약제학적 조성물의 크기 또는 전하를 감소시키기 위해 및/또는 (b) 약제학적 조성물을 보호하기 위해(예를 들어, 변성에 대하여 iRNA 작용제를 보호하기 위해), 본 발명의 약제학적 조성물과 상호작용(예를 들어, 유인, 지탱, 또는 결합)할 수 있다. 축합제는, 이온성 상호작용에 의해, 친수성 모이어티, 예를 들어, 친수성 쇄 또는 iRNA 작용제와 상호작용할 수 있는, 모이어티, 예를 들어, 하전된 모이어티를 포함할 수 있다. 축합제는 하전된 폴리머, 예를 들어, 폴리양이온성 쇄일 수 있다. 축합제는 폴리리신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포피린, 폴리아민의 4급 염, 또는 알파 나선 펩티드일 수 있다.
축합제는 하기 특성들을 지닐 수 있다: (a) 크기가 1 Da 이상임; (b) 2개 이상의 하전된 기, 바람직하게는 2 내지 100개의 하전된 기를 지님; (c) 복합체내에 축합제에 대한 담체 물질이 적어도 1:1의 비율로 존재함; (d) 복합체내의 융합유도제에 대한 축합제가 적어도 1:1의 비율로 존재함; (e) 복합체내의 표적화제에 대한 축합제가 적어도 1:1의 비율로 존재함.
다른 적합한 축합제는, 예를 들어, 친수성 모이어티 또는 iRNA 작용제와 상호작용하는 시험 물질의 활성을 평가함으로써, 당업계의 통상의 기술자에 의해 시험 및 확인될 수 있다. 예를 들어, iRNA 작용제를 축합 또는 보호하기 위해, 친수성 모이어티 또는 iRNA 작용제와 상호작용하는 시험 물질의 활성은 관용 기술에 의해 평가될 수 있다. 한 검정에서, 시험 물질은 핵산과 접촉되고, 접촉된 핵산의 크기 및/또는 전하는 분자량 및/또는 전하에서의 변화를 검출하는데 적합한 기술에 의해 평가된다. 그러한 기술은 비변성 겔 전기영동, 면역학적 방법, 예를 들어, 면역침전, 겔 여과, 이온성 상호작용 크로마토그래피 등을 포함한다. 시험 물질은, 이것이 대조군과 비교하여, 접촉된 친수성 모이어티 또는 핵산의 질량 및/또는 전하(바람직하게는 둘 모두)를 변화시키는 경우, 축합제로서 확인된다. 2단계 검정이 또한 수행될 수 있는데, 여기서 첫번째 검정은, 친수성 모이어티 또는 핵산의 전하 및/또는 질량을 응축시키기 위해, 상호작용, 예를 들어, 결합하는 시험 화합물의 활성을 단독으로 평가하고; 두번째 검정은 친수성 모이어티 또는 핵산의 전하 및/또는 질량을 응축시키기 위해, 상호작용, 예를 들어, 결합하는 시험 화합물을 포함하는 모듈 복합체의 활성을 평가한다.
전달 시스템 제조 방법:
본원에 기재된 전달 시스템, 예를 들어, 혼합 미쎌은, 예를 들어, 버퍼 중에서, 양쪽성 미쎌-형성 분자와 iRNA-컨주게이트를 함께 동시-현탁(co-suspending)시킴으로써 제조될 수 있다. 양쪽성 미쎌-형성 분자와 iRNA-컨주게이트는, 다양한 몰비로, 예를 들어, 1:1의 몰비로 함께 현탁될 수 있다. 일부 바람직한 구체예들에서, 상기 미쎌은 PEG-PE과 컨주게이션된 siRNA, 예컨대, siRNA-Chol을 1:1 몰비로 현탁시킴으로써 제조된다.
바람직한 버퍼는 약 7의 pH를 갖는 버퍼, 예컨대, 약 7.4의 pH를 갖는 HBS 버퍼를 포함한다.
