JPH11504926A - 核酸リガンド複合体 - Google Patents

核酸リガンド複合体

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JPH11504926A
JPH11504926A JP8533500A JP53350096A JPH11504926A JP H11504926 A JPH11504926 A JP H11504926A JP 8533500 A JP8533500 A JP 8533500A JP 53350096 A JP53350096 A JP 53350096A JP H11504926 A JPH11504926 A JP H11504926A
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ジー． シュミット，ポール
ジャンジック，ネボジュサ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体の製造方法において、セレックス法によって核酸リガンドを同定し、核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させる方法を開示する。本発明はさらに、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合した１または２種以上の核酸リガンドからなる複合体を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸リガンド複合体 発明の分野 本発明は、セレックス（ＳＥＬＥＸ）法により核酸リガンドを同定し、この核 酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合させることに よって核酸と親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる治療用また は診断用複合体を製造する方法に関する。本発明はさらに、核酸リガンドを親油 性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて複合体を形成させること によって、核酸リガンドの薬物動態学的性質を改良することに関する。本発明は さらに、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる 複合体に治療用または診断用物質を結合させることにより上記治療用または診断 用物質を特定の予め定められた生物学的標的に対してターゲッティングする方法 において、核酸リガンドは上記特定の予め定められた標的と結合したセレックス 標的を有し、核酸リガンドは複合体の外部に結合されている方法に関する。本発 明はまた、１または２以上の核酸リガンドが親油性化合物または非免疫原性高分 子量化合物と結合してなる複合体も包含する。 発明の背景 Ａ．セレックス 核酸は一義的に情報的役割を有するというのが長年にわたり定説であった。セ レックスと呼ばれ、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発生法（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment として知られる方法によっ て、核酸はタンパク質と違わない三次元構造的多様性を有することが明らかにさ れてきた。セレックスは、標的分子に対して高度に特異的な結合性を有する核酸 分子のインビトロ発生法であり、1990年06月11日に出願されて現在は放棄された 米国特許出願一連番号第07/536,428号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）、1991年06月10日に出願された米国特許 出願一連番号第07/714,131号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands）、現在は米 国特許第5,475,096 号、1992年08月17日に出願された米国特許出願一連番号第07 /931,473号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands）、現在は米国特許第5,270,13 6 号（ＰＣＴ/ ＵＳ91/04078も参照）に記載されている。これらはいずれも引用 により本明細書にとくに導入される。本明細書においては包括的にセレックス特 許出願と呼ばれるこれらの各出願には、任意所望の標的分子に対する核酸リガン ドを作成する基本的に新規な方法が記載されている。セレックス法では、それぞ れがユニークな配列を有し、所望の標的化合物または分子に特異的に結合する性 質を有し、核酸リガンドと呼ばれる１群の生成物が提供される。セレックスで同 定された核酸リガンドはそれぞれ与えられた標的化合物または分子の特異的なリ ガンドである。セレックスは、核酸が実際にモノマーであれポリマーであれ任意 の化学的化合物のリガンドとして作用（特異的結合ペアの形成）するのに十分多 様な二次元および三次元構造の形成能ならびにそのモノマー内に利用可能な十分 の化学的多様性を有するというユニークな洞察に基づくものである。任意のサイ ズまたは組成の分子が標的になりうる。 セレックス法は、実際に任意所望の規準の結合親和性および選択性を達成する ために同一の一般的選択スキームを用い、候補オリゴヌクレオチドの混合物から の選択、ならびに結合、分配および増幅の段階的反復を包含する。核酸混合物、 好ましくは無作為化された配列のセグメントからなる混合物に出発し、セレック ス法は、混合物を標的と結合に有利な条件下に接触させ、標的分子に特異的に結 合した核酸から非結合核酸を分配し、核酸- 標的複合体を解離させ、核酸- 標的 複合体から解離した核酸を増幅させ、リガンドが濃縮された核酸混合物を得て、 ついで結合、分配、解離および増幅の工程を所望の回数再反復して、標的分子に 対して高度に特異的な高度に親和性の核酸リガンドを得る工程を包含する。 化学的化合物としての核酸は広い範囲の形状、サイズおよびコンフィギュレー ションを形成することが可能であり、生物学的系において核酸が示すよりもはる かに広いレパートリーの結合や他の機能を発揮できることがセレックス法により 証明されたと本発明者らは認識している。 セレックスまたはセレックス様方法は、任意の与えられた標的に対する核酸リ ガンドの同定を可能にするのと同様の様式で、任意の選ばれた反応を促進できる 核酸の同定に使用できることを本発明者らは認識するに至った。本発明者らは、 理論的には、ほぼ1013〜1018個の核酸からなる候補混合物中に、広範囲の多様な 物理的および化学的相互作用のそれぞれを促進するのに適当な形状をもつ少なく とも１個の核酸が存在すると考えている。 基本セレックス法は多くの特定の目的を達成するために改良されてきた。たと えば、1992年10月14日に出願された米国特許出願一連番号第07/960,093号（発明 の名称：Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure）に は特異的な構造特性を有する核酸分子たとえばベントＤＮＡを選択するためのゲ ル電気泳動と組合わせたセレックスの使用が記載されている。1993年09月17日に 出願された米国特許出願一連番号第08/123,935号（発明の名称：Photoselection of Nucleic Acid Ligands）には、標的分子に対する結合および／または光架橋 および／または光不活性化を可能にする光反応基を含有する核酸リガンドを選択 するセレックスに基づく方法が記載されている。1993年10月07日に出願された米 国特許出願一連番号第08/134,028号（発明の名称：High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffein）には、非ペ プチドであってもよいきわめて類似した分子間の識別が可能な高度に特異的な核 酸リガンドを同定する、カウンターセレックス（Counter-SELEX）と呼ばれる方 法が記載されている。1993年10月25日出願の米国特許出願一連番号第08/143,564 号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmen t:Solution SELEX）には、標的分子に対して高親和性および低親和性を有するオ リゴヌクレオチドの間の高度に効率的な分配を達成するセレックスに基づく方法 が記載されている。 セレックス法は、リガンドに対して改良された特性、たとえばインビボ安定性 の改良または送達特性の改良を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リ ガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホ スフェートおよび／または塩基位置の化学的置換が包含される。修飾ヌクレオチ ドを含むセレックスで同定される核酸リガンドについては、1993年09月08日出願 の米国特許出願一連番号第08/117,991号（発明の名称：High Affinity Nucleic Acid Ligands Containig Modified Nucleotides）にピリミジンの５- および2' - 位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが 記載されている。上記米国特許出願一連番号第08/134,028号には2'-アミノ（2'- ＮＨ2），2'- フルオロ（2'- Ｆ）および／または2'-Ｏ- メチル（2'- ＯＭｅ ）により修飾された１もしくは２個以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的 な核酸リガンドが記載されている。1994年06月22日に出願された米国特許出願一 連番号第08/264,029号（発明の名称：Novel Method of Preparation of 2'Modif ied Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement）には様々な2'- 修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。 セレックス法は、1994年08月02日出願の米国特許出願一連番号第08/284,063号 （発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX）ならびに1994年04月28日に出願された米国特許出願一連番号第 08/234,997号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX）にそれぞれ記載されているように、選ばれたオリ ゴヌクレオチドの他の選ばれたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド の機能性単位との結合を包含する。これらの出願は、オリゴヌクレオチドの広範 囲の形状および他の性質、ならびに効率的な増幅および複製特性を、他の分子の 望ましい性質と組合わせることを可能にする。基本的セレックス操作の修飾を記 述する上記特許出願のそれぞれは引用によりそれらの全体がとくに本明細書に導 入される。 Ｂ．脂質構築体 脂質二重層小胞は、極性（親水性）および非極性（親油性）部分を有する個々 の分子から主として形成される、閉鎖され、液体が充填された顕微鏡的な球体で ある。親水性部分は、ホスファト、グリセリルホスファト、カルボキシ、スルフ ァト、アミノ、ヒドロキシ、コリンまたは他の極性基から構成できる。親油性基 の例には飽和または不飽和炭化水素たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂 質基がある。ステロール（たとえばコレステロール）および他の医薬的に許容さ れるアジュバント（α- トコフェロールのような酸化防止剤を包含する）も小胞 の安定性の改良または他の所望の性質の付与のため包含させることができる。 リポソームはこれらの二重層小胞のサブセットであり、脂肪酸鎖からなる２つ の疎水性尾部を含むリン脂質分子から主として構成される。水に暴露されると、 これらの分子は自然に整列して球状の二層の膜を形成し、各層における分子の親 油性末端は膜の中心に会合し、反対側の極性末端は二重層膜のそれぞれ内側およ び外側の表面を形成する。すなわち、膜はいずれの側も親水性の表面を提供し、 一方、膜の内部は親油性の媒体を構成する。これらの膜は内部の水性空間の周囲 に、水の薄い層で分離された同心球状の一連の膜として玉葱とあまり変わらない 様式で配列される。これらの多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）は剪断力の適用によって 小さなもしくは単ラメラ小胞（ＵＶ）に変換できる。 リポソームの治療的使用には、遊離の形態では通常毒性の薬物の送達が包含さ れる。リポソーム型では、毒性の薬物は遮蔽され、その薬物に感受性の組織から 隔離され、選択された領域に標的化される。リポソームはまた治療的に、長時間 にわたって薬物を放出させて投与回数を減らすために使用される。さらに、リポ ソームは、通常静脈内送達に不適当な疎水性または両親媒性の薬物の水性分散剤 の形成方法を提供することができる。 多くの薬物および造影剤が治療的または診断的可能性をもつためにはそれらが 生体内の適当な場所に送達されることが必要であり、したがって、リポソームは 注射により持続放出および特定の細胞タイプまたは生体部分への薬物送達の基盤 を容易に形成することができる。封入された薬物を選択された宿主組織に標的化 し感受性の組織から隔離するためにはリポソームを用いる幾つかの技術を採用す ることができる。これらの技術には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電 荷およびそれらの投与経路の操作が包含される。ＭＬＶは主としてそれらが比較 的大きいために、細網内皮系（主として、肝臓および脾臓）によって通常、迅速 に取り込まれる。一方、ＵＶは、ＭＬＶに比較して循環時間の増大、クリアラン ス速度の低下および生物分布の上昇を示すことが見出されている。 リポソームの受動送達には静脈内、皮下、筋肉内および局所投与のような様々 な投与経路が使用される。各経路によって、リポソームの局在には差が生じる。 選ばれた標的領域に対してリポソームを能動的に方向づけるために用いられる２ つの通常の方法には、リポソームの表面への抗体または特異的な受容体リガンド の付着がある。抗体はそれらの相当する抗原に高度な特異性を有することが知ら れていてリポソームの表面に結合されてきたが、結果は多くの場合あまり成功し ていない。しかしながら、抗体を用いないでリポソームを腫瘍に標的化する一部 の努力は成功している（たとえば米国特許第5,019,369 号参照）。 研究者らによって精力的に追究された開発領域は、特定の細胞タイプにのみで なく、細胞の細胞質さらには核への薬剤の送達である。これはＤＮＡ，ＲＮＡ， リボザイムおよびタンパク質のような生物学的物質の送達にとくに重要である。 この領域における有望な治療的研究には疾患の処置のためのアンチセンスＤＮＡ およびＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用が包含される。しかしながら、アンチセ ンス技術の効果的な適用に際して遭遇する大きな問題は、ホスホジエステル型の オリゴヌクレオチドが体液内でまた細胞内および細胞外酵素たとえばエンドヌク レアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって、標的細胞に到達する前に速やかに 分解されることである。静脈内投与も腎臓による血流からの速やかなクリアラン スを生じ、細胞内に有効な薬物濃度を生成させるには取り込みが不十分である。 リポソームによる封入はオリゴヌクレオチドを分解酵素から保護し、リポソーム の貪食の結果として、循環半減期は増大し、取り込み効率は上昇する。 アンチセンスオリゴヌクレオチドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化 合物に結合させた研究が、これまでに数例報告されている。しかしながら、アン チセンスオリゴヌクレオチドは細胞内物質としてのみ有効である。上皮増殖因子 （ＥＧＦ）受容体に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドがポリエチレ ングリコールスペーサーを介して葉酸に連結されたリポソーム（葉酸- ＰＥＧ- リポソーム）に封入され、葉酸受容体誘導エンドサイトーシスによって培養ＫＢ 細胞中に送達されている［Wangら(1995)92: 3318-3322］。さらに、アンチセン スオリゴヌクレオチドに共有結合で結合した親油性化合物が文献に記載されてい る（ＥＰ462 145 B1）。 発明の概要 本発明は、核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物から なる治療用または診断用複合体を製造する方法において、核酸候補混合物から与 えられた標的のリガンドである核酸リガンドを（ａ）核酸候補混合物を標的と接 触させ、（ｂ）上記候補混合物のメンバーを標的に対する親和性に基づいて分配 し、ついで（ｃ）選ばれた分子を増幅させて標的に対する結合親和性が比較的に 高い核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る方法によって同定し、この同定され た核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合させるこ とからなる方法を提供する。 他の実施態様においては、本発明は細胞内セレックス標的を有する核酸リガン ドの細胞内取り込みを改良する方法において、核酸リガンドを親油性化合物また は非免疫原性高分子量化合物に結合させて核酸リガンドと親油性化合物または非 免疫原性高分子量化合物からなる複合体を形成させ、この複合体を患者に投与す ることによる方法を提供する。 他の実施態様においては、本発明は核酸リガンドの薬物動態学的性質を改良す る方法において、核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物 に結合させ核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からな る複合体を形成させこの複合体を患者に投与することによる方法を提供する。 他の実施態様においては、本発明は患者における特定の予め定められた生物学 的標的に対して治療用または診断用物質をターゲッティングする方法において、 治療用または診断用物質を核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子 量化合物からなる複合体に結合させ、この核酸リガンドは特定の予め定められた 生物学的標的に結合したセレックス標的を有し、核酸リガンドは複合体の外部に 結合されていて、この複合体を患者に投与することからなる方法を提供する。 本発明の目的は、１または２個以上の核酸リガンドが親油性化合物または非免 疫原性高分子量化合物と結合してなる複合体およびその製造方法を提供すること にある。本発明のさらに他の目的は、親油性化合物または非免疫原性高分子量化 合物と結合して薬物動態学的性質が改良された１または２個以上の核酸リガンド を提供する。本発明の他の態様においては、親油性化合物は脂質構築体である。 この実施態様においては、脂質構築体は好ましくは脂質二重層小胞であり、とく に好ましくはリポソームである。本発明のある実施態様においては、親油性化合 物はコレステロール、ジアルキルグリセロール、またはジアシルグリセロールで ある。本発明の他の実施態様においては、非免疫原性高分子量化合物はＰＥＧで ある。本発明の他の実施態様においては、非免疫原性高分子量化合物はマグネタ イトである。好ましい実施態様においては、核酸リガンドはセレックス法によっ て同定される。 本発明の実施態様においては、核酸リガンド（単数または複数）と結合したコ レステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、ＰＥＧ，また はマグネタイトからなる複合体が意図され、この場合核酸リガンド（単数または 複数）は標的化能によって働くことができる。 本発明の実施態様においては、内部コンパートメントを限定する膜をもつタイ プのたとえば脂質二重層小胞のような脂質構築体からなり、脂質構築体と結合し た核酸リガンドは脂質構築体の膜と結合しているかまたはコンパートメント内に 封入されている複合体が意図される。核酸リガンドが膜と結合している実施態様 においては、核酸リガンドは膜の内部表面部分または外部表面部分に結合して、 核酸リガンドは小胞の内部または外部に突出する。核酸リガンドが複合体の外部 に突出した実施態様においては、核酸リガンドは標的化能によって働くことがで きる。非免疫原性高分子量化合物も膜に結合することができる。一実施態様にお いては、核酸リガンドは非免疫原性高分子量化合物に結合し、これが膜に結合す る。膜はさらに、核酸リガンドに結合していない非免疫原性高分子量化合物と結 合していてもよい。 複合体の核酸リガンドが標的化能によって働く実施態様においては、複合体に は治療用または診断用物質を導入または結合させることができる。一実施態様に おいては治療用物質は薬物である。別の実施態様においては、治療用または診断 用物質は１または２以上の付加的な核酸リガンドである。異なる標的に特異的な 核酸リガンドを複合体の外表面から突出させることができる。複合体は、同一の 標的上の異なるセレックス標的に特異的な１または２以上の核酸リガンドをその 外部表面から突出させることができる。 これらの目的および他の目的ならびに本発明の本質、範囲および利用について は以下の説明および請求の範囲から本技術分野の熟練者には自明であろう。