ES2336857T3 - Complejos de ligandos de acido nucleico. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN COMPLEJO TERAPEUTICO O DE DIAGNOSTICO FORMADO POR UN LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO Y UN COMPUESTO LIPOFILO O UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO, MEDIANTE LA IDENTIFICACION DE UN LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO POR LA METODOLOGIA SELEX Y LA ASOCIACION DEL LIGANDO DE ACIDO NUCLEICO CON UN COMPUESTO LIPOFILO O UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO. LA INVENCION ADEMAS DESCRIBE COMPLEJOS FORMADOS POR UNO O MAS LIGANDOS DE ACIDO NUCLEICO ASOCIADOS CON UN COMPUESTO LIPOFILO O CON UN COMPUESTO DE ELEVADO PESO MOLECULAR NO INMUNOGENICO.
Description
Complejos de ligandos de ácido nucleico.
La presente invención se refiere a un método
para preparar un complejo terapéutico o de diagnóstico comprendido
de un ligando de ácido nucleico y un compuesto no inmunogénico de
peso molecular elevado mediante la identificación de un ligando de
ácido nucleico mediante metodología SELEX y la asociación del
ligando de ácido nucleico con un compuesto no inmunogénico de peso
molecular elevado. La presente invención también se refiere a la
mejora de las propiedades farmacocinéticas de un ligando de ácido
nucleico mediante la asociación del ligando de ácido nucleico a un
compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado para formar un
complejo. La presente invención también incluye complejos que
comprenden un ligando de ácido nucleico asociado con un compuesto
no inmunogénico de peso molecular elevado.
El dogma durante muchos años fue que los ácidos
nucleicos tenían principalmente un papel informativo. A través del
método conocido como Evolución Sistemática de Ligandos mediante
enriquecimiento Exponencial, denominado, SELEX, se ha visto
claramente que los ácidos nucleicos presentan una diversidad
estructural tridimensional similar a las proteínas. SELEX es un
método para la evolución in vitro de moléculas de ácido
nucleico con una unión altamente específica a moléculas diana y se
describe en la Solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie
07/536,428, solicitada el 11 de junio de 1990, titulada
"Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment",
ya abandonada. La solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de
Serie. 07/714,131, solicitada el 10 de junio de 1991, titulada
"Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No.
5,475,096, la solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie.
07/931,473, solicitada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic
Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,270,163
(véase también PCT/US91/04078). Cada una de estas solicitudes,
referidas en general en la presente invención como las Solicitudes
de Patentes de SELEX, describe un método fundamentalmente nuevo
para producir un ligando de ácido nucleico para cualquier molécula
diana deseada. El proceso SELEX proporciona un tipo de productos a
los que se hace referencia como ligandos de ácido nucleico,
teniendo cada ligando una única secuencia, y que tiene la propiedad
de unirse específicamente a un compuesto o molécula dianas
deseados. Cada ligando de ácido nucleico identificado por SELEX es
un ligando específico de un compuesto o molécula dianas
determinados. SELEX se basa en la visión única de que los ácidos
nucleicos tienen capacidad suficiente para formar una variedad de
estructuras bidimensionales y tridimensionales y suficiente
versatilidad química disponible en sus monómeros para actuar como
ligandos (forman parejas de unión específica) con prácticamente
cualquier compuesto químico, tanto monomérico como polimérico. Las
moléculas de cualquier tamaño o composición pueden utilizarse como
dianas.
El método SELEX implica la selección entre una
mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones por etapas de
la unión, separación y amplificación, utilizando el mismo esquema de
selección general, para conseguir prácticamente cualquier criterio
deseado de afinidad y selectividad de unión. Partiendo de una mezcla
de ácidos nucleicos, que comprenden preferiblemente un segmento de
secuencia aleatoria, el método SELEX incluye las etapas de poner en
contacto la mezcla con la diana en las condiciones favorables para
la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de los ácidos
nucleicos que se han unido específicamente a moléculas diana,
disociar los complejos ácido nucleico-diana,
amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido
nucleico-diana para obtener una mezcla de ácidos
nucleicos enriquecida en ligandos, y a continuación, repetir las
etapas de unión, separación, disociación y amplificación durante
tantos ciclos como se desee para obtener ligandos de ácidos
nucleicos de afinidad elevada altamente específicos con la molécula
diana.
Los presentes inventores reconocen que el método
SELEX demuestra que los ácidos nucleicos como compuestos químicos
pueden formar un amplio espectro de formas, tamaños y
configuraciones, y son capaces de un repertorio mucho más amplio de
unión y otras funciones que los mostrados por los ácidos nucleicos
en los sistemas biológicos.
Los presentes inventores reconocen que los
procesos SELEX o de tipo SELEX se podrían utilizar para identificar
ácidos nucleicos que pueden facilitar cualquier reacción elegida de
manera similar a aquella en la que los ligandos de ácidos nucleicos
se pueden identificar para cualquier diana. En teoría, en la mezcla
de candidatos de aproximadamente 1013 a 1018 ácidos nucleicos, los
presentes inventores postulan que por lo menos existe un ácido
nucleico con la forma apropiada para facilitar cada una de una
amplia variedad de interacciones físicas y químicas.
El método SELEX básico se ha modificado para
conseguir una serie de objetivos específicos. Por ejemplo, la
Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/960,093,
solicitada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for
Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure." describe el
uso de SELEX conjuntamente con electroforesis en gel para
seleccionar moléculas de ácido nucleico con características
estructurales específicas, tales como ADN curvado. La Solicitud de
Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/123,935, solicitada el
17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid
Ligands", describe un método basado en SELEX para la selección
de ligandos de ácidos nucleicos que contienen grupos fotoreactivos
capaces de unirse y/o fotoreticularse y/o fotoinactivar una
molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de
Serie 08/134,028, solicitada el 7 de octubre de 1993, titulada
"High-Affinity Nucleic Acid Ligands That
Discriminate Between Theophylline and Caffeine", describe un
método para identificar ligandos de ácido nucleico altamente
específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente
relacionadas, que pueden ser no peptídicas, denominado
Contra-SELEX. La Solicitud de Patente de Estados
Unidos de No. de Serie No. 08/143,564, solicitada el 25 de octubre
de 1993, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment: Solution SELEX", describe un método basado en SELEX
que consigue una separación altamente eficaz entre oligonucleótidos
que tienen una afinidad elevada y baja por una molécula
diana.
diana.
El método SELEX comprende la identificación de
ligandos de ácidos nucleicos de afinidad elevada que contienen
nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al
ligando, tal como una estabilidad in vivo mejorada o
características de liberación mejoradas. Entre los ejemplos de
dichas modificaciones se incluyen sustituciones químicas en la
ribosa y/o fosfato y/o posiciones de las bases. Los ligandos de
ácidos nucleicos identificados por SELEX que contienen nucleótidos
modificados se describen en la Solicitud de Patente de Estados
Unidos de No. de Serie 08/117,991, solicitada el 8 de septiembre de
1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing
Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que
contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las
posiciones 5 y 2' de las pirimidinas. La Solicitud de Patente de
Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, supra, describe
ligandos de ácidos nucleicos altamente específicos que contienen
uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino
(2'-NH_{2}), 2'-fluoro
(2'-F), y/o
2'-O-metilo
(2'-OMe). La Solicitud de Patente de Estados Unidos
de No. de Serie 08/264,029, solicitada el 22 de junio de 1994,
titulada "Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidine
Intramolecular Nucleophilic Displacement", describe
oligonucleótidos que contienen diversas pirimidinas modificadas en
2'.
El método SELEX comprende combinar
oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos
seleccionados y unidades funcionales que no son oligonucleótidos
tal como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos
de No. de Serie 08/284,063, solicitada el 2 de agosto de 1994,
titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment: Chimeric SELEX" y la Solicitud de Patente de Estados
Unidos de No. de Serie 08/234,997, solicitada el 28 de abril de
1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment: Blended SELEX", respectivamente. Estas solicitudes
permiten la combinación del amplio espectro de formas y otras
propiedades, y las propiedades de amplificación y replicación
eficaces de oligonucleótidos con las propiedades deseadas de otras
moléculas.
Se han descrito varios casos en los que los
investigadores han unido oligonucleótidos antisentido con
compuestos no inmunogénicos de peso molecular elevado. Los
oligonucleótidos antisentido, sin embargo, son sólo eficaces como
agentes intracelulares. Los oligodesoxirribonucleótidos antisentido
dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) se
han encapsulado en liposomas unidos a folato a través de un
espaciador de polietilenglicol
(folato-PEG-liposomas) y se liberan
en células KB cultivadas a través de endocitosis mediada por el
receptor de folato (Wang et al. (1995) 92:
3318-3322).
La presente invención proporciona un método para
preparar un complejo terapéutico o de diagnóstico comprendido de un
ligando de ácido nucleico y un compuesto no inmunogénico de peso
molecular elevado mediante el método que comprende identificar un
ligando de ácido nucleico de una mezcla de candidatos de ácidos
nucleicos, en el que el ácido nucleico es un ligando de una diana
determinada, mediante el método de (a) poner en contacto la mezcla
de candidatos de ácidos nucleicos con la diana, (b) separar entre
los miembros de dicha mezcla de candidatos en base a la afinidad
con la diana, y (c) amplificar las moléculas seleccionadas para
producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con secuencias
de ácidos nucleicos con una afinidad relativamente más elevada para
la unión a la diana, y la asociación de dicho ligando de ácido
nucleico identificado con un compuesto no inmunogénico de peso
molecular elevado.
Esta descripción proporciona un método para
mejorar la captación celular de un ligando de ácido nucleico que
tiene una diana SELEX intracelular mediante la asociación del
ligando del ácido nucleico con un compuesto no inmunogénico de peso
molecular elevado para formar un complejo comprendido de un ligando
de ácido nucleico y un compuesto no inmunogénico de peso molecular
elevado y la administración del complejo a un paciente.
Esta descripción proporciona un método para
mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ligando de ácido
nucleico mediante la asociación del ligando del ácido nucleico con
un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado y la
administración del complejo a un paciente.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar complejos que comprenden un ligando de ácido nucleico
asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado
y métodos para producir los mismos. Un objetivo adicional de la
presente invención es proporciona un ligando de ácido nucleico
asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado
con propiedades farmacocinéticas mejoradas. El compuesto no
inmunogénico de peso molecular elevado es PEG. El ligando de ácido
nucleico se identifica según el método SELEX.
En realizaciones de la presente invención
dirigidas a complejos que comprenden PEG asociados con un ligando
de ácido nucleico, el ligando de ácido nucleico puede actuar con
capacidad de reconocimiento.
En realizaciones en las que el ligando de ácido
nucleico del complejo actúa con capacidad de reconocimiento, el
complejo puede incorporar o tener asociado con él mismo agentes
terapéuticos o de diagnóstico. En una realización, el agente
terapéutico es un fármaco.
Éstos y otros objetivos, así como la naturaleza,
alcance y utilización de la presente invención, serán fácilmente
evidentes para los expertos en la materia a partir de la siguiente
descripción y las reivindicaciones adjuntas.
Las figuras 1A-1Y muestras las
descripciones moleculares de NX229, NX232, NX253, NX256, 225T3,
225T3N, T-P4,
NX-256-PEG-20.000,
225T3N-PEG-3400,
T-P4-PEG-(20.000 ó 10.000), NX268,
NX191, JW966, NX278, JW986, NX213, NX244, JW1130, NX287,
JW1336-20K PEG, JW1379, JW1380, scNX278,
JW986-PEG- (10.000, 20.000, ó 40.000), y JW1336
(SEC ID NOS: 6-30). Una letra minúscula antes de un
nucleótido indica lo siguiente:
m=2'-O-Metil,
a=2'-amino, r=ribo, y f=2'-fluoro.
Si no hay ninguna letra antes del nucleótido indica un
desoxirribonucleótido (2'H). Una S después de un nucleótido indica
una modificación en el esqueleto que consiste en una unión
fosforotioato internucleósido.
La figura 2 resume los datos para la
concentración en plasma de NX229, NX232, NX253, NX253 + Liposoma, y
NX256-PEG20K en función del tiempo después de la
inyección en bolo.
La figura 3 resume los datos para la
concentración en plasma de NX213 (SEC ID NO: 21), NX268 (SEC ID NO:
16), NX278 (SEC ID NO: 19), NX278 + liposoma, JW986 (SEC ID NO:
20), NX213 liposoma encapsulado, y NX244 (SEC ID NO: 22) en función
del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 4 resume los datos para la
concentración en plasma de JW966 (SEC ID NO: 18) y JW966 + liposoma
en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 5 resume los datos para la
concentración en plasma de NX268 (SEC ID NO: 16) y NX268 + liposoma
en función del tiempo después de la inyección en bolo.
La figura 6 resume los datos para la
concentración en plasma de NX191 (SEC ID NO: 17), JW986 + PEG20K,
PEG40K, y PEG10K (SEC ID NO: 29) en función del tiempo después de la
inyección en bolo.
