DE69932249T2 - Chemische anknüpfung unter einbeziehung von einer lipid-matrix und herstellung von membranpolypeptiden - Google Patents

Chemische anknüpfung unter einbeziehung von einer lipid-matrix und herstellung von membranpolypeptiden Download PDF

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Description

  • Gebiet der Technik
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Membran-Polypeptide, Verfahren der Herstellung und Assays, in denen sie genutzt werden.
  • Hintergrund
  • Zellmembranen bestehen aus Lipiden, die in der Lage sind, eine Barriere zwischen wässrigen Kompartimenten zu bilden. Sie bestehen primär aus einer kontinuierlichen Doppelschicht von Lipidmolekülen, die mit verschiedenen Membran-Proteinen assoziiert sind. Die Phospholipide, Sphingolipide und Glykolipide stellen die drei Hauptklassen von membranbildenden Lipidmolekülen dar. Diese Lipide sind amphipatische (amphiphile) Moleküle, da sie einen hydrophilen (polaren) Kopf und einen hydrophoben (unpolaren) Schwanz besitzen. In der wässrigen Umgebung von Zellen weisen die polaren Kopfgruppen zum Wasser hin, während ihre hydrophilen Schwanzgruppen miteinander wechselwirken, um eine lamellare Doppelschicht sowie je nach der Lipidzusammensetzung und den Bedingungen in einem geringeren Ausmass weitere aggregierte Strukturen zu bilden. Zum Beispiel können Membran-Lipide je nach dem Lipid- und Wassergehalt und der Temperatur eine Vielfalt unterschiedlicher Gestalten bilden, darunter Kugeln (Vesikel), Stäbe (Rohre) und Lamellen (Platten). Diese Gestalten sind die Grundeinheiten, die wechselwirken, um zwei- und dreidimensionale Matrixgitterstrukturen zu bilden, die als lamellare Phase (z.B. Doppelschicht, geschlossene Kugel), hexagonale Phase (z.B. Stab) oder kubische Phase (z.B. durch wässrige Kanäle verbundene Kugeln, Stäbe oder Lamellen) untergliedert werden (Lindblom und Mitautoren, Biochim. Biophys. Acta (1989) 988: 221-256). Im Querschnitt kann eine typische Zellmembran-Doppelschicht (lamellare Phase) aus Phospholipid als aus einem hydrophoben Kernbereich von etwa 30 Angstrøm (Å) und zwei Grenzflächenbereichen von je etwa 15 Å bestehend betrachtet werden (White und Mitautoren, Curr. Struc. Biol. (1994) 4: 79-86).
  • Proteine können mit Zellmembranen auf unterschiedliche Weise assoziiert sein. Integrale Membranproteine enthalten mindestens eine Komponente, die in die Lipid-Doppelschicht eingebettet ist. Die unpolaren Segmente dieser integralen Membranproteine, die senkrecht zur Membranoberfläche in die Lipid-Doppelschicht eingebettet sind, können aus einem hydrophoben Bereich des Polypeptids, einer kovalent verknüpften Fettsäurekette oder anderen Arten von Lipidketten bestehen. Periphere Membranproteine sind mit der Lipid-Doppelschicht normalerweise durch nichtkovalente Wechselwirkungen mit diesen integralen Membranproteinen assoziiert. Zusätzlich befinden sich einige periphere Membranproteine gänzlich in der wässrigen Phase und sind durch eine kovalent verknüpfte Fettsäure- oder Lipidkette mit der Membran assoziiert. Die ko-translationale Verknüpfung einer Fettsäurekette wie zum Beispiel Myristinsäure über eine Amidbindung mit dem amino-terminalen Glycin eines Proteins führt zu einer Lokalisierung des Proteins auf der cytoplasmatischen Seite von Zellmembranen. Prenylgruppen und Palmitinsäuregruppen werden post-translational über Thioetherbindungen mit Cysteinresten verknüpft, was ebenfalls zu einer Lokalisierung der Proteine an der Membran führt. Diese Arten kovalenter Verknüpfung sind für Funktionen in einer grossen Vielfalt von Signalproteinen der Zellen wie der heterotrimetrischen G-Proteine von Bedeutung (James und Mitautoren, Biochemistry (1990) 29(11): 2623-2634; Morello und Mitautoren, Biochem. Cell Biol. (1996) 74(4): 449-457; Mumby, S. M., Curr. Opin. Cell. Biol. (1997) 9(2): 148-154; Resh, M. D., Cell Signal (1996) 8(6): 403-412; und Boutin, J. A., Cell Signal (1997) 9(1): 15-35). Am C-Terminus löslicher Proteine befindliche Glykosylphosphatidylinosit-Anker führen zu einer Anknüpfung dieser Proteine an der Zelloberflächenmembran (Turner, A. J., Essays Biochem. (1994) 28: 113-127).
  • Die beiden Hauptklassen bekannter integraler Membranproteine sind diejenigen, die α-Helices in die Lipid-Doppelschicht einfügen, sowie die Proteine, die durch β-Barrelstränge Poren in der Lipid-Doppelschicht bilden (Montal und Mitautoren, Curr. Opin. Struc. Biol. (1996) 6: 499-510; Grigorieff und Mitautoren, J. Mol. Biol. (1996) 259: 393-342; und Weiss und Mitautoren, J. Mol. Biol. (1992) 227: 493-509). Single-pass-Membranproteine bzw. Proteine, die eine Membran einmal durchspannen, haben allgemein einen hydrophoben Bereich, der diese Sequenz über eine α-Helix-Konfiguration in der Lipid-Doppelschicht verankert. Multipass-Membranproteine bzw. Proteine, die eine Membran mehrfach durchspannen, ergeben sich daraus, dass die Polypeptidkette durch die Lipid-Doppelschicht hin- und herläuft, und verwenden typischerweise Membrananker, die die Struktur einer α-Helix oder eines β-Banels besitzen.
  • Beispiele von Membranproteinen sind u.a. mit der Membran assoziierte Rezeptoren, Transporterproteine, Enzyme und Immunogene. Mit der Zellmembran assoziierte Rezeptoren zum Beispiel stellen eine dynamische Auswahl von Membranproteinen besonderer therapeutischer Bedeutung dar. Vier Superfamilien werden hauptsächlich unterschieden: die enzym-verknüpften Rezeptoren, die fibrinonectinartigen Rezeptoren, die Sieben-Transmembran-Rezeptoren und die Ionenkanalrezeptoren. Die enzym-verknüpften Rezeptoren sind Single-pass-Membran-Proteine, deren Grundstruktur aus einem einzelnen Polypeptid besteht, das die Plasmalamelle über eine α-Helix-Ankerdomäne einmal quert. Die extrazelluläre Domäne von enzym-verknüpften Rezeptoren bindet Hormon/Ligand, während die carboxyl-terminale Domäne einen katalytischen Platz enthält, der die Signalübertragung über Hormon/Liganden-Bindung und Rezeptoraggregation fördert.
  • Die fibrinonectinartigen Rezeptoren haben die gleiche allgemeine Struktur wie die enzym-verknüpften Rezeptoren, ausser dass kein spezifischer katalytischer Platz in der cytoplasmatischen Domäne vertreten ist. Fibrinonectinartige Rezeptoren der Klasse 1 enthalten zwei modifizierte extrazelluläre Domänen, die aus zwei siebensträngigen β-Faltblättern gebildet werden, die im rechten Winkel zusammentreffen, um eine Liganden bindende Tasche zu bilden. Die fibrinonectinartigen Rezeptoren der Klasse 2 haben eine geringfügig andere Struktur, indem sie wiederholte fünfsträngige β-Faltblätter bilden, die sich wie Finger über das Hormon erstrecken. Die Rezeptoren der Klassen 1 und 2 enthalten eine konservierte prolinreiche cytosolische Juxtramembran-Region, die lösliche Tyrosinkinasen konstitutiv bindet und durch Liganden/Hormon-Bindung und Rezeptoraggregation aktiviert wird.
  • Die Sieben-Transmembran-Rezeptoren, die auch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, Serpentine-Rezeptoren oder heptahelikale Rezeptoren genannt werden, stellen die grösste und vielfältigste Familie von Membranrezeptoren dar, die bislang identifiziert wurde. Diese Rezeptoren vermitteln sensorische und endokrine Signalübertragungspfade und sind Multipass-Membranproteine mit α-Helix-Ankerregionen, die die Membran siebenmal queren. Bei einigen dieser Proteine bilden die die Membran durchspannenden Bereiche eine kleine Liganden/Hormon-Bindungstasche, während grössere Bindungsplätze durch ausgedehnte amino-terminale Bereiche gebildet werden. Die Sieben-Transmembran-Rezeptoren enthalten auch einen oder mehrere intrazelluläre Schleifen, die als second messengers in Zellen wirkende G-Proteine binden und aktivieren.
  • Die Ionenkanalrezeptoren werden durch die liganden- und spannungsgesteuerten Kanalmembranprotein-Rezeptoren dargestellt. Ligandengesteuerte Ionenkanäle werden durch Pentamere homologer Untereinheiten gebildet. Jede Untereinheit trägt eine α-Helix zur Bildung der Kanalwandung bei. Liganden/Hormon-Bindungen bestehen offenbar zwischen den Untereinheiten. Die typischen spannungsgesteuerten Kanalrezeptoren sind Homotetramere, wobei jede Untereinheit sechs Transmembran-α-Helices besitzt.
  • Verschiedene Techniken sind verwendet worden, um Membranproteine zu studieren und/oder sie für therapeutische Zwecke, für die Diagnostik, für Drug-Screening-Assays und dergleichen zu nutzen. Im Unterschied zu Nichtmembranproteinen liegt aber das grösste Hindernis bei der Arbeit mit Membranproteinen in der schlechten Löslichkeit ihrer hydrophoben Polypeptidketten, der Schwierigkeit, Membranproteine von ungefalteten Polypeptidketten ausgehen zu falten, und der Schwierigkeit, sie in einer für quantitative Analysen geeigneten Umgebung zu überexprimieren und zu isolieren (Huang und Mitautoren, J. Biol. Chem. (1981) 256: 3802-3909; und Liao und Mitautoren, J. Biol. Chem. (1983) 258: 9949-9955). Zum Beispiel ist das Entfalten und Falten ganzer Transmembranproteine schwierig, weil sie wegen ihres stark hydrophoben Charakters in der Lipid-Doppelschicht in der ungefalteten Form, in der wässrigen Phase sowohl in ihrer gefalteten als auch in ihrer ungefalteten Form unlöslich sind (Haltia und Mitautoren, Biochim. Biophys. Acta (1995) 1241: 295-322). Dieses Merkmal von Membranproteinen ist besonders problematisch bei Versuchen, sie chemisch in einer zellfreien Umgebung zu synthetisieren, zu markieren oder anderweitig zu manipulieren. Dennoch sind einzelne Transmembransegmente von Membranproteinen über Festphasenchemie chemisch synthetisiert, danach in Membranen eingesetzt worden und haben sich spontan zu nativ-artigen Strukturen mit biologischer Aktivität organisiert (Popot und Mitautoren, Biochemistry (1990) 29: 4031-4037; und Grove und Mitautoren, Methods Enzymol. (1992) 207: 510-525). Bislang war die Festphasensynthese aber auf die Synthese weniger kurzer Transmembran-Peptidsegmente beschränkt, da sich Membranproteine hartnäckig den Standardverfahren der chemischen Synthese verschliessen.
  • Zugang zu Membranproteinen mit platzspezifischen chemischen Modifikationen zu erlangen ist von entscheidender Bedeutung sowohl für die Analyse von Struktur-Funktions-Beziehungen von Membranproteinen als auch für die Entwicklung neuer Pharmazeutika (drug discovery). Die wichtigsten Techniken, die derzeit eingesetzt werden, um dieses Ziel zu erreichen, sind die Synthese kleiner, die Membran durchspannender Peptidfragmente dieser Proteine (Grove und Mitautoren, Methods Enzymol. (1992) 207: 510-525; und MacKenzie und Mitautoren, Science (1997) 276: 131-133), die chemische Modifizierung vorhandener oder künstlich hergestellter Cysteinreste (Oh und Mitautoren, Science (1996) 273: 810-812) und die In-vitro-Suppressionsmutagenese zum Einbau unnatürlicher Aminosäuren (Cload und Mitautoren, Chemistry and Biology (1996) 3: 1033-1038; und Turcatti und Mitautoren, J. Biol. Chem. (1996) 271: 19991-19998). Keine dieser Techniken verschafft einen allgemeinen Zugang zu gänzlich synthetischen oder halbsynthetischen Membran-Proteinen mit chemisch modifizierten Aminosäure-Seitenketten oder deren Herstellung in Mengen, die für die meisten biophysikalischen Methoden genügen. Hinzu kommt, dass solche Techniken keine modulare Synthese oder Wiedervereinigung von in Membranen eingebauten Transmembran-Polypeptidsegmenten oder -domänen ermöglichen.
  • Relevantes Schrifttum
  • Wilken und Mitautoren (Curr. Opin. Biotech. (1998) 9(4): 412-426) geben eine Übersicht über die chemische Proteinsynthese. Dawson und Mitautoren (Science (1994) 266: 776-779) offenbaren die chemische Synthese wasserlöslicher Polypeptide durch native chemische Ligation. Grove und Mitautoren (Methods in Enzymology (1992) 207: 510-525) offenbaren Boc-chemische Festphasensynthese kleiner, porenbildender Membranpeptide, ihren nachfolgenden Einbau in eine Lipidmembran und ihre Aktivität in der Membran. MacKenzie und Mitautoren (Science (1997) 276: 131-133) offenbaren die rekombinante Synthese und radioaktive Markierung der Transmembrandomäne von Glykophorin A, seinen Einbau in eine Lipidmembran und seine NMR-Struktur in der Membran. Oh und Mitautoren (Science (1996) 273: 810-812) offenbaren die NMR-Struktur einer Diphtherietoxin-Transmembrandomäne durch chemische Modifizierung vorhandener oder künstlich hergestellter Cysteinreste mit einem Methanthiosulfat-Spinmarker, um eine Nitroxid-Seitenkette zu erzeugen. Turcatti und Mitautoren (J. Biol. Chem. (1996) 271: 19991-19998) offenbaren die In-vitro-Suppressionsmutagenese in Xenopus-Oozyten, um fluoreszenzmarkierte Aminosäuren in den Sieben-Transmembran-Neurokinin 2-Rezeptor einzuführen, sowie dessen Einbau und Aktivität in Oozytenmembranen. Portman und Mitautoren (J. Phys. Chem. (1991) 95: 8437-8440) offenbaren den Einbau und die Aktivität von α-Chymotrypsin und Bakteriodopsin in eine Lipidmatrix kubischer Phase. Giorgione und Mitautoren (Biochemistry (1998) 37(8): 2384-2392) offenbaren den Einbau und die Aktivität von Protein-Kinase C in einer kubischen Lipidphasenmatrix und in Liposomen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen für Lipidmatrix-gestützte chemische Ligation (Verknüpfung) und Synthese von Membran-Polypeptiden, durch die Verfahren hergestellte Zusammensetzungen und Assays, in denen sie eingesetzt werden. Die Verfahren beinhalten, ein in eine Lipidmatrix eingebautes Membran-Polypeptid mit einem aus einer oder mehreren Aminosäuren bestehenden Ligationsmarker in Berührung zu bringen, wobei das Polypeptid und der Marker Aminosäuren mit ungeschützten reaktiven Gruppen umfassen, die zu chemoselektiver chemischer Ligation befähigt sind. Eine Vielfalt chemoselektiver Chemien kann für die Ligation verwendet werden, zum Beispiel die native chemische Ligation, die Ligation unter Oximbildung, die Ligation unter Thioesterbildung, die Ligation unter Thioetherbildung, die Ligation unter Hydrazonbildung, die Ligation unter Thiazolidinbildung und die Ligation unter Oxazolidinbildung. Zusammensetzungen der Erfindung sind u.a. vollsynthetische und halbsynthetische, in eine Lipidmatrix eingebettete Membran-Polypeptide, die durch das lipidmatrix-gestützte chemische Ligationsverfahren der Erfindung hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiter ein Verfahren zur Bildung eines in eine Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptids mit einer Ligationsstelle, das einer chemoselektiven chemischen Ligation zugänglich ist, wenn es mit einem Reagens behandelt wird, das das Polypeptid in direkter Nachbarschaft zu einer Gruppe spaltet, die der chemoselektiven Ligation zugänglich ist. Dieser Aspekt der Erfindung beinhaltet, ein Membran-Polypeptid, das in eine Lipidmatrix eingebettet ist, mit einem Reagens in Berührung zu bringen, das das Polypeptid an einer spezifischen Stelle selektiv spaltet, um ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid mit einem ungeschützten N-terminalen oder C-terminalen Rest zu erzeugen, der einer chemoselektiven chemischen Ligation zugänglich sind. Die Spaltstelle kann im Polypeptid natürlich vorliegen, oder das Polypeptid kann künstlich so hergestellt werden, dass es eine oder mehrere solche Stellen enthält.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden, der mit einem in eine Lipidmatrix eingebetteten gefalteten Membran-Polypeptid direkt oder indirekt in Wechselwirkung steht. Dieser Aspekt der Erfindung beinhaltet, ein in eine Lipidmatrix eingebettetes, synthetisches oder halbsynthetisches Membran-Polypeptid, das durch lipidmatrix-gestützte chemische Ligation hergestellt worden ist, mit einem Liganden in Berührung zu bringen, wobei der Ligand und/oder das Membran-Polypeptid einen nachweisbaren Marker umfassen. Die Liganden können von einer beliebigen Anzahl von Quellen abgeleitet sein, darunter natürlich vorkommende Liganden und synthetische bzw. halbsynthetische Quellen wie Verbindungsbibliotheken. Dieses Verfahren ist besonders nützlich für diagnostische Prüfungen, das Screening neuer Verbindungen für die Arzneimittelentwicklung sowie weitere strukturelle und funktionelle Prüfungen, in denen die Bindung eines Liganden an ein vorgefaltetes Membran-Polypeptid eingesetzt wird.
  • Weiter wird eine Trägermatrix zur Verfügung gestellt, die für Screening-Assays geeignet ist und ein nachweisbar markiertes, in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid umfasst, das über einen chemischen Greifer (Handle) daran angeknüpft ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits zur Verfügung, die zumindest eine oder mehrere Zusammensetzungen der Erfindung enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Verfügung, in situ auf einem Harz ein Peptid mit einer chelator-sensibilisierten Metallionensonde zu markieren. Dieses Verfahren beinhaltet, eine oder mehrere Aminosäuren eines an ein Harz angeknüpften Peptids mit einem zwitterionischen Chelatorgruppenmarker zu markieren, der in der Lage ist, Metallionen zu chelieren. Weiter ist ein Verfahren einbeschlossen, die Löslichkeit eines zwitterionischen Cheliermittels zu erhöhen. Dieses Verfahren beinhaltet, ein unlösliches zwitterionisches Cheliermittel mit einem Solubilisierungsmittel zu kombinieren, das eine lösliche Salzform des zwitterioinischen Cheliermittels erzeugt.
  • Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verschaffen einen noch nie dagewesenen Zugang zu Membran-Polypeptiden und ihre platzspezifische Markierung mit einem oder mehreren nachweisbaren Markern. Die Verfahren und Zusammensetzungen haben auch viele weitere Verwendungen. Zum Beispiel können sie verwendet werden, um Ligandenbindung an Membran-Polypeptide und -domänen zu testen, die einen Rezeptor umfassen, und sind daher äusserst nützlich für Struktur-Funktions-Untersuchungen, Drug- Screening, Drug Selection und Drug Design sowie Diagnostika und dergleichen einschliesslich der Anwendungen mit hohem Durchsatz. Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind besonders gut für FRET-Analysen von zuvor unzugänglichen Membran-Polypeptiden geeignet.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A bis D veranschaulichen verschiedene Möglichkeiten der Assoziation von Membran-Polypeptiden mit einer Lipid-Doppelschicht.
  • 2 veranschaulicht verschiedene chemische Ligationsschemata für in eine Lipidmatrix eingebettete Membran-Polypeptide.
  • 3A bis C zeigen Schemata, die eine platzspezifische Proteasespaltung und native chemische Ligation eines in eine Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptids demonstrieren.
  • 4 zeigt ein typisches Ausgangssignal von MALDI-(matrix assisted Laser desorption: matrixgestützte Laserdesorption) Massenspektren, das die Entstehung eines freien, ungeschützten N-terminalen Cysteinrests durch platzspezifische Spaltung und nachfolgende native chemische Ligation eines frei gewählten Ligationsmarkers mit diesem Rest überwacht.
  • 5 veranschaulicht Markierungsschemata mit Donor-Akzeptor-Chromophorenpaaren für Resonanz-Energietransfer-(FRET-) Assays eines in eine Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptids.
  • 6 veranschaulicht FRET-Assays für Ionenkanäle.
  • 7 veranschaulicht FRET-Proximitätsassays für Ionenkanäle.
  • 8 veranschaulicht Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-(SAR: structure-activity relationship) Assays mit NMR für Ionenkanäle.
  • 9 veranschaulicht Umkehrphasen-HPLC und elektrospray-massenspektrometrische Massenanalyse N-terminaler und C-terminaler Peptide als der Vorläufer für HIV-Vpu-Ionenkanäle zur Zeit t = 0 h sowie des Ligationsprodukts zur Zeit t = 3 h nach Einleitung der Ligation in einer Dodecylphosphocholin-(DPC-)Micelle.
  • 10 veranschaulicht Gelpermeations-HPLC und MALDI-massenspektrometrische Massenanalyse N-terminaler und C-terminaler Peptide als der Vorläufer für S. lividans-Kaliumionenkanäle (KcsA) sowie des Ligationsprodukts nach Einleitung der Liga tion und nach Ligation über Nacht in der kubischen Lipidphase (CLP: cubic lipid phase) von 1-Monooleoyl-rac-glycerin (C18 : 1, {cis}-9) (MO).
  • DEFINITIONEN
  • Aminosäuren: Umfasst die 20 genetisch kodierten Aminosäuren, seltene oder ungewöhnliche Aminosäuren, die in der Natur zu finden sind, sowie beliebige der nicht natürlich vorkommenden und modifizierten Aminosäuren. Im Zusammenhang mit einem Peptid, Polypeptid oder Protein manchmal als Aminosäurereste bezeichnet.
  • Chemoselektive chemische Ligation: Chemisch selektive Reaktion der kovalenten Ligation (1) einer ersten ungeschützten Aminosäure, eines ersten ungeschützten Peptids oder Polypeptids mit (2) einer zweiten Aminosäure, einem zweiten Peptid oder Polypeptid. Eine beliebige chemoselektive Reaktionschemie, die auf die Ligation ungeschützter Peptidsegmente angewendet werden kann.
  • Chromophor: Chemische Gruppe, die Lichtabsorption innerhalb des ultravioletten (250 bis 400 nm) bis sichtbaren (400 bis 700 nm) Spektralbereichs von Licht aufweist. Umfasst Fluorophore, Farbstoffe sowie Donor- und Akzeptorgruppen eines resonanten Energietransfersystems. Kann natürlich (intrinsisch) auftreten oder zu einem biologischen Molekül wie einem Peptid, Polypeptid, Kohlenhydrat oder Lipid (extrinsisch) hinzugefügt werden.
  • Spaltstelle: Eine Aminosäuresequenz, die in der Lage ist, durch ein Reagens, das einen chemischen Stoff oder eine Protease umfasst, die die Hydrolyse einer Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren eines Ziel-Polypeptid ermöglichen, gespalten zu werden.
  • Chemische Ligation unter Hydrazonbildung: Chemoselektive Reaktion der Ligation einer ersten ungeschützten Aminosäure, eines ersten ungeschützten Peptids oder Polypeptids, die eine Hydrazingruppe besitzen, mit einer zweiten ungeschützten Aminosäure, einem zweiten ungeschützten Peptid oder Polypeptid, die eine Aldehyd- oder Ketogruppe besitzen, die zur Bildung eines Ligationsprodukts führt, das eine Hydrazongruppe an der Ligationsstelle enthält. Die Hauptkettenstruktur eines Peptid- oder Polypeptidprodukts, die sich aus einer chemischen Ligation unter Hydrazonbildung ergibt, lässt sich von der eines Peptids oder Polypeptids, das natürlich vorkommt oder aus rekombinanter Expression entsteht, unterscheiden.
  • Ligationsmarker: Eine chemische Gruppe, die eine oder mehrere Aminosäuren umfasst. Kann ein Peptid oder Polypeptid sein.
  • Lipidmatrix: Eine molekulare Matrix, die natürliche oder synthetische Lipidmoleküle oder deren Kombinationen enthält, die in der Lage sind, eine lyotrope Phase zu bilden (d.h. Bildung einer geordneten Struktur bei Wechselwirkung mit Wasser). Auch als Lipidmembran bezeichnet. Die Lipidmoleküle haben ein mittelgrosses Molekulargewicht von etwa 100 bis 5000 und enthalten einen erheblichen Anteil an aliphatischem oder aromatischem Kohlenwasserstoff. Enthält eine oder mehrere polare Lipide wie Phospolipide, Lysophospholipide, Sphingolipide und Glykolipide, die in der Lage sind, lamellare Doppelschichten und andere Lipidaggregate zu bilden, die unterschiedliche zweidimensionale Lamellen und/oder hexagonale Phasengitterstrukturen und/oder dreidimensionale kubische Phasengitterstrukturen besitzen.
  • Membran-Polypeptid: Ein Polypeptid mit einer hydrophoben Gruppe, die das Polypeptid an der Lipidmembran verankert. Auch als ein Membranpeptid oder ein Membranprotein bezeichnet. Kann eine oder mehrere Lipidmembran-Ankerdomänen wie zum Beispiel ein hydrophobes Segment des Polypeptids, eine kovalent angeknüpfte Fettsäurekette oder eine kovalent angeknüpfte Lipidkette enthalten. Kann ein Single-pass- oder Multi-pass-Transmembran-Polypeptid sein. Kann einen oder mehrere Extramembran-Aminosäurereste umfassen, die bevorzugt mit der wässrigen Phase wechselwirken, wie zum Beispiel Reste mit einer extrazellulären oder intrazellulären Schleife.
  • Native chemische Ligation: Chemoselektive Reaktion der Ligation einer ersten ungeschützten Aminosäure, eines ersten ungeschützten Peptids oder Polypeptids mit einer zweiten ungeschützten Aminosäure, einem zweiten ungeschützten Peptid oder Polypeptid unter Bildung einer Amidbindung, die eine Hauptkettenstruktur besitzt, die sich nicht von der eines Peptids oder Polypeptids, das natürlich vorkommt oder aus rekombinanter Expression entsteht, unterscheiden lässt.
  • Chemische Ligation unter Oxazolidinbildung: Chemoselektive Reaktion der Ligation einer ersten ungeschützten Aminosäure, eines ersten ungeschützten Peptids oder Polypeptids, die eine Aldehyd- oder Ketogruppe besitzen, mit einer zweiten ungeschützten Aminosäure, einem zweiten ungeschützten Peptid oder Polypeptid, die eine 1-Amino,2-ol-Gruppe besitzen, die zur Bildung einer Oxazolidingruppe an der Ligationsstelle führt. Die Hauptkettenstruktur eines Peptid- oder Polypeptidprodukts, die sich aus einer chemischen Ligation unter Oxazolidinbildung ergibt, lässt sich von der eines Peptids oder Polypeptids, das natürlich vorkommt oder aus rekombinanter Expression entsteht, unterscheiden.
  • Chemische Ligation unter Oximbildung: Chemoselektive Reaktion der Ligation einer ersten ungeschützten Aminosäure, eines ersten ungeschützten Peptids oder Polypeptids, die eine Aminooxygruppe besitzen, mit einer zweiten ungeschützten Aminosäure, einem zweiten ungeschützten Peptid oder Polypeptid, die eine Aldehyd- oder Ketogruppe besitzen, die zur Bildung einer Oximgruppe an der Ligationsstelle führt. Die Hauptkettenstruktur eines Peptid- oder Polypeptidprodukts, die sich aus einer chemischen Ligation unter Oximbildung ergibt, lässt sich von der eines Peptids oder Polypeptids, das natürlich vorkommt oder aus rekombinanter Expression entsteht, unterscheiden.
  • Peptid: Ein Polymer aus mindestens zwei Monomeren, worin die Monomere Aminosäuren sind, manchmal als Aminosäurereste bezeichnet, die über eine Amidbindung zusammengefügt sind. Kann entweder eine völlig native Amidhauptkette oder eine unnatürliche Hauptkette oder aber eine Mischung davon besitzen. Kann mit bekannten synthetischen Verfahren hergestellt werden, darunter Lösungssynthese, schrittweise Festphasensynthese, Segmentkondensation und konvergente Kondensation. Kann ribosomal in einem Zellsystem oder in einem zellfreien System synthetisiert oder durch Proteolyse grösserer Polypeptidsegmente erzeugt werden. Kann mit einer Kombination von chemischen und ribosomalen Methoden synthetisiert werden.
  • Polypeptid: Ein Polymer aus drei oder mehr Monomeren, worin die Monomere Aminosäuren sind, manchmal als Aminosäurereste bezeichnet, die über eine Amidbindung zusammengefügt sind. Auch als ein Peptid oder Protein bezeichnet. Kann native Amidbindungen oder eine beliebige der bekannten nicht natürlichen Peptidhauptketten oder eine Mischung davon umfassen. Reicht in der Grösse von 3 bis 1000 Aminosäureresten, bevorzugt von 3 bis 100 Aminosäureresten, stärker bevorzugt von 10 bis 60 Aminosäureresten und am meisten bevorzugt von 20 bis 50 Aminosäureresten. Segmente des Polypeptids oder das gesamte Polypeptid können mit bekannten synthetischen Verfahren hergestellt werden, darunter Lösungssynthese, schrittweise Festphasensynthese, Segmentkondensation und konvergente Kondensation. Segmente des Polypeptids oder das gesamte Polypeptid können auch ribosomal in einem zellulären oder zellfreien Translationssystem hergestellt oder durch Proteolyse grösserer Polypeptidsegmente erzeugt werden. Kann mit einer Kombination von chemischen und ribosomalen Methoden synthetisiert werden.
  • Chemische Ligation unter Thiazolidinbildung: Chemoselektive Reaktion der Ligation einer ersten ungeschützten Aminosäure, eines ersten ungeschützten Peptids oder Polypeptids, die eine Aldehyd- oder Ketogruppe besitzen, mit einer zweiten ungeschützten Aminosäure, einem zweiten ungeschützten Peptid oder Polypeptid, die eine 1-Amino,2-thiol-Gruppe besitzen, die zur Bildung einer Thiazolidingruppe an der Ligationsstelle führt. Die Hauptkettenstruktur eines Peptid- oder Polypeptidprodukts, die sich aus einer chemischen Ligation unter Thiazolidinbildung ergibt, lasst sich von der eines Peptids oder Polypeptids, das natürlich vorkommt oder aus rekombinanter Expression entsteht, unterscheiden.
  • Chemische Ligation unter Thioesterbildung: Chemoselektive Reaktion der Ligation einer ersten ungeschützten Aminosäure, eines ersten ungeschützten Peptids oder Polypeptids mit einer zweiten ungeschützten Aminosäure, einem zweiten ungeschützten Peptid oder Polypeptid, die zur Bildung einer Thioesterbindung an der Ligationsstelle führt. Die Hauptkettenstruktur eines Peptid- oder Polypeptidprodukts, die sich aus einer chemischen Ligation unter Thioesterbildung ergibt, lässt sich von der eines Peptids oder Polypeptids, das natürlich vorkommt oder aus rekombinanter Expression entsteht, unterscheiden.
  • Chemische Ligation unter Thioetherbildung: Chemoselektive Reaktion der Ligation einer ersten ungeschützten Aminosäure, eines ersten ungeschützten Peptids oder Polypeptids mit einer zweiten ungeschützten Aminosäure, einem zweiten ungeschützten Peptid oder Polypeptid, die zur Bildung einer Thioetherbindung an der Ligationsstelle führt. Die Hauptkettenstruktur eines Peptid- oder Polypeptidprodukts, die sich aus einer chemischen Ligation unter Thioetherbildung ergibt, lässt sich von der eines Peptids oder Polypeptids, das natürlich vorkommt oder aus rekombinanter Expression entsteht, unterscheiden.
  • BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen für eine lipidmatrix-gestützte chemische Ligation und Synthese von Membran-Polypeptiden oder Membran-Polypeptiddomänen, die in eine Lipidmatrix eingebaut sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Zusammensetzungen, die mit den Verfahren der Erfindung hergestellt werden, sowie auf Assays, in denen sie eingesetzt werden.
  • Die lipidmatrix-gestützten chemischen Ligations- und Syntheseverfahren der Erfindung beinhalten eine chemoselektive Ligation eines Ligationsmarkers mit einem in eine Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptid. Die Membran-Polypeptid- und Ligationsmarkerkomponenten besitzen ungeschützte reaktive Gruppen, die selektiv reagieren, um eine kovalente Bindung an der Ligationsstelle, die auch als eine chemoselektive Ligationsstelle bezeichnet wird, zu ergeben. Die Lipidmatrix wird genutzt, 1) um eine Umgebung zur Verfügung zu stellen, in der das Membran-Polypeptid in einem vorgefalteten Zustand gehalten wird, und 2) um die reaktiven Gruppen für die chemoselektive Ligation zu positionieren. Dieser Aspekt der Erfindung wird im Schema 1 beispielhaft dargestellt.