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｙは、ＮＸ229 ，ＮＸ232 ，ＮＸ253 ，ＮＸ256 ，225 Ｔ3 ，225 Ｔ3 Ｎ，Ｔ- Ｐ4,ＮＸ-256- ＰＥＧ-20,000 ，225 Ｔ3 Ｎ- ＰＥＧ3400，Ｔ- Ｐ 4-ＰＥＧ-(20,000もしくは10,000)，ＮＸ268 ，ＮＸ191 ，ＪＷ966 ，ＮＸ278 ，ＪＷ986 ，ＮＸ213 ，ＮＸ244 ，ＪＷ1130，ＮＸ287 ，ＪＷ1130-20 ＫＰＥＧ ，ＪＷ1379，ＪＷ1380，scＮＸ278 ，ＪＷ986-ＰＥＧ-(10,000，20,000または40 ,000），およびＪＷ1336（配列番号：６〜30）の分子構造を示す。ヌクレオチド の前に付した小文字は以下の意味である：ｍ＝2'-Ｏ- メチル、ａ＝2'- アミノ 、ｒ＝リボ、ｆ＝2'- フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がない場合はデオキシ リボヌクレオチド（2'- Ｈ）を指示する。ヌクレオチドの後のｓはホスホロチオ エートによるヌクレオシド間連結からなる骨格修飾を意味する。 図２は、中空のリポソーム（Ｅmpty），4.7 mgＮＸ232 含有リポソーム（Ｌ- ＮｅＸ2 ａ），11.8 mg ＮＸ232 含有リポソーム（Ｌ- ＮｅＸ2 ｂ），72 mgの 遊離ＮＸ232（Free 72 mg），7.2 mgの遊離ＮＸ232（Free 7.2 mg）および超音 波処理した 10 mgの遊離ＮＸ232（Free/soni 10 mg）についてのゲル浸透クロマ トグラムを示す。 図３にはＮＸ229 ，ＮＸ232 ，ＮＸ253 ，ＮＸ253 ＋リポソーム，およびＮＸ 256-ＰＥＧ20Ｋの１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる 。 図４にはＮＸ213（配列番号：21），ＮＸ268（配列番号：16），ＮＸ278（配 列番号：19），ＮＸ278 ＋リポソーム，ＪＷ986（配列番号：20），リポソーム に封入されたＮＸ213 ，およびＮＸ244（配列番号：22）の１回注射後の時間の 関数としての血漿濃度のデータをまとめる。 図５にはＪＷ966（配列番号：18）およびＪＷ966 ＋リポソームの１回注射後 の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。 図６にはＮＸ268（配列番号：16）およびＮＸ268 ＋リポソームの１回注射後 の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。 図７にはＮＸ191（配列番号：17），ＪＷ986 ＋ＰＥＧ20Ｋ，ＰＥＧ40Ｋ，お よびＰＥＧ10Ｋ（配列番号：29）の１回注射後の時間の関数として血漿濃度のデ ータをまとめる。 図８にはＪＷ986 ＋ＰＥＧ20Ｋ（配列番号：29）およびＪＷ1130（配列番号： 23）の１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。 図９には、ＮＸ278 ＋ＰＥＧ40Ｋ（配列番号：24）およびＮＸ256（配列番 号：９）の１回注射後の時間の関数としての血漿濃度のデータをまとめる。 図10はＪＷ1130（配列番号：23），1136- ＰＥＧ20Ｋ（配列番号：25），1336 （配列番号：30）および1379/80（配列番号：26-27）の１回注射後の時間の関数 としての血漿濃度のデータをまとめたものである。 図11は、ＮＸ232（配列番号：７），ＮＸ232 ＋１％ＰＧＳＵＶ，ＮＸ232 ＋2 .5 ％ＰＧＳＵＶおよびＮＸ232 ＋ＰＧＳＵＶについてのクロマトグラムを示す 。 図12は結合した核酸リガンド（ＮＸ253）（配列番号：８）の分画をリポソー ム：核酸リガンド比の関数として示す。 発明の詳細な説明 定義： 「共有結合」は電子の共有によって形成される化学結合である。 「非共有結合相互作用」はイオン性相互作用および水素結合を含む、共有結合 以外の相互作用により分子実体を互いに保持する手段である。 本発明の目的において「脂質構築体」とは脂質、リン脂質またはそれらの誘導 体を含有し、脂質が水性懸濁液中で採用することが知られている多様な異なる構 造配列からなる構造である。これらの構造は、それらに限定されるものではない が脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、エマルジョン、脂質リボンまたはシー トを包含し、様々な薬物および医薬的に許容されることが知られているアジュバ ントと複合体を形成させることができる。通常のアジュバントとしては、とくに コレステロールおよびα- トコフェロールがある。脂質構築体は単独でまたは本 技術分野の熟練者には周知の任意の組合せで特定の適用に望ましい特性を提供す る。さらに、脂質構築体およびリポソーム形成の技術的側面は本技術分野におい ては周知であり、本分野において一般に実用化されている任意の方法が本発明に 使用できる。 「親油性化合物」とは、脂質および／または誘電率の低い他の材料もしくは相 に対して結合または分配する傾向を有し、実質的に親油性成分からなる構造を包 含する化合物である。親油性化合物には、脂質構築体ならびに脂質（および／ま たは誘電率の低い他の材料もしくは相）に結合する傾向を有する非脂質含有化合 物を包含する。コレステロール、リン脂質およびジアルキルグリセロールは親油 性化合物のその他の例である。 本明細書で用いられる「複合体」の語は、核酸リガンドと親油性化合物または 非免疫原性高分子量化合物の結合によって形成される分子実体を記述する。結合 は共有結合でも非共有結合相互作用であってもよい。 本明細書で用いられる「核酸リガンド」とは、セレックス標的に対して所望の 活性を有する天然に存在しない核酸である。所望の活性には、それらに限定され るものではないが、セレックス標的の結合、セレックス標的の触媒的変化、セレ ックス標的またはセレックス標的の機能的活性を修飾／変化させる様式でのセレ ックス標的との反応、自殺阻害剤の場合のようなセレックス標的への共有結合、 標的と他の分子の間の反応の促進が包含される。好ましい実施態様においては、 活性は標的分子に対する特異的結合親和性であり、この場合の標的分子は主とし てワトソン・クリック型塩基対合または三重らせん結合に依存する機構を介して 核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、核酸リ ガンドは標的分子により結合される既知の生理学的機能を有する核酸ではない。 本発明の好ましい実施態様においては、本発明の複合体の核酸リガンドはセレッ クス法によって同定される。核酸リガンドには、与えられた標的のリガンドであ る核酸の候補混合物から、（ａ）核酸候補混合物に比較して標的に対する親和性 が高い核酸が候補混合物の残部から分配できるように核酸候補混合物を標的と接 触させ、（ｂ）親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配し、ついで（ｃ） 親和性が高い核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸混合物を得ることから なる方法によって同定される核酸が包含される。 「候補混合物」は、それから所望のリガンドを選択する様々な配列の核酸の混 合物である。候補混合物の起源は、天然に存在する核酸もしくはそれらのフラグ メント、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸または上記技術の組 合せにより作成された核酸とすることができる。好ましい実施態様においては、 それぞれの核酸は、増幅過程を容易にするために、無作為化された領域を囲む固 定された配列を有する。 「核酸」は、ＤＮＡ，ＲＮＡ，一本鎖または二本鎖およびそれらの任意の化学 修飾体とすることができる。修飾にはそれらに限定されるものではないが、付加 的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および核酸リガンド塩基または核酸 リガンド全体に対する変動を導入する他の化学基を付与する修飾が包含される。 このような修飾にはそれらに限定されるものではないが、2'- 位置の糖修飾、5- 位置のピリミジン修飾、8-位置のプリン修飾、環外アミンの修飾、4-チオウリジ ンの置換、5-ブロモまたは5- ヨードウラシルの置換、骨格の修飾たとえばヌク レオシド間ホスホロチオエート連鎖、メチル化、イソ塩基のイソシチジンとイソ グアニジンのような異常な塩基対合の組合せ等が包含される。修飾にはまた、3' と5' の修飾たとえばキャッピングも包含される。 「非免疫原性高分子量化合物」は、通常免疫原性応答を起こさない約 1000 Da またはそれ以上の化合物である。本発明の目的では、免疫原性応答とは生体に抗 体タンパク質の作成を起こさせる応答である。非免疫原性高分子量化合物の例に は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖たとえばデキストリン、ポリペプ チドたとえばアルブミン、および磁性構造体たとえばマグネタイトがある。非免 疫原性高分子量化合物は、ある種の実施態様においては、核酸リガンドであって もよい。 「脂質二重層小胞」は、極性（親水性）および非極性（親油性）部分を有する 個々の分子から主として形成される、閉鎖され、液体が充填された顕微鏡的な球 体である。親水性部分は、ホスファト、グリセリルホスファト、カルボキシ、ス ルファト、アミノ、ヒドロキシ、コリンまたは他の極性基から構成できる。非極 性基の例には飽和または不飽和炭化水素たとえばアルキル、アルケニルまたは他 の脂質基がある。ステロール（たとえばコレステロール）および他の医薬的に許 容されるアジュバント（α- トコフェロールのような酸化防止剤を包含する）も 小胞の安定性の改良または他の所望の性質の付与のため包含させてもよい。 「リポソーム」は二重層小胞のサブセットであり、長い脂肪酸鎖からなる２つ の疎水性尾部を含むリン脂質分子から主として構成される。水に暴露されると、 これらの分子は自然に整列して二層性の膜を形成し、各層における分子の親油性 末端は膜の中心に会合し、反対側の極性末端は二重層膜のそれぞれ内側および外 側表面を形成する。すなわち、膜はいずれの側も親水性の表面を提供し、一方、 膜の内部は親油性の媒体を構成する。形成されたこれらの膜は内部の水性空間の 周囲に玉葱の層とあまり違わない様式で、層間の水相により分離された同心の閉 鎖された膜システムに全体的に配列される。これらの多重ラメラ小胞（ＭＬＶ） は剪断力の適用によって小さなもしくは単ラメラ小胞（ＵＶ）に変換できる。 「陽イオン性リポソーム」は生理学的ｐＨにおいて、全体的に陽性の電荷を有 する脂質成分を含有するリポソームである。 「セレックス」法は、標的と所望の様式で相互作用するたとえばタンパク質に 結合する核酸リガンドの選択と、これらの選ばれた核酸の増幅の組合せを包含す る。選択／増幅工程の反復サイクリングにより、多数の核酸を含有するプールか ら標的に最も強力に相互作用する１個もしくは少数の核酸の選択が可能になる。 選択／増幅操作のサイクリングは選択された最終目標が達成されるまで続ける。 本発明においては、セレックス法は所望の標的に対する核酸リガンドを得るため に採用される。 セレックス法については、セレックス特許出願に記載されている。 「セレックス標的」とは、そのリガンドが望まれる任意の関心化合物または分 子を意味する。標的は、タンパク質（たとえば、ＶＥＧＦ，トロンビン、および セレクチン）、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、 抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態アナログ、補因子、阻害剤、薬 物、染料、栄養物、増殖因子等とすることができ、制限はない。「セレックス標 的」および「標的」の語は本明細書においては相互に交換して使用できる。文章 の内容から「標的」が「セレックス標的」を意味するか否かは明白である。 「標的」とは、生物系において予め選択された位置、たとえば組織、臓器、細 胞、細胞内コンパートメント、細胞外成分を意味する。後者としては、ホルモン （内分泌、傍分泌、自己分泌）、酵素、神経伝達物質および生理学的カスケード 現象（たとえば血液凝固、補体等）の構成成分が包含される。 「改良された薬物動態学的性質」とは、非免疫原性高分子量化合物または親油 性化合物に結合した核酸リガンドが、親油性化合物または非免疫原性高分子量化 合物に結合していない同一の核酸リガンドに比較して、インビボにおいて循環半 減期の延長または他の薬物動態学的利点たとえば改良された標的対非標的濃度比 を示すことを意味する。 「リンカー」は、２個またはそれ以上の分子実体を共有結合または非共有結合 相互作用によって連結する分子実体である。 「スペーサー」は、１または２以上の分子実体の機能的性質が保存されるよう に２個以上の分子実体の空間的分離を可能にするサイズのリンカーである。 本発明の目的は、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合した１ または２以上の核酸リガンドからなる複合体を提供することにある。このような 複合体は、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結合していない核酸 リガンドに比し１または２以上の以下の利点を有する。すなわち１）薬物動態学 的性質の改善、２）細胞内送達能の改善、または３）標的化能の改善である。 本発明の複合体はこれらの利点の１，２または３すべての利点がある。本発明 の複合体には複合体中で全体として異なる目的で働く異なる核酸リガンドを含有 させることができる。たとえば本発明の複合体は、ａ）リポソーム、ｂ）細胞内 のセレックス標的に標的化され、リポソームの内部に封人された核酸リガンド、 およびｃ）特定の細胞型に標的化され、リポソームに結合してその外部表面から 突出した核酸リガンドから構成することができる。このような場合、複合体には １）リポソームの存在により、薬物動態学的性質の改善、２）リポソームの性質 により、封入された核酸リガンドの細胞内送達能の上昇、および３）外部に結合 した核酸リガンドにより、インビボにおける選ばれた位置への特異的な標的化が 達成される。 他の実施態様においては、本発明の複合体は、親油性化合物たとえばコレステ ロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、または非免疫原性高 分子量化合物たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合で結合した 核酸リガンドから構成される。これらの場合、複合体の薬物動態学的性質は核酸 リガンド単独に比べて改善される。さらに他の実施態様においては、本発明の複 合体はリポソームの内部に封入された核酸リガンドから構成され、核酸リガンド の細胞内取り込みには複合体化されていない核酸リガンドの場合に比べて上昇が 認められる。 本発明のある実施態様においては、本発明の複合体は１個（二量体）または２ 個以上（多量体）の他の核酸リガンドに結合した核酸リガンドから構成される。 核酸リガンドは同一のまたは異なるセレックス標的に向けることができる。多重 核酸リガンドが同一のセレックス標的に向けられる実施態様においては、セレッ クス標的との多重結合相互作用により結合活性が上昇する。さらに、複合体が１ 個または２個以上の他の核酸リガンドに結合した核酸リガンドから構成される本 発明の実施態様においては、複合体の薬物動態学的性質は１個の核酸リガンド単 独の場合に比べて改善される。 親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物は、核酸リガンド（単数または 複数）と共有結合で結合していても、また非共有結合相互作用によって会合して いてもよい。親油性化合物がコレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシ ルグリセロール、または非免疫原性高分子量化合物がＰＥＧである実施態様にお いては、核酸リガンドとの共有結合が好ましい。親油性化合物が陽イオン性リポ ソームであるかまたは核酸がリポソーム内に封入されている実施態様においては 核酸リガンド（単数または複数）との非共有結合が好ましい。共有結合が採用さ れた実施態様においては、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物は核酸 リガンド上の様々な位置、たとえば塩基上の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオ チドの 5- 位置、プリンヌクレオチドの 8- 位置、ホスフェートのヒドロキシル 基または核酸リガンドの 5’もしくは 3’末端におけるヒドロキシル基もしくは 他の基に共有結合させることができる。しかしながら、その 5’または 3’ヒド ロキシル基に結合させることが好ましい。核酸リガンドの複合体の他の成分に対 する結合は直接またはリンカーもしくはスペーサーを用いて行われる。 親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物は、非共有結合相互作用により 核酸リガンド（単数または複数）に結合させることができる。たとえば、本発明 の一実施態様においては、核酸リガンドは親油性化合物の内部コンパートメント 内に封入される。本発明の他の実施態様においては、核酸リガンドは静電的相互 作用によって親油性化合物に結合される。たとえば、陽イオン性リポソームは陰 イオン性核酸リガンドに結合させることができる。イオン吸引力を介した非共有 結合相互作用の他の例には、核酸リガンドの一部が、親油性化合物または非免疫 原性高分子量化合物に結合したオリゴヌクレオチドにワトソン・クリック型塩基 対合または三重らせん塩基対合によってハイブリダイズする相互作用がある。 核酸の治療的およびインビボ診断的使用に際して遭遇する一つの問題は、ホス ホジエステル型のオリゴヌクレオチドが体液中で、細胞内および細胞外酵素たと えばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにより、所望の効果を発現す る前に迅速に分解することである。核酸リガンドのある種の化学的修飾は、核酸 リガンドのインビボ安定性の増大または核酸リガンドの送達の促進もしくは誘導 を可能にする。本発明において意図される核酸リガンドの修飾にはそれらに限定 されるものではないが、付加的な電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作 用および核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に対する変動を導入する他の 化学基を提供する修飾が包含される。このような修飾には、それらに限定される ものではないが、2'- 位置の糖修飾、5-位置のピリミジン修飾、8-位置のプリン 修飾、環外アミンの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは 5- ヨードウ ラシルの置換、骨格の修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェート修 飾、メチル化、イソ塩基イソシチジンおよびイソグアニジンのような異常な塩基 対合の組合せ等が包含される。修飾にはまた、3'と 5’の修飾たとえばキャッピ ングも包含される。 核酸リガンドがセレックス法によって誘導される場合には修飾は前または後セ レックス修飾とすることができる。前セレックス修飾によれば、セレックス標的 に対する特異性および改良されたインビボ安定性の両者を有する核酸リガンドが 生成する。2'- ＯＨ核酸リガンドに行われる後セレックス修飾では、核酸リガン ドの結合能に悪影響を与えることなくインビボ安定性の改善が達成できる。本発 明の核酸リガンドの好ましい修飾は 5’および 3’ホスホロチオエートキャッピ ングまたは 3’末端における 3'3' 逆転ホスホジエステル連鎖がある。ＲＮＡリ ガンドの場合、一部またはすべてのヌクレオチドの付加的 2’アミノ（2'- ＮＨ2 ）修飾が好ましい。 本発明の他の態様においては、核酸リガンドの親油性化合物または非免疫原性 高分子量化合物との結合は、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物と結 合していない核酸リガンドに比較して、薬物動態学的性質の改善（すなわち、ク リアランス速度の遅延）を生じる。本発明の一実施態様においては、複合体は脂 質構築体を包含する。核酸リガンドとの複合体は共有結合または非共有結合相互 作用によって形成することができる。好ましい実施態様においては、脂質構築体 は脂質二重層小胞である。最も好ましい実施態様においては、脂質構築体はリポ ソームである。 本発明のある実施態様においては、複合体は、リポソームから突出した標的化 核酸リガンドを有するリポソームからなる。同一の標的に対する多重核酸リガン が存在する実施態様においては、標的との多重結合相互作用によって結合活性が 上昇する。 本発明で用いられるリポソームは、本技術分野で現在既知のまたは今後開発さ れる様々な任意の方法で調製することができる。それらは通常、リン脂質、たと えばジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、他の材料たとえば中性 脂質、たとえばコレステロール、またさらに表面修飾剤、たとえば陽性に荷電し た（たとえば、コレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノースもしく はアミノマンニトール誘導体）または陰性に荷電した（たとえば、ジセチルホス フェート、ホスファチジルグリセロール）化合物を包含してもよい。