La figura 7 resume los datos para la
concentración en plasma de JW986 + PEG20K (SEC ID NO: 29) y JW1130
(SEC ID NO: 23) en función del tiempo después de la inyección en
bolo.
La figura 8 resume los datos para la
concentración en plasma de NX287 + PEG40K (SEC ID NO: 24) y NX256
(SEC ID NO: 9) en función del tiempo después de la inyección en
bolo.
La figura 9 resume los datos para la
concentración en plasma de JW1130 (SEC ID NO: 23),
1136-PEG20K (SEC ID NO: 25), 1336 (SEC ID NO: 30), y
1379/80 (SEC ID NOS: 26-27) en función del tiempo
después de la inyección en bolo.
La figura 10 muestra los cromatogramas para
NX232 (SEC ID NO: 7), NX232 + 1% PGSUV, NX232 + 2,5% PGSUV, y NX232
+ PGSUV.
"Enlace covalente" es el enlace químico
formado por compartimiento de electrones.
"Interacciones no covalentes" son medios
para mantener juntas entidades moleculares mediante interacciones
diferentes de los enlaces covalentes, incluyendo interacciones
iónicas y enlaces de hidrógeno.
"Construcciones de lípidos", para los
objetivos de esta descripción, son estructuras que contienen
lípidos, fosfolípidos, o derivados de los mismos que comprenden una
variedad de disposiciones estructurales diferentes que se sabe que
adoptan estos lípidos en solución acuosa. Estas estructuras
incluyen, pero sin limitación, vesículas de bicapas lipídicas,
micelas, liposomas, emulsiones, cintas o láminas de lípidos, y
pueden formar complejos con una variedad de fármacos y adyuvantes
que son conocidos por ser farmacéuticamente aceptables. Los
adyuvantes habituales incluyen colesterol y
alfa-tocoferol, entre otros. Las construcciones de
lípidos pueden utilizarse solas o en cualquier combinación que un
experto en la materia entendería que proporciona las
características deseadas para una aplicación concreta. Además, los
aspectos técnicos de la formación de construcciones de lípidos y
liposomas son conocidos en la técnica y se puede utilizar cualquier
método utilizado habitualmente en el sector.
"Compuestos lipofílicos" son compuestos que
tienen la tendencia a asociarse con o separarse en lípidos y/u
otros materiales o fases con constantes dieléctricas bajas,
incluyendo estructuras que están comprendidas sustancialmente de
componentes lipofílicos. Los compuestos lipofílicos incluyen
construcciones de lípidos, así como compuestos que no contienen
lípidos que tienen la tendencia asociarse con lípidos (y/u otros
materiales o fases con constantes dieléctricas bajas). El
colesterol, fosfolípidos y dialquilglicerol son ejemplos adicionales
de compuestos lipofílicos.
"Complejo", tal como se utiliza en la
presente invención describe la entidad molecular formada por la
asociación de un ligando de ácido nucleico con un compuesto no
inmunogénico de peso molecular elevado. La asociación puede ser a
través de enlaces covalentes o interacciones no covalentes.
"Ligando de ácido nucleico", tal como se
utiliza en la presente invención, es un ácido nucleico no natural
que presenta una acción deseable sobre una diana SELEX. Una acción
deseable incluye, pero sin limitación, la unión a la diana SELEX,
el cambio catalítico de la diana SELEX, la reacción con la diana
SELEX, de manera que modifica/altera la diana SELEX o la actividad
funcional de la diana SELEX, la unión covalente a la diana SELEX
como en un inhibidor suicida, facilitar la reacción entre la diana y
otra molécula. En la realización preferida, la acción es la
afinidad de unión específica por una molécula diana, siendo dicha
molécula diana una estructura química tridimensional diferente de
un polinucleótido que se une a un ligando de ácido nucleico a
través de un mecanismo que depende del emparejamiento de bases
Watson/Crick o la unión en triple hélice, donde el ligando de ácido
nucleico no es un ácido nucleico que tiene la función fisiológica
conocida de estar unido por la molécula diana. En realizaciones
preferidas de la presente invención, el ligando de ácido nucleico
de los complejos de la presente invención se identifica mediante la
metodología SELEX. Los ligados de ácidos nucleico incluyen ácidos
nucleicos que se identifican a partir de una mezcla de candidatos de
ácidos nucleicos, siendo dicho ácido nucleico un ligando de una
diana determinada, mediante el método que comprende a) poner en
contacto la mezcla de candidatos con la diana, donde los ácidos
nucleicos que tienen una mayor afinidad por la diana en relación
con la mezcla de candidatos se pueden separar del resto de la mezcla
de candidatos; b) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad
del resto de la mezcla de candidatos, y c) amplificar los ácidos
nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos
nucleicos enriquecidos en
ligando.
ligando.
"Mezcla de candidatos" es una mezcla de
ácidos nucleicos de secuencia diferente a partir de la cual se
selecciona un ligando deseado. El origen de la mezcla de candidatos
pueden ser ácidos nucleicos o fragmentos de los mismos de origen
natural, ácidos nucleicos sintetizados químicamente, ácidos
nucleicos sintetizados químicamente o ácidos nucleicos producidos
mediante la combinación de las técnicas anteriores. En una
realización preferida, cada ácido nucleico tiene secuencias fijas
que rodean una región aleatoria para facilitar el proceso de
amplificación.
"Ácido nucleico" significa ADN, ARN, de
cadena única o cadena doble y cualquier modificación química de los
mismos. Las modificaciones incluyen, pero sin limitación, aquellas
que proporcionan otros grupos químicos que incorporan carga
adicional, polarizabilidad, enlaces de hidrógeno, interacción
electrostática, y fluxionalidad a bases de ligandos de ácidos
nucleicos o al ligando de ácido nucleico como tal. Dichas
modificaciones incluyen, pero sin limitación, modificaciones de
azúcares en la posición 2', modificaciones de pirimidina en la
posición 5, modificaciones de purina en la posición 8,
modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de
4-tiouridina, sustitución de
5-bromo o
5-yodo-uracilo, modificaciones en el
esqueleto, tales como uniones fosforotioato internucleósidos,
mutilaciones, combinaciones inusuales de emparejamiento de bases,
tales como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las
modificaciones también pueden incluir modificaciones en 3' y 5',
tales como terminaciones.
El "compuesto no inmunogénico de peso
molecular elevado" es un compuesto de polietilenglicol de
aproximadamente 1000 Da o más.
"Vesículas de bicapa lipídica" son esferas
microscópicas cerradas rellenas de fluido que están formadas
principalmente de moléculas individuales que tienen partes polares
(hidrofílicas) y no polares (lipofílicas). Las partes hidrofílicas
pueden comprender fosfato, glicerilfosfato, carboxi, sulfato, amino,
hidroxi, colina y otros grupos polares. Ejemplos de grupos no
polares son hidrocarburos saturados o insaturados, tales como
alquilo, alquenilo u otros grupos lipídicos. Los esteroles (por
ejemplo, colesterol) y otros adyuvantes farmacéuticamente
aceptables (incluyendo antioxidantes de tipo
alfa-tocoferol) también se pueden incluir para
mejorar la estabilidad de las vesículas o conferir otras
características deseables.
"Liposomas" son un subgrupo de vesículas de
bicapa y están comprendidas principalmente de moléculas de
fosfolípidos que contienen dos colas hidrofóbicas que consisten en
cadenas largas de ácidos grasos. Tras la exposición al agua, estas
moléculas se alinean espontáneamente para formar una membrana en
bicapa con extremos lipofílicos de las moléculas en cada capa
asociada en el centro de la membrana y los extremos polares opuestos
forman las respectivas superficies interna y externa de la membrana
en bicapa. De este modo, cada cara de la membrana presenta una
superficie hidrofílica mientras que el interior de la membrana
comprende un medio lipofílico. Estas membranas cuando se forman se
disponen generalmente en un sistema de membranas cerradas
concéntricas separadas por fases acuosas interlamelares, de una
manera no muy distinta de las capas de una cebolla, alrededor de un
espacio acuoso interno. Estas vesículas multilamelares (MLV) se
pueden convertir en vesículas pequeñas o unilamelares (UV), con la
aplicación de una fuerza de cizalla.
"Liposoma catiónico" es un liposoma que
contiene componentes lipídicos que tienen una carga positiva global
a pH fisiológico.
La metodología "SELEX" implica la
combinación de la selección de ligandos de ácido nucleico que
interaccionan con una diana de una manera deseable, por ejemplo,
uniéndose a una proteína, con la amplificación de los ácidos
nucleicos seleccionados. El ciclo iterativo de las etapas de
selección/amplificación permite la selección de uno o un pequeño
número de ácidos nucleicos que interaccionan más fuertemente con la
diana de un grupo que contiene una cantidad muy elevada de ácidos
nucleicos. Se continúa con el ciclo del procedimiento de
selección/amplificación hasta que se consigue un objetivo
seleccionado. En la presente invención, la metodología SELEX se
puede utilizar para obtener un ligando de ácido nucleico para una
diana deseada.
La metodología SELEC se describe en las
solicitudes de Patentes de SELEX.
"Diana SELEX" significa cualquier compuesto
o molécula de interés para los que se desea un ligando. Una diana
puede ser una proteína (tal como, VEGF, trombina y selectina),
péptido, carbohidrato, polisacárido, glicoproteína, hormona,
receptor, antígeno, anticuerpo, virus, substrato, metabolito,
análogo de estado de transición, cofactor, inhibidor, farmacia,
colorante, nutriente, factor de crecimiento, etc., sin limitación.
Los términos "diana SELEX" y "diana" se pueden utilizar
indistintamente en la presente invención. Estará claro a partir del
contexto de la frase si "diana" se refiere a "diana SELEX"
o no.
"Diana" significa una localización
preseleccionada en un sistema biológico que incluye tejidos,
órganos, células, compartimentos intracelulares, componentes
extracelulares. Éste último incluye hormonas (endocrinas,
paracrinas, autocrinas), enzimas, neurotransmisores y constituyentes
de fenómenos fisiológicos en cascada (por ejemplo, coagulación de
la sangre, complemento, etc.).
"Propiedades farmacocinéticas mejoradas"
significa que el ligando de ácido nucleico asociado con el
compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado muestra una vida
media de circulación más larga en relación con el mismo ligando de
ácido nucleico no asociado con un compuesto no inmunogénico de peso
molecular elevado u otras ventajas farmacocinéticas, tales como una
mayor proporción de concentración de diana con respecto a no
diana.
"Enlazador" es una entidad molecular que
conecta dos o más entidades moleculares mediante interacciones
covalentes o no covalentes.
"Espaciador" es un enlazador del tamaño que
permite la separación espacial de dos o más entidades moleculares,
de una manera que conserva las propiedades funcionales de una o más
entidades moleculares.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar complejos que comprenden uno o más ligandos de ácido
nucleico asociados con un compuesto no inmunogénico de peso
molecular elevado. Dichos complejos tienen una o más de las
siguientes ventajas sobre un ligando de ácido nucleico que no está
asociado con un compuesto no inmunogénico de peso molecular
elevado: propiedades farmacocinéticas mejoradas, 2) capacidad
mejorada para la liberación intracelular, o 3) capacidad mejorada
para el reconocimiento.
Los complejos de la presente invención pueden
aprovechar una, dos o las tres ventajas. Los complejos de la
presente invención pueden contener diferentes ligandos de ácido
nucleico que presentan objetivos totalmente diferentes en el
complejo.
En una realización, el complejo de la presente
invención está comprendido de un ligando de ácido nucleico unido
covalentemente a polietilenglicol (PEG). Las propiedades
farmacocinéticas del complejo aumentarán en relación con el ligando
de ácido nucleico solo.
El compuesto no inmunogénico de peso molecular
elevado se une covalentemente con el ligando o ligandos de ácido
nucleico. El polietilenglicol se puede unir covalentemente a un
grupo hidroxilo u otro grupo en el extremo 5' ó 3' del ligando de
ácido nucleico. Sin embargo, preferiblemente, se une al grupo
hidroxilo en 5' ó 3' del mismo. La unión del ligando de ácido
nucleico a otros componentes del complejo se puede realizar
directamente o con la utilización de enlazadores o espaciadores.
Un problema que se halla en el uso terapéutico y
de diagnóstico in vivo de ácidos nucleicos es que los
oligonucleótidos en su forma fosfodiéster se pueden degradar
rápidamente en los fluidos corporales mediante enzimas
intracelulares y extracelulares, tales como endonucleasas y
exonucleasas, antes de manifestar el efecto deseado. Se pueden
realizar ciertas modificaciones químicas del ligando de ácido
nucleico para aumentar la estabilidad in vivo del ligando de
ácido nucleico o para aumentar o mediar la liberación del ligando de
ácido nucleico. Las modificaciones de los ligandos de ácido
nucleico contempladas en la presente invención incluyen, pero sin
limitación, aquellas que proporcionan otros grupos químicos que
incorporan una carga adicional, polarizabilidad, hidrofobicidad,
enlaces de hidrógeno, interacción electrostática y fluxionalidad a
las bases del ligando de ácido nucleico o al ligando de ácido
nucleico en general. Dichas modificaciones incluyen, pero sin
limitación, modificaciones de azúcares en la posición 2',
modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones de
purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas,
sustitución de 4-tiouridina, sustitución de
5-bromo o
5-yodo-uracilo, modificaciones en el
esqueleto, modificaciones en fosforotioato o alquil fosfato,
mutilaciones, combinaciones de emparejamiento de bases inusuales,
tales como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las
modificaciones también pueden incluir modificaciones en 3' y 5',
tales como terminaciones.