  • Schema 1
    • Xn-R2 + R1-MP → Xn-R3-MP worin „Xn" eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, „R1" und „R2" ungeschützte reaktionsfreudige Gruppen darstellen, die zur chemoselektiven chemischen Ligation miteinander befähigt sind, „MP" ein Membran-Polypeptid darstellt, das zumindest einen hydrophoben (unpolaren) Bereich umfasst, der in eine Lipidmatrix eingebettet ist, und Striche „-", die die Gruppen verbinden, kovalente Bindungen andeuten. Die chemoselektive Wechselwirkung zwischen den ungeschützten reaktiven Gruppen der Ligationskomponenten „Xn-R2" und „R1-MP" ergibt das chemische Ligationsprodukt „Xn-R3-MP", worin „R3" die sich ergebende kovalente Verknüpfung darstellt, die durch chemoselektive chemische Ligation zwischen Xn-R2 und R1-MP gebildet wird. Reaktionszwischenprodukte und Nebenprodukte sind nicht illustriert. Ein vollsynthetisches Produkt wird erzeugt, wenn alle Ligationskomponenten durch chemische Synthese, also ribosomenfreie Synthese, künstlich erzeugt werden. Ein halbsynthetisches Produkt wird erzeugt, wenn zumindest ein Teil einer Ligationskomponente durch biologische Synthese erzeugt wird, d.h. ribosomal in einem zellulären oder zellfreien Translationssystem, während ein anderer Teil durch chemische Synthese erzeugt wird.
  • Eine Vielfalt von Chemien kann gemäss den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden. Jede chemoselektive Reaktionschemie, die auf die Ligation von ungeschützten Peptidsegmenten angewendet werden kann, ist einer lipidmatrix-gestützten chemoselektiven chemischen Ligation zugänglich. Diese Chemien umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die native chemische Ligation (Dawson und Mitautoren, Science (1994) 266: 776-779; Kent und Mitautoren, WO 96/34878), die erweiterte allgemeine chemische Ligation (Kent und Mitautoren, WO 98/28434), die chemische Ligation unter Oximbildung (Rose und Mitautoren, J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116: 30-33), die Ligation unter Thio esterbildung (Schnölzer und Mitautoren, Science (1992) 256: 221-225), die Ligation unter Thioetherbildung (Englebretsen und Mitautoren, Tet. Letts. (1995) 36(48): 8871-8874), die Ligation unter Hydrazonbildung (Gaertner und Mitautoren, Bioconj. Chem. (1994) 5(4): 333-338) sowie die Ligation unter Thiazolidinbildung und die Ligation unter Oxazolidinbildung (Zhang und Mitautoren, Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95(16): 9184-9189; Tam und Mitautoren, WO 95/00846).
  • Die Reaktionsbedingungen für eine gegebene Ligationschemie werden so gewählt, dass die gewünschte Wechselwirkung zwischen dem in die Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptid und den Ligationsmarkerkomponenten erhalten bleibt. Zum Beispiel können pH-Wert und Temperatur, Wasserlöslichkeit des Ligationsmarkers, das Verhältnis von Lipid zu Polypeptid und Marker, der Wassergehalt und die Zusammensetzung der Lipidmatrix variiert werden, um die Ligation zu optimieren. Der Zusatz oder der Ausschluss von Reaktanten, die die Lipidmatrix und/oder das Membran-Polypeptid in einem unterschiedlichen Ausmass solubilisieren, kann ferner verwendet werden, um die Spezifität und Geschwindigkeit der gewünschten Ligationsreaktion zu steuern, d.h. die Exposition und Präsentation von reaktiven Gruppen zu steuern, indem die Löslichkeit der Lipidmatrix und/oder des Membran-Polypeptids manipuliert werden. Die Reaktionsbedingungen lassen sich leicht bestimmen, indem unter Vergleich mit einem oder mehreren internen und/oder externen Kontrollsubstanzen auf das gewünschte chemoselektive Reaktionsprodukt geprüft wird.
  • Für Lipidmatrix-gestützte native chemische Ligation umfassen das Membran-Polypeptid und der Ligationsmarker eine verträgliche Paarung der Komponenten der nativen chemischen Ligation, in der eine der Komponenten ein Cystein mit einer ungeschützten Aminogruppe, die andere Komponente eine Aminosäure mit einer ungeschützten α-Thioestergruppe zur Verfügung stellt. Diese Gruppen sind in der Lage, chemisch zu einer nativen Peptidbindung an der Ligationsstelle zu reagieren.
  • Für Lipidmatrix-gestützte chemische Ligation unter Oximbildung umfassen das Membran-Polypeptid und der Ligationsmarker eine verträgliche Paarung der Komponenten der chemischen Ligation unter Oximbildung, in der eine der Komponenten eine ungeschützte Aminosäure mit einer Aldehyd- oder Ketogruppe, die andere Komponente eine ungeschützte Aminosäure mit einer Aminooxygruppe zur Verfügung stellt. Diese Gruppen sind in der Lage, chemisch zu einem Ligationsprodukt zu reagieren, das eine Oximgruppe an der Ligationsstelle besitzt.
  • Für lipidmatrix-gestützte chemische Ligation unter Thioesterbildung umfassen das Membran-Polypeptid und der Ligationsmarker eine verträgliche Paarung der Komponenten der chemischen Ligation unter Thioesterbildung, in der eine der Komponenten eine ungeschützte Aminosäure mit einer Halogenacetylgruppe, die andere Komponente eine ungeschützte Aminosäure mit einer α-Thiocarboxylatgruppe zur Verfügung stellt. Diese Gruppen sind in der Lage, chemisch zu einem Ligationsprodukt zu reagieren, das eine Thioestergruppe an der Ligationsstelle besitzt.
  • Für lipidmatrix-gestützte chemische Ligation unter Thioetherbildung umfassen das Membran-Polypeptid und der Ligationsmarker eine verträgliche Paarung der Komponenten der chemischen Ligation unter Thioetherbildung, in der eine der Komponenten eine ungeschützte Aminosäure mit einer Halogenacetylgruppe, die andere Komponente eine ungeschützte Aminosäure mit einer Alkylthiolgruppe zur Verfügung stellt. Diese Gruppen sind in der Lage, chemisch zu einem Ligationsprodukt zu reagieren, das eine Thioethergruppe an der Ligationsstelle besitzt.
  • Für lipidmatrix-gestützte chemische Ligation unter Hydrazonbildung umfassen das Membran-Polypeptid und der Ligationsmarker eine verträgliche Paarung der Komponenten der chemischen Ligation unter Hydrazonbildung, in der eine der Komponenten eine ungeschützte Aminosäure mit einer Aldehyd- oder Ketogruppe, die andere Komponente eine ungeschützte Aminosäure mit einer Hydrazingruppe zur Verfügung stellt. Diese Gruppen sind in der Lage, chemisch zu einem Ligationsprodukt zu reagieren, das eine Hydrazongruppe an der Ligationsstelle besitzt.
  • Für lipidmatrix-gestützte chemische Ligation unter Thiazolidinbildung umfassen das Membran-Polypeptid und der Ligationsmarker eine verträgliche Paarung der Komponenten der chemischen Ligation unter Thiazolidinbildung, in der eine der Komponenten eine ungeschützte Aminosäure mit einer 1-Amino,2-thiolgruppe, die andere Komponente eine ungeschützte Aminosäure mit einer Aldehyd- oder Ketogruppe zur Verfügung stellt. Diese Gruppen sind in der Lage, chemisch zu einem Ligationsprodukt zu reagieren, das eine Thiazolidingruppe an der Ligationsstelle besitzt.
  • Für lipidmatrix-gestützte chemische Ligation unter Oxazolidinbildung umfassen das Membran-Polypeptid und der Ligationsmarker eine verträgliche Paarung der Kompo nenten der chemischen Ligation unter Oxazolidinbildung, in der eine der Komponenten eine ungeschützte Aminosäure mit einer 1-Amino,2-hydroxylgruppe, die andere Komponente eine ungeschützte Aminosäure mit einer Aldehyd- oder Ketogruppe zur Verfügung stellt. Diese Gruppen sind in der Lage, chemisch zu einem Ligationsprodukt zu reagieren, das eine Oxazolidingruppe an der Ligationsstelle besitzt.
  • Es ist leicht ersichtlich, dass jede Kombination von Ligationskomponenten, die für eine chemoselektive chemische Ligation geeignet sind, die ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Polypeptidprodukt mit einer kovalenten Bindung an der Ligationsstelle liefert, unter der Voraussetzung als ein Teil der Erfindung betrachtet wird, dass zumindest eine der Komponenten der Ligationsreaktion ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid umfasst. Genauer wird vom Membran-Polypeptid als Ligationskomponente verlangt, dass es zumindest einen hydrophoben Bereich umfasst, der das Polypeptid an der Lipidmatrix verankert. Ein Beispiel für einen verankernden Bereich ist ein Zellmembrananker, der hydrophobe α-Helix- und/oder hydrophobe β-Barrel-Transmembrankomponenten umfasst. Das Membran-Polypeptid kann auch native Amidbindungen oder eine beliebige der bekannten unnatürlichen Peptidhauptketten oder deren Mischung oder andere chemische Unterschiede gegenüber einer nativen Aminosäuresequenz enthalten, zum Beispiel eine unnatürliche Aminosäure mit einem Chromophor oder einer anderen nachweisbaren Gruppe, die mit dem Erhalt des Membran-Polypeptids in der Lipidmatrix verträglich ist. Dies schliesst Single-pass- und Multipass-Transmembran-Polypeptide oder deren Domänen ein, die eine native oder nicht native Sequenz von Aminosäuren besitzen, die sich in einen hydrophoben Bereich einer Lipidmatrix einbetten und mit ihm wechselwirken, und kann eine oder mehrere Extramembran-Aminosäuren einschliessen, die in die wässrige Umgebungsphase hinausragen, die durch die Lipidmatrix/Wasser-Grenzfläche gebildet wird. Beispiele von Extramembran-Aminosäuren sind u.a. diejenigen, die Teil einer intrazellulären oder extrazellulären, zwei Membrananker verbindenden Schleife sind oder diese Schleife bilden, eine N- oder C-terminale Sequenz, eine Sequenz, die erforderlich ist, um das Einfügen des Polypeptids in eine Lipidmembran zu erleichtern, und/oder eine andere interessante Linker- oder Verkappungssequenz.
  • Das Membran-Polypeptid als Ligationskomponente umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die sowohl eine Einfügung als auch eine Verankerung in einer Lipidmembran erlaubt. Zum Beispiel umfasst das Membran-Polypeptid allgemein eine Amino säuresequenz, die in der Lage ist, eine Transmembranstruktur zu bilden, zum Beispiel eine amphipatische α-Helix, die so organisiert ist, dass die unpolaren Reste mit dem Inneren der Membran in Berührung stehen, während die geladenen oder polaren Reste mit der wässrigen Phase in Berührung stehen. Membran-Polypeptide als Ligationskomponenten dieses Typs haben eine genügende Länge, um die Lipid-Doppelschicht zu durchspannen, und sind daher typisch mehr als 15 bis 20 Aminosäuren lang. Sie können in ihrer Grösse bis zur vollen Länge eines natürlich vorkommenden Membran-Polypeptids reichen und über solche Polypeptide voller Länge hinaus noch zusätzlich ein oder mehrere Aminosäuren enthalten, vorausgesetzt, dass das Membran-Polypeptid zum Einbau in die Lipidmatrix fähig ist.
  • Die Lipidmatrix, in die die Membran-Polypeptidkomponente eingebaut wird, umfasst natürliche und synthetische Lipide, die befähigt sind, eine lyotrope Phase zu bilden (d.h. Bildung einer geordneten Struktur vom Membrantyp bei Wechselwirkung mit Wasser, zum Beispiel eine flüssigkristalline Phase). Zu diesen gehören polare Lipide wie Phospholipide, Lysophospholipide, Sphingolipide und Glykolipide, die zur Bildung lamellarer Doppelschichten und anderer Lipidaggregate befähigt sind. Bevorzugte Lipidmatrizen bilden stabile Membran-Einfach- oder Doppelschichten und deren aggregierte Phasen. Von besonderem Interesse sind Lipide, die stabile kubische Phasen bilden (eine kubische Lipidphasen- oder CLP-[cubic lipidic phase] Matrix) (Luzzati und Mitautoren, Nature (1968) 218: 1031-1034; und Lindblom und Mitautoren, Biochim. Biophys. Acta (1989) 988: 221-256). Eine kubische Phase ist eine Phase, in der die Lipidaggregate ein dreidimensionales Gitter bilden. Die Lipidaggregateinheiten können eine unterschiedliche Gestalt wie Kugeln, Stäbe oder Lamellen besitzen. Hingegen weisen lamellare flüssigkristalline Phasen eine eindimensionale Periodizität auf, in der lamellare Einheiten unendlicher Ausprägung regelmässig gestapelt sind, während hexagonale flüssigkristalline Phasen eine zweidimensionale Periodizität mit stabartigen Aggregaten unendlicher Länge aufweisen, die zu einem hexagonalen Gitter gepackt sind. Daher sind kubische Phasen optisch isotrop, während lamellare und hexagonale Phase optisch anisotrop sind.
  • Lipide, die kubische Phasen bilden, bestehen aus einer Mehrzahl von Lipid-Doppelschichten, die von einer Mehrzahl wässriger Kanäle durchzogen sind, die zwischen bestimmten Lipiden und polaren Lösungsmitteln bei spezifischen Lipid/Lösungsmittel-Verhältnissen gebildet werden (Luzzati und Mitautoren, a.a.O.; und Lindblom und Mit autoren, a.a.O.). Die Lipid-Diffusionsgeschwindigkeit im Inneren der CLP ist mit der in lamellaren Lipidphasen vergleichbar, während die Diffusionsgeschwindigkeit in den wässrigen Kompartimenten ungefähr dreimal geringer als in einer freien Wasserphase ist (Lindblom und Mitautoren, a.a.O.). Ausserdem können Membran-Polypeptide ihre volle Aktivität zur Schau stellen, wenn sie in Lipide der kubischen Phase eingebaut sind (Portmann und Mitautoren, J. Phys. Chem. (1991) 95: 8437-8440). Da die CLP optisch isotrop sind, können sie in empfindlichen spektrophotometrischen Tests eingesetzt werden. Somit liefert die Manipulation eines in eine Lipidmatrix eingebauten Membran-Polypeptids nicht nur ein vorgefaltetes Membran-Polypeptid, das als eine Schablone für eine chemoselektive chemische Ligation dient, sondern die Lipidmatrix kann auch selbst genutzt werden, um Tests zu ermöglichen, die ein lipid-vermittelt gefaltetes Membran-Polypeptid verlangen.
  • Die Ligationsmarkerkomponente umfasst eine oder mehrere Aminosäuren und ist bevorzugt ein Peptid oder Polypeptid. Zumindest eine Aminosäure des Ligationsmarkers stellt eine reaktive Gruppe zur Verfügung, die zur Reaktion und Bildung einer kovalenten Bindung mit einer verträglichen reaktiven Gruppe befähigt ist, die durch das in die Lipidmatrix eingebettete Membran-Polypeptid zur Verfügung gestellt wird. Der Ligationsmarker kann auch eine Membran-Polypeptidkomponente umfassen, wenn zum Beispiel eine modulare Ligation und Synthese eines Multipass-Transmembran-Polypeptids gewünscht wird. Der Ligationsmarker kann auch eine native und/oder unnatürliche Peptid-Hauptkettenstruktur oder unnatürliche Aminosäurereste oder weitere chemische Unterschiede gegenüber einer nativen Peptidsequenz umfassen, zum Beispiel eine unnatürliche Aminosäure mit einem Chromophor oder einer anderen, mit der chemischen Ligation des Ligationsmarkers und dem in die Lipidmatrix eingebetteten Ziel-Membran-Polypeptid verträglichen nachweisbaren Gruppe.
  • In der Lipidmatrix, dem in die Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptid und/oder dem Ligationsmarker der Erfindung können auch ein oder mehrere chemische Tags verwendet werden. Das chemische Tag kann für viele Zwecke genutzt werden, zum Beispiel als Teil des Syntheseprozesses, für die Reinigung, für die Verankerung an einer Trägermatrix, für den Nachweis und dergleichen. Von besonderem Interesse ist ein chemisches Tag, das durch eine unnatürliche Aminosäure mit einem Chromophor geliefert wird. Dazu gehört ein Chromophor, der eine Akzeptor- und/oder Donorgruppe eines Akzeptor-Donor-Resonanzenergietransfer-Paares ist. Von besonderem Interesse sind Synthe se- und Reinigungsgreifer sowie nachweisbare Marker und – wahlweise – chemische Gruppen, um die Lipidmatrix oder das in die Lipidmatrix eingebettete Membran-Polypeptid an eine Trägermatrix für Screening- und diagnostische Tests und dergleichen anzuknüpfen. Verschiedene, hierin beschriebene Marker sind für diesen Zweck geeignet. Verständlicherweise wird es in einigen Fällen von Vorteil sein, ein gegebenes chemisches Tag für mehr als einen Zweck einzusetzen, z.B. als einen Greifer zur Anknüpfung an eine Trägermatrix und als einen nachweisbaren Marker. Beispiele chemischer Tags sind u.a. Metall bindende Tags (z.B. His-Tags), Kohlenhydrat/Substrate bindende Tags (z.B. Bindungsdomänen für Cellulose und Chitin), Antikörper- und Antikörperfragment-Tags, Isotopenmarker, Haptene wie Biotin und verschiedene unnatürliche Aminosäuren mit einem Chromophor. Ein chemisches Tag kann auch ein spaltbarer Linker sein.
  • Die Nutzung der Lipidmatrix für die chemische Ligation eines in eine Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptids ermöglicht eine zuvor nicht möglich gewesene platzpezifische Ligation, nachweisbare Markierung und modulare Synthese vorgefalteter Memran-Polypeptide. Die Lipidmatrix liefert nicht nur die geeignete Umgebung zum Einfügen, Falten und Darbieten einer chemischen Ligationsstelle, sondern durch die Einbettung der Membran-Polypeptidkomponente in eine Lipidmatrix wird auch die Lipidmatrix selbst als eine neuartige Komponente zur Steuerung der Spezifität der chemischen Ligationsreaktion genutzt. Zum Beispiel kann eine Ligationsstelle am Membran-Polypeptid so gewählt werden, dass sie ins Innere einer Lipidmembran-Doppelschicht der Matrix versenkt ist. In dieser Konstellation wird die chemische Ligation eines hydrophoben Ligationsmarkers gegenüber der eines hydrophilen Ligationsmarkers bevorzugt sein. Alternativ kann eine Ligationsstelle ausserhalb der Membran gelegen sein, so dass die Ligation eines hydrophilen Ligationsmarkers bevorzugt wird. Eine weitere Variante, die durch die Nutzung der Lipidmatrixkomponente in Kombination mit der Lokalisierung der Ligationsstelle ermöglicht wird, besteht im Aufbau eines Lipidmembransystems, das so ausgelegt ist, dass zwei wässrige Phasen voneinander geschieden werden, wie zum Beispiel bei geschlossenen Membranvesikeln (z.B. Liposomen), wo eine Ligationsstelle zur Exposition auf der einen Seite der Membran ausgewählt wird. Die Exposition einer Ligationsstelle kann weiter so angepasst werden, dass die Geschwindigkeit und/oder das Ausmass der Ligationsreaktion durch die Zugabe oder den Ausschluss von Reaktanten gesteuert wird, die die Lipidmatrix in verschiedenem Ausmass solubilisieren. Des Weiteren kann das Ausmass der Exposition und Reaktivität der Ligationsstelle gesteuert werden, indem Reaktionsbedingungen wie der pH-Wert und die Temperatur, die Wasserlöslichkeit des Ligationspeptids, der Wassergehalt und die Zusammensetzung der Lipidmatrix angepasst werden. So können die Spezifität und Geschwindigkeit der Ligationsreaktion in Abhängigkeit von der Lage und Orientierung der Ligationsstelle bezüglich der Lipidmembran, in die sie eingebettet ist, der Löslichkeit des Ligationsmarkers sowie der Integrität und Zusammensetzung der Lipidmatrix gesteuert werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiter ein Verfahren zur Bildung einer chemoselektiven Ligationsstelle in einem in eine Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptid durch Behandlung mit einem spaltenden Reagens, das das Polypeptid in direkter Nachbarschaft zu einem Aminosäurerest, der eine reaktive Gruppe für die chemische Ligation liefert, selektiv spaltet. Dieser Aspekt der Erfindung beinhaltet, ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid mit einem Reagens in Berührung zu bringen, das das Polypeptid an einer spezifischen Stelle selektiv so spaltet, dass ein Polypeptid erzeugt wird, das einen N-terminalen Rest mit einer ungeschützten Aminogruppe oder einen C-terminalen Rest mit einer ungeschützten Carboxylgruppe umfasst. Dieser Aspekt der Erfindung wird im Schema 2 beispielhaft dargestellt.
  • Schema 2
    • Spaltendes Reagens + Yn-R1-MP → R1-MPworin „Yn" eine Aminosäuresequenz darstellt, die eine Spaltstelle wie eine chemische oder Protease-Spaltstelle umfasst, die eine Spaltung in direkter Nachbarschaft zu dem Aminosäurerest ermöglicht, der die reaktive Gruppe R1 für die nachfolgende chemoselektive chemische Ligation zur Verfügung stellt.
  • Die Spaltstelle kann im Polypeptid natürlich vorhanden sein, oder das Polypeptid kann künstlich so hergestellt werden, dass es eine oder mehrere solcher Stellen enthält. Je nach seiner schlussendlichen, beabsichtigten Verwendung können auch, wenn gewünscht, eine oder mehrere Spaltstellen im Ligationsmarker vorhanden sein. Eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Spaltstelle ermöglicht daher die Erzeugung eines freien und ungeschützten N-terminalen und/oder C-terminalen Rests durch platzspezifische Proteolyse. Eine auf diese Weise erzeugte Ligationskomponente enthält daher einen Rest, der eine ungeschützte reaktive Gruppe besitzt, die den Verfahren der lipidmatrix-gestützten chemischen Ligation der Erfindung zugänglich ist. Es ist aus dem Schema 2 leicht ersichtlich, dass unter der Voraussetzung, dass nach der Spaltung das Spaltprodukt für eine lipidmatrix-gestützte chemoselektive chemische Ligation geeignet ist, eine oder mehrere Spaltstellen in einer jeglichen Kombination mit einer Ziel-Ligationskomponente der Erfindung eingebaut werden können.
  • Die Spaltstelle kann eine Protease- oder eine chemische Spaltstelle sein. Eine Spaltstelle wird während der Synthese des Polypeptids gewählt und/oder in das Polypeptid eingebaut, so dass das Polypeptid, wenn es dem komplementären spaltenden Reagens ausgesetzt wird, an dieser Stelle selektiv so gespalten wird, dass ein Polypeptid erzeugt wird, das einen freien, ungeschützten Aminosäurerest mit einer chemoselektiv reaktiven Gruppe besitzt, die für eine Ligation mit einer durch den Ligationsmarker zur Verfügung gestellten, komplementären reaktiven Gruppe kompatibel ist. Wenn beispielsweise eine native chemische Ligationschemie eingesetzt und eine Endopeptidasen-Spaltstellensequenz zwischen einer Linker- oder Verkappungssequenz und einem Cys-Polypeptid eingebaut wird, ermöglicht die Spaltstelle die Eliminierung der Linker- oder Verkappungssequenz und Erzeugung des gewünschten ungeschützten Cys-Polypeptids. Alternativ kann die Spaltstelle in Nachbarschaft zu einem Rest positioniert werden, der für eine spontane Ligation mit einer komplementären reaktiven Gruppe befähigt ist, die von einem geeignet positionierten benachbarten Rest geliefert wird.
  • Einige üblicherweise anzutreffende Proteasespaltstellen sind: Thrombin (Schlüssel ValProArg/GlySer); Faktor Xa-Protease (IleGluGlyArg); Enterokinase (AspAspAspAspLys); rTEV (GluAsnLeuTyrPheGln/Gly), d.h. eine rekombinante Endopeptidase aus dem Tabakätzvirus; und menschliche Rhinovirus-Protease 3C (Pharmacia Biotech) (LeuGluValLeuPheGln/GlyPro).
  • Weiter sind auch verschiedene chemische Spaltstellen bekannt, u.a. – aber nicht ausschliesslich – die Inteinelemente für die Proteinspleissung (Dalgaard und Mitautoren, Nucleic Acids Res. (1997) 25(6): 4626-4638) und die Cyanogenbromid-Spaltstellen. Inteine können synthetisiert werden, die nicht spleissen, sondern stattdessen die Peptidbindung an einer der Spleissstellen spalten (Xu und Mitautoren, EMBO J. (1996) 15(19): 5146-5153); und Chong und Mitautoren, J. Biol. Chem. (1996) 271: 22159-22168). Zum Beispiel kann die aus dem Saccharomyces cerevisiae-VMA1-Gen abgeleitete Inteinsequenz so modifiziert werden, dass sie bei niedrigen Temperaturen in Gegenwart von Thiolen wie 1,4-Dithiothreit (DTT), 2-Mercaptoethanol oder Cystein an ihrem N-Terminus eine Selbstspaltreaktion erleidet (Chong und Mitautoren, Gene (1997) 192: 271-281).
  • Cyanogenbromid (CnBr) spaltet bei internen Methionin-(Met-)resten einer Polypeptidsequenz. Die Spaltung mit CnBr liefert zwei oder mehr Fragmente, wobei die Fragmente, die C-terminale Reste aus dem Inneren der ursprünglichen Polypeptidsequenz enthalten, eine aktivierte α-Carboxylfunktionalität besitzen, z.B. liefert die Cyanogenbromidspaltung an einem internen Met-Rest ein Fragment mit einem C-terminalen Homoserin-Lacton. Bei einigen Polypeptiden setzen sich die Fragmente unter Faltungsbedingungen wieder zu einer gefalteten polypeptidartigen Struktur zusammen, die eine Reaktion zwischen den Segmenten begünstigt, so dass sich eine vernünftige Ausbeute (oft 40 bis 60 %) an Polypeptid der vollen Kettenlänge ergibt (das nunmehr Homoserinreste enthält, wo die der Cyanogenbromidspaltung unterworfenen Met-Reste gelegen hatten) (Woods und Mitautoren, J. Biol. Chem. (1996) 271: 32008-32015).
  • Allgemein wird eine Spaltstelle zur Erzeugung einer Ligationsstelle, die einer gewünschten chemischen Ligationschemie zugänglich ist, so gewählt, dass sie einzigartig ist, d.h. im Ziel-Polypeptid nur einmal vorhanden ist. Wenn in einem Ziel-Polypeptid aber mehr als eine Spaltstelle vorhanden ist, die durch das gleiche spaltende Reagens erkannt und gespalten wird, können eine oder mehrere solcher Stellen, wenn gewünscht, auf Dauer oder vorübergehend für den Zutritt des spaltenden Reagens blockiert und/oder während der Synthese eliminiert werden. Insbesondere kann die Lage der Spaltstelle gegenüber dem Angriff durch das spaltende Reagens gesteuert werden, indem seine Position in der Lipidmatrix genutzt wird, wie oben für die chemoselektive Ligationsstelle beschrieben. Spaltstellen können während der Synthese des Membran-Polypeptids eliminiert werden, indem ein oder mehrere Reste der Erkennungssequenz für das spaltende Reagens ersetzt, eingesetzt oder herausgenommen werden und/oder eine oder mehrere unnatürliche Aminosäuren eingebaut werden, die das gleiche Ergebnis erreichen. Eine Spaltstelle kann auch durch Agentien blockiert werden, die an das Membran-Polypeptid binden, darunter durch Liganden, die an das Polypeptid binden und die ganze Spaltstelle oder einen Teiles davon unzugänglich machen. Es ist aber, wie auch immer eine Spaltstelle blockiert oder eliminiert wird, für den normal befähigten Fachmann ersichtlich, dass das Verfahren so ausgewählt wird, dass nach einer Spaltung das Membran-Polypeptid für eine chemoselektive chemische Ligation mit einer interessanten Ziel-Ligationskomponente befähigt ist.
  • Der Einbezug einer Spaltstelle zur Erzeugung einer chemoselektiven Ligationsstelle ist besonders vorteilhaft, wenn das Membran-Polypeptid mit einer Leadersequenz vom Typ einer Verkappungs-, Signal- oder anderen Sequenz versehen ist, die die nötige Information enthält, um die Einfügung in eine Lipidmembran, die Einfügung in besonders gewählte Membranen, die Erkennung und/oder die Reinigung zu ermöglichen oder effektiver zu machen. Wenn zum Beispiel ein Membran-Polypeptid nach seiner Einbettung in eine Lipidmembranmatrix gespalten wird, ermöglicht dies eine Auswahl von zweckmässig gefalteten Polypeptiden wie auch die Eliminierung von Sequenzen, die dafür erforderlich sein mögen, die richtige Einfügung und Faltung einzuleiten, aber nicht mehr benötigt werden, nachdem eine hydrophobe Verankerungssequenz in die Lipidmatrix eingebettet worden ist. Die Spaltstelle kann auch zum Nachweis und/oder die Reinigung richtig eingebauter und gefalteter Polypeptide verwendet werden. Wenn zum Beispiel ein Membran-Polypeptid so ausgewählt wurde, dass es eine Spaltstelle umfasst, die für Exposition ausserhalb der Membran ausgelegt ist, dann weisen Polypeptide, die die geeignete Konfiguration in einer Lipidmembran und daher für die Exposition der Spaltstelle ausserhalb der Membran besitzen, wahrscheinlich die maximale Empfindlichkeit für die Spaltung auf, wenn ein wasserlösliches Spaltungsreagens wie zum Beispiel eine wasserlösliche Endoprotease unter wässrigen Bedingungen eingesetzt wird. Eine Spaltstelle für die Erzeugung einer chemoselektiven Ligationsstelle kann auch einbezogen werden, wenn ein Reinigungsgreifer oder -tag als Teil eines Fusions-Polypeptids einbezogen worden ist, um seine Reinigung nach der Synthese zu erleichtern. So kann der Einbezug einer Spaltstelle, die dafür ausgelegt ist, eine chemoselektive Ligationsstelle zu erzeugen, vielfach ausgenutzt werden.
  • Die Komponentenpaare von Membran-Polypeptiden und Ligationsmarkern, die für die durch Schemata 1 und 2 beispielhaft dargestellten chemischen Ligationswege geeignet sind, können de novo konstruiert oder aus praktisch jedem bekannten Membranproteinsystem abgeleitet werden, darunter denjenigen, die aus viralen, eukaryontischen, prokaryontischen und archaebakteriellen Systemen abgeleitet werden und psychrophile, mesophile sowie thermophile Organismen einschliessen, insbesondere den beiden Hauptklassen von Membranproteinen, nämlich denjenigen, die α-Helices in die Lipid-Doppelschicht einfügen, und denjenigen, die durch β-Barrelstränge Poren bilden. Beispiele sind u.a. mit der Membran assoziierte Rezeptoren, Transporterproteine (z.B. Ionen- und andere Kanäle wie Kalium-, Natrium-, Protonen- und Chloridkanäle und Poren; aktive Transporter wie die TEXAN-Drugtransporter, mini-TEXANs und ABC-Drugtransporter sowie Antiporter wie der H+/Glucose-Antiporter); Enzyme (z.B. Leukotrien C4-Synthase); und Immunogene (z.B. mit Tumormetastasen assoziiertes Antigen). Von besonderem Interesse sind an Enzyme geknüpfte Rezeptoren, fibronectinartige Rezeptoren, die Sieben-Transmembran-Rezeptoren sowie die Ionenkanal-Rezeptoren, darunter die Tyrosin- und Serin-Threonin-Kinasen sowie die Guanylatcyclase-Familien von enzym-verknüpften Rezeptoren. Beispiele für die Tyrosin-Kinase-Rezeptorenfamilie sind u.a. der epidermale Wachstumsfaktor, Insulin, der aus Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor und der Nervenwachstumsfaktor. Ein Beispiel für die Serin-Kinase-Rezeptorenfamilie ist u.a. die Familie des Wachstumsfaktors β. Beispiele der Guanylatcyclase-Familie sind u.a. diejenigen Rezeptoren, die als Reaktion auf atrionatriuretische Faktoren cyclische GMP (cGMP) erzeugen. Beispiele für die Sieben-Transmembran-Rezeptoren sind u.a. diejenigen Membranproteine, die Catecholamine, Histamine, Prostaglandine usw. binden, sowie die Opsin-, Vasopressin-, Chemokin- und Melanocortin-Rezeptoren. Beispiele für die Ionenkanal-Rezeptoren werden durch die Membranprotein-Rezeptoren der liganden- und spannungsgesteuerten Kanäle dargestellt und sind u.a. die durch Acetylcholin aktivierten Natriumkanäle, die durch Glycin und γ-Aminoisobuttersäure aktivierten Chloridkanäle sowie die durch Serotonin und Glutamat aktivierten Calciumkanäle, die Familie von durch cyclische Nukleotide gesteuerten Kanäle (cAMP und cGMP), die Famlie von Inosit-1,4,5-triphosphat (IP3) sowie die Rezeptoren für cyclische ADP-Ribose, die die Calciumspeicherung modulieren. Der normal befähigte Fachmann wird erkennen, dass Nucleinsäure- und/oder Aminosäuresequenzen für die obigen und weitere Membran-Polypeptide in verschiedenen Genom- und Protein-Datenbanken identifiziert werden können. Beispiele für öffentlich zugängliche Datenbanken sind u.a. Genbank (Benson und Mitautoren, Nucleic Acids Res. (1998) 26(1):1-7; U.S. National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), die TIGR-Datenbank (The Institute for Genomic Research, Rockville, MD, USA), die Protein Data Bank (Brookhaven National Laboratory, USA) sowie die Datenbanken ExPASy und Swiss-Protein (Schweizer Institut für Bioinformatik, Genf, Schweiz).
