DE60223040T2 - Epitop-untersuchung mit hla - Google Patents

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Rico Edmond BUCHLI
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine Methode der Epitop-Prüfung für die Identifizierung von Peptiden, die an ein einzellösliches MHC-Klasse I- oder -II-Molekül binden.
  • 2. Beschreibung des einschlägigen Standes der Technik
  • Klasse I-Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Moleküle, bezeichnet als HLA-Klasse I in Menschen, binden und zeigen Peptid-Antigenliganden auf der Zelloberfläche. Die Peptid-Antigenliganden, die von den Klasse I-MHC-Molekülen präsentiert werden, sind entweder von normalen endogenen Proteinen ("selbst") deriviert oder von Fremdproteinen ("nichtselbst"), die in die Zelle eingeführt sind. Nichtselbst-Proteine können Produkte von Malignat-Transformation oder intrazellularen Pathogenen solcher Viren sein. Auf diese Weise übertragen Klasse I-MHC-Moleküle Information in Bezug auf die innere Fitness einer Zelle auf die Immun-Effektorzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf CD8+-cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL's), die bei Wechselwirkung mit "nichtselbst" Peptiden aktiviert werden, wodurch die derartige "nichtselbst"-Peptide präsentierende Zelle lysiert oder getötet wird.
  • Klasse II-MHC-Moleküle, bezeichnet als HLA-Klasse II in Menschen binden ebenfalls und zeigen Peptid-Antigenliganden auf der Zelloberfläche. Anders als bei den Klasse I-MHC-Molekülen, die auf nahezu allen nucleierten Zellen exprimiert werden, sind normalerweise Klasse II-MHC-Moleküle auf spezialisierte Zellen begrenzt, wie beispielsweise B-Lymphocyten, Makrophagen, Dendritenzellen und anderen Antigen präsentierenden Zellen, die Fremd-Antigene von extrazellularem Fluid über einen endocytischen Weg aufnehmen. Die Peptide, die sie binden und präsentieren, sind von extrazellulären Fremd-Antigenen hergeleitet, wie beispielsweise Produkten von Bakterien, die sich außerhalb der Zellen vervielfachen, wobei derartige Produkte Protein-Toxine einschließen, die von den Bakterien ausgeschieden werden, die oftmals schädliche und sogar tödliche Auswirkungen auf den Wirt (zum Beispiel Mensch) ausüben. Auf diese Weise übertragen Klasse II-Moleküle Informationen in Bezug auf die Fitness des extrazellulären Raums in der Umgebung der Zelle, die das Klasse II-Molekül zeigt, an die Immun-Effektorzellen und einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf CD4+-Helfer-T-Zellen, wodurch, indem die Eliminierung derartiger Pathogene unterstützt wird, die Untersuchung solcher Pathogene erreicht wird, indem sowohl B-Zellen die Erzeugung von Antikörpern gegen Mikroben unter stützen als auch Toxine, die durch solche Mikroben erzeugt werden, sowie durch Aktivierung von Makrophagen, um aufgenommene Mikroben zu zerstören.
  • Klasse I- und Klasse II-HLA-Moleküle zeigen einen ausgeprägten Polymorphismus, der durch systematische, rekombinatorische und Punktmutationsereignisse erzeugt wird, wie beispielsweise Hunderte von verschiedenen HLA-Typen in der gesamten Bevölkerung der Welt existieren, was zu einer großen immunologischen Diversität führt. Eine solche extensive HLA-Diversität in der gesamten Bevölkerung führt zu Gewebe- oder Organ-Transplantatabstoßungen zwischen einzelnen Vertretern sowie zu differierenden Anfälligkeiten und/oder Widerstandsfähigkeiten gegenüber Infektionserkrankungen. Die HLA-Moleküle tragen außerdem deutlich zur Autoimmunität und Krebs bei. Da HLA-Moleküle die meisten, wenn nicht alle adaptiven Immunreaktionen vermitteln, werden große Mengen an reinen, isolierten HLA-Proteinen benötigt, um Transplantation, Autoimmunerkrankungen und Vakzin-Entwicklung wirksam zu untersuchen.
  • Es gibt mehrere Anwendungen, bei denen gereinigte, einzelne Klasse I- und Klasse II-MHC-Proteine von hohem Nutzen sind. Derartige Anwendungen schließen die Verwendung von MHC-Peptid-Multimeren als immundiagnostische Reagenzien für Widerstandsfähigkeit gegenüber Erkrankung/Autoimmunität ein; für die Bewertung des Bindens von potentiell therapeutischen Peptiden; die Elution von Peptiden aus MHC-Molekülen zur Identifikation von Impfstoffkandidaten; Screening von Transplantatpatienten auf vorgeformte, MHC-spezifische Antikörper; und Entfernung von Anti-HLA-Antikörpern aus einem Patienten. Da jeder Einzelne unterschiedliche MHC-Moleküle hat, ist das Testen auf zahllose einzelne MHC-Moleküle eine Vorbedingung für das Verständnis der Unterschiede in der Anfälligkeit auf Erkrankung zwischen einzelnen Personen. Daher sind gereinigte MHC-Moleküle, die für die Hunderten der verschiedenen HLA-Typen repräsentativ sind, die in der gesamten Weltbevölkerung vorhanden sind, in hohem Maße für das Aufdecken von Anfälligkeiten auf Erkrankungen und Widerstandsfähigkeiten sowie für die gerichtete Entwicklung von Therapeutika, wie beispielsweise von Vakzinen, wünschenswert.
  • Klasse I-HLA-Moleküle signalisieren die Immunrektionen auf Erkrankungen im Inneren von Wirtszellen. Peptide, die von viral- und tumorspezifischen Proteinen im Inneren der Zellen deriviert sind, werden in die Klasse I-Molekül-Antigen-bindende Vertiefung des endoplasmischen Reticulums der Zelle geladen und anschließend zur Zelloberfläche geführt. Sobald sich das Klasse I-HLA-Molekül und sein geladener Peptid-Ligand auf der Zelloberfläche befinden, sind das Klasse I-Molekül und sein Peptid-Ligand für cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) zugänglich. Die CTL überprüft die von dem Klasse I-Molekül-präsentierten Peptide und zerstört diejenigen Zellen, die Liganden beherbergen, die von infektiösen oder neoplastischen Mitteln im Inneren der Zelle deriviert sind.
  • Während spezifische CTL-Targets identifiziert worden sind, ist wenig bekannt über Umfang und Beschaffenheit von Liganden, die auf der Oberfläche einer erkrankten Zelle präsentiert werden. Aus einer allgemeinen wissenschaftlichen Sicht sind viele offene Fragen bezüglich der Peptid-Verabreichung durch die Fachwelt gegangen. Beispielsweise ist nachgewiesen worden, dass ein Virus bevorzugt die Expression von HLR-Klasse I-Molekülen von einem vorgegebenen Locus blockieren kann, während es die Expression an anderen Loci intakt lässt. In ähnlicher Weise gibt es zahlreiche Veröffentlichungen über Krebszellen, die beim Exprimieren von Klasse I-HLA an speziellen Loci versagen. Allerdings gibt es keinerlei Daten, mit denen beschrieben wird, wie (oder ob) die drei klassischen HLA-Klasse I-Loci hinsichtlich der immunregulatorischen Liganden differieren, die sie binden. Es ist daher unklar, wie Klasse I-Moleküle von den verschiedenen Loci hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit viral- und tumorderivierten Liganden und der Zahl der Peptide, die jeweils geboten werden, variieren.
  • Das Unterscheiden von virus- und tumorspezifischen Liganden für die CTL-Erkennung ist eine wichtige Komponente der gezielten Vakzin-Entwicklung. Auf Tumorgene oder infizierte Zellen eindeutige Liganden können getestet und in Vakzine eingebaut werden, die zum Hervorrufen einer CTL-Schutzreaktion konzipiert sind. Es werden gegenwärtig verschiedene methodische Vorgehensweisen eingesetzt, um potentielle schützende Peptid-Liganden zu identifizieren. Einer der Vorgehensweisen verwendet T-Zelllinien oder -Klone zum Screening auf biologisch aktive Liganden unter chromatographischen Fraktionen von eluierten Peptiden (Cox et al., Science, Band 264, 1994, Seiten 716 bis 719). Diese Vorgehensweise ist eingesetzt worden, um Peptid-Liganden zu identifizieren, die auf Krebszellen spezifisch sind. Eine zweite Methode nutzt prognostische Algorithmen zum identifizieren von Peptiden, die zum Binden an einem speziellen Klasse I-Molekül in der Lage sind, basierend auf zuvor bestimmte Motiv- und/oder individuelle Liganden-Sequenzen (De Groot et al., Emerging Infectious Diseases, (7) 4, 2001) Peptide, die über eine hohe vorhergesagte Wahrscheinlichkeit zum Binden von einem Pathogen, das von Interesse ist, haben, lassen sich synthetisch darstellen und auf T-Zellreaktivität im Präkursor-, Tetramer- oder ELISpot-Assays testen.
  • Es hat jedoch keine wirklich verfügbare Quelle für einzelne HLA-Moleküle gegeben. Die Mengen an HLA-Protein, die verfügbar sind, sind sehr gering gewesen und bestehen im typischen Fall aus einer Mischung verschiedener HLA-Moleküle. Die Erzeugung von HLA-Molekülen umfasst traditionell das Aufziehen und die Lyse von Zellen, die mehrfache HLA-Moleküle exprimieren. Neunzig Prozent der Population ist an jedem der HLA-Loci heterozygot; codominante Expression führt zu mehrfachen HLA-Proteinen, die am jeweiligen HLA-Locus exprimiert sind. Zur Reinigung von nativen Klasse I- oder Klasse II-Molekülen von Säugerzellen sind zeitaufwändige und mühselige Reinigungsmethoden erforderlich, und da jede Zelle im typischen Fall mehrfache, oberflächengebundene HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Moleküle exprimiert, führt die HLA-Reinigung zu einer Mischung vieler unterschiedlicher HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Moleküle. Bei der Ausführung von Versuchen unter Verwendung einer solchen Mischung von HLA-Molekülen oder der Ausführung von Experimenten unter Verwendung einer Zelle mit mehrfach oberflächengebundenen HLA-Molekülen kann bei einer Interpretation der Ergebnisse zwischen den verschiedenen HLA-Molekülen nicht direkt unterschieden werden und man kann nicht sicher sein, dass irgendein spezielles HLA-Molekül für ein vorgegebenes Ergebnis verantwortlich ist. Daher bestand bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung auf dem Fachgebiet ein Bedarf für eine Methode zum Erzeugen wesentlicher Mengen einzelner HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Moleküle, sodass sie mühelos gereinigt und unabhängig von anderen HLA-Klasse I- oder -Klasse II-Molekülen isoliert werden konnten. Derartige einzelne HLA-Moleküle, wenn sie in ausreichender Menge und Reinheit entsprechend der Beschreibung hierin bereitgestellt werden, liefern ein leistungsstarkes Instrument zur Untersuchung und Messung von Immunreaktionen.
  • Auf dem Fachgebiet besteht daher ein Bedarf für verbesserte Methoden zum Assayieren des Bindens von Peptiden der Klasse I- und Klasse II-MHC-Moleküle, um Epitope zu identifizieren, die spezifisch an einzelnen Klasse I- und Klasse II-MHC-Molekülen binden. Mit der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe gelöst, indem die Erzeugung löslicher HLA-Moleküle mit der Methodik der Epitop-Isolation, Nachweis und Test gekoppelt wird.
  • In Ojcius, D. M., et al., Journal of Immunology, 151(11): 6020–6026 (1993) analysierten die Autoren ein an rekombinanten Einzelketten-MHC-Klasse I-Molekül-Dimeren bindendes Peptid, indem der Einfluss von überschüssigem Competitor-Peptid auf die Dissoziation des Peptid-Klasse I-Komplexes bestimmt wird und indem das Binden verschiedener Peptidkonzentrationen an rekombinanten Einzelketten-Klasse I-Molekül-Dimeren gemessen wird, die bereits Peptide mit geringer Affinität oder hoher Affinität enthalten. Es wurden Einzelketten-Klasse I-MHC-Heterodimere, die aus einer schweren Kette und einer leichten Kette bestehen in Hefe- oder Lepidoptera-Zelllinien erzeugt, gereinigt und anschließend in vito mit einem synthetisierten Peptid inkubiert, um den Peptid-Klasse I-Komplex zu erzeugen.
  • In Ojcius, D. M., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 197(3): 1216–1222 (1993) wurden ähnliche Untersuchungen unter Einsatz rekom binanter Einzelketten-MHC-Klasse I-Molekül-Dimere veröffentlicht, worin die pH-Abhängigkeit und der Einfluss endogener Peptide auf die Aktivierungsenergie der Dissoziation des Peptid-MHC-Klasse I-Komplexes untersucht wurde.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Es zeigen:
  • 1 eine Übersicht über eine zweistufige PCR-Strategie zur Amplifikation einer abgestumpften Version des Human-Klasse I-MHC;
  • 2 ein Fließschema des Epitop-Nachweises mit C-Terminus-Anhang versehenen sHLA-Molekülen. Klasse I-positive Transfektanten werden mit einem Pathogen der Wahl infiziert und unter Nutzung des Anhanges sHLA bevorzugt gereinigt. Ein subtraktiver Vergleich von MS-Ion-Karten liefert Ionen, die lediglich auf infizierten Zellen vorhanden sind, die sodann MS/MS-sequenziert werden, um Klasse I-Epitope abzuleiten;
  • 3 A*0201T-Sättigungskurve von zunehmender Menge an Peptid-sHLA-Komplex, geladen auf einer beschichteten W6/32 ELISA-Platte;
  • 4 Vergleich von Sättigungskurven, die erzeugt wurden unter Verwendung entweder von sHLA-Allel (A*0201T) oder Detergens-Lysat A*0201, erhalten durch Zellextraktion, demonstriert eine höhere Empfindlichkeit von sHLA als Detergens-Lysat;
  • 5 schematische Darstellung der Peptid-Austauschreaktion unter Anwendung der Fluoreszenzpolarisation;
  • 6 Binden von P2 an sHLA bei Raumtemperatur zeigt eine Nettozunahme nach t=0-Subtraktion;
  • 7 Binden von P2 an sHLA bei 4°C (vorinkubiert bei 54°C) zeigt eine Nettozunahme nach t=0-Subtraktion;
  • 8 Binden verschiedener Peptide (P1–P5) an sHLA A*0201T über einen Konzentrationsbereich, detektiert mithilfe der Fluoreszenzpolarisation zum Zeitpunkt 45 Stunden nach dem Mischen;
  • 9 Binden verschiedener Peptide (P1–P5) an sHLA A*0201T unter Anwendung der Fluoreszenzpolarisation bei einer Konzentration von 50 μg/ml sHLA;
  • 10 Kompetitionsassay auf sHLA A*0201T, geladen mit dem spezifischen Standardpeptid P5(FITC).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In der vorliegenden Erfindung werden die methodischen Vorgehensweisen zum Assayieren des Bindens von Peptid-Epitopen an einzelnen löslichen MHC-Molekülen mit den methodischen Vorgehensweisen für die Erzeugung einzelner löslicher MHC-Moleküle und mit einer Methode des Epitop-Nachweises und des vergleichenden Liganden-Kartierens (einschließlich Methoden zum Unterscheiden von infizierten/Tumorzellen von nichtinfizierten/Nichttumorzellen) kombiniert.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Methode zum Assayieren eines Peptids auf Binden an einem einzelnen Klasse I-Molekül. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine Methode zum Assayieren eines Peptids auf Binden an einem einzelnen, löslichen MHC-Klasse I-Molekül nach Anspruch 1 hierin. In die Methode einbezogen ist die Bereitstellung eines Peptids, das von Interesse ist, und die Bereitstellung einzelner, löslicher Klasse I-Molekül-endogener Peptid-Komplexe, in denen einzelne, lösliche Klasse I-Moleküle über darin geladene, endogene Peptide verfügen. Das Peptid, das von Interesse ist, und die einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle werden miteinander gemischt und das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül-Peptid von Komplexen, die von Interesse sind, worin die einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle das gesuchte Peptide darin geladen enthalten, identifiziert. Die einzelne, löslichen Klasse I-Molekül-endogenen Peptid-Komplexe können unter Bedingungen behandelt werden, die die einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle dazu bringen, die endogenen Peptide vor dem Mischen des Peptids, das von Interesse ist, mit den einzelnen, löslichen Klasse I-Molekülen freizusetzen, wobei eine solche Behandlungsmethode das Erhitzen der einzelnen, löslichen Klasse I-Molekül-endogenen Peptid-Komplexe umfassen kann, um die einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle dazu zu bringen, die endogenen Peptide freizusetzen.
  • Das Peptid, das von Interesse ist, kann unter Verwendung eines Radiomarkers oder eines Fluoreszenzmarkers markiert werden, um eine Identifikation von einzelnen, löslichen Klasse I-Molekül-Peptid von Komplexen, die von Interesse sind, gegenüber ungebundenem Peptid, das von Interesse ist, zu ermöglichen. Sofern eine Fluoreszenzmarkierung eingesetzt wird, kann das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül-Peptid von Komplexen, die von Interesse sind, mithilfe jeder beliebigen Methode der Fluoreszenzanalyse identifiziert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie beispielsweise mithilfe der Fluoreszenzpolarisation. Alternativ lässt sich das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül-Fluoreszenzmarkierte Peptid, das von Interesse ist, unter Anwendung eines Antikörpers gegen das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül isolieren. Wenn ein Radiomarker eingesetzt wird, kann das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül-Peptid von Komplexen, die von Interesse sind, von ungebundenem Peptid, das von Interesse ist, abgetrennt werden, wie beispielsweise mithilfe der Gel-Filtration. Alternativ kann das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül-Peptid von Komplexen, die von Interesse sind, unter Anwendung eines Antikörpers identifiziert werden, der das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül, das ein Peptid darin geladen hat, erkennen.
  • Zur Erzeugung der einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle-endogenen Peptid-Komplexe, wird eine Genom-DNA oder -cDNA, die mindestens ein Klasse I-Molekül codiert, erhalten und ein Allel, das ein einzelnes Klasse I-Molekül in der Genom-DNA oder -cDNA codiert, identifiziert. Das Allel, welches das einzelne Klasse I-Molekül codiert, wird in einer ortsspezifischen Weise einer PCR-Amplifikation unterzogen, sodass ein PCR-Produkt, das daraus erzeugt wird, eine abgestumpfte, lösliche Form des einzelnen Klasse I-Moleküls codiert. Das PCR-Produkt wird sodann in einen Expressionsvektor kloniert, wodurch ein Konstrukt erzeugt wird, welches das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül codiert, wobei das Konstrukt in eine Zelllinie transfiziert wird, um eine Zelllinie zu schaffen, die ein Konstrukt enthält, welches ein einzelnes, lösliches Klasse I-Molekül codiert. Die Zelllinie muss in der Lage sein, Proteine auf natürliche Weise in Peptid-Liganden einzuarbeiten, die sich in Antigen-bindende Vertiefungen von Klasse I-Molekülen laden lassen.
  • Die Zelllinie wird sodann unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression der einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle von dem Konstrukt ermöglicht, wobei diese Bedingungen ebenfalls ein endogenes Laden eines Peptid-Liganden in die Antigen-bindende Vertiefung jedes einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküls vor der Ausscheidung der einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle aus der Zell erlaubt. Die ausgeschiedenen, einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle, die über die endogen geladenen Peptid-Liganden daran gebunden verfügen, werden sodann isoliert.
