ES2336857T3 - Complejos de ligandos de acido nucleico. - Google Patents

Complejos de ligandos de acido nucleico. Download PDF

Info

Publication number
ES2336857T3
ES2336857T3 ES96915463T ES96915463T ES2336857T3 ES 2336857 T3 ES2336857 T3 ES 2336857T3 ES 96915463 T ES96915463 T ES 96915463T ES 96915463 T ES96915463 T ES 96915463T ES 2336857 T3 ES2336857 T3 ES 2336857T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
nucleic acid
seq
ligand
information
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES96915463T
Other languages
English (en)
Inventor
Larry Gold
Paul G. Schmidt
Nebojsa Janjic
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gilead Sciences Inc
Original Assignee
Gilead Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27030196&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2336857(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/434,465 external-priority patent/US6011020A/en
Application filed by Gilead Sciences Inc filed Critical Gilead Sciences Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2336857T3 publication Critical patent/ES2336857T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544Phospholipids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/554Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06Pyrimidine radicals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06Pyrimidine radicals
    • C07H19/10Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

ESTA INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN COMPLEJO TERAPEUTICO O DE DIAGNOSTICO FORMADO POR UN LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO Y UN COMPUESTO LIPOFILO O UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO, MEDIANTE LA IDENTIFICACION DE UN LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO POR LA METODOLOGIA SELEX Y LA ASOCIACION DEL LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO CON UN COMPUESTO LIPOFILO O UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO. LA INVENCION ADEMAS DESCRIBE COMPLEJOS FORMADOS POR UNO O MAS LIGANDOS DE ACIDO NUCLEICO ASOCIADOS CON UN COMPUESTO LIPOFILO O CON UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO.