  • Bei der Auswahl der Komponentenpaare von Membran-Polypeptiden und Ligationsmarkern und ihren jeweiligen Ligationsstellen können komplementäre chemoselektive Paare durch eine Analyse der Struktur des Ziel-Polypeptids im Zusammenhang mit seiner Funktion identifiziert werden, indem eine oder mehrere Routineprozeduren wie die fachbekannten und hierin beschriebenen biologischen, thermodynamischen, Berechnungs- und Strukturmethoden verwendet werden. Diese Information wird verwendet, um eine oder mehrere chemoselektive Ligationsstellen auszuwählen, die in der nativen Struktur vorhanden sind und/oder künstlich in eine synthetische Form des Moleküls eingebaut werden. Struktur- und Funktionsinformation kann insbesondere unter Verwendung von Standardverfahren wie Homologievergleichen mit anderen Polypeptiden gewonnen werden, die ähnliche Aminosäuresequenzen und -domänen besitzen, bevorzugt mit anderen Polypeptiden, für die zumindest gewisse Struktur- und Funktionsdaten bekannt sind. Für eine beispielhafte Liste von Membran-Polypeptiden bekannter dreidimensionaler Struktur siehe Preusch und Mitautoren, Nature Struct. Biol. (1998) 5: 12-14.
  • Einzigartigkeit der Ligationsstelle, Stabilität der Ligationskomponenten, Spezifität und Vollständigkeit der Ligationsreaktion sowie die Stabilität und die Funktion des Ligationsprodukts des in die Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptids sind die beim Auswahlprozess in Betracht zu ziehenden Punkte. Insbesondere werden die Ligationskomponentenpaare bevorzugt so ausgelegt, dass die Selektivität der Ligationsreaktion und die Stabilität des Ligationsprodukts innerhalb der Lipidmatrix maximiert werden. Dazu gehört die Auslegung von Linker- oder Verkappungssequenzen mit einer oder mehreren Spaltstellen, die für den Einbau und die Erzeugung einer chemoselektiven Ligationsstelle einer Ligationskomponente in der Lipidmatrix verwendet werden. Zum Beispiel können Mutagenese-, thermodynamische, Rechen-, Modellierungs- und/oder alle möglichen Verfahren, die funktionelle und/oder strukturelle Information bezüglich eines interessanten Ziel-Polypeptids offenbaren, für diesen Zweck verwendet werden. Zu diesen Verfahren gehören immunologische und chromatographische Analysen, Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET), Circulardichroismus (CD), kernmagnetische Resonanz (NMR), Elektronen- und Röntgenkristallographie, Elektronenmikroskopie, Raman-Laserspektroskopie und dergleichen, die üblicherweise für die Auslegung und Charakterisierung von Membran-Polypeptidsystemen genutzt werden. (Siehe z.B. Newman, R., Methods Mod. Biol. (1996) 56: 365-387; Muller und Mitautoren, J. Struct. Biol. (1997) 119(2): 149-157; Fleming und Mitautoren, J. Mol. Biol. (1997) 272: 266-275; Haltia und Mitautoren, Biochemistry (1994) 33(32): 9731-9740; Swords und Mitautoren, Biochem. J. (1993) 289(1): 215-219; Wallin und Mitautoren, Protein Sci. (1997) 6(4): 808-815; Goormaghtigh und Mitautoren, Subcell Biochem. (1994) 23: 405-450; Muller und Mitautoren, Biophys. J. (1996) 70(4): 1796-1802; Sami und Mitautoren, Biochim. Biophys. Acta (1992) 1105(1): 148-154; Wang und Mitautoren, J. Mol. Biol. (1994) 237(1):1-4; Watts und Mitautoren, Mol. Memb. Biol. (1995) 12(3): 233-246; Bloom, M., Biophys. J. (1995) 69(5): 1631-1632; und Gutierrez-Merino und Mitautoren, Biochem. Soc. Trans. (1994) 22(3): 784-788.)
  • Wenn Strukturinformation nicht unmittelbar verfügbar ist, können chemoselektive chemische Ligationskomponenten mit verschiedenen, fachbekannten Verfahren identifiziert und in zwei Dimensionen modelliert werden. Zum Beispiel können amphipatische α-Helix-Segmente, die eine Lipidmembran-Doppelschicht durchspannen und somit grösser als etwa 15 bis 20 Reste sind, in der Primärstruktur identifiziert werden, indem Vorhersage-Algorithmen für die Sekundärstruktur verwendet werden. Segmente mit einer Grösse von mehr als 15 bis 20 Resten werden auf der Grundlage von Sequenzenähnlichkeit zwischen Mitgliedern einer Superfamilie ausgewählt, dann werden eine oder mehrere Ligationsstellen bezüglich ihrer Verträglichkeit mit einem Ligationsmarker identifiziert, der ein oder kein Teil des ursprünglichen zweidimensionalen Modells sein kann. (Siehe z.B. Reithmeier, R. A., Curr. Opin. Struct. Biol. (1995) 5(4): 491-500; Du und Mitautoren, Protein Eng. (1994) 7(10): 1221-1229.) Ein bevorzugtes Verfahren ist die Homologie-Modellierung mit Datenbanken-Alignments unter Heranziehung eines oder mehrerer Rechenprogramme, die für die Modellierung und/oder Vorhersage von Membran-Polypeptiden geeignet sind. Zum Beispiel können die Programme „TmPred" und „TopPredII" verwendet werden, um Vorhersagen über die die Membran überspannenden Bereiche und ihre Ausrichtung zu machen, was auf der statistischen Analyse einer Datenbank von Transmembranproteinen basiert, die in der SwissProt-Datenbank vorhanden sind (Gunnar von Heijne, J. Mod. Biol. (1992) 225: 487-494; Hoppe-Seyler, Biol. Chem. (1993) 347: 166; und Claros und Mitautoren, Comput. Appl. Biosci. (1994) 10(6): 685-686). Andere Programme können verwendet werden, darunter „DAS" (Cserzo und Mitautoren, Prot. Eng. (1997) 10(6): 673-676); „PHDhtm" (Rost und Mitautoren, Protein Science (1995) 4: 521-533); und „SOSUI" (Mitaku Laboratory, Department of Biotechnology, Tokyo University of Agriculture and Technology).
  • Die Ligationskomponenten und deren komplementäre Paare können auch ausgewählt werden, indem sie in drei Dimensionen auf der atomaren Ebene modelliert werden, um das ligierte Produkt und/oder die Komponenten vor der Ligationsreaktion zu simulieren. Erstens wird ein Sequenz-Alignment zwischen dem zu modellierenden Polypeptid und einem Polypeptid bekannter Struktur hergestellt. Zweitens wird auf der Basis dieses Alignments eine Hauptkettenstruktur erzeugt. Dies ist normalerweise die Hauptkette der homologesten Struktur, aber eine Hybridhauptkette kann auch verwendet werden. Drittens werden dann Seitenketten in das Modell eingefügt. Verschiedene Verfahren wie die Monte Carlo-Methode, Baumsuch-Algorithmen usw. können verwendet werden, um Rotomer-Seitenketten mit einer Vielzahl möglicher Konformationen zu modellieren. Wenn das zu modellierende Polypeptid Insertionen oder Deletionen gegenüber der bekannten Struktur besitzt, werden Schleifen erneut modelliert oder ab initio modelliert. Datenbanksuchen nach Schleifen mit ähnlichen Ankerpunkten in der Struktur werden oft verwendet, um diese Schleifen zu bauen, aber Verfahren einer auf Energie beruhenden Ab-initio-Modellierung können auch verwendet werden. Energieminimierungen, die oft mit Molekulardynamik kombiniert werden, werden dann normalerweise für eine Optimierung der schlussendlichen Struktur verwendet. Die Qualität des Modells wird dann u.a. durch direkte Betrachtung beurteilt, um sicherzustellen, dass sich die Strukturaspekte des Modells nicht im Widerspruch zu dem befinden, was über die funktionellen Aspekte des Moleküls bekannt ist.
  • Die dreidimensionalen Modelle werden bevorzugt unter Benutzung eines Rechenprogramms erzeugt, das für die Modellierung von Membran-Polypeptiden geeignet ist (Vriend, G., „Molecular Modeling of GPCRs", in: 7TM (1995), Band 5). Beispiele von Rechenprogrammen, die sich für diesen Zweck eignen, sind u.a.: „What If" (Vriend, G., J. Mol. Graph. (1990) 8: 52-56, verfügbar von EMBL, Meyerhofstrasse 1, 69117 Heidelberg, Deutschland) und „Swiss-Model" (Peitsch, M. C., und Herzyk, P., „Molecular Modeling of G-protein coupled receptors", in: G Protein-coupled Receptors. New opportunities for commercial development, 6: 6.29-6.37, N. Mulford und L. M. Savage, Hrsg., IBC Biomedical Library Series; Peitsch und Mitautoren, Receptors and Channels (1996) 4: 161-164; Peitsch und Mitautoren, „Large-scale comparative protein modeling", in: Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics, Seiten 177-186, M. R. Wilkins, K. L. Williams, R. O. Appel und D. F. Hochstrasser, Hrsg., Springer, 1997).
  • Faktoren, die die Lipidmatrix-gestützte chemoselektive Ligation und somit die Auswahl einer kompatiblen Ligationsstelle beeinflussen, sind allgemein den für lösliche Proteine bekannten ähnlich (Woods und Mitautoren, J. Biol. Chem. (1996) 271: 32008-32015). Erstens ist die Sekundärstruktur nicht von gravierender Bedeutung, indem die Ligationsstellen in den meisten α-Helices und β-Faltblättern einer Ligation zugänglich sind. Die Ligationsstellen an den meisten Haarnadelschleifen sind ebenfalls okay, obwohl Ligationsstellen, die dem Ende einer β-Haarnadelschleife entsprechen, weniger bevorzugt werden. Zweitens befindet sich eine Ligationsstelle bevorzugt auf der Oberfläche des gefalteten Polypeptids, nicht aber versunken oder im Inneren des gefalteten Polypeptids an denjenigen Stellen, die gebraucht werden, um die gefaltete Form des Polypeptids in der Lipidumgebung zu stabilisieren.
  • Dementsprechend werden bei der Auswahl der chemoselektiven Ligationskomponenten und komplementären Paare dafür auch die thermodynamischen Kosten in Betracht gezogen, mit denen geladene oder stark polare, ungeladene Verbindungen dem ölartigen Kohlenwasserstoff-Innenraum der Membranen dargeboten und/oder dahinein überführt werden. Zum Beispiel wird die Lage einer Ligationsstelle wie der zur Erzeugung eines in eine Lipidmatrix eingebetteten Memban-Polypeptids durch platzspezifische Spaltung ausgelegten nicht nur für die Selektivität der Ligation ausgelegt, sondern auch dafür, dass die Vorläufer- und schlussendlichen Ligationsprodukte in der Lipidmatrix stabil genug sind. In diesem Aspekt der Erfindung müssen die meisten Aminosäure-Seitenketten der Transmembransegmente unpolar sein (z.B. Ala, Val, Leu, Ile, Phe). So werden Positionen für Reste, die einen natürlich vorkommenden Ligationsstellenrest besitzen oder für eine künstliche Substitution oder Einfügung eines Ligationsstellenrests bestimmt worden sind, so ausgewählt, dass sie die günstigen hydrophoben Wechselwirkungen wie die zwischen den α-Helix-Membranankern vorliegenden hydrophoben Packungswechselwirkungen behalten. Zusätzlich werden die sehr polaren CONH-Gruppen (die Peptidbindungen) der Polypeptid-Hauptkette von Transmembransegmenten ausgewählt, um an Wasserstoffbrückenbindungen (H-Bindungen) beteiligt zu sein, um die Kosten für ihre Überführung ins Innere des Kohlenwasserstoffs zu senken (siehe z.B. Roseman, A., J. Mol. Biol. (1988) 201: 621-625). So wird bei der Auswahl einer kompatiblen Ligationsstelle diese H-Bindung am leichtesten erreicht, indem die α-Helices erhalten werden, bei denen alle Peptidbindungen intern Wasserstoffbrücken besitzen. Sie kann ebenfalls dadurch erreicht werden, dass die β-Faltblätter für Transmembranproteine des Porintyps erhalten werden, vorausgesetzt, dass die β-Stränge geschlossene Strukturen wie das β-Barrel bilden. Da alle Membran-Polypeptide bekannter dreidimensionaler Struktur diesen Prinzipien gehorchen, können die chemoselektiven chemischen Ligationsstellen ausgewählt und/oder ausgelegt werden, diesen Prinzipien zu gehorchen, wenn ein gefaltetes Transmembran-Polypeptid gewünscht wird. In einigen Fällen können geeignet platzierte, positiv geladene Lysinreste verwendet werden, um die Gesamtausrichtung der Membran zu steuern (Whitley und Mitautoren, Nat. Struct. Biol. (1994) 1(12): 858-862).
  • Kompatible Ligationskomponentenpartner und ihre chemoselektiven chemischen Ligationsstellen können auch durch ein Scanning der Ligationsstellen identifiziert werden. Dies beinhaltet ein genetisches Vorgehen, um Aminosäurereste, die einer spezifischen Ligationschemie zugänglich sind, durch platzspezifische, nested (verschachtelte) und/oder zufallsbestimmte Mutagenese in einem Zell- oder zellfreien System in DNA einzuführen, die für ein interessierendes Ziel-Membran-Polypeptid oder eine interessierende Domäne davon kodiert, danach die mutierte DNA zu exprimieren und nach Membran-Polypeptiden zu screenen, die ligationskompatible funktionelle Substitutionen oder Insertionen enthalten. Alternativ können mutierte Membran-Polypeptide chemisch synthetisiert werden, oder eine Kombination von genetischer und chemischer Synthese kann verwendet werden. Gleichviel ob rekombinante DNA und/oder chemische Synthese eingesetzt wird, enthalten die einem Screening nach Ligationsstellen unterworfenen Polypeptide bevorzugt zumindest ein Membran-Verankerungssegment, das zur Einfügung in eine Lipidmembran befähigt ist, z.B. ein die Membran durchspannendes Segment oder eine Transmembran-Polypeptiddomäne. Membran-Polypeptide und Ligationsmarker, die eine oder mehrere funktionelle Mutationen umfassen, werden dann synthetisiert, um ein oder mehrere kompatible Paare für die chemoselektive Ligation zu erzeugen, wie sie beispielhaft in den Schemata 1 und 2 gezeigt sind. Die Ligationskomponenten werden dann der geeigneten, interessierenden Ligationschemie unterworfen und auf ligierte Membran-Polypeptide hin gescreent, die korrekt in die Lipidmatrix eintreten und darin falten.
  • Das Scanning von Ligationsstellen ermöglicht nicht nur ein rasches Screening einer grossen Anzahl von kompatiblen Ligationskomponenten, sondern auch ein rasches Screening für neuartige und unterschiedliche rekombinante, synthetische und halbsynthetische Moleküle, die durch neue Kombinationen von Membran-Polypeptid- und Ligationsmarker- Komponentenpaaren gebildet werden. Zum Beispiel können die Membran-Polypeptid- und Ligationsmarker-Komponenten aus Gemischen oder Bibliotheken erhalten werden, die eine Vielfalt chemischer Strukturen wie unterschiedliche Aminosäuresequenzen wie auch unterschiedliche, unnatürliche Seitenkettensubstituenten darstellen. Eine Bibliothek kann bestimmte Sätze von Peptiden oder Polypeptiden enthalten, die eine unterschiedliche chemische Einheit an einer spezifischen Position enthalten, sowie/oder andere, die sich zufallsbedingt unterscheiden. Solche Komponenten können rekombinant exprimiert, aus Phagen-Display-Bibliotheken oder aus einer chemischen Synthese abgeleitet sein oder Fragmente und Kombinationen davon darstellen. Bibliotheken von modularen Crossover-Membran-Polypeptiden und -Ligationskomponenten können auch aufgebaut werden, indem das bei Kent und Mitautoren, WO 99/11655, beschriebene Vorgehen eingeschlagen wird. In dieser Ausführungsform der Erfindung werden in eine Lipidmatrix eingebettete Membran-Polypeptide durch eine chemoselektive chemische Crossover-Ligation von zwei oder mehr Peptidsegmenten erzeugt, die einen oder mehrere funktionelle Proteinmoduln umfassen, die von unterschiedlichen Membran-Stammpolypeptiden der gleichen Klasse oder Familie abgeleitet sind, um ein oder mehrere in eine Lipidmatrix eingebettete hybride Membran-Polypeptide zu erzeugen. Dies ermöglicht die Einführung funktioneller Domänen und dergleichen, die von verschiedenen Mitgliedern der gleichen Klasse oder Familie von Membran-Polypeptiden stammen, um eine grosse Vielfalt von Bibliotheken zu schaffen, u.a. für Ligationsstelleninformation und für Struktur-Funktions-Information. Es ist ersichtlich, dass ein rasches Screening und eine Auswahl einer oder mehrerer Ligationskomponentenpaare durch Scanning von Ligationsstellen daher besonders geeignet sind, um vielfältige, kompatible Kombinationen der in den obigen Schemata 1 und 2 veranschaulichten Reaktionskomponenten zu identifizieren.
  • Für die Synthese der Ligationskomponenten kann eine beliebige Anzahl der fachbekannten Verfahren eingesetzt werden. Dazu gehören chemische und biologische Verfahren oder deren Kombinationen. Zum Beispiel kann eine Nucleinsäuresequenz, die für einen Teil einer Ligationskomponente oder die ganze Ligationskomponente kodiert, in einer Wirtszelle exprimiert und unter Verwendung von Standardverfahren und/oder den hierin beschriebenen Verfahren ausgebracht werden. Dieses Vorgehen ist besonders nützlich, wenn sich ein Membran-Polypeptid hartnäckig der alleinigen chemischen Synthese widersetzt. Peptide oder Polypeptide können auch erzeugt werden, indem chemische Verfahren verwendet werden, um die gewünschte Ligationskomponente ganz oder teilweise zu synthetisieren.
  • Für eine Synthese in Zellen können Polypeptide durch Standardverfahren erzeugt werden. Zellen, die ein Ziel-Polypeptid natürlich exprimieren, können eingesetzt werden. Eine Transfizierung und Transformation einer Wirtszelle mit DNA, die für ein interessierendes Polypeptid kodiert, kann auch verwendet werden. Zum Beispiel kann eine auf Polymerase-Kettenreaction (PCR: polymerase chain reaction) beruhende Strategie verwendet werden, um eine Ziel-DNA-Sequenz zu klonieren, die für ein interessierendes Ziel-Membran-Polypeptid ganz oder teilweise kodiert. (Siehe z.B.: PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic Engineering, B. A. White, Hrsg., Humana Press, Methods in Molecular Biology, Vol. 67, 1997.) Zum Beispiel kann PCR für ein Klonieren durch differentielle und subtraktive Verfahren der cDNA-Analyse, die Durchführung und Optimierung von Long-distance PCR, die Klonierung unbekannter Nachbar-DNA sowie den Aufbau und das Screening von Bibliotheken verwendet werden. Auch kann PCR verwendet werden, um platzspezifische und zufallsbedingte Mutationen in DNA einzuführen, die für ein interessierendes Ziel-Membran-Polypeptid und/oder einen interessierenden Ligationsmarker kodiert. Dieses Vorgehen eignet sich besonders für die künstliche Herstellung von Cystein-Ligationsstellen.
  • Für allgemeine Klonierungszwecke können komplementäre und/oder degenerierte Oligonukleotide, die konservierten Motiven der Ziel-Membran-Polypeptide entsprechen, dazu ausgelegt werden, als Primer in einer cDNA- und/oder PCR-Reaktion zu dienen. Schablonen für Primer-Auslegung können von einer Anzahl von Quellen bezogen werden. Zum Beispiel können Sequenzen, die exprimierte Sequenztags (EST) enthalten, von verschiedenen Datenbanken wie GenBank, TIGR, ExPASy und Swiss-Protein bezogen werden. Homologie-Vergleiche können durchgeführt werden, indem eines aus einer Anzahl von leicht verfügbaren Alignment-Programmen herangezogen wird, die mit Suchmaschinen arbeiten, um auf der Basis unterschiedlicher Algorithmen die besten Primer in einer Sequenz" zu finden. Eine Anzahl von Sequenzanalyse-Paketen wie Lasergene, GeneWorks, DNASIS, Gene Jockey II, Gene Construction Kit, MacPlasmap, Plasmid ARTIST, Protein Predictor, DNA/RNA Builder und Quanta sind im Handel erhältlich. (Siehe z.B.: Sequence Data Analysis Guidebook, Simon R. Swindell, Hrsg., Humana Press, 1996.) Die Information kann verwendet werden, um degenerierte Primer, nested/Multiplex-Primer, site-direc ted (platzgerichtete) Mutagenese, Restriktions-Enzymplätze usw. auszulegen. Primer können aus Homologieinformation heraus ausgelegt werden, und Rechenprogramme können ebenfalls für die Auslegung von Primern verwendet werden. „Primer Premier 4.0" (Clone-Tech, Inc.) ist eines der Beispiele für eine automatische Primerauswahl. Die amplifizierte cDNA und/oder das amplifizierte PCR-Fragment können verwendet werden, um Klone voller Länge durch radioaktive oder nicht radioaktive Markierung des amplifizierten Fragments und Screening einer Bibliothek zu isolieren.
  • Alternativ kann geklonte Membran-Polypeptid-DNA von der einen Quelle verwendet werden, um die entsprechende Ziel-Membran-Polypeptid-DNA-Sequenz von anderen Quellen zu erhalten. Konkret kann eine Genom- und/oder cDNA-Bibliothek, die aus DNA und/oder RNA aufgebaut wurde, die durch eine Zelle hergestellt wurden, von der bekannt ist, dass sie das Ziel-Membran-Polypeptid exprimiert, dazu verwendet werden, eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle, der das putative Gen fehlt, zu transformieren. Man würde erwarten, dass die Transformation eines rekombinanten, für das Polypeptid kodierenden Plasmids in eine defiziente Wirtszelle die Zelle mit einem komplementären Produkt versieht, das dem interessierenden Polypeptid entspricht. In einigen Fällen kann eine Wirtszelle dafür ausgewählt werden, einen spezifischen, mit dem Ziel-Polypeptid assoziierten Phänotyp zu exprimieren, und kann somit durch diese Eigenschaft ausgewählt werden. Für einen Übersichtsartikel zu Klonierungsstrategien, die benutzt werden können, siehe z.B. Sambrook und Mitautoren, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1989); und Ausubel und Mitautoren, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, New York (1989).
  • Um ein Ziel-Membran-Polypeptid in einer Wirtszelle zu exprimieren, wird die Nukleotidsequenz, die für das Polypeptid kodiert, oder eine funktionell gleichwertige Einheit für einen modularen Zusammenbau, wie sie oben beschrieben wurde, in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, d.h. einen Vektor, der die für die Transkription und Translation der eingefügten Kodiersequenz erforderlichen Elemente enthält. Wirtszellen, die die Kodiersequenz enthalten und das Ziel-Genprodukt exprimieren, können mit Standardverfahren identifiziert werden. Diese sind beispielsweise, aber nicht ausschliesslich die DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung; das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von „Marker" genfunktionen; eine Beurteilung des Ausmasses der Transkription durch Messungen der Expression von mRNA-Transkripts in der Wirtszelle; und der Nachweis des Genprodukts durch eine Immunoassay- oder biologische Aktivitätsmessung.
  • Wenn ein Klon, der das Ziel-Polypeptid erzeugt, identifiziert worden ist, kann er expandiert und verwendet werden, um grosse Mengen des Polypeptids zu erzeugen, das dann mit fachbekannten Verfahren gereinigt werden kann, darunter – aber nicht ausschliesslich – die Immunaffinitätsreinigung, chromatographische Verfahren wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder die Kationenaustausch-Chromatographie, die auf der Affinität des Polypeptids für einen spezifischen Liganden beruhende Affinitätschromatographie, eine Immunaffinitätsreinigung unter Verwendung von Antikörpern und dergleichen. Zum Beispiel können nach ihrer Expression in einer Wirtszelle die Extraktion und Reinigung der Membran-Polypeptide mit Standardverfahren ausgeführt werden (Ohlendieck, K., Methods Mol. Biol. (1996) 59: 313-322; Ohlendieck, K., Methods Mol. Biol. (1996) 59: 293-304; Josic und Mitautoren, Methods Enzymol. (1996), 271: 113-134). Somit werden in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung Nucleinsäuren zur Verfügung gestellt, die für rekombinante Membran-Polypeptide kodieren, die so modifiziert sind, dass sie einen oder mehrere synthetisch erzeugte Ligationsstellenreste enthalten, die dafür ausgelegt sind, einer chemischen Ligation zugänglich zu sein.
  • Einige Wirtszellensysteme, die gewöhlich dafür verwendet werden, Membran-Polypeptide zu exprimieren und auszubringen, sind u.a. E. coli, Xenopus-Oozyten, Bakulovirus, Vakzinia und Hefe sowie viele höhere Eukaryonten einschliesslich transgener Zellen in Kulturen und in ganzen Tieren und Pflanzen. (Siehe z.B. G. W. Gould, Membrane Protein Expression Systems: A User's Guide, Portland Press, 1994, Rocky S. Tuan, Hrsg.; und Recombinant Gene Expression Protocols, Humana Press, 1996.) Hefe-Expressionssysteme sind zum Beispiel gut bekannt und können verwendet werden, um interessierende Ziel-Membran-Polypeptide nach Standardprotokollen zu exprimieren und auszubringen. (Siehe z.B. Nekrasova und Mitautoren, Eur. J. Biochem. (1996) 238: 28-37; Gene Expression Technology (1990), Band 185 von Methods in Enzymology; Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts, CRC Press, Inc. (1992); Herescovics und Mitautoren, FASEB (1993) 7: 540-550; Larriba, G., Yeast (1993) 9: 441-463; Buckholz, R. G., Curr. Opin. Biotech. (1993) 4: 538-542; Asenjo und Mitautoren, An Expert System for Selection and Synthesis of Protein Purification Processes, Frontiers in Bioprocessing II, Seiten 358-379, American Chemical Society (1992); Mackett, M., Ex pression of Membrane Proteins in Yeast Membrane Protein Expression Systems: A Users Guide, Seiten 177-218, Portland Press (1995).) Wenn chemische Synthese eingesetzt wird, können die Peptide oder Polypeptide linear, cyclisch oder verzweigt sein und oft, aber nicht ausschliesslich, aus den 20 genetisch kodierten L-Aminosäuren bestehen. Eine In-vitro-Suppressionsmutagenese in einem zellfreien System kann auch dafür verwendet werden, unnatürliche Aminosäuren in die Polypeptide einzuführen (siehe z.B. Cload und Mitautoren, Chemistry and Biology (1996) 3: 1033-1038; und Turcatti und Mitautoren, J. Biol. Chem. (1996) 271: 19991-19998). Derartige chemisch-synthetische Verfahren ermöglichen auch den Einbau von neuartigen oder ungewöhnlichen chemischen Gruppen, darunter D-Aminosäuen, anderen unnatürlichen Aminosäuren, Oxim-, Hydrazon-, Ether-, Thiazolidin-, Oxazolidin-, Ester- oder Alkyl-Hauptkettenbindungen anstelle der normalen Amidbindung, N- oder C-Alkyl-Substituenten, Seitenkettenmodifikationen sowie Behinderungen wie Disulfidbrücken und Seitenketten-Amid- oder Esterverknüpfungen. Siehe z.B. Wilkins und Mitautoren, Curr. Opin. Biotech. (1998) 9(4): 412-426, die eine Übersicht über die verschiedenen Chemien für die chemische Synthese von Peptiden und Polypeptiden geben.
  • Die native chemische Ligation und Synthese von Polypeptiden mit einer nativen Peptid-Hauptkettenstruktur werden in Kent und Mitautoren, WO 96/34878, offenbart. Siehe auch Dawson und Mitautoren, Science (1994) 266: 776-779; und Tam und Mitautoren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 12485-12489. Unnatürliche Peptid-Hauptketten können auch mit bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. Schnolzer und Mitautoren, Science (1992) 256: 221-225; Rose und Mitautoren, J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 30-34; Liu und Mitautoren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 6584-6588; Englebretsen und Mitautoren, Tet. Letts. (1995) 36(48): 8871-8874; Gaertner und Mitautoren, Bioconj. Chem. (1994) 5(4): 333-338; Zhang und Mitautoren, Proc. Natl. Acad Sci. USA (1998) 95(16): 9184-9189; und Tam und Mitautoren, WO 95/00846). Die erweiterte allgemeine chemische Ligation und Synthese, wie sie in Kent und Mitautoren, WO 98/28434. offenbart werden, können ebenfalls eingesetzt werden.
  • Zusätzlich werden Schnellverfahren der Synthese zusammengesetzter Palypeptide durch die chemische Ligation von drei oder mehr ungeschützten Peptidsegmenten unter Verwendung eines festen Trägers, wobei keine der reaktiven Funktionalitäten auf den Peptidsegmenten vorübergehend durch eine Schutzgruppe maskiert werden muss und wo bei verbesserte Ausbeuten und eine erleichterte Handhabung der Zwischenprodukte verzeichnet werden, in Canne und Mitautoren, WO 98/56807, beschrieben. Kurz gesagt, beinhaltet dieses Verfahren die sequentielle chemische Festphasenligation von Peptidsegmenten in einer Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus, wobei das erste an die feste Phase gebundene, ungeschützte Peptidsegment einen C-terminalen α-Thioester trägt, der mit einem weiteren ungeschützten Peptidsegment reagiert, das ein N-terminales Cystein und eine C-terminale Thiosäure enthält. Die Verfahren erlauben eine native chemische Festphasenligation auch in der Richtung vom C- zum N-Terminus. Grosse Polypeptide können ebenfalls durch eine chemische Ligation von Peptidsegmenten in wässriger Lösung auf einem festen Träger synthetisiert werden, ohne dass Schutzgruppen auf den Peptidsegmenten nötig wären. Eine Vielfalt von Peptidsynthesizern für den Batchbetrieb und für eine Arbeit im kontinuierlichen Durchfluss wie auch für eine Synthese mehrerer Peptide im gleichen Ansatz sind im Handel erhältlich und leicht zu automatisieren.
  • Eine Ligationskomponente kann auch so ausgewählt werden, dass sie Gruppen enthält, die die Reinigung und/oder den Nachweis erleichtern und/oder vereinfachen. Zum Beispiel können für diesen Zweck Reinigungsgreifer oder -tags verwendet werden, die an eine Affinitätsmatrix binden. Viele solcher Gruppen sind bekannt und können über eine chemische Modifizierung nach der Synthese und/oder während der Synthese eingeführt werden. (Siehe, z.B., Protein Purification Protocols (1996), S. Doonan, Hrsg., Humana Press Inc.; Schriemer und Mitautoren, Anal. Chem. (1998) 70(8): 1569-1575; Evangelista und Mitautoren, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. (1997) 699(1-2): 383-401; Kaufmann, M., J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. (1997) 699(1-2): 347-369; Nilsson und Mitautoren, Protein Expr. Purif. (1997) 11(1):1-16; Lanfermeijer und Mitautoren, Protein Expr. Purif. (1998) 12(1): 29-37.) Zum Beispiel können eine oder mehrere unnatürliche Aminosäuren, die eine chemische Gruppe besitzen, die eine spezifische Eigenschaft verleiht, die für die Reinigung genutzt werden kann, während der Synthese eingebaut werden. Reinigungssequenzen können auch durch rekombinante DNA-Verfahren eingebaut werden. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, eine chemische oder Protease-Spaltstelle einzubeziehen, um das Tag je nach seiner Eigenheit und der beabsichtigten Endbestimmung zu eliminieren. Eine unnatürliche Aminosäure oder eine chemisch modifizierte Aminosäure kann auch eingesetzt werden, um den Nachweis zu erleichtern, zum Beispiel durch Einbau eines Chromophors, eines Haptens oder einer biotinylierten Gruppe, die durch Fluoreszenzspektroskopie, Immunoassays und/oder MALDI-Massenspektrometrie nachgewiesen werden können.
  • Die Homogenität und strukturelle Identität der gewünschten Syntheseprodukte der Membran-Polypeptid- und Ligationsmarkerkomponente können mit allen möglichen Mitteln wie Immunoassay, Fluoreszenzspektroskopie, Gel-Elektrophorese, HPLC unter Einsatz von Umkehrphasen- oder Ionenaustauschsäulen, Aminosäure-Analyse, Massenspektrometrie, Kristallographie, NMR und dergleichen bestätigt werden. Die Positionen eventuell vorliegender Aminosäuremodifikationen, -insertionen und/oder -deletionen können durch Sequenzierung entweder mit chemischen Verfahren (Edman-Chemie) oder mit Tandem-Massenspektrometrie identifiziert werden.
  • Die Lipidmatrixkomponente kann natürliche und/oder synthetische Lipide umfassen, die zur Bildung einer lyotropen Phase befähigt sind (z.B. einer flüssigkristallinen Phase bei Wechselwirkung mit Wasser). Von besonderem Interesse sind polare Lipide wie Phospholipide, Lysophospholipide, Sphingolipide und Glykolipide, die in der Lage sind, lamellare Doppelschichten und andere Lipidaggregate zu bilden, darunter Lipidmischungen, die in der Lage sind, eine lyotrope kristalline Phase zu bilden. Beispiele solcher Lipide sind u.a. und nicht ausschliesslich: unlösliche nicht schwellende Amphiphile, unlösliche schwellende Amphiphile und verschiedene lösliche Amphiphile, die in der Lage sind, lyotrope flüssigkristalline Phasen zu bilden. Beispiele unlöslicher, nicht schwellender Amphiphile sind u.a. Triglyceride, Diglyceride, langkettige protonierte Fettsäuren, langkettige normale Alkohole, langkettige normale Amine, langkettige Aldehyde, Phytole, Retinole, Vitamin A, Vitamin K, Vitamin E, Cholesterin, Desmosterin, Sitosterin, Vitamin D, nicht ionisierte Phosphatidsäure, Sterinester sehr kurzkettiger Säuren, Wachse, in denen entweder die Säure- oder die Alkoholgruppe kürzer als vier Kohlenstoffatome ist (z.B. Methyloleat), und Ceremide. Beispiele unlöslicher schwellender Amphiphile sind u.a. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit, Sphingomyelin, Cardiolipid, Plasmalogene, ionisiere Phosphatidsäure, Cerebroside, Phosphatidylserin, Monoglyceride, Säureseifen, α-Hydroxyfettsäuren, Glycerinmonoether, Mischungen von Phospholipiden und Glykolipiden, die aus Zellmembranen oder zellulären Organellen extrahiert werden (Pflanzenglykolipide und Sulfolipide), Sulfocerebroside und Sphingosin (in der Basenform). Beispiele löslicher Amphiphile, die zur Bildung lyotroper flüssigkristalliner Phasen befähigt sind, sind u.a. Natrium- und Kaliumsalze langkettiger Fettsäuren, viele der gewöhnlichen anionischen, kationischen und nichtionischen Tenside, Lysolecithin, Palmitoyl- und Oleyl-Coenzym A sowie andere langkettige Thioester von Coenzym A, Ganglioside und Sphingosin (in der Säureform).