  • Das Konstrukt, welches das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül codiert, kann ferner einen Anhand codieren, wie beispielsweise einen HIS-Schwanz oder FLAG-Schwanz, der an dem einzelnen, löslichen Klasse I-Molekül angehängt ist und die Isolierung des einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküls unterstützt.
  • Das Peptid, das von Interesse ist, lässt sich auf der Grundlage verschiedener, auf dem Fachgebiet für die Epitop-Untersuchung bekannter Methoden wählen. Alternativ kann das Peptid, das von Interesse ist, mithilfe einer Methode zum Identifizieren von mindestens einem endogen geladenen Peptid-Liganden identifiziert werden, der eine infizierte Zelle von einer nichtinfizierten Zelle unterscheidet. Eine solche Methode schließt die Bereitstellung einer nichtinfizierten Zelllinie ein, die ein Konstrukt enthält, das ein einzelnes, lösliches Klasse I-Molekül codiert, wobei die nichtinfizierte Zelllinie zum natürlichen Ein arbeiten von Proteinen in die Peptid-Liganden in der Lage ist, die in die Antigenbindenden Vertiefungen von Klasse I-Molekülen geladen werden können. Ein Teil der nichtinfizierten Zelllinie wird mit mindestens einem Mikroorganismus infiziert (wie beispielsweise HIV oder HBV), mit einem Gen von einem Mikroorganismus oder einem Tumorgen, wodurch eine infizierte Zelllinie geschaffen wird und sowohl die nichtinfizierte Zelllinie als auch die infizierte Zelllinie unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression einzelner, löslicher Klasse I-Moleküle von dem Konstrukt erlauben. Die Bedingungen des Kultivierens ermöglichen außerdem das endogene Laden eines Peptid-Liganden in die Antigen-bindende Vertiefung des jeweiligen einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküls vor der Ausscheidung des einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküls aus der Zelle. Die ausgeschiedenen einzelnen, löslichen Klasse I-Moleküle, die über die endogen geladenen Peptid-Liganden daran gebunden verfügen, werden von der nichtinfizierten Zelllinie und der infizierten Zelllinie isoliert und die endogen geladenen Peptid-Liganden von den einzelnen, löslichen Klasse I-Molekülen sowohl von der nichtinfizierten Zelllinie als auch von der infizierten Zelllinie abgetrennt. Die endogen geladenen Peptid-Liganden werden sodann sowohl von der nichtinfizierten Zelllinie als auch von der infizierten Zelllinie isoliert und die zwei Reihen von endogen geladenen Peptid-Liganden verglichen, um mindestens einen endogen geladenen Peptid-Liganden, der durch das einzelne, lösliche Klasse I-Molekül auf der infizierten Zelllinie präsentiert wird, die nicht von dem einzelnen, löslichen Klasse I-Molekül auf der nichtinfizierten Zelllinie präsentiert wird zu identifizieren oder mindestens einen endogen geladenen Peptid-Liganden zu identifizieren, der von dem einzelnen, löslichen Klasse I-Molekül auf der nichtinfizierten Zelllinie präsentiert wird, die nicht von dem einzelne, löslichen Klasse I-Molekül auf der infizierten Zelllinie präsentiert wird.
  • Nach der Identifikation des Peptid-Liganden, der eine infizierte Zelle von einer nichtinfizierte Zelle unterscheidet, kann ein Quellprotein, von dem der endogen geladene Peptid-Ligand erhalten wird, identifiziert werden. Ein solches Quellprotein kann von mindestens einem der Mikroorganismen, dem Gen von einem Mikroorganismus oder dem Tumorgen codiert werden, mit dem die Zelllinie infiziert wurde, um die infizierte Zelllinie zu erzeugen, oder das Quellprotein kann von der nichtinfizierten Zelllinie codiert werden. Wenn das Quellprotein von der nichtinfizierten Zelllinie codiert wird, kann ein solches Protein auch eine erhöhte Expression in einer Tumorzelllinie zeigen.
  • Herstellung einzelner, löslicher MHC-Moleküle
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in einer der Ausführungsformen eine Methode zum Erzeugen von MHC-Molekülen (aus Genom-DNA oder -cDNA) nutzen, die von Säugerzellen in einer Bioreaktoreinheit ausgeschieden werden. Wesentliche Mengen an einzelnen MHC-Molekülen werden erhalten, indem man Klasse I- oder Klasse II-MHC-Moleküle so modifiziert, dass sie ausgeschieden, isoliert und gereinigt werden können. Die Ausscheidung löslicher MHC-Moleküle überwindet die Nachteile und Mängel bekannter Ausführungen im Bezug auf die Menge und Reinheit der erzeugten MHC-Moleküle. Mengenprobleme werden überwunden, da Zellen, die das MHC erzeugen, nicht mit Detergens lysiert oder abgetötet werden müssen, um das MHC-Molekül zu erhalten. Auf diese Weise bleiben die Zellen, die das MHC ausscheiden, am Leben und setzen somit die Erzeugung von MHC fort. Reinheitsprobleme werden überwunden, da das einzige MHC-Molekül, das von der Zelle abgeschieden wird, dasjenige ist, das speziell zur Abscheidung aufgebaut worden ist. Damit bietet die Transfektion von Vektoren, die derartige in die Zellen ausgeschiedene MHC-Moleküle codieren, die endogenes, oberflächengebundenes MHC exprimieren können, ein Verfahren zum Erhalten einer hochkonzentrierten Form des transfizierten MHC-Moleküls wenn es aus den Zellen ausgeschieden wird. Eine größere Reinheit wird durch das Transfizieren des ausgeschiedenen MHC-Moleküls in die MHC-bedürftigen Zelllinien gewährleistet.
  • Die Erzeugung der MHC-Moleküle in einer Hohlfaserbioreaktor-Einheit ermöglicht das Kultivieren von Zellen mit einer wesentlich größeren Dichte, als dieses eine konventionelle Flüssigphasen-Gewebekultur ermöglicht. Das dichte Kultivieren von Zellen, die MHC-Moleküle abscheiden, verbessert weiter die Möglichkeit zur kontinuierlichen Ernte der transfizierten MHC-Moleküle. Dichte Bioreaktorkulturen von MHC-abscheidenden Zelllinien ermöglichen die Gewinnung hoher Konzentrationen an einzelnen MHC-Proteinen. Hochkonzentrierte, einzelne MHC-Proteine bieten einen Vorteil insofern, dass die meisten Strategien der nachgeschalteten Proteinreinigung besser anwendbar sind, wenn die Konzentration des zu reinigenden Proteins zunimmt. Damit ermöglicht das Kultivieren von MHC-abscheidenden Zellen in Bioreaktoren eine kontinuierliche Erzeugung von einzelnen MHC-Proteinen in einer konzentrierten Form.
  • Das Verfahren zum Herstellen von MHC-Molekülen, das in der vorliegenden Erfindung zum Einsatz gelangt, beginnt damit, dass man genomische oder komplementäre DNA erhält, welche das gewünschte MHC-Klasse I- oder -Klasse II-Molekül codiert. Allele an dem Ort, der das gewünschte MHC-Molekül codiert, werden in einer ortsspezifischen Weise PCR-amplifiziert. Diese ortsspezifischen PCR-Produkte können den gesamten codierenden Bereich des MHC-Moleküls oder einen Teil davon einschließen. In einer der Ausführungsformen gelangt eine ineinander geschachtelte oder halb ineinander geschachtelte PCR zur Anwendung, um eine abgestumpfte Form des Klasse I- oder Klasse II- Gens zu erzeugen, sodass es eher ausgeschieden als an der Zelloberfläche verankert wird. 1 veranschaulicht die PCR-Produkte, die sich aus derartigen ineinander geschachtelten PCR-Reaktionen ergeben. In einer anderen Ausführungsform wird die PCR das MHC-Molekül direkt abstumpfen.
  • Es werden ortsspezifische PCR-Produkte in einen Säuger-Expressionsvektor kloniert und mit einer Vielzahl von Methoden gescreent, um ein das gewünschte MHC-Molekül codierenden Klon zu identifizieren. Die kloniert MHC-Moleküle werden DNA-sequenziert, um die Reproduktionstreue zu überprüfen. Getreue, abgestumpfte Klone des gewünschten MHC-Moleküls werden sodann in eine Säuger-Zelllinie transfiziert. Wenn eine solche Zelllinie mit einem Vektor transfiziert wird, der ein rekombinantes Klasse I-Molekül codiert, kann es einer solchen Zelllinie entweder an endogener Klasse I MHC-Molekülexpression mangeln oder endogene Klasse I MHC-Moleküle exprimieren. Angesichts der vorliegenden Erfindung wird der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet die Bedeutung erkennen, dass Zellen, die endogene Klasse I-MHC-Moleküle exprimieren, spontan MHC in Lösung bei natürlichem Zelltod freisetzen können. In den Fällen, wo diese geringe Menge an spontan freigesetztem MHC ein Problem ist, kann das transfizierte Klasse I-MHC-Molekül mit einem "Anhang" versehen werden, sodass es abseits von spontan freigesetzten, endogenen Klasse I-Molekülen in Zellen, die Klasse I-Moleküle exprimieren, speziell gereinigt werden kann. Beispielsweise kann ein einen HIS-Schwanz codierendes DNA-Fragment an das Protein mithilfe der PCR-Reaktion angehängt oder kann mithilfe des Vektors codiert werden, in den hinein das PCR-Fragment kloniert wurde, womit ein solcher HIS-Schwanz damit die Reinigung der Klasse I-MHC-Moleküle abseits von endogenen Klasse I-Molekülen unterstützet. Außer der Histidin-Schwanz haben auch Anhänge gezeigt, dass sie funktionieren, sodass ein Fachmann auf dem Gebiet des "Protein-Taggings" für die nachgeschaltete Reinigung erkennen und wissen wird, wie ein MHC-Molekül auf diese Weise mit einem Anhang zu versehen ist, um die Einfachheit zu verbessern, mit der das MHC-Molekül gereinigt werden kann.
  • Klonierte, genomische DNA-Fragmente enthalten sowohl Exonen als auch Intronen sowie auch andere nichttranslatierte Regionen an den 5'- und 3'-Termini des Gens. Nach einer Transfektion in eine Zelllinie, die die genomische DNA (gDNA) in eine RNA transkribiert, ergibt die klonierte, genomische DNA ein Proteinprodukt, womit Intronen entfernt werden und die RNA unter Bildung einer Messenger-RNA (mRNA) einer Spleißung unterzogen wird, die dann in ein MHC-Protein translatiert wird. Die Transfektion von MHC-Molekülen, die durch gDNA codiert werden, erleichtert damit die erneute Isolation der gDNA, mRNA/cDNA und des Proteins. Die Erzeugung von MHC-Molekülen in säugerfremden Zell linien, wie beispielsweise Insekten- und Bakterienzellen, erfordert cDNA-Klone, da diese niederen Zelltypen nicht über die Fähigkeit verfügen, Introne aus einer von einem gDNA-Klon transkribierten RNA zu spleißen. In diesen Fällen gewähren die Säuger-gDNA-Transfektanten der vorliegenden Erfindung eine wertvolle Quelle für RNA, die unter Erzeugung von MHC-cDNA reversetranskribiert werden kann. Die cDNA kann sodann kloniert werden, in Zellen übertragen werden und anschließend in ein Protein translatiert werden. Zusätzlich zur Erzeugung ausgeschiedener MHC gewähren derartige gDNA-Transfektanten daher eine einfache Quelle für mRNA und damit cDNA-Klone, die sich anschließend in säugerfremde Zellen zur Erzeugung von MHC transfizieren lassen. Damit ermöglicht die vorliegende Erfindung, die mit MHC-genomischen DNA-Klonen beginnt, die Erzeugung von MHC in Zellen verschiedener Spezies.
  • Ein entscheidender Vorteil für den Start von gDNA besteht darin, dass lebensfähige Zellen, die das MHC-Molekül enthalten, das von Interesse ist, nicht benötigt werden. Da alle Individuen in der Population ein unterschiedliches MHC-Repertoire haben, muss man mehr als 500.000 Individuen suchen, um einige mit dem gleichen MHC-Komplement als ein gewünschtes Individuum zu finden – ein solches praktisches Beispiel nach diesem Prinzip trifft man an, wenn man einen Spender zu finden sucht, der zu einem Empfänger für eine Knochenmarktransplantation passt. Wenn man daher ein spezielles MHC-Molekül zur Verwendung in einem Experiment oder einer Diagnostik erzeugen möchte, muss man zunächst eine Person oder eine Zelle identifizieren, welche das MHC-Allel, das von Interesse ist, exprimieren. Alternativ sind in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Isolation der gDNA lediglich eine Speichelprobe, eine Haarwurzel, eine alte Gefrierprobe oder weniger als ein Milliliter (0,2 ml) Blut erforderlich. Wenn man dann von der gDNA beginnt, kann das MHC-Molekül, das von Interesse ist, über einen gDNA-Klon entsprechend der Beschreibung hierin erhalten werden, sodass nach einer Transfektion eines solchen Klons in Säugerzellen das gewünschte Protein in Säugerzellen oder aus cDNA in mehreren Spezies von Zellen unter Anwendung der Methoden der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben wurden, erzeugt werden kann.
  • Gegenwärtige Versuche, ein MHC-Allel für eine Proteinexpression zu erhalten, beginnen im typischen Fall von mRNA, womit eine frische Probe von Säugerzellen benötigt wird, die das MHC-Molekül, das von Interesse ist, exprimieren. Die Arbeit ausgehend von einer gDNA erfordert keine Gen-Expression oder eine frische, biologische Probe. Es ist ebenfalls wichtig, darauf hinzuweisen, dass die RNA von sich aus unstabil ist und nicht ohne weiteres erhalten werden kann wie die gDNA. Wenn die Erzeugung eines speziellen MHC-Moleküls ausgehend von einem cDNA-Klon gewünscht wird, müssen daher zunächst traditionell eine Person oder eine Zelllinie, die das Allel, das von Interesse ist, exprimieren, identifiziert werden, um eine RNA zu erhalten. Sodann muss eine frische Probe von Blut oder Zellen erhalten werden, wobei Experimente unter Anwendung des methodischen Vorgehens gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen, dass > 5 Milliliter Blut, die weniger als 3 Tage alt sind, benötigt werden, um ausreichend RNA für eine MHC-cDNA-Synthese zu erhalten. Damit wird durch einen Start mit einer gDNA die Bandbreite der MHC-Moleküle, die mühelos erzeugt werden können, erweitert. Dieses ist in einem System, das so polymorph ist wie das MHC-System, ein entscheidender Faktor, insofern es Hunderte von MHC-Molekülen gibt und nicht alle MHC-Moleküle ohne weiteres verfügbar sind. Dieses gilt speziell für MHC-Moleküle, die im Bezug auf isolierte Populationen eindeutig sind, oder für MHC-Moleküle, die im Bezug ethnische Minoritäten eindeutig sind. Beginnend mit einer Klasse I- oder Klasse II-MHC-Molekül-Expression vereinfacht von dem Standpunkt der genomischen DNA die Isolation des Gens, das von Interesse ist, und gewährleistet einfachere Mittel zum Erzeugen von MHC-Moleküle für die Untersuchung; andernfalls bliebe übrig zu bestimmen, welche MHC-Moleküle für die Untersuchung zu wählen oder nicht zu wählen sind, sowie zu bestimmen, welche ethnische Population, von der Frischeproben nicht erhalten werden können und daher deren MHC-Moleküle in einen Diagnostikassay nicht einbezogen werden.
  • Obgleich cDNA für genomische DNA als Ausgangsmaterial ersetzt werden kann, wird die Erzeugung von cDNA für die jeweiligen Typen der gewünschten HLA-Klasse I Hunderte von verschiedenen lebensfähigen Zelllinien vom HLA-Typ erfordern, die jeweils einen anderen HLA-Klasse I-Typ exprimieren. Alternativ werden von den Individuen frische Proben mit den verschiedenen gewünschten MHC-Typen benötigt. Die Verwendung genomische DNA als Ausgangsmaterial ermöglicht die Erzeugung von Klonen für zahlreiche HLA-Moleküle aus einer einzelnen genomischen DNA-Sequenz, da der Amplifikationsprozess zur Nachahmung rekombinatorischer und Gen-Umwandlungsereignisse beeinflusst werden kann. Es gibt mehrere mutagenese Strategien, mit denen ein vorgegebener Klasse I-gDNA-Klon entweder auf der Höhe der gDNA oder der cDNA, die aus diesem gDNA-Klon resultieren, modifiziert werden könnte. Der Prozess des Erzeugens von MHC-Molekülen, der in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, erfordert keine lebensfähigen Zellen, weshalb der Abbau, der die RNA plagt, kein Problem ist.
  • Methode der Epitop-Untersuchung
  • Unter Einsatz der Erzeugung einzelner, löslicher MHC-Proteine, wie sie hierin bereist beschrieben wurde, ist eine Methode zur Epitop-Untersuchung entwickelt worden. Eine derartige Methode zur Epitop-Untersuchung ist aufgrund der einzelnen Besonderheiten der in der hierin beschriebenen Weise erzeugten, löslichen HLA-Moleküle von Vorteil. In früheren Arbeiten auf diesem Gebiet wurden Mischungen verschiedener HLA-Moleküle zur Reinigung oder Abtrennung einzelner Klasse I- oder Klasse II-HLA-Moleküle aus der Mischung angewendet. Diese Reinigungsschritte haben jedoch zu einer selektiven Reinigung spezieller, endogen geladener Peptid/HLA-Komplexe geführt, während das gleiche HLA-Molekül, das mit einem anderen Peptid-Komplex gebunden war, nicht gereinigt wurde. Eine derartige selektive Reinigung wird die endogen geladenen Peptide in den HLA-Molekülen bevorzugen. Beispielsweise ist bei typischen Reinigungsmethoden die Verwendung von Antikörpern beteiligt, die bestimmte in den HLA-Molekülen geladene Peptide erkennen können und andere nicht. Darüber hinaus kann es sein, dass bei diesen Reinigungsschritten nicht alle anderen Klasse I- und Klasse II-HLA-Moleküle entfernt werden und das Zurücklassen dieser Proteine die Daten und ihre Interpretation verzerrt. Daher kann der Antikörper nicht alle einer speziellen Klasse I- oder Klasse II-HLA wegen des darin gebundenen Peptids erkennen. Unter Verwendung der einzelnen, löslichen HLA-Moleküle, die gemäß der vorliegenden Erfindung in der Methode der hierin beschriebenen Epitop-Untersuchung erzeugt werden, werden die einzelnen, löslichen HLA-Moleküle mit tausenden von auf natürlichem Wege erzeugten Peptiden geladen, und der Pool dieser einzelnen, löslichen HLA-Moleküle wird in der darin geladenen Peptid-Fracht nicht beeinflusst.