Description

Complejos de ligandos de ácido nucleico.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para preparar un complejo terapéutico o de diagnóstico comprendido de un ligando de ácido nucleico y un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado mediante la identificación de un ligando de ácido nucleico mediante metodología SELEX y la asociación del ligando de ácido nucleico con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado. La presente invención también se refiere a la mejora de las propiedades farmacocinéticas de un ligando de ácido nucleico mediante la asociación del ligando de ácido nucleico a un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado para formar un complejo. La presente invención también incluye complejos que comprenden un ligando de ácido nucleico asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado.
Antecedentes de la invención A. SELEX
El dogma durante muchos años fue que los ácidos nucleicos tenían principalmente un papel informativo. A través del método conocido como Evolución Sistemática de Ligandos mediante enriquecimiento Exponencial, denominado, SELEX, se ha visto claramente que los ácidos nucleicos presentan una diversidad estructural tridimensional similar a las proteínas. SELEX es un método para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con una unión altamente específica a moléculas diana y se describe en la Solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie 07/536,428, solicitada el 11 de junio de 1990, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment", ya abandonada. La solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/714,131, solicitada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,475,096, la solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/931,473, solicitada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,270,163 (véase también PCT/US91/04078). Cada una de estas solicitudes, referidas en general en la presente invención como las Solicitudes de Patentes de SELEX, describe un método fundamentalmente nuevo para producir un ligando de ácido nucleico para cualquier molécula diana deseada. El proceso SELEX proporciona un tipo de productos a los que se hace referencia como ligandos de ácido nucleico, teniendo cada ligando una única secuencia, y que tiene la propiedad de unirse específicamente a un compuesto o molécula dianas deseados. Cada ligando de ácido nucleico identificado por SELEX es un ligando específico de un compuesto o molécula dianas determinados. SELEX se basa en la visión única de que los ácidos nucleicos tienen capacidad suficiente para formar una variedad de estructuras bidimensionales y tridimensionales y suficiente versatilidad química disponible en sus monómeros para actuar como ligandos (forman parejas de unión específica) con prácticamente cualquier compuesto químico, tanto monomérico como polimérico. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden utilizarse como dianas.
El método SELEX implica la selección entre una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones por etapas de la unión, separación y amplificación, utilizando el mismo esquema de selección general, para conseguir prácticamente cualquier criterio deseado de afinidad y selectividad de unión. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprenden preferiblemente un segmento de secuencia aleatoria, el método SELEX incluye las etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en las condiciones favorables para la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de los ácidos nucleicos que se han unido específicamente a moléculas diana, disociar los complejos ácido nucleico-diana, amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleico-diana para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligandos, y a continuación, repetir las etapas de unión, separación, disociación y amplificación durante tantos ciclos como se desee para obtener ligandos de ácidos nucleicos de afinidad elevada altamente específicos con la molécula diana.
Los presentes inventores reconocen que el método SELEX demuestra que los ácidos nucleicos como compuestos químicos pueden formar un amplio espectro de formas, tamaños y configuraciones, y son capaces de un repertorio mucho más amplio de unión y otras funciones que los mostrados por los ácidos nucleicos en los sistemas biológicos.
Los presentes inventores reconocen que los procesos SELEX o de tipo SELEX se podrían utilizar para identificar ácidos nucleicos que pueden facilitar cualquier reacción elegida de manera similar a aquella en la que los ligandos de ácidos nucleicos se pueden identificar para cualquier diana. En teoría, en la mezcla de candidatos de aproximadamente 1013 a 1018 ácidos nucleicos, los presentes inventores postulan que por lo menos existe un ácido nucleico con la forma apropiada para facilitar cada una de una amplia variedad de interacciones físicas y químicas.
El método SELEX básico se ha modificado para conseguir una serie de objetivos específicos. Por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/960,093, solicitada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure." describe el uso de SELEX conjuntamente con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tales como ADN curvado. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/123,935, solicitada el 17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands", describe un método basado en SELEX para la selección de ligandos de ácidos nucleicos que contienen grupos fotoreactivos capaces de unirse y/o fotoreticularse y/o fotoinactivar una molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, solicitada el 7 de octubre de 1993, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", describe un método para identificar ligandos de ácido nucleico altamente específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente relacionadas, que pueden ser no peptídicas, denominado Contra-SELEX. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie No. 08/143,564, solicitada el 25 de octubre de 1993, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", describe un método basado en SELEX que consigue una separación altamente eficaz entre oligonucleótidos que tienen una afinidad elevada y baja por una molécula
diana.
El método SELEX comprende la identificación de ligandos de ácidos nucleicos de afinidad elevada que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tal como una estabilidad in vivo mejorada o características de liberación mejoradas. Entre los ejemplos de dichas modificaciones se incluyen sustituciones químicas en la ribosa y/o fosfato y/o posiciones de las bases. Los ligandos de ácidos nucleicos identificados por SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/117,991, solicitada el 8 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5 y 2' de las pirimidinas. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, supra, describe ligandos de ácidos nucleicos altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH_{2}), 2'-fluoro (2'-F), y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/264,029, solicitada el 22 de junio de 1994, titulada "Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement", describe oligonucleótidos que contienen diversas pirimidinas modificadas en 2'.
El método SELEX comprende combinar oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales que no son oligonucleótidos tal como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/284,063, solicitada el 2 de agosto de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX" y la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/234,997, solicitada el 28 de abril de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX", respectivamente. Estas solicitudes permiten la combinación del amplio espectro de formas y otras propiedades, y las propiedades de amplificación y replicación eficaces de oligonucleótidos con las propiedades deseadas de otras moléculas.
Se han descrito varios casos en los que los investigadores han unido oligonucleótidos antisentido con compuestos no inmunogénicos de peso molecular elevado. Los oligonucleótidos antisentido, sin embargo, son sólo eficaces como agentes intracelulares. Los oligodesoxirribonucleótidos antisentido dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) se han encapsulado en liposomas unidos a folato a través de un espaciador de polietilenglicol (folato-PEG-liposomas) y se liberan en células KB cultivadas a través de endocitosis mediada por el receptor de folato (Wang et al. (1995) 92: 3318-3322).
Descripción resumida de la invención
La presente invención proporciona un método para preparar un complejo terapéutico o de diagnóstico comprendido de un ligando de ácido nucleico y un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado mediante el método que comprende identificar un ligando de ácido nucleico de una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos, en el que el ácido nucleico es un ligando de una diana determinada, mediante el método de (a) poner en contacto la mezcla de candidatos de ácidos nucleicos con la diana, (b) separar entre los miembros de dicha mezcla de candidatos en base a la afinidad con la diana, y (c) amplificar las moléculas seleccionadas para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad relativamente más elevada para la unión a la diana, y la asociación de dicho ligando de ácido nucleico identificado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado.
Esta descripción proporciona un método para mejorar la captación celular de un ligando de ácido nucleico que tiene una diana SELEX intracelular mediante la asociación del ligando del ácido nucleico con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado para formar un complejo comprendido de un ligando de ácido nucleico y un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado y la administración del complejo a un paciente.
Esta descripción proporciona un método para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ligando de ácido nucleico mediante la asociación del ligando del ácido nucleico con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado y la administración del complejo a un paciente.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar complejos que comprenden un ligando de ácido nucleico asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado y métodos para producir los mismos. Un objetivo adicional de la presente invención es proporciona un ligando de ácido nucleico asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado con propiedades farmacocinéticas mejoradas. El compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado es PEG. El ligando de ácido nucleico se identifica según el método SELEX.
En realizaciones de la presente invención dirigidas a complejos que comprenden PEG asociados con un ligando de ácido nucleico, el ligando de ácido nucleico puede actuar con capacidad de reconocimiento.
En realizaciones en las que el ligando de ácido nucleico del complejo actúa con capacidad de reconocimiento, el complejo puede incorporar o tener asociado con él mismo agentes terapéuticos o de diagnóstico. En una realización, el agente terapéutico es un fármaco.
Éstos y otros objetivos, así como la naturaleza, alcance y utilización de la presente invención, serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
Las figuras 1A-1Y muestras las descripciones moleculares de NX229, NX232, NX253, NX256, 225T3, 225T3N, T-P4, NX-256-PEG-20.000, 225T3N-PEG-3400, T-P4-PEG-(20.000 ó 10.000), NX268, NX191, JW966, NX278, JW986, NX213, NX244, JW1130, NX287, JW1336-20K PEG, JW1379, JW1380, scNX278, JW986-PEG- (10.000, 20.000, ó 40.000), y JW1336 (SEC ID NOS: 6-30). Una letra minúscula antes de un nucleótido indica lo siguiente: m=2'-O-Metil, a=2'-amino, r=ribo, y f=2'-fluoro. Si no hay ninguna letra antes del nucleótido indica un desoxirribonucleótido (2'H). Una S después de un nucleótido indica una modificación en el esqueleto que consiste en una unión fosforotioato internucleósido.
La figura 2 resume los datos para la concentración en plasma de NX229, NX232, NX253, NX253 + Liposoma, y NX256-PEG20K en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 3 resume los datos para la concentración en plasma de NX213 (SEC ID NO: 21), NX268 (SEC ID NO: 16), NX278 (SEC ID NO: 19), NX278 + liposoma, JW986 (SEC ID NO: 20), NX213 liposoma encapsulado, y NX244 (SEC ID NO: 22) en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 4 resume los datos para la concentración en plasma de JW966 (SEC ID NO: 18) y JW966 + liposoma en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 5 resume los datos para la concentración en plasma de NX268 (SEC ID NO: 16) y NX268 + liposoma en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 6 resume los datos para la concentración en plasma de NX191 (SEC ID NO: 17), JW986 + PEG20K, PEG40K, y PEG10K (SEC ID NO: 29) en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 7 resume los datos para la concentración en plasma de JW986 + PEG20K (SEC ID NO: 29) y JW1130 (SEC ID NO: 23) en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 8 resume los datos para la concentración en plasma de NX287 + PEG40K (SEC ID NO: 24) y NX256 (SEC ID NO: 9) en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 9 resume los datos para la concentración en plasma de JW1130 (SEC ID NO: 23), 1136-PEG20K (SEC ID NO: 25), 1336 (SEC ID NO: 30), y 1379/80 (SEC ID NOS: 26-27) en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 10 muestra los cromatogramas para NX232 (SEC ID NO: 7), NX232 + 1% PGSUV, NX232 + 2,5% PGSUV, y NX232 + PGSUV.
Descripción detallada de la invención Definiciones
"Enlace covalente" es el enlace químico formado por compartimiento de electrones.
"Interacciones no covalentes" son medios para mantener juntas entidades moleculares mediante interacciones diferentes de los enlaces covalentes, incluyendo interacciones iónicas y enlaces de hidrógeno.
"Construcciones de lípidos", para los objetivos de esta descripción, son estructuras que contienen lípidos, fosfolípidos, o derivados de los mismos que comprenden una variedad de disposiciones estructurales diferentes que se sabe que adoptan estos lípidos en solución acuosa. Estas estructuras incluyen, pero sin limitación, vesículas de bicapas lipídicas, micelas, liposomas, emulsiones, cintas o láminas de lípidos, y pueden formar complejos con una variedad de fármacos y adyuvantes que son conocidos por ser farmacéuticamente aceptables. Los adyuvantes habituales incluyen colesterol y alfa-tocoferol, entre otros. Las construcciones de lípidos pueden utilizarse solas o en cualquier combinación que un experto en la materia entendería que proporciona las características deseadas para una aplicación concreta. Además, los aspectos técnicos de la formación de construcciones de lípidos y liposomas son conocidos en la técnica y se puede utilizar cualquier método utilizado habitualmente en el sector.
"Compuestos lipofílicos" son compuestos que tienen la tendencia a asociarse con o separarse en lípidos y/u otros materiales o fases con constantes dieléctricas bajas, incluyendo estructuras que están comprendidas sustancialmente de componentes lipofílicos. Los compuestos lipofílicos incluyen construcciones de lípidos, así como compuestos que no contienen lípidos que tienen la tendencia asociarse con lípidos (y/u otros materiales o fases con constantes dieléctricas bajas). El colesterol, fosfolípidos y dialquilglicerol son ejemplos adicionales de compuestos lipofílicos.
"Complejo", tal como se utiliza en la presente invención describe la entidad molecular formada por la asociación de un ligando de ácido nucleico con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado. La asociación puede ser a través de enlaces covalentes o interacciones no covalentes.
"Ligando de ácido nucleico", tal como se utiliza en la presente invención, es un ácido nucleico no natural que presenta una acción deseable sobre una diana SELEX. Una acción deseable incluye, pero sin limitación, la unión a la diana SELEX, el cambio catalítico de la diana SELEX, la reacción con la diana SELEX, de manera que modifica/altera la diana SELEX o la actividad funcional de la diana SELEX, la unión covalente a la diana SELEX como en un inhibidor suicida, facilitar la reacción entre la diana y otra molécula. En la realización preferida, la acción es la afinidad de unión específica por una molécula diana, siendo dicha molécula diana una estructura química tridimensional diferente de un polinucleótido que se une a un ligando de ácido nucleico a través de un mecanismo que depende del emparejamiento de bases Watson/Crick o la unión en triple hélice, donde el ligando de ácido nucleico no es un ácido nucleico que tiene la función fisiológica conocida de estar unido por la molécula diana. En realizaciones preferidas de la presente invención, el ligando de ácido nucleico de los complejos de la presente invención se identifica mediante la metodología SELEX. Los ligados de ácidos nucleico incluyen ácidos nucleicos que se identifican a partir de una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos, siendo dicho ácido nucleico un ligando de una diana determinada, mediante el método que comprende a) poner en contacto la mezcla de candidatos con la diana, donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la diana en relación con la mezcla de candidatos se pueden separar del resto de la mezcla de candidatos; b) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad del resto de la mezcla de candidatos, y c) amplificar los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecidos en
ligando.
"Mezcla de candidatos" es una mezcla de ácidos nucleicos de secuencia diferente a partir de la cual se selecciona un ligando deseado. El origen de la mezcla de candidatos pueden ser ácidos nucleicos o fragmentos de los mismos de origen natural, ácidos nucleicos sintetizados químicamente, ácidos nucleicos sintetizados químicamente o ácidos nucleicos producidos mediante la combinación de las técnicas anteriores. En una realización preferida, cada ácido nucleico tiene secuencias fijas que rodean una región aleatoria para facilitar el proceso de amplificación.
"Ácido nucleico" significa ADN, ARN, de cadena única o cadena doble y cualquier modificación química de los mismos. Las modificaciones incluyen, pero sin limitación, aquellas que proporcionan otros grupos químicos que incorporan carga adicional, polarizabilidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática, y fluxionalidad a bases de ligandos de ácidos nucleicos o al ligando de ácido nucleico como tal. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, modificaciones de azúcares en la posición 2', modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodo-uracilo, modificaciones en el esqueleto, tales como uniones fosforotioato internucleósidos, mutilaciones, combinaciones inusuales de emparejamiento de bases, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones en 3' y 5', tales como terminaciones.
El "compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado" es un compuesto de polietilenglicol de aproximadamente 1000 Da o más.