7.4 제 2의 치료 컨주게이트
본 발명의 약제학적 조성물은, 제 2 치료제와 커플링, 예를 들어, 공유적으로 커플링될 수 있다. 예를 들어, 특정 장애를 치료하기 위해 사용되는 iRNA 작용제는 제 2의 치료제, 예를 들어, iRNA 작용제 이외의 작용제와 커플링될 수 있다. 대안적으로, 상기 제 2 치료제는 혼합 미쎌의 친수성 층내의 친수성 모이어티에, 또는 혼합 미쎌의 소수성 코어내에 포함된 소수성 모이어티에 결합될 수 있거나, 상기 제 2 치료제가 소수성인 경우, 미쎌의 소수성 코어내에 용해될 수 있다. 제 2 치료제는 동일한 장애의 치료를 위한 작용제일 수 있다. 예를 들어, 원치않는 세포 증식으로 특징지워지는 장애, 예를 들어, 암을 치료하는데 사용되는 iRNA의 경우, iRNA 작용제 또는 친수성 쇄는 항-암 효과를 지니는 제 2 작용제와 커플링될 수 있다. 예를 들어, 면역체계를 자극시키는 제 2 치료제, 예를 들어, CpG 모티프, 또는 더 일반적으로 톨-유사 수용체를 활성화시키고/거나 감파 인터페론의 생산을 증가시키는 작용제.
본 발명은 하기 실시예들로 더 상세히 설명되나, 상기 실시예들은 추가 한정을 위한 것으로 고려되어서는 아니된다.
실시예
siRNA 전달용 PEG-PE 미쎌
siRNA의 효과적인 세포내 전달은 이의 치료 활성에 필수적이다. 그러나, 천연 siRNA는 항상 요구되는 높은 세포내 투과를 입증하지 못한다. 다양한 siRNA 유도체, 예컨대, siRNA-Chol가 이의 활성을 향상시키는 것으로 제시되었다. 폴리머성 미쎌을 세포에 의한 이의 흡수를 향상시키기 위해 siRNA를 고 선적(high load) 하여 제조하였다. 그러한 미쎌을 제조하기 위해, siRNA-Chol과 PEG-PE 컨주게이트로 이루어진 혼합 미쎌 시스템을 사용하였는데, 상기 시스템은 매우 낮은 CMC 값과 다양한 양쪽성물질(amphiphiles)을 지니는 안정한 혼합 미쎌을 형성하는 활성을 나타내었다. 클레스테릴-변형된 siRNA는 PEG-PE와 안정한 혼합 미쎌을 형성하는데, 이것는 대략 6x10-6 M의 CMC 값(도 1 참조)과, 약 10 nm의 평균 크기, 및 좁은 크기 분포(도 2 참조)를 지닌다. 혼합된 siRNA-Chol/PEG-PE 미쎌의 CMC 값은, siRNA-Chol내 상기 siRNA 모이어티가 Cy3 염료로 추가적으로 변형된 경우 동일하게 유지된다. MCF7 또는 4T1 암 세포와 함께 인큐베이션한 경우, 높은 siRNA 적하량(대략 50 mol%)을 지니며 Cy3로 형광적으로 표지된 혼합된 siRNA-Chol/PEG-PE 미쎌은 2시간 이내의 인큐베이션시 유효한 세포내 흡수를 나타내었고(도 2, 3 참조) siRNA를 세포내로 전달하는 편리한 수단으로 역할할 수 있다(도 2, 3 참조).
미쎌 siRNA-Chol의 침묵 특성에 관한 주요 실험들은, 세포내 흡수와 더불어, siRNA-Chol/PEG-PE 미쎌이 표적 유전자의 유의미한 침묵을 자극시키며 pGFP-트랜스펙션된 세포에서 GFP의 생산을 감소시킬 수 있음이 입증되었다(도 4). 이 실험에 사용된 제 1세대 siRNA 전달 시스템은 현저하게 최적화되어 이 시스템을 고도로 효과적으로 만들 수 있다.
PEG-PE 및 Chol-siRNA로부터의 혼합 미쎌의 제조.
(GFP 유전자를 침묵시키는) siRNA의 시판 제조물(암비온(Ambion)으로부터 Silencer® GFP(eGFP) siRNA cat#AM4626)을 사용할 수 있다. siRNA-Chol 컨주게이트를 하기한 것과 같이 임의의 표준 화학으로 제조할 수 있다. 혼합된 폴리머성 미쎌을 HBS 완충액(pH 7.4) 중에서 상이한 몰비로 PEG-PE와 Chol-siRNA(Chol-siRNA의 적은 분획을 Cy3 염료로 형광적으로 표지시킬 수 있음)를 동시-현탁시킴으로써 제조할 수 있다. Cy3로 siRNA의 표지는 추적을 위한 목적으로 사용될 수 있다.