  • Das Ziel des Epitop-Bindungsassays besteht darin, die Affinität von Peptid-Liganden zum Binden an speziellen HLA-Molekülen zu identifizieren. Die ersten HLA-Bindungsuntersuchungen haben mit Detergens solubilisierte Klasse I-Moleküle von EBV-transformierten Zelllinien eingesetzt (Sette, Al, et al., Mol Immunol, 31(11): 813–22 (1994). Einer der erkennbaren Vorteile der Nutzung von HLA, die auf natürlichem Wege mit tausenden von endogenen Peptid-Liganden im Inneren der Zelle geladen ist, besteht darin, dass die Assays des kompetitiven Bindens von Peptid diese tausende von auf natürlichem Wege geladenen Peptide in dem Assay nutzen. In dem kompetitiven Assay mit natürlich geladener HLA kann das HLA-Molekül, das von Interesse ist, von anderen HLA-Molekülen in dem Detergens-Lysat gereinigt werden oder in einer Mischung mit anderen HLA-Molekülen verwendet werden. Es werden radiomarkierte Peptide identifiziert, die über eine hohe Affinität zu dem fraglichen HLA-Molekül verfügen. Die Affinität zusätzlicher "Test"-Peptide im Bezug auf das fragliche HLA-Molekül wird sodann aufgrund deren Fähigkeit zu ihrem Konkurrieren mit dem radiomarkierten Peptid hoher Affinität bestimmt.
  • Mit der Isolation des HLA mit natürlich beladenen Peptiden sind mehrere Herausforderungen verbunden. Eine der Herausforderungen besteht darin, dass die meisten EBV-Zelllinien sechs verschiedene Klasse I-Moleküle exprimieren. Die Reinigung der HLA-Moleküle kann zu der Isolation von Klasse I führen, die lediglich eine Unterreihe der repräsentativen Peptid-Liganden enthält (Solheim, J. C., et al., J. Immunol., 151(10); 5387–5397 (1993); und Bluestone, J. A., et al., Journal of Exp. Med., 176(6); 1757–61 (1992). Alternativ liefert die Verwendung einer Mischung von HLA-Molekülen Ergebnisse, bei denen der Untersuchende nicht weiß, welches HLA-Molekül in der Mischung das Peptid tatsächlich bindet. Eine dritte Herausforderung besteht darin, dass die Isolation der HLA-Proteine von Detergens-Zelllysaten Peptidmengen in der Größe von Mikrogramm erzeugt. Bei der Ausführung eines Peptid-Bindungsassays zweimal in dreifachen Ausführungen mit Hunderten bis Tausenden von Peptiden bei mehreren unterschiedlichen Konzentrationen für das jeweilige Peptid lässt sich das HLA-Protein in Milligramm-Mengen schnell nutzen.
  • Um diese Einschränkung in der Menge des mit natürlich geladenen Liganden verfügbaren HLA-Proteins zu umgehen, haben zwei Gruppen das Erzeugen von HLA-Proteinen in Bakterien veröffentlicht (Ostergaard Pedersen, L., et al., Eur J Immunol, 31(10; 2986–96 (2001); und Dedler, S., et al., J. Immunol Methods, 255(1–2); 57–66 (2001). Die in Bakterien erzeugten HLA müssen sodann zu einer natürlichen Konformation rückgefaltet werden, die aus Klasse I-schwerer Kette, beta-2-Mikroglobulin-leichter Kette und Peptid-Ligand(en) besteht. Während mit dieser Methode der Klasse I-Proteinerzeugung die Beschränkungen der Detergens-Lysat-HLA-Protein-Erzeugung umgangen werden, führt die Erzeugung in Bakterien (oder Insektenzellen) eine andere Reihe von Herausforderungen ein, HLA-Protein für eine Peptid-Bindungsuntersuchung zu erhalten.
  • Eine der Herausforderungen des Erzeugens von nichtnativen HLA-schweren Ketten und das anschließende Rückfalten in vitro besehen darin, dass die Rückfaltung in vitro schwierig sein kann. Diskussionen mit Dr. John Altman an der Emory University, The Beckman Tetramer Facility und anderen Mitarbeitern, die an bakteriellen HLA arbeiten, zeigen, dass der prozentuale Anteil der HLA, die sich zu einem intakten, trimolekularen Komplex von schwerer Kette/leichter Kette-Peptid rückfaltet im Bereich zwischen 0 und 70% liegen kann. Einige HLA-Moleküle kommen einwandfrei zusammen zurück, während das bei anderen nicht der Fall ist. Einer der Faktoren beim Rückfalten von HLA-Molekülen in vitro ist das Peptid; Peptide mit hoher Affinität unterstützen die Rückbildung des Komplexes während andere Peptide zu keiner HLA-Rückfaltung führen. Die Verwendung derjenigen, die mit einem Peptid hoher Affinität in einem Peptid-Bindungsassay Rückfalten, kann schwierig sein, da das Verdrängen eines einzelnen Peptids hoher Affinität in dem Bindungsassay schwierig sein kann. Dieses steht im Gegensatz zu den verschiedenen Affinitäten der tausende von endogen geladenen Peptiden. Andererseits lassen sich einige HLA-Moleküle, wenn sie aus Bakterien erzeugt sind, nicht Rückfalten. Schließlich wird sich, obgleich viele HLA-schwere Ketten erzeugt werden können lediglich ein Teil des Proteins rückfalten.
  • Das Verfahren zum Herstellen von sHLA mit Tausenden von natürlich geladenen, endogenen Peptiden, wie es hierin vorstehend offenbart wurde, ermöglicht die Erzeugung der HLA in natürlicher Form in Milligramm-Mengen. Auf diese Weise erzeugte Peptide sind charakterisiert worden und erweisen sich als die gleichen, wie mit Detergens solubilisierte HLA (Prilliman, K. R., et al., Immunogenetics, 45: 379–385 (1997); Prilliman, K. R., et al., Immunogenetics, 48: 89–97 (1998); Prilliman, K. R., et al., Tissue Antigens, 54(5): 450–60 (1999); und Prilliman, K. R., et al., J Immunol, 162(12):7277–84 (1999). Durch Ausscheiden von HLA-Proteinen sichern wir, dass lediglich das gewünschte HLA-Molekül in Lösung ist. Derartige HLA-Moleküle lassen sich dann ohne Beeinflussung der Peptide in dem HLA-Protein reinigen. Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass Peptide hoher Affinität, von denen bekannt ist, dass sie eine spezielle HLA-Spezifität binden, binden das infrage stehende HLA-Molekül, während Peptide, von denen bekannt ist, dass sie andere HLA-Moleküle binden, das infrage stehende HLA-Molekül nicht binden. Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass wir Peptide hoher Affinität mit Fluoreszenzmarkern markieren können und anschließend ein Kompetitionsassay ausführen, womit gezeigt wird, dass andere Peptide mit dem markierten Peptid hoher Affinität bei zunehmenden Konzentrationen konkurrieren können. Wir haben daher wesentliche Mengen eines sHLA-Reagens erzeugt, das in seiner Konformation und Peptid-Fracht natürlich ist und das für Peptid-Bindungsassays verwendbar ist. Die reichliche Menge an Protein ermöglicht ein Screening von Hunderten oder Tausenden von Peptiden bei unterschiedlichen Konzentrationen in mehrfachen Experimenten. Das auf natürliche Weise geladene Peptid gewährt eine echte, kompetitive Reflexion der Affinität der markierten und Testpeptide für das infrage stehende HLA-Molekül.
  • In einer der Ausführungsformen des Verfahrens der Epitop-Untersuchung werden gereinigte, einzelne, lösliche HLA-Moleküle, die endogen geladene Peptid-Liganden enthalten, mit einem Kontrollpeptid gemischt, von dem bekannt ist, dass es über eine hohe Affinität auf für das HLA-Molekül und das/die Peptid(e) das/die von Interesse ist/sind. Es wird eine Nachweismethode für das Binden des bekannten Kontrollpeptids hoher Affinität geboten, wie beispielsweise Markieren des Kontrollpeptids, d. h. Fluoreszenzmarkierung oder Radiomarkierung, oder Bereitstellen eines Antikörpers, der auf den gebildeten Komplex spezifisch ist, wenn das bekannte Kontrollpeptid hoher Affinität an dem einzelnen HLA-Molekül bindet (3 und 4). Das detektierbare Kontrollpeptid hoher Affinität wird die endogen geladenen Peptid-Liganden verdrängen und an dem einzelnen, löslichen HLA-Molekül binden, was durch Messung der Markierung an dem Kontrollpeptid oder der Antikörperbindung an dem Kontrollpeptid/HLA-Komplex detektiert wird, wobei das/die Peptid(e), das/die von Interesse ist/sind, mit den Kontrollpeptiden hoher Affinität für die Verdrängung der endogen geladenen Peptide und des Bindens an den einzelnen, löslichen HLA-Molekülen konkurrieren wird. Eine in einer solchen Methode verwendete, negative Kontrolle würde ein Peptid geringer Affinität sein, das nicht mit dem Kontrollpeptid hoher Affinität für die Verdrängung von endogen geladenem Peptid und das Binden der einzelnen, löslichen HLA-Moleküle konkurriert. Damit umfasst, einfach gesagt, die Epitop-Untersuchung unter Einsatz der löslichen HLA-Moleküle der vorliegenden Erfindung eine Kompetition zwischen dem Kontrollpeptid und dem Testpeptid, indem ermittelt wird, wie gut das Testpeptid das Kontrollpeptid von einem löslichen HLA-Molekül verdrängt hat und/oder ein endogen geladenes Peptid verdrängt und kompetitiv an einem löslichen HLA-Molekül bindet.
  • Der vorstehend beschriebene Assay wird im typischen Fall in flüssiger Phase ausgeführt, wobei die hierin beschriebene Methode der Epitop-Untersuchung jedoch auf Assays in fester Phase ausgelegt werden können. Das bedeutet, dass die einzelnen HLA-Moleküle an einen Träger gebunden sein können. Die Methoden des Bindens von Proteinen an einem Träger sind auf dem Fachgebiet bekannt und lassen sich an die hierin beschriebenen Assay-Methoden anpassen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform einer Methode der Epitop-Untersuchung unter Verwendung der einzelnen, löslichen HLA-Moleküle, wie hierin beschrieben wurde, kann eine Reihe einzelner, löslicher HLA-Moleküle an Luminex-Kügelchen gebunden werden. In der Luminex-Technologie werden jeweils Reihen von 100 bis 1.000 Kügelchen mit unterschiedlichen Konzentrationen zweier verschiedener Farbstoffe versehen. Beispielsweise kann Kügelchen A 10% Farbstoff A und 90% Farbstoff B aufweisen, während Kügelchen B 15% Farbstoff A und 85% Farbstoff B aufweist, während Kügelchen C 20% Farbstoff A und 80% Farbstoff B aufweist und Kügelchen D 25% Farbstoff A und 75% Farbstoff B aufweist usw. Ein spezieller Fluoreszenz-Detektor kann das jeweilige spezielle Kügelchen anhand der Mengen an Farbstoff A und Farbstoff B identifizieren, die in jedem Kügelchen vorhanden sind. An jedem der 100 bis 1.000 Luminex-Kügelchen kann ein anderes einzelnes Klasse I- oder Klasse II-HLA-Molekül binden. Es ist gezeigt worden, dass die einzelnen, löslichen HLA-Moleküle der vorliegenden Erfindung an den Luminex-Kügelchen binden können.
  • Damit kann der Fluoreszenz-Detektor die speziellen, einzelnen HLA-Moleküle anhand der speziellen Farbstoffmengen in dem Kügelchen, an denen derartige Moleküle gebunden sind, identifizieren. Es können alle Kügelchen miteinander in einem einzigen Assay gemischt werden, wie beispielsweise einer Mulde einer 96-Titer-Platte. Für die Reaktion wird ein detektierbares Kontrollpeptid hoher Affinität entsprechend der vorstehenden Beschreibung zu dem jeweiligen, einzelnen, löslichen HLA-Molekül, das an einem Kügelchen gebunden ist, hinzugegeben und ebenfalls das Peptid, das von Interesse ist, zu der Reaktion hinzugefügt. Die Mischung durchläuft sodann den Fluoreszenzdetektor, der zwei verschiedene Laser enthält. Der erste Laser detektiert die Farbstoffmengen in dem Kügelchen, d. h. der erste Laser identifiziert, welches Kügelchen den Laser passiert. Der zweite Laser ist so angeordnet, dass bei Identifikation des speziellen Kügelchens, das den ersten Laser passiert, der zweite Laser feststellt, ob das detektierbare Kontrollpeptid hoher Affinität an dem HLA-Molekül gebunden ist oder nicht, das an dem speziellen Kügelchen aufgebracht ist. Wie vorstehend ausgeführt, kann dieser Nachweise mithilfe einer an dem Kontrollpeptid aufgebrachten Radiomarkierung oder Fluoreszenzmarkierung erfolgen oder mithilfe einer Methode der Antikörper-Bindung, mit der der Kontrollpeptid/HLA-Komplex nachgewiesen wird. Auf diese Weise lässt sich für jedes Peptid, das von Interesse ist, 100 bis 1.000 Bindungstests ausführen, um zu bestimmen, welche HLA-Moleküle ein solches Peptid binden.
  • In einer anderen Ausführungsform der Methode der Epitop-Untersuchung können, da von den HLA-Molekülen bekannt ist, dass sie 9 Aminosäure-Peptide in ihrer Vertiefung binden, Nonamer-Peptide mit einem Chip oder einem anderen Trägertyp verknüpft werden, um ein Peptid-Mikroarray zu schaffen. Zur Herstellung von Protein-Mikroarrays sind beispielsweise PVDF-Membranen eingesetzt worden, wobei sich eine solche Technologie mühelos den hierin beschriebenen Methoden anpassen lässt. Derartige Nonamere können aus jeder beliebigen möglichen Kombination von Aminosäuren bestehen, und damit würden 920 Kombinationen von Nonameren genutzt werden, oder derartige Nonamere können sich lediglich hinsichtlich der Stellungen unterscheiden, von denen bekannt ist, dass sie für das Binden an HLA-Molekülen von Bedeutung sind, beispielsweise die Positionen 2 und 9 (in diesem Fall wären 220 Kombinationen erforderlich). Die Nonamere können an dem Chip oder einem anderen Trägertyp in jeder beliebigen, bekannten Weise verankert werden. Bevorzugt werden die Nonamere innerlich versetzt von den Nebenketten der Aminosäuren verankert und nicht an den Enden der Nonamere. Es ließen sich dann spezielle, einzelne Klasse I- oder Klasse II-HLA-Moleküle über den Nonamer-Mikroarray leiten, die man binden lassen kann und durch Detektieren des Bindens spezieller Klasse I- oder Klasse II-HLA-Moleküle an bestimmten Peptiden eine Datenbasis aller Peptide schaffen, an denen einzelne Klasse I- oder Klasse II-HLA-Moleküle binden können. Anstatt alle die verschiedenen Kombinationen von Peptiden zu erzeugen, die von einem speziellen Virus, einer Bakterie, einem Turmorgen usw. erzeugt wurden, um zu ermitteln, welche Peptide an einzelnen Klasse I- oder Klasse II-MHC-Molekülen gebunden sind, könnte auf diese Weise die genomische Sequenz eines solchen Virus, Bakterie usw. gegen die Daten "geschossen" werden, die vorstehend erhalten wurden und sich in der Datenbasis befinden, um vermutliche Epitope zu identifizieren, die in der hierin beschriebenen Methode der Epitop-Untersuchung genutzt werden könnten.
  • In einer anderen Ausführungsform der Methode der Epitop-Untersuchung ließe sich die vorstehend beschriebene Technologie "umschalten", d. h. die einzelnen HLA-Moleküle könnten an dem Chip oder einem anderen Träger gebunden werden, um ein HLA-Protein-Mikroarray zu erzeugen. Eine solche Methode wäre ähnlich den Assays in Festphase, wie sie hierin vorstehend beschrieben wurden.
  • In der Epitop-Untersuchung eingesetzte Peptide
  • Bei den in dem Epitop-Bindungsassay der vorliegenden Erfindung zu untersuchenden Peptiden wird es sich um synthetische Peptide handeln, deren Sequenz abgeleitet sein wird von Abschnitten verschiedener Wirts-, viraler und bakterieller Proteine. Die Proteine, auf die die Peptide basieren, können auf unterschiedliche Weise identifiziert werden. Eine der Methoden zum Identifizieren von Proteinen, die Peptide enthalten, die an HLA-Molekülen binden können oder nicht binden können läuft über die Verwendung von T-Lymphocyten. Von T-Lymphocyten ist bekannt, dass sie spezielle Peptide im Zusammenhang mit den speziellen HLA-Molekülen erkennen. Im Grunde ist dieses der Mechanismus, mit dem T-Lymphocyten speziell auf Antigene in erworbenen Immunreaktionen zielen.
  • Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Verwendung von T-Lymphocyten zum Identifizieren von HLA-haltenden Peptiden, die den Lymphocyten auslösen. Eine der Möglichkeiten besteht darin, die Komplexmischung von Peptiden, die aus HLA-Molekülen eluiert wurde, in Fraktionen oder Zeitpunkten aufzutrennen. Die Peptide in den Fraktionen werden sodann auf HLA-Moleküle geladen und die Zellen mit den geladenen Peptiden an T-Lymphocyten von einem Krebspatient, einer virusinfizierten Person oder einer Person mit einer bakteriellen Infektion exponiert. Die Idee besteht darin, dass die T-Lymphocyten von einer Person mit einer von T-Lymphocyten kontrollierten Krankheit verwendet werden können, die T-Lymphocyt-Peptid/HLA-Immuntargets zu identifizieren.
  • Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Messung der Erkennung der HLA-Peptid-Targetzellen, indem T-Lymphocyten verwendet werden. Eine der Methoden besteht darin, dass man eine HLA/Peptid-Targetzell-Lyse mithilfe von T-Lymphocyten nachweist, wie sie offenbart wurde in Smith, E. S., et al., Lethalitybased selection of recombinant genes in mammalian cells; application to identifying tumor antigens. Nat Med, 2001. 7(8): Seite 967–72; Huczko, E. L., et al., Characteristics of endogenous peptides eluted from the class I MHC molecule HLA-B7 determined by mass spectrometry and computer modeling. J. Immunol., 1993. 151: Seiten 2572–2587; Scheibenbogen, C., et al., Analysis of the t cell response to tumor and viral peptide antigens by an IFNg-ELISPOT assay. Int. J. Cancer, 1997: 71: Seiten: 932–936; und Rinaldo, C. R., Jr., et al., Anti-human Immunodeficiency virus type 1(HIV-1) CD8(+) T-lymohocyte reactivity during combination antiretroviral therapy in HIV-1-Infected patients with advanced immunodeficiency. J. Virol, 2000. 79(9): Seiten 4127–38. Unter Anwendung eines oder einer Kombination von Assays, die die T-Lymphocyten-Erkennung einer Targetzelle detektieren, lassen sich Experimente so konzipieren, dass HLA-Peptid-Kandidaten identifiziert waren, die T-Lymphocyten auslösen können.
  • In den vorgenannten Fundstellen ist den Untersuchenden, die T-Lymphocyten zum Identifizieren von HLA-Peptid-Targets verwenden, nicht bekannt, welches Peptid T-Lymphocyten stimuliert. Beispielsweise ist Zauderer et al. bekannt, dass eine Überexpression eines transfizierten "Tumorgens" in einer Zelllinie bewirkt, dass T-Lymphocyten von Krebspatienten diese Zelllinie erkennen. Allerdings lässt sich mit diesem Assay nicht ermitteln, welches Peptid von dem Protein, das durch das transfizierte "Tumorgen" codiert wird, die T-Lymphocyten-Erkennung auslöst. Darüber hinaus ist dem Untersuchenden nicht bekannt, ob ein von dem Protein abgeleitetes Peptid, das durch das "Tumorgen" codiert wird, von der HLA präsentiert wird oder ob das Gen indirekt andere Proteine verändert, was indirekt dazu führen kann, dass in dem HLA das Peptid eines anderen Proteins erkannt wird.