"Vesículas de bicapa lipídica" son esferas microscópicas cerradas rellenas de fluido que están formadas principalmente de moléculas individuales que tienen partes polares (hidrofílicas) y no polares (lipofílicas). Las partes hidrofílicas pueden comprender fosfato, glicerilfosfato, carboxi, sulfato, amino, hidroxi, colina y otros grupos polares. Ejemplos de grupos no polares son hidrocarburos saturados o insaturados, tales como alquilo, alquenilo u otros grupos lipídicos. Los esteroles (por ejemplo, colesterol) y otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables (incluyendo antioxidantes de tipo alfa-tocoferol) también se pueden incluir para mejorar la estabilidad de las vesículas o conferir otras características deseables.
"Liposomas" son un subgrupo de vesículas de bicapa y están comprendidas principalmente de moléculas de fosfolípidos que contienen dos colas hidrofóbicas que consisten en cadenas largas de ácidos grasos. Tras la exposición al agua, estas moléculas se alinean espontáneamente para formar una membrana en bicapa con extremos lipofílicos de las moléculas en cada capa asociada en el centro de la membrana y los extremos polares opuestos forman las respectivas superficies interna y externa de la membrana en bicapa. De este modo, cada cara de la membrana presenta una superficie hidrofílica mientras que el interior de la membrana comprende un medio lipofílico. Estas membranas cuando se forman se disponen generalmente en un sistema de membranas cerradas concéntricas separadas por fases acuosas interlamelares, de una manera no muy distinta de las capas de una cebolla, alrededor de un espacio acuoso interno. Estas vesículas multilamelares (MLV) se pueden convertir en vesículas pequeñas o unilamelares (UV), con la aplicación de una fuerza de cizalla.
"Liposoma catiónico" es un liposoma que contiene componentes lipídicos que tienen una carga positiva global a pH fisiológico.
La metodología "SELEX" implica la combinación de la selección de ligandos de ácido nucleico que interaccionan con una diana de una manera deseable, por ejemplo, uniéndose a una proteína, con la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados. El ciclo iterativo de las etapas de selección/amplificación permite la selección de uno o un pequeño número de ácidos nucleicos que interaccionan más fuertemente con la diana de un grupo que contiene una cantidad muy elevada de ácidos nucleicos. Se continúa con el ciclo del procedimiento de selección/amplificación hasta que se consigue un objetivo seleccionado. En la presente invención, la metodología SELEX se puede utilizar para obtener un ligando de ácido nucleico para una diana deseada.
La metodología SELEC se describe en las solicitudes de Patentes de SELEX.
"Diana SELEX" significa cualquier compuesto o molécula de interés para los que se desea un ligando. Una diana puede ser una proteína (tal como, VEGF, trombina y selectina), péptido, carbohidrato, polisacárido, glicoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, substrato, metabolito, análogo de estado de transición, cofactor, inhibidor, farmacia, colorante, nutriente, factor de crecimiento, etc., sin limitación. Los términos "diana SELEX" y "diana" se pueden utilizar indistintamente en la presente invención. Estará claro a partir del contexto de la frase si "diana" se refiere a "diana SELEX" o no.
"Diana" significa una localización preseleccionada en un sistema biológico que incluye tejidos, órganos, células, compartimentos intracelulares, componentes extracelulares. Éste último incluye hormonas (endocrinas, paracrinas, autocrinas), enzimas, neurotransmisores y constituyentes de fenómenos fisiológicos en cascada (por ejemplo, coagulación de la sangre, complemento, etc.).
"Propiedades farmacocinéticas mejoradas" significa que el ligando de ácido nucleico asociado con el compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado muestra una vida media de circulación más larga en relación con el mismo ligando de ácido nucleico no asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado u otras ventajas farmacocinéticas, tales como una mayor proporción de concentración de diana con respecto a no diana.
"Enlazador" es una entidad molecular que conecta dos o más entidades moleculares mediante interacciones covalentes o no covalentes.
"Espaciador" es un enlazador del tamaño que permite la separación espacial de dos o más entidades moleculares, de una manera que conserva las propiedades funcionales de una o más entidades moleculares.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar complejos que comprenden uno o más ligandos de ácido nucleico asociados con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado. Dichos complejos tienen una o más de las siguientes ventajas sobre un ligando de ácido nucleico que no está asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado: propiedades farmacocinéticas mejoradas, 2) capacidad mejorada para la liberación intracelular, o 3) capacidad mejorada para el reconocimiento.
Los complejos de la presente invención pueden aprovechar una, dos o las tres ventajas. Los complejos de la presente invención pueden contener diferentes ligandos de ácido nucleico que presentan objetivos totalmente diferentes en el complejo.
En una realización, el complejo de la presente invención está comprendido de un ligando de ácido nucleico unido covalentemente a polietilenglicol (PEG). Las propiedades farmacocinéticas del complejo aumentarán en relación con el ligando de ácido nucleico solo.
El compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado se une covalentemente con el ligando o ligandos de ácido nucleico. El polietilenglicol se puede unir covalentemente a un grupo hidroxilo u otro grupo en el extremo 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico. Sin embargo, preferiblemente, se une al grupo hidroxilo en 5' ó 3' del mismo. La unión del ligando de ácido nucleico a otros componentes del complejo se puede realizar directamente o con la utilización de enlazadores o espaciadores.
Un problema que se halla en el uso terapéutico y de diagnóstico in vivo de ácidos nucleicos es que los oligonucleótidos en su forma fosfodiéster se pueden degradar rápidamente en los fluidos corporales mediante enzimas intracelulares y extracelulares, tales como endonucleasas y exonucleasas, antes de manifestar el efecto deseado. Se pueden realizar ciertas modificaciones químicas del ligando de ácido nucleico para aumentar la estabilidad in vivo del ligando de ácido nucleico o para aumentar o mediar la liberación del ligando de ácido nucleico. Las modificaciones de los ligandos de ácido nucleico contempladas en la presente invención incluyen, pero sin limitación, aquellas que proporcionan otros grupos químicos que incorporan una carga adicional, polarizabilidad, hidrofobicidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y fluxionalidad a las bases del ligando de ácido nucleico o al ligando de ácido nucleico en general. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, modificaciones de azúcares en la posición 2', modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodo-uracilo, modificaciones en el esqueleto, modificaciones en fosforotioato o alquil fosfato, mutilaciones, combinaciones de emparejamiento de bases inusuales, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones en 3' y 5', tales como terminaciones.
Cuando los ligandos de ácido nucleico se derivan mediante el método SELEX, las modificaciones pueden ser pre- o post-SELEX. Las modificaciones pre-SELEX producen ligandos de ácido nucleico con ambas especificidades por su diana SELEX y estabilidad in vivo mejorada. Las modificaciones post-SELEX realizadas en ligandos de ácido nucleico con 2'-OH pueden dar lugar a una estabilidad in vivo mejorada son afectar de manera adversa a la capacidad de unión de los ligandos de ácido nucleico. Las modificaciones preferidas de los ligandos de ácido nucleico de la presente invención son las terminaciones de fosforotioato en 5' y 3' o la unión de fosfodiéster invertido 3'3' en el extremo 3'. Para los ligandos de ARN, se prefiere la modificación adicional de 2'-amino (2'-NH_{2}) de algunos o todos los nucleótidos.
En otro aspecto de la presente invención, la asociación del ligando de ácido nucleico con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado da lugar a propiedades farmacocinéticas mejoradas (es decir, una velocidad de depuración más lenta) en relación con el ligando de ácido nucleico no asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado.
Un ligando o ligandos de ácido nucleico asociados con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado puede aumentar la liberación intracelular del ligando o ligandos de ácido nucleico sobre el ligando o ligando de ácido nucleico no asociados.
En la realización preferida, los ligandos de ácido nucleico de la presente invención deriva de la metodología SELEX. SELEX se describe en la Solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie 07/536,428, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment", ya abandonada, la solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/714,131, solicitada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,475,096, la solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/931,473, solicitada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,270,163 (véase también PCT/US91/04078). Estas aplicaciones se denominan colectivamente Solicitudes de Patente de SELEX.
El proceso SELEX proporciona una clase de productos que son moléculas de ácido nucleico, cada uno con una secuencia única, y cada uno tiene la propiedades de unirse específicamente a una compuesto o molécula dianas deseadas. Las moléculas diana son preferiblemente proteínas, pero también pueden incluir, entre otros, carbohidratos, peptidoglicanos y una variedad de pequeñas moléculas. La metodología SELEX también se puede utilizar para reconocer estructuras biológicas, tales como superficies celulares o virus, mediante la interacción específica con una molécula que es una parte integral de esa estructura biológica.
En su forma más básica, el proceso SELEX se puede definir mediante la siguiente serie de etapas:
1) Se prepara una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos de diferente secuencia. La mezcla de candidatos incluye generalmente regiones de secuencias fijas, es decir, cada uno de los miembros de la mezcla de candidatos contiene las mismas secuencias en la misma localización) y las regiones de secuencias aleatorias. Las regiones de secuencia fija se seleccionan:
(a) para ayudar en las etapas de amplificación descritas a continuación, (b) para mimetizar una secuencia conocida por unirse a la diana, o (c) para aumentar la concentración de una disposición estructural determinada de los ácidos nucleicos en la mezcla de candidatos. Las secuencias aleatorias pueden ser totalmente aleatorias (es decir, la probabilidad de encontrar una base en cualquier posición es una de cuatro) o sólo parcialmente aleatoria (por ejemplo, la probabilidad encontrar una base en cualquier localización se puede seleccionar a cualquier nivel entre 0 y el 100 por cien).
2) La mezcla de candidatos se pone en contacto con la Diana seleccionada en condiciones favorables para la unión entre la diana y los miembros de la mezcla de candidatos. En estas circunstancias, la interacción entre la diana y los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos se puede considerar que forma parejas de ácido nucleico-diana entre la diana y los ácidos nucleicos que tienen la mayor afinidad por la diana.
3) Los ácidos nucleicos con la mayor afinidad por la diana se pueden separar de los ácidos nucleicos con menor afinidad a la diana. Debido a que sólo un número extremadamente pequeño de secuencias (y posiblemente sólo una molécula de ácido nucleico) que corresponden a los ácidos nucleicos de afinidad más elevada existen en la mezcla de candidatos, es generalmente deseable establecer el criterio de separación, de manera que se retiene una cantidad significativa de los ácidos nucleicos en la mezcla de candidatos (aproximadamente 5-50%) durante la separación.
4) Los ácidos nucleicos seleccionados durante la separación que tienen la afinidad relativamente más elevada por la diana se amplifican a continuación para crear una nueva mezcla de candidatos que se enriquece en ácidos nucleicos que tienen una afinidad relativamente más elevada por la diana.
5) Mediante la repetición de las etapas de separación y amplificación anteriores, la mezcla de candidatos recién formada contiene cada vez menos secuencias únicas, y el grado medio de afinidad de los ácidos nucleicos por la diana generalmente aumentará. Tomado en su extremo, el proceso SELEX producirá una mezcla de candidatos que contiene uno o un pequeño número de ácidos nucleicos que representan los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos original que tienen la afinidad más elevada por la molécula diana.
El método SELEX básico se ha modificado para conseguir un conjunto de objetivos específicos. Por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/960,093, solicitada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure." describe el uso de SELEX conjuntamente con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tales como ADN curvado. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/123,935, solicitada el 17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands", describe un método basado en SELEX para la selección de ligandos de ácido nucleico que contienen grupos fotoreactivos capaces de unirse y/o fotoreticularse y/o fotoinactivar una molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, solicitada el 7 de octubre de 1993, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", describe un método para identificar ligandos de ácido nucleico altamente específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente relacionadas, denominado Contra-SELEX. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/143,564, solicitada el 25 de octubre de 1993, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", describe un método basado en SELEX que consigue una separación altamente eficaz entre oligonucleótidos que tienen una afinidad elevada y baja por una molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/964,624, solicitada el 21 de octubre de 1992, titulada "Methods of Producing Nucleic Acid Ligands" describe métodos para obtener ligandos de ácido nucleico mejorados después de realizar SELEX. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/400,440, solicitada el 8 de marzo de 1995, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX", describe métodos para unir covalentemente un ligando a su diana.
El método SELEX comprende la identificación de ligandos de ácido nucleico de afinidad elevada que contiene nucleótidos modificados que confieren características mejoradas en el ligando, tal como una estabilidad in vivo mejorada o características de liberación mejoradas. Entre los ejemplos de dichas modificaciones se incluyen sustituciones químicas en las posiciones de ribosa y/o fosfato y/o bases. Los ligandos de ácido nucleico identificados por SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/117,991, solicitada el 8 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5 y 2' de pirimidinas. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, supra, describe ligandos de ácido nucleico altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH_{2}), 2'-fluoro (2'-F), y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/264,029, solicitada el 22 de junio de 1994, titulada "Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement", describe oligonucleótidos que contienen diversas pirimidinas modificadas en 2'.
El método SELEX comprende combinar oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales que no son oligonucleótidos tal como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/284,063, solicitada el 2 de agosto de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX" y la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/234,997, solicitada el 28 de abril de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX", respectivamente. Estas solicitudes permiten la combinación del amplio espectro de formas y otras propiedades, y las propiedades de amplificación y replicación eficaces de oligonucleótidos con las propiedades deseadas de otras moléculas. Cada una de las solicitudes de patente descritas anteriormente que describen modificaciones del procedimiento SELEX básico se incorpora específicamente por referencia en su totalidad.
SELEX identifica ligandos de ácido nucleico que son capaces de unirse a dianas con afinidad elevada y con una especificad excepcional, que representa un logro singular que no tiene precedentes en el campo de la investigación de los ácidos nucleicos. Estas características son naturalmente las propiedades deseadas que un experto en la materia buscaría en un ligando terapéutico o de diagnóstico.
Con el fin de producir ligandos de ácido nucleico deseables para su uso como producto farmacéutico, se prefiere que el ligando de ácido nucleico (1) se une a la diana de manera que es capaz de conseguir el efecto deseado en la diana; (2) sea tan pequeño como sea posible para obtener el efecto deseado; (3) sea tan estable como sea posible; y (4) sea un ligando específico para la diana elegida. En la mayoría de las situaciones, se prefiere que el ligando de ácido nucleico tenga la afinidad más alta posible por la diana. Adicionalmente, los ligandos de ácido nucleico pueden tener propiedades auxiliares.
En la Solicitud de Patente de Estados Unidos en trámite y habitualmente designada de No. de Serie 07/964,624, solicitada el 21 de octubre de 1992 ('624), se describen métodos para obtener ligandos de ácido nucleico mejorados después de realizar SELEX.
En realizaciones en las que el ligando o ligandos de ácido nucleico pueden actuar con capacidad de reconocimiento, los ligandos de ácido nucleico adoptan una estructura tridimensional que debe retenerse con el fin de que el ligando de ácido nucleico sea capaz de unirse a su diana. Además, el ligando de ácido nucleico debe orientarse correctamente con respecto a la superficie del complejo, de manera que su capacidad de unión a la diana no esté comprometida. Esto se puede conseguir mediante la unión del ligando de ácido nucleico en una posición que está distante de la parte de unión del ligando de ácido nucleico. La estructura tridimensional y la orientación adecuada también se pueden conservar mediante el uso de un enlazador o espaciador tal como se ha descrito anteriormente.
Se puede unir o incorporar en el complejo cualquier variedad de agentes terapéuticos o diagnóstico tal como se ha descrito anteriormente para la liberación dirigida por el complejo.
