JP2010132594A

JP2010132594A - 膜タンパク質の固定化方法

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Publication number: JP2010132594A
Application number: JP2008309407A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Okahata; 惠雄岡畑; Hiroyuki Furusawa; 宏幸古澤; Hideyuki Mitomo; 秀之三友
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2008-12-04
Filing date: 2008-12-04
Publication date: 2010-06-17

Abstract

【課題】これまでの膜タンパク質の不安定さや調製の困難さを回避し、膜タンパク質の取り扱いを容易にすることで、膜タンパク質の基礎研究もしくは応用研究の進展に寄与する。
【解決手段】膜タンパク質をコードするmRNA、無細胞翻訳因子、及び基板上に固定された脂質二分子膜を共存させ、膜タンパク質を脂質二分子膜に埋め込まれた状態で生成させることを特徴とする膜タンパク質の固定化方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、膜タンパク質の固定化方法に関する。この方法により、膜タンパク質の活性評価を簡便に行うことが可能になる。

また、本発明は、被験物質と膜タンパク質との相互作用を測定するための装置に関する。膜タンパク質と相互作用をする物質は新しい薬剤の候補となるので、この装置は創薬に大きく貢献するものである。

これまで、膜タンパク質の調製には、膜タンパク質を過剰発現させた細胞を大量に培養し、界面活性剤によって膜タンパク質を抽出し精製する必要があった。ここでの技術的なポイントは、界面活性剤の多数の候補の中からいかによい界面活性剤を選択できるか、もしくは新規合成でつくりだせるか、という点であり、試薬メーカーはその開発にしのぎを削っていた。

また膜タンパク質ごとに最適な界面活性剤を選択し抽出方法を検討する指標として、膜タンパク質自身の活性を評価しつつ行わなくてはならないが、その評価方法を確立するだけでも一研究分の労力となってしまい、多量の膜タンパク質調製を必要とする。

従来技術の問題点として、こうした界面活性剤の開発には評価方法が必要だが評価には活性のある膜タンパク質が必要、という研究構造的な矛盾の存在が、膜タンパク質の研究がなかなか進展しない原因であると思われる。

最近になって、培養細胞に膜タンパク質を作らせるのではなく、無細胞翻訳システムを使って膜タンパク質を作らせて細胞膜の代わりにリポソームを共存させる試みが報告され始めた（非特許文献１）。この方法の利点は、膜タンパク質として単一のものが調製できるので精製する必要がない点があげられるが、現在のところその調製量は少なく、できた膜タンパク質の活性評価は難しいのが現状である。

S. M. Nomura, S. Kondoh, W. Asayama, A. Asada, S. Nishikawa, K. Akiyoshi, Journal of Biotechnology 133 (2008) 190-195.

本発明の目的は、これまでの膜タンパク質の不安定さや調製の困難さを回避し、膜タンパク質の取り扱いを容易にすることで、膜タンパク質の基礎研究もしくは応用研究の進展に寄与することにある。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、膜タンパク質発現に無細胞翻訳システムを用い、生成した膜タンパク質を基板上に固定化された脂質二分子膜中に埋め込むことにより、膜タンパク質の活性を容易に評価できることを見出し、この知見により本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供するものである。
（１）膜タンパク質をコードするmRNA、無細胞翻訳因子、及び基板上に固定された脂質二分子膜を共存させ、膜タンパク質を脂質二分子膜に埋め込まれた状態で生成させることを特徴とする膜タンパク質の固定化方法。
（２）基板が、基板上に固定された物質の変化を検知可能なセンサーの基板であることを特徴とする（１）に記載の膜タンパク質の固定化方法。
（３）基板が、水晶発振子センサーの基板であることを特徴とする（１）に記載の膜タンパク質の固定化方法。
（４）被験物質と膜タンパク質との相互作用を測定するための装置であって、膜タンパク質、脂質二分子膜、基板、及び基板上に固定された物質の変化を検知可能なセンサーを含み、膜タンパク質は脂質二分子膜内に埋め込まれており、脂質二分子膜は基板上に固定されていることを特徴とする装置。
（５）基板上に固定された物質の変化を検知可能なセンサーが、水晶発振子センサーであることを特徴とする（４）に記載の装置。

本発明により、これまで膜タンパク質を扱う上で必須であった界面活性剤を使用する必要がなくなる。そのため、煩雑であった界面活性剤の使用条件検討が不要になり、これまで心配されていた界面活性剤による膜タンパク質の活性低下を懸念する必要がなくなり、原則的にどんな膜タンパク質でも測定対象になりうる可能性を有している。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の膜タンパク質の固定化方法は、膜タンパク質をコードするmRNA、無細胞翻訳因子、及び基板上に固定された脂質二分子膜を共存させ、膜タンパク質を脂質二分子膜に埋め込まれた状態で生成させることを特徴とするものである。