Cuando los ligandos de ácido nucleico se derivan
mediante el método SELEX, las modificaciones pueden ser pre- o
post-SELEX. Las modificaciones
pre-SELEX producen ligandos de ácido nucleico con
ambas especificidades por su diana SELEX y estabilidad in
vivo mejorada. Las modificaciones post-SELEX
realizadas en ligandos de ácido nucleico con 2'-OH
pueden dar lugar a una estabilidad in vivo mejorada son
afectar de manera adversa a la capacidad de unión de los ligandos
de ácido nucleico. Las modificaciones preferidas de los ligandos de
ácido nucleico de la presente invención son las terminaciones de
fosforotioato en 5' y 3' o la unión de fosfodiéster invertido 3'3'
en el extremo 3'. Para los ligandos de ARN, se prefiere la
modificación adicional de 2'-amino
(2'-NH_{2}) de algunos o todos los
nucleótidos.
En otro aspecto de la presente invención, la
asociación del ligando de ácido nucleico con un compuesto no
inmunogénico de peso molecular elevado da lugar a propiedades
farmacocinéticas mejoradas (es decir, una velocidad de depuración
más lenta) en relación con el ligando de ácido nucleico no asociado
con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado.
Un ligando o ligandos de ácido nucleico
asociados con un compuesto no inmunogénico de peso molecular
elevado puede aumentar la liberación intracelular del ligando o
ligandos de ácido nucleico sobre el ligando o ligando de ácido
nucleico no asociados.
En la realización preferida, los ligandos de
ácido nucleico de la presente invención deriva de la metodología
SELEX. SELEX se describe en la Solicitud de Patentes de Estados
Unidos No. de Serie 07/536,428, titulada "Systematic Evolution of
Ligands by Exponential Enrichment", ya abandonada, la solicitud
de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/714,131, solicitada
el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora
la Patente de Estados Unidos No. 5,475,096, la solicitud de
Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/931,473, solicitada el
17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la
Patente de Estados Unidos No. 5,270,163 (véase también
PCT/US91/04078). Estas aplicaciones se denominan colectivamente
Solicitudes de Patente de SELEX.
El proceso SELEX proporciona una clase de
productos que son moléculas de ácido nucleico, cada uno con una
secuencia única, y cada uno tiene la propiedades de unirse
específicamente a una compuesto o molécula dianas deseadas. Las
moléculas diana son preferiblemente proteínas, pero también pueden
incluir, entre otros, carbohidratos, peptidoglicanos y una variedad
de pequeñas moléculas. La metodología SELEX también se puede
utilizar para reconocer estructuras biológicas, tales como
superficies celulares o virus, mediante la interacción específica
con una molécula que es una parte integral de esa estructura
biológica.
En su forma más básica, el proceso SELEX se
puede definir mediante la siguiente serie de etapas:
1) Se prepara una mezcla de candidatos de ácidos
nucleicos de diferente secuencia. La mezcla de candidatos incluye
generalmente regiones de secuencias fijas, es decir, cada uno de los
miembros de la mezcla de candidatos contiene las mismas secuencias
en la misma localización) y las regiones de secuencias aleatorias.
Las regiones de secuencia fija se seleccionan:
(a) para ayudar en las etapas de amplificación
descritas a continuación, (b) para mimetizar una secuencia conocida
por unirse a la diana, o (c) para aumentar la concentración de una
disposición estructural determinada de los ácidos nucleicos en la
mezcla de candidatos. Las secuencias aleatorias pueden ser
totalmente aleatorias (es decir, la probabilidad de encontrar una
base en cualquier posición es una de cuatro) o sólo parcialmente
aleatoria (por ejemplo, la probabilidad encontrar una base en
cualquier localización se puede seleccionar a cualquier nivel entre
0 y el 100 por cien).
2) La mezcla de candidatos se pone en contacto
con la Diana seleccionada en condiciones favorables para la unión
entre la diana y los miembros de la mezcla de candidatos. En estas
circunstancias, la interacción entre la diana y los ácidos
nucleicos de la mezcla de candidatos se puede considerar que forma
parejas de ácido nucleico-diana entre la diana y
los ácidos nucleicos que tienen la mayor afinidad por la diana.
3) Los ácidos nucleicos con la mayor afinidad
por la diana se pueden separar de los ácidos nucleicos con menor
afinidad a la diana. Debido a que sólo un número extremadamente
pequeño de secuencias (y posiblemente sólo una molécula de ácido
nucleico) que corresponden a los ácidos nucleicos de afinidad más
elevada existen en la mezcla de candidatos, es generalmente
deseable establecer el criterio de separación, de manera que se
retiene una cantidad significativa de los ácidos nucleicos en la
mezcla de candidatos (aproximadamente 5-50%) durante
la separación.
4) Los ácidos nucleicos seleccionados durante la
separación que tienen la afinidad relativamente más elevada por la
diana se amplifican a continuación para crear una nueva mezcla de
candidatos que se enriquece en ácidos nucleicos que tienen una
afinidad relativamente más elevada por la diana.
5) Mediante la repetición de las etapas de
separación y amplificación anteriores, la mezcla de candidatos
recién formada contiene cada vez menos secuencias únicas, y el grado
medio de afinidad de los ácidos nucleicos por la diana generalmente
aumentará. Tomado en su extremo, el proceso SELEX producirá una
mezcla de candidatos que contiene uno o un pequeño número de ácidos
nucleicos que representan los ácidos nucleicos de la mezcla de
candidatos original que tienen la afinidad más elevada por la
molécula diana.
El método SELEX básico se ha modificado para
conseguir un conjunto de objetivos específicos. Por ejemplo, la
Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/960,093,
solicitada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for
Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure." describe el
uso de SELEX conjuntamente con electroforesis en gel para
seleccionar moléculas de ácido nucleico con características
estructurales específicas, tales como ADN curvado. La Solicitud de
Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/123,935, solicitada el
17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid
Ligands", describe un método basado en SELEX para la selección
de ligandos de ácido nucleico que contienen grupos fotoreactivos
capaces de unirse y/o fotoreticularse y/o fotoinactivar una
molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de
Serie 08/134,028, solicitada el 7 de octubre de 1993, titulada
"High-Affinity Nucleic Acid Ligands That
Discriminate Between Theophylline and Caffeine", describe un
método para identificar ligandos de ácido nucleico altamente
específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente
relacionadas, denominado Contra-SELEX. La Solicitud
de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/143,564, solicitada
el 25 de octubre de 1993, titulada "Systematic Evolution of
Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", describe un
método basado en SELEX que consigue una separación altamente eficaz
entre oligonucleótidos que tienen una afinidad elevada y baja por
una molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No.
de Serie 07/964,624, solicitada el 21 de octubre de 1992, titulada
"Methods of Producing Nucleic Acid Ligands" describe métodos
para obtener ligandos de ácido nucleico mejorados después de
realizar SELEX. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de
Serie 08/400,440, solicitada el 8 de marzo de 1995, titulada
"Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment:
Chemi-SELEX", describe métodos para unir
covalentemente un ligando a su diana.
El método SELEX comprende la identificación de
ligandos de ácido nucleico de afinidad elevada que contiene
nucleótidos modificados que confieren características mejoradas en
el ligando, tal como una estabilidad in vivo mejorada o
características de liberación mejoradas. Entre los ejemplos de
dichas modificaciones se incluyen sustituciones químicas en las
posiciones de ribosa y/o fosfato y/o bases. Los ligandos de ácido
nucleico identificados por SELEX que contienen nucleótidos
modificados se describen en la Solicitud de Patente de Estados
Unidos de No. de Serie 08/117,991, solicitada el 8 de septiembre de
1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing
Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que
contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las
posiciones 5 y 2' de pirimidinas. La Solicitud de Patente de Estados
Unidos de No. de Serie 08/134,028, supra, describe ligandos
de ácido nucleico altamente específicos que contienen uno o más
nucleótidos modificados con 2'-amino
(2'-NH_{2}), 2'-fluoro
(2'-F), y/o
2'-O-metilo
(2'-OMe). La Solicitud de Patente de Estados Unidos
de No. de Serie 08/264,029, solicitada el 22 de junio de 1994,
titulada "Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidine
Intramolecular Nucleophilic Displacement", describe
oligonucleótidos que contienen diversas pirimidinas modificadas en
2'.
El método SELEX comprende combinar
oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos
seleccionados y unidades funcionales que no son oligonucleótidos
tal como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos
de No. de Serie 08/284,063, solicitada el 2 de agosto de 1994,
titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment: Chimeric SELEX" y la Solicitud de Patente de Estados
Unidos de No. de Serie 08/234,997, solicitada el 28 de abril de
1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment: Blended SELEX", respectivamente. Estas solicitudes
permiten la combinación del amplio espectro de formas y otras
propiedades, y las propiedades de amplificación y replicación
eficaces de oligonucleótidos con las propiedades deseadas de otras
moléculas. Cada una de las solicitudes de patente descritas
anteriormente que describen modificaciones del procedimiento SELEX
básico se incorpora específicamente por referencia en su
totalidad.
SELEX identifica ligandos de ácido nucleico que
son capaces de unirse a dianas con afinidad elevada y con una
especificad excepcional, que representa un logro singular que no
tiene precedentes en el campo de la investigación de los ácidos
nucleicos. Estas características son naturalmente las propiedades
deseadas que un experto en la materia buscaría en un ligando
terapéutico o de diagnóstico.
Con el fin de producir ligandos de ácido
nucleico deseables para su uso como producto farmacéutico, se
prefiere que el ligando de ácido nucleico (1) se une a la diana de
manera que es capaz de conseguir el efecto deseado en la diana; (2)
sea tan pequeño como sea posible para obtener el efecto deseado; (3)
sea tan estable como sea posible; y (4) sea un ligando específico
para la diana elegida. En la mayoría de las situaciones, se
prefiere que el ligando de ácido nucleico tenga la afinidad más alta
posible por la diana. Adicionalmente, los ligandos de ácido
nucleico pueden tener propiedades auxiliares.
En la Solicitud de Patente de Estados Unidos en
trámite y habitualmente designada de No. de Serie 07/964,624,
solicitada el 21 de octubre de 1992 ('624), se describen métodos
para obtener ligandos de ácido nucleico mejorados después de
realizar SELEX.
En realizaciones en las que el ligando o
ligandos de ácido nucleico pueden actuar con capacidad de
reconocimiento, los ligandos de ácido nucleico adoptan una
estructura tridimensional que debe retenerse con el fin de que el
ligando de ácido nucleico sea capaz de unirse a su diana. Además, el
ligando de ácido nucleico debe orientarse correctamente con
respecto a la superficie del complejo, de manera que su capacidad de
unión a la diana no esté comprometida. Esto se puede conseguir
mediante la unión del ligando de ácido nucleico en una posición que
está distante de la parte de unión del ligando de ácido nucleico. La
estructura tridimensional y la orientación adecuada también se
pueden conservar mediante el uso de un enlazador o espaciador tal
como se ha descrito anteriormente.
Se puede unir o incorporar en el complejo
cualquier variedad de agentes terapéuticos o diagnóstico tal como
se ha descrito anteriormente para la liberación dirigida por el
complejo.
En otras realizaciones, el complejo de la
presente invención está comprendido de un ligando de ácido nucleico
unido a PEG. En esta realización, se mejoran las propiedades
farmacocinéticas del complejo en relación con el ligando de ácido
nucleico solo. Tal como se ha descrito anteriormente, la asociación
es a través de enlaces covalentes. También, tal como se ha descrito
anteriormente, el PEG puede estar unido covalentemente a una
variedad de posiciones en el ligando de ácido nucleico. Cuando se
utiliza PEG, se prefiere que el ligando de ácido nucleico se una a
5' tiol a través de una funcionalidad maleimida o vinil sulfota o a
través de una unión fosfodiéster. En realizaciones adicionales, se
pueden unir ente sí un conjunto de moléculas PEG.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
explicar e ilustrar la presente invención y no deben tomarse como
limitantes de la invención. Las estructuras de los ligandos de ácido
nucleico descritas en los ejemplos siguientes se muestran en la
figura 1. El ejemplo 1 describe la conjugación de ligandos de ácido
nucleico con lípido, dialquil glicerol o diacil glicerol, así como
la incorporación de modificadores farmacocinéticas a través de la
síntesis automatizada. El ejemplo 2 describe la conjugación de PEG y
colesterol con un ligando de ácido nucleico. Las modificaciones al
ligando de ácido nucleico no interfieren con su capacidad para
unirse a su diana SELEX, ya que las afinidades de unión de los
ligandos de ácido nucleico conjugados a PEG y colesterilados eran
idénticas a las moléculas no conjugadas y no colesteriladas. El
ejemplo 3 describe las propiedades farmacocinéticas de ligandos de
ácido nucleico asociados con colesterol solo, dialquil glicerol
solo, con PEG solo, con colesterol y liposoma, con dialquil
glicerol y liposomas, y con PEG y liposoma. También se incluyen los
ligandos de ácido nucleico que han sido modificados en la posición
del azúcar 2' de purinas y pirimidinas. El ejemplo 4 describe la
conjugación covalente de ligandos de ácido nucleico a liposomas.