多重ラメラ リポソームは慣用技術、すなわち脂質を適当な溶媒に溶解し、ついで溶媒を蒸発 させて容器の内側に薄いフィルムを残留させて適当な容器の内壁に選ばれた脂質 を沈積させることによりまたは噴霧乾燥によって形成させることができる。つい で容器に水相を、水平または垂直の渦状に攪拌しながら加えるとＭＬＶの形成が 起こる。ＵＶはついで、ＭＬＶのホモジェニゼーション、超音波処理または押し 出し（フィルターから）によって形成できる。さらに、ＵＶは界面活性剤除去法 により形成させることもできる。 本発明のある実施態様においては、複合体はリポソームとリポソームの表面に 結合した標的化核酸リガンド（単数または複数）および封入された治療用または 診断用物質から構成される。予め形成されたリポソームを核酸リガンドと結合さ せて修飾することができる。たとえば、陽イオン性リポソームは静電相互作用を 介して核酸リガンドに結合させる。別法として、親油性化合物たとえばコレステ ロールに結合した核酸リガンドを予め形成されたリポソームに添加すると、コレ ステロールがリポソームの膜に結合する。別法として、核酸リガンドはリポソー ムの形成時にリポソームと結合させることができる。好ましくは核酸リガンドは 予め形成されたリポソーム中に負荷することによりリポソームと結合させる。 リポソームが広範囲の多様な治療用または診断用物質の封入または導入に有利 であることは本技術分野においてよく知られている。多様な任意の化合物がリポ ソームの内部水性コンパートメント中に封入可能である。治療用物質の例として は抗生物質、抗ウイルス性ヌクレオシド、抗かび性ヌクレオシド、代謝調節剤、 免疫調節剤、化学療法薬、トキシン解毒剤、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アンチセンスオリ ゴヌクレオチド等がある。同様に、脂質二重層小胞には診断用核種（たとえば、 イリジウム111 ，ヨウ素131 ，イットリウム90，リン32またはガドリニウム）な らびに蛍光物質またはインビトロおよびインビボ適用で検知可能な材料を負荷す ることができる。治療用または診断用物質はリポソーム壁部によって水性の内部 に封入できることを理解すべきである。別法として、担体物質を小胞壁形成材料 の一部として、すなわち小胞壁形成材料中に分散または溶解することができる。 リポソームの形成時に、水溶性の担体物質はそれらを水和溶液中に包含させて 水性の内部に封入し、親油性分子は脂質処方中に包含させることにより脂質二重 層中に導入させることができる。ある種の分子（たとえば、陽イオン性または陰 イオン性親油性薬物）の場合には、予め形成されたリポソーム中への薬物の負荷 はたとえば米国特許第4.946,683 号に記載の方法により行うことができる。この 開示は引用により本明細書に導入される。薬物の封入後、リポソームはゲルクロ マトグラフィーまたは限外ろ過のような方法により処理して封入されなかった薬 物を除去する。リポソームは通常ついで滅菌ろ過して懸濁液中に存在する可能性 のある微生物を除去する。微生物は無菌操作によっても除去できる。 大きな親水性分子をリポソーム中に封入することを所望の場合には、大きな単 ラメラ小胞をたとえば相転換蒸発（reverse-phase evaporation; ＲＥＶ）また は溶媒注入法のような方法によって形成させることができる。リポソームの形成 のための他の標準方法には、本技術分野においてたとえば米国特許第4,753,788 号に記載されたホモジェニゼーション操作を含むリポソームの工業的製造方法、 ならびに米国特許第4,935,171 号に記載の薄層フィルム蒸発法が知られている。 これらの特許出願は引用により本明細書に導入される。 治療用または診断用物質はまた、脂質二重層小胞の表面への結合も可能である ことを理解すべきである。たとえば、薬物はリン脂質またはグリセライドに結合 させることができる（プロドラッグ）。プロドラッグのリン脂質またはグリセラ イド部分は、脂質処方中への包含または予め形成されたリポソーム中への負荷に よりリポソームの脂質二重層中に導入することができる（米国特許第5,194,654 号および第5,223,263 号参照。両特許は引用により本明細書に導入される）。 特定のリポソームの製造方法は、二重層膜の形成に用いられる脂質の意図され る用途および種類に依存することになる。 親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合した核酸リガンド（単数 または複数）では、非結合核酸リガンド（単数または複数）に比較して核酸リガ ンド（単数または複数）の細胞内送達が増大する。複合体の細胞への送達効率は リポソームと細胞の膜の融合を増強することが知られている脂質処方および条件 を用いることにより至適化される。たとえば、ある種の陰性に荷電した脂質たと えばホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンは、とくに他のフ ゾゲン（たとえば、Ｃa21のような多価陽イオン、遊離脂肪酸、ウイルス融合タ ンパク質、短鎖ＰＥＧ，リゾセレクチン、界面活性剤）の存在下に融合を促進す る。ホスファチジルエタノールアミンも膜融合を増強するためにリポソーム処方 に包含させることが可能であり、同時に細胞送達を増大させる。さらに、遊離脂 肪酸および、たとえばカルボキシレート残基を含有するその誘導体は、高いｐＨ または中性では陰性に荷電し、低いｐＨではプロトン化されるｐＨ- 感受性リポ ソームの製造に使用できる。このようなｐＨ- 感受性リポソームは高い融合傾向 を有することが知られている。 好ましい実施態様では、本発明の核酸リガンドはセレックス法により誘導され る。セレックスは、現在は放棄された米国特許出願一連番号第07/536,428号（発 明の名称：Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment）、1 991年06月10日付で出願の米国特許出願一連番号第07/714,131号（発明の名称：N ucleic Acid Ligands）、現在米国特許第5,475,096 号、1992年08月17日出願の 米国特許出願一連番号第07/931,473号（発明の名称：Nucleic Acid Ligands）、 現在米国特許第5,270,136 号（ＰＣＴ/ ＵＳ91/04078も参照）に記載されている 。これらの出願はいずれも引用により本明細書にとくに導入され、包括的にセレ ッ クス特許出願と呼ばれる。 セレックス法では、それぞれがユニークな配列を有し、所望の標的化合物また は分子に特異的に結合する性質を有する核酸分子である１群の生成物が提供され る。標的分子は好ましくはタンパク質であるが、他の炭水化物、ペプチドグリカ ンおよび各種の小分子もとくに包含できる。セレックス法は、細胞表面またはウ イルスのような生物学的構造をその生物学的構造の必須部分である分子との特異 的相互作用を介して標的化するためにも使用することができる。 その最も基本的な形態において、セレックス法は、以下の一連の工程によって 定義することができる。 １）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は一般に、固定さ れた配列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一の位置に同一の配列 を含有する）および無作為化された配列の領域を含有する。固定された配列領域 は、（ａ）以下に記載する増幅工程を補助するため、（ｂ）標的に結合すること が既知の配列を模倣するため、または（ｃ）候補混合物中の与えられた構造アレ ンジメントの核酸の濃度を増大させるために選択される。無作為化配列は全体的 に無作為化されていても、すなわち、任意の位置にある塩基が見出される確率は 1/4 である）また部分的に無作為化されていてもよい（たとえば、任意の位置に ある塩基が見出される確率は 0〜100 ％の任意のレベルで選択できる）。 ２）候補混合物を選択された標的と、標的と候補混合物のメンバーの間の結合 に好ましい条件下に接触させる。これらの環境下では、標的と候補混合物の核酸 の間の相互作用は、標的とその標的に対して最強の親和性を有する核酸の間での 核酸-標的ペアを形成すると考えることができる。 ３）標的に対して最強の親和性を有する核酸を、標的に対する親和性がより弱 い核酸から分配する。最高の親和性の核酸に相当する配列は、きわめて少数しか （多分１分子の核酸分子しか）候補混合物中には存在しないので、候補混合物中 の有意な量の核酸（約５〜50％）が分配後に残るように分配規準を設定すること が一般的に望ましい。 ４）分配時に標的に対して比較的高い親和性を有するとして選択された核酸を ついで増幅して、標的に対して比較的高い親和性を有する核酸が濃縮された新し い候補混合物を創成する。 ５）上述の分配および増幅工程を反復することにより、新たに形成される候補 混合物に含まれるユニークな配列は次第に減少し、標的に対する核酸の平均的な 親和性の程度は一般に上昇する。その極限を考えれば、セレックス法では最初の 候補混合物からの標的に対して最高の親和性を有する核酸である１種または少数 種のユニークな核酸を含有する候補混合物が生成することになる。 基本セレックス法は多くの特殊な目的を達成するために改良されてきた。たと えば、1992年10月14日に出願された米国特許出願一連番号第07/960,093号（発明 の名称：Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure）に は特異的な構造特性を有する核酸分子たとえばベントＤＮＡを選択するためのゲ ル電気泳動と組合わせたセレックスの使用が記載されている。1993年09月17日に 出願された米国特許出願一連番号第08/123,935号（発明の名称：Photoselection of Nucleic Acid Ligands）には、標的分子に対する結合および／または光架橋 および／または光不活性化を可能にする光反応基を含有する核酸リガンドを選択 するセレックスに基づく方法が記載されている。1993年10月07日に出願された米 国特許出願一連番号第08/134,028号（発明の名称：High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffein）には、きわ めて類似した分子間の識別が可能な高度に特異的な核酸リガンドを同定するカウ ンターセレックスと呼ばれる方法が記載されている。1993年10月25日に出願され た米国特許出願一連番号第08/143,564号（発明の名称：Systematic Evolution o f Ligands by EXponential Enrichment: Solution SELEX）には標的分子に対し て高親和性および低親和性を有するオリゴヌクレオチドの間の高度に効率的な分 配を達成するセレックスに基づく方法が記載されている。1992年10月21日に出願 された米国特許出願一連番号第07/964,624号（発明の名称：Methods of Produci ng Nucleic Acid Ligands）には、セレックスの実施後に、改良された核酸リガ ンドを得る方法が記載されている。1995年03月08日付出願の米国特許出願一連番 号第08/400,440号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by EXponen tial Enrichment: Chemi-SELEX）にはリガンドをその標的に共有結合で連結させ る方法が記載されている。 セレックス法は、リガンドに対して改良された特性、たとえばインビボ安定性 の改良または送達特性の改良を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リ ガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホ スフェートおよび／または塩基位置の化学的置換が包含される。修飾ヌクレオチ ドを含むセレックスで同定される核酸リガンドについては、1993年09月08日出願 の米国特許出願一連番号第08/117,991号（発明の名称：High Affinity Nucleic Acid Ligands Containig Modified Nucleotides）にピリミジンの 5- および2'- 位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが 記載されている。上記米国特許出願一連番号第08/134,028号には2'-アミノ（2'- ＮＨ2），2'- フルオロ（2'- Ｆ）および／または2'-Ｏ- メチル（2'- ＯＭｅ ）により修飾された１もしくは２個以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的 な核酸リガンドが記載されている。1994年06月22日に出願された米国特許出願一 連番号第08/264,029号（発明の名称：Novel Method of Preparation of 2' Modi fied Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement）には様々な 2'- 修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。 セレックス法は、1994年08月02日出願の米国特許出願一連番号第08/284,063号 （発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX）ならびに1994年04月28日に出願された米国特許出願一連番号第 08/234,997号（発明の名称：Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX）にそれぞれ記載されているように、選ばれたオリ ゴヌクレオチドの他の選ばれたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド の機能性単位との結合を包含する。これらの出願は、オリゴヌクレオチドの広範 囲の形状および他の性質、ならびに効率的な増幅および複製特性を、他の分子の 望ましい性質と組合わせることを可能にする。基本的セレックス操作の修飾を記 述する上記特許出願のそれぞれは引用によりそれらの全体がとくに本明細書に導 入される。 セレックスは標的に高い親和性および顕著な特異性で結合できる核酸リガンド を同定し、これは核酸研究の分野において先例のない卓絶した業績である。これ らの特性はもちろん、本技術分野の熟練者が治療用または診断用リガンドに求め ている望ましい性質である。 医薬としての使用に望ましい核酸リガンドを製造するためには、核酸リガンド は（１）標的に対して所望の効果を達成できる様式で結合し、（２）所望の効果 を得るために可能な限り小さく、（３）可能な限り安定であり、（４）選ばれた 標的に対して特異的なリガンドであることが好ましい。大部分の場合、核酸リガ ンドは標的に対して可能な最高の親和性をもつことが好ましい。さらに、核酸リ ガンドは促進作用をもつことができる。 1992年10月21日に出願され係属中の共通に譲渡された米国特許出願一連番号第 07/964,624号（'624）にはセレックスの実施後に改良された核酸リガンドを得る 方法が記載されている。'624出願（発明の名称：Methods of Producing Nucleic Acid Ligands）は引用によりとくに本明細書に導入される。 核酸リガンド（単数または複数）が標的化能によって働く実施態様においては 核酸リガンドは、核酸リガンドがその標的に結合できるために維持されなければ ならない三次元構造を選択する。さらに、核酸リガンドはその標的結合能が弱化 されないように複合体の表面に関し適切な方向性で配置されなければならない。 これは、核酸リガンドを核酸リガンドの結合部分から離れた位置で結合させるこ とによって達成できる。三次元構造および適切な方向性は上述のリンカーまたは スペーサーの使用によって維持することもできる。 複合体による標的化送達には上述のように、任意の様々な治療用または診断用 物質を複合体に結合、封入または導入することができる。複合体がリポソームと 核酸リガンドからなる実施態様においては、たとえば、複合体の表面上に暴露さ れたかび特異的な核酸リガンドは、殺かび剤（たとえば、アンホテリシンＢ）の 送達のためにかびの細胞に標的化できる。別法として、化学療法剤は、腫瘍抗原 に対する核酸リガンドを介して腫瘍細胞に送達することができる。 別の実施態様においては、標的細胞に送達すべき治療用または診断用物質は他 の核酸リガンドとすることができる。たとえば、腫瘍抗原に結合する核酸リガン ドは複合体の外側に提示し、細胞内標的たとえばｒａｓ遺伝子のタンパク質産物 であるｐ21の突然変異アイソフォームに結合し、それを阻害する核酸リガンドは 送達すべき物質とすることができる。 本発明によればさらに、送達すべき物質は複合体に、複合体の外部表面に結合 する様式で導入できることも意図されている（たとえば、プロドラッグ、受容体 アンタゴニスト、または処置もしくは造影用の放射性物質）。核酸リガンドの場 合のように、この物質は共有結合または非共有結合相互作用によって結合させる ことができる。複合体はその物質の細胞外への標的化送達を提供し、リポソーム はリンカーとして働く。 他の実施態様においては、非免疫原性高分子量化合物（たとえば、ＰＥＧ）は リポソームに結合されて複合体に改良された薬物動態学的性質を与える。核酸リ ガンドは、上述のようにリポソーム膜に結合されるかまたは非免疫原性高分子量 化合物に結合され、一方これが膜に結合される。この方法で、複合体は血中のタ ンパク質から遮蔽されて長時間にわたって循環され、一方、核酸リガンドは依然 としてそのセレックス標的に接触しそれに結合するのに十分暴露される。 本発明の一実施態様においては、複合体の外面に存在する核酸リガンドは、細 網内皮系（すなわち、肝臓および脾臓）による除去のため循環タンパク質（たと えば、抗体、増殖因子、タンパク質ホルモン）に標的化することができる。一例 として、このような複合体によれば、自己免疫疾患の処置が可能である。自己免 疫疾患は、生体の免疫系に自己抗体および自己反応性Ｔ細胞の産生による自己認 識の回避が欠如する結果である。宿主細胞に対する免疫系による攻撃は、神経疾 患たとえば多発性硬化症および重症筋無力症、関節疾患たとえば慢性関節リウマ チ、全身性エリテマトーデスに認められるような核酸に対する攻撃、様々な臓器 が関連するこのような他の疾患、たとえば乾癬、若年性糖尿病、シェーグレン病 およびグレーブス病を含む多くの疾患を引き起こすことができる。タンパク質と 結合したリポソームは一般的に、タンパク質と結合していないリポソームよりも 迅速に細網内皮系（すなわち、肝臓および脾臓）によって除去されることが見出 されていることから、リポソームで複合体化された核酸リガンドは細網内皮系に よる自己抗体の除去に使用できる。 本発明の他の実施態様においては、同一のセレックス標的に対して特異的な核 酸リガンドが同一のリポソームの表面に結合される。これは、同一のセレックス 標的を互いに接近させる可能性を提供し、同一のセレックス標的の間の特異的な 相互作用を発生させるために使用できる。たとえば、リポソームに結合させたチ ロシンキナーゼ受容体に対する核酸リガンドは、この受容体を互いに接近させる ことが期待される。これは、シグナル伝達カスケードを開始させる自己リン酸化 を促進することが考えられる。 本発明の別の実施態様においては、異なるセレックス標的に対して特異的な核 酸リガンドを同一のリポソームの表面に結合させる。これは、異なる標的を互い に接近させる可能性を提供し、それらの標的の間の特異的な相互作用を発生させ るために使用できる。たとえば、腫瘍マーカーまたは抗原に特異的な核酸リガン ドおよびＴ- 細胞受容体に特異的な核酸リガンドは、Ｔ- 細胞を腫瘍に接近させ ることが期待される。標的を接近させる方法としてのリポソームの使用に加えて 薬剤（たとえば、免疫系調節剤）をリポソームに封入して、相互作用の強度を増 大（たとえば、Ｔ- 細胞免疫応答の増強）させることができる。 関心細胞標的にユニークな生物分子の同定が困難な場合には、標的に対する２ またはそれ以上のマーカーに特異的な核酸リガンドを複合体と結合させることに よって特異性を得ることができる。このシナリオでは、最善の核酸リガンドはそ れらのそれぞれの標的に対して低いまたは中等度の親和性を有することが期待さ れる。高い親和性を有する核酸リガンドではいずれかのマーカータンパク質をも つすべての細胞と薬物の結合を導きそれによって特異性が低下することから、上 述のタイプの核酸リガンドの使用が推薦される。低親和性リガンドでは、必要な 特異性を提供するためには結合活性が要求される。 リポソーム／核酸リガンド複合体はまた、標的に対する多重結合相互作用の可 能性も生じる。これはもちろん、複合体あたりの核酸リガンドの数ならびに核酸 リガンドおよび受容体のそれらそれぞれの膜における可動性に依存する。有効結 合定数は各部位における結合定数の積として増大するので、多重結合相互作用が あることは実質的に有利である。換言すれば、多くの核酸リガンドをリポソーム に結合させることによって、すなわち多価結合を創成することによって、その標 的に対する多重複合体の有効親和性（すなわち、結合活性）は各部位に対する結 合定数の積と同程度に改良される。 本発明のある実施態様においては、本発明の複合体は、親油性化合物たとえば コレステロール、ジアルキルグリセロール、またはジアシルグリセロールに結合 した核酸リガンドから構成される。この場合、複合体の薬物動態学的性質は核酸 リガンド単独の場合に比較して改善される。上述のように、コレステロールは核 酸リガンド上の多くの位置で核酸リガンドに共有結合することができる。