  • Andere Anwendungen von T-Lymphocyten zeigen, dass es HLA-Peptid-Targetkomplexe gibt, jedoch geben sie wiederum nicht an, welches exakte Targetpeptid sich in dem HLA-Molekül befindet. Unter Anwendung des Nachweises aus dem T-Lymphocyten-Assay wird ein Untersuchender mehrere Peptide synthetisch darstellen, von denen vermutet wird, dass sie dem T-Lymphocyten-Target ähnlich sind. Diese Peptide lassen sich dann auf ihr Binden an den HLA-Targetmolekülen testen. Peptide, die an HLA-Molekülen binden, werden in diesem Bindungsassay detektiert. Ein solches Binden an einem HLA-Molekül zeigt, dass ein Peptid als nächstes auf Erkennung durch T-Lymphocyten getestet werden sollt. Peptide, die nicht binden, können von einer weiteren Charakterisierung eliminiert werden.
  • Die Verwendung von T-Lymphocyten ist eine Möglichkeit, mit der Durchsuchung von Proteinen und Peptid-Mischungen auf mögliche Immuntagets zu beginnen. Eine andere Möglichkeit besteht einfach darin, alle überlappenden Peptide in einem Targetprotein synthetisch darzustellen. Diese überlappenden Peptide können auf ihr Binden an HLA-Proteinen getestet werden. Peptide, die binden, können sodann auf T-Lymphocyten-Erkennung getestet werden. Mit diesem Prozess werden T-Lymphocyten aus dem Selektionsprozess eliminiert.
  • Ein Protein, von dem ein Untersuchender wünscht, dass es in einem Vakzin einer Diagnostik oder Therapie ein Target ist, lässt sich in einer Reihe von Möglichkeiten auswählen. Diese Mechanismen der Protein-Auswahl schließt T-Lymphocytenwahl ein, Microarray-Identifikation von aufwärtsregulierten Genen oder das einfache Prüfen von Immunreaktionen auf ein Protein, das von Interesse ist. Die Auswahlkriterien werden sodann zu einem Epitop-Bindungsassay entsprechend der Beschreibung hierin zusammengestellt, um Abschnitte eines Proteins zu identifizieren, das an einem oder vielen HLA-Proteinen gut bindet. Eine andere Methode, die sich mit dem hierin beschriebenen Epitop-Bindungstest koppeln lässt, ist eine prognostische Datenbasis. Eine prognostische Datenbasis kann angeben, welche Peptide in welchen Proteinen an HLA binden könnten, wonach der hierin beschriebene HLA-Bindungstest diese Vorhersagen bestätigen oder zurückweisen kann.
  • Bei den vorgenannten Methoden zum Identifizieren von Epitopen für den Peptid-Bindungsassay handelt es sich um indirekte Methoden, d. h. die Peptide, die immunogen sein könnten, werden nicht direkt als immunogen identifiziert. Insofern bestätigt der hierin beschriebene Epitop-Testassay, welche Peptide tatsächlich an HLA-Molekülen binden. Der Epitop-Testassay bestimmt außerdem, wie gut ein Peptid bindet und an welchem/welchen HLA-Molekül(en) das Peptid bindet. Die Bestimmung, an welchem/welchen HLA-Molekül(en) ein Peptid bindet ist deshalb von Bedeutung, weil die Population für HLA heterogen ist. Daher ist ein Peptid, das viele HLA bindet, ein guter Kandidat für ein Vakzin, weil ein Vakzin, in welchem dieses Peptid eingebaut ist, in einem breiteren Bereich der Population funktionsfähig ist. Der Peptid-Bindungsassay zeigt daher an, wie viele HLA und wie gut an dem jeweiligen HLA ein Peptid-Epitop bindet.
  • Der Peptid-Bindungsassay kann auch mit direkten Epitop-Nachweismethoden gekoppelt werden. Beispielsweise lassen sich Peptid-Epitope, die in Bezug auf infizierte und Krebszellen eindeutig sind, direkt identifizieren, indem sHLA-Moleküle in Krebszellen und infizierten Zellen erzeugt werden und anschließend die Epitope, die in Bezug auf die Krebszellen oder infizierten Zellen eindeutig sind, sequenziert werden. Diese Epitope können sodann auf ihr Binden an verschiedenen HLA-Molekülen getestet werden, um festzustellen, wie viele HLA-Moleküle diese Epitope binden könnten.
  • Zusammengefasst kann eine Reihe von Methoden angewendet werden, um Peptide auszuwählen, die an HLA binden können und Immuntargets sein können. Der Epitop-Bindungsassay kann ermitteln, ob ein vermutliches Peptid-Target tatsächlich an einem speziellen HLA-Molekül bindet und wie gut dieses Epitop das spezielle HLA im Vergleich zu anderen bekannten Peptiden bindet, die an dem speziellen HLA binden. Der Epitop-Bindungsassay lässt sich Anwenden für Platten von überlappenden, synthetischen Peptiden einem Screening zu Unterwerfen und dazu beizutragen, eine große Zahl von potentiellen Vakzin/Diagnostik-Kandidaten herauszufinden. Solche Peptide, die gut binden, lassen sich sodann auf Immunogenität testen. Schließlich kann ein Epitop-Bindungsassay ermitteln, ob ein spezielles Peptid mehrfach HLA-Moleküle bindet sowie die relative Affinität des Peptids auf verschiedene HLA-Moleküle.
  • Methoden der Epitop-Auffindung und vergleichende Ligandenkartierung
  • Wie vorstehend ausgeführt können Peptide, die in dem Peptid-Bindungsassay eingesetzt werden, mithilfe von Methoden der direkten Epitop-Auffindung identifiziert werden. Beispielsweise lassen sich Peptid-Epitope, die in Bezug auf infizierte und Krebszellen eindeutig sind, direkt identifizieren, indem sHLA-Moleküle in Krebszellen und infizierten Zellen erzeugt und anschließend die in Bezug auf Krebszellen und infizierte Zellen eindeutigen Epitope sequenziert werden. Derartige Epitope können anschließend hinsichtlich ihres Bindens an verschiedenen HLA-Molekülen getestet werden, um herauszufinden, wie viele HLA-Moleküle diese Epitope binden könnten.
  • Methoden der Epitop-Auffindung schließen die folgenden Schritte ein: (1) Bereitstellen einer Zelllinie, die ein Konstrukt enthält, welches ein einzelnes, lösliches Klasse I- oder Klasse II-MHC-Molekül codiert (wobei die Zelllinie in der Lage ist, auf natürlichem Wege "Selbst-Proteine" oder "Nichtselbst-Proteine" in Peptid-Liganden einzubauen, die in die Antigen-bindenden Vertiefungen der Klasse I- oder Klasse II-MHC-Moleküle geladen werden können); (2) Kultivieren der Zelllinie unter Bedingungen, welche die Expression des einzelnen, löslichen Klasse I- oder Klasse II-MHC-Moleküls von dem Konstrukt erlauben, wobei diese Bedingungen auch ein endogenes Laden eines Peptid-Liganden (aus dem Selbst- oder Nichtselbst-bearbeiteten Protein) in die Antigen-bindende Vertiefung jedes einzelnen, löslichen Klasse I- oder Klasse II-MHC-Moleküls vor der Abscheidung der löslichen Klasse I- oder Klasse II-MHC-Moleküle erlauben, die Peptid-Liganden daran gebunden haben; und (4) Abtrennen der Peptid-Liganden von den einzelnen, löslichen Klasse I- oder Klasse II-MHC-Molekülen.
  • Klasse I- und Klasse II-MHC-Moleküle sind faktisch ein trimolekularer Komplex, der aus einer Alpha-Kette besteht, einer Beta-Kette und der Peptid-Fracht der Alpha/Beta-Kette (d. h. Peptid-Ligand), die auf der Zelloberfläche den Immun-Effektorzellen präsentiert wird. Da es die Peptid-Fracht ist und nicht die MHC-Alpha-und-Beta-Ketten, die eine Zelle als infiziert, tumorgen oder erkrankt markiert, besteht ein großer Bedarf die durch spezielle MHC-Moleküle gebundenen Peptid-Liganden zu identifizieren und zu charakterisieren. Beispielsweise bietet die Charakterisierung derartiger Peptid-Liganden eine große Unterstützung bei der Bestimmung, wie die Peptide, die von einer Person mit MHC-assoziiertem Diabetes präsentiert werden, sich von den Peptiden unterscheiden, die von den MHC-Molekülen präsentiert werden, die mit einer Resistenz gegen Diabetes in Verbindung stehen. Wie vorstehend ausgeführt, bietet, wenn man über einen ausreichenden Vorrat eines einzelnen MHC-Moleküls verfügt und damit der gebundenen Peptide des MHC-Moleküls, eine Möglichkeit zur Untersuchung derartiger Erkrankungen. Da das Verfahren der vorliegenden Erfindung Mengen an MHC-Protein bereitstellt, die zuvor nicht erhalten werden konnten, lassen sich jetzt beispiellose Untersuchungen von MHC-Molekülen und derer bedeutende Peptid-Fracht erleichtern und zur Unterscheidung von infizierten/Tumorzellen von nichtinfizierten/Nichttumorzellen mithilfe eindeutiger Epitope einsetzen, die von MHC-Molekülen im Erkrankungszustand oder Nichterkranktenzustand präsentiert werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt die direkte, vergleichende Analyse von Peptid-Liganden ein, die aus Klasse I-HLA-Mokekülen eluiert wurden. Die Hinzufügung eines C-terminalen Epitop-Anhangs (wie beispielsweise ein 6-HIS- oder Flag-Schwanz) zu transfizierten Klasse I-Molekülen hatte keine Auswirkungen auf die Besonderheit des Peptid-Bindens des Klasse I-Moleküls und dementsprechend keine nachteiligen Auswirkungen auf die direkte Liganden-Kartierung des Peptids und dessen Sequenzierung und auch nicht auf ein Zerstören der endogenen Peptid-Ladung.
  • Das beschriebene Verfahren bezieht sich ferner auf eine neuartige Methode zum Detektieren solcher Peptid-Epitope, die die infizierte/Tumorzelle von der nichtinfizierten/Nichttumorzelle unterscheiden. Die Ergebnisse, die gemäß dem methodischen Vorgehen der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, können nicht vorhergesagt werden oder indirekt bestätigt werden; es können lediglich mit einer direkten Methode der Epitop-Auffindung die beschriebenen, eindeutigen Epitope identifiziert werden. Darüber hinaus kann man lediglich mit dieser direkten Vorgehensweise sicherstellen, dass das Quellprotein zu potentiell immunogenen Peptid-Epitopen abgebaut ist. Schließlich gewährt diese eindeutige Vorgehensweise einen Einblick darin, welche Proteine in den infizierten/Tumorzellen eindeutig aufwärts- und abwärtsreguliert sind.
  • Die Nutzanwendung der HLA-präsentierten Peptid-Epitope, die die infizierte/Tumorzelle infizieren, ist von dreifacher Art. Erstens, kann eine zum Nachweis eines Krankheitszustandes (d. h. Infektion oder Krebs) konzipierte Diagnostik Epitope nutzen, die in Bezug auf infizierte/Krebszellen eindeutig sind, um das Vorhandensein/Fehlen eines Tumor/Virus zu bestätigen. Zweitens, stellen im Bezug auf infizierte/Tumorzellen eindeutige Epitope Vakzin-Kandidaten dar. Hierin werden von uns Epitope beschrieben, die aus der Oberfläche von mit HIV infizierten Zellen hervorgehen. Derartige Epitope könnten nicht ohne natürliche Virusinfektion und direkte Epitop-Auffindung vorhergesagt werden. Die aufgefundenen Epitope sind von Proteinen abgeleitet, die im Bezug auf virusinfizierte und Tumorzellen eindeutig sind. Diese Epitope lassen sich für die Virus/Tumor-Vakzin-Entwicklung sowie für die Virus/Tumor-Diagnostik verwenden. Drittens, zeigt das Verfahren, dass spezielle, auf Virus infizierte Zellen eindeutige Proteine in Kompartimenten der Wirtszelle angetroffen werden, die auf andere Weise nicht darin gefunden werden. Damit identifizieren wir eindeutig aufwärts regulierte oder befrachtete Wirtsproteine für das Medikamenten-Targeting zum Abtöten infizierter Zellen.
  • Peptid-Epitope, die im Bezug auf die HLA-Moleküle von HIV-infizierten Zellen eindeutig sind, können mithilfe des direkten Vergleichs mit HLA-Peptid-Epitopen von nichtinfizierten Zellen mithilfe der in dem Fließschema von 2 veranschaulichten Methode identifiziert werden. Eine solche Methode hat gezeigt, dass sie in der Lage ist es zu identifizieren: (1) HLA-präsentierte Peptid-Epitope, die von intrazellulären Wirtsproteinen deriviert sind, die in Bezug auf infizierte Zellen eindeutig sind, die jedoch nicht in nichtinfizierten Zellen angetroffen werden, und (2) dass die intrazellulären Quellproteine der Peptide in HIV-infizierten Zellen eindeutig exprimiert/eingearbeitet werden, sodass die Peptidfragmente der Proteine von HLA auf infizierten Zellen präsentiert werden können, nicht jedoch auf nichtinfizierten Zellen.
  • Die Methode der Epitop-Auffindung und die vergleichende Liganden-Kartierung beschreibt daher ebenfalls die eindeutige Expression von Proteinen in infizierten Zellen oder alternativ die eindeutige Befrachtung und Bearbeitung von normal exprimierten Wirtszellen, sodass Peptidfragmente davon durch HLA-Moleküle auf infizierten Zellen präsentiert werden. Diese HLA-präsentierten Peptidfragmente von intrazellulären Proteinen stellen leistungsstarke Alternativen zum Diagnostizieren von virusinfizierten Zellen und zum Targeting von infizierten Zellen zur Zerstörung dar (d. h. zur Vakzin-Entwicklung).
  • Eine Gruppe der Wirt-Quellproteine für HLA-präsentierte Peptid-Epitope, in Bezug auf HIV-infizierte Zellen eindeutig sind, stellen Quellproteine dar, die eindeutig in Krebszellen exprimiert werden. Beispielsweise wird unter Anwendung des methodischen Vorgehens gemäß der vorliegenden Erfindung ein Peptidfragment von Reticulocalbin eindeutig auf HIV-infizierten Zellen festgestellt. Eine Suche in der Literatur zeigt, dass das Reticulocalbin-Gen eindeutig in Krebszellen aufwärts reguliert ist (Brustkrebs, Leberkrebs, Carzinom). So lässt sich daraus schließen, dass das HLA-präsentierte Peptidfragment von Reticulocalbin, das HIV-infizierte Zellen von nichtinfizierten Zellen unterscheiden kann, ebenfalls Tumorzellen von gesunden Nichttumorzellen unterscheiden kann. Nun sind HLA-präsentierte Peptidfragmente von Wirtsgenen und Genprodukten, die Tumorzellen und virusinfizierte Zellen von gesunden Zellen unterscheiden können, direkt identifiziert worden. Die Methode der Epitop-Auffindung ist ebenfalls zur Identifizierung von Wirtsproteinen in der Lage, die auf virusinfizierten oder Tumorzellen eindeutig exprimiert oder eindeutig eingearbeitet sind. HLA-präsentierte Peptidfragmente von derartigen, eindeutig exprimierten oder eindeutig eingearbeiteten Proteinen können als Vakzin-Epitope und als Diagnostikmittel verwendet werden.
  • Die methodische Vorgehensweise zum Targeting und Detektieren von virusinfizierten Zellen muss nicht die zum Targeting der Virus-derivierten Peptide sein. Vielmehr zeigt das methodische Vorgehen der vorliegenden Erfindung, dass der Weg zur Unterscheidung infizierter Zellen von gesunden Zellen über Veränderungen in der Wirts-codierten Protein-Expression und -Bearbeitung geht. Dieses gilt für Krebszellen genauso wie für virusinfizierte Zellen. Das methodische Vorgehen gemäß der vorliegenden Erfindung führt zu Daten, die ohne Einschränkung zeigen, dass Proteine/Peptide Virus-/Tumorzellen von gesunden Zellen unterscheiden.
  • In einem kurzen Beispiel des methodischen Vorgehens der vergleichenden Liganden-Kartierung, worin die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Einsatz gelangen, wird eine Zelllinie, die einzelne, lösliche MHC-Moleküle erzeugt, aufgebaut, wie hierin bereits beschrieben wurde. Es wird ein Teil der transfizierten Zelllinie gemeinsam mit einem Virus, der von Interesse ist, kultiviert und führt zu einem Virus mit hohem Titer und liefert infizierte Zellen. In dem hierin gebotenen Beispiel ist der Virus, der von Interesse ist, ein HIV. Alternativ kann ein Teil der Zelllinie, die einzelne, lösliche MHC-Moleküle erzeugt, transformiert werden, um eine Tumorzelllinie zu erzeugen.
  • Die nichtinfizierte Zelllinie und die Zelllinie, die mit HIV infiziert ist, werden beide in Hohlfaser-Bioreaktoren entsprechend der Beschreibung hierin in Kultur genommen und der lösliche HLA-enthaltende Überstand sodann aus den Hohlfaser-Bioreaktoren entfernt. Die nichtinfiziert und infiziert geernteten Überstände werden sodann in identischer Weise nach der Entfernung aus dem Zell-Pharmacon behandelt.
  • Die MHC-Klasse I-Peptid-Komplexe werden unter Verwendung von W6/32-Antikörpern aus den infizierten und nichtinfizierten Überständen einer Affinitätsreinigung unterzogen. Nach der Elution werden Peptide aus den Klasse I-Molekülen isoliert und mithilfe der Umkehrphasen-HPLC-Fraktionierung abgetrennt. Es werden separate und jedoch identische (bis herab zu den gleichen Puffer-Präparaten) Peptid-Reinigungen für jede Peptid-Charge von nichtinfizierten und infizierten Zellen vorgenommen.
  • Es wurden sodann fraktionierte Peptide mithilfe der Massenspektrometrie kartiert, um Fraktion-basierende Ionenkartierungen zu erzeugen. Die Spektren von dergleichen Fraktion in nichtinfizierten/infizierten Zellen wurden manuell abgeglichen und visuell auf Vorhandensein von Unterschieden in den von den Spektren dargestellten Ionen bewertet. Es wurden Ionen für das MS/MS-Sequenzieren ausgewählt, die den folgenden Kategorien entsprachen: (1) Aufwärtsregulierung in infizierten Zellen (mindestens 1,5 Faltung über das gleichen Ion in nichtinfizierten Zellen), (2) Abwärtsregulierung in infizierten Zellen (mindestens 1,5 Faltung über das gleiche Ion in den nichtinfizierten Zellen), (3) Vorhandensein des Ions ausschließlich in infizierten Zellen oder (4) Fehlen eines Ions in infizierten Zellen, das in nichtinfizierten Zellen vorhanden ist. Darüber hinaus wurden mehrere Parameter ermittelt, bevor Peptide einer der vorgenannten Kategorien zugeordnet wurden, einschließlich wurden die Peptid-Fraktionen kontrolliert, die der Peptid-Fraktion vorangingen und folgten, und zwar mithilfe der MS/MS um sicherzustellen, dass das interessierende Peptid in einer früheren oder späteren Fraktion nicht vorhanden war, sowie die Erzeugung synthetischer Peptide und diese einer MS/MS unterziehen, um eine genaue Übereinstimmung zu überprüfen. Darüber hinaus umfasst ein vorgezogener Schritt der Qualitätskontrolle die Untersuchung der Sequenz des Peptids, um zu erkennen, ob es zu dem "vorhergesagten Motiv" passt, dass durch Sequenzen festgelegt ist, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie von dem eingesetzten MHC-Molekül präsentiert werden.