本発明の膜タンパク質の固定化方法は、無細胞翻訳システムを利用するものである。無細胞翻訳システムは、膜タンパク質として人為的に指定したもののみが発現するように制御可能であるが、現状では細胞培養法と比較して、スケールアップが難しい、同量の膜タンパク質を得るためのコストが高い、といった問題点がある。しかし、本発明の方法では、センサー基板上で翻訳反応を開始させることができるため、スケールアップする必要がない利点がある。

また、本発明の方法は、膜タンパク質の活性をセンサーで直接評価することが可能なので、従来の界面活性剤を使用したことによる失活の心配がなく、リポソームを用いたときのような活性評価方法に悩む必要がないという利点もある。

固定化対象とする膜タンパク質の種類に特に制限はなく、対応するmRNAを得ることができるものであればどのようなものでもよい。膜タンパク質の具体例としては、カリウムイオンチャネルKcsA、膜透過機構膜タンパク質SecYEG、ジスルフィド形成機構膜タンパク質DsbBおよびDsbDなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。

本発明において無細胞翻訳因子とは、無細胞状態でmRNAからタンパク質を合成するために必要な因子を意味し、例えば、リボソームタンパク質、リボソームRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、tRNA、翻訳開始因子、伸長因子、終結因子などを含む。無細胞翻訳システムは、本願の出願時において公知の技術であり、どのような物質を無細胞翻訳因子とすればよいかは、当業者であれば容易に理解することができる。また、無細胞翻訳因子は、キットとして市販されており、そのようなキットを使用することも可能である。市販のキットの具体例としては、例えば、PURESYSTEM（登録商標、ポストゲノム研究所社製）、RTSシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、ENDEXT（株式会社セルフリーサイエンス）、Expressway Plus（インビトロジェン株式会社）などを挙げることができる。

膜タンパク質をコードするmRNAの量は、使用する無細胞翻訳システムに応じて決めればよいが、通常、0.1〜2μM程度である。

基板はガラス基板のような単純な基板でもよいが、基板上に固定された物質の変化を検知可能なセンサーの基板を用いることが好ましい。このような基板を用いることにより、基板上に固定されている膜タンパク質と他の物質との相互作用を簡便に測定することが可能になる。基板上に固定された物質の変化を検知可能なセンサーとしては、例えば、水晶発振子センサーを好適な例として挙げることができる。水晶発振子センサーは、基板上に固定された物質の質量の変化を検知することができるので、このセンサーの基板上に膜タンパク質を固定することにより、被験物質が膜タンパク質と結合するかどうか（相互作用をするかどうか）を測定することができる。水晶発振子センサー以外のセンサーとしては、表面プラズモン共鳴(SPR)、金異常反射(AR)などを例示できる。

基板上に脂質二分子膜を形成させる方法は公知であり、例えば、B. A. Cornell, V. L. B. Braach-Maksvytis, L. G. King, P. D. J. Osman, B. Raguse, L. Wieczorek and R. J. Pace, Nature 387(1997)580-583の記載に従って行うことができる。具体的には、基板に対して結合性を有する脂質をアンカーとして結合させた後、極性脂質を加えることにより、基板上に脂質二分子膜を形成させることができる。

脂質二分子膜の基板からの厚さは特に制限はないが、通常、2〜100nm、好ましくは5〜20nm程度である。

本発明の方法により、膜タンパク質をセンサーの基板上に固定することにより、被験物質と膜タンパク質との相互作用を測定するための装置を作製することができる。膜タンパク質と相互作用をする物質は、薬剤の候補物質となるので、このような装置は新しい薬剤の開発に有用である。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

（１）装置
水晶発振子装置は、バイオセンサーとして液中測定が可能な市販の装置、AFFINIX Q4（(株)イニシアム社製）を用いた。センサーセルは、500μL容量の専用セルを用いた（図１）。測定はすべて20 ℃にて行った。

（２）水晶発振子センサー上での脂質二分子膜の調製
洗浄済みのセンサー表面の金電極に、ビオチン化結合タンパク質であるNeutrAvidin（PIERCE社）を固定した。NeutrAvidin固定化セル内を、500μL のDDM(+) buffer（20 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 5%Glycerol, 0.1% n-Dodecyl-β-D-Maltoside(DDM), pH 8.0）で満たし、装置にセットした後、水晶発振子基板を発振させた。振動数（ΔF）が一定値に安定したところで、1 mg/mL のビオチン化脂質（1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(Cap Biotinyl); bio-PE（Avanti polar lipids社製））溶液をセル内へ2 μL添加し、脂質膜のアンカーとなるbio-PEを基板に固定化した。振動数変化が飽和値に達した後、DDM(+) bufferで基板表面を洗浄した。セルから500 μLのbufferのうち上層の450 μL除き、100 μgの大腸菌由来抽出脂質（E. coli polar Lipid Extract; E.coli PL（Avanti polar lipids社製））と界面活性剤DDMの混合ミセル溶液20 μLと430 μL のDDM (-) buffer（20 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 5%Glycerol, pH 8.0）の合計450μLの溶液を加えた。振動数変化が安定した後、系内の界面活性剤DDMおよび過剰の脂質分子を除くためDDM (-) bufferで3回洗浄を行った。