本発明 の他の実施態様においては、複合体はさらに、脂質構築体たとえばリポソームか ら構成されてもよい。この実施態様においてはコレステロールは、コレステロー ルの他の親油性化合物と結合しやすい傾向により、リポソーム中への核酸リガン ドの導入を補助することができる。核酸リガンドと結合したコレステロールは、 リポソーム処方中への包含または予め形成されたリポソーム中への負荷により、 リポソームの脂質二重層に導入することができる。好ましい実施態様では、コレ ステロール／核酸リガンド複合体は、予め形成されたリポソームと結合させる。 コレステロールは、核酸リガンドがリポソームの内部または外部に突出するよう な様式でリポソームの膜に結合させることができる。核酸リガンドが複合体の外 部に突出している実施態様においては核酸リガンドは標的化能によって働く。 他の実施態様においては、本発明の複合体は、非免疫原性高分子量化合物たと えばＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステ ロールに結合した核酸リガンドから構成される。この実施態様においては、複合 体の薬物動態学的性質は核酸リガンド単独の場合に比較して改善される。上に述 べたように、結合は共有結合または非共有結合相互作用を介することができる。 好ましい実施態様においては、核酸リガンドは、ＰＥＧ，ジアルキルグリセロー ル、ジアシルグリセロール、またはコレステロール分子と共有結合によって結合 される。また上述のように、共有結合が採用された場合、ＰＥＧ，ジアルキルグ リセロール、ジアシルグリセロールまたはコレステロールは核酸リガンドの様々 な位置に共有結合させることができる。ＰＥＧまたはジアシルグリセロールが用 いられる実施態様では、核酸リガンドは、マレイミドもしくはビニルスルホン官 能基によりまたはホスホジエステル結合を介して 5’チオールに結合させること が好ましい。ジアルキルグリセロールおよびコレステロールが用いられる実施態 様では、核酸リガンドはホスホジエステル結合を介して結合させることが好まし い。ある種の実施態様では、複数個の核酸リガンドを単一のＰＥＧ，ジアルキル グリセロール、ジアシルグリセロールまたはコレステロール分子に結合させるこ とができる。核酸リガンドは同一または異なる標的に対するものであってよい。 多重核酸リガンドが同一の標的に対するものである実施態様では、標的との多重 結合相互作用により結合活性の増大が起こる。さらに他の実施態様においては、 複数個のＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレ ステロール分子が互いに結合することができる。これらの実施態様においては、 同一の標的または異なる標的に対する１または２個以上の核酸リガンドを、それ ぞれのＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレス テロール分子に結合させることができる。これも各核酸リガンドのそのセレック ス標的に対する結合活性の増大を生じる。同一のセレックス標的に特異的な複数 の核酸リガンドがＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールまた はコレステロールに結合している実施態様においては、同一の標的の間での特異 的相互作用を発生させるために、同一の標的を互いに接近させる可能性がある。 異なる標的に特異的な複数の核酸リガンドがＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、 ジアシルグリセロールまたはコレステロール分子に結合している場合には、それ らの標的の間での特異的相互作用を発生させるために、異なる標的を互いに接近 させる可能性がある。さらに、同一の標的または異なる標的に対する核酸リガン ドがＰＥＧ，ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステ ロール分子に結合している実施態様では、薬物を同じくＰＥＧ，ジアルキルグリ セロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロールに結合させることがで きる。すなわち、複合体は薬物の標的化送達を提供し、この場合、ＰＥＧ，ジア ルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはコレステロールはリンカー として働く。 本発明の他の実施態様においては、複合体は非免疫原性高分子量化合物たとえ ばマグネタイトに結合した核酸リガンドから構成される。上に述べたように、結 合は共有結合または非共有結合相互作用によることができる。好ましい実施態様 においては、核酸リガンドはマグネタイトと共有結合によって結合される。マグ ネタイトは、結合のために異なる化学的機能を発揮する様々な化合物でコーティ ングすることができる（たとえば、デキストラン、親油性化合物）。マグネタイ トと結合した核酸リガンドは核磁気共鳴造影に使用するマグネタイトの標的化送 達を提供する。 以下の実施例は本発明の説明および例示のために提供されるものであって、本 発明の限定として受け取るべきではない。以下の実施例に記載する核酸リガンド の構造は図１に示す。実施例１には核酸リガンドの脂質、ジアルキルグリセロー ルまたはジアシルグリセロールとの接合、ならびに自動合成による薬物動態調節 物質の導入を記載する。実施例２にはＰＥＧおよびコレステロールの核酸リガン ドとの接合を記載する。核酸リガンドに対する修飾は、ＰＥＧ- 接合およびコレ ステリル化核酸リガンドの結合親和性が非接合および非コレステリル化分子の場 合と同一であったように、そのセレックス標的に対する結合能を妨害することは ない。実施例３には、コレステロール誘導体化核酸リガンドの脂質処方への導入 を記載する。トロンビン核酸リガンドを含有する核酸リガンド／リポソーム処方 の活性をインビトロ凝血阻害アッセイで試験した。リポソーム処理条件は核酸リ ガンドの抗凝血活性に影響しない。さらに、リポソームの結合は核酸リガンドの その標的に対する結合能および阻害能に影響しない。実施例４にはコレステロー ル単独、ジアルキルグリセロール単独、ＰＥＧ単独、コレステロールとリポソー ム、ジアルキルグリセロールとリポソーム、およびＰＥＧとリポソームに結合し た核酸リガンドの薬物動態学的性質を記載する。プリンおよびピリミジンの 2' 糖位置で修飾された核酸リガンドも包含する。実施例５には陽イオン性リポソー ム- 核酸リガンド複合体の毒性およびヒトリンパ球による細胞内取り込みを記録 する。実施例６〜10は予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入に対す る以下の影響、すなわち、脂質の陰性電荷の変動、コレステロール含量の変動、 固定量の核酸リガンドでの脂質／核酸リガンド比の変動、固定量のＳＵＶでの脂 質／核酸リガンド比の変動、およびリン脂質の鎖長の変動の影響を記載する。実 施例11は、リポソーム処方中への核酸リガンド／コレステロール接合体の導入が 起こったことを非変性ゲル電気泳動によって証明する。実施例12は、核酸リガン ドのリポソーム中への受動的封入を可能にする方法を記述する。実施例13には、 核酸リガンドをリポソーム中に遠隔負荷できる方法を記載する。実施例14は核酸 リガンドのリポソームへの共有結合による接合を記載する。実施例15には核酸リ ガンド- リポソーム複合体のインビトロおよびインビボ効率を記載する。 実施例１．オリゴヌクレオチド修飾のための脂質、ＰＥＧ，ジアルキルグリセ ロールおよびジアシルグリセロール試薬 この実施例では、核酸リガンドの脂質および／またはＰＥＧまたはジアシルグ リセロールまたはジアルキルグリセロールとの接合、ならびにホスホロアミダイ トもしくはＨ- ホスホネートカップリング化学を用いる自動合成による薬物動態 学的修飾物質の導入を説明する。以下に示す反応図中、実線の矢印は完成した工 程を示し、点線の矢印は未完成の工程を示す。反応図１は、スルフヒドリル- 修 飾オリゴヌクレオチド基質にカップリングするためのジパルミトイルホスファチ ジルエタノールアミンマレイミド試薬の調製を示す。この操作は、単純な脂肪族 ジおよびトリアミン基質からビスおよびトリス- マレイミド試薬の製造のために Cheronis ら［Cheronis,J.C．ら，J.Med.Chem.（1992）35: 1563-1572］によっ て報告された操作と同様である。リン脂質のメトキシカルボニルマレイミドでの 処理により、性質未決定の中間体の形成が起こり、これはスルフヒドリル- 修飾 オリゴヌクレオチドとインキュベーションすると、オリゴヌクレオチドのジパル ミトイルホスファチジルエタノールアミン接合体への完全な変換が起こる（下記 参照）。同様の試薬は Avanti Polar Lipidsから市販品も入手できる。 反応図１ オリゴヌクレオチドを自動合成条件下に修飾できれば多くの利点があることは 明白である。脂質および／またはＰＥＧ残基の標準的自動合成条件下での容易な 導入を可能にする試薬を調製した。最初に、アミノ基の化学選択的な官能化つい でヒドロキシル基のホスフィチル化により多数の関心オリゴ修飾試薬に放散的に 変換できる多目的モジュール10を設計し合成した（反応図２）。修飾基（アミン リガンド）および 2'-ヒドロキシル基の誘導体化によって導入される活性化ホス フェート前駆体（ホスホロアミダイト、Ｈ- ホスホネート、またはホスフェート トリエステル）に関して、この戦略が提供する柔軟性は注目に値する。さらに、 この方法で調製される自動合成試薬のグリセロール核は、生成物を内部鎖の位置 または 5’末端におけるオリゴ修飾に適当にする。モジュール10の別法による合 成を反応図３に示す。テトラエチレングリコール（１；ＴＥＧ）を塩基性メジウ ム好ましくはピリジン中で、限定量のｐ- トルエンスルホニルクロリド好ましく は10モル％で処理すると、モノトシレート２ａに誘導体化される。この方法では２ａ はシリカゲルろ過後75％の収率で得られた。２ａのＴＥＧフタルイミド３ａ への変換は塩基としてジアザビシクロウンデカン（ＤＢＵ）の存在下にＤＭＦ溶 液中で加温してフタルイミドにより処理すると、80％の収率で達成された。フタ ルイミド３ａのアリル化（アリルブロミド，ＮａＨ，ＴＨＦ／ＤＭＦ）は60％の 収率でアリルＴＥＧ４ａを与えた。４ａを 0.5％ＯｓＯ4および 1.1当量のＮ- メチルモルホリンＮ- オキシド（ＮＭＯ）により処理するとジオール中間体が得 られ、これはさらに精製することなくジメトキシトリチル（ＤＭＴ）エーテル誘 導体９に、２工程の総収率89％で変換された。最後に、40％ＭｅＮＨ2を用いて アミンの脱保護を行うと10が精製後収率95％で得られた。モジュール10はさらに ＰＥＧ- ニトロフェニルカルボネート（ＰＥＧ- ＮＰＣ；Shearwater Polymers ）で処理して精密化した。この方法で、ホスフィチル化前駆体12（反応図４）が 好収率で調製された。12のホスホロアミダイト13およびＨ- ホスホネート14両者 への更なる変換も実施された。 反応図２ 反応図３ 反応図４ 自動合成によるオリゴヌクレオチド修飾のための脂質試薬の設計には、上述の ジパルミトイルホスファチジル誘導体におけるようにネイティブなジアシルグリ セロールのエステル結合を合成オリゴの回収に必要な塩基性脱保護プロトコール に安定なグリセロール- アルキル結合によって置換する必要がある。検討が最初 に選択された結合は既知のジパルミトイルグリセロール誘導体15（Sigma から入 手できる）におけるようにエーテル結合であったが、長鎖アルキルカルバメート （またはエーテルとカルバメートの組合せ）も適当と思われる。ジパルミトイル グリセロールはアシルカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ，ピリジン）として活性 化し、この活性化中間体をモジュール10にカップリングした（ピリジン、80℃； 44％）。16のホスフィチル化［ＣＩＰ(iＰr2Ｎ）ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ；ジイソプロ ピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ），ＣＨ2Ｃl2；59％］はホスホロアミダイト17 を与えた（反応図５）。アミダイト17のＣ18アナログのクロロホルメート中間体 を経由する合成を反応図６に示す。ジアルキルグリセロール（18；ＤＡＧ）はト ルエン中過剰のホスゲンで処理して相当するクロロホルメート19に変換した。19 とアミノアルコール10の接合はピリジン中で実施し、精製後の収率57％で付加物20 が得られた。20の二級ヒドロキシルの標準条件下でのホスフィチル化によって 、ホスホロアミダイト21が95％の収率で得られた。アミダイト17のトリヌクレオ チド（ＴＴＴ）の 5'-末端へのカップリングは、ＡＢＩ394 自動オリゴヌクレオ チドシンセサイザーによって、脂質アミダイトのためにカップリング時間を延長 した（カップリング２×30分）わずかに改変した合成サイクルを用いて行い、平 行トリチル陽イオン分析で測定して94+ ％のカップリング効率が得られた。 反応図５ 反応図６ 実施例Ａ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）マレ イミド試薬の合成 200 mg（0.289 ミリモル）のＤＰＰＥおよび 54 mg（0.347 ミリモル）のメト キシカルボニルマレイミドの 10 mlＴＨＦ／飽和ＮａＨＣＯ3溶液（1:1）中懸濁 液を室温で攪拌した。12時間後、混合物を 100 ml のＥｔＯＡｃで処理し、有機 相（生成物のゼラチン状懸濁液を含有する）を水相から分離した。有機相を真空 中で濃縮し、ＭｅＯＨと２回共蒸発させ、得られた白色の固体をＥｔＯＡｃと３ 回磨砕した。この物質はさらに分析または精製することなく、オリゴヌクレオチ ド接合実験に用いた（下記参照）。 実施例Ｂ：自動合成モジュール10の合成および推敲 テトラエチレングリコールジメトキシトリチルエーテル（２）：テトラエチレ ングリコール（76.4 mL，0.44 モル）を 300 mL の無水ピリジンに溶解し、０℃ に冷却した。4,4'- ジメトキシトリチルクロリド（15 g，0.044 モル）を固体と して、攪拌しながら添加した。反応フラスコを乾燥管で覆い、反応混合物を一夜 放置して温度を室温まで上昇させた。反応混合物を真空中、低い温度（＜30℃） で濃縮した。残留物を 300 mL の酢酸エチルで希釈し、３×300 mLの水で抽出し た。水層を合わせて酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせて硫酸ナトリウム上で 乾燥し、濃縮した。粗製の残留物を 1000 mLのシリカゲル（５％トリエチルアミ ン含有ヘキサンでカラムに湿式充填）を用い、５％トリエチルアミン含有ヘキサ ン中 10-20-40-60-80 ％酢酸エチルついで５％トリエチルアミン含有酢酸エチル で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。19.51 g（89％）の２ が、金色の油状物として収集された。1ＨＮＭＲ（300 MHz，ＣＤＣl3）δ 7.4 7-7.16（重複シグナル，9H），6.79（d，4H），3.72（s，6H），3.66-3.62（m， 2H），3.22（t，J＝5.22 Hz，1H），2.96（br t，1H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz ，ＣＤＣl3）δ 158.12，144.86，136.04，129.81，127.93，127.49，126.40，1 12.78，85.67，72.31，70.48，70.44，70.12，62.89，61.39，54.89; 低分解能ＭＳ m/eＣ15Ｈ25Ｏ7Ｓ（Ｍ- ＤＭＴ+ １+）での計算値 349.167，分析 値 349.1. テトラエチレングリコールジメトキシトリチルエーテルｐ- トルエンスルホネ ート（３） ：化合物２（5.0 g，10.06ミリモル）を 50 mLの無水ジクロロメタン に溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（18.2 mL，13.1 ミリモル）、つ いでｐ- トルエンスルホニルクロリド（1.92 g，10.06 ミリモル）を固体として 攪拌しながら添加した。反応混合物を一夜冷蔵庫に保存した。ＴＬＣ分析は反応 がほぼ80％完了したことを示した。さらに、0.5 当量のトリエチルアミンおよび 0.5当量のｐ- トルエンスルホニルクロリドを加え、反応混合物を室温で一夜攪 拌した。反応混合物をセライトを通してろ過し、濃縮した。残留物を 300 mL の シリカゲル（５％トリエチルアミン含有ヘキサンでカラムに湿式充填）を用い、 ５％トリエチルアミン含有ヘキサン中 25-50-75 ％酢酸エチルついで５％トリエ チルアミン含有酢酸エチルで溶出させるフラッシュクロマトグラフィーによって 精製した。5.7 g（87％）の３が橙色の油状物として収集された。1Ｈ ＮＭＲ（ 300MHz，ＣＤＣl3）δ 7.75（d，2H），7.44-7.12（m，11H），6.78（d，4H）， 4.12-4.09（m，2H），3.73（s，6H），3.66-4.54（m，13H），3.22（t，J＝3.87 Hz，2H），2.41（s，3H）， テトラエチレングリコールモノトシレート（２ａ）：テトラエチレングリコー ル（200 mL，1.15モル）を 500 mL のピリジンに溶解し、０℃に冷却し 22.0 g （0.115 モル）のｐ- トルエンスルホニルクロリドで処理した。溶液が完成した ならば、反応混合物を冷蔵庫中に一夜放置し、ついで真空中で濃縮した。残留物 を800 mLのＥｔＯＡｃで希釈し、３×600 mLのＨ2Ｏにより抽出した。Ｈ2Ｏ分画 をＥｔＯＡｃで逆抽出し、ＥｔＯＡｃ分画を合わせて飽和Ｎａ2ＨＰＯ4水溶液で 抽出した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥し、濃縮すると、無色の油状物が得られ た。この油状物を 800 mL のシリカゲルを使用してフラッシュクロマトグラフィ ーに付し、ヘキサン中25％ＥｔＯＡｃ-50 ％ＥｔＯＡｃ，ついでＥｔＯＡｃ，つ いでＥｔＯＡｃ中10％ＭｅＯＨ-20 ％ＭｅＯＨで溶出して精製すると 23.7 g（6 0％）の純粋な生成物および微量の不純物含有生成物（11％）が得られた。２ａ ：1Ｈ ＮＭＲ（300 MHz，ＣＤＣl3）δ 7.77（d，J＝8.1 Hz，2H），7.32（d， J＝8.1 Hz，2H），4.13（t，J＝4.8 Hz，2H），3.68-3.53（m，14H），2.58（t ，J＝5.6 Hz，1H），2.42（s，3H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 168 .2，158.3，144.8，135.9，133.8，132.0，129.9，128.0，127.7，126.6，123.1 ，113.0，85.9，73.0，70.6，70.4，70.0，69.7，67.8，64.4，55.1，37.1;低分 解ＭＳ m/eＣ15Ｈ24Ｏ8Ｓ（Ｍ＋１）として 349.1. テトラエチレングリコールモノフタルイミド（３ａ）：400 mLの無水ＤＭＦ中 31.96 g（0.092 モル）の２ａの溶液を攪拌しながら、これに 14.2g（1.05当量 ）のフタルイミドおよび 14.4mL（1.05当量）の1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウン デカ-7- エンを加えた。この溶液を70℃に18時間加熱し、真空中において濃縮し た。粗製の黄色油状物を 1600 mLのシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラ フィーに付し、ヘキサン中25％ＥｔＯＡｃ-50 ％ＥｔＯＡｃ，ＥｔＯＡｃ，つい でＥｔＯＡｃ中10％ＭｅＯＨ-20 ％ＭｅＯＨで溶出して精製すると、23.8 g（80 ％）の３ａが油状物として得られた。放置すると３ａは蝋状の白色固体となった 。1Ｈ ＮＭＲ（300 MHz，ＣＤＣl3）δ 7.84-7.78（m，2H），7.70-7.66（m，2 H），3.86（t，J＝5.6 Hz，2H），3.70（t，J＝5.6 Hz，2H），3.64-3.51（m，1 2H），2.67（bs，1H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 168.2，133.8，1 32.0，123.1，72.4，70.5，70.4，70.2，70.0，67.8，61.6，37.2． 化合物４ａの合成：150 mLのＴＨＦおよび 15 mLのＤＭＦ中 15 g（0.0464 モ ル）の３ａの溶液をＡr 下に０℃に冷却した。この溶液にアリルブロミド(6.0mL , 1.5当量）、ついで1.76 g（1.5 当量）のＮａＨを固体として加えた。不透明な 黄色の懸濁液を０℃で30分間ついで室温で18時間攪拌した。50〜100 mLのＭｅＯ Ｈを加えて濃縮しついで混合物を真空中で濃縮した。粗製の物質を 1500 mLのシ リカゲルを用いフラッシュクロマトグラフィーに付し、ヘキサン中25％ＥｔＯＡ ｃ-50 ％ＥｔＯＡｃ-75 ％ＥｔＯＡｃついでＥｔＯＡｃついでＥｔＯＡｃ中10％ ＭｅＯＨで溶出すると、11.05 g（65％）の４ａが黄色油状物として得られた。1 Ｈ ＮＭＲ（300 MHz，ＣＤＣl3）δ 7.84-7.80（m，2H），7.72-7.67(m，2H)5. 