  • Nach der Identifikation der Epitope wurden an Quellproteinen Literatursuchen ausgeführt, um deren Funktion im Inneren der infizierten Zelle zu ermitteln, und die Quellproteine zu Gruppen entsprechend der Funktionen im Inneren der Zelle klassifiziert. Zweitens wurden Quellproteine auf andere mögliche Epitope gescannt, die durch andere MHC-Klasse I-Allele gebunden sein können. Peptid-Bindungsvorhersagen wurden eingesetzt, um zu ermitteln, ob andere von den Quellproteinen präsentierte Peptide zum Binden vorhergesagt wurden und in ähnlicher Weise Proteasomale-Vorhersagealgorithmen eingesetzt, um die Wahrscheinlichkeit dafür zu bestimmen, dass ein Peptid durch das Proteasom erzeugt wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle I Peptid-Liganden aufgeführt, von denen identifiziert worden ist, dass sie von dem B*0702-Klasse I-MHC-Molekül in Zellen präsentiert werden, die mit dem HIV MN-1-Virus infiziert sind, nicht jedoch in nichtinfizierten Zellen, wobei ebenfalls ein Peptid-Ligand aufgeführt ist, der als nicht durch B*0702-Klasse I-MHC-Molekül in Zellen, die mit dem HIV MN-1-Virus infiziert sind, präsentiert wurde, der in nichtinfizierten Zellen präsentiert wurde. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet kann die Neuheit und Nutzbarkeit der erfindungsgemäßen Methodik zur direkten Identifikation solcher Peptid-Liganden und die Bedeutung einer solchen Identifikation einschätzen, die sie für zahlreiche therapeutische (Vakzin-Entwicklung, Medikamenten-Targeting) und diagnostische Instrumente hat.
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Wie vorstehend ausgeführt, werden in Tabelle I die Sequenzen von Peptid-Liganden identifiziert, die bis jetzt als eindeutig im Bezug auf HIV-infizierte Zellen identifiziert wurden. Klasse I-sHLA-B*0702 wurde für T-Zellen geerntet, die mit HIV infiziert bzw. nichtinfiziert waren. Es wurden Peptid-Liganden aus B*0702 eluiert und auf einem Massenspektrometer vergleichend kartiert, sodass Ionen, die in Bezug auf infizierte Zellen eindeutig waren, in Erscheinung traten. Die in Bezug auf infizierte Zellen eindeutigen Ionen (und ein im Bezug auf nichtinfizierte Zellen eindeutiger Ligand) wurden der massenspektrometrischen Fragmentierung für eine Peptid-Sequenzierung unterworfen. Spalte 1 zeigt das zum Sequenzieren ausgewählte Ion, Spalte 2 ist die HPLC-Fraktion, Spalte 3 ist die Peptid-Sequenz, Spalte 4 ist die vorhergesagte Molmasse, Spalte 5 ist die ermittelte Molmasse, Spalte 6 ist das Quellprotein für das sequenzierte Epitop, Spalte 7 gibt an, wo das Epitop in der Sequenz des Quellproteins beginnt, Spalte 8 ist die Zugriffnummer und Spalte 9 ist ein Deskriptor, der kurz angibt, was von dem Epitop und/oder seinem Quellprotein bekannt ist.
  • Die hierin zur Anwendung gelangte Methodik dient der Verwendung von sHLA, um zu ermitteln, welche in Bezug auf nichtgesunden Zellen im Vergleich zu gesunden Zellen eindeutig sind. Die Verwendung von sHLA zur übersichtlichen Betrachtung der Inhalte einer Zelle liefert einen Einblick darin, welche in Bezug auf nichtgesunde Zellen hinsichtlich der Proteine eindeutig sind, die in die Peptide eingearbeitet sind. Die in Tabelle I zusammengestellten Daten zeigen, dass die hierin beschriebene Methode der Epitop-Auffindung in der Lage ist, sHLA-gebunde Epitope und deren Quellproteine zu identifizieren, die in Bezug auf infizierte/nichtgesunde Zellen eindeutig sind.
  • In ähnlicher Weise, wie auch in Tabelle I gezeigt wird, können Peptid-Liganden, die in einzelnen Klasse I-MHC-Molekülen in einer nichtinfizierten Zelle präsentiert werden, die durch einzelne Klasse I-MHC-Moleküle in einer nichtinfizierten Zelle nicht präsentiert werden, ebenfalls identifiziert werden. Beispielsweise wurde das Peptid "GSHSMRY" (SEQ ID Nr:20) mithilfe der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung als ein einzelnes Klasse I-MHC-Molekül identifiziert werden, das in einer nichtinfizierten Zelle vorhanden ist, nicht jedoch in einer infizierten Zelle vorhanden ist.
  • Die Nutzung dieser Daten besteht mindestens in dreierlei Hinsicht. Erstens, zeigen die Daten, was aus der Zelle mit HLA herauskommt. Diese Daten können für ein Targeting von CTL auf nichtgesunde Zellen verwendet werden. Zweitens können die Antikörper für ein Targeting verwendet werden, um speziell HLA-Moleküle zu erkennen, die den beschriebenen Ligand führen. Drittens, kann die Realisierung des Quellproteins zu Therapien und zur Diagnostik führen, die auf das Quellprotein zielen. Somit zeigt ein in Bezug auf nichtgesunden Zellen eindeutiges Epitop auch, dass das Quellprotein in der nichtgesunden Zelle eindeutig ist.
  • Die Methoden der Epitop-Auffindung und der vergleichenden Liganden-Kartierung, wie sie hierin beschrieben sind, sind nicht auf durch einen Mikroorganismus infizierte Zellen beschränkt, wie beispielsweise HIV. Nichtgesunde Zellen, die mithilfe des hierin beschriebenen Verfahrens der Epitop-Auffindung analysiert werden, können sich aus einer Virusinfektion ergeben oder auch aus einer cancerogenen Umwandlung. Darüber hinaus kann der Status einer nichtgesunden Zelle auch durch Transfizieren eines speziellen Gens nachgeahmt werden, von dem bekannt ist, dass es im Verlaufe einer viralen Infektion oder einer Tumorbildung exprimiert wird. Beispielsweise können spezielle Gene von HIV in einer Zelllinie exprimiert werden, wie beschrieben wurde von Achour, A., et al., AIDS Res Retroviruses, 1994. 10(1): Seiten 19–25; und Chiba, M., et al., CTL Arch Vitrol, 1999. 144(8): Seiten 1469–85, wonach der Prozess der Epitop-Auffindung ausgeführt wird, um festzustellen, wie die Expression des transferierten Gens die Epitop-Präsentation durch sHLA modifiziert. In ähnlicher Weise lassen sich Gene, von denen bekannt ist, dass sie bei Krebs aufwärts reguliert werden (Smith, E. S. et. al., Nat Med, 2001. 7(8): Seiten 967–72) in Zellen mit sHLA übertragen und sodann eine Epitop-Auffindung vollenden. Damit kann eine Epitop-Auffindung mit sHLA, wie hierin beschrieben wurde, an Zellen vervollständigt werden, die mit intakten Pathogenen, cancerogenen Zeilen oder Zelllinien oder Zellen infiziert sind, in die ein spezielles Krebsgen, virales oder bakterielles Gen transferiert worden ist. In allen diesen Fällen liefert das hierin beschriebenen sHLA eine Möglichkeit zum Detektieren, was sich im Bezug auf Epitop-Präsentation und den Quellproteinen für die Epitope ändert.
  • Beispiel für ein Epitop-Bindungsassay unter Verwendung von radiomarkiertem Peptid und Vergleich sHLA mit Detergenslyast hergestelltem HLA
  • Die Ausführbarkeit eines kompetitiven Bindungsassays wurde unter Anwendung eines speziellen Assays auf das A*0201T-Allel getestet, um das Binden vorgegebener, synthetischer, antigener Peptide unter Verwendung von sHLA-Klasse I-Molekülen zu messen. Ein von HBV-deriviertes Peptid, von dem bekannt ist, dass es stark A*0201T bindet, wurde verwendet, um das endogene Peptid in Lösung zu ersetzen. Als eine negative Kontrolle wurde ein irrelevantes p53-Peptid verwendet, insofern es nicht mit dem endogenen Peptid für das spezifische Binden an A*0201T konkurriert.
  • In der Reaktion wurden unterschiedliche Konzentrationen von einzelnem sHLA mit darin gebundenem, endogenen Peptid inkubiert mit (1) einer Standardkonzentration von HBV-Peptid (Positivreaktion) oder (2) p53-Peptid (Negativreaktion) und nach Inkubation für 48 Stunden bei Raumtemperatur die sHLA-Komplexe auf einem festen Träger unter Verwendung von HLA-spezifischem Antikörper W6/32 immobilisiert. Der A*0201T-HVB-Peptidkomplex wurde unter Verwendung eines hochspezifischen Antikörpers detektiert (Maus-Antihuman-MHC/HVB-Peptidantikörper 5H9/1-2H), der lediglich diese spezielle Konformation erkennt (d. h. A*0201T mit HBV-Peptid darin gebunden), während A*0201T-endogene Peptid-Komplexe durch den Antikörper nicht erkannt werden. Um den Austauschvorgang sichtbar zu machen, wurde ein zweiter Antimaus-Antikörper konjugiert mit HRP verwendet.
  • Der Assay wurde unter Verwendung einer sHLA-Menge von 1,5 μg A*0201T mit einem Endvolumen von 20 μl (75 ng/μl) und einer Peptid-Endmenge von 2 μg bei einem Endvolumen von 20 μl (100 ng/μl) ausgeführt. Nach Inkubation wurde die Reaktion 75fach verdünnt und Titriermengen von sHLA-Peptidkomplexen mit dem auf einer ELISA-Platte aufgezogenen W6/32-Antikörper abgefangen.
  • 3 veranschaulicht, dass sich unter Verwendung des HBV-Peptids eine Sättigung der mit W6/32 beschichteten ELISA-Platte erzielen ließe, womit der erfolgreiche Austausch des endogenen Peptids durch das HBV-Peptid nachgewiesen ist. Keine Sättigung ließe sich jedoch unter Verwendung des irrelevanten Peptids p53 nachweisen, wodurch die Spezifität des HBV-Peptidbindens an sHLA A*0201T gestützt wird.
  • Zusätzlich wurden die hierin verwendeten sHLA-Moleküle mit einem HLA verglichen, das mithilfe der bekannten Methode des Detergens-Lysat unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Methode hergestellt wurde. 4 ist ein Vergleich der Sättigungskurven des sHLA-Allels A*0201T und des Detergens-Lysat-Präparats von A*0201, das durch Zellextraktion erhalten wurden. Diese Figur demonstriert, dass eine sehr viel geringere Konzentration von sHLA-A*0201 ein detektierbares und verwendbares Signal im Vergleich zu der detergenssolubilisierten Klasse I A*0201 liefert. Dieses kann darauf zurückgeführt werden, dass das detergenssolubilisierte Klasse I A*0201 tatsächlich eine Mischung von Klasse I-Molekülen ist, oder dass die detergenssolubilisierte Klasse I keine vollständige Mischung von endogen geladenen Peptiden hat. Die Peptide in dem detergenssolubilisierten A*0201 könnten lediglich eine Unterreihe der endogen geladenen Peptide darstellen, wobei die Reinigung des A*0201 von anderen Klasse I in dem Lysat die Peptide verzerren kann.
  • Allerdings ist die hierin beschriebene Methode des Assayierens der Epitop-Bindung lediglich unter Verwendung des A*0201T-Allels geladen mit HBV anwendbar, was darauf zurückzuführen ist, dass ein hochspezifischer Antikörper beteiligt ist, der lediglich diese spezielle Konformation erkennt. Daher ist eine direktere Messung des Epitop-Bindens an sHLA ermittelt worden, mit der die Notwendigkeit zur Isolierung und Erzeugung eines für ein spezielles in der jeweiligen Klasse I-Allel gebundenes Peptid spezifischer Antikörper eliminiert wird. Die Methode der Fluoreszenzpolarisation umfasst das Markieren des Peptids, das von Interesse ist, und wird nachfolgend detailliert beschrieben.
  • Epitop-Bindungsassay unter Anwendung der Fluoreszenzpolarisation (FP)
  • Eines der attraktivsten Merkmale der Bindungsassays ist deren Einfachheit. Die Entwicklung eines Bindungsassays besteht in dem Nachweis, dass die markierte Sonde an dem Molekül bindet, das von Interesse ist. Um den Bindungsassay zu validieren muss jedoch die folgende Reihe von Kriterien eingehalten sein: (1) Das Binden sollte sättigungsfähig sein, indem eine begrenzte Zahl von Bindungsstellen angegeben wird; (2) das Binden sollte über die erforderliche Spezifität verfügen, wo die Bindungsaffinität, definiert als die Dissoziationskonstante (Kd), in Übereinstimmung mit den Werten stehen sollte, die für die physiologischen Moleküle ermittelt wurden; und (3) das Binden des Liganden sollte reversibel sein, womit die dynamische Natur des chemischen Umwandlungsprozesses widergespiegelt wird, und solle ein Gleichgewicht erreichen, wenn die Liganden-Assoziationsgeschwindigkeit gleich der Dissoziationsgeschwindigkeit ist.
  • Obgleich die Ausführung eines routinemäßigen Bindungsassays jedoch trivial erscheint, erfordert die Entwicklung eines solchen Assays viele Stunden des Testens, um die Gültigkeit zu ermitteln. Es können zahlreiche Faktoren die Spezifität des Ligandenbindens beeinflussen. Es können anorganische Ionen die Haftungsstelle eines Liganden beeinflussen, und Faktoren, wie beispielsweise Zeit, Temperatur, pH-Wert und Peptid-Konzentration beeinflussen die kinetischen Eigenschaften und möglicherweise die Spezifität eines Bindungsassays. Andere Überlegungen schließen die Stabilität des Fluoreszenzfarbstoffes in dem Inkubationsmedium ein und noch grundsätzlicher die biologische Aktivität des Peptids.
  • Eines der am häufigsten verwendeten Moleküle zur Erzeugung von Fluoreszenzmarkern, um Antigen, Rezeptoren oder Gruppen mit Affinität für die markierten Moleküle zu erzeugen, ist das Fluorescein. FITC (Fluoresceinisothiocyanat) ist in wässrigen Umgebungen stark fluoreszent und liefert eine hohe Empfindlichkeit unter UV-Licht. Allerdings ist seine Fluoreszenz pH abhängig. Seine grüne Fluoreszenz erscheint in sauren, verschwindet jedoch in neutralen oder basischen Lösungen. Der pKa-Wert von FITC beträgt näherungsweise 6,5 und liefert das beste Fluoreszenzsignal oberhalb von pH 8. FITC hat Molmasse (MW) von 473,4; Anregungs- und Emissionswellenlängen bei 494 nm bzw. 520 nm; und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 72.000 M–1cm–1 in einem wässrigen Puffer, pH 8. Damit hat FITC einen Farbumschlag von einem blauen zu grünen Fluoreszenzprodukt. Die FITC-Fluoreszenz hat die Neigung zu verblassen, wobei dieses Verblassen jedoch durch Verwendung von Mitteln überwunden werden kann, wie beispielsweise n-Propylgallat oder Phenylendiamin um die Färbung zu stabilisieren. Allerdings sind diese Reagenzien gegenüber lebenden Zellen toxisch und können nicht in allen Anwendungen eingesetzt werden. Isothiocyanate reagieren außerdem mit einer Vielzahl von Metallionen unter Erzeugung farbiger Komplexe. Daher sollten in Reaktionsmischungen Metalle, wie beispielsweise Fe3+, Cu1+ und Ag1+ vermieden werden.
  • Fluoreszenz ist gekennzeichnet durch einen Prozess der Absorption von einfallender Strahlung bei einer Wellenlänge, λabs, gefolgt von der Emission von Strahlung bei einer anderen Wellenlänge, λemiss. Dieses Verhalten wurde erstmals beschrieben von G. G. Stokes (1852) in Form des Stokesschen Fluoreszenzgesetzes, was besagt, dass die Fluoreszenz (Emission) stetes bei einer größeren Wellenlänge auftritt als die Wellenlänge der einfallenden Strahlung (Anregung).
  • Dieses Verhalten wurde erfolgreich aufgeklärt von A. Einstein (1905) unter Anwendung der Planckschen Quantenhypothese. Ein Quant eines einfallenden Lichts mit einer Energie von Eexck wird von dem Fluoreszenzmolekül absorbiert und seine Energie um Eexck erhöht. Danach folgt rasch ein Übergang des Moleküls abwärts zu einem Schwingungsniveaus im Grundzustand Eemiss, mit der Emission eines Lichtquants.
  • Dieses Phänomen der Absorption und Fluoreszenz lässt sich in Form eines Energieniveau-Diagramms beschreiben, das die Übergänge zwischen den Schwingungsniveaus des Grundzustandes (s0) und den Schwingungsniveaus des ersten angeregten Zustandes (s1) zeigt.
  • Um die Fluoreszenz und Fluoreszenzpolarisation zu beschreiben, trifft ein einfallender Strahl auf ein Fluoreszenzmolekül (Absorption), wonach das Molekül Fluoreszenzstrahlung emittiert. Die parallelen und vertikalen Intensitäten dieser Fluoreszenz werden dargestellt durch III bzw. II, die als die Komponenten dienen, die im Versuchsaufbau zur Beobachtung der Fluoreszenzpolarisation benutzt werden.
  • Der primäre Parameter, der auf dem Gebiet der Fluoreszenzpolarisation zur Beschreibung der Polarisation der Fluoreszenz benutzt wird, ist der Polarisationsgrad, P. Dieser Parameter ist ein sehr nützlicher Weg, den Polarisationszustand der Fluoreszenz zusammenzufassen.
  • Die Gleichung für den Polarisationsgrad, P, lautet: Polarisation = (III – II)/(III + II)worin II die Intensität der Fluoreszenz ist, die in der senkrechten (I) oder vertikalen (V) Richtung gemessen wird und III die Intensität der Fluoreszenz ist, die in der parallelen (II) oder horizontalen (H) Richtung gemessen wird. Diese Messungen werden unter Verwendung eines in Bezug auf die vertikalen bzw. horizontalen Richtungen gedrehten Polarisators ausgeführt.
  • Unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes zum Markieren eines kleinen Moleküls kann seine Bindung an einem anderen Molekül gleicher oder größerer Größe unter Anwendung der Fluoreszenzpolarisation (FP) beobachtet werden. FP funktioniert nach dem Prinzip, dass kleinere Moleküle schneller rotieren als große Moleküle. Wenn ein Molekül mit einem Fluorophor markiert ist, lässt sich diese Rotation durch Anregung des Fluorophors mit in der Ebene polarisiertem Licht messen und anschließend das emittierte Licht mit Polarisatoren parallel und senkrecht zur Anregungsebene messen, um zu ermitteln, ob es noch in der gleichen Ebene orientiert ist, wie es im angeregten Zustand war. Wenn ein Fluorophor auf einem kleinen Molekül markiert ist, wird es in der Zeit zwischen Anregung und Emission rotieren, und das emittierte Licht wird depolarisiert. Wenn das markierte Molekül an einem großen Molekül gebunden ist (womit seine Gesamtgröße wesentlich zunimmt) wird das Molekül nicht in der Zeit zwischen Anregung und Emission rotieren, und das emittierte Licht wird polarisiert, was zu einer Polarisationsänderung zwischen den freien und gebundenen Formen führt. Der Einfachheit halber sind die Einheiten in der Regel 1.000 mP = P gesetzt.