最終的に、二分子膜が形成していない基板と比較して600Hzの振動数減少が観察された（図２）。これは、372 ng / cm²の質量増加に相当する。E.coli PLの脂質二分子膜が一層吸着したときの理論重量変化は390 ng/cm² (脂質断面積0.66 nm², 平均分子量770より算出)なので、妥当であると思われる。

（３）脂質二分子膜上での無細胞翻訳反応による膜タンパク質DsbBの埋め込み
大腸菌由来抽出脂質の二分子膜を固定した水晶発振子基板上に、無細胞翻訳システムであるPURESYSTEMの反応溶液を100μL添加し、目的である膜タンパク質DsbBをコードしたmRNAを終濃度0.2μMとなるように添加して翻訳反応を開始した（図３）。反応は37℃の恒温槽中で1時間インキュベートすることで行い、その後センサー表面をバッファーで洗浄し、500 μLのリン酸ナトリウムbuffer（50 mM phosphate-Na, 100 mM NaCl, pH 8.0）で満たした。

（４）埋め込まれた膜タンパク質DsbBの活性評価
生体内で翻訳されたばかりのタンパク質のジスルフィド結合の形成・組換えを補助する膜タンパク質DsbBは、もう一つの関連するタンパク質DsbAを介して酸化力を提供することが知られている。すなわち、酸化型DsbBは還元型DsbAとは相互作用するが、酸化型DsbAとは相互作用しないと予想される。DsbBの活性を評価するために、水晶発振子センサー上の脂質二分子膜に埋め込まれた酸化型DsbBに対して、還元型DsbAもしくは酸化型DsbAを添加して、相互作用する様子を振動数変化として観察を行った。

DsbAは、大腸菌タンパク質発現システムを用いて調製を行った。DsbAをコードする遺伝子配列をpETベクターに挿入し、JM109(DE3)株に導入して形質転換させた。発現誘導されたDsbAは大腸菌のペリプラズム画分から回収し、陰イオン交換カラムにより精製を行った。得られたDsbAは、1.5倍等量の還元剤（Tris(2-carboxyethyl)phosphine;TCEP）と共に室温下40分インキュベートすることで還元型とし、ゲル濾過スピンカラム（シグマ社製）により還元剤を除いた。酸化型DsbA、DsbBは空気酸化により調製した物を用いた。

酸化型DsbBを埋め込んだ水晶発振子センサーに対して還元型DsbAを添加したところ、振動数減少が観察された（図４）。これは、酸化型DsbBに対して還元型DsbAが結合したことを示し、ジスルフィド結合（S-S結合）を介して結合したと考えられる。一方、酸化型DsbAを添加した場合には、振動数減少は観察されなかった（図４）。これは、ジスルフィド結合同士では結合できないことを示している。これらの結果は、生体内でのDsbA-DsbBの機能とよく相関しており、センサー上で膜タンパク質が機能していることがわかった。

実施例で使用した水晶発振子装置とセンサーセルの模式図。ビオチン化脂質をアンカーとして脂質二分子膜を再構成する方法を表した図。（a）脂質固定化基板上で、DDM(+) bufferからE.coli PL + DDM(-) bufferへ置換した。（b）脂質固定化基板上で、DDM(+) bufferからDDM(-) bufferへ置換した。（c）bio-PEが固定化されないように予め過剰のビオチン（終濃度：100 μＭ）を添加して（a）と同様の操作を行った。水晶発振センサー表面上に固定された脂質二分子膜へ膜タンパク質DsbBを埋め込む方法を表した図。セル内に入れた無細胞翻訳因子および膜タンパク質をコードしているmRNAを添加することで、膜タンパク質をセル内で発現させた。脂質二分子膜へ埋め込まれた膜タンパク質DsbBにDsbAを添加した場合の水晶発振子センサーの振動数の変化を示す図。

Claims

膜タンパク質をコードするmRNA、無細胞翻訳因子、及び基板上に固定された脂質二分子膜を共存させ、膜タンパク質を脂質二分子膜に埋め込まれた状態で生成させることを特徴とする膜タンパク質の固定化方法。
基板が、基板上に固定された物質の変化を検知可能なセンサーの基板であることを特徴とする請求項１に記載の膜タンパク質の固定化方法。
基板が、水晶発振子センサーの基板であることを特徴とする請求項１に記載の膜タンパク質の固定化方法。
被験物質と膜タンパク質との相互作用を測定するための装置であって、膜タンパク質、脂質二分子膜、基板、及び基板上に固定された物質の変化を検知可能なセンサーを含み、膜タンパク質は脂質二分子膜内に埋め込まれており、脂質二分子膜は基板上に固定されていることを特徴とする装置。
基板上に固定された物質の変化を検知可能なセンサーが、水晶発振子センサーであることを特徴とする請求項４に記載の装置。