En otras realizaciones, el complejo de la presente invención está comprendido de un ligando de ácido nucleico unido a PEG. En esta realización, se mejoran las propiedades farmacocinéticas del complejo en relación con el ligando de ácido nucleico solo. Tal como se ha descrito anteriormente, la asociación es a través de enlaces covalentes. También, tal como se ha descrito anteriormente, el PEG puede estar unido covalentemente a una variedad de posiciones en el ligando de ácido nucleico. Cuando se utiliza PEG, se prefiere que el ligando de ácido nucleico se una a 5' tiol a través de una funcionalidad maleimida o vinil sulfota o a través de una unión fosfodiéster. En realizaciones adicionales, se pueden unir ente sí un conjunto de moléculas PEG.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para explicar e ilustrar la presente invención y no deben tomarse como limitantes de la invención. Las estructuras de los ligandos de ácido nucleico descritas en los ejemplos siguientes se muestran en la figura 1. El ejemplo 1 describe la conjugación de ligandos de ácido nucleico con lípido, dialquil glicerol o diacil glicerol, así como la incorporación de modificadores farmacocinéticas a través de la síntesis automatizada. El ejemplo 2 describe la conjugación de PEG y colesterol con un ligando de ácido nucleico. Las modificaciones al ligando de ácido nucleico no interfieren con su capacidad para unirse a su diana SELEX, ya que las afinidades de unión de los ligandos de ácido nucleico conjugados a PEG y colesterilados eran idénticas a las moléculas no conjugadas y no colesteriladas. El ejemplo 3 describe las propiedades farmacocinéticas de ligandos de ácido nucleico asociados con colesterol solo, dialquil glicerol solo, con PEG solo, con colesterol y liposoma, con dialquil glicerol y liposomas, y con PEG y liposoma. También se incluyen los ligandos de ácido nucleico que han sido modificados en la posición del azúcar 2' de purinas y pirimidinas. El ejemplo 4 describe la conjugación covalente de ligandos de ácido nucleico a liposomas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Reactivos lípidos, PEG, dialquil glicerol y diacil glicerol para la modificación de oligonucleótidos
En este ejemplo, se describe la conjugación de ligandos de ácido nucleico con reactivos lípidos y/o PEG o diacil glicerol o dialquil glicerol, así como la incorporación de los modificaciones farmacocinéticas a través de la síntesis automatizada utilizando química de acoplamiento de fosforamidita o H-fosfonato. En los esquemas representados a continuación, una flecha representa las etapas que se han completa, mientras que una flecha discontinua representa las etapas que aún no se han completado. El esquema 1 representa la preparación de un reactivo dipalmitoil fosfatidil etanolamina maleimida para acoplarse a sustratos de oligonucleótidos modificados con sulfhidrilo. Este procedimiento es análogo al descrito por Cheronis et al (Cheronis, J. C. et al., J. Med. Chem. (1992) 35: 1563-1572) para la preparación de reactivos bis- y tris-maleimida a partir de sustrato alifáticos di- y triamina simples. El tratamiento del fosfolípido con metoxicarbonil maleimida daba lugar a la formación de un intermedio no caracterizado que, tras la incubación con oligonucleótidos modificado con sulfhidrilo, daba lugar a la conversión completa del oligonucleótido al conjugado de dipalmitoil fosfatidil etanolamina (vida infra). Reactivos similares también se encuentran disponibles comercialmente de Avanti Polar Lipids.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema 1
1
La capacidad de modificar oligonucleótidos bajo condiciones de síntesis automatizada tiene ventajas obvias. Los reactivos se prepararon de manera que permitían la incorporación fácil de grupos de lípidos y/o PEG bajo condiciones de síntesis automatizadas estándar. Inicialmente, se diseñó y se sintetizó el módulo versátil 10 (Esquema 2) que se podía convertir de forma divergente en cualquier cantidad de reactivos de modificación de oligonucleótidos de interés mediante la simple funcionalización quimioselectiva del grupo amino y a continuación la fosfotilación del grupo hidroxilo. Cabe indicar la flexibilidad que esta estrategia ofrece con respecto al grupo de modificación (el ligando amina) y al precursor fosfato activado (fosforamidita, H-fosfonato o fosfato triéster) introducido a través de la derivatización del grupo 2'-hidroxilo. Adicionalmente, el núcleo de glicerol de los reactivos de la síntesis automatizada preparados de esta manera hace que los productos sean adecuados para la modificación de oligonucleótidos en las posiciones internas de cadena, o en el extremo 5'. Una síntesis alternativa del módulo 10 se muestra en el Esquema 3. Se derivatiza tetraetilenglicol (1; TEG) como el monotosilato 2a tras el tratamiento con una cantidad limitante de cloruro de p-toluensulfonilo, preferiblemente 10% molar, en un medio básico, preferiblemente piridina. De esta manera, se obtuvo 2a en un 75% de rendimiento tras la filtración en gel de sílice. Se realizó la conversión de 2a al TEG ftalimida 3 a en un 80% de rendimiento tras el tratamiento con ftalimida en presencia de diazabicicloundecano (DBU) como base a temperatura elevada en solución DMF. La alilación de la ftalimida 3 a (bromuro de alilo, NaH, THF/DMF) permitió obtener un 65% de rendimiento de alil TEG 4a. El tratamiento de 4a con OsO_{4} al 0,5% y 1,1 equivalentes de N-metilmorfolina N-óxido (NMO) permitió obtener un intermedio de diol que se convirtió, sin purificación adicional, en derivado éter de dimetoxitritil (DMT) 9 en un 89% de rendimiento global para las dos etapas. Finalmente, se llevó a cabo la desprotección de la amina utilizando MeNH2 al 40% para proporcionar 10 en un 95% de rendimiento purificado. Se ha elaborado adicionalmente el módulo 10 mediante tratamiento con PEG nitrofenilcarbonato (PEG-NFC; Shearwater Polymers). De este modo, se preparó el precursor 12 de fosfitilación (Esquema 4) con un rendimiento excelente. Se han llevado a cabo conversiones adicionales de 12 tanto en fosforamidita 13 como H-fosfonato 14.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema 2
\vskip1.000000\baselineskip
2
\newpage
Esquema 3
3
Esquema 4
4
El diseño de un reactivo de lípido para modificación de oligonucleótido mediante síntesis automatizada necesita la sustitución de los enlaces éster de diacilgliceroles nativos, como en el derivado de dipalmitoil fosfatidilo descrito anteriormente, mediante enlaces de glicerolalquilo estables al protocolo de desprotección básica requerido para la recuperación de oligonucléotidos sintéticos. El enlace que se eligió para explorar inicialmente fue el enlace éter, como en el derivado de dipalmitil glicerol 15 conocido (disponible en Sigma), aunque también serían adecuados carbamatos de alquilo de larga cadena (o una combinación de éteres y carbamatos). Se activó el dipalmitil glicerol como el acil carbonil imidazol (CDI, piridina) y este intermedio activado se acopló con el módulo 10 (piridina, 80ºC; 44%). La fosfitilación (ClP(iPr_{2}N)OCH_{2}CH_{2}CN; diisopropietilamina (DIPEA), CH_{2}Cl_{2}; 59%) de 16 proporcionó la fosforamidita 17 (Esquema 5). En el Esquema 6 se muestra la síntesis de un análogo C_{18} de amidita 17 a través de un intermedio de cloroformiato. Se convirtió el dialquil glicerol (18; DAG) en el correspondiente cloroformiato 19 tras el tratamiento con fosgeno en exceso en tolueno. Se llevó a cabo la conjugación de 19 y el aminoalcohol 10 en piridina para proporcionar el aducto 20 con un 57% de rendimiento purificado. La fosfitilación del hidroxilo secundario de 20 bajo condiciones estándar proporcionó la fosforamidita 21 con 95% de rendimiento. El acoplamiento de la amidita 17 al extremo 5' de un trinucleótido (TTT) en un sintetizador automatizado de oligonucleótidos ABI 394 utilizando un ciclo de síntesis ligeramente modificado con tiempos de acoplamiento extendidos (acoplamientos de 2x 30 min) para la amidita de lípido dio lugar a 94+% de eficacia del acoplamiento, tal y como se determina mediante el análisis del catión tritilo en línea.
Esquema 5
5
Esquema 6
6
Ejemplo A
Síntesis de dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE)
Reactivo maleimida: Se agitó a temperatura ambiente una suspensión de 200 mg (0,289 mmol) de DPPe y 54 mg (0,347 mmol) de metoxicarbonil maleimida en 10 mL de THF/solución saturada de NaHCO_{3} (1:1). Después de 12 horas, la mezcla se trató con 100 mL de EtOAc y la fase orgánica (que contenía una suspensión gelatinosa del producto) se separó de la fase acuosa. La fase orgánica se concentró al vacío, se coevaporó dos veces con MeOH, y el sólido blanco resultante se trituró tres veces con EtOAc. Esta material se utilizó sin caracterización o purificación adicional en experimentos de conjugación de oligonucleótidos (vida Infra).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo B
Síntesis y elaboraciones del módulo 10 de síntesis automatizada
Tetraetilenglicol dimetoxitritil éter (2): Se disolvió tetraetilenglicol (76,4 ml, 0,44 mol) en 300 mL de piridina anhidra y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (15 g, 0,044 mol) como un sólido con agitación. El matraz de reacción se cubrió con un tubo de secado y se dejó que la reacción se calentara hasta temperatura ambiente durante la noche. La reacción se concentró al vacío a baja temperatura (<30ºC). El residuo se diluyó con 300 mL de acetato de etilo y se extrajo con 3 x 300 mL de agua. Las capas acuosas combinadas se extrajeron con acetato de etilo y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía súbita utilizando 1000 mL de gel de sílice (empaquetado en húmedo en la columna utilizando trietilamina al 5% que contenía hexano), eluyendo con acetato de etilo al 10-20-40-60-80% en trietilamina al 5% que contenía hexano y a continuación, trietilamina al 5% que contenía acetato de etilo. Se recogieron 19,51 g (89%) de 2 como un aceite dorado. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.47-7.16 (señales solapantes, 9H), 6.79 (d, 4H), 3.72 (s, 6H), 3.66-3.62 (m, 2H), 3.22 (t, J=5.22 Hz, 1H), 2.96 (br t, 1H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 158.12, 144.86, 136.04, 129.81, 127.93, 127.49, 126.40, 112.78, 85.67, 72.31, 70.48, 70.44, 70.12, 62.89, 61.39, 54.89; MS m/e de baja resolución calculado para C_{15}H_{25}O_{7}S (M-DMT+1+): 349,167, hallado 349,1.
Tetraetilenglicol dimetoxitritil éter p-toluensulfonato (3): Se disolvió el compuesto 2 (5,0 g, 10,06 mmol) en 50 mL de diclorometano anhidro y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió trietilamina (1,82 mL, 13,1 mmol), seguido de cloruro de p-toluensulfonilo (1,92 g, 10,06 mmol) como sólido, con agitación. La mezcla de reacción se almacenó en el refrigerador durante toda la noche. El análisis TLC indicó que la reacción se completó aproximadamente en un 80%, Se añadieron adicionalmente 0,5 equivalentes de trietilamina y 0,5 equivalentes de cloruro de p-oluensulfonilo y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de Celita y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 300 mL de gel de sílice (empaquetado en húmedo en la columna utilizando trietilamina al 5% en hexano) eluyendo con acetato de etilo al 25-50-75% en hexano que contenía trietilamina al 5% y, a continuación, acetato de etilo que contenía trietilamina al 5%. Se recogieron 5,7 g (87%) de 3 como un aceite naranja. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.75 (d, 2H), 7.44-7.12 (m, 11H), 6.78 (d, 4H), 4.12-4.09 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 3.66-3.54 (m, 13H), 3.22 (t, J=3.87 Hz, 2H), 2.41 (s, 3H).
Tetraetilenglicol monotosilato (2a): Se disolvió tetraetilenglicol (200 mL, 1,15 mol) en 500 mL de piridina y se enfrió hasta 0ºC y se trató con 22,0 g (0,115 mol) de cloruro de p-toluensulfonilo. Cuando se completó la solución, la mezcla de reacción se almacenó en el refrigerador durante la noche, y a continuación se concentró al vacío. El residuo se disolvió en 800 mL de EtOAc y se extrajo con 3 x 600 mL de H2O. Las fracciones acuosas se retroextrajeron con EtOAc, y las fracciones de EtOAc combinadas se extrajeron con Na2HPO4 acuosa saturado. La fase orgánica se secó sobre MgSO4 y se concentró hasta una aceite incoloro. El aceite se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 800 mL de gel de sílice y eluyendo con hexano, EtOAc al 25%-EtOAc al 505 en hexano, a continuación EtOAc, a continuación MeOH al 10%-MeOH al 20% en EtOAc para obtener 23,7 g (60% de producto puro y 11% de producto que contenía una impureza menor. 2a: 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.77 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J=8.1 Hz, 2H), 4.13 (t, J=4.8 Hz, 2H), 3.68-3.53 (m, 14H), 2.58 (t, J=5.6 Hz, 1H), 2.42 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl_{3}) d 168.2, 158.3, 144.8, 135.9, 133.8, 132.0, 129.9, 128.0, 127.7, 126.6, 123.1, 113.0, 85.9, 73.0, 70.6, 70.4, 70.0, 69.7,67.8,64.4,55.1,37.1; MS m/e de baja resolución calculada para C_{15}H_{24}O_{8}S (M+1): 349,1.
Tetraetilenglicol monoftalimida (3a): A una solución agitada de 31,96 g (0,092 mol) de 2a en 400 mL de DMF anhidro se añadieron 14,2 g (1,05 equiv.) de ftalimida y 14,4 ml (1,05 equiv.) de 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno. La solución se calentó a 70ºC durante 18 h, a continuación se concentró al vacío. El aceite amarillo crudo se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 1600 mL de gel de sílice y eluyendo con EtOAc al 25%-EtOAc al 50%-EtOAc al 75% en hexano, a continuación EtOAc, a continuación MeOH al 10%-MeOH al 20% en EtOAc para obtener 23,8 g (80%) de 3 a como un aceite. Tras reposo, 3 a se convirtió en un sólido blanco ceroso. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.84-7.78 (m, 2H), 7.70-7.66 (m, 2H), 3.86 (t, J=5.6 Hz, 2H), 3.70 (t, J=5.6 Hz, 2H), 3.64-3.51 (m, 12H), 2.67 (bs, 1H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 168.2, 133.8, 132.0, 123.1, 72.4, 70.5, 70.4, 70.2, 70.0, 67.8, 61.6, 37.2.
Síntesis del compuesto 4a: Una solución de 15 g (0,0464 mol) de 3a en 150 mL de THF y 15 mL de DMF se enfrió hasta 0ºC bajo Ar. Se añadió bromuro de alilo (6,0 ml, 1,5 equiv.) a la solución, seguido de la adición de 1,76 g (1,5 equiv.) de NaH como sólido. La suspensión amarilla opaca se agitó a 0ºC durante 30 minutos y a continuación a temperatura ambiente durante 18 horas. Se añadió y concentró MeOH (50-100 mL) y a continuación se concentró la mezcla al vacío. El material crudo se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 1500 mL de gel de sílice y eluyendo con EtOAc al 25%-EtOAc al 50%-EtOAc al 75% en hexano, a continuación EtOAc, a continuación MeOH al 10% en EtOAc para obtener 11,05 g (65%) de 4^{a} como un aceite amarillo. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.84-7.80 (m, 2H), 7.72-7.67 (m, 2H), 5.94-5.84 (m, 1H), 5.28-5.14 (m, 2H), 3.99 (d, J=5.61 Hz, 2H), 3.88 (t, J=5.85 Hz, 2H), 3.72 (t, J=5.76 Hz, 2H), 3.64-3.54 (m, 13H); 13C NMR (75 MHz. CDCl_{3}) d 168.0, 134.6, 133.7, 131.9, 123.0, 116.9, 72.0, 70.4, 69.9, 69.2, 67.7, 37.0.
(S)-(+)-2,2-Dimetil-1,3-dioxolanil-4-ilmetil (dimetoxitritil) tetraetilen glicol (5): se pesó hidruro sódico (0,56 g, 23,5 mmol) en un matraz secado a la llama, y se añadieron 70 mL de tetrahidrofurano anhidro y 15 mL de N,N-dimetilformamida anhidro. La suspensión se enfrió hasta 0ºC bajo argón, y se añadió gota a gota (S)-(+)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol (2,7 mL, 21,7 mmol) a través de una jeringa. Después de agitar durante 30 minutos a 0ºC, se añadió gota a gota el compuesto 3 (11,77 g, 18,1 mmol) en 15 mL de tetrahidrofurano mediante un embudo de adición. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, a continuación se detuvo con 100 mL de bicarbonato acuoso saturado y se diluyó con 300 mL de dietil éter. Las capas se separaron, y la capa de éter se extrajo 3 veces con 300 mL de agua. La capa de éter se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 500 mL de gel de sílice y eluyendo primero con hexano y a continuación acetato de el etilo al 10-20-30-40-50-75% en hexano y, a continuación, con acetato de etilo. Se recogieron 8,93 g (82%) de 5 como un aceite incoloro. 1H RMN (CDCl_{3}) d 7.46-7.43 (m, 2H), 7.34-7.17 (m, 7H), 6.78 (d, 4H), 4.23 (penteto, J=6.1 Hz, 1H), 4.00 (t, 8.2H), 3.75 (s, 6H), 3.71-3.60 (m, 15H), 3.53 (dd, J=10.0, 5.7 Hz, 1H), 3.52 (10.4, J=5.2 Hz, 1H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl_{3}) d 158.24, 144.97, 136.20, 129.93, 128.07, 127.61, 126.51, 112.89, 109.21, 85.77, 74.57, 72.20, 70.82, 70.59, 70.40, 69.68, 66.67, 63.01, 55.04, 26.67, 25.29; MS m/e de baja resolución calculada para C_{35}H_{50}O_{9}N (M+NH4 +): 628.399, encontrado
628.5.
(S)-(+)-2,2-Dimetil-1,3-dioxolanil-4-ilmetil tetraetilenglicol (6): Se enfriaron 100 mL de ácido acético al 80% hasta 0ºC y, a continuación, se añadió a un compuesto 5 (6,6 g, 10,8 mmol). La solución naranja clara se agitó a 0ºc durante 1 hora. Se añadió metanol (100 mL) y la mezcla de reacción se concentró al vacío a baja temperatura (<30ºC). El residuo se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 200 mL de gel de sílice, eluyendo primero con acetato de etilo y, a continuación metanol al 5-10-15-20% en acetato de etilo. Se recogieron 2,5 g (74%) de 6 como un aceite incoloro. 1H RMN (CDQ3) d 4.21 (penteto, J=6.2 Hz, 1H), 4.08 (dd, J=5.9, 4.8 Hz, 1H), 3.82-3.35 (m, 19H), 2.93 (br s, 1H), 1.34 (s, 3H), 1.28 (s, 3H); 13C RMN (75 MHz. CDCl_{3}) d 109.20, 74.50, 72.42, 72.14, 70.76, 70.39, 70.32, 70.14, 66.63, 61.48, 26.61, 25.23; MS m/e de baja resolución calculada para C_{35}H_{50}O_{9}N (M+NH4+): 628.399, encontrado 628.5.
(S)-(+)-2,2-Dimetil-1,3-dioxolanil-4-ilmetil (ftalimida) tetraetilen glicol (8): Se disolvió el alcohol 6 (4,06 g, 13,2 mmol) en 50 mL de diclorometano anhidro y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió trietilamina (3,7 mL, 26,3 mmol), seguido de la adición de cloruro de p-toluensulfonilo (3,26 g, 17,1 mmol). El matraz de reacción se cubrió por un tubo de secado y se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y el filtrado se concentró al vacío. El material crudo se purificó mediante cromatografía súbita en 400 ml de gel de sílice, eluyendo primero con acetato de etilo al 10% en hexano, y a continuación acetato de etilo al 20-40-60-80-100%, y a continuación metanol al 10% en acetato de etilo. Se recogieron 5,21 g (85%) del intermedio tosilato como un aceite dorado (1H RMN (400 MHz, CDCl_{3}) d 7.79 (d, J=8.1 Hz, 2H, aromáticos de tosilo), 7.32 (d, J=8.1 Hz, 2H, aromáticos de tosilo), 4.25 (penteto, J=6.0 Hz, 1H), 4.13 (t, 4.7H), 4.02 (dd, J=8.12, 6.4 Hz, 1H), 3.71-3.40 (m, 18H), 2.42 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.34 (s, 3H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 144.74, 133.1, 129.76, 127.91, 109.8, 74.63, 72.27, 70.89, 70.68, 70.52, 70.44, 69.19, 68.60, 66.74, 64.1, 26.73, 25.34, 21.59; MS m/e de baja resolución calculada para C_{21}H_{38}O_{9}NS (M+NH4+): 480,364, encontrado 480,2.) El tosilato (5,2 g, 11,24 mmol) se disolvió en 60 mL de dimetilformamida anhidra. Se añadió 1,8-diazabiciclo-[5.4.0]undec-7-eno (1,7 mL, 11,24 mmol), seguido de ftalimida (1,65 g, 11,24 mol). La mezcla de reacción se calentó hasta 70ºC durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía súbita en 400 mL de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo al 50% en hexano. Se recogieron 3,96 g (81%) de 8 como un aceite incoloro. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.83-7.79 (m, 2H), 7.72-7.68 (m, 2H), 4.26 (penteto, J=6.0 Hz, 1H), 4.03 (dd, J=8.2, 6.5 Hz, 1H), 3.88 (t, J=5.8 Hz, 1H), 3.74-3.44 (m, 18H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H); 13C RMN (75 MHz. CDCl_{3}) d 168.21, 133.88, 132.10, 123.19, 109.33, 74.66, 72.30, 70.90, 70.52, 70.04, 67.87, 66.79, 37.19, 26.75, 25.37; MS m/e calculada para C_{22}H_{35}O_{8}N_{2} (M+NH4+): 455,288, encontrado 455.2.