  • Das theoretische Maximum des mP-Wertes, das erhalten werden kann, beträgt 500 mP. Somit lässt jeder experimentelle Wert, der größer als dieser Wert ist, ein Artefakt innerhalb des Assays vermuten. Der angenommene theoretische mP-Wert für Fluorescein beträgt 27. Wenn ein kleiner freier Tracer an einem großen Molekül gebunden ist, ist eine Zunahme des mP-Wertes zu erwarten. Ein guter FP-Assay hat in der Regel eine mP-Änderung von 100 oder mehr.
  • Eine Reihe von Faktoren kann dazu beitragen, das Maximum des erzielbaren Polarisationswertes zu verringern. Einige Faktoren, die dieses beeinflussen können, sind ein Quenchen des Fluorophors durch die Moleküle selbst, ein Puffer-Quenchen, Adsorption auf Oberflächen, Rotationsspin (der "Propellereffekt") und eine geringe Affinität der Wechselwirkung zwischen den Komponenten.
  • Polarisationsmethoden werden angewendet, um Affinitäten von FITC-markierten Peptidsonden auf gereinigte sHLA-Moleküle zu messen. Gleichgewichtsergebnisse trugen zu der Vorhersage einer Wirkungsdosis (IC50) bei und klärten die starke Korrelation von in vitro-Potenz zu der Form des in dem Assay verwendeten sHLA-Moleküls. Diese Ergebnisse zeigten außerdem, dass Gleichgewichtspolarisationsmessungen nach Optimierung von Assay-Parametern möglich sind. Darüber hinaus sind mit FP kinetische Messungen möglich.
  • Die Vorteile von FP-Messungen schließen ein: homogene Messungen, Gleichgewichtsdaten und Daten der kinetischen Bindung, Plattenleser, verfügbar mit verbesserter Empfindlichkeit und verringertem Mindestvolumen für den Nachweis und Daten der Kompetitoraffinität. FP verwendet ausschließlich eine Markierung und hat ein echtes homogenes Format, d. h. keine feste Phase bei der Herstellung oder Suspension und keine erforderlichen Schritte des Waschens, und es lassen sich schnelle kinetische Daten erhalten. Darüber hinaus ist keine Radioaktivität erforderlich, und die radiometrischen Ablesungen sind gegenüber einem Farb-Quenchen beständig.
  • Die Minimierung des Beitrags von Assay-Komponenten auf nichtspezifische Fluoreszenzpolarisation ist sehr wichtig. Qualitätsfaktoren schließen Reinheit des Tracers (Fluoreszenzpeptid) ein, Reinheit des Binders (sHLA), puffereigene Fluoreszenz und die Fähigkeit von Pufferkomponenten, wie beispielsweise Trägerproteine, zum Binden des Tracers. Einige Materialien von Mikrotiterplatten, wie beispielsweise Polystyrol, können freie Tracer binden, wodurch die Polarisation erhöht wird.
  • Aufgrund der Einfachheit, mit der die Fluoreszenz detektiert werden kann, ist es außerdem von Bedeutung zu wissen, dass es die Verbindung ist, die von Interesse ist, die mit Tracer versehen wird und nicht eine Fluoreszenz-Verunreinigung. Daher stellen die Hersteller Daten über die Spezifität und Reinheit ihrer Produkte zur Verfügung. Tracer sollten > 90% markiert und > 95% rein sein. Ein Versagen bei der Reinigung des freien Fluorophors von Tracer bedeutet einen erhöhten Anteil der Gesamtfluoreszenz, der nicht zur Änderung seiner Polarisation in der Lage ist.
  • Der am häufigsten zum Markieren von Peptiden verwendete Farbstoff ist Fluorescein. Eine fluoreszent markierte Substanz ist biologisch nicht identisch mit der nichtmarkierten Verbindung, und sie darf sich nicht in einer ähnlichen Weise wie das Ausgangsmolekül verhalten.
  • Da große Proteine, Zellmembranen und Zelltrümmer Licht streuen und eine Nettozunahme der Gesamtpolarisation bewirken, sollten Verunreinigungen auf ein Minimum herabgesetzt sein und lediglich ein hoch gereinigter Binder verwendet werden. In einigen Fällen lassen sich die Verunreinigungen zum Teil durch eine entsprechende Hintergrundsubtraktion korrigieren, wobei es jedoch zu bevorzugen ist, den Beitrag zu dem Signal unter Verwendung von gereinigten Molekülen auf ein Minimum herabzusetzen.
  • Sofern während der Inkubation ein Abbau auftritt, kommt eine Mischung von Protease-Hemmern infrage. Oftmals ist ein einfacher Cocktail ausreichend, um das Molekül zu schützen, wie beispielsweise die Verwendung eines Cocktails von Protease-Hemmern (Gibco BRL Cat# 20012-043) aufgelöst in PBS pH 7,4 oder einer Endkonzentration von 1 mM PMSF, 73 mM Pepstatin A und 8 mM EDTA. In dem sHLA-Assay werden hoch gereinigte sHLA-Moleküle verwendet, die auch gegen den Abbau durch Proteasen nicht anfällig sind und damit keinen Zusatz von Protease-Hemmern oder Kalzium-Komplex-bildenden Salzen (EDTA oder EGTA) zu dem Puffersystem benötigen.
  • Außerdem sollte der Puffer-Beitrag zu dem Signal auf ein Minimum herabgesetzt werden. Ein erhöhter Puffer-Fluoreszenzhintergrund ist auf Verunreinigungen zurückzuführen, die bei der Wellenlänge, die von Interesse ist, fluoreszieren. Unter Beachtung der Ausgangsmaterialien, der Reinheit der Misch- und Aufbewahrungsgefäße und der Methoden der Pufferherstellung sollte dieses auf akzeptable Werte reduzieren. Hohe Nulleffektimpulse infolge von Puffer- oder nicht-Fluorophor-Komponenten können die Signal-Rauschverhältnisse eines Assays sowie die eigentliche Empfindlichkeit eines Assays schwerwiegend beeinflussen.
  • Puffer für Proteine schließen oftmals Carrierproteine ein, wie beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA). Albumin kann einige Fluorophore binden, und das Binden von BSA an dem Tracer könnte die Grundlinienpolarisation ungewollt erhöhen, womit der Assay-Bereich erweitert wird. Dieses Problem kann jedoch überwunden werden, indem Carrierproteine vermieden oder schwach bindende Alternativen verwendet werden, wie beispielsweise Rinder-Gammaglobulin (BGG).
  • In jedem Fall ist es nützlich, den Beitrag von Pufferproteinen zu der Nettopolarisation des Tracers zu ermitteln, indem man die Polarisation im Puffer mit und ohne zugegebenes Protein vergleicht. Alternativ lässt sich die Endkonzentration von BSA verringern, um diese Effekte auf ein Minimum herabzusetzen.
  • Schließlich schließen wahrscheinliche Ungenauigkeitsquellen, die die Standardabweichung des Assays erhöhen, das Pipettieren ein, das Instrument, den Puffer, den Tracer und das Protein, von denen jede Komponente zum Gesamtfehler beiträgt.
  • Das entscheidende Merkmal des rekombinanten sHLA-Moleküls ist die Fähigkeit zum Laden des Peptid-bindenden Abschnittes mit einem Peptid, das von Interesse ist. Die aus mit Säure eluierten Peptid-Pool erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Mehrzahl der rekombinanten sHLA-Komplexe um undefinierte "Volumen-Peptide" gefaltet sind, die von der Zelllinie deriviert sind, worin sie erzeugt wurden. Es ist erforderlich, diese endogenen Peptide durch einzelne, wohldefinierte, markierte Standardpeptide zu ersetzen. Endogene sHLA-Moleküle mit endogenem Peptid oder keinem gebundenen Peptid werden wahrscheinlich in der Mehrzahl vorhanden sein, werden jedoch keinerlei Beeinflussung mit dem Ergebnis des Assays zeigen. Das Peptid sollte stark gereinigt sein, da geringe Verunreinigungen in synthetisch dargestellten Peptiden die Peptid-Ladung hemmen können.
  • Es sind mehrere Peptid-Ladeprotokolle beschrieben worden. Eine einfache Methode umfasst das passive Laden von Überschlusspeptid in Lösung mit sHLA. Das passive Laden eignet sich besonders gut im Fall von Peptiden mit hoher Affinität. Bei Peptiden mit geringerer Affinität kann eine Erhöhung des Molverhältnisses von Peptid zu HLA das Laden verbessern. Für jedes Peptid müssen von dem untersuchenden Parameter empirisch ermittelt werden, wie beispielsweise die Dosierung des HLA, das Molverhältnis von Peptid zu HLA und die Peptid-Ladezeit.
  • Damit die MHC-Klasse I-Allele zum Binden von Peptiden in der Lage sind, haben jüngere Versuche der Peptid-Ladung gezeigt, dass β2-Mikroglobulin (β-2-m) vorhanden sein muss. Im Allgemeinen werden MHC-Klasse I-Moleküle passiv über eine Zeitdauer von mehreren Tagen geladen (in einem Bereich von etwa zwei bis etwa fünf Tagen). Das optimale Peptidladen kann von den speziellen MHC-Klasse I-Allelen abhängen. Obgleich passiv geladenen Komplexe in der Regel ausreichend sind, um mit ihnen zu arbeiten, sind sie nicht notwendigerweise optimal geladen. Es sind Parameter und Mindestanforderungen zum Peptidladen an HLA veröffentlich worden. (Khilko SN, et al., Measuring Interactions of MHC dass I molecules using surface plasmon resonance. J Immunol Methods 183(1): 77–94 (1995); Parker KC, et al. Peptide binding to HLA-B27 heavy chain/beta 2-microglobulin complexes requires specific peptides. J Biol Chem. 267(8): 5451–9 (1992); Parker KC, et al., Sequence motifs important for peptide binding to the human MHC class I molecule, HLA-A2. J Immunol. 149(11): 3580–7 (1992).
  • HLA-Komplexe können auch erfolgreich durch eine kurze, alkalische Stripping-Prozedur, gefolgt von einer langsamen Rückfaltung bei neutralem pH-Wert geladen werden. Das Peptid-Stripping kann auch in Gegenwart von überschüssigem β-2-m unter schwach sauren Bedingungen ausgeführt werden.
  • Es gibt drei grundlegende Typen von Bindungsexperimenten: (1) Sättigungsexperimente, bei denen eine Sättigungskurve erzeugt wird, indem entweder die Menge des fluoreszenten Peptids (Tracer) oder sHLA (Binder) konstant gehalten wird oder die Konzentration von sHLA im Fall eines konstanten Tracers oder des markierten Peptids im Fall eines konstanten Binders konstant gehalten wird, um die Affinitätskonstante (Kd) zu bestimmen; (2) Kompetitionsexperimente, worin die Menge einer kompetierenden, nicht markierten Verbindung für den Rezeptor und einschließlich in der Inkubation die einzige Variable ist und die Affinität (Ki) dieses Medikaments bestimmt werden kann; sowie (3) kinetische Experimente, von denen die Geschwindigkeiten vorwärts (Kon) und rückwärts (Koff) des Bindungsprozesses bestimmt werden können, wenn die Menge von sHLA und Peptid konstant gehalten wird und die Zeit variiert wird. Das Verhältnis dieser Konstanten liefert einen unabhängigen Schätzwert für den Kd-Wert.
  • Beschreibung von Sättigungsexperimenten
  • In den Sättigungsassays wurde ein passives Laden von Überschusspeptid in Lösung mit sHLA angewendet. Für das jeweilige Peptid müssen Parameter empirisch ermittelt werden, wie beispielsweise die Dosis von HLA, das Molverhältnis von Peptid zu HLA und die Peptid-Ladezeit. Die MHC-Klasse I-Moleküle werden passiv über eine Zeitdauer von mehreren Tagen (im Bereich von etwa zwei bis etwa fünf Tagen) geladen. Das optimale Peptidladen kann von den speziellen MHC-Klasse I-Allelen abhängen.
  • Titrationsassays zur Bestimmung der optimalen sHLA-Konzentration
  • Der Assay bestimmt die sHLA-Konzentration, die erforderlich ist, um ein ausreichendes Peptid-Binden zu erzielen. Es sollte das spezifische Binden verschiedener Konzentrationen von sHLA (Dosisbereich: 0,1 nM bis 1.000 nM) in Gegenwart einer konstanten Konzentration (5 nM) von fluoreszent-markiertem, synthetischem Peptid getestet werden. Das fixierte fluoreszent-markierte, synthetische Peptid sollte in Vorversuchen bewertet werden unter Einbeziehung biochemischer Gesichtspunkte: die Konzentration des Tracers sollte kleiner sein als der Kd-Wert und kleiner sein als die Konzentration des verfügbaren Binders (sHLA), der ein Peptidbinden erlaubt. Es wird empfohlen, dass der Binder (sHLA) eine höhere Konzentration haben sollte als der Tracer (fluoreszent-markiertes, synthetisches Peptid).
  • Ein Vergleich des freien Tracers mit freiem Fluorophor (indem freies Fluorescein parallel laufen gelassen wird) bestimmt die Eignung der Tracer-Größe. Wenn der Wert für den Tracer-mP deutlich größer ist als der für das vergleichbare Fluorophor, kann es sein, dass der Tracer für die Verwendung in FP nicht optimal ist. Für eine angemessene Nettoänderung der Polarisation muss eine Bewertung mehrerer Tracer vorgenommen werden.
  • Die Aufgabe der Titrazion von Binder (sHLA) mit entsprechenden Kontrollen besteht darin, die optimale Konzentration von Binder und Tracer zu bestimmen. Die akzeptablen Konzentrationsbereiche des Tracers schließen alle Konzentrationen ein, die einen Polarisationswert (in mP) in der Nähe der vorgeschriebenen 27 mP ergibt. Wenn die Integrationszeit 100.000 Mikrosekunden beträgt, sollte die Zählungen pro Sekunde mindestens 100.000 betragen.
  • Die Verwendung entsprechender Kontrollen ermöglicht eine genaue Ermittlung der spezifischen Polarisation. Das Hintergrundsignal ist der Beitrag zu der Messung aus anderen Quellen als der Fluoreszenzmarker. Am leichtesten zeigt sich die Aufnahme einer Messung auf einer Mikrotitermulde, die alle Testkomponenten mit Ausnahme der Fluoreszenzmarkierung enthält. Es können Hintergrundsignale aus dem Kunststoff der Mikrotiterplatte, aus Lösungsverunreinigungen, aus durchgelassenem Licht durch optische Filter oder anderen in dem Instrument erzeugten Quellen entstehen. Sofern der Hintergrund in einem hohen Maß vorhersagbar ist, d. h. von Mikrotitermulde zu Mulde konstant ist, lässt er sich im großen und ganzen durch Subtraktion des Signals von einer Kontrollmulde eliminieren, die keinen Fluoreszenzmarker hat. Das Subtrahieren dieses konstanten Signals wird eine nützliche Information aus Mulden liefern, die Signale erzeugen, die nahe an den Hintergrundpegeln liegen.
  • Spezielle Kontrollgruppen, die in dem Assay eingesetzt werden, schließen ein (1) ausschließlich Puffer, (2) ausschließlich Tracer, (3) ausschließlich Protein und (4) Protein + Tracer. Die Aufgaben der jeweiligen speziellen Kontrollgruppen werden nachfolgend detailliert diskutiert.
  • Die Kontrolle "ausschließlich Puffer" zeigt den Beitrag des Puffers allein zu den S-P-Signalen und speziell dann, wenn störende Moleküle in dem Puffer vorhanden sind. Da der Binder zu dem Nettosignal beitragen kann, eignet sich Binder ohne Tracer als eine geeignete Kontrolle und wird als Hintergrundsubration für "ausschließlich Tracer" verwendet. Bei mehrfachen Konzentrationen von Binder sollte jede die "ausschließlich Puffer"-Kontrolle haben.
  • In der "ausschließlich Tracer"-Kontrolle wurden die S- und P-Werte für freien Tracer Hintergrund-subtrahiert mit den "ausschließlich Puffer"-Kontrollen und für die G-Faktorberechung verwendet. G-Faktoren werden unter Verwendung des angenommenen, theoretischen mP-Wertes (27 für Fluorescein) berechnet. S (parallel) und P (senkrecht) sind die Hintergrund-subtrahierten Intensi tätsmessungen, wenn die Polarisatoren in paralleler oder senkrechter Richtung stehen. G-Faktor = S/P·(1 – 27/1000)/(1 + 27/1000)
  • G sollte ein sehr stabiler Wert sein, der den Beitrag des Messweges zu der beobachteten Gesamtpolarisation korrigiert. Optische Wege und speziell solche mit reflektierenden Komponenten lassen Licht unterschiedlicher Polarisation mit variierenden Wirkungsgraden durch. Instrumentelle Elemente, die diesen Korrekturfaktor beeinflussen, schließen den dichroitischen Spiegel ein, Erregungs- und Emissionsfilter, polarisierende Filter und Dämpfungsglieder. Andere Elemente, die den G-Faktor beeinflussen, schließen die Assayplatte ein und Puffer/Assay-Komponenten.
  • Im Wesentlichen fungiert der G-Faktor als ein skalierender Faktor (Korrekturfaktor) der die relativen Polarisationsmessungen aufnimmt und sie absolut erscheinen lässt (relativ zum bekannten Standard). Der G-Faktor ist im typischen Fall ein Wert im Bereich von 0,8 bis 1,2. Erhält man einen G-Faktor, der von 1 wesentlich verschieden ist, so lässt dieses vermuten, dass die Filter und der dichroitische Spiegel für die Fluoreszenzpolarisation unter Umständen nicht optimiert sind, obgleich wertvolle Ergebnisse erhalten werden können.
  • Sobald ein G-Faktor bestimmt worden ist, kann er in die damit zusammenhängende Methode der Fluoreszenzpolarisation eingegeben werden. Der berechnete mP-Wert aus der "Criterion Host"-Software wird jetzt als "korrigierte" mP-Werte aufgezeichnet. Unter Verwendung des ermittelten G-Faktors wird der mP-Wert für den freien Tracer berechnet. Die mP-Werte werden in der Regel erhalten, indem man die mittleren S- und P-Hintergrundwerte von den einzelnen S- und P-Werten des freien Tracers subtrahiert. Als Kontrolle sollte das freie Fluorophor einen mP-Wert haben, der nahe dem theoretischen Wert liegt und als der kleinste Polarisationswert dient (mPmin). mP = (S – (P·G))/(S + (P·G))·1000
  • Die "ausschließlich Protein"-Kontrolle zeigt den Beitrag der Lichtstreuung durch den speziellen Proteinbinder. Dieser wird als Hintergrundsubtraktion für "Protein + Tracer" verwendet. Da mehrere Konzentrationen von Protein verwendet werden, sollte jeder in Abwesenheit des Tracers getestet werden.