94-5.84（m，1H），5.28-5.14（m，2H），3.99（d，J＝5.61 Hz，2H），3.88(t ，J＝5.85 Hz，2H)，3.72（t，J＝5.76 Hz，2H），3.64-3.54(m，13H)；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 168.2，134.6，133.7，131.9，123.0，116.9，7 2.0，70.4，69.9，69.2，67.7，37.0． ( Ｓ)-( ＋)-2,2-ジメチル-1,3- ジオキソラニル-4- イルメチル（ジメトキシ トリチル）テトラエチレングリコール（５） ：焔で乾燥したフラスコに水素化ナ トリウム（0.56 g，23.5ミリモル）を秤量し、70 mL の無水テトラヒドロフラン および 15 mLの無水Ｎ，Ｎ- ジメチルホルムアミドを加えた。この懸濁液をアル ゴン下０℃に冷却し、シリンジを介して(Ｓ)- (＋)-2,2-ジメチル-1,3- ジオキ ソラン-4- メタノール（2.7 mL，21.7ミリモル）を滴下して加えた。０℃で30分 間攪拌したのち、15 mL のテトラヒドロフラン中化合物３（11.7 g，18.1ミリモ ル）を滴下ろ斗を通して滴下して加えた。反応混合物を室温で一夜攪拌し、100 mLの飽和炭酸水素ナトリウムで反応を停止させ、300 mLのジエチルエーテルで希 釈した。層を分離し、エーテル層を 300 mL の水で３回抽出した。エーテル層を 硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。残留物を 500 mL のシリカゲルを用いて フラッシュクロマトグラフィーに付し、最初にヘキサン、ついでヘキサン中 10- 20-30-40-50-75％酢酸エチル、ついで酢酸エチルで溶出して精製した。8.93 g（ 82％）の５が無色の油状物として収集された。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）δ 7.46 -7.43（m，2H），7.34-7.17（m，7H），6.78（d，4H），4.23（pentet，J＝6.1H z,1H），4.00（t，8.2H），3.75（s，6H），3.71-3.60(m，15H)，3.53（dd,J＝1 0.0，5.7 Hz，1H），3.52(10.4，J＝5.2 Hz,1H)，1.39（s，3H），1.33（s，3H ）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 158.24，144.97，136.2 0，129.93，128.07，127.61，126.51，112.89，109.21，85.77，74.57，72.20， 70.82，70.59，70.40，69.68，66.67，63.01，55.04，26.67，25.29; 低分解Ｍ Ｓ m/eＣ35Ｈ50Ｏ9Ｎ（Ｍ＋ＮＨ4 +）として計算値 628.399，分析値 628.5. ( Ｓ)-( ＋)-2,2-ジメチル-1,3- ジオキソラニル-4- イルメチルテトラエチレ ングリコール（６） ：100 mLの 80 ％酢酸を０℃に冷却し、ついで化合物５（6. 6 g，10.8ミリモル）を加えた。澄明な橙色の溶液を０℃で１時間攪拌した。メ タノール（100 mL）を加え、反応混合物を真空中低い温度（＜30℃）で濃縮した 。残留物を 200 mL のシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーに付し 、最初に酢酸エチル、ついで酢酸エチル中 5-10-15-20 ％メタノールで溶出して 精製した。2.5 g（74％）の６が無色油状物として収集された。1Ｈ ＮＭＲ（Ｃ ＤＣl3）δ4.21（pentet，J＝6.2 Hz，1H)，4.08（dd，J＝5.9，4.8 Hz，1H）， 3.82-3.35（m，19H），2.93（br s，1H），1.34（s，3H），1.28（s，3H）；13 Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 109.20，74.50，72.42，72.14，70.76，70. 39，70.32，70.14，66.63，61.48，26.61，25.23;低分解能ＭＳ m/e Ｃ35Ｈ50Ｏ9 Ｎ（Ｍ＋ＮＨ4 +）として計算値 628.399，分析値 628.5. ( Ｓ)-( ＋)-2,2-ジメチル-1,3- ジオキソラニル-4- イルメチル（フタルイミ ド）テトラエチレングリコール（８） ：アルコール６（4.06 g，13.2ミリモル） を無水ジクロロメタン 50 mLに溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（3. 7 mL，26.3ミリモル）、ついでｐ- トルエンスルホニルクロリド（3.26 g，17.1 ミリモル）を加えた。反応フラスコを乾燥管で保護し、反応混合物を一夜放置 して温度を室温まで上昇させた。反応混合物をセライトを通してろ過し、ろ液を 真空中で濃縮した。粗製の物質を 400 mL のシリカゲル上フラッシュクロマトグ ラフィーに付し、最初にヘキサン中10％酢酸エチル、ついで 20-40-60-80-100％ 酢酸エチル、ついで酢酸エチル中10％メタノールで溶出して精製した。中間体の トシレート 5.21 g（85％）が、金色の油状物として収集された。1Ｈ ＮＭＲ（ 400 MHz,ＣＤＣl3）δ7.79（d，J＝8.1 Hz,2H,トシル芳香族），7.32（d，J＝8. 1 Hz，2H，トシル芳香族），4.25（pentet，J＝6.0 Hz，1H），4.13（t，4.7H） ，4.02（dd，J＝8.12，6.4Hz，1H），3.71-3.40（m，18H），2.42（s，3H），1. 46（s，3H），1.34（s，3H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3） δ 144.74，133.1，129.76，127.91，109.8，74.63，72.27，70.89，70.68，70. 52，70.44，69.19，68.60，66.74，64.1，26.73，25.34，21.59;低分解ＭＳ m/e Ｃ21Ｈ38Ｏ9ＮＳ（Ｍ＋ＮＨ4 +）として計算値 480.364，分析値 480.2．この トシレート（5.2 g，11.24 ミリモル）を 60 mLの無水ジメチルホルムアミドに 溶解した。1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7- エン（1.7 mL，11.24 ミリ モル）、ついでフタルイミド（1.65 g，11.24 ミリモル）を加えた。反応混合物 を70℃に一夜加熱した。反応混合物を真空中で濃縮し、400 mLのシリカゲルを用 いてフラッシュクロマトグラフィーに付し、ヘキサン中50％酢酸エチルで溶出し て精製した。3.96 g（81％）の８が無色油状物として収集された。1Ｈ ＮＭＲ （300 MHz,ＣＤＣl3）δ 7.83-7.79（m，2H），7.72-7.68（m，2H），4.26（pen tet，J＝6.0 Hz,1H），4.03（dd，J＝8.2，6.5Hz，1H），3.88（t，J＝5.8 Hz， 1H ），3.74-3.44（m，18H），1.39(s，1H)，1.33（s，3H）；13Ｃ ＮＭＲ（7 5 MHz，ＣＤＣl3）δ 168.21，133.88，132.10，123.19，109.33，74.66，72.30 ，70.90，70.52，70.04，67.87，66.79，37.19，26.75，25.37;低分解ＭＳ m/e Ｃ22Ｈ35Ｏ8Ｎ2（Ｍ＋ＮＨ4 +）として計算値 455.288，分析値 455.2. 1- ジメトキシトリチル-3-(フタルイミドテトラエチレングリコリル)-sn- グリ セロール（９） ：反応図２に従い、化合物９を以下のように合成する。アセチル８ （5.16 g，11.8ミリモル）を無水メタノール 100 mL に溶解し、無水ｐ- トル エンスルホン酸（100 mg）を加えた。反応フラスコを乾燥管で保護し、反応混合 物を室温で 2.5時間攪拌し、ついで無水ピリジン 10 mLを加えて中和し、真空中 で濃縮し、無水ピリジンと共蒸発させた。得られたジオールをついで 150 mL の 無水ピリジンに溶解し、０℃に冷却した。4,4'- ジメトキシトリチルクロリド（ 4.39 g，13ミリモル）を固体として加えた。反応フラスコを乾燥管で保護し、反 応混合物を一夜放置して温度を室温に上昇させた。メタノール（50 mL）を加え 、反応混合物を真空中で濃縮した。粗製の物質を 700 mL のシリカゲル（ヘキサ ン中５％トリエチルアミンによりカラムに湿式充填）を用い、フラッシュクロマ トグラフィーに付し、最初にヘキサン中10％酢酸エチル（５％トリエチルアミン 含有）、ついで 20-40-60-80-100％酢酸エチル（５％トリエチルアミン含有） で溶出して精製した。6.98 g（82％）の９が淡黄色の油状物として収集された。1 Ｈ ＮＭＲ（300 MHz,ＣＤＣl3）δ 7.80（dd，J＝5.4，3.1 Hz，2H），7.68（ dd，J＝5.4，3.1 Hz，2H），7.42-7.14（m，9H，DMT），6.79（d，4H，DMT），3 .95（br m，1H），3.86（t，J＝5.9 Hz，1H），3.75（s，6H），3.70（t，J＝5. 6 Hz，1H），3.63-3.37（m，18H），3.16（m，2H），2.84（br d，1H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 168.15，158.32，144.79，135.95，133.82，132 .02，129.95，128.04，127.69，126.64，123.12，112.97，85.89，72.97，70.64 ，70.43，69.97，69.74，67.80，64.34，55.10，37.14; 低分解ＭＳ m/e Ｃ40 Ｈ49Ｏ10Ｎ2（Ｍ＋ＮＨ4 +）として計算値 717.398，分析値 715.5. 反応図３に従い、化合物９は以下の通り合成した。100 mLのアセトンおよび 1mL のＨ2Ｏ中４ａ(10.13 g，0.0279ミリモル)の溶液を攪拌しながらこれに 3.98g（ 1.22当量）のＮ- メチルモルホリンＮ- オキシドを加えた。この懸濁液に1.75mL （0.005 当量）の四酸化オスミウムを iＰr ＯＨ中 2.5％溶液として加えた。Ｏ sＯ4溶液の添加後には反応混合物は澄明な黄色を呈した。ＴＬＣ分析が４ａの完 全な変換を示したのち（約16時間）、反応混合物を 1.5 gの亜硫酸水素ナトリウ ムおよび 5.0 gのフロリジルで処理し、30分間攪拌した。懸濁液をフロリジルを 通してろ過し、ろ液を濃縮して油状物を得た。この粗生成物を、1.0 g の４ａか ら同様の方法で調製された他のバッチと合わせた。合わせたロットから 100mL部 のピリジンを用い２回共蒸発し、残留物を 300 mL のピリジンに溶解した。この 溶液を０℃に冷却し、4,4'- ジメトキシトリチルクロリド 10.89 g（1.05当量） を加えた。反応フラスコを乾燥管を挿入し、反応混合物を室温で16時間攪拌した 。この溶液を 50 mLのＭｅＯＨで処理し、水浴の温度を40℃以下に保持して真空 中で濃縮した。粗製の油状物を 1100 mLのシリカゲル（ヘキサン中３％トリエチ ルアミンを用いカラムに湿式充填）を用いフラッシュクロマトグラフィーに付し 、ヘキサン（すべて３％トリエチルアミン含有）中10-100％ＥｔＯＡｃ（すべて ３％トリエチルアミン含有）で溶出して精製すると、21.3 g（２工程後89％）の９ が黄色の油状物として得られた。1Ｈ ＮＭＲ（300 MHz,ＣＤＣl3）δ 7.80-7 .77（m．2H），7.66-7.64（m，2H），7.39-7.22（m，9H），7.20-6.76(m，4H)， 3.97（bs，1H），3.84（t，J＝5.97 Hz,2H），3.74（s，6H），3.68 （t，J＝5.7 Hz，2H），3.60-3.49（m，14H），3.13-2.76（m，2H），2.00（bs ，1H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 168.2，158.3，144.8，135.9，1 33.8，132.0，129.9，128.0，127.7，126.6，123.1，113.0，85.9，73.0，70.6 ，70.4，70.0，69.7，67.8，64.4，55.1，37.1;低分解ＭＳ m/e Ｃ40Ｈ45Ｏ10 Ｎ（Ｍ＋ＮＨ4 +）として717.5. 1- ジメトキシトリチル-3-(アミノテトラエチレングリコリル)-sn- グリセロー ル（10） ：反応図２に従い、化合物10を以下のように合成した。化合物９（5.2 g，7.2ミリモル）をＨ2Ｏ中40％メチルアミン 50 mLに取り、出発原料を可溶化 するために 10 mLのメタノールを加えた。反応混合物を50℃に５時間加熱し、つ いで真空中で濃縮し、トルエンと共蒸発させた。粗製の物質を 200 mLのシリカ ゲル上フラッシュクロマトグラフィーに付し、ジクロロメタン中15％メタノール 性アンモニアで溶出して精製した。3.94 g（96％）の10が淡黄色の油状物として 収集された。1Ｈ ＮＭＲ（300 MHz,ＣＤＣl3）δ 7.46-7.21（m，9H，DMT），6 .81（d，4H，DMT），4.00（m，1H），3.80（s，6H），3.70-3.49（重複 m，18H ），3.20（dd，J＝9.24 Hz，1H），3.12（dd，J＝9.21 Hz，1H），2.84-2.80（m ，3H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 158.30，144.82，136.01，129.9 5，128.04，127.66，126.61，112.95，85.85，73.46，72.85，70.55，70.45，69 .99，69.51，64.43，55.10，41.40; 低分解ＭＳ m/e Ｃ32Ｈ44Ｏ8Ｎ（Ｍ＋１+ ）として計算値 570.353，分析値 570.4. 反応図３に従い、化合物10は以下のように合成した。Ｈ2Ｏ中 40 ％メチルア ミン 50 mLに化合物９（5.2 g，7.2ミリモル）を取り、10 mL のメタノールを出 発原料を可溶化するために添加した。反応混合物を50℃に５時間加熱し、ついで 真空中で濃縮し、トルエンと共蒸発させた。粗製の物質を 200 mL のシリカゲル 上フラッシュクロマトグラフィーに付し、ジクロロメタン中15％メタノール性ア ンモニアで溶出して精製した。3.94 g（96％）の10が淡黄色の油状物として収集 された。1Ｈ ＮＭＲ（300 MHz，ＣＤＣl3）δ 7.46-7.21（m．9H，DMT），6.81 （d，4H，DMT），4.00（m，1H），3.80(s，6H)，3.70-3.49（重複 m,18H），3.2 0（dd，J＝9.24，5.49 Hz，1H），3.12（dd，J＝9.21，6.0 Hz,IH），2.84-2.80 （m，3H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 158.30，144.82，1 36.01，129.95，128.04，127.66，126.61，112.95，85.85，73.46，72.85，70.5 5，70.45，69.99，69.51，64.43，55.10，41.40;低分解ＭＳ m/e Ｃ32Ｈ44Ｏ8 Ｎ（Ｍ＋１+）として計算値 570.353，分析値 570.4. ＰＥＧ試薬12：10 mL のＤＭＦ中 0.24 g（0.41ミリモル）の10の溶液を攪拌 しながら、これに 2.08 g（0.4 ミリモル）のメトキシ- ＰＥＧ5000- ニトロフ ェニルカルボネート（Shearwater Polymers，Inc．）を加えた。混合物を70時間 攪拌し、次に真空中で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、有機相を 30 mL 部の 10％ＮａＯＨで３回洗浄した。100 mLのシリカゲル（５％Ｅt3Ｎ含有ジク ロロメタンを用い湿式充填）を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付しジク ロロメタン中20％メタノール性アンモニアで溶出して精製すると、1.97 g（85％ ）の12が白色固体として得られた。1Ｈ ＮＭＲ（300 MHz,ＣＤＣl3）δ 7.42-7 .39（d，2H，DMT），7.39-7.18（m，7H，DMT），6.79（m，4H，DMT），5.70（br m，1H），4.21（m，1H），3.97（m，1H），3.88（t，J＝4.4 Hz，1H），3.81（ s，6H，DMT），3.78-3.50（br m，〜500，PEG Hs），3.42-3.31（重複 ms），3. 35（s，PEG Me），3.16（m，2H），2.84（br d，4.2H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz ，ＣＤＣl3）δ 159.36，157.19，146.15，136.95，130.83，128.86，128.65，1 27.61，113.86，86.48，73.58，72.88，72.5-70.0（PEG 炭素），68.31，65.77 ，64.45，41.36，30.75（未帰属不純物）． ＰＥＧホスホロアミダイト試薬13：60 mL のＴＨＦ中 2.22 g（0.4ミリモル） の12の溶液を３Åモルキュラーシーブ上で攪拌しながら、これに 0.24 mL（1.39 ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンおよび 0.1 mL（0.44ミリモル）の 2- シアノエチルＮ，Ｎ- ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを添加した。 ５時間後、31Ｐ ＮＭＲは所望の生成物の形成ならびに加水分解したホスフィチ ル化試薬を示し、さらに0.05 mL（0.22ミリモル）の 2- シアノエチルＮ，Ｎ- ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを添加した。12時間後、0.07 mL（0.4 ミリモル）のＤＩＰＥＡおよび 0.1 mL のクロロホスホロアミダイトを加えた 。混合物を２日間攪拌し、セライトを通してろ過し、真空中で濃縮した。残留物 を数回エーテルと磨砕した。31Ｐ ＮＭＲ：δ 156.4，155.8。δ 20.6，19.8に もシグナルが観察され、加水分解されたホスフィチル化試薬に相当するものと思 われた。 ＰＥＧ Ｈ- ホスホネート試薬14：10 mL のＭｅＣＮ中無水イミダゾール（0. 4 g; 5.9ミリモル）溶液を０℃で攪拌しながら、これに 0.17 mL（1.9 ミリモル ）のＰＣl3、ついで 0.86 mL（6.2 ミリモル）のＥt3Ｎを添加した。この混合物 に、12 mL のＭｅＣＮ中 3.0 g（0.55ミリモル）の12の溶液を滴下して加えた。 反応混合物を放置して温度を室温まで上昇させ、16時間攪拌し、10 mL の 0.1Ｍ トリエチルアンモニウム重炭酸塩で処理し、真空中で濃縮した。トリエチルアミ ンついでトルエンを粗製の残留物から共蒸発させ、ついで生成物をジクロロメタ ンに溶解した。有機相を 1.0Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ＴＥＡＢ）溶 液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。300 mLのシリカゲル（ヘキ サン/ Ｅt3Ｎ 95:5 で湿式充填）上フラッシュクロマトグラフィーに付し、ジク ロロメタン中 2-4-6-8-10-12-15 ％メタノール性アンモニアで溶出して精製する と、1.95 gの生成物が白色固体として得られた。31Ｐ ＮＭＲ：δ 10.3，10.2 ． 脂質ホスホロアミダイト17の合成：ピリジン 10 mL中 540 mg（１ミリモル） の 1,2- ジ- Ｏ- パルミチル rac- グリセロールの溶液を 195 mg（1.2 ミリモ ル）のカルボニルジイミダゾールで処理し、得られた混合物を室温で一夜攪拌し た。この混合物に 570 mg（１ミリモル）のアミノアルコールを 3 m LのＤＭＦ 中溶液として添加した。混合物を一夜40℃に加温したのち、反応混合物からのア リコートの1Ｈ ＮＭＲ分析を行ったところ生成物の形成は無視できる程度であ った。混合物を80℃に６時間加熱し（1Ｈ ＮＭＲによれば生成物：出発原料は 約1:1）、ついで真空中で濃縮した。粗製の残留物を 125 mL のＳiＯ2ゲル（ヘ キサン中で充填）カラムに適用し、ヘキサン（２％ＴＥＡ含有）中 20-50％Ｅｔ ＯＡｃの勾配で生成物を溶出すると、500 mg（44％）の中間体16が透明の蝋状物 として得られた。16：1Ｈ ＮＭＲ（300 MHz,ＣＤＣl3）δ 7.42(d,J＝7.2Hz,2H )，7.30-7.18（m．7H），6.76（d，J＝8.2 Hz，4H），5.34(br t,1H)，4.20-3.2 5（重複シグナル），3.16（m，2H），1.53（m），1.24（m），0.86(t，J＝6.5 H z，6H)．アルコール16（500 mg，0.44ミリモル）を 4 mL の ＣＨ2Ｃl2ならびに 0.1 5mL（２当量）のＤＩＰＥＡに溶解した。この溶液に0.15 mL（0.66ミリモル ）の 2- シアノエチル（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ） クロロホスホロアミダイトを添加した。３時間後、ＴＬＣは２スポットへの変換 を示し、混合物をＣＨ2Ｃl2で希釈し、ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄した。有機相をＮ ａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮した。