  • Bevorzugte Lipidmatrizen bilden stabile Membran-Mono- oder Doppelschichten und deren aggregierte Phasen. Von besonderem Interesse sind Lipide, die stabile kubische Phasen bilden, auch als eine kubische Lipidphase oder CLP-Matrix bezeichnet (Lindblom und Mitautoren, a.a.O.). Beispiele von Lipiden, die zur Bildung kubischer Phasen befähigt sind, sind u.a., aber nicht ausschliesslich, die folgenden Lipide: Phosphatidylcholin (PC); Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC); 1-Palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholin (POPC); Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC); Dilineoleylphosphatidylcholin (DliPC); Lysophosphatidylcholin (LPC); 1-Palmitoyl-LPC (PaLPC); 1-Oleoyl-LPC (OILPC); 1-Monoolein (MO); Phosphatidylethanolamin (PE); Plasmenylethanolamin (PalE); Glycerinacetal des Plasmenylethanolamins (GAPlaE); Didodecylphosphatidylethanolamin (DDPE); Dielaidoylphosphatidylethanolamin (DEPE); Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE); Dilineoleoylphosphatidylethanolamin (DliPE); Dioleoylphosphatidyl-N-monomethyl-ethylethanolamin (DOPE-Me); Diphosphatidylglycerin (DPG); Phosphatidylglycerin (PG); Phosphatidylserin (PS); Phosphatidylinosit (PI); Monoglucosyldiacylglycerin (MgluDG); Monogalactosyldiacylglycerin (MgalDG); Diglucosyldiacylglycerin (DgluDG); Digalactosyldiacylglycerin (DgalDG); Dioleoylmonoglucosyldiacylglycerin (DOMGluDG); Dioleoyldiglucosyldiacylglycerin (DODGluDG); Glycerindialkylnonitol-tetraether (GDNT); und eine Glycerin-Lipid-Mischung aus 70 % GDNT mit β-D-Glycopyranose, mit der Nonitolgruppe verknüpft, und 30 % Glycerindialkylglycerin-tetraether mit β-D-Galactopyranosyl-β-D-Galactopyranose, mit einer der Glyceringruppen verknüpft (GL).
  • Die Hydratation, Temperatur und Lipidzusammensetzung können variiert werden, um die Flüssigkristallstruktur einer Lipidmatrix zu modulieren. Zum Beispiel bilden Lipidsysteme der kubischen Phase, die Mischungen von MO mit 1-Palmitoyl-2-oleoyl-3-phosphatidylserin (PaOlPS) und DEPE/Alamethicin enthalten, innerhalb bestimmter Konzentrationsverhältnisse und Temperaturbereiche unter voll hydratisierten Bedingungen bikontinuierliche kubische Phasen. Dagegen existiert DOPE mit bis zu 10 Molprozent PaOlPS bei Zimmertemperatur in der hexagonalen Phase. So können Temperatur und Zusammensetzung der Lipidmembran verwendet werden, um die kristalline Phase zu steuern. Solche Parameter sind für viele Lipidsysteme bekannt oder können mit verschiedenen fachbe kannten Methodenbestimmt werden, darunter Prüfungen mit einer Serie von Mischungen mit verschiedenen Konzentrationen spezifischer Lipidkomponenten und Wasser und deren Vergleich über einen Bereich von Temperaturen. Speziellere Verfahren können auch eingesetzt werden, um die kubischen Phasen eines bestimmten Lipid/Wasser-Systems fein abzustimmen, zum Beispiel eine Bestimmung von Phasendiagrammen, Röntgenbeugung, NMR, Polarisationslichtmikroskopie und dergleichen (Lindblom und Mitautoren, a.a.O.).
  • Lipide, die zur Bildung kubischer Phasen befähigt sind, die einen bestimmten Wassergehalt in Gewichtsprozent (Gew.%) und eine minimale Temperatur (°C) für die Bildung der kubischen Phase besitzen, sind u.a. – aber nicht ausschliesslich – die folgenden Lipid/Wasser-Systeme: MO mit 12-40 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 20 °C; PaLPC mit 40-46 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 25 °C; OILPC mit 20-25 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 25 °C; Ei-PC mit 0-4 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 75 °C; DOPC mit 2-11 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 60 °C; DliPC mit 4 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 55 °C; Ei-PC + 22-35 Gew.% Natriumcholat mit 22-26 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 22 °C; Ei-PC + 75-80 Gew.% Diacylglycerin mit einem Überschuss von Wasser und einem Temperaturminimum von 10 °C; Ei-PC + 85 Gew.% DliPE mit einem Überschuss von Wasser und einem Temperaturminimum von 40 °C; DOPE mit 67 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 25 °C; DOPE-Me mit 67 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 25 °C; DOPC + 0-50 Gew.% DOPE mit einem Wassergehalt von 10 Gew.% und einem Temperaturminimum von 70 °C; POPC + 85-90 Gew.% DliPE mit 29-41 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 7 °C; PE aus P. regina mit einem Wassergehalt von 35-50 Gew.% und einem Temperaturminimum von 40 °C; PE aus B. megaterium mit 8 bis 26 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 58 °C; DDPE mit einem Wassergehalt von 10-16 Gew.% oder von mehr als 33 Gew.% und einem Temperaturminimum von 75 °C bzw. 115 °C; DPG aus Rinderherz + 29 Gew.% Dibucan mit 41 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 7 °C; Natriumsulfatid aus dem menschlichen Hirn mit 40-70 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 20 °C; DOMGluDG aus A. laidlawii mit 7-15 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 0 °C; DOMGluDG + 51 Gew.% DODGluDG aus A. laidlawii mit 10 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 25 °C; MgalDG + 31 Gew.% DgalDG aus Maischloroplasten mit 10-20 % Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 60 °C; MgalDG 34-50 Gew. + DgalDG aus Weizenchloroplasten mit einem Wassergehalt von 3-15 Gew.% und einem Temperaturminimum von 10 °C; GDNT mit 7-13 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 15 °C; GL mit 0-11 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 60 °C; polare Lipide aus A. laidlawii mit 18 Gew.% Wassergehalt und einem Temperaturminimum von 65 °C; und polare Lipide aus S. solfactaricus mit einem Wassergehalt von 20 oder 40 Gew.% und einem Temperaturminimum von 85 °C (Lindblom und Mitautoren, a.a.O.).
  • Die Lipide können von unterschiedlichen Quellen bezogen werden, darunter Quellen des Handels, oder nach fachbekannten Standardverfahren als Micellen, Liposomvesikel, CLP-Matrizen oder kontinuierliche lamellare Membranen aus Zellen erzeugt und gereinigt werden. (Siehe z.B. Small, D. M. (1986), „The physical chemistry of lipids from alkenes to phospholipids", in: Handbook of Lipid Research, Band 4, Seiten 1-672, D. Haccham, Hrsg., Plenum Press, New York; Winterhalter und Mitautoren, Chem. Phys. Lipids (1993) 64(1-3): 35-43; McNamee, M. G., Biotechniques (1989) 7(5): 466-475; Albertsson und Mitautoren, Methods Biochem. Anal. (1982) 28: 115-150; Graham, J. M., Methods Mol. Biol. (1993) 19: 97-108; Kinne-Saffran und Mitautoren, Methods Enzymol. (1989) 172: 3-17; Larsson, K., J. Phys. Chem. (1989) 93: 7304-7314; Zumbuehl und Mitautoren, Biochim. Biophys. Acta (1981) 640: 252-262; Erikson und Mitautoren, J. Phys. Chem. (1985) 91: 846; Seddon und Mitautoren, Prog. Colloid Polym. Sci. (1990) 81: 189; und US-Patent Nr. 5 554 650.)
  • Eine Lipidmatrix für den Einbau eines Membran-Polypeptids wird nach ihrer Verträglichkeit mit dem Polypeptid ausgewählt. Insbesondere wird ein Membran-Polypeptid, von dem bekannt ist, dass es über einen spezifischen Temperaturbereich stabil ist, für den Einbau in eine Lipidmatrix ausgewählt, die ein kompatibles Temperaturprofil besitzt. Wenn beispielsweise eine CLP-Matrix verwendet wird, wird das Temperaturprofil für die Bildung der kubischen Phase so gewählt, dass es mit dem Einbau und der Stabilität des Membran-Polypeptids kompatibel ist. Eine CLP mit einem MO/Wasser-System ist für die meisten bei Zimmertemperatur (etwa 25 °C) stabilen Membran-Polypeptide geeignet. Hitzebeständige Membran-Polypeptide sind andererseits eventuell besser für einen Einbau in CLP geeignet, die ein DOPE/Wasser-System umfassen, das ein Temperaturminimumprofil für die Bildung einer kubischen Phase von etwa 70 °C besitzt.
  • Der Einbau einer Membran-Polypeptid-Ligationskomponente in eine interessierende Lipidmatrix can in vitro und/oder in vivo erreicht werden. Bei ribosomaler Expression in einem Zell- oder zellfreien System, das eine Lipidmembran enthält, können die Membranen und damit assoziierten Polypeptide zusammen isoliert, wenn erwünscht weiter verfeinert oder die Polypeptide zur darauffolgenden Rekonstitution in einer vorgeformten Lipidmatrix nach Standardverfahren der Technik von den Membranen abgetrennt werden. (Siehe z.B. Hubbel und Mitautoren, Membrane Protein Structure: Experimental Approaches, S. White, Hrsg., Oxford Univ. Press, London, 1994; Kahn und Mitautoren, Biochemistry (1992) 31: 6144-6151; Nowak und Mitautoren, Science (1995) 268: 439-442; Turcatti und Mitautoren, J. Biol. Chem. (1996) 271(33): 19991-19998; Okumura und Mitautoren Biochim. Biophys. Acta (1994) 1194(2): 335-340; Mimms, Biochemistry (1981) 20: 833-839; und US Patent. Nr. 4 515 736.) Um ein spezifisches Membran-Polypeptid zu einer konkreten Lipidmatrix zu lenken, kann eine native oder künstliche Targeting-Sequenz, die die Lokalisierung des Ziel-Polypeptids an einer konkreten, interessierenden Zellmembran erleichtert, ebenfalls einbezogen werden. (Siehe z.B. Pelham und Mitautoren, Cell (1993) 75: 603-605; und Magee und Mitautoren, (1994) Protein Targeting: A Practical Approach, D. Rickwood und B. D. Hames, Hrsg., Oxford University Press, Oxford.)
  • Beim Einbau in eine vorgeformte Lipidmatrix kann ein Ziel-Membran-Polypeptid nach Standardverfahren der Technik rekonstituiert werden, darunter in einer vorgeformten Lipidmatrix nativer Zellmembranen, Liposomen, Micellen oder CLP. (Siehe z.B. Cladera und Mitautoren, Eur. Biochem. (1997) 243(3): 798-804; Takahashi und Mitautoren, Nature Struct. Biol. (1997) 4: 44-50; Das, T. K., J. Phys. Chem. (1996) 100: 2014320147; Angrand und Mitautoren, Eur. J. Biochem. (1997) 250(1): 168-176; Zardeneta und Mitautoren, Anal. Biochem. (1994) 223(1):1-6; Landau und Mitautoren, J. Amer. Chem. Soc. (1993) 115: 2102-2106; Portman und Mitautoren, J. Phys. Chem. (1991) 95: 8437-8440; und Mariani und Mitautoren, J. Mol. Biol. (1988) 204: 165-189). Ein Ziel-Membran-Polypeptid kann insbesondere durch kontrollierte Solubilisierungs- und/oder Lipidextraktionsverfahren in einer vorgeformten Lipidmatrix rekonstituiert werden. Zum Beispiel kann das Membran-Polypeptid zu einem geeigneten Lösungsmittel/Tensid-System hinzugegeben werden, und die Auszüge können einer vorgeformten Lipidmatrix zugegeben werden, die von Lösungsmittel/Tensid frei ist oder davon eine solche Menge enthält, die eine Solubilisierung und Einfügung des Membran-Polypeptids in die Lipidmatrix ermöglicht. Eine oder mehrere Bedingungen der Rekonstitution können angepasst werden, um den Prozess zu optimieren, so die Temperatur, der pH-Wert, der Gehalt an Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln, die Ionenkonzentration, reduzierende oder oxidierende Reaktanten, soweit vorhanden, sowie die Verhältnisse von Tensid zu Lipid, Tensid zu Polypeptid und Lipid zu Polypeptid. Ein Beispiel ist die Vermischung einer Lipidmatrix und eines Membran-Polypeptids in einem geeigneten Puffersystem mit aufeinanderfolgenden Dosen eines Tensids und die Verfolgung des Einbaus des Membran-Polypeptids nach jedem Schritt des Rekonstitutionsprozesses, um die optimalen Puffer/Tensid-Profile für ein konkretes Lipidmembran/Polypeptid-Rekonstitutionssystem zu beurteilen. Beispiele von Lipid-Solubilisierungsreagentien, die für Rekonstitutionsanalysen geeignet sind, sind u.a. SDS (Natriumdodecylsulfat), Triton-X100, Ammonyx-LO (N,N-Dimethyllaurylaminoxid), Natriumcholat, Taurocholat, Sucrose-monolaurat, Dodecylmaltosid, CHAPS (3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propansulfonat), CHAPSO (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat), Octylglucosid, Octylglucopyranosid und dergleichen. (Siehe z.B. Rigaud und Mitautoren, Biochim. Biophys. Acta (1995) 1231(3): 223-246; Yang, Q., und Mitautoren, Anal. Biochem. (1994) 218(1): 210-221; Scotto und Mitautoren, Biochemistry (1987) 26(3): 833-839.) Sofern erforderlich, kann das Tensid nach der Rekonstitution entfernt und der Gehalt und/oder die Aktivität des rekonstituierten Systems mit verschiedenen fachbekannten Methoden charakterisiert werden.
  • Die Rekonstitution durch Lipidextraktion kann erfolgen, indem das isolierte Membran-Polypeptid zur Abtrennung der wasserlöslichen Phase von der im Lipid und im organischen Lösungsmittel löslichen Phase einer Lipidmatrix in einem geeigneten organischen Lösungsmittelsystem wie Hexan und gepufferter wässriger Lösung zugegeben wird. Wie bei dem Lösungsmittel/Tensid-Solubilisierungsverfahren weiter oben können eine oder mehrere Rekonstitutionsbedingungen angepasst werden, um den Prozess zu optimieren, zum Beispiel die Temperatur, der pH-Wert, der Gehalt an Wasser und/oder organischem Lösungsmittel, die Ionenkonzentration, reduzierende oder oxidierende Reaktanten, soweit vorhanden, sowie die Verhältnisse von Tensid zu Lipid, Tensid zu Polypeptid und Lipid zu Polypeptid. Die extrahierte Lipidphase, die das Membran-Polypeptid enthält, kann dann verwendet werden, um je nach der Lipidmatrix, die gewonnen werden soll, mit Standardverfahren wie Ultraschallbehandlung, Überschichtung, Extrudieren, Zentrifugieren und dergleichen Lipid-Mono- und Doppelschichten, Liposome, Micellen oder CLP auszubilden. Alle geeigneten Verfahren zur Rekonstitution von Membran-Polypeptiden in einer Lipidmatrix durch Lipidextraktion können verwendet werden. (Siehe z.B. Montal und Mitautoren, Q. Rev. Biophys. (1981) 14: 1-79; Ayala und Mitautoren, Biochim. Biophys. Acta (1985) 810(2): 115-122; Montal und Mitautoren, Proc. Natl Acad Sci. USA (1990) 87: 6929; Puu und Mitautoren, Biosens. Bioelectron. (1995) 10(5): 463-476.) Zum Beispiel kann das Lösungsmittelsystem für ein konkretes Lipidmembran-Polypeptid ausgewählt werden, um die Extraktion zu optimieren, wie oben für die Gewinnung und Herstellung von Lipiden beschrieben. Wie beim Verfahren der Solubilisierung für den Einbau eines Membran-Polypeptids in eine Lipidmatrix können aufeinanderfolgende Dosen eines gewählten Lösungsmittels mit oder ohne Tensid und/oder Salzen verwendet werden, um ein optimales Lipid-Extraktionssystem zu überwachen und auszuwählen und eine extrahierte Lipidphase zu gewinnen, die das Membran-Polypeptid enthält.
  • Je nach dem Ligationskomponentenpaar und seiner beabsichtigten Endbestimmung kann der Ligationsmarker der Lipidmatrix wahlweise vor, während und/oder nach dem Einbau des Membran-Polypeptids beigegeben werden. Wenn ein wasserlöslicher Ligationsmarker verwendet wird, kann der Marker einer Lipidmatrix beigegeben werden, in die ein Ziel-Membran-Polypeptid bereits eingebaut worden ist. Ein löslicher Ligationsmarker kann auch vor und/oder in Verbindung mit dem – Einbau der Membran-Polypeptidkomponente in die Lipidmatrix zum Beispiel in ein wässriges Kompartiment eines Liposoms, einer Micelle oder CLP gegeben werden. Letzteres ist besonders vorteilhaft, wenn das Membran-Polypeptid zum spontanen Eintritt in eine vorgeformte Lipidmatrix, die einen Ligationsmarker enthält, befähigt ist. In ähnlicher Weise kann ein lipidlöslicher Marker vor, während und/oder nach Einbau des Membran-Polypeptids hinzugegeben werden. Wenn beispielsweise der Ligationsmarker eine sich in das Lipid einbettende Ankerdomäne besitzt, die in der Lage ist, einen Komplex mit einer sich in das Lipid einbettenden Ankerdomäne einer Membran-Polypeptidkomponente zu bilden, kann es wünschenswert sein, den Ligationsmarker mit der Membran-Polypeptidkomponente vor der Ligation einzubauen, um einen Komplex oder ein Bündel spontan zusammenfindender, aber nicht verbundener Domänen zu erhalten. Der Einbau der Membran-Polypeptid- und Ligations komponenten vor der Ligation kann verwendet werden, um den Eintritt und/oder Faltung von individuellen Polypeptidsegmenten oder -domänen bei ihrer Wechselwirkung in der Lipidmatrix zu unterstützen und die richtige Positionierung einer beabsichtigten Ligationsstelle zu befördern. Dieses Vorgehen ist ferner besonders nützlich, wenn die beabsichtigte Ligationsstelle ein kompatibles Ligationskomponentenpaar ist, das dafür ausgelegt ist, bei Ligation einer extrazellulären und/oder intrazellulären Schleife, die die eingetretenen Domänen verbindet, ein modulares Multipass-Transmembran-Polypeptid zu bilden. Ein weiteres Beispiel ist die Expression und Einfügung des Ligationsmarkers in eine Lipidmembran in einem Zell- oder zellfreien System und nachfolgende Rekonstitution der den Ligationsmarker enthaltenden Zellmembran mit einem Membran-Polypeptid. Um das gewünschte Lipidmatrixsystem nach dem Einbau des Membran-Polypeptids und/oder des Ligationsmarkers zu bewahren, können Bedingungen wie die Temperatur, der pH-Wert, der Gehalt an Wasser und/oder organischem Lösungsmittel, die Ionenkonzentration, reduzierende oder oxidierende Reaktanten, soweit vorhanden, sowie die Verhältnisse von Tensid zu Lipid, Tensid zu Polypeptid und Lipid zu Polypeptid wie erforderlich angepasst werden. Aliquote Mengen können in bestimmten Zeitabständen entnommen werden, um den Einbau und die Integrität mit Standardverfahren oder den hierin beschriebenen Verfahren zu verfolgen.
  • Wenn das Membran-Polypeptid und der Ligationsmarker gemeinsam rekonstituiert werden, können eine oder mehrere der Ligationskomponenten eine Linker- oder Verkappungssequenz enthalten, die eine oder mehrere Spaltstellen besitzt, die so positioniert sind, dass bei Spaltung eine chemisch reaktive Ligationsstellengruppe erzeugt wird, und somit verwendet werden, um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der für die Ligationsreaktion benötigten reaktiven Gruppen zu steuern. Zusätzlich können Reaktanten oder Pufferbedingungen verwendet werden, um das Vorhandensein und die Reaktivität solcher reaktiver Gruppen zu steuern. Beispielsweise können Pufferbedingungen bei einem pH-Wert von weniger als 6,5 auch genutzt werden, um native chemische Ligation zu verhindern. In einem weiteren Beispiel kann, wenn die Ligationskomponenten für native chemische Ligation ausgelegt sind und daher gemeinsam ein komplementäres Ligationskomponentenpaar mit einem ungeschützen N-terminalen Cystein und einer C-terminalen α-COSR-Gruppe liefern, wie sie nach Spaltung und Erzeugung einer Cystein-Ligationsstelle entsteht, ein Thiol-Reduktionsmittel wie β-Mercaptoethanol wahlweise einbezogen wer den, wenn vorgezogen wird, eine Ligationsreaktion zu verzögern oder zu verhindern. Vor der Zugabe des Thiol-Reduktionsmittels wird natürlich das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Disulfid-Bindungen und Faltung des Membran-Polypeptids in der Lipidmatrix in Betracht gezogen. Wenn eine Disulfid-Bindung erforderlich ist, um ein richtig eingefügtes und gefaltetes Membran-Polypeptid zu bewahren, und das Disulfid gegenüber dem Thiol-Reduktionsmittel allgemein empfindlich ist, kann der Ligationsmarker gerade vor der Ligation zugegeben werden, wodurch die Notwendigkeit, ein Reduktionsmittel hinzuzufügen, um die Ligation zu verzögern oder zu verhindern, minimiert wird.
  • Wie auch immer die Ligationsmarkerkomponente dem Lipidmatrixsystem zur Verfügung gestellt wird, so wird ein normal befähigter Fachmann erkennen, dass das Verfahren und die Reihenfolge des Einbaus für eine gegebene Endbestimmung angepasst werden können, solange die Integrität und Kompatibilität der Komponentenpaare aus dem in die Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptid und dem Ligationsmarker bewahrt bleiben und sie zu einer nachfolgender Ligation befähigt bleiben, wie sie beispielhaft in einem oder mehreren der Schemata 1 bis 2 dargestellt wird.
  • Nachdem eine Membranpolypeptid- und/oder eine Ligationsmarkerkomponente in eine interessierende Lipidmatrix eingebaut worden ist, kann die Matrix aufbewahrt oder für die Ligation weiter verarbeitet werden. Für die Ligation kann das in die Lipidmatrix eingebaute Membran-Polypeptid in einer Lösungsphase dargeboten oder an eine feste Trägerphasenmatrix angefügt sein. Dazu gehören flüssige Lösungen, Gele, Aufschlämmungen, Affinitätsmatrix-Trägersysteme und dergleichen. Wenn das Membran-Polypeptid oder der Ligationsmarker eine Spaltstelle in Nachbarschaft zu einem Rest besitzen, der für die chemoselektive chemische Ligation bestimmt ist, wird die Spaltung vor der Ligationsreaktion durchgeführt. Die chemische oder Proteasespaltung wird durchgeführt, indem ein spaltendes Reagens, das für die Spaltstelle spezifisch ist, hinzugefügt wird und die Mischung unter geeigneten Bedingungen und für eine geeignete Zeit inkubiert wird, um Spaltung zu erhalten. Viele platzspezifische spaltende Reagentien sind gut bekannt und können hergestellt oder vom Handel bezogen werden. Das spaltende Reagens und die Reaktionsnebenprodukte können dann vor der Ligation, wenn gewünscht, neutralisiert oder entfernt werden, um jegliche Störung der Ligationsreaktion zu vermeiden. Das Ausmass der Spaltung nach der Inkubation und die Erzeugung des in die Lipidmatrix eingebauten Spaltprodukts können mit vielen der fachbekannten oder hierin beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Es versteht sich natürlich, dass das Produkt der Spaltreaktion, das für chemische Ligation bestimmt ist, einen ungeschützten Aminosäurerest enthält, der einem spezifischen Typ von Ligationschemie zugänglich ist, gleichviel ob das Produkt der Ligationsmarker und/oder das Membran-Polypeptid ist. Beispielsweise enthält ein für native chemische Ligation ausgelegtes Spaltprodukt bevorzugt ein ungeschütztes N-terminales Cystein, in einigen Fällen wird aber nur eine zweckmässig positionierte Aminosäure für die native chemische Ligation mit einem Membran-Polypeptid oder einem Ligationsmarker, die eine C-terminale Thioestergruppe liefern, benötigt.
  • Für die Ligationsreaktion werden Reaktionsbedingungen ausgewählt, die die erwünschte Wechselwirkung zwischen den in die Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptid- und Ligationsmarkerkomponenten bewahren. Routinemässige Anpassungen zum Auffinden optimaler Bedingungen können zum Beispiel erfolgen, indem individuelle Reaktanten, Konzentrationen, Temperaturen und dergleichen variiert werden. Zur Optimierung der Ligation können zum Beispiel Reaktionsbedingungen wie die Temperatur, der pH-Wert, der Gehalt an Wasser und/oder organischem Lösungsmittel, die Ionenkonzentration, reduzierende oder oxidierende Reaktanten, soweit vorhanden, sowie die Verhältnisse von Tensid zu Lipid, Tensid zu Polypeptid und Lipid zu Polypeptid angepasst werden. Ein Zusatz oder Ausschluss von Reaktanten, die die Lipidmatrix und/oder das Membran-Polypeptid in verschiedenem Ausmass solubilisieren, können weiter dafür benutzt werden, die Spezifität und Geschwindigkeit der gewünschten Ligationsreaktion zu steuern. Der normal gebildete Fachmann wird erkennen, dass diese Bedingungen auf der Basis einer gegebenen, eingesetzten Ligationschemie ausgewählt werden, also für diese Chemie zweckmässig sind. Solche Bedingungen und Bereiche von Bedingungen lassen sich leicht durch einen Fachmann normaler Befähigung ermitteln.
  • Die Bildung und Homogenität des gewünschten Systems aus Lipidmatrix und Membran-Polypeptid- oder Ligationsmarkerkomponenten sowie die Bildung eines gewünschten Ligationsprodukts können mit einer Anzahl von Verfahren überwacht werden. Zu diesen Verfahren gehören Tests, die die Aktivität des eingebauten Membran-Polypeptids nachweisen, Fluoreszenzspektroskopie, Massenspektrometrie, Affinitätsmatrix- und Ligandenbindungstests, NMR, Circulardichroismus (CD), Scanner-Densitometrie, Kalorimetrie und verschiedene chromatographische Verfahren wie die Elektrophorese, Affinitätschromatographie, HPLC mit Umkehrphasen- oder Ionenaustauschersäulen und dergleichen.
  • Eine Lipidmatrix, die ein Prä- oder Postligationsprodukt enthält, kann zur späteren Verwendung aufbewahrt oder direkt in einem Test eingesetzt werden. Bei Aufbewahrung wird das Aufbewahrungsverfahren so gewählt, dass die Stabilität der Lipidmatrix und seiner eingebauten Komponenten bewahrt bleibt. Dies schliesst die Aufbewahrung im gefrorenen Zustand, in Gestalt eines gefriergetrockneten Pulvers, Kristalls, Gels, einer Aufschlämmung, Flüssigkeit oder jeglichen anderen geeigneten Form ein, darunter die Aufbewahrung auf einer Trägermatrix wie einer Film- oder Affinitätsmatrix. Zum Beispiel wird eine Lipidmatrixfraktion, die von einer nativen Zellmembran abgeleitet ist, typischerweise gefroren, wenn sie zur Langzeitlagerung bestimmt ist, sofern sie nicht hoch gereinigt ist. Künstliche Lipidmatrizen wie Liposome und CLP sind etwas offener für einen Bereich von Aufbewahrungsoptionen, insbesondere CLP, die als viskose Gele unter Bedingungen aufbewahrt werden können, die die kubische Phase des Lipidsystems begünstigen. Wenn als eine geschlossene Vesikel wie ein Liposom vorliegend, kann eine Aggregation und Fusion verringert werden, indem der Zusammensetzung mit Standardverfahren negativ und/oder positiv geladene Komponenten zugefügt werden. Die Zugabe von Lipiden, die einen höheren Klärpunkt besitzen, zum Beispiel Cholesterinen oder Phospholipiden, die gesättigte Fettsäuren enthalten, kann ebenfalls einen Verlust aus den geschlossenen Vesikeln verringern. Zusätze wie Trehalose können ebenfalls als Kälteschutzmittel verwendet werden. Natürlich können alle geeigneten, fachbekannten Methoden für die Aufbewahrung vorgeformter Lipidsysteme verwendet werden, und die Lagerstabilität allgemein kann verbessert werden, indem die Temperatur und der Feuchtigkeitsgehalt geregelt, Berührung mit Rohmaterialien oder Oxidantien z.B. durch Aufbewahrung unter einem Inertgas verringert, die Lipidmatrizen in einem neutralen Puffersystem dispergiert und/oder restliche Lösungsmittel eliminiert werden.
  • Für einen Einsatz in Tests lassen sich die chemischen Ligationsmethoden und -zusammensetzungen der Erfindung bei einem Screening-Assay der Erfindung verwenden. Die Screening-Assays der Erfindung sind durch die Bindung eines Liganden an ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Ziel-Membranpolypeptid gekennzeichnet, das durch eine oder mehrere der Methoden und Zusammensetzungen der Erfindung erzeugt wurde.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird zumindest eine Ligationskomponente mit einer oder mehreren nachweisbaren Gruppen versehen, die auch als ein nachweisbarer Marker oder eine nachweisbare Sonde bezeichnet werden, wie einem Isotop, Hapten, einem Chromophor einschliesslich der Fluorophore, Schwermetallkomplexen mit aromatischen Liganden oder Chelatliganden und dergleichen. Stärker bevorzugt wird zumindest ein erster nachweisbarer Marker durch ein Verfahren der chemoselektiven chemischen Ligation, wie beispielhaft in einem oder mehreren der Schemata 1 und 2 ausgedrückt, in das Membran-Polypeptid eingebaut. Wenn gewünscht, können zusätzlich zu den Schemata 1 und 2 mit einer Anzahl von Verfahren ein oder mehrere eines zweiten nachweisbaren Markers in das Membran-Polypeptid, die Lipidmatrix und/oder einen Liganden für das Polypeptid eingebaut werden. Wie oben beschrieben, kann eine nachweisbare Gruppe mit jeder für einen solchen Zweck geeigneten Methode während und/oder nach der Synthese und auch nach einer Ligation in der Lipidmatrix in eine Ligationskomponente eingebaut werden, solange die Reektivität, Selektivität und Stabilität des Systems der in die Lipidmatrix eingebauten Membran-Polypeptid- und/oder Ligationskomponenten, wie sie in einem oder mehreren der Schemata 1 und 2 beispielhaft dargestellt werden, im Wesentlichen erhalten bleiben. Wie ebenfalls oben beschrieben, können ein oder mehrere für eine kovalente Anknüpfung eines nachweisbaren Markers bestimmte Gruppen während der Auslegung und des Screenings der kompatiblen Ligationskomponentenpaare ausgewählt werden.