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Ejemplo
1
En este ejemplo, se describe la conjugación de
ligandos de ácido nucleico con reactivos lípidos y/o PEG o diacil
glicerol o dialquil glicerol, así como la incorporación de los
modificaciones farmacocinéticas a través de la síntesis
automatizada utilizando química de acoplamiento de fosforamidita o
H-fosfonato. En los esquemas representados a
continuación, una flecha representa las etapas que se han completa,
mientras que una flecha discontinua representa las etapas que aún
no se han completado. El esquema 1 representa la preparación de un
reactivo dipalmitoil fosfatidil etanolamina maleimida para acoplarse
a sustratos de oligonucleótidos modificados con sulfhidrilo. Este
procedimiento es análogo al descrito por Cheronis et al
(Cheronis, J. C. et al., J. Med. Chem. (1992) 35:
1563-1572) para la preparación de reactivos bis- y
tris-maleimida a partir de sustrato alifáticos di-
y triamina simples. El tratamiento del fosfolípido con
metoxicarbonil maleimida daba lugar a la formación de un intermedio
no caracterizado que, tras la incubación con oligonucleótidos
modificado con sulfhidrilo, daba lugar a la conversión completa del
oligonucleótido al conjugado de dipalmitoil fosfatidil etanolamina
(vida infra). Reactivos similares también se encuentran
disponibles comercialmente de Avanti Polar Lipids.
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Esquema
1
La capacidad de modificar oligonucleótidos bajo
condiciones de síntesis automatizada tiene ventajas obvias. Los
reactivos se prepararon de manera que permitían la incorporación
fácil de grupos de lípidos y/o PEG bajo condiciones de síntesis
automatizadas estándar. Inicialmente, se diseñó y se sintetizó el
módulo versátil 10 (Esquema 2) que se podía convertir de forma
divergente en cualquier cantidad de reactivos de modificación de
oligonucleótidos de interés mediante la simple funcionalización
quimioselectiva del grupo amino y a continuación la fosfotilación
del grupo hidroxilo. Cabe indicar la flexibilidad que esta
estrategia ofrece con respecto al grupo de modificación (el ligando
amina) y al precursor fosfato activado (fosforamidita,
H-fosfonato o fosfato triéster) introducido a
través de la derivatización del grupo 2'-hidroxilo.
Adicionalmente, el núcleo de glicerol de los reactivos de la
síntesis automatizada preparados de esta manera hace que los
productos sean adecuados para la modificación de oligonucleótidos
en las posiciones internas de cadena, o en el extremo 5'. Una
síntesis alternativa del módulo 10 se muestra en el Esquema 3. Se
derivatiza tetraetilenglicol (1; TEG) como el monotosilato 2a tras
el tratamiento con una cantidad limitante de cloruro de
p-toluensulfonilo, preferiblemente 10% molar, en un
medio básico, preferiblemente piridina. De esta manera, se obtuvo 2a
en un 75% de rendimiento tras la filtración en gel de sílice. Se
realizó la conversión de 2a al TEG ftalimida 3 a en un 80% de
rendimiento tras el tratamiento con ftalimida en presencia de
diazabicicloundecano (DBU) como base a temperatura elevada en
solución DMF. La alilación de la ftalimida 3 a (bromuro de alilo,
NaH, THF/DMF) permitió obtener un 65% de rendimiento de alil TEG 4a.
El tratamiento de 4a con OsO_{4} al 0,5% y 1,1 equivalentes de
N-metilmorfolina N-óxido (NMO) permitió obtener un
intermedio de diol que se convirtió, sin purificación adicional, en
derivado éter de dimetoxitritil (DMT) 9 en un 89% de rendimiento
global para las dos etapas. Finalmente, se llevó a cabo la
desprotección de la amina utilizando MeNH2 al 40% para proporcionar
10 en un 95% de rendimiento purificado. Se ha elaborado
adicionalmente el módulo 10 mediante tratamiento con PEG
nitrofenilcarbonato (PEG-NFC; Shearwater Polymers).
De este modo, se preparó el precursor 12 de fosfitilación (Esquema
4) con un rendimiento excelente. Se han llevado a cabo conversiones
adicionales de 12 tanto en fosforamidita 13 como
H-fosfonato 14.
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Esquema
2
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\newpage
Esquema
3
Esquema
4
El diseño de un reactivo de lípido para
modificación de oligonucleótido mediante síntesis automatizada
necesita la sustitución de los enlaces éster de diacilgliceroles
nativos, como en el derivado de dipalmitoil fosfatidilo descrito
anteriormente, mediante enlaces de glicerolalquilo estables al
protocolo de desprotección básica requerido para la recuperación de
oligonucléotidos sintéticos. El enlace que se eligió para explorar
inicialmente fue el enlace éter, como en el derivado de dipalmitil
glicerol 15 conocido (disponible en Sigma), aunque también serían
adecuados carbamatos de alquilo de larga cadena (o una combinación
de éteres y carbamatos). Se activó el dipalmitil glicerol como el
acil carbonil imidazol (CDI, piridina) y este intermedio activado
se acopló con el módulo 10 (piridina, 80ºC; 44%). La fosfitilación
(ClP(iPr_{2}N)OCH_{2}CH_{2}CN;
diisopropietilamina (DIPEA), CH_{2}Cl_{2}; 59%) de 16
proporcionó la fosforamidita 17 (Esquema 5). En el Esquema 6 se
muestra la síntesis de un análogo C_{18} de amidita 17 a través
de un intermedio de cloroformiato. Se convirtió el dialquil
glicerol (18; DAG) en el correspondiente cloroformiato 19 tras el
tratamiento con fosgeno en exceso en tolueno. Se llevó a cabo la
conjugación de 19 y el aminoalcohol 10 en piridina para proporcionar
el aducto 20 con un 57% de rendimiento purificado. La fosfitilación
del hidroxilo secundario de 20 bajo condiciones estándar
proporcionó la fosforamidita 21 con 95% de rendimiento. El
acoplamiento de la amidita 17 al extremo 5' de un trinucleótido
(TTT) en un sintetizador automatizado de oligonucleótidos ABI 394
utilizando un ciclo de síntesis ligeramente modificado con tiempos
de acoplamiento extendidos (acoplamientos de 2x 30 min) para la
amidita de lípido dio lugar a 94+% de eficacia del acoplamiento, tal
y como se determina mediante el análisis del catión tritilo en
línea.
Esquema
5
Esquema
6
Ejemplo
A
Reactivo maleimida: Se agitó a
temperatura ambiente una suspensión de 200 mg (0,289 mmol) de DPPe y
54 mg (0,347 mmol) de metoxicarbonil maleimida en 10 mL de
THF/solución saturada de NaHCO_{3} (1:1). Después de 12 horas, la
mezcla se trató con 100 mL de EtOAc y la fase orgánica (que contenía
una suspensión gelatinosa del producto) se separó de la fase
acuosa. La fase orgánica se concentró al vacío, se coevaporó dos
veces con MeOH, y el sólido blanco resultante se trituró tres veces
con EtOAc. Esta material se utilizó sin caracterización o
purificación adicional en experimentos de conjugación de
oligonucleótidos (vida Infra).
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Ejemplo
B
Tetraetilenglicol dimetoxitritil éter (2): Se
disolvió tetraetilenglicol (76,4 ml, 0,44 mol) en 300 mL de
piridina anhidra y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió cloruro de
4,4'-dimetoxitritilo (15 g, 0,044 mol) como un
sólido con agitación. El matraz de reacción se cubrió con un tubo de
secado y se dejó que la reacción se calentara hasta temperatura
ambiente durante la noche. La reacción se concentró al vacío a baja
temperatura (<30ºC). El residuo se diluyó con 300 mL de acetato
de etilo y se extrajo con 3 x 300 mL de agua. Las capas acuosas
combinadas se extrajeron con acetato de etilo y las capas orgánicas
combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. El
residuo crudo se purificó mediante cromatografía súbita utilizando
1000 mL de gel de sílice (empaquetado en húmedo en la columna
utilizando trietilamina al 5% que contenía hexano), eluyendo con
acetato de etilo al
10-20-40-60-80%
en trietilamina al 5% que contenía hexano y a continuación,
trietilamina al 5% que contenía acetato de etilo. Se recogieron
19,51 g (89%) de 2 como un aceite dorado. 1H RMN (300 MHz,
CDCl_{3}) d 7.47-7.16 (señales solapantes, 9H),
6.79 (d, 4H), 3.72 (s, 6H), 3.66-3.62 (m, 2H), 3.22
(t, J=5.22 Hz, 1H), 2.96 (br t, 1H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d
158.12, 144.86, 136.04, 129.81, 127.93, 127.49, 126.40, 112.78,
85.67, 72.31, 70.48, 70.44, 70.12, 62.89, 61.39, 54.89; MS m/e de
baja resolución calculado para C_{15}H_{25}O_{7}S
(M-DMT+1+): 349,167, hallado 349,1.
Tetraetilenglicol dimetoxitritil éter
p-toluensulfonato (3): Se disolvió el compuesto 2
(5,0 g, 10,06 mmol) en 50 mL de diclorometano anhidro y se enfrió
hasta 0ºC. Se añadió trietilamina (1,82 mL, 13,1 mmol), seguido de
cloruro de p-toluensulfonilo (1,92 g, 10,06 mmol)
como sólido, con agitación. La mezcla de reacción se almacenó en el
refrigerador durante toda la noche. El análisis TLC indicó que la
reacción se completó aproximadamente en un 80%, Se añadieron
adicionalmente 0,5 equivalentes de trietilamina y 0,5 equivalentes
de cloruro de p-oluensulfonilo y la reacción se
agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de
reacción se filtró a través de Celita y se concentró. El residuo se
purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando
300 mL de gel de sílice (empaquetado en húmedo en la columna
utilizando trietilamina al 5% en hexano) eluyendo con acetato de
etilo al 25-50-75% en hexano que
contenía trietilamina al 5% y, a continuación, acetato de etilo que
contenía trietilamina al 5%. Se recogieron 5,7 g (87%) de 3 como un
aceite naranja. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.75 (d, 2H),
7.44-7.12 (m, 11H), 6.78 (d, 4H),
4.12-4.09 (m, 2H), 3.73 (s, 6H),
3.66-3.54 (m, 13H), 3.22 (t, J=3.87 Hz, 2H), 2.41
(s, 3H).
Tetraetilenglicol monotosilato (2a): Se disolvió
tetraetilenglicol (200 mL, 1,15 mol) en 500 mL de piridina y se
enfrió hasta 0ºC y se trató con 22,0 g (0,115 mol) de cloruro de
p-toluensulfonilo. Cuando se completó la solución,
la mezcla de reacción se almacenó en el refrigerador durante la
noche, y a continuación se concentró al vacío. El residuo se
disolvió en 800 mL de EtOAc y se extrajo con 3 x 600 mL de H2O. Las
fracciones acuosas se retroextrajeron con EtOAc, y las fracciones
de EtOAc combinadas se extrajeron con Na2HPO4 acuosa saturado. La
fase orgánica se secó sobre MgSO4 y se concentró hasta una aceite
incoloro. El aceite se purificó mediante cromatografía súbita
("flash") utilizando 800 mL de gel de sílice y eluyendo con
hexano, EtOAc al 25%-EtOAc al 505 en hexano, a continuación EtOAc,
a continuación MeOH al 10%-MeOH al 20% en EtOAc para obtener 23,7 g
(60% de producto puro y 11% de producto que contenía una impureza
menor. 2a: 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.77 (d, J=8.1 Hz, 2H),
7.32 (d, J=8.1 Hz, 2H), 4.13 (t, J=4.8 Hz, 2H),
3.68-3.53 (m, 14H), 2.58 (t, J=5.6 Hz, 1H), 2.42
(s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl_{3}) d 168.2, 158.3, 144.8, 135.9,
133.8, 132.0, 129.9, 128.0, 127.7, 126.6, 123.1, 113.0, 85.9, 73.0,
70.6, 70.4, 70.0, 69.7,67.8,64.4,55.1,37.1; MS m/e de baja
resolución calculada para C_{15}H_{24}O_{8}S (M+1):
349,1.