1-Dimetoxitriril-3-(ftalimidotetraetilen glycolil)-sn-glicerol (9): Según el esquema 2, se sintetiza el compuesto 9 de la siguiente manera: se disolvió el acetilo 8 (5,16 g, 11,8 mmol) en 100 mL de metanol anhidro, y se añadió ácido p-toluen sulfónico anhidro (100 mg). El matraz de reacción se cubrió con un tubo de secado y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas, a continuación se neutralizó mediante la adición de 10 mL de piridina anhidra, se concentró al vacío y se coevaporó con piridina anhidra. El diol resultante se disolvió a continuación en 1,50 mL de piridina anhidra y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió cloruro de 4,4-dimetoxitritilo (4,39 g, 13 mmol) como un sólido. El matraz de reacción se cubrió con un tubo de secado y la mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante la noche. Se añadió metanol (50 mL), y la mezcla de reacción se concentró al vacío. El material crudo se purificó mediante cromatografía súbita en 700 mL de gel de sílice (empaquetado en húmedo en una columna con trietilamina 1l 5% en hexano), eluyendo primero con acetato de etilo al 10% en hexano (que contiene trietilamina al 5%). Se recogieron 6,98 g (82%) de 9 como un aceite amarillo claro. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.80 (dd, J=5.4, 3.1 Hz, 2H), 7.68 (dd, J=5.4, 3.1 Hz, 2H), 7.42-7.14 (m, 9H, DMT), 6.79 (d, 4H, DMT), 3.95 (br m, 1H). 3.86 (t, J=5.9 Hz, 1H), 3.75 (s, 6H), 3.70 (t, J-5.6 Hz, 1H), 3.63-3.37 (m, 18H), 3.16 (m, 2H), 2.84 (br d, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl_{3}) d 168.15, 158.32, 144.79, 135.95,133.82, 132.02, 129.95, 128.04, 127.69, 126.64, 123.12, 112.97, 85.89, 72.97, 70.64, 70.43, 69.97, 69.74, 67.80, 64.34, 55.10, 37.14; MS m/e de baja resolución calculada para C_{40}H_{49}O_{10}N_{2} (M+NH4+): 717,398, encontrado 717,5. Según el esquema 3, el compuesto 9 se sintetizó de la siguiente manera: A una solución agitada de 4a (10,13 g, 0,0279 mol) en 100 mL de acetona y 1 mL de H_{2}O se añadieron 3,98 g (1,22 equiv.) de N-metilmorfolina N-óxido. A esta suspensión se añadieron 1,75 mL (0,05 equiv.) de tetróxido de osmio como una solución al 2,5% en iPrOH. Después de la adición de la solución de OsO4, la mezcla de reacción se volvió de color amarillo claro. Después de que el análisis TLC indicara una conversión completa de 4a (aproximadamente 16 horas), la mezcla de reacción se trató con 1,5 g de hidrosulfito sódico y 5,0 g de florisilo y se agitó durante 30 minutos. La suspensión se filtró a través de florisilo, el filtrado se concentró hasta obtener un aceite. Este producto crudo se combinó con otro lote preparado de la misma manera a partir de 1,0 g de 4a. Dos partes de 100 ml de piridina se coevaporaron de los lotes combinados y el residuo se disolvió en 300 mL de piridina. La solución se enfrió hasta 0ºC y se añadieron 10,89 g (1,05 equiv.) de cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo. Se insertó un tubo de secado en el matraz y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La solución se trató con 20 mL de MeOH y se concentró al vacío, manteniendo la temperatura del baño de agua por debajo de 40ºC. El aceite crudo se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 100 mL de gel de sílice (empaquetado en húmedo en la columna utilizando trietilamina al 3% en hexano), y eluyendo con EtOac al 10-100% en hexano (todos contenían trietilamina al 35) para obtener 21,3 g (89% después de dos etapas) de 9 como un aceite amarillo. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.80-7.77 (m, 2H), 7.66-7.64 (m, 2H), 7.39-7.22 (m, 9H), 7.20-6.76 (m, 4H), 3.97 (bs, 1H), 3.84 (t, J=5.97 Hz, 2H), 3.74 (s, 6H). 3.68 (t, J=5.7 Hz, 2H), 3.60-3.49 (m, 14H), 3.13-2.76 (m, 2H), 2.00 (bs, 1H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 168.2, 158.3, 144.8, 135.9, 133.8, 132.0, 129.9, 128.0, 127.7, 126.6, 123.1, 113.0, 85.9, 73.0, 70.6, 70.4, 70.0, 69.7, 67.8, 64.4, 55.1, 37.1; MS m/e de baja resolución calculada para C_{40}H_{45}O_{10}N
(M+NH4+): 717.5.
1-Dimetoxitritil-3-(aminotetraetilen glicolil)-sn-glicerol (10): Según el esquema 2, el compuesto 10 se sintetizó de la siguiente manera: se recibió el compuesto 9 (5,2 g, 7.2 mmol) en 50 mL de metilamina al 40% en H_{2}O y se añadieron 10 mL de metanol para solubilizar el material de partida. La mezcla de reacción se calentó a 50ºC durante 5 horas, y a continuación, se concentró al vacío y se coevaporó con tolueno. El material crudo se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") en 200 mL de gel de sílice, eluyendo con amoniaco metanólico al 15% en diclorometano. Se recogieron 3,94 g (96%) de 10 como un aceite amarillo claro. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.46-7.21 (m, 9H, DMT), 6.81 (d, 4H, DMT), 4.00 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.70-3.49 (solapante m, 18H), 3.20 (dd, J=9.24, 5.49 Hz, 1H), 3.12 (dd, J=9.21, 6.0 Hz, 1H), 2.84-2.80 (m, 3H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 158.30, 144.82, 136.01, 129.95, 128.04, 127.66, 126.61, 112.95, 85.85, 73.46, 72.85, 70.55, 70.45, 69.99, 69.51, 64.43, 55.10, 41.40; MS m/e de baja resolución calculada para C_{32}H_{44}O_{8}N (M+1+): 570.353, encontrado 570.4.
Según el esquema 3, el compuesto 10 se sintetizó de la siguiente manera: se recibió el compuesto 9 (5,2 g, 7.2 mmol) en 50 mL de metilamina al 40% en H_{2}O y se añadieron 10 mL de metanol para solubilizar el material de partida. La mezcla de reacción se calentó a 50ºC durante 5 horas, y a continuación, se concentró al vacío y se coevaporó con tolueno. El material crudo se purificó mediante cromatografía súbita ("flash") en 200 mL de gel de sílice, eluyendo con amoniaco metanólico al 15% en diclorometano. Se recogieron 3,94 g (96%) de 10 como un aceite amarillo claro. 1H NMR (300 MHz. CDCl_{3}) d 7.46-7.21 (m, 9H, DMT), 6.81 (d, 4H. DMT), 4.00 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.70-3.49 (solapante m, 18H), 3.20 (dd, J=9.24, 5.49 Hz, 1H), 3.12 (dd, J=9.21, 6.0 Hz, 1H), 2.84-2.80 (m, 3H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 158.30, 144.82, 136.01, 129.95, 128.04, 127.66, 126.61, 112.95, 85.85, 73.46, 72.85, 70.55, 70.45, 69.99, 69.51,64.43, 55.10.41.40; MS m/e de baja resolución calculada para C_{32}H_{44}O_{8}N (M+1+): 570.353, encontrado 570.4.
Reactivo PEG 12: a una solución agitada de 0,24 g (0,41 mmol) de 10 en 10 mL de DMF se añadieron 2,08 g (0,4 mmol) de carbonato de metoxi-PEG5000-nitrofenilo (Shearwater Polymers, Inc.). La mezcla se agitó 70 h, a continuación se concentró al vacío. El residuo se disolvió en EtOAc y la fase orgánica se lavó con tres partes de 30 mL de una solución de NaOH al 10%. La purificación mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 100 mL de gel de sílice (empaquetado en húmedo con diclorometano que contenía Et_{3}N al 5%), y eluyendo con amoniaco metanólico al 5-10-15-20%, permitió obtener 1,97 g (85%) de 12 como un sólido blanco. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.42-7.39 (d, 2H, DMT), 7.39-7.18 (m, 7H, DMT), 6.79 (d, 4H, DMT), 5.70 (br m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.88 (t, J=4.4 Hz, 1 H), 3.81 (s, 6H, DMT), 3.78-3.50 (br m, ~500, PEG Hs), 3.42-3.31 (solapante ms), 3.35 (s, PEG Me), 3.16 (m, 2H), 2.84 (br d, 4.2H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 159.36, 157.19, 146.15, 136.95, 130.83, 128.86, 128.65, 127.61, 111.86,86.48, 73.58, 72.88, 72.5-70.0 (carbonos de PEG), 68.31, 65.77, 64.45, 41.36, 30.75 (impureza no asignada).
Reactivo PEG Fosforamidita 13: A una solución agitada de 2,22 g (0,4 mmol) de 12 en 60 mL de THF sobre tapices moleculares de 3 \ring{A}, se añadieron 0,24 mL (1,39 mmol) de diisopropiletilamina y 0,1 mL (0,44 mmol) de 2-cianoetil N,N-diisopropilclorofosforamidita. Después de 5 h, el ^{31}P RMN indicó la formación del producto deseado, así como la adición de agente fosfitilizante hidrolizado y 0,05 ml adicionales (0,22 mmol) de 2-cianoetil N,N-diisopropilclorofosforamidita. Después de 12 h, se añadieron 0,07 mL (0,4 mmol) de DIPEA y 0,1 mL de la clorofosforamidita. La mezcla se agitó durante 2 días, se filtró a través de Celite y se concentró al vacío. El residuo se trituró con varias partes de éter. ^{31}P RMN d 156.4, 155.8. También se observaron señales a d 20.6, 19.8 que presumiblemente correspondían al reactivo de fosfitilación hidrolizado.
Reactivo PEG H-fosfonato 14: a una solución a 0ºC agitada de imidazol anhidro (0,4 g; 5,9 mmol) en 10 mL de MeCN, reañadieron 0,17 mL (1,9 mmol) de PCl3, seguido de 0,86 mL (6,2 mmol) de Et3N. a esta mezcla, se añadió gota a gota una solución de 3,0 g (0,55 mmol) de 12 en 12 mL de MeCN. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas, se trató con 10 mL de una solución de bicarbonato de trietilamonio 0,1 M y se concentró al vacío. Se coevaporaron trietilamina y a continuación tolueno del residuo crudo, a continuación, el producto se disolvió en diclorometano. La fase orgánica se lavó con una solución bicarbonato de trietilamonio (TEAB) 1,0 M, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La purificación mediante cromatografía súbita en 300 mL de gel de sílice (empaquetado en húmedo con hexano/Et_{3}N (95:5)) eluyendo con amoniaco metanólico al 2-4-6-8-10-12-
15% en diclorometano permitió obtener 1,95 g de producto como un sólido blanco. ^{31}P RMN (CDCl_{3}) d 10.3, 10.2.
Síntesis de lípido fosforamiditas 17: Se trató una solución de 540 mg (1 mmol) de 1,2-di-O-palmitil rac-glicerol en 10 mL de piridina con 195 mg (1,2 mmol) de carbonildiimidazol y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A esta mezcla se añadieron 570 mg (1 mmol) del aminoalcohol como una solución de 3 mL de DMF. La mezcla se calentó hasta 40ºC durante la noche, después de lo cual, un análisis por 1H RMN de una alícuota de la mezcla de reacción indicó una formación muy despreciable del producto. La mezcla se calentó hasta 80ºC durante 6 h (aproximadamente 1:1 de producto con respecto al material de partida mediante 1H RMN), a continuación se concentró al vacío. El residuo crudo se aplicó a una columna de 125 mL de gel de SiO_{2} (empaquetado en hexanos) y el producto se eluyó con un gradiente de EtOAc al 20-50% en hexanos (con TEA al 2%) para obtener 500 mg (44%) del intermedio 16 como una cera clara (16: 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.42 (d, J=7.2 Hz, 2H), 7.30-7.18 (m, 7H), 6.76 (d, J=8.2 Hz, 4H), 5.34 (br t, 1H), 4.20-3.25 (señales solapantes), 3.16 (m, 2H), 1.53 (m), 1.24 (m), 0.86 (t, J=6.5 Hz, 6H). Se disolvió el alcohol 16 (500 mg; 0,44 mmol) en 4 mL de CH_{2}Cl_{2} y 0,15 mL (2 equiv) de DIPEA. A esta solución se añadieron 0,15 mL (0,66 mmol) de 2-cianoetil (N,N-diisopropilamino) clorofosforamidita. Después de 3 h, la TLC mostró una conversión en 2 manchas y la mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con una solución de NaHCO_{3}. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El residuo crudo se aplicó a una columna de 50 mL de gel de SiO_{2} (empaquetado en hexanos) y el producto se eluyó con EtOAc al 20% en hexanos (que contenía TEA al 2%) para obtener 350 mg (59%) de fosforamidita 17 como una cela incolora. ^{31}P RMN (CDCl_{3}) d 151.55,
151.08.
Síntesis automatizada de lípido-oligonucleótidos: La fosoframidita 17 se acopló al extremo 5' de un T-3 unidades (preparado mediante síntesis de ADN automatizado estándar en un instrumento ABI 394) utilizando un ciclo de acoplamiento modificado que consistía en dos exposiciones de 30 minutos de una solución 0,1 M de 17 en THF al 40% en MeCN a la columna. El análisis de tritilo en línea indicó una eficacia de acoplamiento del 94% para amidita
17.
Cloroformiato 19: A una solución agitada de 3 g (5,03 mmol) de 1,2-di-O-octadecil-sn-glicerol 21 en 60 mL de tolueno se añadieron 20 mL de una solución de fosgeno 1,93 M. Se añadió una solución de fosgeno adicional (2x10 mL; 15,4 equiv. De fosgeno total) hasta que no quedó más alcohol como material de partida (mediante análisis 1H RMN de alícuotas concentradas). El fosgeno y HCl en exceso se extrajo mediante un aspirador y la mezcla de reacción se concentró al vacío para obtener 3,3 g (98%) del cloroformiato 19 deseado como un polvo blanco. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 4.45 (dd, J=11.22, 3.69 Hz, 1H), 4.34 (dd, J=11.22, 6.15 Hz, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.56-3.40 (m, 6H), 1.53 (m, 4H), 1.24 (m, 62H), 0.87 (t, J=6.36 Hz, 6H); 13C NMR (75 MHz, CDCl_{3}) d 75.90, 71.91, 71.35, 70.93, 69.36, 31.99, 29.96-29.44 (señales solapantes de cadenas de hidrocarburos), 26.13, 26.04, 22.76, 14.18.
Conjugado 20: A una solución agitada de 2,25 g (3,95 mmol) de 10 en 60 mL de piridina se añadieron 2,6 g del glicerol cloroformiato de diestearilo 18. El análisis de 1H RMN de una alícuota concentrado después de 2 horas reveló que no quedaba cloroformiato y la mezcla se concentró al vacío. El residuo crudo se combinó con material preparado de forma similar a partir de 0,5 g (0,88 mmol) de 10 y 0,58 g del cloroformiato y los lotes combinados se purificaron mediante cromatografía súbita con gel de sílice en una columna de 100 mL de gel de sílice (empaquetada en hexanos que contenían trietilamina al 2%), eluyendo con 200 mL de hexanos, a continuación 250 mL de cada uno de EtOAc al 10-20 y 30% en hexanos, 500 mL de EtOAc al 40% en hexanos, a continuación 250 mL de cada uno de EtOAc al 50-60-70 y 80% en hexanos, y finalmente con 250 mL de EtOAc. El producto que contenía fracciones se concentró para obtener 3,3 g (57%) del conjugado 20.
Fosforamidita 21: a una solución agitada de 3,8 g (3,26 mmol) del conjugado en 25 mL de CH_{2}Cl_{2} se añadieron 1,14 mL (6,52 mmol) de diisopropiletilamina, a continuación 1,09 mL (4,88 mmol) de 2-cianoetil N,N-diisopropilclorofosforamidita. Después de 2 horas, la mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con una solución saturada de NaHCO_{3}, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y se concentró. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía súbita con gel de sílice en una columna de 125 mL de gel de sílice (empaquetada en hexanos que contenían trietilamina al 2%), eluyendo con 100 mL de hexanos, a continuación 250 mL de cada uno de EtOAc al 10 y 20% en hexanos, 500 mL de EtOAc al 30% en hexanos, a continuación 250 mL de EtOAc al 50% en hexanos. El producto que contenía fracciones se concentró para obtener 4,2 g (95%) de la fosforamidita 21. ^{31}P RMN (CDCl_{3}) d 151.52, 151.08.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Preparación y propiedades funcionales de ligandos de ácido nucleico derivados de colesterol y conjugados a PEG Un conjugado PEG3400 de un ligando de ácido nucleico retiene la afinidad de unión de la molécula no conjugada
Se analizó la capacidad de un conjugado ligando bFGf/PEG-3400 para unirse a bFGF. Se escogió la molécula 225t3 (SEC ID No. 10), un ligando de ADN de afinidad elevada por bFGf, para la conjugación con PEG a través de una reacción de acoplamiento NHS-amina primaria. El ligando 225t3 presenta una afinidad de unión de 1 nM y se pliega en una horquilla de extremo romo con una T_{f} de 68ºC. El ligando 225t3 se modificó con un modificador 3'-amino C7 CPG (Glen Research, Sterling, VA) utilizando métodos de síntesis de ADN estándar y se le hará referencia como 225t3N (SEC ID NO: 11). 225t3N reacción con el éster activo de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) de PEG (PM promedio 3400) en 20% (v/v) de dimetoxi formamida al 80% (v/v), bicarbonato sódico 0,5 M tamponado a pH 8,5. El conjugado resultante, 225t3N-PEG-3400 (SEC ID NO: 14), se purificó a partir del AND libre en un gel de poliacrilamida al 12%/urea 7M. El conjugado se marcó en el extremo 5' con ^{32}P y se realizó un ensayo de unión. El 225t3N-PEG-3400 (SES ID No. 14) se une a bFGF con la misma afinidad (K_{d}=1 nM) que 225t3.
Conjugación de PEG-20.000 a un ligando de ADN de trombina
El ligando de ADN de trombina NX256 (SEC ID No. 9) (figura 1d) que contiene una funcionalidad amino y una disulfuro se preparó utilizando los métodos y procedimientos de síntesis de ADN estándar en un sintetizador de ADN/ARN Biosearch 8909 con un soporte de vidrio de poro controlado de 500 Á con dT-5'-LCAA y reactivos de fosforamidita disponibles comercialmente. Después de la desprotección se realizó una purificación por HPLC de intercambio iónico. El enlace disulfuro 5' terminal se redujo incubando el ADN en una solución de ditiotreitol (DTT) 50 mM a 37ºC durante 30 minutos. El ADN reducido (que contenía un tiol 5' terminal) se separó en una columna de exclusión de tamaño Nap-5 y se recogió el volumen vacío, que contenía el ADN pero no el DTT, en un recipiente de reacción que contenía PEG derivatizado con maleimida bajo una capa de argón. Todas las soluciones se purgaron con argón para eliminar el oxígeno. La mezcla de reacción se mantuvo a 40ºC durante 1 hora. La progresión de la reacción se monitorizó mediante la extracción de alícuotas pequeñas y su análisis mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 8%/urea 7 M. Después del final del periodo de incubación de 1 hora, la reacción se había esencialmente completado, y en este momento se añadió un volumen igual de cloruro de metileno a la mezcla de reacción y se agitó el recipiente hasta formar una suspensión blanca lechosa. La mezcla de centrifugó a 14.000 rpm en una centrífuga eppendorf hasta que se separaban las fases. La fase acuosa contenía los tres ligandos de ácido nucleico y se descartó. El producto (ligando de AND NX256 modificado con PEG-20,000, referido como NX256-PEG-20,000; SEC ID NO: 13) (Figura 1G) se purificó adicionalmente utilizando cromatografía de intercambio iónico seguido de desalación de fase inversa y lipofilización hasta obtener un polvo blanco. Esta material se utilizó para determinar el efecto de la modificación con PEG en el comportamiento farmacocinético del ligando de ácido nucleico ADN (vide Infra). El ligando NX256 modificado con PEG-10,000, referido como NX-256-PEG-10,000, se preparó de una manera análoga.
Valores de T_{f} para conjugados de PEG
La funcionalidad de PEG también se puede introducir a través de la reacción tiofosfato-maleimida. Se introdujo el grupo tiofosfato en el ligando de ADN de trombina en el extremo 5' mediante el método de fosforamidita estándar utilizando reactivos disponibles comercialmente (a este ligando se hace referencia como T-P4) (figura 1F, SEC ID NO: 12). La conjugación a la maleimida que contiene PEG es análoga a la reacción sulfhidrilo-maleimida descrita anteriormente. A los ligandos conjugados a PEG se hace referencia como T-P4-PEG-10,000 y T-P4-PEG-20,000 (SEC ID NO: 15). Las temperaturas de fusión (T_{f}) para T-P4-PEG-10,000, T-P4-PEG-20,000 y ligandos de AND-T-P4 se determinaron a partir de las representaciones de la primera derivada de la absorbancia óptica a 260 nm frente a la temperatura. Los valores de T_{f} para T-P6-PEG-10,000, T-P6-PEG-20,000 y T-P6 fueron de 40ºC para los tres ligandos. Estos datos y los datos de unión de ligando de ácido nucleico bFGF-PEG3400 descritos anteriormente, sugieren que la conjugación a PEG no afecta a la estructura del ligando de ácido nucleico.
Un ligando de bFGF colesterilado retiene la afinidad de unión de la molécula no colesterilada
Se puede introducir colesterol en un ligando de ácido nucleico, en cualquier posición en la secuencia, mediante el método de fosforamidita en fase sólida estándar. Por ejemplo, se incorporó una fosforamidita de tetraetilenglicol colesterol (Glen Research, Sterling, VA) en el extremo 3' del ligando 225t3 (Figura 1E; SEC ID NO: 10) para producir el ligando 225t3-Colesterol. Tras la purificación en un gel de poliacrilamida al 12%/urea 7 M, 225t3-Col se marcó en el extremo 5' con ^{32}P y se realizó un ensayo de unión. La afinidad de unión de 225t3-Col fue idéntica (Kd=1 nM) a la de 225t3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Propiedades farmacocinéticas de colesterol, diacil glicerol, dialquil glicerol, y ADNs modificados con PEG