siRNA-Chol의 합성. 이중 가닥 siRNA는 센스 가닥의 5'-말단 및 3'-말단에서 유도체화될 수 있다. 형광(Chiu et al. (2002), Mol. Cell 10:549-561; Harborth et al. (2003), Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13:83- 105) 또는 방사능(Braasch et al. (2004), Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143)을 지니는 다양한 작용기를 비롯한 막을 통한 세포내 흡수 및 운송을 촉진하는 기(예를 들어, 콜레스테롤, 리토콜산, 라우릴산 또는 긴 알킬 쇄)가 이 위치에 컨주게이션될 수 있다(Soutschek et al. (2004), Nature 432:173-178; Lorenz et al. (2004), Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:4975-4977). 콜레스테롤-변형된 siRNA의 전달은 폴리양이온 트랜스펙션 시약의 부가 없이 시험관내(Lorenz et al. (2004), Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:4975-4977) 및 생체내(Soutschek et al. (2004), Nature 432:173-178) 둘 모두에서 유효한 것으로 입증되었다. 펜던트 기, 예컨대, 푸로마이신(Chiu et al. (2002), Mol Cell 10:549-561), 비오틴(Chiu et al. (2002), Mol. Cell 10:549-561), 역전된 뉴클레오시드(Morrissey et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23:1002-1007; Morrissey et al. (2005), Hepatology 41:1349-1356), 알릴 잔기(Amarzguioui et al. (2003), Nucleic Acids Res 31:589-595) 또는 아미노알칸(Czauderna et al. (2003), Nucleic Acids Res 31 :2705-2716)을 결과적으로 얻은 작제물의 침묵 활성의 임의의 유의미한 손실없이 siRNA 분자의 3'-말단에 부착시켰다. 3'-아미노-활성화된 올리고뉴클레오티드는 공개된 절차에 따라 이황화결합을 통해 머캅틸 콜레스테롤에 컨주게이션될 수 있다(Bandgar et al. (2000), Chem. Lett. 29:1304-1305). 예를 들어, 머캅틸 콜레스테롤은, 유순한 조건하에서, 트리플루오로아세트 안하이드라이드 및 폴리머 지지 히드로설파이드를 사용하여 알코올부터 티올의 직접 합성으로 제조할 수 있다. 도 5A 참조. 3' 아미노-siRNA는 이작용성(heterofunctional) 스페이서 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)를 사용하여 머캅틸 콜레스테롤에 컨주게이션될 수 있다(Kim et al. (2006), J. Control. Release 116:123-129). 도 5B 참조.
siRNA-S-S-Chol의 특성결정은 하기에 의해 실행될 수 있다: (1) 컨주게이션 수율 평가를 위한 UV 분석(λ=260 nm)(Lee et al. (2007), Biochem. Biophys. Res. Commun. 357:511-516); (2) 뉴클레아제 공격에 대한 확인(Checking) 안정성(Kim et al. (2006), J. Control. Release 116: 123-129): RNAse가 임의 2개 리보뉴클레오티드 간의 포스포디에스테르 결합을 절단하기 때문에, RNAse 보호 검정 사용; (3) 글루타치온 용액과 함께 인큐베이션에 의한 자극받은 세포내 조건에서 이황화결합의 절단성의 평가 및 전기영동에 의한 후속 분석; (4) 전기영동에 의한 혈청 안정성의 평가.
Cy3로 siRNA-Chol의 표지. 필요한 경우, 콜레스테롤 및 Cy3는 동일한 siRNA 모이어티에 부착될 수 있다. 콜레스테롤-siRNA는 반응성이 높은 포스포디에스테르 중간체를 생성하는 수용성 카르보디이미드 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드)를 사용하여 5' 말단에 가용한 포스페이트 기에 컨주게이션될 수 있다; 에틸렌 디아민과의 추가 반응은 말단 아미노 반응 기를 제공할 수 있다. 활성화된 카르복실 유도체 Cy3B NHS Ester가 Cy3로 형광적으로 표지된 미쎌을 획득하기 위해 5'-NH2-3'-콜레스테롤-siRNA과 컨주게이션될 수 있다. 도 6 참조.