Tetraetilenglicol monoftalimida (3a): A una
solución agitada de 31,96 g (0,092 mol) de 2a en 400 mL de DMF
anhidro se añadieron 14,2 g (1,05 equiv.) de ftalimida y 14,4 ml
(1,05 equiv.) de 1,8-diazabiciclo [5.4.0]
undec-7-eno. La solución se calentó
a 70ºC durante 18 h, a continuación se concentró al vacío. El
aceite amarillo crudo se purificó mediante cromatografía súbita
("flash") utilizando 1600 mL de gel de sílice y eluyendo con
EtOAc al 25%-EtOAc al 50%-EtOAc al 75% en hexano, a continuación
EtOAc, a continuación MeOH al 10%-MeOH al 20% en EtOAc para obtener
23,8 g (80%) de 3 a como un aceite. Tras reposo, 3 a se convirtió
en un sólido blanco ceroso. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d
7.84-7.78 (m, 2H), 7.70-7.66 (m,
2H), 3.86 (t, J=5.6 Hz, 2H), 3.70 (t, J=5.6 Hz, 2H),
3.64-3.51 (m, 12H), 2.67 (bs, 1H); 13C RMN (75 MHz,
CDCl_{3}) d 168.2, 133.8, 132.0, 123.1, 72.4, 70.5, 70.4, 70.2,
70.0, 67.8, 61.6, 37.2.
Síntesis del compuesto 4a: Una solución de 15 g
(0,0464 mol) de 3a en 150 mL de THF y 15 mL de DMF se enfrió hasta
0ºC bajo Ar. Se añadió bromuro de alilo (6,0 ml, 1,5 equiv.) a la
solución, seguido de la adición de 1,76 g (1,5 equiv.) de NaH como
sólido. La suspensión amarilla opaca se agitó a 0ºC durante 30
minutos y a continuación a temperatura ambiente durante 18 horas. Se
añadió y concentró MeOH (50-100 mL) y a
continuación se concentró la mezcla al vacío. El material crudo se
purificó mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando
1500 mL de gel de sílice y eluyendo con EtOAc al 25%-EtOAc al
50%-EtOAc al 75% en hexano, a continuación EtOAc, a continuación
MeOH al 10% en EtOAc para obtener 11,05 g (65%) de 4^{a} como un
aceite amarillo. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d
7.84-7.80 (m, 2H), 7.72-7.67 (m,
2H), 5.94-5.84 (m, 1H), 5.28-5.14
(m, 2H), 3.99 (d, J=5.61 Hz, 2H), 3.88 (t, J=5.85 Hz, 2H), 3.72 (t,
J=5.76 Hz, 2H), 3.64-3.54 (m, 13H); 13C NMR (75
MHz. CDCl_{3}) d 168.0, 134.6, 133.7, 131.9, 123.0, 116.9, 72.0,
70.4, 69.9, 69.2, 67.7, 37.0.
(S)-(+)-2,2-Dimetil-1,3-dioxolanil-4-ilmetil
(dimetoxitritil) tetraetilen glicol (5): se pesó hidruro sódico
(0,56 g, 23,5 mmol) en un matraz secado a la llama, y se añadieron
70 mL de tetrahidrofurano anhidro y 15 mL de
N,N-dimetilformamida anhidro. La suspensión se
enfrió hasta 0ºC bajo argón, y se añadió gota a gota
(S)-(+)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol
(2,7 mL, 21,7 mmol) a través de una jeringa. Después de agitar
durante 30 minutos a 0ºC, se añadió gota a gota el compuesto 3
(11,77 g, 18,1 mmol) en 15 mL de tetrahidrofurano mediante un
embudo de adición. La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante la noche, a continuación se detuvo con 100 mL de
bicarbonato acuoso saturado y se diluyó con 300 mL de dietil éter.
Las capas se separaron, y la capa de éter se extrajo 3 veces con
300 mL de agua. La capa de éter se secó sobre sulfato de sodio y se
concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía súbita
("flash") utilizando 500 mL de gel de sílice y eluyendo
primero con hexano y a continuación acetato de el etilo al
10-20-30-40-50-75%
en hexano y, a continuación, con acetato de etilo. Se recogieron
8,93 g (82%) de 5 como un aceite incoloro. 1H RMN (CDCl_{3}) d
7.46-7.43 (m, 2H), 7.34-7.17 (m,
7H), 6.78 (d, 4H), 4.23 (penteto, J=6.1 Hz, 1H), 4.00 (t, 8.2H),
3.75 (s, 6H), 3.71-3.60 (m, 15H), 3.53 (dd, J=10.0,
5.7 Hz, 1H), 3.52 (10.4, J=5.2 Hz, 1H), 1.39 (s, 3H), 1.33 (s, 3H);
13C NMR (75 MHz, CDCl_{3}) d 158.24, 144.97, 136.20, 129.93,
128.07, 127.61, 126.51, 112.89, 109.21, 85.77, 74.57, 72.20, 70.82,
70.59, 70.40, 69.68, 66.67, 63.01, 55.04, 26.67, 25.29; MS m/e de
baja resolución calculada para C_{35}H_{50}O_{9}N (M+NH4 +):
628.399, encontrado
628.5.
628.5.
(S)-(+)-2,2-Dimetil-1,3-dioxolanil-4-ilmetil
tetraetilenglicol (6): Se enfriaron 100 mL de ácido acético al 80%
hasta 0ºC y, a continuación, se añadió a un compuesto 5 (6,6 g, 10,8
mmol). La solución naranja clara se agitó a 0ºc durante 1 hora. Se
añadió metanol (100 mL) y la mezcla de reacción se concentró al
vacío a baja temperatura (<30ºC). El residuo se purificó
mediante cromatografía súbita ("flash") utilizando 200 mL de
gel de sílice, eluyendo primero con acetato de etilo y, a
continuación metanol al
5-10-15-20% en
acetato de etilo. Se recogieron 2,5 g (74%) de 6 como un aceite
incoloro. 1H RMN (CDQ3) d 4.21 (penteto, J=6.2 Hz, 1H), 4.08 (dd,
J=5.9, 4.8 Hz, 1H), 3.82-3.35 (m, 19H), 2.93 (br s,
1H), 1.34 (s, 3H), 1.28 (s, 3H); 13C RMN (75 MHz. CDCl_{3}) d
109.20, 74.50, 72.42, 72.14, 70.76, 70.39, 70.32, 70.14, 66.63,
61.48, 26.61, 25.23; MS m/e de baja resolución calculada para
C_{35}H_{50}O_{9}N (M+NH4+): 628.399, encontrado 628.5.
(S)-(+)-2,2-Dimetil-1,3-dioxolanil-4-ilmetil
(ftalimida) tetraetilen glicol (8): Se disolvió el alcohol 6 (4,06
g, 13,2 mmol) en 50 mL de diclorometano anhidro y se enfrió hasta
0ºC. Se añadió trietilamina (3,7 mL, 26,3 mmol), seguido de la
adición de cloruro de p-toluensulfonilo (3,26 g,
17,1 mmol). El matraz de reacción se cubrió por un tubo de secado y
se dejó calentar hasta temperatura ambiente durante la noche. La
mezcla de reacción se filtró a través de Celite y el filtrado se
concentró al vacío. El material crudo se purificó mediante
cromatografía súbita en 400 ml de gel de sílice, eluyendo primero
con acetato de etilo al 10% en hexano, y a continuación acetato de
etilo al
20-40-60-80-100%,
y a continuación metanol al 10% en acetato de etilo. Se recogieron
5,21 g (85%) del intermedio tosilato como un aceite dorado (1H RMN
(400 MHz, CDCl_{3}) d 7.79 (d, J=8.1 Hz, 2H, aromáticos de
tosilo), 7.32 (d, J=8.1 Hz, 2H, aromáticos de tosilo), 4.25
(penteto, J=6.0 Hz, 1H), 4.13 (t, 4.7H), 4.02 (dd, J=8.12, 6.4 Hz,
1H), 3.71-3.40 (m, 18H), 2.42 (s, 3H), 1.46 (s, 3H),
1.34 (s, 3H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 144.74, 133.1, 129.76,
127.91, 109.8, 74.63, 72.27, 70.89, 70.68, 70.52, 70.44, 69.19,
68.60, 66.74, 64.1, 26.73, 25.34, 21.59; MS m/e de baja resolución
calculada para C_{21}H_{38}O_{9}NS (M+NH4+): 480,364,
encontrado 480,2.) El tosilato (5,2 g, 11,24 mmol) se disolvió en 60
mL de dimetilformamida anhidra. Se añadió
1,8-diazabiciclo-[5.4.0]undec-7-eno
(1,7 mL, 11,24 mmol), seguido de ftalimida (1,65 g, 11,24 mol). La
mezcla de reacción se calentó hasta 70ºC durante la noche. La mezcla
de reacción se concentró al vacío y se purificó mediante
cromatografía súbita en 400 mL de gel de sílice, eluyendo con
acetato de etilo al 50% en hexano. Se recogieron 3,96 g (81%) de 8
como un aceite incoloro. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d
7.83-7.79 (m, 2H), 7.72-7.68 (m,
2H), 4.26 (penteto, J=6.0 Hz, 1H), 4.03 (dd, J=8.2, 6.5 Hz, 1H),
3.88 (t, J=5.8 Hz, 1H), 3.74-3.44 (m, 18H), 1.39
(s, 3H), 1.33 (s, 3H); 13C RMN (75 MHz. CDCl_{3}) d 168.21,
133.88, 132.10, 123.19, 109.33, 74.66, 72.30, 70.90, 70.52, 70.04,
67.87, 66.79, 37.19, 26.75, 25.37; MS m/e calculada para
C_{22}H_{35}O_{8}N_{2} (M+NH4+): 455,288, encontrado
455.2.
1-Dimetoxitriril-3-(ftalimidotetraetilen
glycolil)-sn-glicerol (9): Según el
esquema 2, se sintetiza el compuesto 9 de la siguiente manera: se
disolvió el acetilo 8 (5,16 g, 11,8 mmol) en 100 mL de metanol
anhidro, y se añadió ácido p-toluen sulfónico
anhidro (100 mg). El matraz de reacción se cubrió con un tubo de
secado y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 2,5 horas, a continuación se neutralizó mediante la adición
de 10 mL de piridina anhidra, se concentró al vacío y se coevaporó
con piridina anhidra. El diol resultante se disolvió a continuación
en 1,50 mL de piridina anhidra y se enfrió hasta 0ºC. Se añadió
cloruro de 4,4-dimetoxitritilo (4,39 g, 13 mmol)
como un sólido. El matraz de reacción se cubrió con un tubo de
secado y la mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura
ambiente durante la noche. Se añadió metanol (50 mL), y la mezcla
de reacción se concentró al vacío. El material crudo se purificó
mediante cromatografía súbita en 700 mL de gel de sílice
(empaquetado en húmedo en una columna con trietilamina 1l 5% en
hexano), eluyendo primero con acetato de etilo al 10% en hexano
(que contiene trietilamina al 5%). Se recogieron 6,98 g (82%) de 9
como un aceite amarillo claro. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 7.80
(dd, J=5.4, 3.1 Hz, 2H), 7.68 (dd, J=5.4, 3.1 Hz, 2H),
7.42-7.14 (m, 9H, DMT), 6.79 (d, 4H, DMT), 3.95 (br
m, 1H). 3.86 (t, J=5.9 Hz, 1H), 3.75 (s, 6H), 3.70 (t,
J-5.6 Hz, 1H), 3.63-3.37 (m, 18H),
3.16 (m, 2H), 2.84 (br d, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl_{3}) d
168.15, 158.32, 144.79, 135.95,133.82, 132.02, 129.95, 128.04,
127.69, 126.64, 123.12, 112.97, 85.89, 72.97, 70.64, 70.43, 69.97,
69.74, 67.80, 64.34, 55.10, 37.14; MS m/e de baja resolución
calculada para C_{40}H_{49}O_{10}N_{2} (M+NH4+): 717,398,
encontrado 717,5. Según el esquema 3, el compuesto 9 se sintetizó de
la siguiente manera: A una solución agitada de 4a (10,13 g, 0,0279
mol) en 100 mL de acetona y 1 mL de H_{2}O se añadieron 3,98 g
(1,22 equiv.) de N-metilmorfolina N-óxido. A esta
suspensión se añadieron 1,75 mL (0,05 equiv.) de tetróxido de osmio
como una solución al 2,5% en iPrOH. Después de la adición de la
solución de OsO4, la mezcla de reacción se volvió de color amarillo
claro. Después de que el análisis TLC indicara una conversión
completa de 4a (aproximadamente 16 horas), la mezcla de reacción se
trató con 1,5 g de hidrosulfito sódico y 5,0 g de florisilo y se
agitó durante 30 minutos. La suspensión se filtró a través de
florisilo, el filtrado se concentró hasta obtener un aceite. Este
producto crudo se combinó con otro lote preparado de la misma manera
a partir de 1,0 g de 4a. Dos partes de 100 ml de piridina se
coevaporaron de los lotes combinados y el residuo se disolvió en 300
mL de piridina. La solución se enfrió hasta 0ºC y se añadieron
10,89 g (1,05 equiv.) de cloruro de
4,4'-dimetoxitritilo. Se insertó un tubo de secado
en el matraz y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 16 h. La solución se trató con 20 mL de MeOH y se concentró
al vacío, manteniendo la temperatura del baño de agua por debajo de
40ºC. El aceite crudo se purificó mediante cromatografía súbita
("flash") utilizando 100 mL de gel de sílice (empaquetado en
húmedo en la columna utilizando trietilamina al 3% en hexano), y
eluyendo con EtOac al 10-100% en hexano (todos
contenían trietilamina al 35) para obtener 21,3 g (89% después de
dos etapas) de 9 como un aceite amarillo. 1H RMN (300 MHz,
CDCl_{3}) d 7.80-7.77 (m, 2H),
7.66-7.64 (m, 2H), 7.39-7.22 (m,
9H), 7.20-6.76 (m, 4H), 3.97 (bs, 1H), 3.84 (t,
J=5.97 Hz, 2H), 3.74 (s, 6H). 3.68 (t, J=5.7 Hz, 2H),
3.60-3.49 (m, 14H), 3.13-2.76 (m,
2H), 2.00 (bs, 1H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 168.2, 158.3,
144.8, 135.9, 133.8, 132.0, 129.9, 128.0, 127.7, 126.6, 123.1,
113.0, 85.9, 73.0, 70.6, 70.4, 70.0, 69.7, 67.8, 64.4, 55.1, 37.1;
MS m/e de baja resolución calculada para
C_{40}H_{45}O_{10}N
(M+NH4+): 717.5.