Las propiedades farmacocinéticas de ligandos de ADN de trombina NX229, NX232, NX253, NX253 + Liposoma, y NX256-PEG20K se determinaron (véase las Figuras 1A-1C, 1G para descripciones moleculares) (SEC ID NOS: 6-8, 13). Cada oligonucleótido se diluyó en PBS hasta una concentración de la solución de 0,5-1,0 mg/ml basada en la absorción de UV a 260 nm y un coeficiente de extinción de 0,033 \mug de oligo/ml. En todos, excepto un estudio, 6 ratas recibieron 0,5-1,0 mg de oligonucleótido/kg de peso animal y se tomaron muestras de plasma a varios tiempos de 1 minuto a 4 horas. Se utilizó una rata en el estudio en el que se analizó NX253. Las muestras de plasma y las muestras del control de calidad se analizaron utilizando un ensayo de hibridación. El ensayo de hibridación utilizó un oligonucleótido de captura que contiene una secuencia complementaria al extremo 5' de los ligandos de ADN conjugada a una esfera de óxido de hierro (FeO) (FeO-espaciador-5'-d (GTC AGG CAC CAT CCC-3') (SEC ID NO: 1) donde el espaciador = (dT)8), y un oligonucleótido de detección que contenía un grupo biotina en el extremo 3' (5'd-CCC CAC TGA AGC ACC-espaciador-3'-biotina-biotin, donde el espaciador = (d1)10) (SEC ID NO: 2). La cantidad del oligonucleótido de biotina unido a la esfera se cuantificó con la fosfatasa alcalina unida a estreptavidina, utilizando SPD-Sapphire como sustrato luminiscente.
Los datos para la concentración en plasma de NX229, NX232, NX253, NX253 + Liposoma y NX256-PEG20K (SEC ID NOS: 6-8,13) en función del tiempo tras la inyección en bolo se resumen en la figura 2. Las concentraciones en plasma de NX232, NX253, NX253 + Liposoma, y NX256-PEG20K en función del tiempo son considerablemente mayores en comparación con la de NX299 (SEC ID NO: 6). Todos estos oligonucleótidos comparten el mismo módulo de unión a trombina (d (CAG TCC GTG GTA GGG CAG GTT GGG GTG ACT TCG TGG)) (SEC ID NO: 3). La concentración en plasma de un oligonucleótido en función del tiempo puede incrementarse significativamente mediante la introducción de grupos funcionales apropiados en el oligonucleótido. Se ha observado previamente una vida media en plasma prolongada de un oligonucleótido que contiene colesterol en comparación con el oligonucleótido de control (no contiene colesterol) (de Smidt et al., Nucl. Acids Res., 19: 4695 (1991)).
Se han evaluado las propiedades farmacocinéticas en plasma de un amplio número de ligandos de ácido nucleico que presentan varios grupos funcionales unidos a la secuencia base de NX213 (véase la figura 1 para la descripción molecular), así como algunas formulaciones liposomales de estos oligonucleótidos. Estos datos se resumen en la figura 3 (SEC ID NOS: 16, 19, 21, 22 y 29). La formulación con la velocidad de depuración más lenta fue cuando NX213 (Figure 1P; SEC ID NO: 21) se encapsulaba en liposomas.
Para determinar el papel de los conjugados de dialquil glicerol y ADN más y menos liposomas PK se llevaron a cabo los estudios 77 y 73 con el conjugado de dialquil glicerol y ligando de ADN de trombina (Véase la Figura 1 para la descripción molecular). Estos datos se resumen en la figura 4 (SEC ID No. 18).
Los oligonucleótidos NX213 de VEGF colesterilados (NX268) (Véase la figura 1K para la descripción molecular; SEC ID No 16) se formularon con liposomas con PEG o liposomas estándar y se evaluó la farmacocinética (PK 85-86). Estas formulaciones contienen oligonucleótidos tanto en la parte interna como externa del liposoma. La figura 5 (SEC ID No. 16) muestra los niveles en plasma de rata de oligonucleótidos de longitud completa en función del tiempo después de la inyección. Ambas formulaciones con liposomas muestran una farmacocinética de oligonucleótidos similar.
Para evaluar la dependencia con el tamaño en la depuración, se han estudiado conjugados de oligonucleótidos de VEGF con 2'-O-metilo con varios PEG (véase la Figura 1 para la descripción molecular) (PK 50, 80, 87, y 88). La figura 6 muestra a comparación de todos los oligonucleótidos con 2'-O-metilo más PEG 40K, 20K, 10K, así como en ausencia de PEG (SEC ID NOS: 17 y 29). Estos datos demuestran una depuración del plasma significativamente más lento con un mayor tamaño del conjugado PEG.
Se llevó a cabo PK 96 para evaluar la farmacocinética de 2'F pirimidinas conjuntamente con 2' O-metil purinas y PEG20K (JW1130) (véase la figura 1R para la descripción molecular; SEC ID NO: 23). La figura 7 muestra los niveles en plasma de este oligonucleótido en comparación con todos los del tipo 2' O-metilo (PK 80, JW986) (véase la figura 1x para la descripción molecular; SEC ID No. 29). Estos datos muestran propiedades de depuración bastante similares para ambos oligonucleótidos.
La observación de que JW1130 (SEC ID NO: 23), que contiene 2' F pirimidinas, muestra una depuración similar a JW986 (2' O-metil pirimidinas) sugiere que los oligonucleótidos con 2'F pirimidinas sin resistentes a la digestión por nucleasas.
Se llevó a cabo PK 97 para determinar las propiedades de depuración de un ligando de ADN de L-selectina (NX287) (Figura 1S; SEC ID NO: 24) conjugado con 40K PEG. La figura 8 muestra los niveles en plasma de este oligonucleótido en función del tiempo después de la inyección con bolo (dosis 1 mg/kg). Para la comparación, se incluyó el ligando de ADN de trombina (NX256) (Figura 1H; SEC ID NO: 13) conjugado con 20K PEG. Tal como se muestra en la figura 8, estos dos oligonucleótidos muestran velocidades de depuración similares presumiblemente debido al metabolismo.
Los estudios PK 99, 100 y 102 se han llevado a cabo como parte de un estudio más amplio para evaluar la estabilidad de los oligonucleótidos in vivo. Estos estudios es muestran en la figura 9. Para la comparación, también se incluye PK 96 (JW1130 VEGF) 2'F Py 2'O-Met (14 Pu) + PEG 20K) (Figura 1R; SEC ID NO: 23). Los oligonucleótidos utilizados en los estudios PK 96, 100 y 102 difieren sólo en el número de posiciones de purina que contienen 2' desoxi nucleótidos, donde PK 96 no contiene 2' desoxi purinas, PK 100 contienen cuatro 2' desoxi purinas y en PK 102 las 14 purinas son 2' desoxi. La figura 9 (SEC ID NOS: 23, 25, 26, 27 y 30) demuestran una calara relación entre la creciente velocidad de depuración y el número de desoxi nucleótidos presentes en el oligonucleótido. Este incremento observado en la velocidad de depuración con un creciente número de desoxi nucleótidos se presume que es debido a un mayor metabolismo de estos oligonucleótidos. Una observación esperanzadora en el nivel de estabilidad elevado observado para PK 100 que contiene cuatro 2' desoxi purinas y sugiere que la modificación post-SELEX puede ser apropiada si se pueden modificar un amplio número de purinas. También se muestra en la figura 9 PK 99 frente a PK 100, que difieren de la conjugación PEG20K. Tal como se ha observado previamente con otros oligonucleótidos, la conjugación a moléculas PEG de peso molecular significativo reduce bruscamente la velocidad de depuración del plasma observada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Conjugación covalente de ligandos de ácido nucleico a liposomas
En el esquema 1 proporcionado a continuación, un PEG-2000 (PEG con peso molecular de 2000 Da) heterobifuncional que contiene las funcionalidades de éster de N-hidroxisuccinimida y vinil sulfona se conjugó en primer lugar a una liposoma que contenía un 2% molar de diestearilfosfatidiletanolamina (DSPE) a través del grupo de éster de N-hidroxisuccinimida. El producto se purificó a partir del PEG libre mediante cromatografía de exclusión de tamaño. A continuación, el producto de vinil sulfona se dejó reaccionar con NX 256 reducido (Figura 1D; SEC ID NO: 9). Existe una DSPE-PEG-2000-vinil sulfona comercialmente disponible y se puede utilizar para fabricar liposomas que contienen la funcionalidad de vinil sulfona, eliminando de este modo una etapa de conjugación del Esquema 1.
7
Se ha completado la segunda reacción mostrada a continuación como el esquema 2. El material de partida fueron liposomas con diestearilfosfatidilcolina (DSPC) que contenía un 25 molar de DSPE maleimida. Utilizando un valor de 50.000 lípidos por liposoma, el liposoma debería tener aproximadamente 1000 moléculas de maleimida por liposoma, aproximadamente 600 de los cuales están disponibles en el exterior. El complejo ligando de ácido nucleico-liposoma se separó del ligando de ácido nucleico libre a través de la cromatografía de exclusión de tamaño (vide supra). A partir de la absorbancia a 260 nm, se estimó que aproximadamente 200 moléculas del ligando de ácido nucleico se conjugaron a cada liposoma
8
Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
Documentos de patente citados en la descripción
\bullet US 07536428 B [0002]
\bullet US 08264029 B [0007] [0049]
\bullet US 07714131 B [0002]
\bullet US 08284063 B [0008] [0050]
\bullet US 5475096 A [0002] [0045]
\bullet US 08234997 B [0008] [0050]
\bullet US 07931473 B [0002] [0045]
\bullet US 536428 A [0045]
\bullet US 5270163 A [0002] [0045]
\bullet US 71413191 A [0045]
\bullet US 9104078 W [0002] [0045]
\bullet US 07964624 B [0048]
\bullet US 07960093 B [0006] [0048]
\bullet US 08400440 B [0048]
\bullet US 08123935 B [0006] [0048]
\bullet US 96462492 A [0053]
\bullet US 08134028 B [0006] [0007] [0048] [0049]
\bullet US 08945604 B [0097] [0098]
\bullet US 08143564 B [0006] [0048]
\bullet US 08434465 B [0097] [0098]
\bullet US 08117991 B [0007] [0049]
\bullet US 08464443 B [0097] [0098]
Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción
\bulletCheronis, J. C. et al. J. Med. Chem., 1992, vol. 35, 1563-1572 [0058]
\bullet de Smidt et al. Nucl. Acids Res., 1991, vol. 19, 4695 [0086]
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: LARRY GOLD, PAUL G. SCHMIDT, NEBOJSA JANJIC
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPLEJOS DE LIGANDOS DE ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 30
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Swanson and Bratschun, L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 8400 East Prentice Avenue, Suite #200
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Denver
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Colorado
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 80111
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Diskette, 3.50 pulgadas, 1.44 Mb de capacidad
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WordPerfect 8.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE SOLICITUD PRESENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/945,604
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-OCTUBRE-1997
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/434,465
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-MAYO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/464,443
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-JUNIO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: BARRY J. SWANSON
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33,215
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: NEX29C/US
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE COMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (303) 793-3333
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (303) 793-3433
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTTTTTGT CAGGCACCAT CCC
\hfill
23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCCACTGAA GCACCTTTTT TTTTT
\hfill
25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGG
\hfill
36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos 49-53 estás unidos por un enlace fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
100
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 39 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAATT
\hfill
40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos 37 y 38 están unidos por un enlace fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAA
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAAT
\hfill
39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 39 es una fosforamidita de orientación invertida {}\hskip3.6cm (unión 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAATT
\hfill
40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 37 es una fosforamidita de orientación invertida {}\hskip3.6cm (unión 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGTT
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill
35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill
35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 39 es una fosforamidita de orientación invertida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGTCCGTG GTAGGGCAGG TTGGGGTGAC TTCGTGGATT
\hfill
40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 37 es una fosforamidita de orientación invertida {}\hskip3.6cm (unión 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGTT
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill
35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 37 es una fosforamidita de orientación invertida {}\hskip3.6cm (unión 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGTCCGTG GTAGGGCAGG TTGGGGTGAC TTCGTGTT
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5-28 están modificados en 2'-OMetil {}\hskip3.6cm (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAA
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22 y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Todos los nucleótidos están modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22 y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2})
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-5, 10-11, 13-14, 16-18, 20, 23-26, y {}\hskip3.6cm 28 están modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCCATTCAC CATGGCCCCT TCCTACGTAT GTTCTGCGGG TGGCTTAC
\hfill
48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 están modificados en 2'-OMetil (2'- {}\hskip3.6cm OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 están modificados en 2'-OMetil (2'- {}\hskip3.6cm OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGT
\hfill
29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 8-9, 11, 14, 16, 18, 23, 26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'OMO).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-7, 10, 12, 17, 21-22, 24-25, y 27 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTGUCGGU ACGGAGUGGA CCGUCACGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUULTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: LARRY GOLD, PAUL G. SCHMIDT, NEBOJSA JANJIC
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPLEJOS DE LIGANDOS DE ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 30
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Swanson and Bratschun, L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 8400 East Prentice Avenue, Suite #200
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Denver
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Colorado
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 80111
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Diskette, 3.50 pulgadas, 1.44 Mb de capacidad
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: MS-DDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WordPerfect 8.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/945,604
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-OCTUBRE-1997
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/434,465
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-MAYO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/464,443
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-JUNIO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: BARRY J. SWANSON
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33,215
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: NEX29C/US
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE COMUNCIACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (303) 793-3333
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (303) 793-3433
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTTTTTGT CAGGCACCAT CCC
\hfill
23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCCACTGAA GCACCTTTTT TTTTT
\hfill
25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGG
\hfill
36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos 49-53 están unidos por una unión fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
100
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 39 es una fosoforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAATT
\hfill
40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos 37 y 38 están unidos por un enlace fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAA
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAAT
\hfill
39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 39 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAATT
\hfill
40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 37 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGTT
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill
35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill
35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucléotido número 39 es una fosforamidita de orientación invertida
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGTCCGTG GTAGGGCAGG TTGGGGTGAC TTCGTGGATT
\hfill
40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 37 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGTT
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill
35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 37 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGTCCGTG GTAGGGCAGG TTGGGGTGAC TTCGTGTT
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2-OMetil (2'-OMe)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5-28 están modificados en 2'-OMetil {}\hskip3.6cm (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAA
\hfill
38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22 y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: todos los nucleótidos están modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22 y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2})
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-5, 10-11, 13-14, 16-18, 20, 23-26, y {}\hskip3.6cm 28 están modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCCATTCAC CATGGCCCCT TCCTACGTAT GTTCTGCGGG TGGCTTAC
\hfill
48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 están modificados en 2'-OMetil {}\hskip3.6cm (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 están modificados en 2'-OMetil {}\hskip3.6cm (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGT
\hfill
29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotiato.
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 8-9, 11, 14, 16, 18, 23, 26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-7, 10, 12, 17, 21-22, 24-25, y 27 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTGUCGGU ACGGAGUGGA CCGUCACGTT TTT
\hfill
33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUG
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
UUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill
28