Claims (14)

  1. (1) (a) 각각의 컨주게이트가 친수성 모이어티와 소수성 모이어티를 포함하는, 복수의 양쪽성 iRNA 컨주게이트로서, 상기 친수성 모이어티 각각이 상기 iRNA 작용제의 iRNA 모이어티를 포함하는, 복수의 양쪽성 iRNA 컨주게이트; (b) 각각의 미쎌-형성 양쪽성 분자가 친수성 모이어티 및 소수성 모이어티를 포함하는, 복수의 미쎌-형성 양쪽성 분자로서, 상기 친수성 모이어티 각각이 상기 혼합 미쎌의 중심으로부터 방사상으로 뻗어 나간 하나 이상의 친수성 쇄를 포함하는, 복수의 미쎌-형성 양쪽성 분자;를 포함하는 혼합 미쎌; 및 (2) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 iRNA 작용제의 약제학적 제형.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 복수의 친수성 쇄가 상기 혼합 미쎌의 중심으로부터 방사상으로 뻗어 나간 친수성 층을 형성하며; 상기 양쪽성 iRNA 컨주게이트가 상기 혼합 미쎌내에 위치하여 상기 iRNA 모이어티의 표면의 적어도 일부분이 상기 친수성 층 내에 존재하는, 약제학적 제형.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 iRNA 모이어티의 표면의 일부가 상기 친수성 층을 벗어나 바깥쪽으로 방사상으로 뻗어 나가지 않은, 약제학적 제형.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 복수의 친수성 쇄가 200 내지 500 Å의 평균 백본 길이를 갖는, 약제학적 제형.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 복수의 친수성 쇄가 1,500 내지 5,000 g/mole의 평균 분자량을 갖는, 약제학적 제형.
  6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 미쎌-형성 양쪽성 분자의 상기 소수성 모이어티가 장쇄 지방산, 인지질, 지질, 및 당지질의 라디칼들로 이루어진 군에서 선택되는, 약제학적 제형.
  7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 양쪽성 iRNA 컨주게이트의 상기 소수성 모이어티가 콜레스테롤, 장쇄 지방산, 지질, 인지질, 및 당지질의 라디칼들로 구성된 군에서 선택되는, 약제학적 제형.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 지방산이 부탄산, 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 테트라데칸산, 헥사데칸산, 옥타데칸산, 에이코산산, 도코산산, 테트라코산산 및 이의 불포화 동질체(congeners)로 이루어진 군에서 선택되는, 약제학적 제형.
  9. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 인지질이 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanlamine, PE), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline, PC), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG), 포스파티딜 이노시톨(phosphatidyl inositol, PI), 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine, PS), 포스파티드산(phosphatidic acid, PA), 및 스핑고미엘린으로 이루어진 군에서 선택되는, 약제학적 제형.
  10. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 당지질이 갈락토지질, 설포지질, 세레브로시드, 및 강글리오시드로 이루어진 군에서 선택되는, 약제학적 제형.
  11. 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 상기 미쎌-형성 양쪽성 분자의 상기 친수성 모이어티가 PEG, PEI, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 폴리옥사졸린, 폴리몰포린, 키토산, 및 수용성 펩티드로 이루어진 군에서 선택되는, 약제학적 제형.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 친수성 모이어티가 1,500 내지 5,000 g/mole의 평균 분자량을 갖는 PEG 라디칼인, 약제학적 제형.
  13. 제 1항 내지 제 12항중 어느 한 항의 약제학적 제형으로 상기 iRNA 작용제를 제형화시키는 단계; 및 상기 약제학적 제형을 세포외로 투여하는 단계를 포함하는 세포내 표적에 iRNA 작용제의 전달을 증가시키는 방법으로서, 상기 세포내 표적에 대한 상기 약제학적 조성물 중의 상기 iRNA 작용제의 전달이 상기 약제학적으로 허용되는 담체 중의 상기 iRNA 작용제의 전달과 대비하여 증가되는, 방법.
  14. 제 1항 내지 제 12항중 어느 한 항의 약제학적 제형으로 상기 iRNA 작용제를 제형화시키는 단계; 및 상기 약제학적 제형을 세포외로 투여하는 단계를 포함하여, 그로 인해 상기 약제학적 제형 중의 상기 iRNA 작용제의 세포외 뉴클레아제 변성이 상기 약제학적으로 허용되는 담체 중의 상기 iRNA 작용제의 변성과 대비하여 감소되는, iRNA 작용제의 세포외 뉴클레아제 변성을 감소시키는 방법.
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