  • Bei "Protein + Tracer" sind die S- und P-Werte mit den "ausschließlich Protein"-Kontrollen Hintergrund-subtrahiert, um für eine vorgegebene Konzentration den maximalen mP-Wert zu bestimmen. Bei Hintergrundsubtraktion werden die mittleren S- und P-"ausschließlich Protein"-Werte berechnet und der entsprechende Mittelwert von den einzelnen S- und P-Werten von Mulden subtrahiert, die "Protein + Tracer" enthalten. Es wird der berechnete G-Faktor verwendet. mP = (S – (P·G))/(S + (P·G))·1000
  • Als eine zusätzliche Kontrolle an dem System ist es ratsam, die Mikrotiterplatte in dem Fluoreszenzintensitäts-Modus erneut lesen zu lassen. Wenn in jeder Mulde die gleiche Tracer-Menge vorhanden ist, sollte es über der Titerplatte in dem Fluoreszenzintensitäts-Modus gleiche Intensitätswerte geben. Das Rücklesen der Platte im Intensitätsmodus ermöglicht die Bewertung des Umfanges des Quenchens. Quencheffekte können die eigentliche Empfindlichkeit eines auf Fluoreszenz-basierenden Assays beeinträchtigen. Der Vergleich der molaren Fluoreszenzintensität des mit Fluorophor-markierten Peptids und des Fluorophors selbst in freier Lösung kann benutzt werden, um den Quenchgrad zu bestimmen, der durch den chemischen Kopplungsprozess selbst hervorgerufen wird. Sofern es kein Quenchen gibt, sollte das Signal für 1 nM fluoresziertes Peptid das gleiche sein wie für das freie Fluorescein. Es ist nicht zu erwarten, dass an einem anderen Molekül gekoppeltes Fluorescein stärker fluoreszent sein würde als freies Fluorescein, sodass damit angezeigt wird, dass der Tracer eine unkorrekte Konzentration zugeordnet haben kann. Die Fluoreszenzpolarisation führt oftmals zu einem Verlust von etwa 10 bis 90% der Fluoreszenzintensität. Diese kann von sich aus die Empfindlichkeit der Fluoreszenzpolarisation gegenüber direkten Intensitätsmessungen verringern.
  • Methode des Epitop-Bindungsassays unter Anwendung der Fluoreszenzpolarisation
  • Die FITC-markierten Peptide werden hergestellt, indem das lyophilisierte Pulver aufgelöst wird in 90% Acetonitril/10% Wasser bis zu einer Endkonzentration von 0,25 mM (diese Messung sollte so genau wie möglich erfolgen). Es kommt darauf an sicherzustellen, dass alles in Lösung geht. Sofern noch ein Niederschlag vorhanden ist, erfolgt eine Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln. Das Röhrchen wird mit Parafin verschlossen und gegen Licht geschützt (einige Peptide werden sich lediglich durch Zugabe von NH4HCO3 bei einer Endkonzentration von 25 mM zur Umwandlung der sauren Umgebung in einen basischeren Zustand auflösen).
  • Die FITC-markierte Peptidlösung wird in 800 μl-Aliquots aufgeteilt und in mit Schraubverschluss abschließbaren Reagenzröhrchen gegeben. Die Aliquots werden sodann über Nacht bei Raumtemperatur lyophilisiert. Jedes Röhrchen sollte zum Schluss 0,2 μM Peptid enthalten. Jedes Röhrchen ist fest verschlossen und Parafilm wurde verwendet, um das Oberteil zu umwickeln. Das Röhrchen wird sodann entsprechend gekennzeichnet und bis zum Gebrauch bei –80°C aufbewahrt.
  • Bei einer ausreichenden Nettopolarisationsänderung werden mehrere FITC-markierte Peptid-Tracer ausgewertet. Für eine optimale Auswertung von FP-Daten müssen 5 unabhängige Reaktionstypen entsprechend der Beschreibung in Tabelle II gemischt werden. Tabelle II
    A Reaktionsgemisch "Protein + Peptid-Tracer" sHLA; β-2-m; pFITC; PBS; (BGG)
    B "ausschließlich Protein"-Kontrolle "ausschließlich Protein" sHLA; β-2-m; PBS; (BGG)
    C "ausschließlich markierte Peptid"-Kontrolle "ausschließlich freier Peptid-Tracer" pFITC; β-2-m; PBS; (BGG)
    D "ausschließlich freie FITC-Tracer"-Kontrolle "ausschließlich freier FITC-Tracer" FITC; β-2-m; PBS; (BGG)
    E "ausschließlich Puffer"-Kontrolle "ausschließlich Puffer" β-2-m; PBS; (BGG)
  • Es wurden mehrfache Konzentrationen von sHLA auf das spezifische Binden in einem Bereich von 0,1 bis 1.000 nM getestet. Eine erste Untersuchung kann verhältnismäßig breite Konzentrationsbereiche sowohl für Tracer als auch Binder einbeziehen, während eine nachfolgende Untersuchung lediglich eine Konzentration an Tracer und eine eng begrenzte Verdünnungsreihe des Binders benutzt.
    HC (A*0201T) 273 aa (31.495)
    N-Glykosylierung - (3.000)
    β-2-m 99 aa
    (11.731)
    Peptid (Nonamer) 9 aa (1.000)
    Komplex 381 aa (47.226)
    47,2 μg/ml 1 μM
    47,2 ng/ml 1 nM
  • Damit die MHC-Klasse I-Allele in der Lage sind, Peptide zu Binden, muss, wie jüngere Experimente des Peptid-Ladens zeigen zusätzliches β2- Mikroglobulin vorhanden sein. Angemessen ist die Zugabe einer Extramenge an β-2-m in einem Verhältnis von β-2-m:sHLA zwischen 0,5 bis etwa 2,0. Erstrebenswert wird ein Verhältnis von β-2-m:sHLA von etwa 1,0 zu Beginn eingesetzt und anschließend nach Erfordernis eingestellt.
    β-2-m 99 aa (11.731)
    11,7 μg/ml 1 μM
    11,7 ng/ml 1 nM
  • Vorgeschlagene Verdünnungen von sHLA und β-2-m sind in Tabelle III angegeben: Tabelle III
    sHLA-Verdünnungen β-2-m-Verdünnungen
    1 50.000 ng/ml 1.060 nM 12.402 ng/ml 1.060 nM
    2 10.000 ng/ml 212 nM 2.480 ng/ml 212 nM
    3 5.000 ng/ml 106 nM 1.240 ng/ml 106 nM
    4 1.000 ng/ml 21,2 nM 248 ng/ml 21,2 nM
    5 500 ng/ml 10,6 nM 124 ng/ml 10,6 nM
    6 250 ng/ml 5,3 nM 62 ng/ml 5,3 nM
    7 125 ng/ml 2,65 nM 31 ng/ml 2,65 nM
    8 62,5 ng/ml 1,32 nM 15,5 ng/ml 1,32 nM
    9 31,25 ng/ml 0,66 nM 7,75 ng/ml 0,66 nM
    10 15,6 ng/ml 0,33 nM 3,88 ng/ml 0,33 nM
    11 7,8 ng/ml 0,16 nM 1,94 ng/ml 0,16 nM
    12 3,9 ng/ml 0,08 nM 0,97 ng/ml 0,08 nM
  • Zur Herstellung von zweifachen Verdünnungen von sHLA + Überschuss-β-2-m, ist ein Gesamtvolumen von 550 μl ausreichend, um 5 unabhängige Messungen für A ("Protein + Peptid-Tracer") und B ("ausschließlich Protein") mit einem Nachfüllvolumen von 50 μl auszuführen. In dem zur Anwendung gelangenden Verdünnungsschema werden bis zu 81,4 μg sHLA und 20,2 μg β-2-m für die (A)- & (B)-Reaktionen verwendet.
  • Als der Puffer wird PBS mit pH 7,4 verwendet. Wahlweise können 0,05% (0,5 mg/ml) Rinder-Gammaglobulin (BGG) als Ergänzung verwendet werden und ein nichtspezifisches Binden von Protein an den Wänden des Röhrchens oder als Carrier-Protein zu vermeiden. Bei Verwendung von BGG ist ein Volumen von 33 ml frischgemischten PBS/0,05% BGG (16,5 mg BGG/33 ml PBS) anzusetzen.
  • Zur Herstellung der zweifachen Verdünnungen werden zwölf "Anithaft"-1,5ml-Reagenzgläser mit den Zahlen 1 bis 12 markiert. In der nachfolgenden Tabelle IV sind die Verdünnungen beschrieben. Nach Zugabe von sHLA/β-2-m wird jedes Röhrchen gründlich gemischt. Ein behutsames Pipettieren ist erforderlich.
  • Das erste Röhrchen (Röhrchen #1) sollte ursprünglich 814 μl Gesamtvolumen mit einer sHLA-Konzentration von 100.000 ng/ml und einer β-2-m-Konzentration von 24.804 ng/ml enthalten. Es werden daher die Mengen an sHLA und β-2-m, die dem Röhrchen #1 zugegeben werden sollen, berechnet und anschließend das Röhrchen bis zu 814 μl gefüllt. Zugabe von μl sHLA = 100 μg/ml Endkonzentration·814 μl Gesamtvolumen[μg/ml Stamm-sHLA] Zugabe von μl b2m = 24,8 μg/ml Endkonzentration·814 μl Gesamtvolumen[μg/ml Stamm-b2m) Tabelle IV
    Röhrchen # Volumen PBS/0,05% Zugabe von BGG Verwendung von Röhrchen # oder Stamm Zugabe von Volumen der sHLA/β-2-m-Probe zweifache Verdünnungen (ng/ml)
    1 siehe oben siehe oben siehe oben 100.000/24.804
    2 1.056 μl Röhrchen 1 264 μl 20.000/4.961
    3 770 μl Röhrchen 2 770 μl 10.000/2.480
    4 880 μl Röhrchen 3 220 μl 2.000/496
    5 550 μl Röhrchen 4 550 μl 1.000/248
    6 550 μl Röhrchen 5 550 μl 500/124
    7 550 μl Röhrchen 6 550 μl 250/62
    8 550 μl Röhrchen 7 550 μl 125/31
    9 550 μl Röhrchen 8 550 μl 62,5/15,5
    10 550 μl Röhrchen 9 550 μl 31,25/7,75
    11 550 μl Röhrchen 10 550 μl 15,6/3,88
    12 550 μl Röhrchen 11 550 μl 7,8/1,94
  • Zur Herstellung von zweifachen Kontrollverdünnungen von überschüssi gen β-2-m ausschließlich ist ein Gesamtvolumen von 800 μl ausreichend, um den Rest der Kontrollen anzusetzen, die für C ("ausschließlich freier Peptid-Tracer"), D ("ausschließlich freier FITC-Tracer") und E ("ausschließlich Puffer") mit einem Nachfüllvolumen von 50 μl erforderlich sind. Bei dem zur Anwendung gelangenden Verdünnungsschema werden etwa 29,4 μg β-2-m für die (C)-, (D)- & (E)-Reaktion verwendet.
  • Zur Herstellung der zweifachen Verdünnungen werden zwölf "anti-haft"-1,5ml-Röhrchen mit den Zahlen 1 bis 12 markiert. Die Verdünnungen sind in Tabelle V beschrieben. Jedes Röhrchen wird gründlich nach Zugabe sHLA/β-2-m gemischt. Es ist ein behutsames Pipettieren erforderlich.
  • Das erste Röhrchen (Röhrchen #1) sollte ursprünglich 1.184 μl Gesamtvolumen mit einer β-2-m-Konzentration von 24.804 ng/ml enthalten. Die Menge an β-2-m, die dem Röhrchen #1 zugegeben werden soll, wird berechnet und das Röhrchen anschließend bis 1.184 μl gefüllt. Zugabe von μl b2m = 24,8 μg/ml Endkonzentration·1.184 μl Gesamtvolumen[mg/ml Stamm-b2m] Tabelle V
    Röhrchen # Volumen PBS/0,05% Zugabe von BGG Verwendung von Röhrchen # oder Stamm Zugabe von Volumen der sHLA/β-2-m-Probe zweifache Verdünnungen (ng/ml)
    1 siehe oben siehe oben siehe oben 24.804
    2 1.536 μl Röhrchen 1 384 μl 4,961
    3 1.120 μl Röhrchen 2 1.120 μl 2,480
    4 1.280 μl Röhrchen 3 320 μl 496
    5 800 μl Röhrchen 4 800 μl 248
    6 800 μl Röhrchen 5 800 μl 124
    7 800 μl Röhrchen 6 800 μl 62
    8 800 μl Röhrchen 7 800 μl 31
    9 800 μl Röhrchen 8 800 μl 15,5
    10 800 μl Röhrchen 9 800 μl 7,75
    11 800 μl Röhrchen 10 800 μl 3,88
    12 800 μl Röhrchen 11 800 μl 1,94
  • Abschließend wird eine Stammlösung von FITC-markiertem Peptid-Tracer (pFITC) hergestellt, indem ein zuvor abgemessenes Röhrchen (0,2 μM verwendet und bei –80°C aufbewahrt wird. Es werden 20 μl DMSO zu 0,2 μM FITC-markiertem Peptid-Pulver zuvor abgemessen in einem Mirkoröhrchen gegeben, um eine Stammkonzentration von 10 mM zu erhalten und mit der Pipette auf und ab gezogen, bis der Tracer vollständig aufgelöst ist. Wahlweise können 20 μM DMF für Peptide verwendet werden, die Methionin (M) enthalten, von denen bekannt ist, dass sie in DMSO leichter oxidieren als in DMF. Zum Schutz gegen Feuchtigkeit lässt man das FITC-markierte Peptid und DMSO vor dem Öffnen bei Raumtemperatur zum Gleichgewicht kommen.
  • Um eine Arbeitsverdünnung von 100 μM zu erhalten, werden 980 μl PBS der ursprünglichen DMSO-Stammlösung zugegeben und sodann die Arbeitskonzentration weiter bis zu einer 1 μM-Lösung (10 μl Arbeitslösung zu 990 μl PBS) verdünnt. Die 100 μM-Arbeitsverdünnung wird in Aliquots geteilt und bei –25°C aufbewahrt. Akzeptable Konzentrationen von FITC-markierten Peptiden in FP-Experimenten liegen im Bereich von 0,75 bis 50 nM. Ein mP-Bereich von freiem FITC-Tracer liegt erwartungsgemäß zwischen 30 bis 50 mP. Die Intensitäten bei paralleler und senkrechter Fluoreszenz für den Konzentrationsbereich von 0,75 bis 50 nM FITC betragen 0,3 bis 30 × 106 "Zählungen pro Sekunde". Die unpolarisierte Fluoreszenzintensität wird um zehnfach über den polarisierten Intensitäten liegen. Ein optimale Ausgangskonzentration des FITC-markierten Peptids würde 5 nM betragen. Zu Beginn sollte mehr als eine Konzentration mit Tracer durchlaufen.
  • Um 20 ml 5 nM pFITC herzustellen, das in (A) ("Protein + Peptid-Tracer") und (C) ("ausschließlich freier Peptid-Tracer") verwendet wird, werden 100 μl des 1 μM pFITC zu 19,9 ml Puffer zugegeben. Freier Peptid-Tracer wird mit freiem Fluorophor verglichen, indem man freies FITC parallel laufen lässt, um die Eignung des Tracers zu ermitteln, sowie als Kontrolle, ob die korrekte Konzentration dem Peptid-Tracer zugeordnet ist. Sofern es kein Quenchen gibt, sollte das Signal für die ausgewählte Konzentration des fluorescenierten Peptids gleich derjenigen der FITC-Kontrolle sein.
  • Es wird eine Stammlösung von FITC angesetzt, indem zuvor abgemessenes FITC (Fluoresceinisothiocyana)-Mikroröhrchen (Pierce # 51004; 6 × 1 mg) verwendet werden. (1 mg/ml sind 2.112 mM). FITC hat ein Molekulargewicht (MW) von 473,4. Es werden 211,2 μl DMSO zu 1 mg FITC-Pulver zuvor abgemessen in ein Mikroröhrchen gegeben, um eine Stammkonzentration von 10 mM zu erhalten. Das FITC-Markierungsreagens wird auf seine ursprüngliche Konzentration verdünnt, indem die Folie durchstoßen wird und 211,2 μl DMSO zugegeben werden und mit der Pipette hoch und runter gezogen werden, bis das FITC vollständig aufgelöst ist. Zum Schutz gegen Feuchtigkeit lässt man das FITC und DMSO bei Raumtemperatur vor dem Öffnen zum Gleichgewicht kommen.
  • Um eine 100 μM-Arbeitslösung zu erhalten, werden 980 μl PBS zu der ursprünglichen DMSO-Stammlösung gegeben. Die Arbeitskonzentration wird weiter bis zu einer 1 μM-Lösung verdünnt (10 μl Arbeitsverdünnung zu 990 μl PBS). Die 100 μM-Arbeitsverdünnung wird zu Aliquots aufgeteilt und bei –25°C aufbewahrt.
  • Um 10 ml 5 nM pFITC herzustellen, das in (D) ("ausschließlich freier FITC-Tracer") verwendet wird, werden 50 μl des 1 μM pFITC zu 9,95 ml Puffer zugegeben.
  • Um die Peptid-Austauschreaktion zu starten, werden 50 μl jeder vorstehend angesetzten Lösung entsprechend dem in 5 gezeigten Schema hergestellt. Es werden 50 μl Puffer (PBS/BGG) in Reihe 1 bis 12 von B & E zugegeben. 50 μl der FITC-Lösung werden in Reihe 1 bis 12 von D zugegeben und 50 μl von pFITC in Reihe 1 bis 12 von A% C zugegeben. Die Reihenverdünnungen der β-2-m-Reihen werden lediglich zu C, D & E zugegeben, beginnend mit 12 endend mit 1. Abschließend werden die Reihenverdünnungen der sHLA/β-2-m-Reihen zu A & B zugegeben und zwar ebenfalls beginnend mit 12 und endend mit 1. Die Verdünnungen werden sodann bei 4°C in Dunkelheit gehalten.
  • Der Meniskus wird kontrolliert, um sicherzustellen, dass sie gleichförmig sind und wird durch leichtes Anschlagen nach Erfordernis egalisiert. Luftbläschen, die in einigen Mulden vorhanden sein können, werden entfernt.
  • Die übliche Inkubationszeit für eine Peptid-Austauschreaktion beträgt etwa 48 Stunden. Um jedoch optimale Bindungszeiten zu bestimmen, sollte der Verlauf des Bindens überwacht werden, indem die Platten mehre Male während der Inkubation gelesen werden. Man startet mit dem ersten Lesen bei t = 0 Stunden.
  • Die Nachweismethode mit Fluoreszenzpolarisation wird mit den folgenden Parametern vorbereitet:
    Lampe: Dauerlicht
    Plattenformat: nach Zweckmäßigkeit für die zu bewertende Platte Umschaltung der Polarisation nach jeder Mulde
    Auswahl der Mulden: Festlegen aller zu lesenden Mulden
    G-Faktor: 1
    Z-Höhe: 1 mm
    Filter: Fluorescein-Erregung und -Emission (man verwende auch das Fluorescein dichroitisch in dem oberen optischen Aufbau)
    Zeitablauf, Dauerlicht:
    Ablesungen pro Mulde: 1
    Integrationszeit: 100.000 μs
    Einheiten der Ausgangsdaten: Zählungen/Sekunde
    Dämpfungsmodus: aus
    Polarisatoren: Erregungspolarisator in der S-Position
    Emissionspolarisator dynamisch
    PMT-Aufbau: SmartRead, Empfindlichkeit 2
    Plattenbewegung: keine
    kinetischer Zeitablauf:
    Verzögerung vor der ersten Ablesung: 0
    Verzögerung zwischen den Ablesungen: 0
    Zahl der Ablesungen: 1
    Platten-Absetzzeit: 25 ms
  • Die Platte wird erneut im Fluoreszenzintensitäts-Modus gelesen, um den Quenchgrad zu bestimmen, der durch den chemischen Kopplungsprozess des sHLA und das Peptid hervorgerufen wird. Ohne Quenchen und bei in jeder in Mulde gleicher vorhandener Tracer-Menge sollten die Intensitätswerte über der Platte gleich sein. Zu beachten ist, dass die Fluoreszenzintensität ein um 10 bis 90% höheres Signal als die Fluoreszenzpolarisation erreicht.