Claims (9)

1. Método para la preparación de un complejo terapéutico o de diagnóstico que comprende un ligando de ácido nucleico de cadena sencilla y un polietilenglicol unido covalentemente en los extremos 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico, en el que el ligando de ácido nucleico tiene una afinidad y especificidad elevada por una molécula diana diferente de un polinucleótido que se une al ligando de ácido nucleico a través de un mecanismo que depende del emparejamiento de bases de Watson/Crick o la unión en triple hélice y en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 1000 Da o más, comprendiendo dicho método la unión covalente de un ligando de ácido nucleico de cadena sencilla a polietilenglicol que tiene un peso molecular de 1000 Da o más en los extremos 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico, en el que el método comprende identificar el ligando de ácido nucleico a partir de una mezcla candidata de ácidos nucleicos mediante un método que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una mezcla candidata de ácidos nucleicos de cadena sencilla con la molécula diana en condiciones favorables para la unión;
(b) separar los ácidos nucleicos no unidos de los ácidos nucleicos que se han unido a moléculas diana;
(c) disociar las parejas ácido nucleico-diana;
(d) amplificar los ácidos nucleicos disociados de las parejas ácido nucleico-diana para obtener una mezcla enriquecida en ligando de ácidos nucleicos;
en el que las etapas (a)-(d) se repiten mediante tantos ciclos como se deseen para obtener un ligando de ácido nucleico para la molécula diana.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende unir covalentemente el polietilenglicol con el grupo hidroxilo en 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el método comprende unir covalentemente el polietilenglicol con 5' tiol a través de una funcionalidad maleimida o vinil sulfona.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el método comprende unir covalentemente una molécula enlazadora a los extremos 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico y unir covalentemente la molécula enlazadora al polietilenglicol.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ligando de ácido nucleico tiene una unión fosfodiéster invertida 3'3' en el extremo 3'.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando de ácido nucleico es ADN.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando de ácido nucleico es ARN.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido nucleico está químicamente modificado.
9. Método según la reivindicación 8, en el que la modificación se elige del grupo:
-
modificaciones de azúcar en la posición 2';
-
modificaciones de pirimidina en la posición 5;
-
modificaciones de purina en la posición 8;
-
modificaciones en aminas exocíclicas;
-
sustitución de 4-tiouridina;
-
sustitución de 5-bromo-uracilo;
-
sustitución de 5-yodo-uracilo;
-
modificaciones en el esqueleto;
-
uniones fosforotioato;
-
fosfato de alquilo;
-
metilaciones;
-
terminación de cadena con fosforotioato 5';
-
terminación de cadena con fosforotioato 3'.
ES96915463T 1995-05-04 1996-05-02 Complejos de ligandos de acido nucleico. Expired - Lifetime ES2336857T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US464443 1983-02-07
US434465 1995-05-04
US08/434,465 US6011020A (en) 1990-06-11 1995-05-04 Nucleic acid ligand complexes
US46444395A 1995-06-05 1995-06-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2336857T3 true ES2336857T3 (es) 2010-04-16