  • Chemische Synthese ist die bevorzugte Methode für den Einbau eines nachweisbaren Markers. In dieser Ausführungsform wird chemische Synthese eingesetzt, um zumindest einen nachweisbaren Marker in eine Prä-Ligationskomponente einzubauen, wie sie in einem oder mehreren der Schemata 1 und 2 beispielhaft dargestellt werden. Auf diese Weise kann das sich ergebende, in eine Lipidmembran eingebettete Ligationsprodukt so ausgelegt werden, dass es ein oder mehrere nachweisbare Marker an im Voraus festgelegten, gewählten Positionen besitzt. Isotopenmarker, die durch NMR erkennbar sind, sind von besonderem Interesse. Ebenfalls von besonderem Interesse ist der Einbau einer oder mehrerer unnatürlicher Aminosäuren mit einem nachweisbaren Marker an einer oder mehreren spezifischen Stellen einer interessierenden Ziel-Ligationskomponente. Unter unnatürlichen Aminosäuren werden alle nicht genetisch kodierten L-Aminosäuren und D-Aminosäuren verstanden, die so modifiziert worden sind, dass sie einen nachweisbaren Marker enthalten, zum Beispiel photoaktive Gruppen wie auch Chromophore einschliesslich der Fluorophore und anderer Farbstoffe oder ein Hapten wie Biotin. Unnatürliche Aminosäuren mit einem Chromophor sowie Verfahren der chemischen Synthese, die verwendet werden, um sie in eine Peptid- oder Polypeptidsequenz einzubauen, sind gut bekannt und können für diesen Zweck verwendet werden. Zum Beispiel kann es praktisch sein, einen Fluorophor an den N-Terminus eines harzgebundenen Peptids zu binden, ehe andere Schutzgruppen entfernt und das markierte Peptid vom Harz freigegeben wird. Fluorescein, Eosin, Oregongrün, Rhodamine Green, Rhodol Green, Tetramethylrhodamin, Rhodamine Red, Texasrot, Cumarin und NBD-Fluorophore, der Dabcyl-Chromophor und Biotin sind alle gegenüber Fluorwasserstoff (HF) wie auch gegenüber den meisten anderen Säuren annehmbar stabil und daher für den Einbau über Festphasensynthese geeignet (Peled und Mitautoren, Biochemistry (1994) 33: 7211; Ben-Efraim und Mitautoren, Biochemistry (1994) 33: 6966). Im Unterschied zu den Cumarinen sind diese Fluorophore auch gegenüber den Reagentien stabil, die für die Entschützung von mit Fmoc-Chemie synthetisierten Peptiden verwendet werden (Strahilevitz und Mitautoren, Biochemistry (1994) 33: 10951). Die t-Boc and α-Fmoc-Abkömmlinge von ε-Dabcyl-L-lysin können ebenfalls verwendet werden, um den Dabcyl-Chromophor an ausgewählten Stellen einer Polypeptidsequenz einzubauen. Der Dabcyl-Chromophor besitzt eine breite Absorption im Sichtbaren und kann als eine Quenchergruppe verwendet werden. Die Dabcyl-Gruppe kann unter Verwendung von Dabcyl-Succinimidylester am N-Terminus eingebaut werden (Maggiora und Mitautoren, J. Med. Chem. (1992) 35: 3727). EDANS ist ein üblicher Fluorophor für eine Paarung mit dem Dabcyl-Quencher in FRET-Experimenten. Dieser Fluorophor lässt sich bei der automatisierten Synthese von Peptiden günstig einführen, indem 5-((2-(t-Boc)-γ-Glutamylaminoethyl)amino)naphthalin-1-sulfonsäure verwendet wird (Maggiora und Mitautoren, J. Med. Chem. (1992) 35: 3727). Ein α-(t-Boc)-ε-Dansyl-L-lysin kann für den Einbau des Dansyl-Fluorophors in Polypeptide während der chemischen Synthese verwendet werden (Gauthier und Mitautoren, Arch. Biochem. Biophys. (1993) 306: 304). Wie bei EDANS überlappt die Fluoreszenz dieses Fluorphors mit der Absorption von Dabcyl. Eine platzspezifische Biotinylierung von Peptiden kann unter Verwendung des t-Boc-geschützten Abkömmlings von Biocytin (Geahlen und Mitautoren, Anad. Biochem. (1992) 202: 68) oder anderen, gut bekannten Biotinylierungsabkömmlingen wie NHS-Biotin und dergleichen erreicht werden. Ein racemisches Benzophenon phenylalanin-Analoges kann nach seinem t-Boc- oder Fmoc-Schutz ebenfalls in Peptide eingebaut werden (Jiang und Mitautoren, Intl. J. Peptide Prot. Res. (1995) 45: 106). Die Auflösung der Diastereomeren kann während der HPLC-Reinigung des Produkts erreicht werden; das ungeschützte Benzophenon kann auch mit Standardverfahren der Technik aufgelöst werden. Keto-tragende Aminosäuren für eine Oximkopplung, Aza/Hydroxytryptophan, Biotyl-Lysin und D-Aminosäuren sind weitere Beispiele für unnatürliche Aminosäuren, die verwendet werden können. Es ist ersichtlich, dass andere geschützte Aminosäuren für eine automatisierte Peptidsynthese durch spezielle Synthesen mit Standardverfahren der Technik hergestellt werden können.
  • Weitere nachweisbare Marker können mit Verfahren, die über die beispielhaft in Schemata 1 2 angeführten hinausgehen, in das Membran-Polypeptid, die Lipidmatrix und/oder einen Liganden für das Polypeptid eingebaut werden. In dieser Ausführungsform wird die nachweisbare Gruppe typischerweise durch postchemische Ligation eingeführt. Dies kann durch chemische Modifizierung unter Verwendung einer reaktiven Substanz erfolgen, die nach ihrer Bindung an eine reaktive Gruppe des Zielmoleküls eine kovalente Verknüpfung bildet. Zum Beispiel kann eine Peptid- oder Polypeptid-Ligationskomponente mehrere reaktive Gruppen oder für Reaktivität modifizierte Gruppen wie Thiol-, Aldehyd- und Aminogruppen enthalten, die für eine Ankopplung des nachweisbaren Markers durch chemische Modifizierung geeignet sind (Lundblad und Mitautoren, in: Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1984)). Platzgerichtete Mutagenese und/oder chemische Synthese können auch verwendet werden, um solche Gruppen an einer gewünschten Position einzuführen und/oder davon zu eliminieren. Eine beliebige Anzahl nachweisbarer Marker, darunter Biotinylierungssonden eines Biotin-Avidin- oder -Streptavidin-Systems, Antikörper, Antikörperfragmente, Kohlenhydrat-Bindungsdomänen, Chromophore einschliesslich Fluorophore und andere Farbstoffe, Lectin, Nucleinsäure-Hybridisierungssonden, Arzneistoffe, Toxine und dergleichen können auf diese Weise angekoppelt werden. Zum Beispiel können unter Einsatz von Haptenylierungs- und Biotinylierungsmitteln ein Hapten niedrigen Molekulargewichts wie ein Fluorophor, Digoxigenin, Dinitrophenyl (DNP) oder Biotin, chemisch an die Membran-Polypeptid- oder Ligationsmarkerkomponente angeknüpft werden. Das haptenylierte Polypeptid kann dann unter Einsatz von Fluoreszenz-Spektroskopie, Massenspektrometrie und dergleichen direkt oder unter Einsatz eines markierten Reagens, das als ein sekundäres Nachweismittel selektiv an das Hapten bindet, indirekt nachgewiesen werden. Üblicherweise verwendete sekundäre Nachweismittel sind u.a. Antikörper, Antikörperfragmente, Avidine und Streptavidine, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff oder anderem nachweisbaren Marker markiert worden sind.
  • Je nach der reaktiven Gruppe kann die chemische Modifikation reversibel oder irreversibel sein. Eine übliche reaktive Gruppe, die in Peptiden und Polypeptiden gezielt modifiziert wird, ist die Thiolgruppe, die mit Halogenacetyl- und Maleimid-Markerreagentien, die zu irreversiblen Modifikationen führen und daher stabilere Produkte liefern, chemisch modifiziert werden kann. Zum Beispiel sind Reaktionen von Sulfhydrylgruppen mit α-Halogenketonen, Amiden und Säuren im physiologischen pH-Bereich (pH 6,5 bis 8,0) gut bekannt und ermöglichen die spezifische Modifizierung von Cysteinen in Peptiden und Polypeptiden (Hermason und Mitautoren, in: Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA, Seiten 98-100 (1996)). Die kovalente Verknüpfung eines nachweisbaren Markers kann auch durch eine Änderung der Bedingungen ausgelöst werden, in der Photoaffinitätsmarkierung zum Beispiel im Ergebnis einer Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge. Für die Photoaffinitätsmarkierung enthält der Marker, der oft fluoreszierend oder radioaktiv ist, eine Gruppe, die bei Lichteinstrahlung (üblicherweise mit ultraviolettem Licht) chemisch reaktiv wird und eine kovalente Verknüpfung mit einer geeigneten Gruppe an dem zu markierenden Molekül bildet. Eine wichtige Klasse von für diesen Zweck geeigneten photoreaktiven Gruppen sind die Arylazide, die bei Lichteinstrahlung kurzlebige, aber hochreaktive Nitrene bilden. Blitzlicht-Photolyse von photoaktivierbaren oder „caged" Aminosäuren kann ebenfalls verwendet werden, um Peptide zu markieren, die biologisch inaktiv sind, bis sie mit UV-Licht photolysiert werden. Verschiedene Caging-Reagentien können verwendet werden, um die Aminosäuren zu modifizieren, zum Beispiel Abkömmlinge von o-Nitrobenzylverbindungen, und mit Standardverfahren der Technik nachgewiesen werden (Kao und Mitautoren, Optical Microscopy: Emerging Methods and Applications, B. Herman, J. J. Lemasters, Hrsg., Seiten 27-85 (1993)). Die Nitrobenzylgruppe kann in das biologisch aktive Molekül synthetisch über eine Ether-, Thioether-, Ester- (einschliesslich Phosphatester-), Amin- oder ähnliche Verknüpfung mit einem Heteroatom (üblicherweise O, S oder N) eingebaut werden. Caged Fluorophore können für Experimente mit der Photoaktivierung von Fluoreszenz (PAF: Photoactivation of Fluorescence) verwendet werden, was der Fluoreszenzregenerierung nach Photobleaching (FRAP: Fluorescence Recovery after Photobleaching) analog ist. Caged Fluorophore auf der ε-Aminogruppe von Lysin, dem Phenol von Tyrosin, der γ-Carboxylgruppe von Glutaminsäure oder dem Thiol von Cystein können für den spezifischen Einbau von caged Aminosäuren in die Sequenz verwendet werden. Alanin, Glycin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan und Valin, wenn caged auf dem α-Amin, können ebenfalls verwendet werden, um Peptide, die auf dem N-Terminus caged sind, oder caged Zwischenprodukte herzustellen, die entweder in einem Polymer oder in Lösung selektiv zur aktiven Aminosäure photolysiert werden können (Patchornik und Mitautoren, J. Am. Chem. Soc. (1970) 92: 6333). Spinmarkierungsverfahren können ebenfalls verwendet werden, um eine Gruppe mit einem ungepaarten Elektron einzuführen, die als ein Reporterspezies für Elektronenspinresonanz (ESR) wirkt, zum Beispiel eine Nitroxidverbindung (-N-O), in der der Stickstoff Bestandteil eines sterisch behinderten Rings ist (Oh und Mitautoren, a.a.O.).
  • Die Wahl eines nachweisbaren Markersystems hängt allgemein vom Test und dessen Bestimmung ab. Die chemischen Ligationsverfahren und -zusammensetzungen der Erfindung können insbesondere in einem Screening-Assay der Erfindung verwendet werden, der durch Bindung eines Liganden an ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid gekennzeichnet ist, das einen Ligationsmarker umfasst, der über eine kovalente Bindung mit der Membran-Polypeptid-Ligationsstelle verbunden ist. Solche Assays sind u.a. diagnostische Assays, das Screening neuer Verbindungen für Arzneimittelentwicklung und weitere strukturelle und funktionelle Assays, in denen die Bindung eines Liganden an ein vorgefaltetes Membran-Polypeptid genutzt wird. Die Liganden können von natürlich vorkommenden Liganden oder von synthetischen Quellen wie kombinatorischen Bibliotheken abgeleitet sein. Von besonderem Interesse sind Screeningverfahren mit einem fluoreszenzspektroskopischen Nachweis von Ligandenbindung an ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid, das durch ein Verfahren der Erfindung hergestellt wurde.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Screening bezüglich der Bindung eines Liganden an ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid mit einem oder mehreren Chromophoren in einem Assay, der durch den Nachweis von Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) gekennzeichnet ist. Ligandenbindung an das in eine Lipidmatrix eingebettete Membran-Polypeptid kann mit vielen der fachbekannten Verfahren für FRET-Analysen gemessen werden, darunter der stationären und zeitaufgelösten Fluoreszenz mit einer Verfolgung der Änderungen in der Fluoreszenzintensität, Emissionsenergie und/oder Anisotropie zum Beispiel infolge eines Energietransfers von einer Donor- zu einer Akzeptorgruppe des FRET-Systems (siehe z.B. Wu und Mitautoren, Anal. Biochem. (1994) 218:1-13). FRET-Assays ermöglichen nicht nur Abstandsmessungen, sondern auch eine Auflösung des Bereichs von Donor-Akzeptor-Abständen. FRET kann auch dafür verwendet werden zu zeigen, dass das Membran-Polypeptid entweder in einem einzigen Konformationszustand vorliegt oder, wenn es sich in einem anderen Zustand wie an einen Liganden gebunden befindet, einen Bereich von Donor-Akzeptor-Abständen aufweist.
  • In FRET-Assays ist das in eine Lipidmatrix eingebaute Membran-Polypeptid dafür ausgelegt, zumindest einen Chromophor eines Donor-Akzeptor-Systems zu enthalten. Das Donormolekül ist für den Nachweis immer ein fluoreszierendes (oder lumineszierendes) Molekül. Das Akzeptormolekül kann fluoreszierend oder nicht fluoreszierend sein. Somit werden für ein Donor-Akzeptor-System mindestens zwei Chromophore zur Verfügung gestellt, der erste durch das in die Lipidmatrix eingebettete Membran-Polypeptid, der zweite wahlweise durch das Membran-Polypeptid, die Lipidmatrix oder einen Liganden für das Polypeptid.
  • Mehr als nur ein Donor-Akzeptor-Paar kann ebenfalls einbezogen werden. Zum Beispiel kann das Membran-Polypeptid ein oder mehrere Donor- und/oder Akzeptormoleküle enthalten, vorzugsweise zumindest ein Donormolekül mit einem Chromophor. Ein Ligand kann ebenfalls ein oder mehrere Donor- oder Akzeptormoleküle umfassen. Die Lipidmembranmatrix kann ebenfalls ein oder mehrere Donor- oder Akzeptormoleküle enthalten, ferner sekundäre Moleküle, die in das Lipid und/oder in durch die Matrix gebildete, für Lösungsmittel zugängliche Kanäle eingebaut sind und Liganden für das interessierende Ziel-Polypeptid sind, zum Beispiel G-Proteine, wenn das Ziel-Membran-Polypeptid einen Teil eines Sieben-Transmembran-Rezeptorsystems oder das ganze System umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Membran-Polypeptid ein oder mehrere Donormoleküle, während ein Ligand für das Membran-Polypeptid ein oder mehrere Akzeptormoleküle umfasst. Die Liganden können kleine organische Moleküle, Peptide, Peptidmimetika, behinderte Peptide, Polypeptide und dergleichen sein. Sie können von natürlich vorkommenden Liganden oder von synthetischen Quellen wie kombinatorischen Bibliotheken abgeleitet sein. Wenn der Ligand ein Peptid oder Polypeptid ist, kann er unter Einsatz verschiedener Chemien wie den hierin beschriebenen mit einem Chromophormarker hergestellt werden. Von besonderem Interesse sind modulare „Crossover"-Polypeptidliganden, die so aufgebaut werden können, dass sie einen oder mehrere Chromophore umfassen, und durch die Kombination eines oder mehrerer funktioneller Moduln von einem ersten Polypeptid und von zumindest einem zweiten Polypeptid hergestellt werden. Die Synthese modularer Polypeptide wird bei Kent und Mitautoren, WO 99/11655, beschrieben.
  • Liganden von besonderem Interesse konkurrieren für einen Ligandenbindungsplatz an einem in eine Lipidmatrix eingebauten Membran-Polypeptid, das mit einem oder mehreren der beispielhaft in Schemata 1 und 2 aufgeführten Verfahren und/oder Zusammensetzungen hergestellt wurde. Diese Liganden können in einem zusätzlichen Verfahren der Erfindung genutzt werden, das beinhaltet, ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid mit zwei oder mehreren unterschiedlichen Liganden in Berührung zu bringen, die für Bindung an einen Ligandenbindungsplatz des Membran-Polypeptids konkurrieren. Ein oder mehrere der verschiedenen konkurrierenden Liganden können für Nachweiszwecke markiert sein. Beispielsweise kann das Membran-Polypeptid mit einem ersten Chromophor, ein konkurrierender Ligand mit einem zweiten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Systems markiert sein. Wechselweise können das Membran-Polypeptid oder die Lipidmatrix den zweiten Chromophor zur Verfügung stellen. Die Konkurrenz für Ligandenbindung an das Polypeptid wird durch FRET-Analyse verfolgt, wobei die Änderungen in der intrinsischen Fluoreszenz des Membran-Polypeptids bei Bindung des Liganden und/oder die Änderungen in den Eigenschaften eines Fuoreszenz-markierten Liganden bei der Bindung verfolgt werden, so dass die Ligandenbindung nachgewiesen und charakterisiert werden kann.
  • Wenn ein Donor-Akzeptor-Paar als Chromophor für FRET ausgewählt wird, wird die Lage des ersten Chromophors in einem Ziel-Polypeptid so ausgelegt, dass er sich innerhalb eines genügend grossen Abstands von einem zweiten Chromophor befindet, um ein Donor-Akzeptor-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfersystem auszubilden. Energietransfer vom Donor zu einem Akzeptor beinhaltet zum Beispiel eine Kopplung von Dipolen, bei der die Energie über einen charakteristischen Abstand hinweg übertragen wird, der Förster- Radius (R0) genannt wird und als der Abstand definiert wird, bei dem der Energietransfer-Wirkungsgrad 50 % beträgt (d.h. der Abstand, bei dem 50 % der angeregten Donoren durch FRET desaktiviert werden). Dieser Abstand wird hierin als der Förster-Abstand bezeichnet. Diese Abstände reichen von etwa 10 bis 100 Angstrøms (Å), was mit dem Durchmesser vieler Proteine und mit der Dicke der Membranen vergleichbar ist. Manchmal kann instrinsisches Tryptophan oder Tyrosin als ein Chromophor in Abstandsmessungen verwendet werden, aber in den meisten Fällen ist der Förster-Abstand auf einen oberen Wert von 30 Å begrenzt. Mit einem Akzeptormolekül, das Cluster von Akzeptoren umfasst, deren jeder einen grossen molaren Extinktionskoeffizienten besitzt, kann man aber eine weitere Verlängerung des Förster-Abstands erreichen. So können durchschnittliche Abstände von mehr als 100 Å gemessen werden. Da die Förster-Abstände aus dem Absorptionsspektrum des Akzeptors und dem Emissionsspektrum des Donors zuverlässig berechnet werden können, ermöglicht FRET die Ermittlung molekularer Abstände. Bei bekanntem Förster-Abstand kann das Ausmass des Energietransfers benutzt werden, um den Abstand zwischen Donor und Akzeptor zu berechnen.
  • Donor-Akzeptor-Chromophore, die auf biologische Moleküle anwendbar sind und für die die Förster-Abstände bei Paarung bekannt sind, sind u.a. – aber nicht ausschliesslich – die folgenden Chromophore: ANAI (2-Anthracen-N-acetylimidazol); BPE (B-Phycoerythrin); CF (Carboxyfluorescein-succinimidylester); CPM (7-Diethylamino-3-(4'-maleimidylphenyl)-4-methylcumarin); CY5 (Carboxymethylindocyanin-N-hydroxysuccinimidylester, DiI-C13, 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanin; DiO-C14, 3,3'-Ditetradecyloxacarbocyanin); DABM (4-Dimethylaminophenylazo-phenyl-4'-maleimid); DACM ((7-(Dimethylamino)cumarin-4-yl)acetyl); DANZ (Dansylaziridin); DDPM (N-(4-Dimethylamino-3,5-dinitrophenyl)maleimid); DMAMS (Dimethylamino-4-maleimidostilben); DMSM (N-(2,5-Dimethoxystilben-4-yl)maleimid); DNP (2,4-Dinitrophenyl); ε-A (1,N6-Ethenoadenosin); EIA (5-(Iodacetamido)eosin); EITC (Eosin-thiosemicarbazid); F2DNB (1,5-Difluor-2,4'-dinitrobenzol); F2DPS (4,4'-Difluor-3,3'-dinitrophenylsulfon); FITC (Fluorescein-5-isothiocyanat); FM (Fluorescein-5-maleimid); FMA (Fluoresceinquecksilber(II)acetat); FNAI (Fluorescein-N-acetylimidazol); FTS (Fluorescein-thiosemicarbazid); IAANS (2-(4'-Iodacetamido)amino)naphthalin-6-sulfonsäure); IAEDANS (5-(2-((Iodacetyl)amino)ethyl)amino)naphthalin-1-sulfonsäure); IAF (5-Iodacetamidofluorescein); IANBD (N-((2-(Iodacetoxy)ethyl)-N-methyl)amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol); IPM (3(4-Isothiocyanatophenyl)-7-diethyl-4-amino-4-methylcumarin); ISA (4-(Iodacetamido)salicylsäure); LRh (Lissamin-Rhodamine); LY (Lucifer yellow); mBBr (Monobrombiman); MNA ((2-Methoxy-1-naphthyl)methyl); NAA (2-Naphthoxyessigsäure); NBD (7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl); NCP (N-Cyclohexyl-N'-(1-pyrenyl)carbodiimid); ODR (Octadecylrhodamin); PM (N-(1-Pyren)-maleimid); SRH (Sulforhodamin); TMR (Tetramethylrhodamin); TNP (Trinitrophenyl); TR (Texasrot); BODIPY ((N1-B)-N1'-(Difluorboryl)-3,5'-dimethyl-2-2'-pyrromethen-5-propionsäure-N-succinimidylester); Lanthanidenionenchelate wie ein Iodacetamidabkömmling des Eu3+-Chelats der N-(p-Benzoesäure)diethylentriamin-N,N',N'-tetraessigsäure (DTTA); Eu-DTPA-cs124 und Tb-DTPA-cs124 (das Eu-Chelat und das Tb-Chelat von Diethylentriaminpentaessigäure-Carbostyril 124); Eu-TTHA-cs124 (das Eu-Chelat von Triethylentetraminhexaessigsäure-Carbostyril 124); Eu-DOTA (das Eu-Chelat von 1,4,7,10-Tetraazacyclodedecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure); Eu-DTPA-AMCA (das Eu-Chelat von Diethylentriaminpentaessigsäure-7-amino-4-methylcumarin); sowie Cy5 und Cy5.5 (Cyaninfarbstoffe Cy5 und Cy5.5).
  • Da eine Messung des Energietransfers für Abstandsänderungen am empfindlichsten ist, wenn der Donor-Akzeptor-Abstand in der Nähe ihres Förster-Abstands liegt, wird das Membran-Polypeptid, das den ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paarsystems umfasst, so ausgewählt bzw. künstlich hergestellt, dass sich der erste und zweite Chromophor dem Förster-Abstand nähern oder diesen Abstand haben. Tabelle 1 zeigt einige typische Förster-Abstände von Donor-Akzeptor-Paaren, darunter ausgewählte, zum Vergleich in H2O und D2O gemessene (Selvin und Mitautoren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 10024-10028; Li und Mitautoren, J. Amer. Chem. Soc. (1995) 117: 8132-8138; und Heyduk und Mitautoren, Anal. Biochem. (1997) 248: 216-227).
  • Tabelle 1
    Figure 00560001
  • Ausführliche Aufstellungen von Förster-Abständen für verschiedene Donor-Akzeptor-Paare und ihre konkreten Anwendungen in der FRET-Analyse von biologischen Molekülen einschliesslich Peptiden, Polypeptiden, Kohlenhydraten und Lipiden sind im Fach gut bekannt (siehe z.B. Wu und Mitautoren, a.a.O.; Berlman und Mitautoren (1973), Energy Transfer Parameters of Aromatic Compounds, Academic Press, New York; Von der Meer und Mitautoren (1994), Resonance Energy Transfer Theory and Data, VCH Publishers; Fairclough und Mitautoren, J. Muscle Res. Cell Motility (1987) 8: 97; des Remedios und Mitautoren, Meth. Enzymol. (1978) 48: 347). Diese Förster-Abstände werden als eine allgemeine Richtschnur verwendet, wenn ein konkretes Donor-Akzeptor-Paar ausgewählt wird.
  • Zusätzlich zu dem Gesichtspunkt, die Donor- und Akzeptorgruppen danach auszuwählen, dass sie sich eng beabstandet finden (typischerweise 10-100 Å) und dem Förster-Abstand nähern oder an diesem befinden, werden die Chromophorenpaare für FRET so ausgewählt, dass das Absorptionsspektrum des Akzeptors das Fluoreszenzemissionsspektrum des Donors überlappt und die Übergangsdipolorientierungen von Donor und Akzeptor in etwa parallel sind. Bei Anisotropieuntersuchtungen, in denen zwei identische Chromophore benutzt werden, einer am Membran-Polypeptid und ein anderer an einem Liganden, werden ausserdem die Chromophore bevorzugt so positioniert, dass ein Taumeln der Donor- oder Akzeptorgruppe minimiert wird. In einer bevorzugten Ausführungs form wird zumindest der eine Chromophor in einem starren Abschnitt der in die Matrix eingebetteten Membran-Polypeptid- und/oder Ligationsmarkerkomponente positioniert, zum Beispiel in einem α-Helix- oder β-Faltblattabschnitt. Ein Chromophor, der zwischen zwei etwa 2-3 Å voneinander beabstandeten Cysteinresten in einer α-Helix oder einem β-Faltblatt positioniert und verankert ist, ist für diesen Zweck besonders gut geeignet. Ein Vorteil, der sich aus verringertem Taumeln der Chromophore ergibt, ist eine erhöhte Empfindlichkeit im FRET-Nachweis durch vermindertes Hintergrundrauschen im Spektrum.
  • In den meisten Anwendungen sind Donor- und Akzeptorfarbstoff unterschiedlich, so dass FRET durch das Auftreten von sensibilisierter Fluoreszenz des Akzeptors (Akzeptorverstärkung), Quenchen von Donorfluoreszenz (Donorquenching) oder Fluoreszenzpolarisation (Anisotropie) nachgewiesen werden kann. Wenn Donor und Akzeptor gleich sind, wird FRET typischerweise durch Anisotropie nachgewiesen. Zum Beispiel kann Donorquenching (Fluoreszenzauslöschung) verwendet werden, um Energietransfer zu erkennen. Die Anregung wird bei der Wellenlänge der Donorabsorption angesetzt, und die Donoremission wird verfolgt. Die Emissionswellenlänge des Donors wird so gewählt, dass kein Beitrag von der Akzeptorfluoreszenz beobachtet wird. Ein vorhandener Akzeptor löscht Donorfluoreszenz. Eine grosse Vielfalt von kleinen Molekülen oder Ionen wirken als Fluoreszenzquencher, d.h. senken die Emissionsintensität. Zu diesen Substanzen gehören Iodid, Sauerstoff, chlorierte Kohlenwasserstoffe, Amine und Disulfidgruppen. Die Zugänglichkeit von Fluorophoren für Quencher findet breite Anwendung in der Ermittlung der Lage von Sonden an Makromolekülen oder der Porosität von Proteinen und Membranen für Quencher. Zum Beispiel kann die Intensität von an Polypeptide und Membranen gebundenen Fluorophoren durch Donorquenching in Gegenwart von gelösten, wasserlöslichen Quenchern gemessen werden. Lipidlösliche Quencher wie bromierte Fettsäuren können ebenfalls zugegeben werden, um den inneren Acylseitenkettenbereich von Membranen zu beurteilen.
  • Verfahren der Erfassung von Akzeptorverstärkung können mit fluoreszierenden Akzeptoren verwendet werden, deren Fluoreszenz verstärkt wird, wenn Energietransfer (unter Anregung des Donors) auftritt. Dies ergibt zusätzliche Möglichkeiten, Energie von einem Fluoreszenzspektrum sichtbar zu machen. In einem Emissionsspektrum erfolgt Anregung bei der Wellenlänge der Donorabsorption, und die Intensitätszunahme des Akzeptors wird beobachtet. In einem Anregungsspektrum erfolgt die Messung bei der Wellen länge der Akzeptoremission, und Intensitätsverstärkungen werden in einem Wellenlängenbereich beobachtet, in dem der Donor absorbiert.
  • Die FRET-Analyse der Anisotropie (oder Fluoreszenzpolarisation) ist von besonderem Interesse, wenn zum Beispiel zwei identische Chromophore an ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid und einen wasserlöslichen Liganden angehängt wurden. Die Polarisationseigenschaften des Lichtes und die Abhängigkeit der Lichtabsorption von der Ausrichtung der Fluorophore mit dem elektrischen Vektor des einfallenden Lichtes liefern die physikalische Basis für Anisotropiemessungen. Fluoreszenzsonden bleiben gewöhnlich während 1 bis 100 Nanosekunden (ns) im angeregten Zustand, einer Zeit, die die Fluoreszenz-Lebensdauer genannt wird. Da die Rotationsdiffusion von Polypeptiden ebenfalls in 1 bis 100 ns erfolgt, sind Fluoreszenz-Lebensdauern eine günstige Zeitskala für Untersuchungen des Assoziations- und/oder Rotationsverhaltens von Makromolekülen. Weitere Sonden, zum Beispiel Sonden mit einer Lebensdauer von einigen 100 Mikrosekunden, sind u.a. – aber nicht ausschliesslich – [Ru(bpy)2dcbpy)]2+R, wobei bpy Bipyridin und dcbpy 4.4'-Dicarboxyl-bpy ist; [Os(bpy)2 (dcbpy)]2+; und (L)Re(CO)3C=NR, wobei L = 1,10-Phenanthrolin oder bpy, R = n-Bu oder t-Bu und Bu = Butyl. Eine Übersichtsarbeit zu diesen Komplexen und entsprechende Literaturhinweise sind bei Terpetsching und Mitautoren (Meth. Enzymol. (1997) 278: 295) zu finden. Wenn also eine Probe eines in eine Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptids mit einem geeigneten Donor-Akzeptor-Chomophorenpaar mit senkrecht polarisiertem Licht bestrahlt wird, kann die Emission polarisiert sein. Wenn der Energietransfer zwischen gleichen Molekülen in identischen Umgebungen stattfindet, ändert sich die Fluoreszenzintensität oder Lebensdauer nicht. Auf der anderen Seite kann sich die Anisotropie wegen wahrscheinlicher Unterschiede in der räumlichen Ausrichtung zwischen den an das Membran-Polypeptid und an den Liganden angehängten Chromophoren ändern.
  • Von besonderem Interesse für Anisotropieuntersuchungen ist die Möglichkeit, Chromophore durch Anbringung von zwei Verknüpfungsstellen, zum Beispiel zwei Resten, die durch drei dazwischenliegende Reste entlang einer α-Helix beabstandet sind, in ihrer Rotation um ihre Linkerarme zu behindern. Eine solche Auslegung verhindert, dass sich die angeknüpften Chromophore frei um die Linkerarme drehen, und verhindert damit einen Verlust von räumlicher Information in Anisotropieuntersuchungen. Wenn das Polypeptid einen Liganden bindet, dann haben der an das Membran-Polypeptid gebundene Chromophor und der Ligandenchromophor (und damit ihre jeweiligen Dipole) eine definierte gegenseitige räumliche Ausrichtung. Wichtiger ist, dass ihre gegenseitige Ausrichtung wenig fluktuiert, wenn der Chromophor starr verknüpft ist. Da das Signal-Rausch-Verhältnis in Anisotropiemessungen direkt vom Ausmass der Orientierungsfluktuationen abhängt, ermöglicht eine starre Verknüpfung des Chromophors einen FRET-Nachweis über Anisotropie mit höherer Empfindlichkeit.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, um Polypeptide mit chelator-sensibilisierten, zeitaufgelösten Metallionensonden wie zum Beispiel cumarin-sensibilisierten zeitaufgelösten Lanthanidensonden zu markieren. Dieser Aspekt der Erfindung liefert Verfahren und Zusammensetzungen, um ein beliebiges Peptid oder Polypeptid, das für chemische Festphasensynthese oder eine Kombination von chemischen Festphasensynthese- und chemischen Ligationsverfahren zugänglich ist, darunter lösliche sowie Membrane-Peptide und -Polypeptide, zum Nachweis zeitaufgelöster Lumineszenz in FRET-Messungen und Screening-Tests mit hohem Durchsatz platzspezifisch mit einem sensibilisierten zwitterionischen Metallionen-Chelator-Komplex (MCC: metal ion chelator complex) zu markieren. Das Verfahren beinhaltet, eine oder mehrere Aminosäuren einer Peptid- oder Polypeptidkette, die an ein Harz für chemische Synthese angehängt ist, mit einer zwitterionischen Chelatorgruppe zu markieren, die in der Lage ist, Metallionen zu chelieren. So wird eine Chelatorgruppe gleichzeitig mit der chemischen Synthese auf dem Harz an die Peptid- oder Polypeptidkette angehängt. Metallionen können dann je nach ihrer beabsichtigten Endbestimmung durch die Chelatorgruppe auf dem Harz oder nach Abspaltung der Peptid- oder Polypeptidkette vom Harz komplexiert werden. Für dieses Verfahren geeignete Chelatorgruppen sind u.a. – aber nicht ausschliesslich – die zwitterionischen Cheliermittel aus der Gruppe von TTHA (Triethylentetraminhexaessigsäure), DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), DTTA (Diethylentriamin-N,N,N,N-tetraessigsäure), DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure), TETA (1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure) und beliebigte weitere zwitterionische Chelatorliganden für die Bindung von Metallen. Metallionen von besonderem Interesse sind die Lanthanidenionen und insbesondere Terbium (Tb3+), Samarium (Sm3+) und Europium (Eu3+).
  • Weiter wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, um die Löslichkeit der zwitterionischen Cheliermittel zu erhöhen, darunter der zwitterionischen Cheliermittel aus der Gruppe von TTHA, DTPA, DTTA, DOTA und TETA sowie beliebiger weiterer zwitterionischer Chelatorliganden für die Bindung von Metallen. Dieser Aspekt der Erfindung beinhaltet, ein unlösliches zwitterionisches Cheliermittel mit einem solubilisierenden Mittel zu kombinieren, das eine lösliche Salzform des zwitterionischen Cheliermittels liefert. Dieses Verfahren ist auf jedes zwitterionische Cheliermittel anwendbar, das in den üblicherweise verwendeten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Methanol und dergleichen eine ungenügende Löslichkeit besitzt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das zu solubilisierende zwitterionische Cheliermittel eine Carboxylgruppe, die für eine gegebene, nachfolgende Kupplungsreaktion aktiviert werden soll, während das solubilisierende Mittel gegenüber einer Aktivierung inert ist. Das bevorzugte solubilisierende Mittel ist Trifluoressigsäure (TFA). Zum Beispiel liefert die Kombination des zwitterionischen Chelators TTHA mit TFA das TFA-Salz von TTHA, das als ein gefriergetrocknetes Pulver hergestellt und aufbewahrt werden kann, das sich sehr leicht im DMF auflöst und das gewöhnlich in der chemischen Synthese auf Harz eingesetzt wird. Ein weiteres Beispiel eines solubilisierenden Mittels ist p-Toluolsulfonsäure (TSA). Im Vergleich zu TFA hat TSA die vorteilhaften Eigenschaften, nicht nur eine starke Säure, sondern auch nichtflüchtig und nicht nukleophil zu sein. Es ist ersichtlich, dass je nach der beabsichtigten Endbestimmung auch Kombinationen von solubilisierenden Mitteln eingesetzt werden können. Durch Einsatz des löslichen Salzes eines zwitterionischen Chelators in der Markierung von Peptiden oder Polypeptiden auf dem Harz werden die Reaktionsausbeuten durch die erhöhte Konzentration des für die Reaktion zur Verfügung stehenden löslichen Chelators signifikant verbessert. Ferner wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die eine lösliche Salzform eines zwitterionischen Chelators umfasst. Die bevorzugte lösliche Salzform eines zwitterionischen Chelators ist das TFA-Salz des zwitterionischen Chelators. Eine weitere lösliche Salzform eines zwitterionischen Chelators ist das TSA-Salz des zwitterionischen Chelators. Dazu gehören u.a. – aber nicht ausschliesslich – die TFA- und TSA-Salze von zwitterionischen Cheliermitteln aus der Gruppe von TTHA, DTPA, DTTA, DOTA, TETA und allen anderen zwitterionischen Chelatorliganden für die Bindung von Metallen.