粗製の残留物を 50 mLのＳiＯ2ゲルカラム（ヘ キサン中で充填）に適用し、生成物をヘキサン（２％ＴＥＡ含有）中20％ＥｔＯ Ａｃで溶出し、350 mg（59％）のホスホロアミダイト17を透明の蝋状物として得 た。31 Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）δ 151.55，151.08． 脂質- オリゴの自動合成：ホスホロアミダイト17を、Ｔ-3マー（ＡＢＩ394 型 装置で標準自動ＤＮＡ合成により調製）の 5'-末端にＭｅＣＮ中40％ＴＨＦ中 0 .1 Ｍの17溶液のカラムへの各30分２回暴露からなる改良カップリングサイクル を用いて結合させた。平行トリチル分析はアミダイト17について94％のカップリ ング効率を示した。 クロロホルメート19：トルエン 60 mL中 3 g（5.03ミリモル）の 1,2- ジ- Ｏ - オクタデシル-sn-グリセロール21の溶液を攪拌しながら、これに 1.93 Ｍホス ゲン溶液 20 mlを加えた。アルコール出発原料の残留が認められなくなるまで（ 濃縮アリコートの1Ｈ ＮＭＲ分析）ホスゲン溶液を追加した（２ ×10mL;総ホ スゲン量 15.4 当量）。過剰のホスゲンおよびＨＣｌをアスピレーターで除去し たのち反応混合物を真空中で濃縮すると、3.3 g（98％）の所望のクロロホルメ ート19が白色の粉末として得られた。1Ｈ ＮＭＲ（300 MHz,ＣＤＣl3）δ 4.45 （dd，J＝11.22，3.69 Hz，1H），4.34（dd，J＝11.22，6.15Hz，1H），3.65（m ，1H），3.56-3.40（m，6H），1.53（m，4H），1.24（m，62H），0.87（t，J＝6 .36 Hz，6H）；13Ｃ ＮＭＲ（75 MHz，ＣＤＣl3）δ 75.90，71.91，71.35，70 .93，69.36，31.99，29.96-29.44（炭化水素鎖からの重複シグナル），26.13，2 6.04，22.76，14.18. 接合体20：60 mL のピリジン中 2.25 g（3.95ミリモル）の10の溶液を攪拌し ながら、これに 2.6 gのジステアリルグリセロールクロロホルメート18を添加し た。２時間後の濃縮アリコートの1Ｈ ＮＭＲ分析により、クロロホルメートの 残留は認められなかったので、混合物を真空中で濃縮した。この粗製の残留物を 、0.5 g（0.88ミリモル）の10および 0.58 g のクロロホルメートから同様 にして調製した生成物と合わせ、合わせたロットを 100 mL のシリカゲル（２％ トリエチルアミン含有ヘキサン中で充填）上フラッシュシリカゲルクロマトグラ フィーに付し、200 mLのヘキサン、ついでそれぞれ 250 mL のヘキサン中 10-20 および30％ＥｔＯＡｃ、500 mLのヘキサン中40％ＥｔＯＡｃ、ついでそれぞれ 2 50 mL のヘキサン中50-60-70および80％ＥｔＯＡｃで溶出して精製した。生成物 を含有する分画を濃縮すると 3.3 g（57％）の接合体20が得られた。 ホスホロアミダイト21：25 mL のＣＨ2Ｃl2中 3.8 g（3.26ミリモル）の接合 体の溶液を攪拌しながら、これに 1.14 mL（6.52ミリモル）のジイソプロピルエ チルアミン、ついで 1.09 mL（4.88ミリモル）の 2- シアノエチルＮ，Ｎ-ジイ ソプロピルクロロホスホロアミダイトを添加した。２時間後、混合物をＣＨ2Ｃl2 で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮した。 粗製の残留物を 125 mL のシリカゲルカラム（２％トリエチルアミン含有ヘキサ ン中で充填）上フラッシュクロマトグラフィーに付し、100 mLのヘキサン、つい でそれぞれ 250 mL のヘキサン中 10 および20％ＥｔＯＡｃ、500 mLのヘキサン 中30％ＥｔＯＡｃ、ついで 250 mL のヘキサン中50％ＥｔＯＡｃで溶出して精製 した。生成物を含有する分画を濃縮すると 4.2 g（95％）のホスホロアミダイト21 が得られた。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣl3）δ 151.52，151.08. 実施例２．ＰＥＧ接合およびコレステロール誘導体化核酸リガンドの調製およ び機能的性質 核酸リガンドのＰＥＧ3400接合体は非接合分子の結合親和性を維持する ｂＦＧＦリガンド／ＰＥＧ-3400 接合体のｂＦＧＦに対する結合能を調べた。 分子 225t3（配列番号：10）、すなわちｂＦＧＦに対する高親和性ＤＮＡリガン ドを一級アミン- ＮＨＳカップリング反応を介するＰＥＧとの接合に選択した。 リガンド225t3 は１ｎＭの結合親和性を有し、Ｔm 68℃おいてブラント末端ヘア ピンにフォールディングする。リガンド225t3 は、3'- アミノ修飾剤Ｃ7 ＣＰＧ （Glen Research，Sterling，VA）により標準ＤＮＡ合成法を使用して修飾し、2 25t3 Ｎ（配列番号：11）と呼ぶ。225t3 ＮはｐＨ8.5に緩衝化した20％（v/v） ジメトキシホルムアミド、80％（v/v）0.5 Ｍ炭酸水素ナトリウム中ＰＥＧ（平 均分子量 3400）のＮ- ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化エステル と反応させた。得られた接合体、225t3 Ｎ- ＰＥＧ-3400（配列番号：14）は12 ％ポリアクリルアミド/7Ｍ尿素ゲル上遊離のＤＮＡから精製した。接合体は32Ｐ で 5'-末端を標識し、結合アッセイを行った。225t3 Ｎ- ＰＥＧ-3400（配列番 号：14）は 225t3と同じ親和性（Ｋd＝１ｎＭ）でｂＦＧＦに結合した。 トロンビンＤＮＡリガンドへのＰＥＧ-20,000 の接合 アミノとジスルフィド官能基を有するトロンビンＤＮＡリガンドＮＸ256（配 列番号：９）（図１Ｄ）は標準ＤＮＡ合成法、ならびに dT-5'-LCAA-500 Å制御 多孔性ガラス固体支持体および市販のホスホロアミダイト試薬による Biosearch 8909ＤＮＡ/ＲＮＡシンセサイザー上での操作を用いて調製した。脱保護に続い てイオン交換ＨＰＬＣ精製を行った。5'- 末端ジスルフィド結合は、ＤＮＡを50 ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液中37℃で30分間インキュベートすると減 少した。還元ＤＮＡ（5'- 末端チオールを含む）を Nap-5サイズ排除カラムに通 して、ＤＮＡを含むがＤＴＴを含まない空隙容量を、アルゴン層下にマレイミド 誘導体化ＰＥＧを含有する反応容器中に集めた。溶液はすべてアルゴンで洗浄し 酸素を除去した。反応混合物を40℃に１時間保持した。反応の進行は、少量のア リコートを採取し、８％／７Ｍ尿素ポリアクリルアミド上電気泳動により分析し てモニターした。１時間のインキュベーションの終了後、反応はほぼ完了し、こ の時点で反応混合物に等容のメチレンクロリドを加え乳状の白色懸濁液が形成さ れるまで容器を振盪した。混合物をエッペンドルフ遠心分離器により 14,000rpm で層が分離するまで遠心分離した。遊離の核酸リガンドを含む水層は捨てた。生 成物（ＰＥＧ-20,000 修飾ＤＮＡリガンドＮＸ256 、ＮＸ256-ＰＥＧ-20,000 と 呼ぶ。配列番号：13）（図１Ｇ）はイオン交換クロマトグラフィーついで逆相脱 塩を用いてさらに精製し、凍結乾燥して白色の粉末を得た。この物質はＤＮＡ核 酸リガンドの薬物動態学的挙動に対するＰＥＧ修飾の効果の測定に用いた（下記 参照）。ＰＥＧ-10,000 修飾リガンドＮＸ256（ＮＸ256-ＰＥＧ-10,000 と呼ぶ ）も同様に調製された。 ＰＥＧ接合体のＴm 値 ＰＥＧの機能性はチオホスフェート- マレイミド反応によっても導入すること ができる。本発明者らは、トロンビンＤＮＡリガンドの 5'-末端に、チオホスフ ェート基を、標準ホスホロアミダイト法によって、市販の試薬を用いて導入した （このリガンドはＴ- Ｐ４と呼ぶ）（図１Ｆ，配列番号：12）。マレイミドを含 有するＰＥＧへの接合は上記スルフヒドリル- マレイミド反応の場合と同様であ る。ＰＥＧ接合リガンドはＴ- Ｐ4-ＰＥＧ-10,000 およびＴ- Ｐ4-ＰＥＧ-20,00 0（配列番号：15）と呼ぶ。Ｔ- Ｐ4-ＰＥＧ-10,000，Ｔ- Ｐ4-ＰＥＧ-20,000 お よびＴ- Ｐ4-ＤＮＡの融点（Ｔm）は最初の誘導体の 260 nm における吸光度対 温度プロットから決定された。Ｔ- Ｐ4-ＰＥＧ-10,000，Ｔ- Ｐ4-ＰＥＧ-20,000 およびＴ- Ｐ6のＴm 値は３つのリガンドすべて40℃であった。これらのデータ および上述のｂＦＧＦ- ＰＥＧ-3400 リガンド結合データは、ＰＥＧへの接合が 核酸リガンドの構造に影響しないことを示唆している。 コレステリル化ｂＦＧＦ- リガンドは非コレステリル化分子の結合親和性を維 持する コレステロールは、標準固相ホスホロアミダイト法により、核酸リガンドの配 列中の任意の位置に導入することができる。たとえば、本発明者らは、リガンド 225t3（図１Ｅ；配列番号：10）の 3' 末端にテトラエチレングリコールコレス テロールホスホロアミダイト（Glen Research，Sterling，VA）を導入してリガ ンド 225t3- コレステロールを作成した。12％ポリアクリルアミド／7 Ｍ尿素ゲ ル上で精製したのち、225t3-コレステロールは32Ｐで 5'-末端を標識し、結合ア ッセイを実施した。225t3-Ｃhol の結合親和性は 225t3の値（Ｋd＝１ｎＭ）と 同じであった。 実施例３ 核酸リガンド- リポソーム製剤および抗凝固活性 Ａ．ＮＸ232 リポソームの調製 フルオレセイン- 標識、コレステロール誘導体化ＮＸ232（図１Ｂ；配列番号 ：７）を主としてジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびコレ ステロール（Ｃhol）2:1 のモル比からなるリポソームに導入した。 ＤＳＰＣ: Ｃhol（2:1 モル比）を含有するＮＸ232 リポソームの８種の製剤 を調製した。ＮＸ232 のモル百分率は存在する総脂質に対して 0.01 〜0.1 モル ％で変動させた。組成（Ａ〜Ｈ）は表１に示す。製剤Ｄ〜Ｈでは、陽イオン性の 脂質1,2-ジオレイル-3- トリメチルアンモニウム- プロパン（ＤＯＴＡＰ）の分 画を増大させて、ＮＸ232 とリポソーム表面の間の結合の強度に対する陽性電荷 の影響を評価した。 脂質およびＮＸ232 はクロロホルム、メタノール、水（ＣＨＣl3：ＭｅＯＨ： Ｈ2Ｏ，1:1:1，v:v:v）の混合物中に共可溶化して試験管に移した。脂質フィル ムは窒素気流下に溶媒を蒸発させて形成させた。乾燥脂質フィルムは、水和まで 真空下に保存した。フィルムは、10ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ ン（ＴＲＩＳ）および 1ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有９％スク ロース（約250 ｍＭ）水溶液（ｐＨ 7.4）によって65℃で水和した。水和後、脂 質はプローブ型ソニケーターを用いて約６〜９分間超音波処理し、ついで室温に 冷却した。 導入されなかったＮＸ232（図１Ｂ；配列番号：７）は、Sephacryl S-300 を 用いてＦＰＬＣゲル透過クロマトグラフィーにより、上述のスクロース水和溶液 で溶出して除去した。空のリポソーム（Ｅmpty）、4.7 μg ＮＸ232 含有リポソ ーム（Ｌ- ＮｅＸ２ａ）、11.8μg ＮＸ232 含有リポソーム（Ｌ- ＮｅＸ２ｂ） 、72μg の遊離ＮＸ232（Ｆree 72μg）、7.2 μg の遊離ＮＸ232（Ｆree 7.2 μg）および超音波処理した 10 μg の遊離ＮＸ232（Ｆree/soni 10 μg）のゲ ル透過クロマトグラムを図２に示す。これらのクロマトグラムは遊離ＮＸ232 と リポソームの良好な分離が可能であることを示している。72μg の遊離ＮＸ232 のクロマトグラムはリポソームの後に明瞭なピーク（約53分の溶出ピーク）を示 すが、254 nmにおけるＵＶ吸収によって可視化するためには 72 μg の遊離核酸 リガンドを添加しなければならなかった。7.2 μg の遊離ＮＸ232 では類似のピ ークは識別できない。したがって、リポソーム製剤に関しては、ＮＸ232 量（「 ａ」については 4.7μg および「ｂ」については 11.8 μg）はクロマトグラム に明瞭なピークを示すためには十分でななかった。 254 nmにおける吸収の測定によれば、ＮＸ232 はこれらのリポソームにほぼ定 量的に導入された。約50％程度のＮＸ232 しかフルオレセイン標識されなかった ので、定量的な導入はフルオレセイン標識の存在がＮＸ232 のリポソームとの結 合に有意な影響は与えないことを示唆している。 Ｂ．凝血阻害のインビトロアッセイ ＮＸ232（図１Ｂ；配列番号：７）はトロンビンに対して親和性の高い核酸リ ガンドのＤＮＡ配列を含有する。トロンビンは血液凝固カスケードの重要な成分 である。トロンビンのタンパク分解活性の阻害は血液の凝固能力を低下させるこ とが知られている。各種ＮＸ232 製剤の活性を、抗凝固活性を測定するフィブリ ン／トロンビン凝血アッセイを用い評価した。アッセイには、50ｍＭ ＴＲＩＳ ，100 ｍＭ ＮａＣl，１ｍＭ ＭｇＣl2、および 0.1％ポリエチレングリコー ル（ＰＥＧ8000）（ＭＷ 8,000），ｐＨ7.4 の緩衝溶液を使用した。最終 300μ l のアッセイ混合物では、ガラス試験管に 2.5 mg/ml濃度のフィブリノーゲンお よ び１国立保健研究所（ＮＩＨ）単位のトロンビンを加えた。凝血の測定ではすべ ての溶液および容器を37℃に加温または維持した。凝固時間を表２に示す。 これらの結果は超音波処理、可溶化、加熱および乾燥を含む典型的なリポソー ム処理条件はＮＸ232 の抗凝血活性に影響しないことを示している。さらにリポ ソームの結合はＮＸ232 のその標的に対する結合および阻害に影響しない。 実施例４．コレステロール、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール およびＰＥＧ修飾ＤＮＡの薬物動態学的性質 トロンビンＤＮＡリガンドＮＸ229，ＮＸ232，ＮＸ253，ＮＸ253 ＋リポソー ムおよびＮＸ256-ＰＥＧ20Ｋの薬物動態学的性質を測定した（分子構造について は図１Ａ〜１Ｃ，１Ｇ参照）（配列番号：６〜８，13）。各オリゴヌクレオチド は260 nmにおけるＵＶ吸収および吸光係数 0.033μg オリゴ/ml に基づいて0.5 〜1.0 mg/ml の溶液濃度でＰＢＳに希釈した。１つを除く全試験で、６匹のラッ トに 0.5〜1.0 mgオリゴヌクレオチド/kg 動物体重を投与し、血漿サンプルを１ 〜４時間の様々な時点で採取した。１匹のラットはＮＸ253 を試験する実験に使 用した。血漿サンプルおよび品質管理サンプルはハイブリダイゼーションアッセ イを用いて分析した。ハイブリダイゼーションアッセイには、酸化鉄（Ｆe Ｏ） ビーズに接合したＤＮＡリガンドの 5'-末端に相補性の配列を含有する捕捉オリ ゴヌクレオチド［Ｆe Ｏ- スペーサ-5'-ｄ（ＧＴＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＣＣ-3'）（配列番号：１），スペーサ＝（ｄＴ）8］および 3'-末端にビオチ ン基を含有する検出オリゴヌクレオチド［5'- ｄ（ＣＣＣ ＣＡＣ ＴＧＡ Ａ ＧＣ ＡＣＣ- スペーサ-3'-ビオチン- ビオチン），スペーサ＝（ｄＴ）10］（ 配列番号：２）を使用した。ビーズに結合するビオチンオリゴヌクレオチドの量 はルミネセント基質として CSPD-Sapphireを用いストラプトアビジン連結アルカ リホスファターゼで定量した。 ＮＸ229，ＮＸ232，ＮＸ253，ＮＸ253 ＋リポソームおよびＮＸ256-ＰＥＧ20 Ｋ（配列番号：６〜８，13）の血漿濃度の１回注射後の時間の関数としてのデー タを図３にまとめる。時間の関数としてのＮＸ232，ＮＸ253，ＮＸ253 ＋リポソ ームおよびＮＸ256-ＰＥＧ20Ｋの血漿濃度はＮＸ229（配列番号：６）の場合に 比較してかなり大きかった。これらのオリゴヌクレオチドはすべて、同一のトロ ンビン結合モジュール［ｄ（ＣＡＧ ＴＣＣ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＧＧ）］（配列番号：３）を共 有する。時間の関数としてのオリゴヌクレオチドの血漿濃度は、オリゴヌクレオ チドへの適当な官能基の導入によって有意に増大させることができる。コレステ ロール含有オリゴヌクレオチドの対照（非コレステロール含有）オリゴヌクレオ チドに比較した血漿半減期の延長は以前に観察されている（de Smidtら，Nucl.A cids Res.，19: 4695，1991）。 ＮＸ213（分子構造は図１参照）の基本配列に様々な官能基が結合した広範囲 の核酸リガンド、ならびにこれらのオリゴヌクレオチドのリポソーム製剤の一部 の血漿薬物動態学的性質を評価した。これらのデータは図４にまとめる（配列番 号：16，19，21，22および29）。クリアランスの速度が最も遅い製剤はＮＸ213 （図１Ｐ；配列番号：21）がリポソームに封入された製剤であった。 ジアルキルグリセロールＤＮＡ接合体＋および−リポソーム役割を決定するた めに、ＰＫ試験77および73をトロンビンＤＮＡリガンドジアルキルグリセロール 接合体（分子構造については図１参照）について実施した。データは図５にまと める（配列番号：18）。 コレステリル化ＶＥＧＦオリゴヌクレオチドＮＸ213（ＮＸ268）（分子構造は 図１Ｋ参照；配列番号：16）はＰＥＧ- リポソームまたは標準リポソームによっ て製剤化し、薬物動態を評価した（ＰＫ85-86）。これらの製剤はオリゴヌクレ オチドをリポソームの内側および外側両者に含有する。図６（配列番号：16）は 注射後の時間の関数としての完全長オリゴヌクレオチドのラット血漿レベルを示 す。両リポソーム製剤とも類似のオリゴヌクレオチド薬物動態を示す。 クリアランスに対するサイズ依存性を評価するために、様々なＰＥＧ接合体を 有する2'Ｏ- メチルＶＥＧＦオリゴヌクレオチドを試験した（分子構造について は図１参照）（ＰＫ50，80，87 & 88）。図７はすべての2'Ｏ- メチルオリゴヌ クレオチド＋ＰＥＧ40Ｋ，20Ｋ，10ＫならびにＰＥＧの不存在（配列番号：17お よび29）の比較を示す。これらのデータは、ＰＥＧ接合体のサイズが増大すると ともに、血漿クリアランスは有意に遅延することを証明する。 ＰＫ96は、2'Ｏ- メチルプリンならびにＰＥＧ20Ｋと接合した 2’Ｆピリミジ ン（ＪＷ1130）の薬物動態を評価するために実施された（分子構造については、 図１Ｒ参照；配列番号：23）。図８にはこのオリゴヌクレオチドの血漿レベルの 全2'Ｏ- メチルバージョン（ＰＫ80，ＪＷ986）との比較を示す（分子構造につ いては図１Ｘ参照；配列番号：29）。これらのデータは両オリゴヌクレオチドの かなり類似したクリアランス性を示す。 2'Ｆピリミジン含有ＪＷ1130（配列番号：23）がＪＷ986（2'Ｏ- メチルピリ ミジン）と類似のクリアランスを示すという観察は2'Ｆピリミジンを有するオリ ゴヌクレオチドがヌクレアーゼ消化に抵抗性であることを示唆する。 ＰＫ97は40ＫＰＥＧと接合したＬ- セレクチンＤＮＡリガンド（ＮＸ287）（ 図１Ｓ；配列番号：24）のクリアランス性を測定するために実施した。図９は１ 回注射（用量１mg/kg）後の時間の関数としてのこのオリゴヌクレオチドの血漿 レベルを示す。比較のために、20Ｋ ＰＥＧと接合したトロンビンＤＮＡリガン ド（ＮＸ256）（図１Ｈ；配列番号：13）を包含させた。図９に示すように、こ れらの２つのオリゴヌクレオチドは類似のクリアランスを示し、これは代謝によ るものと考えられる。 ＰＫ試験99，100 および 102はオリゴヌクレオチドのインビボ安定性を評価す るさらに大きな試験の一部として行われた。これらの試験は図10に示す。比較の ためＰＫ96（JＷ1130ＶＥＧＦ）2'Ｆ Ｐy 2'Ｏ- Ｍet（14Ｐu）＋ＰＥＧ20Ｋ（ 図１Ｒ：配列番号：23）も包含させる。ＰＫ試験96，100 および 102に用いたオ リゴヌクレオチドは、2'デオキシヌクレオチドを含有するプリン位置の数のみが 相違し、ＰＫ96は 2’デオキシプリンを含まず、ＰＫI00 は４個の 2’デオキシ プリンを含み、ＰＫ102 では14個のプリンがすべて 2’デオキシである。図10（ 配列番号：23，25，26，27および30）は、クリアランス速度の上昇とオリゴヌク レオチド中のデオキシヌクレオチドの数の間の明瞭な関係を証明するものである 。デオキシヌクレオチドの数の増加とともにこの観察されたクリアランス速度の 上昇はこれらのオリゴヌクレオチドの代謝の増大による可能性が考えられる。４ 個の 2’デオキシプリンを含むＰＫ100 で示された高レベルの安定性という有望 な観察は、多数のプリンが修飾できるならばセレックス後修飾が適当であること を示唆している。図10にはまたＰＥＧ20Ｋ接合の異なるＰＫ99およびＰＫ100 が 示されている。他のオリゴヌクレオチドで以前に認められているように、大きな 分子量のＰＥＧ分子の接合は観察された血漿からのクリアランス速度を劇的に低 下させる。 実施例５．陽イオン性リポソーム- 核酸リガンド複合体：毒性およびヒトリン パ球によるその細胞内取り込み 毒性：リポソーム- 核酸リガンドの細胞に対する毒性作用を測定するためヒト 一次末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を核酸リガンド単独、２種類のリポソーム単独、 ならびに２種類のリポソーム- 核酸リガンドの組合せで処置した（下記参照）。 ２つのタイプの異なるリポソーム、タイプ１［＝ジオレオイルホスファチジルエ タノールアミン（ＤＯＰＥ）：アミノマンノースコレステロール，1:1 重量比］ およびタイプ２［＝ＤＯＰＥ：アミノマンノースコレステロール：ＤＯＴＡＰ， 1:1.5:1 重量比］をこの試験に用いた。