(M+NH4+): 717.5.
1-Dimetoxitritil-3-(aminotetraetilen
glicolil)-sn-glicerol (10): Según el
esquema 2, el compuesto 10 se sintetizó de la siguiente manera: se
recibió el compuesto 9 (5,2 g, 7.2 mmol) en 50 mL de metilamina al
40% en H_{2}O y se añadieron 10 mL de metanol para solubilizar el
material de partida. La mezcla de reacción se calentó a 50ºC
durante 5 horas, y a continuación, se concentró al vacío y se
coevaporó con tolueno. El material crudo se purificó mediante
cromatografía súbita ("flash") en 200 mL de gel de sílice,
eluyendo con amoniaco metanólico al 15% en diclorometano. Se
recogieron 3,94 g (96%) de 10 como un aceite amarillo claro. 1H RMN
(300 MHz, CDCl_{3}) d 7.46-7.21 (m, 9H, DMT), 6.81
(d, 4H, DMT), 4.00 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.70-3.49
(solapante m, 18H), 3.20 (dd, J=9.24, 5.49 Hz, 1H), 3.12 (dd,
J=9.21, 6.0 Hz, 1H), 2.84-2.80 (m, 3H); 13C RMN (75
MHz, CDCl_{3}) d 158.30, 144.82, 136.01, 129.95, 128.04, 127.66,
126.61, 112.95, 85.85, 73.46, 72.85, 70.55, 70.45, 69.99, 69.51,
64.43, 55.10, 41.40; MS m/e de baja resolución calculada para
C_{32}H_{44}O_{8}N (M+1+): 570.353, encontrado 570.4.
Según el esquema 3, el compuesto 10 se sintetizó
de la siguiente manera: se recibió el compuesto 9 (5,2 g, 7.2 mmol)
en 50 mL de metilamina al 40% en H_{2}O y se añadieron 10 mL de
metanol para solubilizar el material de partida. La mezcla de
reacción se calentó a 50ºC durante 5 horas, y a continuación, se
concentró al vacío y se coevaporó con tolueno. El material crudo se
purificó mediante cromatografía súbita ("flash") en 200 mL de
gel de sílice, eluyendo con amoniaco metanólico al 15% en
diclorometano. Se recogieron 3,94 g (96%) de 10 como un aceite
amarillo claro. 1H NMR (300 MHz. CDCl_{3}) d
7.46-7.21 (m, 9H, DMT), 6.81 (d, 4H. DMT), 4.00 (m,
1H), 3.80 (s, 6H), 3.70-3.49 (solapante m, 18H),
3.20 (dd, J=9.24, 5.49 Hz, 1H), 3.12 (dd, J=9.21, 6.0 Hz, 1H),
2.84-2.80 (m, 3H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d
158.30, 144.82, 136.01, 129.95, 128.04, 127.66, 126.61, 112.95,
85.85, 73.46, 72.85, 70.55, 70.45, 69.99, 69.51,64.43, 55.10.41.40;
MS m/e de baja resolución calculada para C_{32}H_{44}O_{8}N
(M+1+): 570.353, encontrado 570.4.
Reactivo PEG 12: a una solución agitada de 0,24
g (0,41 mmol) de 10 en 10 mL de DMF se añadieron 2,08 g (0,4 mmol)
de carbonato de
metoxi-PEG5000-nitrofenilo
(Shearwater Polymers, Inc.). La mezcla se agitó 70 h, a
continuación se concentró al vacío. El residuo se disolvió en EtOAc
y la fase orgánica se lavó con tres partes de 30 mL de una solución
de NaOH al 10%. La purificación mediante cromatografía súbita
("flash") utilizando 100 mL de gel de sílice (empaquetado en
húmedo con diclorometano que contenía Et_{3}N al 5%), y eluyendo
con amoniaco metanólico al
5-10-15-20%,
permitió obtener 1,97 g (85%) de 12 como un sólido blanco. 1H RMN
(300 MHz, CDCl_{3}) d 7.42-7.39 (d, 2H, DMT),
7.39-7.18 (m, 7H, DMT), 6.79 (d, 4H, DMT), 5.70 (br
m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.88 (t, J=4.4 Hz, 1 H), 3.81
(s, 6H, DMT), 3.78-3.50 (br m, ~500, PEG Hs),
3.42-3.31 (solapante ms), 3.35 (s, PEG Me), 3.16
(m, 2H), 2.84 (br d, 4.2H); 13C RMN (75 MHz, CDCl_{3}) d 159.36,
157.19, 146.15, 136.95, 130.83, 128.86, 128.65, 127.61,
111.86,86.48, 73.58, 72.88, 72.5-70.0 (carbonos de
PEG), 68.31, 65.77, 64.45, 41.36, 30.75 (impureza no asignada).
Reactivo PEG Fosforamidita 13: A una solución
agitada de 2,22 g (0,4 mmol) de 12 en 60 mL de THF sobre tapices
moleculares de 3 \ring{A}, se añadieron 0,24 mL (1,39 mmol) de
diisopropiletilamina y 0,1 mL (0,44 mmol) de
2-cianoetil
N,N-diisopropilclorofosforamidita. Después de 5 h,
el ^{31}P RMN indicó la formación del producto deseado, así como
la adición de agente fosfitilizante hidrolizado y 0,05 ml
adicionales (0,22 mmol) de 2-cianoetil
N,N-diisopropilclorofosforamidita. Después de 12 h,
se añadieron 0,07 mL (0,4 mmol) de DIPEA y 0,1 mL de la
clorofosforamidita. La mezcla se agitó durante 2 días, se filtró a
través de Celite y se concentró al vacío. El residuo se trituró con
varias partes de éter. ^{31}P RMN d 156.4, 155.8. También se
observaron señales a d 20.6, 19.8 que presumiblemente correspondían
al reactivo de fosfitilación hidrolizado.
Reactivo PEG H-fosfonato 14: a
una solución a 0ºC agitada de imidazol anhidro (0,4 g; 5,9 mmol) en
10 mL de MeCN, reañadieron 0,17 mL (1,9 mmol) de PCl3, seguido de
0,86 mL (6,2 mmol) de Et3N. a esta mezcla, se añadió gota a gota
una solución de 3,0 g (0,55 mmol) de 12 en 12 mL de MeCN. La mezcla
de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó
durante 16 horas, se trató con 10 mL de una solución de bicarbonato
de trietilamonio 0,1 M y se concentró al vacío. Se coevaporaron
trietilamina y a continuación tolueno del residuo crudo, a
continuación, el producto se disolvió en diclorometano. La fase
orgánica se lavó con una solución bicarbonato de trietilamonio
(TEAB) 1,0 M, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La
purificación mediante cromatografía súbita en 300 mL de gel de
sílice (empaquetado en húmedo con hexano/Et_{3}N (95:5)) eluyendo
con amoniaco metanólico al
2-4-6-8-10-12-
15% en diclorometano permitió obtener 1,95 g de producto como un sólido blanco. ^{31}P RMN (CDCl_{3}) d 10.3, 10.2.
15% en diclorometano permitió obtener 1,95 g de producto como un sólido blanco. ^{31}P RMN (CDCl_{3}) d 10.3, 10.2.
Síntesis de lípido fosforamiditas 17: Se trató
una solución de 540 mg (1 mmol) de
1,2-di-O-palmitil
rac-glicerol en 10 mL de piridina con 195 mg (1,2
mmol) de carbonildiimidazol y la mezcla resultante se agitó a
temperatura ambiente durante la noche. A esta mezcla se añadieron
570 mg (1 mmol) del aminoalcohol como una solución de 3 mL de DMF.
La mezcla se calentó hasta 40ºC durante la noche, después de lo
cual, un análisis por 1H RMN de una alícuota de la mezcla de
reacción indicó una formación muy despreciable del producto. La
mezcla se calentó hasta 80ºC durante 6 h (aproximadamente 1:1 de
producto con respecto al material de partida mediante 1H RMN), a
continuación se concentró al vacío. El residuo crudo se aplicó a una
columna de 125 mL de gel de SiO_{2} (empaquetado en hexanos) y el
producto se eluyó con un gradiente de EtOAc al
20-50% en hexanos (con TEA al 2%) para obtener 500
mg (44%) del intermedio 16 como una cera clara (16: 1H RMN (300 MHz,
CDCl_{3}) d 7.42 (d, J=7.2 Hz, 2H), 7.30-7.18 (m,
7H), 6.76 (d, J=8.2 Hz, 4H), 5.34 (br t, 1H),
4.20-3.25 (señales solapantes), 3.16 (m, 2H), 1.53
(m), 1.24 (m), 0.86 (t, J=6.5 Hz, 6H). Se disolvió el alcohol 16
(500 mg; 0,44 mmol) en 4 mL de CH_{2}Cl_{2} y 0,15 mL (2 equiv)
de DIPEA. A esta solución se añadieron 0,15 mL (0,66 mmol) de
2-cianoetil (N,N-diisopropilamino)
clorofosforamidita. Después de 3 h, la TLC mostró una conversión en
2 manchas y la mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con
una solución de NaHCO_{3}. La fase orgánica se secó sobre
Na_{2}SO_{4} y se concentró. El residuo crudo se aplicó a una
columna de 50 mL de gel de SiO_{2} (empaquetado en hexanos) y el
producto se eluyó con EtOAc al 20% en hexanos (que contenía TEA al
2%) para obtener 350 mg (59%) de fosforamidita 17 como una cela
incolora. ^{31}P RMN (CDCl_{3}) d 151.55,
151.08.
151.08.
Síntesis automatizada de
lípido-oligonucleótidos: La fosoframidita 17 se
acopló al extremo 5' de un T-3 unidades (preparado
mediante síntesis de ADN automatizado estándar en un instrumento ABI
394) utilizando un ciclo de acoplamiento modificado que consistía
en dos exposiciones de 30 minutos de una solución 0,1 M de 17 en
THF al 40% en MeCN a la columna. El análisis de tritilo en línea
indicó una eficacia de acoplamiento del 94% para amidita
17.
17.
Cloroformiato 19: A una solución agitada de 3 g
(5,03 mmol) de
1,2-di-O-octadecil-sn-glicerol
21 en 60 mL de tolueno se añadieron 20 mL de una solución de
fosgeno 1,93 M. Se añadió una solución de fosgeno adicional (2x10
mL; 15,4 equiv. De fosgeno total) hasta que no quedó más alcohol
como material de partida (mediante análisis 1H RMN de alícuotas
concentradas). El fosgeno y HCl en exceso se extrajo mediante un
aspirador y la mezcla de reacción se concentró al vacío para
obtener 3,3 g (98%) del cloroformiato 19 deseado como un polvo
blanco. 1H RMN (300 MHz, CDCl_{3}) d 4.45 (dd, J=11.22, 3.69 Hz,
1H), 4.34 (dd, J=11.22, 6.15 Hz, 1H), 3.65 (m, 1H),
3.56-3.40 (m, 6H), 1.53 (m, 4H), 1.24 (m, 62H), 0.87
(t, J=6.36 Hz, 6H); 13C NMR (75 MHz, CDCl_{3}) d 75.90, 71.91,
71.35, 70.93, 69.36, 31.99, 29.96-29.44 (señales
solapantes de cadenas de hidrocarburos), 26.13, 26.04, 22.76,
14.18.