  • Die Markierung von Peptiden und Polypeptiden mit chelator-sensibilisierten zeitaufgelösten Metallionensonden direkt auf dem Harz ermöglicht eine platzspezifische Markierung, eine hohe Reinheit durch die Beseitigung restlicher Reaktionskomponenten und restlicher Farbstoffe sowie bislang nicht möglich gewesene Ausbeuten. Dadurch werden frühere Probleme vermieden, wenn ein Peptid oder Polypeptid nach seiner rekombinanten Erzeugung markiert wurde oder Markierung nach Zusammenbau der Kette durch chemische Synthese erfolgte. Zum Beispiel verursacht die Markierung eines gefalteten Peptids oder Polypeptids mit einem Farbstoff oder anderem Marker oft eine unspezifische, nicht kovalente Bindung des Markers. Im Gegensatz dazu ist es mit dem erfindungsgemässen Verfahren der Chelatormarkierung direkt auf dem Harz viel leichter, bei der Festphasenverknüpfung die Lage des Markers zu steuern und zu charakterisieren, weil alle Stellen für mögliche Nebenreaktionen auf dem Harz geschützt sind, während sie bei der herkömmichen Markierung gefalteter Peptide oder Polypeptide ungeschützt sind. Das Vorgehen der Erfindung, das eine lipidmatrx-gestützte chemische Ligation beinhaltet, vermag auch diesen Vorteil zu erbringen, zum Beispiel wenn die Herstellung des Chelatorkomplexes in Verbindung mit einer chemoselektiven Hydrazon- oder ähnlichen Verknüpfung erfolgt. Auch folgt auf die Festphasensynthese und die direkte Markierung auf dem Harz ein mehrfaches Waschen mit organischem Lösungsmittel, was jeglichen restlichen Farbstoff oder anderen Marker, der nicht kovalent binden konnte, minimiert (im Wesentlichen eliminiert). Was die Ausbeute anbetrifft, so ergaben frühere Verfahren einer Markierung mit den Lanthanidenionen-Chelator-Komplexen „post-resin" (nach Ablösung vom Harz) typischerweise eine Reaktionsausbeute von etwa 10 bis 50 % für eine Komplexbildung mit Ankopplung eines Sensibilisators an den Farbstoff (z.B. die Ankopplung von AMCA-X oder Carbostyril cs124 (7-Amino-4-methyl-2(1H)-chinolin) an den TTHA- oder DTPA-(Diethylentriaminpentaessigsäure-) sensibilisierten Komplex (beschriebene TTHA-Ausbeute etwa 10 bis 25 %, beschriebene DTPA-Ausbeute etwa 40-50 %); siehe z.B. Heyduk und Mitautoren, Anal. Biochem. 11997) 248: 214; Li und Mitautoren, J. Am. Chem. Soc. (1995) 116: 8132; und Mathis und Mitautoren, Clin. Chem. (1995) 41: 1391). Im Gegensatz dazu ist die „on-resin"-Markierung (auf dem Harz) des Verfahrens der vorliegenden Erfahrung im Grunde genommen komplett (> 95 %). Dieser ausserordentliche Unterschied in der Ausbeute beruht teilweise (1) auf dem innewohnenden Vorteil der Festphasensynthese in einem Gelmaterial, das die Reaktanten perfekt solvatisiert, und (2) auf der Möglichkeit, eine hohe Konzentration des Chelators (z.B. TTHA) in DMF durch vorausgehende Umwandlung des Chelators in das TFA-Salz zu erreichen. Weitere Vorteile sind u.a. seine einfache Herstellung. Zum Beispiel werden für eine Anknüpfung des Markers auf dem Harz einige wenige Schritte der Festphasensynthese beansprucht. Alle weiteren Schritte wie die Ligation, Reinigung und Faltung sind die gleichen wie für das native Protein. Hingegen verlangt eine Markierung des gefalteten Proteins potentiell weitreichende Reinigungsarbeit, um nicht umgesetztes Material zu elimnieren.
  • Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung besitzen ein enormes Potenzial für therapeutische Anwendungen, da sie in diagnostischen Tests ebenso gut wie in der Entwicklung neuer Pharmaka verwendet werden können, zum Beispiel indem Verbindungsbibliotheken, die Liganden für interessante Membran-Polypeptide enthalten, mit hohem Durchsatz gescreent werden können. Die Erfindung hat breite Anwendungsmöglichkeiten für die Synthese und für Struktur-Funktions-Untersuchungen gefalteter Membran-Polypeptide, darunter Single-pass- und Multipass-Membran-Polypeptide. Darin einbeschlossen sind die nachweisbare Markierung und der modulare Zusammenbau von Membran-Polypeptiden aus separat synthetisierten und gefalteten Extramembran- und Transmembran-Domänen. Darüber hinaus können rekombinante Polypeptide, die eine native oder künstlich erzeugte Spaltstelle in Nachbarschaft zu einem angepeilten chemoselektiven Ligationsstellenrest besitzen, mit einem halbsynthetischen Vorgehen zu fast jedem gewünschten Peptid gespalten und ligiert werden. Somit ermöglicht die vorliegende Erfindung den Einbau einer sehr grossen Vielfalt von molekularen Werkzeugen wie spektroskopischen Sonden, unnatürlichen Aminosäuren und molekularen Markern mit Ausbeuten, die die mit den derzeit verfügbaren Verfahren erreichten signifikant übertreffen.
  • Durch Ausnutzung der physikalischen und chemischen Eigenschaften einer Lipidmatrix in Kombination mit der Verschiedenartigkeit, Spezifität und Ausbeute der chemoselektiven chemischen Ligationsverfahren eröffnet sich der Zugang zu praktisch allen Membran-Polypeptiden, die einen oder mehrere geeignete chemoselektive chemische Ligationsstellen enthalten, gleichviel ob diese Stellen künstlich erzeugt wurden und/oder natürlich vorkommen. Einbeschlossen ist der Zugang zu einzelnen oder multiplen Transmembran-Domänen, die mit Extramembran-Domänen verbunden sind, zum Beispiel N-terminalen und C-terminalen Sequenzen, sowie/oder zu internen Schleifen, die sich aus der Membran-Doppelschicht heraus erstrecken. Beispielsweise können Schleifen ausserhalb der Membran verkürzt, abgeschnitten oder mit Segmenten, die proteolytische Spaltstellen bilden, fremden Epitopen, Extra-Transmembran-Segmenten oder sogar ganzen Proteinsystemen verlängert werden, um zum Beispiel die Reinigung, biochemische und biophysikalische Untersuchungen oder die Kristallogenese zu erleichtern. Ferner können Transmembran-Segmente wie α-Helices entfernt, dupliziert, ausgetauscht, in eine fremde Umgebung transportiert oder durch synthetische Peptide ersetzt werden, um ihre Integration in die Membran, ihren Zusammenbau und ihre Funktion in der Membran zu charakterisieren. Die Einfügung von Resten, die im Gefolge als Ziel einer interessierenden chemoselektiven Ligationschemie dienen, kann auch als die Grundlage für eine grosse Vielfalt von Experimenten dienen, die von der Erkundung von sekundären, tertiären und quartären Strukturen der Transmembran-Region bis zur Schaffung von Verankerungspunkten für Reportermolekülen reichen, die durch einen Ligationsmarker, der eine kovalente Bindung an der Ligationsstelle umfasst, an ein vorgefaltetes Membran-Polypeptid angehängt werden. Da die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung für die chemische Synthese zugänglich sind und da viele Faltdomänen in Membran-Polypeptiden, insbesondere die α-Helix-Domänen, klein sind, ist eine modulare Synthese von Multipass-Membran-Polypeptiden möglich.
  • Ferner können die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung für Messungen von Resonanzenergietransfer durch FRET-Analysen genutzt werden. Darin einbeschlossen ist der Zugang zu Donor-Akzeptor-Chromophor-Systemen, die als ein qualitatives oder quantitatives Werkzeug verwendet werden können, um Wechselwirkungen zwischen einem gefalteten, in eine Lipidmatrix eingebetteten Membran-Polypeptid und einem Liganden für das Polypeptid, zum Beispiel einem an die Membran gebundenen Rezeptor-Liganden-System, zu charakterisieren. Die Prinzipien und Anwendungen des Einsatzes von Resonanzenergietransfersystemen sind zahlreich und gut bekannt, daher können sie unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung leicht genutzt werden. Zum Beispiel können die lipidmatrix-gestützte Ligation und Synthese genutzt werden, um ein Chromophor-Donor/Akzeptor-System zu schaffen, das einen Nachweis durch FRET ermöglicht. Da die Messungen des Energietransfers auf einer Erfassung von Fluoreszenz beruhen, sind die Tests hochempfindlich und können verwendet werden, um Ligandenbindung nachzuweisen, wenn das markierte Membran-Polypeptid ein Rezeptor für den Liganden ist. Ausserdem kann atomare Strukturinformation für Membran-Poly peptide ohne Rücksicht auf die Komplexität oder Heterogenität des Systems gewonnen werden. Da die Zeitskala des Resonanzenergietransfers in der Grössenordnung von Nanosekunden bis Mikrosekunden liegen kann, können viele Prozesse aufgelöst werden, darunter die langsame Umwandlung von Konformeren, für die in anderen Verfahren der zeitliche Durchschnitt gefunden wird. Dieses Vorgehen kann verwendet werden, um auf die räumliche Beziehung zwischen Donor- und Akzeptor-Chromophoren zu schliessen und Strukturinformation zu gewinnen, darunter die bezüglich liganden-induzierter Konformationsänderungen. Zusätzlich zur Datenerfassung mit einem herkömmlichen Spektrophotofluorimeter können die FRET-Methoden für viele Tests in vitro und in vivo angepasst werden, darunter die Flüssigkeitschromatographie, Elektrophorese, Mikroskopie, Durchflusszytometrie usw. Die vorliegende Erfindung kann somit sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Assays verwendet werden. Die Verfahren können auch als ein einfaches diagnostisches Werkzeug und für Untersuchungen der Membranstruktur und -dynamik angewendet oder auf molekulare Wechselwirkungen auf Zelloberflächen oder in einzelnen Zellen ausgedehnt werden.
  • Die lipidmatrix-gestützte chemische Ligation und Membran-Polypeptidsynthese können auch für „D-target"-Screening genutzt werden. Viele Arzneimittel sind auf integrale Membran-Polypeptide wie Rezeptoren, insbesondere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, sowie auf Ionenkanäle gerichtet. Solche Arzneimittel sind typischerweise entweder kleine chirale Moleküle, oft von Naturprodukten abgeleitet (gewöhnlich Rezeptor-Antagonisten) oder chirale {Peptid-, Polypeptid- oder Kohlenhydrat-} Moleküle. Die letztgenannten, biomolekularen Liganden können je nach den Eigenschaften eines konkreten Systems entweder agonistische oder antagonistische Wirkungen auf das integrale Membran-Polypeptid haben. Siehe z.B. Kent und Mitautoren, WO 93/25667.
  • Alle natürlich vorkommenden Polypeptide bestehen ausschliesslich aus L-Aminosäuren plus der achiralen Aminosäure Glycin. (Sehr selten kann eine Aminosäure durch posttranslationale enzymatische Einwirkung chiral zur entgegengesetzten D-Konfiguration invertiert werden.) Somit bestehen natürliche Polypeptide aus Polypeptidketten, die ausschliesslich die L-Konfiguration besitzen. Die chirale Polypeptidkette faltet sich zu einer definierten dreidimensionalen Struktur, die für ein konkretes Polypeptidmolekül charakteristisch ist. Genau diese gefaltete, dreidimensionale Form gibt einem Polypeptid seine spezifischen Eigenschaften wie Bindung, enzymatische Aktivität, Transporterfunktion usw.
  • Die konkrete gefaltete Gestalt eines Polypeptids wird durch die Sequenz und Chiralität der Aminosäuren in der Polypeptidkette bestimmt. Es ist experimentell gezeigt worden, dass eine Polypeptidkette entgegengesetzter Chiralität, d.h. eine aus D-Aminosäuren bestehende [mit umgekehrter Stereochemie an allen chiralen Zentren einschliesslich der Seitenketten-Cβ-Atome von Thr und Ile], zu einem Polypeptidmolekül einer Gestalt faltet, die das Spiegelbild des Polypeptidmoleküls ist, das durch Faltung der entsprechenden L-Polypeptidkette gebildet wird. Des weiteren hat ein solches „D-Polypeptid" zum entsprechenden L-Polypeptid reziproke Bindungseigenschaften für chirale Liganden, d.h. aus einem Gemisch von Enantiomeren bindet das L-Polypeptid das eine Enantiomer einer Verbindung, während das D-Polypeptid das andere Enantiomer der gleichen Verbindung bindet.
  • Diese reziproken Bindungseigenschaften der spiegelbildlichen Polypeptide können genutzt werden für die Entdeckung von Hinweisen auf neue Pharmaka, d.h. einzigartige kleine chirale Moleküle, die an ein spezifisches Polypeptid binden und seine biologische Funktion stören. So kann ein Gemisch kleiner Moleküle willkürlicher Chiralität, die aus nur einem einzigen Enantiomer jedes Moleküls bestehen, wie zum Beispiel ein Gemisch von Naturprodukten, die aus mikrobiellen, pflanzlichen oder anderen natürlichen Quellen isoliert worden sind, für ein Screening bezüglich der Bindung der Moleküle an der spiegelbildlichen Form, d.h. der D-Form, eines Membran-Polypeptids verwendet werden, wobei diese D-Form unter Einsatz der lipidmatrix-gestützten chemischen Ligation und Synthese erzeugt wird. Mit diesem Verfahren als bindend identifizierte chirale Moleküle binden nur an das D-Polypeptid, aber nicht an das entspechende L-Polypeptid. Wenn aber die chiralen Moleküle, die als am D-Polypeptid bindende Moleküle erkannt worden sind, als identische Moleküle reproduziert (synthetisiert) werden, jedoch mit entgegengesetzter Chiralität (d.h. als das andere Enantiomere, das in dem ursprünglichen Gemisch von Verbindungen, das für das Screening verwendet wurde, nicht vorhanden war), dann bindet das neu synthetisierte Enantiomer nicht an das für das Screening verwendete D-Polypeptid, sondern an das entsprechende L-Polypeptid.
  • Auf diese Weise können einzigartige, chirale bindende Moleküle für natürliche Polypeptid-Pharmaka-Ziele in Bibliotheken von chiralen Molekülen (Naturprodukten) auf gefunden werden. Solche bindenden Moleküle konnten unter Verwendung des entsprechenden natürlichen Polypeptids der L-Konfiguration nicht aufgefunden werden.
  • Die lipidmatrix-gestützte chemische Ligation von Membran-Polypeptiden nach dem Verfahren der Erfindung kann auch genutzt werden, um leichten Zugang zu integralen Membran-Proteinen zu erlangen, die durch eine kovalente Anknüpfung hydrophober Gruppen wie Fettsäuren, Prenylgruppen oder Glycosylphosphatidylinosit-Ankern an der Lipid-Doppelschicht verankert sind. Obwohl viele dieser Polypeptide selbst löslich sind, kann eine Anknüpfung dieser hydrophoben Gruppen die Löslichkeit dieser Proteine verringern und in einer zellfreien Umgebung die Arbeit mit ihnen erschweren. Dementsprechend erleichtert eine chemische Ligation in Gegenwart einer Lipidphase den synthetischen Zugang zu den acylierten Formen dieser Proteine, die mit anderen Methoden nicht zugänglich sind.
  • Fettsäureketten wie Myristinsäure können platzspezifisch durch eine Amidbindung am N-Terminus eines Peptids auf Harz angeknüpft werden. Prenylgruppen und Palmitinsäuregruppen können auf Harz durch Thioetherverknüpfungen an spezifische Cysteinreste angekoppelt werden. Das Peptid kann dann in HF vom Harz abgespalten werden, was ein ungeschütztes Peptid mit einer kovalent angehängten Fettsäure- oder Lipidkette liefert.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen verschiedene Aspekte dieser Erfindung. Diese Beispiele schränken nicht die Reichweite der Erfindung ein. Abbreviations
    AGRP Agouti-verwandtes Protein
    AMCA-X 6-((7-Amino-4-methylcumarin-3-acetyl)amino)hexansäure
    Boc tert-Butoxycarbonyl
    CLP Kubische Lipidphasenmatrix
    DIEA Diisopropylethylamin
    DMF N,N-Dimethylformamid
    DMSO Dimethylsulfoxid
    DNP Dinitrophenyl
    DOPC Dioleoylphosphatidylcholin
    DPC Dodecylphosphocholin
    EDTA Ethylendiamintetraessigsäure, Tetranatriumsalz
    ES/MS Elektrospray-Massenspektrometrie
    Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
    FRET Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer
    HBTU O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
    HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure
    HF Fluorwasserstoff
    hIL-8 humanes Interleukin 8
    HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
    IRK1 einwärts gleichrichtende Kaliumkanalpore
    KCSA Kaliumionenkanalpore von Streptomyces lividans
    LUV Grosse unilamellare Vesikel
    MALDI Matrixgestützte Laserdesorption(s-Massenspektrometrie)
    MBHA Methylbenzhydrylamin
    MC4 Melanocortin
    MO 1-Monooleoyl-rac-glycerin (C18:1, {cis}-9)
    OG β-Octylglucopyranosid
    PAM Phenyl(acetamido)methyl-, d.h. -OCH2C6H4CH2CONHCH2C6H4-(Polystyrol)
    SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
    TAMRA Carboxytetramethylrhodamin
    TCEP Triscarboxyethylphosphin
    TFA Trifluoressigsäure
    TFE Trifluorethanol
    TTHA Triethylentetraminhexaessigsäure
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Auslegung und Synthese eines Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptids
  • Bakteriorhodopsin wirkt als lichtgetriebene Protonenpumpe in der Purpurmembran von Halobakterien und besitzt ein charakteristisches Sieben-Helix-Strukturmotiv. Es gehört zu einer Familie von Retinal bindenden Proteinen, der auch das Rhodopsin als Photorezeptor der Säuger angehört. Bakteriorhodopsin kann aus einem vollkommen denaturierten Zustand erneut zu einem funktionellen, nativen Protein gefaltet werden, und seine ato mare Struktur ist bekannt. Segmente von Bakteriorhodopsin können ebenfalls konstruiert werden, die unabhängig eine die Membran-Doppelschicht durchspannende α-Helix bilden, wenn sie in eine Lipidmembran eingebaut werden (Hunt und Mitautoren, Biophys. J. (1991) 59: 400a).
  • Ein aus der ersten Transmembran-α-Helix von Bakteriorhodopsin und seiner ersten extrazellulären Schleife (den Bakteriorhodopsinresten 5 bis 42 entsprechend) abgeleitetes Membran-Polypeptid wird für die native chemische Ligation ausgewählt. Das Membran-Polypeptid wird so modifiziert, dass der N-terminale Thr-Rest (dem Thr5 von Bakteriorhodopsin entsprechend) mit einem Cys-Rest ersetzt wird, um als Ligationsstelle für eine native chemische Ligation zu dienen (Dawson und Mitautoren, Science (1994) 266: 776-779).
  • Dieser Cys-Rest wird mit einer N-terminalen Faktor Xa-Protease-Spaltstelle und einigen zufällig ausgewählten Resten verkappt, um die Möglichkeit zu prüfen, ob durch Proteasespaltung ein freier N-terminaler Cysteinrest erhalten werden kann. Ein Iminobiotin-Marker wird an den C-terminalen Lys-Rest (dem Lys41 von Bakteriorhodopsin entsprechend) angeknüpft, um Peptidreinigung und den Nachweis in einer MALDI-Analyse zu erleichtern. Wenn nicht anders vermerkt, werden alle Aminosäuresequenzen in der Richtung vom N-Terminal zum C-Terminal angegeben.
  • Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid 1: Native Bakteriorhodopsin-α-Helix 1 und erste extrazelluläre Schleife (SEQ ID NO: 1): TGRPEWIWLA LGTALMGLGT LYFLVKGMGV SDPDAKK. Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid 2: Cys-modifizierte Bakteriorhodopsin-α-Helix 1 und erste extrazelluläre Schleife (SEQ ID NO: 2): CGRPEWIWLA LGTALMGLGT LYFLVKGMGV SDPDAKK. Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid 3: Factor Xa-Protease-Spaltstelle, Cys-modifizierte Bakteriorhodopsin-α-Helix 1 und erste extrazelluläre Schleife (SEQ ID NO: 3): GKGYIEGRCG RPEWIWLALG TALMGLGTLY FLVKGMGVSD PDAKK
  • Das Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid 3 (SEQ ID NO: 3) wird unter Verwendung etablierer Seitenketten-Schutzstrategien auf einem MBHA-Harz synthetisiert, und zwar mit einem In-situ-Neutralisierungsprotokoll für Boc-Chemie, ausser dass die ε-Aminogruppe des C-terminalen Lys mit einer Fmoc-Gruppe geschützt wird (Schnolzer und Mitautoren, Int. J. Pept. Protein Res. (1992) 40: 180-193). Automatisierte Peptidsynthese wird nach etablierten Protokollen auf einem kundenspezifisch modifizierten Applied Bio systems 430A-Peptidsynthesizer durchgeführt (Schnolzer und Mitautoren, a.a.O.). Die Fmoc-Schutzgruppe des C-terminalen Lys wird nach der Peptidsynthese durch Inkubieren mit 20 % Piperidin in DMF entfernt, und eine N-Iminobiotingruppe wird durch Zugabe von 2-Imino-N-hydroxysuccinimid (Sigma, St. Louis) an die freie Aminogruppe angefügt. Das Peptid wird durch eine einstündige Behandlung mit HF bei 0 °C in Gegenwart von 10 Vol.% p-Cresol entschützt und gleichzeitig vom Harz abgespalten. Das rohe Peptid wird in Diethylether ausgefällt, in 75 % B (Acetonitril + 0.1 % TFA) aufgenommen und gefriergetrocknet. Polypeptid 3 (SEQ ID NO: 3) wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt (45 bis 75 % B während 60 Minutes bei 10 ml/min) und durch Elektrospray-MS charakterisiert (MW gefunden: 5080 ± 1 kD, berechnet 5080 kD (durchschnittliche Isotopenzusammensetzung)). Gradienten-HPLC wird mit einem Hochdruck-Mischsystem mit einer Rainin-Doppelpumpe und UV-Nachweis bei 214 nm unter Verwendung einer halbpräparativen Säule Vydac C-4 (10 μm Teilchengrösse, 1 cm × 25 cm) oder einer präparativen Säule Vydac C-4 (10 μm Teilchengrösse, 2,2 cm × 25 cm) ausgeführt. Die Elektrospray-Massenspektren werden mit einem Sciex API-1-Quadrupol-Ionenspray-Massenspektrometer gewonnen. Die MALDI-Massenspektren werden mit einem Ciphergen xyz TOF-MALDI-Instrument gewonnen.
  • Beispiel 2
  • Auslegung und Synthese des Ligationsmarkers
  • Ein C-terminales, thioester-modifiziertes Ligationsmarkerpeptid EAQL (SEQ ID NO: 4), das für eine native chemische Ligation mit dem in die Lipidmatrix eingebauten Membran-Polypeptid (SEQ ID NO: 2) ausgelegt ist, wird manuell auf einem PAM-Thioester erzeugenden Harz synthetisiert, gespalten und wie oben beschrieben entschützt. Das rohe Peptid wird in Diethylether ausgefällt, in 50 % B aufgenommen und gefriergetrocknet. Das Peptid wird durch halbpräparative Umkehrphasen-HPLC (25 bis 45 % B während 45 Minuten bei 10 ml/min) gereinigt und durch Elektrospray-MS charakterisiert (MW gef. 647 ± 1 kD, ber. 647 kD (durchschnittliche Isotopenzusammensetzung)).
  • Beispiel 3
  • Herstellung der CLP-Matrix und Einbau von Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid
  • Mit Membran-Polypeptid 3 (SEQ ID NO: 3) versetzte kubische Lipidphasenmatrizen werden nach Standardprotokollen durch Zentrifugieren der Lipidmatrixbestandteile in einer Heraeus Biofuge 13-Tischzentrifuge hergestellt. Genauer werden 75 μg des Membran-Polypeptids 3 (SEQ ID NO: 3) in 3 μl 200 mM Tris-Puffer von pH 8 mit 2 % OG aufgelöst. Diese Polypeptidlösungen werden in ein 1,7-ml-Eppendorf-Röhrchen gegeben, das 14,2 mg MO enthält. Danach werden 1,5 μl 200 mM Tris-Puffer (pH 8) hinzugefügt, um das Lipid-Wasser-Verhältnis zu senken. Dieses Gemisch wird während drei Stunden bei 12 000 U/min und etwa 25 °C zentrifugiert. Die Bildung der CLP wird durch die Bildung von optisch klaren, gelartigen Phasen angezeigt. Diese Phasen bleiben bei Zimmertemperatur während mindestens zweier Monate optisch klar. Bei 514,5 nm angeregte Off-Resonance-Raman-Spektren werden verwendet, um zu zeigen, dass der Zusatz des Membran-Polypeptids die Membran-Doppelschichtstruktur des CLP nicht stört, was durch ein unverändertes Intensitätsverhältnis der C-H-Valenzschwingungen bei 2885 und 2845 cm–1 in der Gegenwart und Abwesenheit von Membran-Polypeptid in der CLP angezeigt wird (Razumas und Mitautoren, Chemistry and Physics of Lipids (1996) 84: 123-138).
  • Beispiel 4
  • Affinitätsreinigung des in die CLP-Matrix eingebauten Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptids und MALDI-TOF-Analyse
  • Die CLP (MO), die das Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid 3 (SEQ ID NO: 3) enthalten, werden durch Zusatz von 33 mg OG in 100 μl Wasser solubilisiert. Um unerwünschte Ligation während der Analyse zu verhindern, werden während der Solubilisierung 20 % β-Mercaptoethanol zugesetzt. Der pH-Wert der solubilisierten Phase wird mit 0,2 M NaOH auf 9,5 eingestellt. Streptavidin-beschichtete Magnetperlen (Sigma, S 2415) werden den solubilisierten Phasen zugesetzt und bei Zimmertemperatur während einer Stunde inkubiert. Die Magnetperlen werden fünfmal mit 20 mM Bis-Tris-Propanpuffer von pH 9,5 gewaschen; sie werden nach jedem Waschen durch magnetische Trennung isoliert. Die Magnetperlen werden in einer gesättigten Lösung von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 50 % Acetonitril/0,1 % TFA erneut aufgeschlämmt. Ein aliquoter Teil von 1 ml der Aufschlämmung von Magnetperlen und Matrix wird direkt auf den Probenglasträger aufgebracht und luftgetrocknet. Die Probenzubereitungen werden mit dem Flugzeit massenspektrometer eines Ciphergen Biosystems Massphoresis System analysiert. Alle Spektren werden mit Peptidstandards intern kalibriert und stellen den Durchschnitt von 25 Schüssen dar.
  • Beispiel 5
  • Proteasespaltung des in die CLP-Matrix eingebauten Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptids
  • Die Proteasespaltung des in die CLP-Matrix eingebauten Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptids 3 (SEQ ID NO: 3) erfolgt durch Zusatz von 1,5 μl einer 1 mg/ml-Lösung von Factor Xa (New-England Biolabs} in 50 % Glycerin und 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (pH 8,0) zur CLP. Das Gemisch wird mit der Spitze einer Kunststoffpipette gründlich vermischt und die CLP während 15 Minutes bei 12 000 U/min zentrifugiert, um die Bildung einer optisch klaren Phase zu erreichen. Das Ausmass der Spaltung nach einer Inkubation über Nacht und die Erzeugung von in die CLP eingebautem Spaltprodukt wird durch MALDI-Massenspektrometrie bestimmt, wie oben beschrieben.
  • Example 6
  • Native chemische Ligation des in eine CLP-Matrix eingebauten Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptids
  • Die native chemische Ligation des in CLP eingebauten Polypeptids wird wie folgt ausgeführt. Ungefähr 10 μm des Ligationsmarkerpeptids EAQL (SEQ ID NO: 4) werden in 1 μl 200 mM Tris-Puffer (pH 8) aufgelöst und zu der CLP hinzugefügt, die das Cys-terminale Transmembran-Polypeptid (SEQ ID NO: 2) enthält, danach werden 0,5 μl Thiophenol und 3 mg MO zugegeben, um ein ungefähres Lipid-Wasser-Verhältnis aufrecht zu erhalten, das mit der CLP-Bildung kompatibel ist. Das Gemisch wird mit der Spitze einer kleinen Pipette gründlich vermischt. Die CLP wird dann während 15 Minutes bei 12 000 U/min zentrifugiert, um eine optisch klare Phase zu bilden. Aliquote Teile der CLP werden in definierten Zeitabständen entnommen, um den Fortschritt der Ligation durch MALDI-Massenspektrometrie zu verfolgen, wie oben beschrieben. Das primäre chemische Ligations-Reaktionsprodukt ist das folgende:
    Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid 5: Durch chemische Ligation markierte, Cys-modifizierte Bakteriorhodopsin-α-Helix 1 und erste extrazelluläre Schleife (SEQ ID NO: 5): EAQLCGRPEW IWLALGTALM GLGTLYFLVK GMGVSDPDAK K.
  • 3 liefert eine schematische Darstellung, die die Proteasespaltung und den Einsatz einer nativen chemischen Ligation zur Erzeugung eines markierten, in die CLP-Matrix eingebetteten Membran-Polypeptids veranschaulicht. Nach Einbau in die CLP-Lipid-Doppelschicht wird das N-terminale Polypeptid, das die Protease-Erkennungsstelle enthält, durch Faktor Xa-Spaltung entfernt (A). Ein Ligationspeptid, das dem N-Terminus von Bakteriorhodopsin entspricht (Ile4 ist durch Leu4 ersetzt worden, um die Ligation zu optimieren), wird dann an das Transmembran-Polypeptid ligiert, um den vollen Bakteriorhodopsin-N-terminus zu erhalten (B). Das Ausmass der Spaltung und der Fortschritt der Ligation im Inneren der CLP werden gemessen, indem MALDI-Massenspektren des über einen N-Iminobiotinmarker an Magnetperlen adsorbierten Transmembran-Polypeptids aufgenommen werden (C).
  • 4 zeigt ein typisches MALDI-Massenspektrum-Ausgangsignal, das die Entstehung eines freien, ungeschützten N-terminalen Cysteins durch Proteasespaltung und nachfolgende chemische Ligation eines frei gewählten Ligationspeptids an diesen Rest verfolgt. Spektrum A ist ein MALDI-Spektrum von Polypeptid 3 (SEQ ID NO: 3) nach Einbau in eine CLP, gefolgt von Auflösung der CLP in OG/20 % β-Mercaptoethanol. Das Spektrum weist einen Hauptpeak bei m/z = 5080 auf, der der Masse des ungespaltenen Polypeptids 3 (SEQ ID NO: 3) entspricht. Kleinere Peaks stellen Verunreinigungen von den Affinitätsperlen dar und sind auch in den Spektren vorhanden, die in Abwesenheit des Proteins aufgenommen werden (Daten nicht gezeigt). Das Spektrum B stellt ein Massenspektrum des gleichen Polypeptids nach einer Spaltung mit Faktor Xa über Nacht dar. Das Verschwinden des Hauptpeaks bei m/z = 5080 und das damit einhergehende Aufkommen eines Hauptpeaks mit m/z = 4220 ist mit der fast völligen Entfernung der Cys-Verkappungssequenz GKGYIEGR durch die Factor Xa-Protease und Entstehung des Polypeptids 2 (SEQ ID NO: 2) vereinbar.
  • Die Spektren C, D und E verfolgen das Auftreten von Ligationsprodukt nach dem Zusatz eines zweifachen Überschusses des Ligationspeptids 4 (SEQ ID NO: 4) mit 5 % Thiophenol zum Cys-terminalen Membran-Polypeptid 2 (SEQ ID NO: 2) nach einer Inkubation von 25 und 75 Minutes bzw. über Nacht. Das allmähliche Verschwinden des Peaks bei m/z = 4220 und das damit einhergehende Anwachsen eines Peaks bei m/z = 4661 zeigt den Fortschritt der Bildung einer nativen Amidbindung zwischen dem α-helicalen Transmembran-Polypeptid 2 (SEQ ID NO: 2) und dem Ligationspeptid 4 (SEQ ID NO: 4). Nach dem MALDI-Massenspektrum beurteilt, ist die Umwandlung des Cys-verkappten Transmembran-Polypeptids in das voll ligierte Transmembran-Polypeptid (SEQ ID NO: 5) zu mehr als 90 % beendet.