リポソームはＨＩＶ- １逆転写酵素と約 １〜５ｎＭのＫdで結合する一本鎖標準ＤＮＡセレックスリガンドＲＴ1t49ＰＳ ［5'- ｄ(ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＴＴ ＡＧＣ ＧＡＴ ＡＣＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＡＴ ＡＡＡ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＧＡ ＡＣＴ ＴＧＧ Ａs Ｔ s Ｔs Ｔs Ｔ)-3'（配列番号：４）；小文字のｓはホスホロチオエート結合を示 す］と 5:1（リポソーム：核酸リガンド、重量比）に混合した。陽イオン性リポ ソーム- 核酸リガンド複合体はリポソームおよびタイプ１またはタイプ２リポソ ームをＲＴ1t49ＰＳと65℃で10分間インキュベートして形成させた。 ＰＢＬ（フィトヘマグルチニンおよび天然のＩＬ−２刺激）は96- ウエルプレ ートの各ウエルあたり 2×105細胞の密度でプレーティングした。細胞は日０に 核酸リガンド単独、２種類のリポソーム単独、または２種類のリポソーム- 核酸 リガンド複合体で処置し、分裂させ、日４に再処置した。生存細胞は日７に計数 した。各処置群についての生存細胞の百分率を以下にまとめる。 処置 ％生存率 細胞単独 85 30μg/mlＲＴ1t49ＰＳ 82 リポソームタイプ１（150 μg/ml） 85 リポソームタイプ２（150 μg/ml） 63 リポソームタイプ１（150 μg/ml）＋ＲＴ1t49ＰＳ（30μg/ml） 88 リポソームタイプ２（150 μg/ml）＋ＲＴ1t49ＰＳ（30μg/ml） 77 これらの結果は以下のことを示唆する。リガンドＲＴ1t49ＰＳは 30 μg/mlま での濃度では毒性はない。リポソームタイプ１は 150μg/mlまでの濃度で毒性は 示さないが、リポソームタイプ２はこの濃度で中等度の毒性を示す（生存率の約 25％低下）。ＤＯＰＴＡの毒性は既知であることから、リポソームタイプ２には 毒性が期待される。リガンドＲＴ1t49ＰＳはリポソームタイプ２の毒性を見掛け 上約50％まで低下させる。 細胞取り込み．フルオレセイン標識ＲＴ1t49ＰＳリガンドの細胞内送達を、フ ルオレセイン活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析ならびに共焦点顕微鏡を使用して ＣＥＭss細胞（ヒトＴ細胞系）で調べた。この試験では、ＤＯＰＥ：アミノマン ノース（1:1 モル比）リポソームを用いた。脂質フィルムは 2.33 mgのＤＯＰＥ および 2.33 mgのアミノマンノースをクロロホルムに溶解し、デシケーター中一 夜真空下に保持して調製した。１mlの９％スクロースをフィルムに加え、試験管 を65℃に 0.5分間加熱しボルテックス攪拌した。この脂質混合物をついで、50℃ に加熱した水を含むビーカー中パワー設定７（microtip）で２分間超音波処理し た。リポソームにさらに 0.5 ml の９％スクロースを加え、MicroTrac 粒子サイ ザーを用いてサイズを揃え（平均サイズ 45 nm）、0.45μm 酢酸セルロースフィ ルターを用いて滅菌ろ過した。リポソーム- 核酸リガンド複合体はリポソームを 核酸リガンドと脂質：オリゴヌクレオチド 5:1 w/w比において65℃で10分間イン キュベートして調製した。 細胞取り込み実験には、106 ＣＥＭ細胞をＴ25フラスコ中、1640ＲＰＭＩ/10 ％ウシ胎児血清 10 mlに希釈した。核酸リガンドは遊離薬物またはリポソーム複 合体として 0.6μＭを各フラスコに加え、５％ＣＯ2含有雰囲気中37℃でインキ ュベートした。細胞を遠心分離し、２回洗浄して過剰の薬物を除去したのち観察 した。 共焦点顕微鏡試験は空冷アルゴンレーザー（励起 488 nm）により実施した。 共焦点映像は１μm スライスで撮影した（１シリーズあたり約20スライス）。核 酸リガンド単独とインキュベートしたＣＥＭ細胞には有意な（バックグランド以 上の）蛍光は24時間を通じて検出されなかった。リポソーム結合核酸リガンドと インキュベートしたＣＥＭ細胞には５時間までに有意な蛍光が検出され、24時間 を通じて増強された。蛍光は小胞に局在するように見えて、核には認められなか った。分極した細胞（たとえば７時間リポソーム結合核酸リガンドとインキュベ ーション）では、蛍光は前縁／先端から離れた細胞の後部に局在する。 ＦＡＣＳ分析は、空冷アルゴンレーザー（励起 488 nm）を装着した Coulter Epics Eliteを用いて行った。ＣＥＭ細胞は前方および側方スキャッターにより ゲートし、緑色の蛍光を検査した。死亡細胞および凝集体はゲートで排除された 。共焦点顕微鏡試験で示唆されたように、リポソーム結合核酸リガンドとインキ ュベートされた細胞の蛍光は遊離の核酸リガンドとインキュベートされた細胞の 場合よりほぼ１オーダー大きい。リポソーム結合核酸リガンドの取り込みは完全 には均一ではない。一部の細胞では他に比べて蛍光が有意に強い。脂質：核酸リ ガンド比 5:1 w/w（核酸リガンドのＭr約14,000；脂質のＭr約700）で、リポソ ームあたり脂質40,000と仮定すると、リポソームあたり約400 の核酸リガンドが 存在する。ＦＡＣＳによる検出の下限は細胞あたり約500 蛍光粒子または細胞あ たり１個のリポソームよりわずかに大きい。 結論として、遊離の5'Ｆ1-ＲＴ1t49ＰＳ核酸リガンドは、24時間以内にＣＥＭ 細胞内に有意には局在しない。ＤＯＰＥ：アミノマンノースリポソームに結合し た核酸リガンドはＣＥＭ細胞内に５時間までに局在し、24時間を通して細胞内に 局在を続ける。リポソーム結合核酸リガンドは小胞に蓄積し、核には蓄積しない ように思われる。リポソーム結合核酸リガンドの取り込みは、ＦＡＣＳ分析から 判断して、遊離の核酸リガンドの少なくとも10倍である。 実施例６．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：脂質の陰性電 荷の変動の影響 表３に示すモル比での処方を使用して、ジステアロイルホスファチジルコリン （ＤＳＰＣ）、コレステロール（Ｃhol）およびジステアロイルホスファチジル グリセロール（ＤＳＰＧ）からなる小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）を調製した。 陰性に荷電した脂質であるＤＳＰＧの含有モル百分率が変動する４つの組成物を 調製し、多重陰イオン性核酸リガンドの導入に対する陰性リポソーム電荷の影響 を評価した。脂質をＣＨＣl3に溶解し、混合し、窒素を絶えず流しながら乾燥さ せた。乾燥した脂質フィルムは水和の前に一夜真空中でさらに乾燥させ、保存し た。脂質フィルムはＮａ2ＨＰＯ4（1.15 g/L），ＮａＨ2ＰＯ4（0.228 g/L）お よびスクロース（90 g/L）を含有するｐＨ 7.4のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）によ り65℃で水和し、50 mg/mLの脂質懸濁液を得た。水和された脂質懸濁液をついで プローブ型ソニケーターを使用して不透明な溶液が得られるまで超音波処理した 。 これらの予め形成されたＳＵＶを等容量の核酸リガンド232（ＮＸ232）（配列 番号：７）ＰＢＳ中 1.0 mg/mL（終濃度：0.5 mg/mL ＮＸ232，25 mg/mL脂質） に加えた。この混合物を65℃で15分間インキュベートするかまたは室温に保持し たのち、Sephacryl HR S300 サイズ排除カラム（0.5 ×20 cm）上クロマトグラ フィーに付し、ＳＵＶ結合ＮＸ232 から遊離体を分離した。クロマトグラフィー 条件は次の通りである。溶出液：上述のＰＢＳ；流速：0.1 mL/ 分；注入サンプ ル：25μL；検出：254 nmにおけるＵＶ吸収；分画：0.2 mL/ 分画。収集した分 画は蛍光強度によってもモニターした（励起：494 nm，発光：516 nm）。 ＳＵＶ結合ＮＸ232 はＳＵＶピーク（排除容量）に遊離のＮＸ232 は包含容量 に溶出した。クロマトグラム（図４）はＳＵＶとのＮＸ232 の結合程度がＳＵＶ 中のＤＳＰＧ含量に依存することを明らかに示している。ＳＵＶ中に含まれる陰 性に荷電したＤＳＰＧの百分率がサンプルＡ〜Ｄの間で上昇するに従い、ＮＸ23 2 のＳＵＮとの結合は減少した。 実施例７．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：コレステロー ル含量の変動の影響 ＤＳＰＣおよびＣhol からなるＳＵＶを調製し、実施例６のようにＮＸ232 の 導入をアッセイした。リポソームは表４に指示するように、ＤＳＰＣおよびコレ ステロールを異なるモル比で含有した。ＮＸ232 はリポソームと結合し、室温で 調製した場合、ＳＵＶとともに溶出した。 リポソーム処方ＪおよびＫ（ＤＳＰＣ：コレステロールのモル比約２：１）で 核酸リガンドＮＸ232 の最も効率的な導入が可能であった。 実施例８．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：ＮＸ232 の固 定量において脂質／核酸リガンド比の変動の影響 ＤＳＰＣ：Ｃhol（モル比２：１）ＳＵＶを調製し、脂質／ＮＸ232 比を変動 させたほかは実施例６と同様にアッセイした。ＮＸ232（配列番号：７）の固定 量1.0 mg/mL を室温において、脂質濃度 2.5〜50 mg/mLのＳＵＶの等容量と混合 した（表５）。結果はＮＸ232 のＳＵＶとの最大結合が脂質/ ＮＸ比（w/w）25/ 1で得られたことを示唆している。最高の脂質/ ＮＸ比 50/1 はＳＵＶに結合す るＮＸ232 の量を増大させなかった。 実施例９．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：ＳＵＶの固定 量において脂質／核酸リガンド比の変動の影響 実施例６と同様に調製した予め形成されたＳＵＶ（ＤＳＰＣ/ Ｃhol ：2/1）5 0 mg/mLを 0.5〜5.0 mg/mL の様々な濃度におけるＮＸ232 の等容量と室温で混 合した（表６）。結果はＮＸ232 のＳＵＶとの最大結合が脂質/ ＮＸ232 比（w/ w）25/1で得られたことを指示している。ＳＵＶに結合するＮＸ232 の分画は脂 質/ ＮＸ232 比量が低いと減少した。 実施例10．予め形成されたリポソームへの核酸リガンドの導入：リン脂質鎖長 の変動の影響 様々な鎖長を有するリン脂質から作成したＳＵＶとＮＸ232 の結合を試験する ために、表７に示すリン脂質から実施例６と同様にしてＳＵＶを調製した。 試験した３種のリポソーム処方中、ＤＰＰＣ/ コレステロールリポソームが核 酸リガンドＮＸ232 の最高導入能をもつことが明らかにされた。 実施例11．核酸リガンド- リポソーム複合体の非変性ゲル電気泳動分析 この実施例ではコレステロールと接合した核酸リガンドのリポソーム製剤への 導入を証明する。本実施例で用いたリポソーム製剤はＤＳＰＣ：コレステロール （2:1 モル比）である。125Ｉ- ボルトン- ハンター試薬で放射標識したコレス テリル化トロンビンリガンドＮＸ253 ｛5'-[コレステロール][ｄＴ- ＮＨ-125Ｉ - ボルトン- ハンター]-ｄ(ＣＡＧ ＴＣＣ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＴＧＧ ＡＡ)[3'3'ｄＴ］ｄＴ- 3'（配列番号：８）；ｄＴ- ＮＨ-125Ｉ- ボルトン- ハンターは、ボルトン- ハ ンター試薬（New England Nuclear，Boston，MA）に接合しているアミノモディ ファイアーＣ６ｄＴ（Glen Research，Sterling，VA）であり、3'3'ｄＴ（dT-5' - ＣＥホスホロアミダイト，Glen Research，Sterling，VA）は逆方向性ホスホ ロアミダイトである｝はリポソーム：核酸リガンド比の関数として結合核酸リガ ンド分画の測定のために検査した。核酸リガンド- リポソーム複合体は核酸リガ ンドを９％スクロース含有25ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ 7.4中リポソームと65℃ で15分間インキュベートして調製した。遊離の核酸リガンドはリポソーム結合核 酸リガンドから、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離できる。 この方法はこの２種の迅速かつ完全な分離を可能にする。リポソーム結合核酸リ ガンドをゲルに入れる（すなわち可視化可能にする）ためには、電気泳動試行の 終了約５分間、負荷ウエルに triton X-100 の１％溶液を加えてリポソームを破 壊する必要がある。リポソーム結合核酸リガンドの量は、よく定義されたバンド として移動する遊離核酸リガンドの相対量からリン造影分析によって測定された 。リポソームあたり約60,000の脂質が存在し、脂質の平均ＭＷを 655.9 Da(＝79 0.15×0.67＋386.7 ×0.33）と仮定すると、核酸リガンドによるリポソームの飽 和は核酸リガンド対リポソームのモル比約300 で起こる（図12）。コレステロー ル残基をもたないＮＸ253 のアナログは、リポソーム濃度の同程度の範囲ではリ ポソームに導入されない（データは示していない）。 実施例12．核酸リガンドのリポソームへの受動封入 核酸リガンドをリポソームの水性内部内に封入する。核酸リガンドの水溶液は 核酸リガンドをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に溶解し、濃度約 3.5 ml/mlの保存 溶液を得る。ＤＳＰＣ：Chol （2:1 モル比）を含有する脂質フィルムは、クロ ロホルム：メタノール：水（1:5:1，v:v:v）溶媒から脂質混合物を乾燥させて調 製する。核酸リガンド保存溶液１ml を脂質フィルムに添加し、40℃で10秒間浴 超音波処理する。得られた溶液を、液体窒素を用いる４サイクルの凍結- 解凍操 作に付す。得られた均一な溶液を最初 0.8μmフィルター膜から押し出し（３回 ）、ついで 0.45 μm フィルター膜から（３回）、最後に 0.2μm フィルター 膜から（３回）押し出す。非封入核酸リガンドは、床容量約 20 mlの Sephadex G-50カラムに分散液を通過させて除去する。 実施例13．リポソームへの核酸リガンドの遠隔負荷 核酸リガンドは遠隔負荷により、ＭＬＶの水性内部内に封入する。ＤＳＰＣ： Ｃhol（2:1 モル比）の脂質混合物を、20μmol の脂質を用いて脂質フィルムに 調製する。脂質フィルムは 0.1Ｍ Ｍg Ｃl2を用いて65℃でボルテックス攪拌し て懸濁し、平均直径１ミクロンのＭＬＶを形成させる。リポソーム懸濁液を液体 窒素中で凍結し、65℃で解凍する。凍結/ 解凍サイクルを３回反復し、塩がラメ ラ全体に均一に分布することを保証する。内部水相の浸透圧は約300 ミリオスモ ール（mOsm）である。リポソーム懸濁液を 10,000 g で 15 分間遠心分離してペ レット化して外部のＭg Ｃl2溶液を除去する。上清を除き、リポソームペレット を65℃で５分間加熱する。核酸リガンド溶液（水 100μl 中20μg）を予め65℃ で５分間加熱し、リポソームペレットに加える。加熱を30分間続け、ついでサン プルを徐々に室温に冷却し、１mlのＰＢＳで希釈する。捕捉されなかった核酸リ ガンドはＭＬＶの遠心分離ついで上清の除去により除く。ペレットを新たなＰＢ Ｓに再懸濁し、遠心分離して再ペレット化する。 実施例14．リポソームへの核酸リガンドの共有結合 以下のスキーム１に示すようにＮ- ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび ビニルスルホン官能基を含む二機能性ＰＥＧ-2000（分子量 2000 DaのＰＥＧ） を最初、２モル％のジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ） を含有するリポソームにＮ- ヒドロキシスクシンイミドエステル残基を介して接 合させた。生成物はサイズ排除クロマトグラフィーによって遊離のＰＥＧから精 製した。ビニルスルホン生成物をついで還元ＮＸ256（図１Ｄ；配列番号：９） と反応させた。ＤＳＰＥ- ＰＥＧ-2000-ビニルスルホンは市販品が入手可能でビ ニルスルホン官能基を含むリポソームの製造に使用できるので、スキーム１の接 合工程は省略できる。 以下のスキーム２に示すように第二の反応は完成した。出発原料は２モル％の ＤＳＰＥマレイミドを含有するジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ） リポソームとした。リポソームあたり 50,000 脂肪価を用いると、リポソームは リポソームあたり約 1000 のマレイミド分子をもつことになり、その約 600が外 側に存在する。核酸リガンド- リポソーム複合体は遊離の核酸リガンドからサイ ズ排除クロマトグラフィーによって分離した（上記参照）。260 nmの吸収から、 核酸リガンド約 200分子が各リポソームに接合したと評価された。 実施例15．核酸リガンド- リポソーム複合体のインビトロおよびインビボ効率 ．リポソーム二重層に封埋されたジアルキルグリセロール（ＤＡＧ）修飾ＶＥＧ Ｆリガンド（ＮＸ278） ＮＸ278-リポソーム複合体は、１mgのＮＸ278（図１Ｎ；配列番号：19）を９ ％スクロース含有10ｍＭリン酸塩（ｐＨ 7.4）緩衝液中、ＤＳＰＣ：コレステロ ールの混合物（50 mg）とインキュベートして調製し、プローブ型ソニケーター を用いて、不透明な溶液が得られるまで15〜30分超音波処理した。核酸リガンド ＮＸ-278の配列スクランブルアナログ（scＮＸ278）（図１Ｗ；配列番号：28） を含有する対照核酸リガンド- リポソーム複合体を同様にして調製した。粒子ア ナライザー（Leeds & Northrup Model Microtrack UPA 150，Horshman，PA）で 測定したリポソーム粒子のサイズ（通常 50〜100 ｎＭ）は核酸リガンドの不存 在下に得られた粒子と同じであった。ＮＸ278-リポソーム複合体は、ビオチン標 識核酸リガンドと、ポリスチレン固定化ＶＥＧＦへの結合でＶＥＧＦに競合し、 競合ＥＬＩＳＡアッセイにおける見掛けのＥＤ50は約10-7Ｍであった。同じアッ セイで、scＮＸ278-リポソーム複合体は２μＭ核酸リガンドまででは有効に競合 しなかった。比較のための、ＮＸ278 と同じ配列を有するが5'末端にＤＡＧ残基 をもたない遊離核酸リガンド，ＮＸ213（図１Ｐ；配列番号：21）はＶＥＧＦに 対してＥＤ50値約10-9Ｍの競合を示した。ＮＸ213 に比較してＮＸ278-リポソー ムの固定化ＶＥＧＦに対する結合能の低下は、リポソームの外表面に提示された 核酸リガンドの分画のみが平坦表面への結合に利用されると期待されることから 、単純な幾何的抑制によるものと考えられる。さらに、内部表面に提示された核 酸リガンドの分画はこのアッセイにおける結合には当然利用されない。 ヒト映帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびカポジ肉腫（ＫＳ）細胞の組織培 養における増殖に対するＮＸ278-リポソーム、scＮＸ278-リポソームおよびＮＸ 213 の作用を検討した。ＨＵＶＥＣは10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびヘパリ ン（45μg/ml）含有ＩＭＤＭ：Ｈam's Ｆ12（1:1）培地中ＶＥＧＦ(10 ng/ml) の存在下に増殖させた。細胞は日０に 24-ウエルゼラチン被覆プレートにウエル あたり20,000細胞の密度でプレーティングし、上述のリガンド 0.1ｎＭ〜１μＭ 濃度で日１，２および３に処理した（培地をリガンドとともに置換）。細胞の計 数は日４に実施した。ＫＳ細胞系ＫＳＹ-1は、２％ＦＣＳ、Ｌ- グルタミン、ペ ニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ1640含有培地中に、日０ に 24-ウエルゼラチン被覆プレートにウエルあたり 7,500〜10,000細胞密度でプ レーティングした。核酸リガンドは新鮮培地中 0.1ｎＭ〜１μＭ濃度で日１，２ および３に添加し、細胞の計数は日４に実施した。ＮＸ278-リポソームはＨＵＶ ＥＣの増殖をＩＣ50約300 ｎＭで阻害した（濃度は核酸リガンド成分の濃度を示 す）。遊離核酸アナログＮＸ213 の効果は有意に低かった（ＩＣ50＞１μＭ）。 ＮＸ278-リポソームはＫＳ細胞の増殖もＩＣ50約100 ｎＭで阻害し、ＮＸ278-リ ポソームはこれらの細胞の増殖を１μＭで完全に阻害した。scＮＸ278-リポソー ムおよびＮＸ213 はＩＣ50＞１μＭであった。 ＮＸ278-リポソームがインビボにおけるＶＥＧＦの血管透過活性を阻害する能 力を調べた。血管透過性アッセイ［Miles アッセイとも呼ばれる（Miles，A.A.& Miles，E.M.(1952)J.Physiol.(London)118:228］は Senger ら （Senger，R.S. ら(1983)Science 219: 983）の記載にほぼ従いモルモットで実施した。濃度１μ ＭのＮＸ278-リポソームはＶＥＧＦ誘発血管透過性を有意に阻害した。対照化合 物，scＮＸ278-リポソームはこの濃度では阻害を示さず、実際には血管透 過性は上昇を示したようであった。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年１１月８日 【補正内容】 請求の範囲 １．核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からな る治療用または診断用複合体。 ２．