Family

ID=27030196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES96915463T Expired - Lifetime ES2336857T3 (es) 1995-05-04 1996-05-02 Complejos de ligandos de acido nucleico.

Country Status (8)

Country Link
EP (2) EP2168973A1 (es)
JP (1) JPH11504926A (es)
AT (1) ATE452136T1 (es)
AU (1) AU728176B2 (es)
CA (1) CA2219119C (es)
DE (1) DE69638099D1 (es)
ES (1) ES2336857T3 (es)
WO (1) WO1996034876A1 (es)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6465189B1 (en) 1990-06-11 2002-10-15 Gilead Sciences, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended selex
US6280932B1 (en) 1990-06-11 2001-08-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US6346611B1 (en) * 1990-06-11 2002-02-12 Gilead Sciences, Inc. High affinity TGfβ nucleic acid ligands and inhibitors
US6229002B1 (en) 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
AU725590B2 (en) * 1995-06-07 2000-10-12 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US6426335B1 (en) 1997-10-17 2002-07-30 Gilead Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
WO2000012536A2 (en) * 1998-08-31 2000-03-09 Gryphon Sciences Lipid matrix-assisted chemical ligation and synthesis of membrane polypeptides
US7482425B2 (en) 1999-08-26 2009-01-27 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Compositions for lipid matrix-assisted chemical ligation
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
EP1438321B1 (de) * 2001-10-26 2010-05-26 Noxxon Pharma AG Modifizierte l-nukleinsäure
US6989442B2 (en) * 2002-07-12 2006-01-24 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
EP3222294A1 (en) * 2003-04-30 2017-09-27 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
CN101217967B (zh) * 2005-05-04 2014-09-10 诺松制药股份公司 镜像异构体的新用途
KR20100037120A (ko) * 2007-07-06 2010-04-08 노스이스턴 유니버시티 Rna 작용제의 양쪽성 컨주게이트를 포함하는 혼합 미쎌, 및 이의 용도
WO2009063998A1 (ja) * 2007-11-14 2009-05-22 Ribomic Inc. 疎水性物質付加核酸及びその使用
JP5863670B2 (ja) 2010-01-19 2016-02-17 ノースウェスタン ユニバーシティ 核酸および/または他の構成要素を含有している合成ナノ構造体
US9506030B2 (en) * 2013-05-01 2016-11-29 Regulus Therapeutics Inc. Compounds and methods for enhanced cellular uptake
ES2750608T3 (es) 2013-07-25 2020-03-26 Exicure Inc Construcciones esféricas a base de ácido nucleico como agentes inmunoestimulantes para uso profiláctico y terapéutico
CA2932122C (en) 2013-12-03 2022-04-19 Northwestern University Liposomal particles, methods of making same and uses thereof
EP3508198A1 (en) 2014-06-04 2019-07-10 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
AU2015349680A1 (en) 2014-11-21 2017-06-08 Northwestern University The sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
MX2020000387A (es) 2017-07-13 2020-08-17 Univ Northwestern Método general y directo para preparar nanopartículas de estructura organometálica funcionalizadas con oligonucleotidos.

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2712344C2 (de) * 1977-03-21 1982-09-23 Hans Dr. 4803 Steinhagen Bünemann Löslicher Komplexbildner für die affinitätsspezifische Trennung von Nukleinsäuren
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4753788A (en) 1985-01-31 1988-06-28 Vestar Research Inc. Method for preparing small vesicles using microemulsification
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
EP0229108B1 (en) * 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4946683A (en) 1987-11-18 1990-08-07 Vestar, Inc. Multiple step entrapment/loading procedure for preparing lipophilic drug-containing liposomes
US4935171A (en) 1989-01-27 1990-06-19 Vestar, Inc. Method for vesicle formation
WO1990010448A2 (en) 1989-03-07 1990-09-20 Genentech, Inc. Covalent conjugates of lipid and oligonucleotide
US5194654A (en) 1989-11-22 1993-03-16 Vical, Inc. Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use
US5162515A (en) * 1990-01-16 1992-11-10 La Jolla Pharmaceutical Company Conjugates of biologically stable polymers and polynucleotides for treating systemic lupus erythematosus
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
EP1493825A3 (en) * 1990-06-11 2005-02-09 Gilead Sciences, Inc. Method for producing nucleic acid ligands
CA2104698A1 (en) * 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
WO1993019768A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system
ES2257735T3 (es) * 1992-09-29 2006-08-01 Gilead Sciences, Inc. Ligandos de acido nucleico y procedimiento de produccion.
ES2181799T3 (es) * 1994-10-06 2003-03-01 Isis Pharmaceuticals Inc Conjugados de acidos peptido nucleicos.
JP2015069119A (ja) 2013-09-30 2015-04-13 パナソニック液晶ディスプレイ株式会社 表示装置
US20170110787A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Apple Inc. Electronic Devices With Millimeter Wave Antennas And Metal Housings

Also Published As

Publication number Publication date
EP2168973A1 (en) 2010-03-31
EP0824541B1 (en) 2009-12-16
EP0824541A1 (en) 1998-02-25
ATE452136T1 (de) 2010-01-15
CA2219119A1 (en) 1996-11-07
JPH11504926A (ja) 1999-05-11
EP0824541A4 (en) 2007-04-18
WO1996034876A1 (en) 1996-11-07
AU728176B2 (en) 2001-01-04
DE69638099D1 (de) 2010-01-28
AU5723196A (en) 1996-11-21
CA2219119C (en) 2012-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2336857T3 (es) Complejos de ligandos de acido nucleico.
US6147204A (en) Nucleic acid ligand complexes
US6011020A (en) Nucleic acid ligand complexes
US6465188B1 (en) Nucleic acid ligand complexes
ES2259188T3 (es) Complejos de ligando de acido nucleico de factor de crecimiento endotelial vascular (vegf).
ES2690538T3 (es) Composiciones y métodos para inhibir la expresión génica del virus de la hepatitis B
US6051698A (en) Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6525031B2 (en) Targeted Oligonucleotide conjugates
ES2426160T3 (es) Complejos de ligandos de ácidos nucleicos de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
US6656730B1 (en) Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
US7674778B2 (en) Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
EP2319854A1 (en) Bioconjugation Of Macromolecules
US8071737B2 (en) Nucleic acid ligand complexes
US20210388348A1 (en) Modified guide rnas for crispr genome editing
JP5637528B2 (ja) 核酸リガンド複合体
WO2000012530A1 (en) dU SITE-DIRECTED CLEAVAGE OF COVALENT CONJUGATES
CA2535449A1 (en) Vascular endothelial growth factor (vegf) nucleic acid ligand complexes