  • Beispiel 6
  • Umkehrphasen-HPLC-Reinigung des in die kubische Lipidphase eingebauten Membran-Polypeptids
  • Die chemische Ligation des Membran-Polypeptids mit dem Membran-Polypeptid 1 (SEQ ID NO: 1) und dem Membran-Polypeptid 4 (SEQ ID NO: 4) wird wie oben beschrieben ausgeführt und ergibt das in die CLP eingebaute Membran-Polypeptid 5 (SEQ ID NO: 5). Nachdem die Ligation abgeschlossen ist, wird die gesamte CLP in 50 μl 85 % wässrigem Isopropanol, das 50 mM Ameisensäure enthält, aufgelöst. Die Lösung wird dann mit einem gleichen Volumen von 50 mM wässriger Ameisensäure verdünnt.
  • Eine Umkehrphasen-HPLC-Säule C18 wird bei 45 % (6 : 3 : 1 Isopropanol/Acetonitril/Wasser mit 0,1 % TFA) ins Gleichgewicht gebracht. 20 μl aufgelöste CLP werden in die Säule eingespritzt und isokratisch mit 45 % Isopropanol/Acetonitril/Wasser mit 0,1 TFA eluiert. Das ligierte Membran-Polypeptid 5 (SEQ ID NO: 5) ist nach 10-minütiger isokratischer Elution eluiert und wird durch ES/MS positiv identifiziert. MO wird zwischen 16 und 20 Minuten isokratisch eluiert. Das Membran-Polypeptid 5 (SEQ ID NO: 5) wird durch Gefriertrocknung isoliert.
  • Beispiel 7
  • Ort des Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptids in der CLP Matrix
  • Die Kanäle innerhalb einer CLP sind mit wässrigem Puffer angefüllt, während bei einem Lipid/Tensid-Verhältnis von 300: 1 überschüssiges Tensid in die Lipid-Doppelschichtphase absorbiert wird. Ausserdem wird eine vollständige Ligation auch in Abwesenheit von Tensid beobachtet (Daten nicht gezeigt). Das Peptid 1 ist ein äusserst hydrophobes Peptid u löst sich nicht in 6 M Guanidinium-HCl/200 mM Phosphat (pH 7,5). Daher ist es unwahrscheinlich, dass signifikante Mengen dieses Peptids im wässrigen Kanal gelöst sind. Ausserdem wird keine sichtbare Aggregation des hydrophoben Peptids festgestellt, wenn die CLP nach Einbringen von 1 mg des Peptids in eine CLP der gleichen Grösse langzeitlich bei 12 000 U/min zentrifugiert werden. Zusammengenommen mit der früheren Beobachtung durch CD-FTIR-Spektroskopie und Proteolyseschutzversuche, dass sich Peptid 1 im Inneren von Liposomen unabhängig zu einem α-helikalen Transmembran-Polypeptid faltet (Hunt und Mitautoren, Biophys. J. (1991) 59: 400a), kann vernünftig gefolgert werden, da s die Spaltung und Ligation des Peptids 1 an einem in die Membran-Doppelschicht eingebauten Peptid erfolgen.
  • Zusammengenommen zeigen die obigen Beispiele an, dass die Spaltung des Transmembran-Peptids 3 (SEQ ID NO: 3) und die Ligation des Transmembran-Peptids 2 (SEQ ID NO: 2) and des Peptids 4 (SEQ ID NO: 4) tatsächlich an einem Polypeptid erfolgen, das in die Membran-Doppelschicht eingebaut ist, um eine Lipidmatrix zu bilden, in der das Transmembran-Polypeptid 5 (SEQ ID NO: 5) korrekt und funktionell eingebettet ist.
  • Beispiel 8
  • Chromophor-Markierung und FRET-Analysen des Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptids in einer CLP-Matrix
  • Ein chromophor-markiertes, in eine CLP-Matrix eingebettetes Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid wird konstruiert und mit FRET analysiert, indem das Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid 1 (SEQ ID NO: 1) zuerst mit TTHA-Cumarin markiert und dann der Thioester-Ligationsmarker, das Peptid 4 (SEQ ID NO: 4), mit Texasrot markiert wird.
  • Das Membran-Polypeptid 1 (SEQ ID NO: 1) und das Ligationsmarkerpeptid 4 (SEQ ID NO: 4) werden auf einem PAM-Thioester erzeugenden Harz bzw. auf einem Carboxy erzeugenden Harz synthetisiert, indem ein In-situ-Neutralisierungsprotokoll für Boe-Chemie und etablierte Seitenketten-Schutzstrategien verwendet werden. Das Transmembran-Bakteriorhodopsin mit einem Cumarin-Lanthanid-Komplex wie folgt.
  • Vor dem eigentlichen Markierschritt wird das TTHA-TFA-Salz hergestellt; 100 mg TTHA werden in 50 ml unvermischter TFA während vier Stunden bei Zimmertemperatur aufgelöst. Die Lösung wird in einem Rotationsverdampfer Rotavap eingedampft, in 50 % wässrigem Acetonitril aufgenommen und gefriergetrocknet, um ein weisses Pulver zu ergeben, das sich sehr leicht in DMF auflöst.
  • Markierung der freien Aminogruppen auf dem Harz: Zur Ankopplung an den N-Terminus des Polypeptids wird das N-terminal mit Boc geschützte Peptidharz in DMF ins Gleichgewicht gebracht. Die terminale Boc-Gruppe wird durch Behandlung mit TFA (2 × eine Minute) entfernt und dann mit DMF, 10 % DIEA in DMF und DMF gewaschen. Zur Ankopplung an einen Lysinrest wird das ε-Fmoc-geschützte Boc-Lysin während des Kettenzusammenbaus in die Ziel-Polypeptidkette eingebaut. Die Fmoc-Gruppe wird entweder durch Behandlung mit 20 % Piperidin in DMF (2 × fünf Minuten) oder durch Behandlung mit einem doppelten Überschuss von DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en) während einer Minute für das Ziel-Polypeptid auf dem Thioester erzeugenden Harz entfernt. Das Polypeptid wird dann mit DMF gewaschen.
  • Fluoreszenzsonden des ACMA-X-Chelatkomplexes: Das N-terminal mit Boc geschützte Peptidharz wird in DMF ins Gleichgewicht gebracht. Die Fmoc-Schutzgruppe von Lysin 36 im Membran-Polypeptid 1 (SEQ ID NO: 1) wird durch eine zehnminütige Behandlung mit 20 % Piperidin in DMF entfernt. Dann werden 10 mg AMCA-X (ein etwa zweifacher Überschuss) in 150 μl DMSO aufgelöst und während einer Stunde zu 0,01 mmol abgetropftem Peptidharz hinzugegeben. Nicht umgesetztes AMCA-X wird mit DMSO und DMF weggewaschen. Ninhydrintests vor und nach der Kupplungsreaktion zeigten > 95 % Umsatz. Etwa 0,03 mmol TTHA-TFA-Salz wurden in einer äquimolaren Menge von 0,5 M HBTU-Lösung in DMF mit etwa 20 % DIEA aufgelöst und über Nacht an das Peptidharz angekoppelt. Das Harz wird mit DMF und Dichlormethan gewaschen und getrocknet. Die HF-Harzspaltung und Peptidreinigung wurden nach Standardprozeduren ausgeführt (Schnoelzer, 1992, a.a.O.). Zur Komplexbildung mit den Lanthanidenionen (Eu3+, Tb3+ oder Sm3+) wird das Peptid in 50 % Acetonitril, das einen dreifachen Überschuss wässrigen Lanthanidchlorids enthält, aufgelöst. Der Metalleinbau wird mit ES/MS-Analyse verfolgt. Die Extinktionsspektren des komplex-gebundenen Peptids zeigten ein Absorptionsmaximum bei 329 nm.
  • Texasrot-Fluoreszenz-Sonde: Das N-terminal Boc-geschützte Polypeptid- (SEQ ID NO: 4) harz wird in DMF ins Gleichgewicht gebracht und die Boc-Gruppe durch Behandlung mit TFA (zweimal je eine Minute) entfernt. Der N-Terminus wird dann durch Behandlung mit 10 % DIEA (zweimal je eine Minute) neutralisiert. 25 mg Texasrot (ein etwa zweifacher Überschuss) werden in 150 μl DMSO aufgelöst und während einer Stunde zu 0,02 mmol abgetropftem Peptidharz hinzugegeben. Nicht umgesetzter Farbstoff wird mit DMSO und DMF weggewaschen. Ninhydrintests vor und nach der Kupplungsreaktion zeigten > 95 % Umsatz. Die HF-Harzspaltung und Peptidreinigung werden nach Standardprozeduren ausgeführt (Schnoelzer, 1992, a.a.O.).
  • Beide Polypeptide (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4) werden wie in Beispiel 4 beschrieben zur CLP-Matrix hinzugegeben, zusammen mit einer wässrigen Pufferlösung, die einen dreifachen Überschuss der chelierten Metalle (Eu3+, Tb3+ oder Sm3+) und 1 % Thiophenol enthält. Nach der Ligation wird die das ligierte Membran-Polypeptid enthaltende Lipidmatrix in eine kleine Küvette überführt und ins Gleichgewicht gebracht, um ein optisch isotropes CLP-Matrixgel zu erhalten. Die Fluoreszenz-Energietransfermessungen wurden bei Anregung mit einer gepulsten Xenon-Blitzlichtlampe bei 330 nm und Nachweis nach einem 50-Mikrosekunden-Fenster bei Wellenlängen zwischen 500 und 750 nm mit einem Fluorolog 3-Spektrofluorimeter ausgeführt. Die FRET-Abstände werden durch einen Vergleich zum bekannten Abstand zwischen den Markierungsplätzen in der Bakteriorhodopsin-Kristallstruktur analysiert.
  • Beispiel 9
  • Chemische Ligation von in Liposomen eingebautem Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid
  • Zur Herstellung von Lipidvesikeln wird Ei-Lecithin in 2 : 1 Chloroform/Methanol aufgelöst, in einem Rundkolben zu einem trockenen Film eingedampft und weiter unter Vakuum in einem Gefriertrockner getrocknet. Das Lipid wird während 30 s in einem Vortexmischer in wässrigem Puffer (5 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, pH 7,2) aufgeschlämmt, um multilamellare Liposomvesikel zu bilden. Nach 10 Frost-Tau-Zyklen werden aus den Phospholipiden LUV durch Extrusion durch Polycarbonatmembranen (dreimal mit 0,4 μm Porendurchmesser, zehnmal mit 0,1 μm Porendurchmesser) hergestellt. Die Lösung wird bei 500 g zentrifugiert, um Lipidaggregate zu einem Pellet zu vereinigen, während die Liposomen dann bei 48 000 g zu Pellets zentrifugiert werden
  • Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid 3 (SEQ ID NO: 3) wird in einer minimalen Menge unvermischtem TFE aufgelöst und bei einem Lipid/Protein-Verhältnis von 1000 : 1 zu einer Aufschlämmung von Ei-Lecithin-Liposomenvesikeln in einem wässrigen Puffer (5 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, pH 7,2) hinzugegeben. Der Einbau des Membran-Polypeptids in die Liposomen-Lipidmembran wird durch Beobachtung der Fluoreszenzemission von Tryptophan overhalb von 300 nm verfolgt. Die Proteoliposomen werden bei 48 000 g zu Pellets zentrifugiert und bei –80 °C in aliquoten Mengen eingefroren.
  • Für die chemische Ligation des in das Lipid eingebetteten Polypeptids wird eine aliquote Menge der Proteoliposomen in 5 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, pH 7,2 aufgeschlämmt und mit 0,01 Moläquivalenten von Faktor Xa-Protease behandelt, dann wie in Beispielen 3 und 5-6 beschrieben ligiert und die Ligation wie in Beispiel 4 verfolgt.
  • Beispiel 10
  • Chemische Ligation von in Micellen eingebautem Bakteriorhodopsinmembran-Polypeptid
  • 300 μg des Membran-Polypeptids 2 (SEQ ID NO: 2) und 50 μg C-terminal mit α-Thioester modifiziertes Ligationspolypeptid 4 (SEQ ID NO: 4) werden in 100 μl 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) mit 10 % Ammonyx-LO (N,N-Dimethylaminoxid) und 1 μl Thiophenol aufgelöst. Die Lösung wird während 24 Stunden bei Zimmertemperatur in einem Eppendorf-Röhrchen gerührt. Der Ligationsfortschritt wird durch analytische Umkehrphasen-HPLC verfolgt. Das ligierte Membran-Polypeptid wird mit halbpräparativer Umkehrphasen-HPLC isoliert, die Identität des ligierten Produkts (Membran-Polypeptid 5 (SEQ ID NO: 5)) durch Massenanalyse mit Elektrospray-Massenspektrometrie bestätigt.
  • Beispiel 11
  • Chemische Ligation von in eine Zellmembran eingebautem Melanocortin-Rezeptor MC4
  • Die chemische Membran-Polypeptid-Ligation von rekombinant erzeugtem Melanocortin-Rezeptor MC4, der in Stücke von aus Zellen isolierter Lipidmembran eingebettet war, wird wie folgt ausgeführt. HEK-293-Zellen, die den MC4-Rezeptor mit einer künstlich eingebauten Faktor Xa-Spaltstelle (SEQ ID NO: 6) überexprimieren, werden wie folgt konstruiert, wobei das MC4-Rezeptormembran-Polypeptid mit Factor Xa-Spaltstelle (SEQ ID NO: 6) die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
    Figure 00770001
    Figure 00780001
  • Das MC4-Membran-Polypeptid (SEQ ID NO: 6) ist für eine chemische Ligation nach einer Faktor Xa-Spaltung; mit einem C-tenninal α-thioester-modifizierten Rezeptor-Ligationsmarker (SEQ ID NO: 7) mit der folgenden Aminosäuresequenz ausgelegt:
    Figure 00780002
  • Der Ligationsmarker ist wahlweise so modifiziert, dass er weitere Modifikationen wie die Insertion unnatürlicher Aminosäuren, isotopenmarkierter Aminosäuren oder an spezifischen Stellen angefügter Fluoreszenzsonden enthält. Zum Beispiel wird der N-Terminus des Ligationsmarkers durch Ankupplung von Texasrot in DMSO modifiziert, wie in Beispiel 8 beschrieben
  • Eukaryontische HEK-293-Zellen, die den MC4-Rezeptor (SEQ ID NO: 6) überexprimieren, werden wie folgt konstruiert: Die für den MC4-Rezeptor kodierende Region des Gens wird in Bakteriophagen M13 subkloniert, um eine einsträngige, platzgerichtete Mutagenese durchzuführen (Sambrook und Mitautoren, a.a.O.). Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese (Kunkel, 1984; Zoller und Smith, 1987) mit einem In-vitro-Mutagenese-Kit Muta-Gene T4® (BioRad, Hercules, CA) wird eingesetzt, um die Faktor Xa-Stelle zu erzeugen (Bakteriophag M13-Vektor, das mutante Rezeptorgen pGRFN-MC4-8a enthaltend). Das Vorhandensein der Faktor X-Spaltstelle wird durch einsträngige DNA-Sequenzierung bestätigt (Sequenase Version 2.0 (Life Science, Cleveland, OH)). Die für mutante MC4-Rezeptoren kodierende DNA wird in den eukaryontischen Expressionsvektor pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) subkloniert, um das MC4-Rezeptor-Expressionskonstrukt pGRFN-MC4-8b zu erzeugen. Dieses Konstrukt wird mit Standardprotokollen (LipfectAmine Reagent® (Life Technologies, Gaithersburg, MD)) in HEK-293 Zellen (ATCC, Manassas, VA) transfiziert, um die Zelllinie cGRFN-MC4-8a zu gewinnen.
  • Membranstücken werden aus cGRFN-MC4-8a-Zellen isoliert, die das MC4-Rezeptormembran-Polypeptid (SEQ ID NO: 6) exprimieren. Von einer 10-cm-Kulturplatte genommene Zellen, die je ungefähr 107 Rezeptoren enthalten, werden fünfmal mit PBS (PBS: 1,12 M NaCl, 2,6 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4) gewaschen und in hypotonischem Puffer (1 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 mM EDTA) inkubiert. Die Zellen werden durch Scherwirkung (mit einer Spritze dreimal durch eine Gauge 26-Nadel) zerborsten. Die zerborstenen Zellen werden auf einen Dichte-Stufengradienten geladen und während 10 Minuten bei 20 000 g zentrifugiert. Die Gradientengrenzfläche mit den Membranstücken wird mit einer Pasteurpipette aufgenommen. Die Membranstücken werden während 10 Minuten bei 48 000 g sedimentiert und dreimal mit darauf folgender Sedimentation gewaschen. Alle Prozeduren werden bei 4 °C ausgeführt, wenn nicht anders vermerkt.
  • Zur Spaltung des MC4-Membran-Polypeptids (SEQ ID NO: 6) mit Faktor Xa und zur nativen chemischen Ligation an den MC4-Rezeptor-Ligationsmarker (SEQ ID NO: 7) werden Membranstücken, die den rekombinanten MC4-Rezeptor (SEQ ID NO: 6) enthalten, in 50 μl 100 mM Tris/pH 8 aufgeschlämmt, die Proteaseinhibitoren enthalten, die nicht gegen die Faktor Xa-Protease gerichtet sind, wie Aprotinin, 2 mg/mL, N-[N-(L-3-trans-Carboxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]agmatin, 10 μg/ml, und Pepstatin A, 2 mg/ml. Zwei μl Factor Xa-Lösung (1,0 mg/ml) werden hinzugefügt und die Aufschlämmung über Nacht bei Zimmertemperatur (etwa 25 °C) inkubiert. Die Membranstücken werden bei 48 000 g sedimentiert und dreimal mit je 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Die Spaltung von MC4 (SEQ ID NO: 6) mit Faktor Xa ergibt das MC4-Rezeptormembran-Polypeptid-Faktor Xa-Spaltprodukt (SEQ ID NO: 8):
    Figure 00790001
    Figure 00800001
  • Die chemische Ligation des gespaltenen MC4 (SEQ ID NO: 8) in Membranstücken an einen MC4-Ligationsmarker (SEQ ID NO: 7) mit oder ohne AMCA-X/TTHA/Eu3+ wird wie folgt ausgeführt. Eine 2 mM Lösung des MC4-Ligationsmarkers (SEQ ID NO: 7) mit einem C-terminalen Thioester wird zu 1,5 M Guanidiniumchlorid/100 mM Natriumphosphat (pH 7,5) mit 1 % Thiophenol hinzugefügt und über Nacht inkubiert. Fluoreszenzmarkierter oder nativer MC4-Ligationsmarker (SEQ ID NO: 7) mit einem C-terminalen Thioester wird dann zu 1,5 M Guanidiniumchlorid/100 mM Phosphat (pH 7,5) mit 1 % Thiophenol hinzugefügt. Die Markierung mit AMCA-X/TTHA/Eu3+-Chelat wird wie in Beispiel 8 beschrieben ausgeführt, mit den folgenden Modifikationen. Nach einer Inkubation über Nacht werden die den modifizierten MC4-Rezeptor enthaltenden Membranen mit PBS gewaschen und aliquote Teile werden bei –80 °C gefroren. Das Ligationsprodukt besitzt die folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 9), die dem halbsynthetischen, in die Lipidmatrix eingebetteten MC4-Rezeptor entspricht, mit oder ohne platzspezifischen Fluoreszenzmarker:
    MC4-Rezeptormembran-Polypeptid-Ligationsmarker-Ligat (SEQ ID NO: 9):
    Figure 00800002
  • Membranstücke, die den chemisch ligierten MC4-Rezeptor (SEQ ID NO: 9) enthalten, werden in 10 % SDS-PAGE-Ladepuffer aufgelöst und auf ein 10 % SDS-PAGE-Gel geladen, um durch Western-Blotting identifiziert zu werden. Alternativ wird der Fluoreszenzsonden-markierte MC4-Rezeptor direkt auf dem Gel sichtbar gemacht.
  • Beispiel 12
  • FRET-Analyse von Chromophor-markiertem Melanocortin-Rezeptor MC4
  • Die FRET-Analyse von cs124/TTHA/Tb3+- oder AMCA-X/TTHA/Eu3+-chelatmarkiertem MC4-Rezeptor wird wie folgt ausgeführt. Membranstücke, die Rezeptoren enthalten, die cs124/TTHA/Tb3+- oder AMCA-X/TTHA/Eu3+-Chelat tragen, werden wie in Beispiel 11 konstruiert und in einer 200-μl-Küvette in PBS aufgeschlämmt. Der MC4-Rezeptorligand AGRP wird der im Beispiel 11 beschriebenen Prozedur folgend mit TAMRA (gepaart mit Th3+-Chelat) oder Texasrot (gepaart mit Eu3+-Chelat) markiert. Die Sequenz des humanen AGRP (SEQ ID NO: 10) ist:
    Figure 00810001
  • TAMRA- oder Texasrot-markiertes AGRP wird aus einer Vorratslösung in PBS in die Küvette titriert, und Fluoreszenzspektren werden mit einem Fluorolog 3 Spektrofluorimeter aufgenommen, das mit einer Xenon-Blitzlichtlampe ausgerüstet ist. Die Emission wird nach 50 μs während 1 ms zwischen 400 und 700 nm erfasst.
  • Für ein Screening, um Ligandenbindungsinhibitoren zu finden, werden potentielle Inhibitoren zugegeben und die Änderungen in der Form des Fluoreszenzspektrums verfolgt. Alternativ wird das Abklingen der Fluoreszenzemission bei 543 nm für TAMRA oder bei 614 nm für Texasrot verfolgt. Ein Ersatz des quenchenden natürlichen Liganden durch den Inhibitor führt zu einer Verlängerung der Fluoreszenz-Lebensdauer bei dieser Wellenlänge.
  • Beispiel 13
  • Totalsynthesis der Einwärts gleichrichtenden Kaliumkanalpore IRK1 und FRET-Analysen ihrer Wechselwirkung mit einem Toxinliganden
  • Polypeptide für eine chemische Totalsynthese und Chromophormarkierung der Kanalpore IRK1 werden auf der Grundlage der dreidimensionalen Struktur des homologen Kaliumkanals von Streptomyces lividans (Dole und Mitautoren, Science (1998) 280: 69-77) sowie dafür ausgelegt, Toxinbindung zu ermöglichen (MacKinnon und Mitautoren, Science (1998) 280: 106). Die Polypeptide werden so konstruiert, dass die N-terminale Domäne die äussere Helix, die C-terminale Domäne die inneren und die Porenhelices hervorbringt. Ein Glycinest wird in die Position 120 von IRK1 hereinsynthetisiert, um die chemische Ligation zu erleichtern. Polypeptide für eine schrittweise Synthese und das Ligationsprodukt von IRK1 werden in den folgenden SEQ ID NOs illustriert:
    Polypeptid der N-terminalen Domäne von IRK1 (SEQ ID NO: 11):
    Figure 00820001
  • Polypeptid der C-terminalen Domäne von IRK1 (SEQ ID NO: 12):
    Figure 00820002
  • Totalsynthetisches/ligiertes Polypeptid von IRK1 (SEQ ID NO: 13):
    Figure 00820003
  • Der N-Terminus von IRK1 (76-120) (SEQ ID NO: 11) wird unter Verwendung eines In-situ-Neutralisierungsprotokolls für Boc-Chemie und etablierter Seitenketten-Schutzstrategien auf einem PAM-Thioester erzeugenden Harz synthetisiert. Ein TTHA-Cumarinmarker wird den oben beschriebenen Prozeduren folgend an den N-Terminus des N-terminalen Polypeptids angehängt. Die Polypeptide werden während einer Stunde bei 0 °C durch eine Behandlung mit HF in Gegenwart von 10 Vol.% p-Cresol entschützt und gleichzeitig vom Harz abgespalten. Das rohe Polypeptid wird in kaltem Ether ausgefällt und dreimal gewaschen, dann in unvermischter TFA aufgelöst. Die TFA wird auf einem Rotavap entfernt und der Rückstand in unvermischtem TFE aufgenommen, um eine klare Lösung zu bilden. Die TFE-Lösung wird mit 50 % wässrigem Acetonitril, das 0,1 % TFA enthält, zehnfach verdünnt und gefriergetrocknet.
  • Zur Reinigung wird das rohe Polypeptid mit unvermischtem TFE aufgenommen und mit zwei Äquivalenten 6 M Guanidiniumchlorid, das 100 mM Acetat enthält (pH 4), verdünnt. Das Material wird auf eine mit 45 % Puffer B (100 % Acetonitril, 0,1 % TFA enthaltend) ins Gleichgewicht gebrachte präparative HPLC-Säule C4 (Innendurchmesser ein Zoll) geladen. Nach 15-minütigem isokratischem Ablauf der Säule bei 10 ml/min 45 % C wird das Peptid in 60 min bei 10 ml/min in einem Gradienten von 45 % bis 75 % C eluiert. Alle 5 ml werden Fraktionen gesammelt und mit ES/MS auf ihre Reinheit hin analysiert.
  • Der C-Terminus von IRK1 (120-186) (SEQ ID NO: 12) wird unter Verwendung eines In-situ-Neutralisierungsprotokolls für Boc-Chemie und etablierter Seitenketten-Schutzstrategien auf einem Amid erzeugenden Harz synthetisiert. Die Peptide werden während einer Stunde bei 0 °C durch eine Behandlung mit HF in Gegenwart von 10 Vol.% p-Cresol entschützt und gleichzeitig vom Harz abgespalten. Das rohe Peptid wird in kaltem Ether ausgefällt und dreimal gewaschen, dann in unvermischter TFA aufgelöst. Die TFA wird auf einem Rotavap entfernt und der Rückstand in unvermischtem TFE aufgenommen, um eine klare Lösung zu bilden. Die TFE-Lösung wird mit 50 % wässrigem Acetonitril, das 0,1 % TFA enthält, zehnfach verdünnt und gefriergetrocknet.
  • Zur Reinigung wird das rohe Polypeptid mit unvermischtem TFE aufgenommen und mit zwei Äquivalenten 6 M Guanidiniumchlorid, das 100 mM Acetat enthält (pH 4), verdünnt. Das Material wird auf eine mit 65 % Puffer C (60 % Isopropanol, 30 % Acetonitril, 10 % H2O mit 0,1 % TFA) ins Gleichgewicht gebrachte präparative HPLC-Säule C4 (Innendurchmesser ein Zoll) geladen. Nach 15-minütigem isokratischem Ablauf der Säule bei 10 ml/min 65 % Puffer C wird das Peptid in 45 min bei 10 ml/min in einem Gradienten von 65 % bis 95 % Puffer C eluiert. Alle 5 ml gesammelte Fraktionen werden mit Lanthanidenionenchelat (z.B. Terbiumchelat, Tb3+Cl3) rekonstituiert und mit ES/MS auf ihre Reinheit hin analysiert.
  • Zur lipidmatrix-gestützten membranchemischen Ligation in dem eine CLP-Matrix bildenden Lipid werden 50 μg N-terminales Polypeptid (SEQ ID NO: 11) and 60 μg C-terminales Polypeptid (SEQ ID NO: 12) in 3 μl DMSO aufgelöst und zu 42,6 mg MO und 1 μl Thiophenol in einem Eppendorf-Zentrifugenröhrchen hinzugefügt. Das Gemisch wird während 2,5 Stunden zentrifugiert, bis die Bildung einer klaren Phase beobachtet wird. Die Reaktion wird über Nacht belassen. Die MALDI-Massenanalyse zeigt, dass Ligationsprodukt (SEQ ID NO: 13) vorhanden ist.
  • Ein Agitoxinligand (SEQ ID NO: 14), der dafür ausgelegt ist, an den synthetischen Kaliumkanal IRK1 zu binden, wird unter Berücksichtigung der bekannten Kanal-Toxin-Wechselwirkungsstellen durch chemische Synthese konstruiert (Doyle und Mitautoren, a.a.O.; Savarin und Mitautoren, Biochemistry (1998) 37: 5407-5416). Ein Texasrotmarker wird der in Beispiel 8 beschriebenen Prozedur folgend an das C-terminale Lysin (Rest 39) von Agitoxin 2 (SEQ ID NO: 14) angehängt. Das Toxin, IRK1-Agitoxin 2-Ligand (SEQ ID NO: 14), hat die folgende Aminosäuresequenz:
    Figure 00840001
  • Das IRK1-Toxinpeptid wird durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und in 2 M Guanidiniumchlorid/100 mM Tris, pH 8,6 mit 8 mM Cystin/1 mM Cystein gefaltet, gefolgt von präparativer Umkehrphasen-HPLC während 45 Minuten bei 10 ml/min (25 bis 45 % B (Isopropanol/Acetonitril 2 : 1)).
  • Das gefriergetrocknete IRK1-Toxin wird dann mit der CLP-Matrix vermischt, die das mit Lanthanidenionenchelat markierte IRK1-Membran-Polypeptid (SEQ ID NO: 13) enthält, und zentrifugiert, um ins Gleichgewicht gebracht zu werden. Das klare, rote Gel wird dann in einem Spex-Fluorolog 3-Fluorimeter auf einen Halter für feste Proben aufgebracht, und das Vorhandensein von Energietransfer wird ermittelt, indem das bei 330 nm angeregte Fluoreszenzspektrum des Gels zwischen 450 und 600 nm aufgenommen wird. Eine wässrige Lösung eines Antagonisten mit kleinem Molekül wird dann in die CLP gemischt, und die Verdrängung des Toxins aus dem Kanal wird durch eine Abnahme der Fluoreszenz beobachtet.
  • Beispiel 14
  • Chemische Ligation von in eine CLP eingebautem Kaliumionenkanal von S. lividans
  • Die für die die Membran durchspannenden Domänen der Kaliumionenkanalpore von Streptomyces lividans (KCSA) verwendeten Peptide werden auf der Grundlage der bekannten Struktur von KCSA ausgelegt (Doyle und Mitautoren, Science (1998) 280: 69-77). Die für Ligation verwendete N-terminale Transmembrandomäne (SEQ ID NO: 15) ist dafür ausgelegt, die äussere Helix hervorzubringen, während die Auslegung der C-terminalen Transmembrandomäne (SEQ ID NO: 16) die inneren und Porenhelices hervorbringt. Diese Ligationsauslegung führt zu einer verkürzten Version der natürlich vorkommenden KCSA, um die Funktionalität der die Membran durchspannenden Anteile von extrazellulären Anteilen zu isolieren. Ferner wird anstelle des Ala54 in dem natürlich vorkommenden KCSA (160 Reste) während der Peptidsynthese ein Cystein eingebaut, um eine chemoselektive Gruppe einzuführen, die einer nativen chemischen Ligation zugänglich ist, um an der Ligationsstelle eine native Peptidhauptkette zu erzeugen. Die Sequenzen des N- terminaten und C-terminaten Produkts und des fertigen Ligationsprodukts werden hierunter wiedergegeben.
  • N-terminates Segment des Kaliumkanals KCSA (SEQ ID NO: 15):
    Figure 00850001
  • C-terminales Segment des Kaliumkanals KCSA (SEQ ID NO: 16):
    Figure 00850002
  • Ligationsprodukt des Kaliumkanals KCSA (SEQ ID NO: 17):
    Figure 00850003
  • Der N-Terminus von KSCA (Reste 23-53) (SEQ ID NO: 15) wird unter Verwendung eines In-situ-Neutralisierungsprotokolls für Boc-Chemie und etablierter Seitenketten-Schutzstrategien auf einem PAM-Thioester erzeugenden Harz synthetisiert. Die Peptide werden während einer Stunde bei 0 °C durch eine Behandlung mit HF in Gegenwart von 10 Vol.% p-Cresol entschützt und gleichzeitig vom Harz abgespalten. Das rohe Peptid wird in kaltem Ether ausgefällt und dreimal gewaschen, dann in unvermischter TFA aufgelöst. Die TFA wird auf einem Rotavap entfernt und der Rückstand in unvermischtem TFE aufgenommen, um eine klare Lösung zu bilden. Die TFE-Lösung wird mit 50 % wässrigem Acetonitril, das 0,1 % TFA enthält, zehnfach verdünnt und gefriergetrocknet. Zur Reinigung wird das rohe Peptid (SEQ ID NO: 15) mit unvermischtem TFE aufgenommen und mit zwei Äquivalenten 6 M Guanidiniumchlorid, das 100 mM Acetat enthält (pH 4), verdünnt. Das Material wird auf eine mit 45 % Puffer C (60 % Isopropanol, 30 % Acetonitril, 10 % H2O mit 0,1 % TFA) ins Gleichgewicht gebrachte präparative HPLC-Säule C4 (Innendurchmesser ein Zoll) geladen. Nach 15-minütigem isokratischem Ablauf der Säule bei 10 ml/min 45 % Puffer C wird das Peptid in 60 min bei 10 ml/min in einem Gradienten von 45 % bis 75 % Puffer C eluiert. Alle 5 ml werden Fraktionen gesammelt und mit ES/MS auf ihre Reinheit hin analysiert.
  • Der C-Terminus von KSCA (Reste 54-118) (SEQ ID NO: 16) wird unter Verwendung eines In-situ-Neutralisierungsprotokolls für Boc-Chemie und etablierter Seitenketten-Schutzstrategien auf einem Amid erzeugenden MBHA-Harz synthetisiert. Das Peptid wird während einer Stunde bei 0 °C durch eine Behandlung mit HF in Gegenwart von 10 Vol.% p-Cresol entschützt und gleichzeitig vom Harz abgespalten. Das rohe Peptid wird in kaltem Ether ausgefällt und dreimal gewaschen, dann in unvermischter TFA aufgelöst. Die TFA wird auf einem Rotavap entfernt und der Rückstand in unvermischtem TFE aufgenommen, um eine klare Lösung zu bilden. Die TFE-Lösung wird mit 50 % wässrigem Acetonitril, das 0,1 % TFA enthält, zehnfach verdünnt und gefriergetrocknet. Zur Reinigung wird das rohe Peptid (SEQ ID NO: 16) mit unvermischtem TFE aufgenommen und mit zwei Äquivalenten 6 M Guanidiniumchlorid, das 100 mM Acetat enthält (pH 4), verdünnt. Das Material wird auf eine mit 65 % Puffer C ins Gleichgewicht gebrachte präparative HPLC-Säule C4 (Innendurchmesser ein Zoll) geladen. Nach 15-minütigem isokratischem Ablauf der Säule bei 10 ml/min 65 % Puffer C wird das Peptid in 45 min bei 10 ml/min in einem Gradienten von 65 % bis 95 % Puffer C eluiert. Alle 5 ml werden Fraktionen gesammelt und mit ES/MS auf ihre Reinheit hin analysiert.