核酸リガンドは核酸候補混合物から与えられた標的のリガンドとして、 ａ）核酸候補混合物に比較して標的に対する親和性が高い核酸が候補混合物の 残部から分配できるように核酸候補混合物を標的と接触させ、 ｂ）親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配し、ついで ｃ）親和性が高い核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸混合物を得るこ とによって同定される「請求項１」記載の複合体。 ３．さらにｄ）工程ｂ）およびｃ）の反復からなる「請求項２」の複合体。 ４．核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物からなる「請求項１」記載 の複合体。 ５．非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコール、デキストラン、ア ルブミン、およびマグネタイトからなる群より選択される「請求項４」記載の複 合体。 ６．非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールである「請求項４」 記載の複合体。 ７．核酸リガンドおよび親油性化合物からなる「請求項１」記載の複合体。 ８．親油性化合物はコレステロール、ジアルキルグリセロール、およびジアシ ルグリセロールからなる群より選択される「請求項７」記載の複合体。 ９．親油性化合物はコレステロールである「請求項８」記載の複合体。 10．親油性化合物はジアルキルグリセロールである「請求項８」の複合体。 11．さらに脂質構築体からなる「請求項９」記載の複合体。 12．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項11」記載の複合体。 13．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項12」記載の複合体。 14．さらに脂質構築体からなる「請求項７」記載の複合体。 15．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項14」記載の複合体。 16．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項15」記載の複合体。 17．さらに脂質構築体からなる「請求項10」記載の複合体。 18．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項17」記載の複合体。 19．脂質構築体はリポソームである「請求項18」記載の複合体。 20．さらに脂質構築体からなる「請求項６」記載の複合体。 21．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項20」記載の複合体。 22．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項21」記載の複合体。 23．核酸リガンドは上記リポソームの内部内に封入される「請求項16」記載の 複合体。 24．核酸リガンドは上記リポソームの外部に非共有結合的に結合される「請求 項16」記載の複合体。 25．核酸リガンドは第二の親油性化合物に共有結合で結合される「請求項16」 記載の複合体。 26．核酸リガンドはリンカーを介して第二の親油性化合物に結合される「請求 項25」記載の複合体。 27．核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項25」記載 の複合体。 28．核酸リガンドは、リポソームの内部に突出している「請求項25」記載の複 合体。 29．さらに治療用または診断用物質からなる「請求項16」記載の複合体。 30．治療用物質は、リポソームの内部に封入されている「請求項29」記載の複 合体。 31．治療用または診断用物質はリポソームの膜に結合している「請求項29」記 載の複合体。 32．治療用もしくは診断用物質はリポソームの外部表面に結合している「請求 項29」記載の複合体。 33．核酸リガンドは予め定められた位置に対して複合体を標的化する「請求項 １」記載の複合体。 34．複合体の薬物動態学的性質が核酸リガンド単独に比較して改良されている 「請求項１」記載の複合体。 35．核酸リガンドのセレックス標的は細胞間のセレックス標的である「請求項 １」記載の複合体。 36．核酸リガンドのセレックス標的は細胞内のセレックス標的である「請求項 １」記載の複合体。 37．核酸リガンドの細胞内取り込みが核酸リガンド単独に比較して改良されて いる「請求項36」記載の複合体。 38．さらに治療用または診断用物質からなる「請求項６」記載の複合体。 39．治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに結合している「請求 項38」記載の複合体。 40．治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに共有結合で結合して いる「請求項39」記載の複合体。 41．核酸リガンドは親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に共有結合 で結合している「請求項１」記載の複合体。 42．核酸リガンドは親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に非共有結 合的に結合している「請求項１」記載の複合体。 43．核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からな る治療用または診断用複合体の製造方法において、核酸リガンドは核酸候補混合 物から与えられた標的のリガンドとして、 ａ）核酸候補混合物に比較して標的に対する親和性が高い核酸が候補混合物の 残部から分配できるように核酸候補混合物を標的と接触させ、 ｂ）親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配し、ついで ｃ）親和性が高い核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸混合物を得るこ とにより同定し、ついで、 ｄ）同定された核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物 と結合させる方法。 44．複合体は核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物からなる「請求項 43」記載の方法。 45．非免疫原性高分子量化合物は、ポリエチレングリコール、デキストラン、 アルブミン、およびマグネタイトからなる群より選択される「請求項44」記載の 方法。 46．非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールである「請求項45」 記載の方法。 47．複合体は核酸リガンドおよび親油性化合物からなる「請求項43」記載の方 法。 48．親油性化合物はコレステロール、ジアルキルグリセロールおよびジアシル グリセロールからなる群より選択される「請求項47」記載の方法。 49．親油性化合物はコレステロールである「請求項48」記載の方法。 50．親油性化合物はジアルキルグリセロールである「請求項48」の方法。 51．複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項49」記載の方法。 52．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項51」記載の方法。 53．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項52」記載の方法。 54．複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項50」記載の方法。 55．複合体はさらに脂質二重層小胞からなる「請求項54」記載の方法。 56．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項55」記載の方法。 57．核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項56」記載 の方法。 58．複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項47」記載の方法。 59．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項58」記載の方法。 60．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項59」記載の方法。 61．核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項60」記載 の方法。 62．複合体は、さらに治療用もしくは診断用物質からなる「請求項60」記載の 方法。 63．核酸リガンドは予め定められた位置に対して複合体を標的化する「請求項 43」記載の方法。 64．複合体の薬物動態学的性質が核酸リガンド単独に比較して改良されている 「請求項43」記載の方法。 65．複合体は、さらに治療用もしくは診断用物質からなる「請求項46」記載の 方法。 66．治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに結合している「請求 項65」記載の方法。 67．核酸リガンドの薬物動態学的性質を改良する方法において、 核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて核 酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体 を形成させること、および この複合体を患者に投与することからなる方法。 68．細胞内セレックス標的を有する核酸リガンドの細胞内取り込みを改良する 方法において、 核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて核 酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体 を形成させること、および この複合体を患者に投与することからなる方法。 69．治療用または診断用物質を患者における予め定められた生物学的標的に標 的化する方法において、 治療用または診断用物質を核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性 高分子量化合物からなる複合体に結合させ、この場合、核酸リガンドは特定の予 め定められた生物学的標的に結合するセレックス標的を有し、核酸リガンドは複 合体の外部に結合していて、この複合体を患者に投与することからなる方法。 70．疾患を処置する方法において、核酸リガンドおよび親油性化合物または非 免疫原性高分子量化合物からなる複合体の医薬的有効量を投与することからなる 方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジャンジック，ネボジュサ アメリカ合衆国 80301 コロラド州 ボ ールダー，カーター トレイル 6973

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からな る治療用または診断用複合体。 ２．核酸リガンドは核酸候補混合物から与えられた標的のリガンドとして、 ａ）核酸候補混合物に比較して標的に対する親和性が高い核酸が候補混合物の 残部から分配できるように核酸候補混合物を標的と接触させ、 ｂ）親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配し、ついで ｃ）親和性が高い核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸混合物を得るこ とによって同定される「請求項１」記載の複合体。 ３．さらにｄ）工程ｂ）およびｃ）の反復からなる「請求項２」の複合体。 ４．核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物からなる「請求項１」記載 の複合体。 ５．非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコール、デキストラン、ア ルブミン、およびマグネタイトからなる群より選択される「請求項４」記載の複 合体。 ６．非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールである「請求項４」 記載の複合体。 ７．核酸リガンドおよび親油性化合物からなる「請求項１」記載の複合体。 ８．親油性化合物はコレステロール、ジアルキルグリセロール、およびジアシ ルグリセロールからなる群より選択される「請求項７」記載の複合体。 ９．親油性化合物はコレステロールである「請求項８」記載の複合体。 10．親油性化合物はジアルキルグリセロールである「請求項８」の複合体。 11．さらに脂質構築体からなる「請求項９」記載の複合体。 12．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項11」記載の複合体。 13．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項12」記載の複合体。 14．さらに脂質構築体からなる「請求項７」記載の複合体。 15．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項14」記載の複合体。 16．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項15」記載の複合体。 17．さらに脂質構築体からなる「請求項10」記載の複合体。 18．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項17」記載の複合体。 19．脂質構築体はリポソームである「請求項18」記載の複合体。 20．さらに脂質構築体からなる「請求項６」記載の複合体。 21．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項20」記載の複合体。 22．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項21」記載の複合体。 23．核酸リガンドは上記リポソームの内部内に封入される「請求項16」記載の 複合体。 24．核酸リガンドは上記リポソームの外部に非共有結合的に結合される「請求 項16」記載の複合体。 25．核酸リガンドは第二の親油性化合物に共有結合で結合される「請求項16」 記載の複合体。 26．核酸リガンドはリンカーを介して第二の親油性化合物に結合される「請求 項25」記載の複合体。 27．核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項25」記載 の複合体。 28．核酸リガンドは、リポソームの内部に突出している「請求項25」記載の複 合体。 29．さらに治療用または診断用物質からなる「請求項16」記載の複合体。 30．治療用物質は、リポソームの内部に封入されている「請求項29」記載の複 合体。 31．治療用または診断用物質はリポソームの膜に結合している「請求項29」記 載の複合体。 32．治療用もしくは診断用物質はリポソームの外部表面に結合している「請求 項29」記載の複合体。 33．核酸リガンドは予め定められた位置に対して複合体を標的化する「請求項 １」記載の複合体。 34．複合体の薬物動態学的性質が核酸リガンド単独に比較して改良されている 「請求項１」記載の複合体。 35．核酸リガンドのセレックス標的は細胞間のセレックス標的である「請求項 １」記載の複合体。 36．核酸リガンドのセレックス標的は細胞内のセレックス標的である「請求項 １」記載の複合体。 37．核酸リガンドの細胞内取り込みが核酸リガンド単独に比較して改良されて いる「請求項36」記載の複合体。 38．さらに治療用または診断用物質からなる「請求項６」記載の複合体。 39．治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに結合している「請求 項38」記載の複合体。 40．治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに共有結合で結合して いる「請求項39」記載の複合体。 41．核酸リガンドは親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に共有結合 で結合している「請求項１」記載の複合体。 42．核酸リガンドは親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に非共有結 合的に結合している「請求項１」記載の複合体。 43．核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からな る治療用または診断用複合体の製造方法において、核酸リガンドは核酸候補混合 物から与えられた標的のリガンドとして、 ａ）核酸候補混合物に比較して標的に対する親和性が高い核酸が候補混合物の 残部から分配できるように核酸候補混合物を標的と接触させ、 ｂ）親和性が高い核酸を候補混合物の残部から分配し、ついで ｃ）親和性が高い核酸を増幅させてリガンドが濃縮された核酸混合物を得るこ とにより同定し、ついで、 ｄ）同定された核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物 と結合させる方法。 44．複合体は核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物からなる「請求項 43」記載の方法。 45．非免疫原性高分子量化合物は、ポリエチレングリコール、デキストラン、 アルブミン、およびマグネタイトからなる群より選択される「請求項44」記載の 方法。 46．非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールである「請求項45」 記載の方法。 47．複合体は核酸リガンドおよび親油性化合物からなる「請求項43」記載の方 法。 48．親油性化合物はコレステロール、ジアルキルグリセロールおよびジアシル グリセロールからなる群より選択される「請求項47」記載の方法。 49．親油性化合物はコレステロールである「請求項48」記載の方法。 50．親油性化合物はジアルキルグリセロールである「請求項48」の方法。 51．複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項49」記載の方法。 52．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項51」記載の方法。 53．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項52」記載の方法。 54．複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項50」記載の方法。 55．複合体はさらに脂質二重層小胞からなる「請求項54」記載の方法。 56．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項55」記載の方法。 57．核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項56」記載 の方法。 58．複合体はさらに脂質構築体からなる「請求項47」記載の方法。 59．脂質構築体は脂質二重層小胞である「請求項58」記載の方法。 60．脂質二重層小胞はリポソームである「請求項59」記載の方法。 61．核酸リガンドはリポソームの外部表面から突出している「請求項60」記載 の方法。 62．複合体は、さらに治療用もしくは診断用物質からなる「請求項60」記載の 方法。 63．核酸リガンドは予め定められた位置に対して複合体を標的化する「請求項 43」記載の方法。 64．複合体の薬物動態学的性質が核酸リガンド単独に比較して改良されている 「請求項43」記載の方法。 65．複合体は、さらに治療用もしくは診断用物質からなる「請求項46」記載の 方法。 66．治療用または診断用物質はポリエチレングリコールに結合している「請求 項65」記載の方法。 67．核酸リガンドの薬物動態学的性質を改良する方法において、 核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて核 酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体 を形成させること、および この複合体を患者に投与することからなる方法。 68．細胞内セレックス標的を有する核酸リガンドの細胞内取り込みを改良する 方法において、 核酸リガンドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に結合させて核 酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物からなる複合体 を形成させること、および この複合体を患者に投与することからなる方法。 69．治療用または診断用物質を患者における予め定められた生物学的標的に標 的化する方法において、 治療用または診断用物質を核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性 高分子量化合物からなる複合体に結合させ、この場合、核酸リガンドは特定の予 め定められた生物学的標的に結合するセレックス標的を有し、核酸リガンドは複 合体の外部に結合していて、この複合体を患者に投与することからなる方法。
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