Conjugado 20: A una solución agitada de 2,25 g
(3,95 mmol) de 10 en 60 mL de piridina se añadieron 2,6 g del
glicerol cloroformiato de diestearilo 18. El análisis de 1H RMN de
una alícuota concentrado después de 2 horas reveló que no quedaba
cloroformiato y la mezcla se concentró al vacío. El residuo crudo se
combinó con material preparado de forma similar a partir de 0,5 g
(0,88 mmol) de 10 y 0,58 g del cloroformiato y los lotes combinados
se purificaron mediante cromatografía súbita con gel de sílice en
una columna de 100 mL de gel de sílice (empaquetada en hexanos que
contenían trietilamina al 2%), eluyendo con 200 mL de hexanos, a
continuación 250 mL de cada uno de EtOAc al 10-20 y
30% en hexanos, 500 mL de EtOAc al 40% en hexanos, a continuación
250 mL de cada uno de EtOAc al
50-60-70 y 80% en hexanos, y
finalmente con 250 mL de EtOAc. El producto que contenía fracciones
se concentró para obtener 3,3 g (57%) del conjugado 20.
Fosforamidita 21: a una solución agitada de 3,8
g (3,26 mmol) del conjugado en 25 mL de CH_{2}Cl_{2} se
añadieron 1,14 mL (6,52 mmol) de diisopropiletilamina, a
continuación 1,09 mL (4,88 mmol) de 2-cianoetil
N,N-diisopropilclorofosforamidita. Después de 2
horas, la mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con una
solución saturada de NaHCO_{3}, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, y
se concentró. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía
súbita con gel de sílice en una columna de 125 mL de gel de sílice
(empaquetada en hexanos que contenían trietilamina al 2%), eluyendo
con 100 mL de hexanos, a continuación 250 mL de cada uno de EtOAc
al 10 y 20% en hexanos, 500 mL de EtOAc al 30% en hexanos, a
continuación 250 mL de EtOAc al 50% en hexanos. El producto que
contenía fracciones se concentró para obtener 4,2 g (95%) de la
fosforamidita 21. ^{31}P RMN (CDCl_{3}) d 151.52, 151.08.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se analizó la capacidad de un conjugado ligando
bFGf/PEG-3400 para unirse a bFGF. Se escogió la
molécula 225t3 (SEC ID No. 10), un ligando de ADN de afinidad
elevada por bFGf, para la conjugación con PEG a través de una
reacción de acoplamiento NHS-amina primaria. El
ligando 225t3 presenta una afinidad de unión de 1 nM y se pliega en
una horquilla de extremo romo con una T_{f} de 68ºC. El ligando
225t3 se modificó con un modificador 3'-amino C7
CPG (Glen Research, Sterling, VA) utilizando métodos de síntesis de
ADN estándar y se le hará referencia como 225t3N (SEC ID NO: 11).
225t3N reacción con el éster activo de
N-hidroxisuccinimidilo (NHS) de PEG (PM promedio
3400) en 20% (v/v) de dimetoxi formamida al 80% (v/v), bicarbonato
sódico 0,5 M tamponado a pH 8,5. El conjugado resultante,
225t3N-PEG-3400 (SEC ID NO: 14), se
purificó a partir del AND libre en un gel de poliacrilamida al
12%/urea 7M. El conjugado se marcó en el extremo 5' con ^{32}P y
se realizó un ensayo de unión. El
225t3N-PEG-3400 (SES ID No. 14) se
une a bFGF con la misma afinidad (K_{d}=1 nM) que 225t3.
El ligando de ADN de trombina NX256 (SEC ID No.
9) (figura 1d) que contiene una funcionalidad amino y una disulfuro
se preparó utilizando los métodos y procedimientos de síntesis de
ADN estándar en un sintetizador de ADN/ARN Biosearch 8909 con un
soporte de vidrio de poro controlado de 500 Á con
dT-5'-LCAA y reactivos de
fosforamidita disponibles comercialmente. Después de la
desprotección se realizó una purificación por HPLC de intercambio
iónico. El enlace disulfuro 5' terminal se redujo incubando el ADN
en una solución de ditiotreitol (DTT) 50 mM a 37ºC durante 30
minutos. El ADN reducido (que contenía un tiol 5' terminal) se
separó en una columna de exclusión de tamaño Nap-5
y se recogió el volumen vacío, que contenía el ADN pero no el DTT,
en un recipiente de reacción que contenía PEG derivatizado con
maleimida bajo una capa de argón. Todas las soluciones se purgaron
con argón para eliminar el oxígeno. La mezcla de reacción se mantuvo
a 40ºC durante 1 hora. La progresión de la reacción se monitorizó
mediante la extracción de alícuotas pequeñas y su análisis mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida al 8%/urea 7 M. Después
del final del periodo de incubación de 1 hora, la reacción se había
esencialmente completado, y en este momento se añadió un volumen
igual de cloruro de metileno a la mezcla de reacción y se agitó el
recipiente hasta formar una suspensión blanca lechosa. La mezcla de
centrifugó a 14.000 rpm en una centrífuga eppendorf hasta que se
separaban las fases. La fase acuosa contenía los tres ligandos de
ácido nucleico y se descartó. El producto (ligando de AND NX256
modificado con PEG-20,000, referido como
NX256-PEG-20,000; SEC ID NO: 13)
(Figura 1G) se purificó adicionalmente utilizando cromatografía de
intercambio iónico seguido de desalación de fase inversa y
lipofilización hasta obtener un polvo blanco. Esta material se
utilizó para determinar el efecto de la modificación con PEG en el
comportamiento farmacocinético del ligando de ácido nucleico ADN
(vide Infra). El ligando NX256 modificado con
PEG-10,000, referido como
NX-256-PEG-10,000,
se preparó de una manera análoga.
La funcionalidad de PEG también se puede
introducir a través de la reacción
tiofosfato-maleimida. Se introdujo el grupo
tiofosfato en el ligando de ADN de trombina en el extremo 5'
mediante el método de fosforamidita estándar utilizando reactivos
disponibles comercialmente (a este ligando se hace referencia como
T-P4) (figura 1F, SEC ID NO: 12). La conjugación a
la maleimida que contiene PEG es análoga a la reacción
sulfhidrilo-maleimida descrita anteriormente. A los
ligandos conjugados a PEG se hace referencia como
T-P4-PEG-10,000 y
T-P4-PEG-20,000
(SEC ID NO: 15). Las temperaturas de fusión (T_{f}) para
T-P4-PEG-10,000,
T-P4-PEG-20,000 y
ligandos de AND-T-P4 se
determinaron a partir de las representaciones de la primera derivada
de la absorbancia óptica a 260 nm frente a la temperatura. Los
valores de T_{f} para
T-P6-PEG-10,000,
T-P6-PEG-20,000 y
T-P6 fueron de 40ºC para los tres ligandos. Estos
datos y los datos de unión de ligando de ácido nucleico
bFGF-PEG3400 descritos anteriormente, sugieren que
la conjugación a PEG no afecta a la estructura del ligando de ácido
nucleico.
Se puede introducir colesterol en un ligando de
ácido nucleico, en cualquier posición en la secuencia, mediante el
método de fosforamidita en fase sólida estándar. Por ejemplo, se
incorporó una fosforamidita de tetraetilenglicol colesterol (Glen
Research, Sterling, VA) en el extremo 3' del ligando 225t3 (Figura
1E; SEC ID NO: 10) para producir el ligando
225t3-Colesterol. Tras la purificación en un gel de
poliacrilamida al 12%/urea 7 M, 225t3-Col se marcó
en el extremo 5' con ^{32}P y se realizó un ensayo de unión. La
afinidad de unión de 225t3-Col fue idéntica (Kd=1
nM) a la de 225t3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las propiedades farmacocinéticas de ligandos de
ADN de trombina NX229, NX232, NX253, NX253 + Liposoma, y
NX256-PEG20K se determinaron (véase las Figuras
1A-1C, 1G para descripciones moleculares) (SEC ID
NOS: 6-8, 13). Cada oligonucleótido se diluyó en
PBS hasta una concentración de la solución de
0,5-1,0 mg/ml basada en la absorción de UV a 260 nm
y un coeficiente de extinción de 0,033 \mug de oligo/ml. En todos,
excepto un estudio, 6 ratas recibieron 0,5-1,0 mg
de oligonucleótido/kg de peso animal y se tomaron muestras de plasma
a varios tiempos de 1 minuto a 4 horas. Se utilizó una rata en el
estudio en el que se analizó NX253. Las muestras de plasma y las
muestras del control de calidad se analizaron utilizando un ensayo
de hibridación. El ensayo de hibridación utilizó un oligonucleótido
de captura que contiene una secuencia complementaria al extremo 5'
de los ligandos de ADN conjugada a una esfera de óxido de hierro
(FeO)
(FeO-espaciador-5'-d
(GTC AGG CAC CAT CCC-3') (SEC ID NO: 1) donde el
espaciador = (dT)8), y un oligonucleótido de detección que
contenía un grupo biotina en el extremo 3' (5'd-CCC
CAC TGA AGC
ACC-espaciador-3'-biotina-biotin,
donde el espaciador = (d1)10) (SEC ID NO: 2). La cantidad
del oligonucleótido de biotina unido a la esfera se cuantificó con
la fosfatasa alcalina unida a estreptavidina, utilizando
SPD-Sapphire como sustrato luminiscente.
Los datos para la concentración en plasma de
NX229, NX232, NX253, NX253 + Liposoma y NX256-PEG20K
(SEC ID NOS: 6-8,13) en función del tiempo tras la
inyección en bolo se resumen en la figura 2. Las concentraciones en
plasma de NX232, NX253, NX253 + Liposoma, y
NX256-PEG20K en función del tiempo son
considerablemente mayores en comparación con la de NX299 (SEC ID
NO: 6). Todos estos oligonucleótidos comparten el mismo módulo de
unión a trombina (d (CAG TCC GTG GTA GGG CAG GTT GGG GTG ACT TCG
TGG)) (SEC ID NO: 3). La concentración en plasma de un
oligonucleótido en función del tiempo puede incrementarse
significativamente mediante la introducción de grupos funcionales
apropiados en el oligonucleótido. Se ha observado previamente una
vida media en plasma prolongada de un oligonucleótido que contiene
colesterol en comparación con el oligonucleótido de control (no
contiene colesterol) (de Smidt et al., Nucl. Acids Res., 19:
4695 (1991)).
Se han evaluado las propiedades farmacocinéticas
en plasma de un amplio número de ligandos de ácido nucleico que
presentan varios grupos funcionales unidos a la secuencia base de
NX213 (véase la figura 1 para la descripción molecular), así como
algunas formulaciones liposomales de estos oligonucleótidos. Estos
datos se resumen en la figura 3 (SEC ID NOS: 16, 19, 21, 22 y 29).
La formulación con la velocidad de depuración más lenta fue cuando
NX213 (Figure 1P; SEC ID NO: 21) se encapsulaba en liposomas.
Para determinar el papel de los conjugados de
dialquil glicerol y ADN más y menos liposomas PK se llevaron a cabo
los estudios 77 y 73 con el conjugado de dialquil glicerol y ligando
de ADN de trombina (Véase la Figura 1 para la descripción
molecular). Estos datos se resumen en la figura 4 (SEC ID No.
18).
Los oligonucleótidos NX213 de VEGF
colesterilados (NX268) (Véase la figura 1K para la descripción
molecular; SEC ID No 16) se formularon con liposomas con PEG o
liposomas estándar y se evaluó la farmacocinética (PK
85-86). Estas formulaciones contienen
oligonucleótidos tanto en la parte interna como externa del
liposoma. La figura 5 (SEC ID No. 16) muestra los niveles en plasma
de rata de oligonucleótidos de longitud completa en función del
tiempo después de la inyección. Ambas formulaciones con liposomas
muestran una farmacocinética de oligonucleótidos similar.
Para evaluar la dependencia con el tamaño en la
depuración, se han estudiado conjugados de oligonucleótidos de VEGF
con 2'-O-metilo con varios PEG
(véase la Figura 1 para la descripción molecular) (PK 50, 80, 87, y
88). La figura 6 muestra a comparación de todos los oligonucleótidos
con 2'-O-metilo más PEG 40K, 20K,
10K, así como en ausencia de PEG (SEC ID NOS: 17 y 29). Estos datos
demuestran una depuración del plasma significativamente más lento
con un mayor tamaño del conjugado PEG.
Se llevó a cabo PK 96 para evaluar la
farmacocinética de 2'F pirimidinas conjuntamente con 2'
O-metil purinas y PEG20K (JW1130) (véase la figura
1R para la descripción molecular; SEC ID NO: 23). La figura 7
muestra los niveles en plasma de este oligonucleótido en
comparación con todos los del tipo 2' O-metilo (PK
80, JW986) (véase la figura 1x para la descripción molecular; SEC
ID No. 29). Estos datos muestran propiedades de depuración bastante
similares para ambos oligonucleótidos.