  • Zum Einbau in eine CLP-Matrix werden 50 mg MO in 2 ml Chloroform/Methanol (2 : 1) aufgelöst. 2 mg DOPC werden der Lösung zugegeben. 70 μg N-terminales Peptid (SEQ ID NO: 15) und 90 μg C-terminales Peptid (SEQ ID NO: 16) werden in 150 μl TFE aufgelöst und während 30 min in einem Glasfläschchen auf 60 °C erwärmt. Die beiden Lösungen werden dann vereinigt. Die vereinigte Lösung wird eingetrocknet, indem das Lösungsmittel mit Argon weggeblasen wird, und über Nacht unter Vakuum stehen gelassen, um einen milchigen Film zu ergeben. 35 μl Natriumphosphat (100 mM, pH 7,5) and 0,5 μl Thiophenol werden auf den trockenen Film gegeben. Das Gemisch wird während 2,5 Stunden zentrifugiert, bis die Bildung einer klaren Phase beobachtet wird. Die Reaktion wird über Nacht belassen. Am nächsten Tag werden 100 μl TFE mit 20 % β-Mercaptoethanol zu der Phase hinzugefügt. Die Phase wird kurz im Vortexmischer vermischt und in einer Tischzentrifuge während 10 Minuten zentrifugiert. Dann werden 150 μl Puffer C (6 : 3 : 1 Isopropanol/Acetonitril/H2O mit 0,1 % TFA) in 0,1 % wässriger TFA hinzugefügt. Restlicher Niederschlag wird in unvermischter TFA aufgelöst. Die Lösung wird filtriert, und eine Spatelspitze TCEP wird hinzugefügt, um die Probe zu reduzieren. Schliesslich wird das aufgelöste Reaktionsgemisch in eine GPC-(Gelpermeationschromatographie-)säule eingespritzt, die mit in Puffer C ins Gleichgewicht gebrachtem Divinylbenzol gefüllt ist. Die Eluatpeaks werden gesammelt, und die Fraktionen werden mit MALDI-Massenspektrometrie analysiert (siehe Figur. 10).
  • Beispiel 15
  • Chemische Ligation von in Micellen eingebautem HIV-Vpu-Ionenkanal
  • Die chemische Totalsynthese des HIV-Vpu-Ionenkanals unter Verwendung einer nativen chemischen Ligation wird wie folgt ausgeführt. Das N-terminale Peptid (Vpu-Reste 1-39) (SEQ ID NO: 18): MEPIQLAIVA LVVAIIIAIV VWSIVIIYRK ILRQRKID, wird auf einem Thioester erzeugenden Harz synthetisiert, das C-terminale Peptid (Vpu-Reste 40-81) (SEQ ID NO: 19): CLIDRLIERA EDSGNESEGE ISALVEMGVE MGHHAPWDID DL, auf einem Standardharz-OCH2 PAM. Die Peptide werden durch native chemische Ligation an einem nicht nativen Cysteinrest kombiniert, der während der Peptidsynthese geeignet eingeführt wird und in der Mitte des Proteins positioniert ist. Eine 2 mM Lösung des N-terminalen Peptids wird in einem Micellen bildenden Ligationspuffer mit 250 mM Phosphatpuffer (pH 7,5), 8 M Harnstoff, 250 mM DPC und 1 μl Thiophenol hergestellt. Dieser Lösung wird ein 1,2-facher molarer Überschuss von C-terminalem Peptid zugefügt. Die Lösung wird während drei Stunden bei Zimmertemperatur in einem Eppendorf-Röhrchen gerührt. Der Ligationsfortschritt wird durch analytische Umkehrphasen-HPLC verfolgt. Die Reaktion ist nach drei Stunden beendet und stellt eine mehr als 95-%ige Ausbeute von den anfänglichen Reaktionskomponenten dar. Das ligierte Membran-Polypeptid wird mit halbpräparativer Umkehrphasen-HPLC isoliert, die Identität des ligierten Produkts durch Massenanalyse mit Elektrospray-Massenspektrometrie für eine Masse bestätigt, die der erwarteten Sequenz entspricht, wie folgt (SEQ ID NO: 20):
    Figure 00870001
    • Siehe 9.
  • Beispiel 16
  • Chemische Ligation von in Micellen eingebautem Influenza M2-Ionenkanal
  • Die chemische Totalsynthese des Influenza M2-Ionenkanals wird wie in Beispiel 15 beschrieben vorbereitet, indem die folgenden M2-Peptide für die micellen-vermittelte Ligation verwendet werden. Das auf Thioester erzeugendem Harz synthetisierte N-terminale Peptid hat die folgende Sequenz (SEQ ID NO: 21):
    Figure 00880001
    die den M2-Resten 1-49 entspricht. Das auf Standardharz-OCH2 PAM synthetisierte C-terminale Peptid hat die folgende Sequenz (SEQ ID NO: 22):
    Figure 00880002
    die den M2-Resten 50-97 entspricht. Wie beim HIV Vpu-Ionenkanal ist die Reaktion nach drei Stunden beendet, wobei mehr als 95 % der Ausgangspeptide in der Reaktion ligiert worden sind, um das ligierte Produkt zu liefern (M2-Reste 1-97). Halbpräparative Umkehrphasen-HPLC und eine Massenanalyse mit Elektrospray-Massenspektrometrie bestätigten ein Ligationsprodukt mit einer der erwarteten Sequenz entsprechenden Masse, wie folgt (SEQ ID NO: 23)
    Figure 00880003
  • Die analytische Ultrazentrifugierung des in die DPC-Micellen eingebauten M2-Ligationsprodukts zeigt, dass M2 zu Tetrameren oligomerisiert.
  • Beispiel 17
  • Chemische Totalsynthese und Auf-Harz-Markierung humaner IL-8-Chemokine und FRET-Analyse der Dimerisierung in Lösung
  • Humanes IL-8 (hIL-8) ist ein Mitglied der Alpha-(CXC-)Chemokinfamilie, und seine Dimerisierungseigenschaften sind gut untersucht worden (Rajaratham und Mitautoren, (1997) Methods in Enzymology 287: 89-105). Das hIL-8 wird auf Harz synthetisiert und mit einem FRET-Paar markiert, um die Dimerisierungseigenschaften in Lösung zu charakterisieren und mit seinen Membran-Polypeptid-Rezeptoren CXCR1 und CXCR2 zu testen. Ein FRET-Paar aus TTHA-cs124-Tb3+-Marker (Donor) und TAMRA (Akzeptor) ist ein Beispiel für ein Markersystem, das als für diesen Zweck geeignet ausgewählt wurde.
  • Die für die chemische Totalsynthese und Fluoreszenzmarkierung des humanen IL-8 auf Harz erforderlichen Peptide werden unter Verwendung der veröffentlichten Aminosäuresequenz dieses Proteins ausgelegt. Für die Auslegung der Synthese und Markierung wird ein zusätzlicher Lysinrest zum C-Terminus hinzugefügt, um auf Harz die Fluores zenzsonde anzuknüpfen, und eine Cystein-Ligationsstelle wird in der Mitte der Sequenz ausgewählt, was zu zwei Polypeptiden mit 33 bzw. 40 Aminosäuren führt.
  • N-terminales Peptid von hIL-8 (1-33) (SEQ ID NO: 24):
    Figure 00890001
  • C-terminales Peptid von hIL-8 (34-73) (SEQ ID NO: 25):
    Figure 00890002
  • Synthetisches hIL-8 voller Länge (1-73) (SEQ ID NO: 26):
    Figure 00890003
  • Das N-terminale Thioesterpeptid von hIL-8 (1-33) wird wie oben beschrieben (siehe z.B. Beispiel 13) synthetisiert, entschützt und gespalten. Zur Reinigung wird das rohe Peptid zuerst in 6 M Guanidiniumchlorid/0,1 M Natriumacetat, pH 4,0 aufgelöst, dann auf eine präparative Umkehrphasensäule C4 geladen, die in 10 % Puffer B (100 % Acetonitril, 0,1 % TFA enthaltend) ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Guanidinium wurde während 15 Minuten bei isokratischem Ablauf von 10 % Puffer B bei 13 ml/min eluiert. Ein Gradient von 30 % zu 50 % in 60 Minuten wird verwendet, um das Peptid herauszueluieren. Fraktionen werden alle 6 ml gesammelt, mit ES/MS auf ihre Reinheit analysiert und dann gefriergetrocknet.
  • Das akzeptor-markierte C-terminale Peptid hIL-8 (34-73-TAMRA) wird auf MBHA-Harz synthetisiert und, wie im Beispiel 8 beschrieben, unter Verwendung von 5-(und 6-) Carboxytetramethylrhodamin-succinimidylester markiert. Das Polypeptid wird dann in ähnlicher Weise wie das N-terminale Peptid entschützt, gespalten und gereinigt. Das donor-markierte C-terminale Peptid hIL-8-TTHA-cs124 wird wie folgt hergestellt. Die Fmoc-Seitenkette am Lysin 73 wird durch 20 % Piperidin entfernt (zweimal fünf Minuten), dann gut mit DMF gewaschen. Zehn Äquivalente des TFA-Salzes von TTHA werden in 0,5 M HBTU (1 : 1-Molverhältnis von TTHA zu HBTU) aufgelöst, mit 3,5 Moläquivalenten von DIEA neutralisiert und dann zum Harz hinzugefügt. Die Ankupplung erfolgt während dreier Stunden, bis das Ninhydrin klar aussieht. Um das cs124 an das TTHA auf dem Harz anzukoppeln, wird ein Äquivalent von HBTU je TTHA mit vier Äquivalenten von DIEA zum Harz hinzugefügt, um während einer Minute aktivieren zu lassen. Dem aktivierten Harz werden 10 Moläquivalente von in DMF aufgelöstem cs124 zugefügt und während drei Stunden ankoppeln lassen. Überschüssiges cs124 wird mit DMF weggewaschen, und das Harz wird wie oben beschrieben in HF gespalten. Das markierte C-terminale Peptid hIL-8 (34-73-TTHA-cs124) wird wie oben beschrieben gereinigt.
  • Die chemische Ligation des gereinigten N-terminalen Peptids mit jedem der markierten, gereinigten C-terminalen Peptide wird in Lösung (6 M Guanidiniumchlorid/0,1 M Natriumphosphat, pH 7, 0,1 mM Peptid) mit 0,1 % Thiophenol als Katalysator ausgeführt. Die Reaktion ist nach 16 Stunden beendet. Beide Ligationsprodukte werden während 20 Minuten bei pH 8,6 mit β-Mercaptoethanol (20 %) behandelt, um etwa verbleibende DNP-Schutzgruppen an den Histidinresten zu beseitigen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 4,0 abgesenkt, TCEP wird hinzugefügt, um etwa vorhandene Disulfide zu reduzieren, und das Reaktionsgemisch wird auf eine halbpräparative Umkehrphasensäule C4 in 10 % Puffer B geladen. Das Ligationsprodukt wird während 60 Minuten bei einem Gradienten von 30 auf 50 % Puffer B herauseluiert. Fraktionen von 1,5 ml werden gesammelt, mit ES-MS auf ihre Reinheit analysiert und dann gefriergetrocknet.
  • Das TAMRA-markierte hIL-8-Polypeptid wird gefaltet, indem das gefriergetrocknete Ligationsprodukt zuerst in 6 M Guanidiniumchlorid/0,1 M Tris, pH 8,0 aufgelöst und dann mit 0,1 M Tris, pH 8,0, auf 2 M verdünnt wird. Die schlussendliche Peptidkonzentration beträgt 1 mg/ml. Ein Redoxpuffer von 8 mM Cystein und 1 mM Cystin wird einbezogen, um Disulfidshuffling zu unterstützen. Nach 16 Stunden ist die Faltreaktion beendet. Dieses gefaltete Produkt wird wie oben beschrieben durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Das gewünschte Produkt enthaltende Fraktionen werden durch ES-MS identifiziert. Ein Verlust von 4 AME bestätigt das Vorhandensein von zwei Disulfidbrücken und folglichen Verlust von vier Protonen. Das gefaltete Produkt wird gefriergetrocknet und bis zu seiner Verwendung bei –20 °C aufbewahrt. Das TTHA-cs124-markierte hIL-8-Polypeptid wird auf ähnliche Art gefaltet.
  • Gefaltetes hIL-8 (1-73-TTHA-cs124) wird in 20 mM Bis-Tris-Propan, pH 6,5, aufgelöst und mit drei Äquivalenten von TbCl3 rekonstituiert. Die Emissionsspektren des Proteins werden mit einer Anregungswellenlänge von 342 nm aufgenommen und zeigen starke Metallemissionsbanden bei 488, 543 und 583 nm, die für Tb3+-Emission typisch sind. Gefaltetes hIL-8 (1-73-TAMRA) wird ebenfalls in 20 mM Bis-Tris-Propan, pH 6,5, aufgelöst und weist eine typische, um 577 nm zentrierte Rhodaminemission auf, wenn bei 553 nm angeregt.
  • Der Abstand zwischen den Donor- und Akzeptormarkern in einem Proteinkomplex kann aus den gemessenen Fluoreszenzlebensdauern mit den folgenden Gleichungen ermittelt werden (Biological Spectroscopy, I. D. Campbell und R. A. Dwek (1984), Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Seiten 114-115). Die Effizienz des Energietransfers (E) zwischen den beiden Sonden wird ermittelt, indem über die Gleichung: E = 1 – (τDA/τD), die Lebensdauer des Donors (τD) mit der Lebensdauer des Donors in Gegenwart des Akzeptors (τDA) verglichen wird. Diese Effizienz wird dann zum Förster-Radius (R0) in Beziehung gesetzt, um den durchschnittlichen Abstand (R) zwischen den beiden Markern mit der Gleichung: R = R0{(1 – E)/E}1/6, zu ermitteln.
  • Gleiche Konzentrationen (30 μM) des Donors, hIL-8 (1 – 73-TTHA-cs124-Tb3+), und des Akzeptors, hIL-8 (1 – 73-TAMRA), werden zusammengemischt, und die Lebensdauer bei 488 nm wird gemessen. Bei dieser Konzentration sollte ein grosser Anteil des Proteins in der Lösung dimerisiert sein, da die Dimerisationskonstante etwa 10 μM beträgt. Die Abklingkurve zeigt ein biexponentielles Abklingen. Die Hauptkomponente dieses Abklingens besitzt eine kürzere Lebensdauer von 0,22 ms und entspricht der Lebensdauer des Komplexes zwischen Donor und Akzeptor (τDA). Diese Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer der Donoremission erfolgt wegen des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers, FRET, vom Donor zum Akzeptor. Die kleinere Komponente dieses Abklingens hat eine Lebensdauer von etwa 1 ms und entspricht dem monomeren Donorprotein oder dem mit sich selbst komplexierten Donorprotein. Der zeitabhängige Verlust von Emission bei 570 nm wird ebenfalls gemessen und zeigt ein Einzelphasenabklingen mit einer Lebensdauer von 0,24 ms. Bei dieser Wellenlänge wird nur das Abklingen der sich aus FRET ergebenden Akzeptoremission beobachtet. Diese Lebensdauer ist der bei 488 nm ermittelten ähnlich. Schliesslich wird das zeitabhängige Abklingen der Fluoreszenzemission des Donors allein (30 μM) bei 488 nm nach Anregung bei 342 nm verfolgt. Diese Abklingkurve zeigt ein monoexponentielles Abklingen mit einer berechneten Lebensdauer von 0,94 ms (τD).
  • Unter Benutzung der gemessenen Lebensdauern und der oben beschriebenen Gleichungen werden eine Effizienz (E) des Energietransfers von 75 % und ein Abstand (R) von etwa 50 Å beobachtet. In Anbetracht der früher ermittelten NMR-Struktur des Komplexes ist dies eine vernünftige Schätzung. Der Abstand zwischen den beiden C-Termini in dieser Struktur beträgt 40 Å. Wenn die zusätzlichen Lysin-Seitenketten berücksichtigt werden, erscheint eine Schätzung von 50 Å vernünftig. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Proteine in Lösung gefaltet sind und Dimere bilden. Diese Ergebnisse demonstrieren des Weiteren die Vorteile, eine Markierung auf dem Harz zu nutzen, um die Spezifität, Reinheit und Ausbeute für hochempfindliche FRET-Analysen zu liefern.
  • Beispiel 18
  • Micellen-vermittelte chemische Ligation des emrE-Transporters
  • Eine Micellen-vermittelte chemische Ligation wird auf die chemische Totalsynthese des emrE-Transportproteins (SEQ ID NO: 27):
    Figure 00920001
    angewendet.
  • Das N-terminale emrE-Peptidsegment 1 (SEQ ID NO: 28): MNPYIYLGGA ILAEVIGTTL MKFSEGFTRL WPSVGTIICY, und das mittlere emrE-Peptidsegment 2 (SEQ ID NO: 29): C(Acm) ASFWLLAQT LAY AIWSGVGIVL ISLLSWGFFG QRLDLPAIIG MMLI, werden auf Thioester erzeugendem Harz synthetisiert, das C-terminale emrE-Peptidsegment 3 (SEQ ID NO: 30): CAGVLI INLLSRSTPH, auf Standard-MBHA-Harz. Je 3,5 mg des emrE-Peptidsegment 2-Thioesters und des emrE-Peptidsegments 3 werden zusammen in 50 μl TFE und 350 μl Wasser aufgelöst. 10 mg DPC-Pulver werden hinzugefügt. Die klare Lösung wird in flüssigem Stickstoff gefroren und während fünf Stunden gefriergetrocknet, was eine mit Peptid durchsetzte Micellenmatrix von DPC ergibt. 400 μl 200 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) mit 8 M Harnstoff und 4 μl Thiophenol werden zur Lipidmatrix hinzugefügt, was eine klare Lösung der Peptidsegmente ergibt. Nach zweitägiger Ligation wird das Ligationsgemisch zu einer Lösung von 2 ml TFE und 2 ml Wasser mit 20 % β-Mercaptoethanol hinzugegeben und während 20 Minuten inkubiert. Die Lösung wird mit einer Lösung von 15 mg/ml TCEP in 20 % wässriger Essigsäure angesäuert und auf eine halbpräparative Umkehrphasen-HPLC-Säule geladen. Fraktionen, die das gewünschte erste Ligationsprodukt (Ligationsprodukt der emrE-Segmente 2 + 3) enthalten, werden durch Elektrospray-Massenspektrometrie identifiziert und über Nacht gefriergetrocknet.
  • Um die N-terminale „Acm-" (Acetamidomethyl-)gruppe zu entfernen, wird das anfallende gefriergetrocknete/ligierte emrE-Peptidsegment (Ligationsprodukt der emrE-Segmente 2 + 3, etwa 2 mg) in 50 μl TFE und 350 μl 0,5 M Essigsäure aufgelöst. Die Acm-Gruppe wird dann durch einstündige Behandlung mit einem 1,5-molaren Überschuss (bezogen auf die Gesamtkonzentration von Cystein) einer Hg(acetat)2-Lösung entfernt. Die Lösung wird dann 20-%ig in β-Mercaptoethanol gemacht, auf eine analytische Umkehrphasen-HPLC-Säule geladen und mit einem Stufengradienten gereinigt. Fraktionen, die das gewünschte ligierte Produkt enthalten, wurden mit Elektrospray-Massenspektrometrie identifiziert und über Nacht gefriergetrocknet.
  • Gleiche Mengen des anfallenden entschützten ligierten emrE-Peptidsegments (Ligationsprodukt der emrE-Segmente 2 + 3) und des fertigen emrE-Segment 1-Thioesters werden zusammen in 50 μl TFE und 350 μl Wasser aufgelöst. 5 mg DPC-Pulver werden hinzugegeben. Die klare Lösung wird in flüssigem Stickstoff gefroren und während mehrerer Stunden gefriergetrocknet, was eine mit Peptid durchsetzte Micellenmatrix von DPC ergibt. 200 μl 250 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) mit 8 M Harnstoff und 2 μl Thiophenol werden zur Lipidmatrix hinzugefügt, was zu einer klaren Lösung der Peptidsegmente führt. Nach eintägiger Ligation wird das Ligationsgemisch zu einer Lösung von 1,4 ml TFE, 0,7 ml β-Mercaptoethanol, 0,7 ml Piperidin und 1,4 ml Wasser hinzugegeben und während 20 Minuten inkubiert, um etwa verbleibende Schutzgruppen zu entfernen. Die Lösung wird mit einer Lösung von 15 mg/ml TCEP in 20 % wässriger Essigsäure angesäuert, auf eine halbpräparative Umkehrphasen-HPLC-Säule geladen und mit einem linearen Gradienten gereinigt. Fraktionen, die das gewünschte ligierte Produkt (SEQ ID NO: 27) enthalten, werden mit Elektrospray-Massenspektrometrie identifiziert und über Nacht gefriergetrocknet. SEQUENZLISTEN
    Figure 00940001
    Figure 00950001
    Figure 00960001
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    Figure 01010001
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    Figure 01040001
    Figure 01050001

Claims (66)

  1. Verfahren zur chemoselektiven chemischen Ligation eines Membran-Polypeptids, wobei das Verfahren umfasst, ein Membran-Polypeptid, das in eine Lipidmatrix eingebaut ist und eine erste Aminosäure mit einer ungeschützten reaktiven Gruppe umfasst, mit einem Ligationsmarker in Berührung zu bringen, der eine zweite Aminosäure mit einer ungeschützten reaktiven Gruppe umfasst, die unter Bedingungen der chemoselektiven chemischen Ligation zur chemoselektiven chemischen Ligation mit der ersten Aminosäure befähigt ist, wodurch eine kovalente Bindung zwischen der ersten und zweiten Aminosäure gebildet wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chemosetektive chemische Ligation aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus nativer chemischer Ligation, Ligation unter Oximbildung, Ligation unter Thioesterbildung, Ligation unter Thioetherbildung, Ligation unter Hydrazonbildung, Ligation unter Thiazolidinbildung und Ligation unter Oxazolidinbildung besteht.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidmatrix Lipidmoleküle umfasst, die in der Lage sind, eine lyotrope Phase zu bilden.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidmatrix aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer planaren Doppelschichtmembran, einem Liposom, einer Micelle oder einer kubischen lipidischen Phasenmatrix besteht.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Membran-Polypeptid gefaltet ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Membran-Polypeptid ein integrales Membran-Polypeptid ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das integrale Membran-Polypeptid ein Transmembran-Polypeptid ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Transmembran-Polypeptid ein Rezeptor ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligationsmarker eine oder mehr Aminosäuren umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligationsmarker ein Peptid umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein wasserlösliches Peptid ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein lipidlösliches Peptid ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Polypeptid umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Membran-Polypeptid ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine unnatürliche Aminosäure umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die unnatürliche Aminosäure einen Chromophor umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Chromophor eine Akzeptorgruppe eines Resonanzenergietransfer-Akzeptor-Donor-Paares ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Chromophor eine Donorgruppe eines Resonanzenergietransfer-Akzeptor-Donor-Paares ist.
  19. Verfahren zur Markierung eines gefalteten, in eine Lipidmembran eingebetteten Polypeptids, das Verfahren umfassend, ein gefaltetes, in eine Lipidmembran eingebettetes Membran-Polypeptid, das eine Aminosäure umfasst, die eine ungeschützte reaktive Gruppe besitzt, die zur chemoselektiven chemischen Ligation befähigt ist, durch Spaltung des gefalteten, in die Lipidmembran eingebetteten Polypeptides mit einem spaltenden Mittel zu erzeugen, das selektiv das benannte Polypeptid an einer Spaltstelle in Nachbarschaft zu der benannten Aminosäure spaltet; und einen Ligationsmarker, der eine Aminosäure umfasst, die eine ungeschützte reaktive Gruppe besitzt, die zur chemoselektiven chemischen Ligation befähigt ist, unter Bedingungen an das gefaltete, in die Lipidmembran eingebettete Polypeptid zu ligieren, unter denen eine kovalente Bindung zwischen den benannten Aminosäuren gebildet wird, wodurch das benannte gefaltete, in die Lipidmembran eingebettete Polypeptid markiert wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltstelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer chemischen Spaltstelle und einer Proteasen-Spaltstelle besteht.
  21. Zusammensetzung, ein markiertes Membran-Polypeprid umfassend, das durch das Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 20 hergestellt wurde.
  22. Zusammensetzung, die als Komponenten umfasst: a) einen Ligationsmarker, eine Aminosäure umfassend, die eine ungeschützte reaktive Gruppe hat, die zur chemoselektiven chemischen Ligation befähigt ist; und b) ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass das Membran-Polypeptid eine Aminosäure umfasst, die eine ungeschützte reaktive Gruppe besitzt, die zur chemoselektiven chemischen Ligation mit der benannten ungeschützten reaktiven Gruppe des Ligationsmarkers befähigt ist.
  23. Zusammensetzung, die als Komponenten umfasst: a) einen Ligationsmarker, eine Aminosäure umfassend, die eine ungeschützte reaktive Gruppe hat, die zur chemoselektiven chemischen Ligation befähigt ist; und b) ein in eine Lipidmatrix eingebettetes gefaltetes Membran-Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine Spaltstelle in direkter Nachbarschaft zu einer Aminosäure umfasst, die nach Spaltung mit einem spaltenden Mittel zur Lieferung einer ungeschützten reaktiven Gruppe und chemoselektiver chemischer Ligation mit der ungeschützten reaktiven Gruppe des Ligationsmarkers befähigt ist.
  24. Zusammensetzung, ein gefaltetes, in eine optisch isotrope, kubische Lipidphasenmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid umfassend, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid einen nachweisbaren Marker umfasst, der eine oder mehr Aminosäuren und einen Chromophor umfasst.
  25. Verfahren zum Nachweis eines Liganden, der an ein an eine Lipidmembran gebundenes Polypeptid bindet, das Verfahren umfassend: ein an eine Lipidmembran gebundenes Polypeptid mit einem Liganden in Berührung zu bringen, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid einen nachweisbaren Marker umfasst, der einen ersten Chromophor umfasst; und ein Screening auf Bindung des benannten Liganden an das Polypeptid in einer Prüfung durchzuführen, die durch den Nachweis von Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer zwischen dem benannten Chromophor und einem zweiten Chromophor gekennzeichnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und zweite Chromophor ein Donor-Akzeptor-Paar eines Resonanzenergietransfersystems umfassen.
  26. Kit, eine Zusammensetzung nach Anspruch 20 umfassend.
  27. Verfahren zur Markierung eines Peptids auf Harz mit einer chelator-sensibilisierten Metallionensonde, das Verfahren umfassend, eine oder mehr Aminosäuren eines an ein Harz angefügten Peptids mit einem zwitterionischen Chelatorgruppenmarker zu markieren, der zur Chelierung von Metallionen befähigt ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Harz ein Festphasenharz für die chemische Peptidsynthese ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ein Polypeptid ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Membran-Polypeptid ist.
  31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der zwitterionische Chelatorgruppenmarker zu der einen oder mehr als einen Aminosäure durch eine chemische Gruppe konjugiert ist, die eine kovalente Bindung mit einer reaktiven Gruppe bildet, die durch die eine oder mehr als eine Aminosäure geliefert wird.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass der zwitterionische Chelatorgruppenmarker eine chelator-sensibilisierte Sonde ist.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die chelator-sensibilisierte Sonde eine chelator-sensibilisierte Lanthanoidenmetallionensonde ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die chelator-sensibilisierte Sonde aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Triethylentetraminhexaessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, Diethylentriamin-N,N,N,N-tetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure und 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure besteht.
  35. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Lanthanoidenmetallionen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Terbium, Samarium und Europium besteht.
  36. Verfahren zur Erhöhung der Löslichkeit eines zwitterionischen Chelierungsmittels, das Verfahren umfassend, ein unlösliches zwitterionisches Chelierungsmittel mit einem Solubilisierungsmittel zu kombinieren, das eine lösliche Salzform des zwitterionischen Chelierungsmittels erzeugt.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das unlösliche zwitterionische Chelierungsmittel im Wesentlichen in einem Lösungsmittel unlöslich ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Methanol besteht.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das unlösliche zwitterionische Chelierungsmittel eine nichtreaktive Carboxylgruppe [hat], die zur Aktivierung in einer nachfolgenden Kupplungsreaktion bestimmt ist, und dadurch, dass das Solubilisierungsmittel gegenüber dieser Aktivierung inert ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Solubilisierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Trifluoressigsäure und p-Toluolsulfonsäure besteht.
  40. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das zwitterionsche Chelierungsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Triethylentetraminhexaessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, Diethylentriamin-N,N,N,N-tetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure und 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure besteht.
  41. Zusammensetzung, ein in eine Lipidmatrix eingebettetes, integrales Membran-Polypeptid sowie zumindest eine unnatürliche Aminosäure umfassend, die eine ungeschützte reaktive Gruppe umfasst, die zur chemoselektiven chemischen Ligation mit einem Ligationsmarker befähigt ist, der eine verträgliche ungeschützte reaktive Gruppe hat.
  42. Zusammensetzung nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass das integrale Membran-Polypeptid einen ersten Aminosäurerest enthält, der an einen zweiten Aminosäurerest kovalent durch eine unnatürliche Hauptkettenbindung gebunden ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxim, Thioester, Thioether, Hydrazon, Thiazolidin und Oxazolidin besteht.
  43. Zusammensetzung nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass das Membran-Polypeptid ein integrales Membran-Polypeptid ist.
  44. Zusammensetzung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass das integrale Membran-Polypeptid ein Transmembran-Polypeptid ist.
  45. Zusammensetzung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Transmembran-Polypeptid eine oder mehr Lipidmembran-Ankerdomänen eines Rezeptors umfasst.
  46. Zusammensetzung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Transmembran-Polypeptid eine oder mehr Lipidmembran-Ankerdomänen eines Ionenkanals umfasst.
  47. Zusammensetzung nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass das Membran-Polypeptid eine unnatürliche Aminosäure umfasst, die einen nachweisbaren Marker umfasst.
  48. Zusammensetzung, ein in eine Lipidmatrix eingebettetes Membran-Polypeptid umfassend, wobei das Membran-Polypeptid zumindest zwei Aminosäurereste hat, die durch eine unnatürliche Hauptkettenbindung kovalent verbunden sind
  49. Zusammensetzung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass die unnatürliche Hauptkettenbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Oxim, Thioester, Thioether, Hydrazon, Thiazolidin und Oxazolidin besteht.
  50. Verfahren zur beschleunigten chemischen Ligation eines Membran-Polypeptids und eines Ligationsmarkers, das Verfahren umfassend: einem Ligationspuffer ein Membran-Polypeptid, das eine erste Aminosäure umfasst, die eine ungeschützte reaktive Gruppe hat, sowie einen Ligationsmarker zuzugeben, der eine zweite Aminosäure umfasst, die eine ungeschützte reaktive Gruppe hat, die zur chemoselektiven chemischen Ligation mit der ersten Aminosäure befähigt ist, wobei der Ligationspuffer als Komponenten eine Micellen bildende Lipidmatrix, eine chaotrope Substanz, einen Puffer und einen chemischen Ligationskatalysator umfasst, der die chemoselektive chemische Ligation der ersten und zweiten Aminosäure katalysiert, und eine kovalente Bindung zwischen der ersten und zweiten Aminosäure zu bilden.
  51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass die chemoselektive chemische Ligation aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus nativer chemischer Ligation, Ligation unter Oximbildung, Ligation unter Thioesterbildung, Ligation unter Thioetherbildung, Ligation unter Hydrazonbildung, Ligation unter Thiazolidinbildung und Ligation unter Oxazolidinbildung besteht.
  52. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass die Micellen bildende Lipidmatrix Dodecylphosphocholin ist.
  53. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass die chaotrope Substanz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Harnstoff und Guanidiumchlorid besteht.
  54. Verfahren nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass die chemoselektive chemische Ligation native chemische Ligation ist.
  55. Verfahren nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass der chemische Ligationskatalysator Thiophenol ist.
  56. Ligationspuffer für die chemoselektive chemische Ligation eines Membran-Polypeptids und eines Ligationsmarkers, wobei der Ligationspuffer als Komponenten ein Lipidreagens, das in der Lage ist, eine Lipidmatrix zu bilden, eine chaotrope Sub stanz, einen Puffer und einen chemischen Ligationskatalysator für eine ausgewählte chemoselektive chemische Ligationschemie umfasst.
  57. Ligationspuffer nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidmatrix aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer planaren Lipid-Doppelschichtmembran, einem Liposom, einer Micelle und einer kubischen lipidischen Phase besteht.
  58. Ligationspuffer nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bildung einer Lipidmatrix befähigte Lipidreagens Dodecylphosphocholin ist.
  59. Ligationspufer nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass die chaotrope Substanz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Harnstoff und Guanidiumchlorid besteht.
  60. Ligationspuffer nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass der chemische Ligationskatalysator Thiophenol ist.
  61. Kit, die Komponenten des Anspruchs 56 umfassend.
  62. Kit nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die benannten Komponenten in einem Gefäss vorgemischt sind.
  63. Kit nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehr als eine der Komponenten in einem getrennten Gefäss im Kit bereitgestellt wird.
  64. Kit nach Anspruch 61, weiter ein Polypeptide spaltendes Mittel umfassend.
  65. Kit nach Anspruch 61, weiter einen Ligationsmarker umfassend, der eine Aminosäure umfasst, die eine ungeschützte Gruppe hat, die zur chemoselektiven chemischen Ligation befähigt ist.
  66. Kit nach Anspruch 61, weiter ein Membran-Polypeptid umfassend, das eine Aminosäure umfasst, die eine ungeschützte Gruppe hat, die zur chemoselektiven chemischen Ligation befähigt ist.
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