La observación de que JW1130 (SEC ID NO: 23),
que contiene 2' F pirimidinas, muestra una depuración similar a
JW986 (2' O-metil pirimidinas) sugiere que los
oligonucleótidos con 2'F pirimidinas sin resistentes a la digestión
por nucleasas.
Se llevó a cabo PK 97 para determinar las
propiedades de depuración de un ligando de ADN de
L-selectina (NX287) (Figura 1S; SEC ID NO: 24)
conjugado con 40K PEG. La figura 8 muestra los niveles en plasma de
este oligonucleótido en función del tiempo después de la inyección
con bolo (dosis 1 mg/kg). Para la comparación, se incluyó el
ligando de ADN de trombina (NX256) (Figura 1H; SEC ID NO: 13)
conjugado con 20K PEG. Tal como se muestra en la figura 8, estos
dos oligonucleótidos muestran velocidades de depuración similares
presumiblemente debido al metabolismo.
Los estudios PK 99, 100 y 102 se han llevado a
cabo como parte de un estudio más amplio para evaluar la
estabilidad de los oligonucleótidos in vivo. Estos estudios
es muestran en la figura 9. Para la comparación, también se incluye
PK 96 (JW1130 VEGF) 2'F Py 2'O-Met (14 Pu) + PEG
20K) (Figura 1R; SEC ID NO: 23). Los oligonucleótidos utilizados en
los estudios PK 96, 100 y 102 difieren sólo en el número de
posiciones de purina que contienen 2' desoxi nucleótidos, donde PK
96 no contiene 2' desoxi purinas, PK 100 contienen cuatro 2' desoxi
purinas y en PK 102 las 14 purinas son 2' desoxi. La figura 9 (SEC
ID NOS: 23, 25, 26, 27 y 30) demuestran una calara relación entre
la creciente velocidad de depuración y el número de desoxi
nucleótidos presentes en el oligonucleótido. Este incremento
observado en la velocidad de depuración con un creciente número de
desoxi nucleótidos se presume que es debido a un mayor metabolismo
de estos oligonucleótidos. Una observación esperanzadora en el nivel
de estabilidad elevado observado para PK 100 que contiene cuatro 2'
desoxi purinas y sugiere que la modificación
post-SELEX puede ser apropiada si se pueden
modificar un amplio número de purinas. También se muestra en la
figura 9 PK 99 frente a PK 100, que difieren de la conjugación
PEG20K. Tal como se ha observado previamente con otros
oligonucleótidos, la conjugación a moléculas PEG de peso molecular
significativo reduce bruscamente la velocidad de depuración del
plasma observada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
En el esquema 1 proporcionado a continuación, un
PEG-2000 (PEG con peso molecular de 2000 Da)
heterobifuncional que contiene las funcionalidades de éster de
N-hidroxisuccinimida y vinil sulfona se conjugó en
primer lugar a una liposoma que contenía un 2% molar de
diestearilfosfatidiletanolamina (DSPE) a través del grupo de éster
de N-hidroxisuccinimida. El producto se purificó a
partir del PEG libre mediante cromatografía de exclusión de tamaño.
A continuación, el producto de vinil sulfona se dejó reaccionar con
NX 256 reducido (Figura 1D; SEC ID NO: 9). Existe una
DSPE-PEG-2000-vinil
sulfona comercialmente disponible y se puede utilizar para fabricar
liposomas que contienen la funcionalidad de vinil sulfona,
eliminando de este modo una etapa de conjugación del Esquema 1.
Se ha completado la segunda reacción mostrada a
continuación como el esquema 2. El material de partida fueron
liposomas con diestearilfosfatidilcolina (DSPC) que contenía un 25
molar de DSPE maleimida. Utilizando un valor de 50.000 lípidos por
liposoma, el liposoma debería tener aproximadamente 1000 moléculas
de maleimida por liposoma, aproximadamente 600 de los cuales están
disponibles en el exterior. El complejo ligando de ácido
nucleico-liposoma se separó del ligando de ácido
nucleico libre a través de la cromatografía de exclusión de tamaño
(vide supra). A partir de la absorbancia a 260 nm, se estimó
que aproximadamente 200 moléculas del ligando de ácido nucleico se
conjugaron a cada liposoma
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
- \bullet US 07536428 B [0002]
- \bullet US 08264029 B [0007] [0049]
- \bullet US 07714131 B [0002]
- \bullet US 08284063 B [0008] [0050]
- \bullet US 5475096 A [0002] [0045]
- \bullet US 08234997 B [0008] [0050]
- \bullet US 07931473 B [0002] [0045]
- \bullet US 536428 A [0045]
- \bullet US 5270163 A [0002] [0045]
- \bullet US 71413191 A [0045]
- \bullet US 9104078 W [0002] [0045]
- \bullet US 07964624 B [0048]
- \bullet US 07960093 B [0006] [0048]
- \bullet US 08400440 B [0048]
- \bullet US 08123935 B [0006] [0048]
- \bullet US 96462492 A [0053]
- \bullet US 08134028 B [0006] [0007] [0048] [0049]
- \bullet US 08945604 B [0097] [0098]
- \bullet US 08143564 B [0006] [0048]
- \bullet US 08434465 B [0097] [0098]
- \bullet US 08117991 B [0007] [0049]
- \bullet US 08464443 B [0097] [0098]
\bulletCheronis, J. C. et al.
J. Med. Chem., 1992, vol. 35,
1563-1572 [0058]
\bullet de Smidt et al. Nucl.
Acids Res., 1991, vol. 19, 4695 [0086]
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: LARRY GOLD, PAUL G. SCHMIDT, NEBOJSA JANJIC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPLEJOS DE LIGANDOS DE ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 30
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Swanson and Bratschun, L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 8400 East Prentice Avenue, Suite #200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Denver
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Colorado
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 80111
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Diskette, 3.50 pulgadas, 1.44 Mb de capacidad
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect 8.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE SOLICITUD PRESENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/945,604
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-OCTUBRE-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/434,465
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-MAYO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/464,443
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-JUNIO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BARRY J. SWANSON
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33,215
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: NEX29C/US
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE COMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (303) 793-3333
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (303) 793-3433
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTGT CAGGCACCAT CCC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCACTGAA GCACCTTTTT TTTTT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos 49-53 estás unidos por un enlace fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 39 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAATT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos 37 y 38 están unidos por un enlace fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 39 es una fosforamidita de orientación invertida {}\hskip3.6cm (unión 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAATT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 37 es una fosforamidita de orientación invertida {}\hskip3.6cm (unión 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGTT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 39 es una fosforamidita de orientación invertida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGTCCGTG GTAGGGCAGG TTGGGGTGAC TTCGTGGATT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 37 es una fosforamidita de orientación invertida {}\hskip3.6cm (unión 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGTT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido número 37 es una fosforamidita de orientación invertida {}\hskip3.6cm (unión 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGTCCGTG GTAGGGCAGG TTGGGGTGAC TTCGTGTT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5-28 están modificados en 2'-OMetil {}\hskip3.6cm (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22 y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Todos los nucleótidos están modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22 y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2})
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-5, 10-11, 13-14, 16-18, 20, 23-26, y {}\hskip3.6cm 28 están modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCCATTCAC CATGGCCCCT TCCTACGTAT GTTCTGCGGG TGGCTTAC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 están modificados en 2'-OMetil (2'- {}\hskip3.6cm OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 están modificados en 2'-OMetil (2'- {}\hskip3.6cm OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 8-9, 11, 14, 16, 18, 23, 26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'OMO).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-7, 10, 12, 17, 21-22, 24-25, y 27 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGUCGGU ACGGAGUGGA CCGUCACGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUULTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: LARRY GOLD, PAUL G. SCHMIDT, NEBOJSA JANJIC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPLEJOS DE LIGANDOS DE ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 30
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Swanson and Bratschun, L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 8400 East Prentice Avenue, Suite #200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Denver
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Colorado
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 80111
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Diskette, 3.50 pulgadas, 1.44 Mb de capacidad
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect 8.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/945,604
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-OCTUBRE-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/434,465
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-MAYO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/464,443
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-JUNIO-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BARRY J. SWANSON
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33,215
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: NEX29C/US
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE COMUNCIACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (303) 793-3333
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (303) 793-3433
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTGT CAGGCACCAT CCC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCACTGAA GCACCTTTTT TTTTT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos 49-53 están unidos por una unión fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 39 es una fosoforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAATT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos 37 y 38 están unidos por un enlace fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 39 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAATT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 37 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGTT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucléotido número 39 es una fosforamidita de orientación invertida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGTCCGTG GTAGGGCAGG TTGGGGTGAC TTCGTGGATT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 37 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGTT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGGCTAC GTACCGGGGC TTTGTAAAAC CCCGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 37 es una fosforamidita de orientación invertida (unión {}\hskip3.6cm 3'3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGTCCGTG GTAGGGCAGG TTGGGGTGAC TTCGTGTT
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2-OMetil (2'-OMe)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5-28 están modificados en 2'-OMetil {}\hskip3.6cm (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22 y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: todos los nucleótidos están modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22 y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2})
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotioato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 13, 16, 17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21, 22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-5, 10-11, 13-14, 16-18, 20, 23-26, y {}\hskip3.6cm 28 están modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCCATTCAC CATGGCCCCT TCCTACGTAT GTTCTGCGGG TGGCTTAC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 están modificados en 2'-OMetil {}\hskip3.6cm (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 están modificados en 2'-OMetil {}\hskip3.6cm (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGACG CCGGGGUGT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4 y 29-33 están unidos por un enlace {}\hskip3.6cm fosforotiato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 5, 8-9, 11, 14, 16, 18, 23, 26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-7, 10, 12, 17, 21-22, 24-25, y 27 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-amino (2'-NH_{2}).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTGUCGGU ACGGAGUGGA CCGUCACGTT TTT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC G CCGGGGUG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 1-4, 13, 16-17, 20, 23-26, y 28 están {}\hskip3.6cm modificados en 2'-OMetil (2'-OMe).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: Nucleótidos en las posiciones 6-9, 12, 15, 19, 21-22, y 27 están modi- {}\hskip3.6cm ficados en 2'-Fluoro (2'-F).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUACCCUG AUGGUAGAC GCCGGGGUG
\hfill28
Claims (9)
1. Método para la preparación de un complejo
terapéutico o de diagnóstico que comprende un ligando de ácido
nucleico de cadena sencilla y un polietilenglicol unido
covalentemente en los extremos 5' ó 3' del ligando de ácido
nucleico, en el que el ligando de ácido nucleico tiene una afinidad
y especificidad elevada por una molécula diana diferente de un
polinucleótido que se une al ligando de ácido nucleico a través de
un mecanismo que depende del emparejamiento de bases de
Watson/Crick o la unión en triple hélice y en el que el
polietilenglicol tiene un peso molecular de 1000 Da o más,
comprendiendo dicho método la unión covalente de un ligando de ácido
nucleico de cadena sencilla a polietilenglicol que tiene un peso
molecular de 1000 Da o más en los extremos 5' ó 3' del ligando de
ácido nucleico, en el que el método comprende identificar el ligando
de ácido nucleico a partir de una mezcla candidata de ácidos
nucleicos mediante un método que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una mezcla candidata de
ácidos nucleicos de cadena sencilla con la molécula diana en
condiciones favorables para la unión;
(b) separar los ácidos nucleicos no unidos de
los ácidos nucleicos que se han unido a moléculas diana;
(c) disociar las parejas ácido
nucleico-diana;
(d) amplificar los ácidos nucleicos disociados
de las parejas ácido nucleico-diana para obtener una
mezcla enriquecida en ligando de ácidos nucleicos;
en el que las etapas (a)-(d) se repiten mediante
tantos ciclos como se deseen para obtener un ligando de ácido
nucleico para la molécula diana.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el método comprende unir covalentemente el polietilenglicol con el
grupo hidroxilo en 5' ó 3' del ligando de ácido nucleico.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el método comprende unir covalentemente el polietilenglicol con
5' tiol a través de una funcionalidad maleimida o vinil sulfona.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el método comprende unir
covalentemente una molécula enlazadora a los extremos 5' ó 3' del
ligando de ácido nucleico y unir covalentemente la molécula
enlazadora al polietilenglicol.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el ligando de ácido nucleico tiene
una unión fosfodiéster invertida 3'3' en el extremo 3'.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando de ácido nucleico es
ADN.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando de ácido nucleico es
ARN.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido nucleico está
químicamente modificado.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
la modificación se elige del grupo:
- -
- modificaciones de azúcar en la posición 2';
- -
- modificaciones de pirimidina en la posición 5;
- -
- modificaciones de purina en la posición 8;
- -
- modificaciones en aminas exocíclicas;
- -
- sustitución de 4-tiouridina;
- -
- sustitución de 5-bromo-uracilo;
- -
- sustitución de 5-yodo-uracilo;
- -
- modificaciones en el esqueleto;
- -
- uniones fosforotioato;
- -
- fosfato de alquilo;
- -
- metilaciones;
- -
- terminación de cadena con fosforotioato 5';
- -
- terminación de cadena con fosforotioato 3'.
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