  • Sodann wird eine Nachweismethode der Fluoreszenzintensität mit den folgenden Parametern vorbereitet:
    optisches System: von oben, Dauerlicht
    Plattenformat: nach Zweckmäßigkeit für die zu bewertende Platte ausgewählte Mulden: Angabe aller zu lesenden Mulden
    Z-Höhe: 1 mm
    Filter: Fluorescein-Erregung und -Emission
    (man verwende auch Fluorescein dichroitisch im oberen Teil des optischen Systems)
    Zeitablauf, Dauerlicht:
    Ablesungen pro Mulde: 1
    Integrationszeit: 100.000 μs
    Einheiten der Ausgangsdaten: Zählungen/Sekunde
    Dämpfungsmodus: aus
    Polarisatoren: keine
    PMT-Aufbau: SmartRead, Empfindlichkeit 2
    Plattenbewegung: keine
    kinetischer Zeitablauf:
    Verzögerung vor der ersten Ablesung: 0
    Verzögerung zwischen den Ablesungen: 0
    Zahl der Ablesungen: 1
    Absetzzeit der Platte: 25 ms
  • Nach dem Lesen der Platte wird die Platte mit einem Deckel abgedeckt und mit Parafilm versiegelt. Zum Schutz gegen Licht wird die Platte zusätzlich mit Aluminiumfolie abgedeckt. Sodann wird die Platte bei der zugewiesenen Temperatur bis zur nächsten Lesung inkubiert. Jede Lesung wird wie folgt aufgezeichnet:
    Datum: Zeit: Nr. Inkubationsdauer laufende Inkubationszeit
    t1 0 Stunden 0 Stunden
    t2 Stunden Stunden
    t3 Stunden Stunden
    t4 Stunden Stunden
    t5 Stunden Stunden
    t6 Stunden Stunden
    t7 Stunden Stunden
    t8 Stunden Stunden
    t9 Stunden Stunden
    t10 Stunden Stunden
  • Die Daten wurden unter Verwendung eines Spreadsheet-Programmes, wie beispielsweise das EXCELTM von Microsoft ausgewertet. Die Nettozunahme der Polarisation wurde nach Zugabe von sHLA zu dem Peptid bestimmt.
  • Die Werte für "ausschließlich freies Peptid-Tracer" liefern die Grundlage zur Berechnung des G-Faktors. Die "ausschließlich Tracer" liefert den niedrigsten zu erhaltenden mP-Wert (Minimum der Tracer-Bindung) ohne Verwendung eines G-Faktors zur Korrektur der Werte auf einen theoretisch angenommenen Wert. Die "ausschließlich Puffer"-Kontrolle liefert eine Hintergrundkontrolle, die den Betrag des alleinigen Puffers zu den S- und P-Signalen wiedergibt und speziell dann, wenn in dem Puffer störende Moleküle vorhanden sind. Das Hintergrundsignal ist der Beitrag zu der Messung von anderen Quellen als der Fluoreszenz-Markierung. Am leichtesten ist dieses anhand einer Messung an einer Mulde zu erkennen, die alle Testkomponenten mit Ausnahme der Fluoreszenzmarkierung enthält. Hintergrundsignale können aus dem Kunststoff der Mikrotiterplatte entstehen, aus Lösung von Verunreinigungen, aus durch die optischen Filter durchgelassenes Licht oder anderen Quellen, die in dem Instrument erzeugt werden. Die S- und P-Werte für "ausschließliches freien Peptid-Tracer" und "ausschließlich freier FITC-Tracer" sind Hintergrund-subtrahiert mit "ausschließlich Puffer"-Kontrollen vor der Berechnung von mP und des G-Faktors.
  • Wenn es mehrere Konzentrationen von (nicht markierten) Komponenten gibt, die vorhanden sind (d. h. mehrfache β-2-m-Konzentrationen) sollte es eine Hintergrundmulde für jede Konzentration geben. Experimente mit homogenen Puffersystemen sind Hintergrund-korrigiert, indem die Mittelwerte subtrahiert werden.
  • G-Faktoren werden unter Verwendung des angenommenen, theoretischen mP-Wertes (für Fluorescein 27) berechnet. S (parallel) und P (senkrecht) sind Hintergrund-subtrahierte Intensitätsmessungen, wenn die Polarisatoren in paralleler oder senkrechter Richtung stehen. G-Faktor = S/P·(1 – 27/1000)/(1 + 27/1000)
  • Unter Verwendung des berechneten G-Faktors werden alle Ergebnisse auf den angenommenen, theoretischen mP-Wert von 27 als dem niedrigsten erhaltbaren mP-Wert (Minimum der Tracer-Bindung) eingestellt. Die Verhältnisse von Signal zu Hintergrund werden zur Gewährleistung der Qualität des G-Faktors bestimmt. "ausschließlich freier Peptid-Tracer"/"ausschließlich Puffer"und "ausschließlich freier FITC-Tracer"/"ausschließlich Puffer"
  • Ein repräsentativer Wert für Signal/Hintergrund kann aus dem Parallel(S)-Wert des Signals "ausschließlich freier Peptid-Tracer" zum Hintergrund "ausschließlich Puffer"-Werten berechnet werden. Im Idealfall sollte man auf Signal/Hintergrund-Werte von mindestens zehnfach zielen. Fehler werden normalerweise bei geringer Konzentration groß, da das Hintergrundrauschen die Intensitäten dominiert.
  • Das Rauschen bezieht sich auf die Unbestimmtheit in den Messungen und bestimmt gewöhnlich die eigentliche Empfindlichkeit eines Instruments. Um die Signals-Rauschverhältnisse zu messen, werden die mP-Werte durch die Standardabweichung dividiert, wobei der mP-Wert dem Signal entspricht und die Ungenauigkeit (Standardabweichung) dem "Rauschen" entspricht. Im idealen Fall sollte auf Signal-Rauschwerte von mindestens dreifach der Hintergrund-Standardabweichung gezielt werden.
  • Als eine zusätzliche Kontrolle an dem System ist es ratsam, die Mikrotiterplatte in dem Fluoreszenzintensitäts-Modus erneut zu lesen. Das Nachlesen der Platte im Intensitätsmodus ermöglicht eine Bewertung des Umfan ges des Quenchens. Auswirkungen des Quenchens können die eigentliche Empfindlichkeit eines auf Fluoreszenz-basierenden Assays beeinträchtigen.
  • Der Vergleich der molaren Fluoreszenzintensität des mit Fluorophor markierten Peptids und des Fluorophores in freier Lösung selbst kann zur Bestimmung des Umfanges des Quenchens verwendet werden, das durch den chemischen Kopplungsprozess selbst hervorgerufen wird. Man vergleiche die "ausschließlich freier Peptid-Tracer"-Fluoreszenzintensitäten mit den "ausschließlich freier FITC-Tracer"-Fluoreszenzintensitäten, die erneut im Fluoreszenzintensitäts-Modus gelesen wurden. Sofern es kein Quenchen gibt, sollte das Signal für 1 μM fluoresceiniertes Peptid das gleich sein, wie das des freien Fluoresceins. Es ist nicht zu erwarten, dass Fluorescein, welches an einem anderen Molekül gekoppelt ist, stärker fluoresent als freies Fluorescein, sodass damit angezeigt werden könnte, dass der Tracer eine unkorrekte Konzentration zugeordnet haben kann. Darüber hinaus werden die erhaltenen Ergebnisse der Fluoreszenzintensität durch G-Faktor-Vergleich zwischen "ausschließlich freier Peptid-Tracer" und "ausschließlich freier FITC-Tracer" bestätigt.
  • Die S- und P-Werte "Protein + Peptid-Tracer" bestimmen den höchsten erhältlichen mP-Wert (Maximum der Tracer-Bindung) für eine gewählte Konzentration. Vor der Berechnung des mP-Wertes, wird der Hintergrund mit den "ausschließlich Protein"-Kontrollen subtrahiert und der berechnete G-Faktor verwendet.
  • Die "ausschließlich Protein"-Kontrollen zeigen den Beitrag der Lichtstreuung durch den speziellen Protein-Binder. Da mehrere Konzentrationen von Protein zur Anwendung gelangen werden, sollte jede in Abwesenheit eines Tracers getestet werden. mP = S – (P·G)S + (P·G) ·1000
  • Eine Dosis-Wirkungskurve wird erhalten, indem man die gebundenen Fluoreszenz-Werte (mP) in Abhängigkeit von der Gesamtkonzentration des sHLA-Moleküls auf einer doppellogarithmischen Kurve aufträgt. Dabei sollte es einen Plateau-Effekt gegen mit supraoptimalen Konzentrationen an Binder, die zu keiner weiteren Zunahme des mP-Wertes führen. Unter Anwendung der Dosis-Wirkungsgleichung werden die Datenpunkte dem Dosis-Wirkungsmodel angepasst. Die Reproduzierbarkeit lässt sich zeigen, indem man den Mittelwert von drei unabhängigen Messungen bildet.
  • Im Fall der Verwendung eines irrelevanten Fluoreszenz-markierten MHC-Moleküls sollte kein Binden nachgewiesen werden. In dem Fall der Verwendung eines irrelevanten Fluoreszenz-markierten Peptids sollte kein Binden nachgewiesen werden.
  • Die Ungenauigkeit ist die Standardabweichung des Mittelwerts jeder Gruppe von den mP-Werten. Diese sollte in der Regel kleiner sein als 10 mP. Die Signal-Rauschverhältnisse werden zur Gewährleistung der Qualität der Ergebnisse bestimmt. "Protein + Peptid-Tracer"/"ausschließlich Protein"
  • Ein repräsentativer Wert für Signal/Hintergrund lässt sich aus den Werten von Parallel(S)-Wert des Signals ("Protein + Peptid-Tracer") zu Hintergrund ("ausschließlich Protein") berechnen. Im Idealfall sollte auf Signal/Hintergrundwerte von mindestens zehnfach gezielt werden.
  • Der Assay-Bereich als die Änderung in der Polarisation wird berechnet, indem das mittlere mP von ("ausschließlich freier Peptid-Tracer") von dem mittleren mP des ("Protein + Peptid-Tracer") subtrahiert wird. Im Idealfall sollte die Nettoänderung in der Polarisation größer als 70 mP sein. Das messbare Maximum des Bindens wird als die ("Protein + Peptid-Tracer")-Werte, Hintergrund-subtrahiert mit ("ausschließlich Protein")-Kontrollen (Maximum-sHLA und Tracer-Bindung zulässig, was einen hohen mP-Wert gibt) minus dem "ausschließlich freier Peptid-Tracer" (Minimum der Tracer-Bindung, die einen sehr niedrigen mP-Wert liefert) bestimmt. Die Differenz zwischen diesen zwei Bedingungen ist das Maximum des Delta-mP.
  • Jeder Hintergrund-korrigierte mP-Wert, der erhalten wird, wird auf eine spezielle sHLA-Konzentration normiert, indem durch den maximalen Delta-mP-Wert dividiert wird. Um das prozentuale, maximale Binden zu berechnen, ist mit 100% zu multiplizieren. Die optimale sHLA-Konzentration wird durch Vergleichen der Ergebnisse gewählt, die ihrem besten Signal-Rauschverhältnis und höchsten Polarisationswert entsprechen.
  • Mit den vorgegebenen sHLA-Mengen von Milligramm bis Gramm für die vielen HLA-Allele in der Population ist es möglich, die Fluoreszenz-Epitop-Bindungsassays mit sHLA und Tausenden bis Millionen verschiedener Peptide zu automatisieren. In der Robotik oder anderen Methoden mit hohem Durchsatz werden verschiedene Peptide in die verschiedenen sHLA-Moleküle eingeführt, mit der hierin beschriebenen Zeit und den Temperaturen inkubiert und diejenigen Peptide ermittelt, die an einem vorgegebenen sHLA-Molekül binden, sowie die relative Affinität diese Peptide im Bezug auf ein sHLA-Molekül. Beispielsweise könnten all die überlappenden Peptide in 50 verschiedenen viralen Pathogenen synthetisch dargestellt und auf ihr Binden an 50 verschiedenen sHLA-Molekülen getestet werden. Die resultierenden Daten würden eine Datenbasis solcher viraler Peptide ergeben, die an HLA-Molekülen für eine mögliche Präsentation die im Bezug auf die Immunreaktion binden. Diese Daten wären für die Entdeckung von viralen Vakzinen von Bedeutung. In einem ähnlichen Test werden alle Peptide, die durch Gene codiert werden, von denen bekannt ist, dass sie in Tumorzellen aufwärts reguliert werden, auf ihr Binden an sHLA-Molekülen getestet. Die resultierenden Daten würden Peptide für die mögliche Verwendung in Tumor-Vakzinen angeben. Schließlich könnten alle Humanproteine überlappende Peptide synthetisch dargestellt haben und auf das Binden an sHLA-Molekülen getestet werden. Die resultierenden Daten wären kombiniert mit Gen-Expressionsstudien bei der Bestimmung solcher Epitope nützlich, die bei Autoimmun-Erkrankungen beteiligt sind. Die resultierenden Daten könnten dann zur gezielten Entwicklung von Therapien und Diagnostik verwendet werden.
  • Ergebnisse von Epitop-Bindungsassays unter Anwendung der Fluoreszenzpolarisation
  • Bei den veröffentlichten Methoden für Peptid-Bindungsassays mit Detergens/Lysat-HLA oder bakteriell erzeugtem HLA werden im typischen Fall Peptide und HLA bei Raumtemperatur inkubiert. 6 veranschaulicht, dass ein Inkubieren verschiedener Konzentrationen von sHLA mit einer konstanten Konzentration von Peptid bei Raumtemperatur 10.000 bis 100.000 Picomol erfordert, um ein signifikantes Binden von Fluoreszenz-Peptid zu erhalten, wie es mithilfe der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen wird. Die Grundlinienwerte der FP betragen näherungsweise 20 mP, während das Maximum der FP bei Inkubation bei Raumtemperatur näherungsweise 70 beträgt und eine Differenz von 50 das erforderliche Minimum ist, um zwischen einem positiv und negativ bindenden Peptid zu unterscheiden.
  • Durch einen Vergleich der Inkubation von Peptid und sHLA bei Raumtemperatur, wie 7 gezeigt ist, lässt sich feststellen, dass ein Erhitzen des sHLA auf 54°C für 45 Minuten, gefolgt von einer Inkubation des sHLA mit dem selben Peptid bei 4°C ein sehr viel stärkeres FP-Signal bei den gleichen sHLA-Konzentrationen erzeugt. Die Differenz zwischen Hintergrund und dem stärksten Signal betrug näherungsweise 130 mp. Eine größere Differenz zwischen der Grundlinie und dem Positiven ermöglicht und die Verwendung von weniger sHLA, um eine Signaldifferenz von 50 mp zu erhalten und ermöglicht außerdem, dass der Assay eine größere Differenzierung unter den verschiedenen Bindungsaffinitäten der verschiedenen Peptide gewährt.
  • 8 demonstriert, dass sHLA-Moleküle Fluoreszenz-Peptide in einer spezifischen Form an dem zu testenden sHLA binden. In dieser Figur wurde das sHLA-Molekül A*0201 auf seine Fähigkeit zum Binden von 5 auf A*0201 (+P1 bis +P5) spezifische Peptide und 5 Peptide getestet, die für das HLA-Molekül B*2705 spezifisch sind. Das sHLA A*0201 wurde für 45 Minuten bis 54°C erhitzt und anschließend bei 4°C zu einem Reaktionsgemisch gegeben, das die verschiedenen Peptide enthielt. Die Daten zeigen, dass das sHLA-A*0201 A*0201-Peptide spezifisch bindet, wie mithilfe der FP nachgewiesen wird.
  • 9 demonstriert, dass sHLA-A*0201 bei einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter Peptide spezifisch für A*0201 bindet. Darüber hinaus demonstrieren diese Daten, dass die meisten für A*0201-spezifischen Peptide innerhalb von 24 Stunden in ihrem maximalen Umfang binden. Dieser Assay zeigt, dass Peptide an den sHLA-Molekülen in einer spezifischen Form mit einer FP-Differenz von bis zu 200 mp binden. Wir haben daher Reaktionsbedingungen ermittelt, mit denen die Fähigkeit eines Peptids zum Binden von sHLA-Molekülen schnell nachgewiesen wird. Die große FP-Differenz ermöglicht uns, Peptid-Bindungsaffinitäten verschiedener Peptide für die sHLA-Moleküle zu vergleichen.
  • In den vorangegangenen Figuren der vorliegenden Patentanmeldung haben wir gezeigt, dass A*0201-spezifische Peptid-Liganden an sHLA-A*0201 binden. In 10 haben wir ein Peptid hinzugefügt, welches ebenfalls auf A*0201 spezifisch ist (A2-Peptid (KLGEFYNQMM) (SEQ ID-Nr. 21)). Diese "kalte" Kompetitorpeptid wurde mit dem "heißen" Fluoreszenzpeptid (Peptid P5 mit der Sequenz ALMDKVLK(FITC)V (SEQ ID-Nr. 22)) bei verschiedenen Konzentrationen des kalten Peptid gemischt. Das sHLA, das für 45 Minuten bis zu 54°C erhitzt worden war, wurde der Mischung von Peptiden zugegeben, die sich bei 4°C befanden. Die Mischung wurde sodann bei 4° inkubiert. In 10 ist zu entnehmen, dass zunehmende Konzentration des kalten Peptids das heiße Peptid von einem Binden an sHLA-A*0201 abhalten. Es wird eine umso geringere FP erhalten, je weniger das heiße Peptid bindet. Damit haben wir nachgewiesen, dass auf sHLA-A*0201-spezifische Peptide mit den auf A*0201-spezifischen, markierten Peptiden konkurrieren können. Auf diese Weise konnten wir die vergleichende Affinität der verschiedenen Peptide für A*0201 ermitteln: die geringere Konzentration, die zum Konkurrieren mit dem heißen Peptid benötigt wird, bedeutet, dass der kalte Konkurrent eine höhere Affinität hat.
  • Damit ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Assayieren des Epitop-Bindens an HLA bereitgestellt worden, worin eine methodische Vorgehensweise zum Erzeugen und Verändern von Klasse I- und Klasse II-MHC-Molekülen von gDNA einbezogen ist sowie eine methodische Vorgehensweise zu Anleiten der Auffindung von auf infizierte oder Krebszellen eindeutige Epitope, die den vorstehend ausgeführten Zielstellungen und Vorteilen voll und ganz genügen.

Claims (18)

  1. Verfahren zum Assayieren eines Peptids zum Binden eines einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Moleküls, welches Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen eines zu untersuchenden Peptids; Bereitstellen eines Pools von einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexen, wobei jeder trimolekulare Komplex ein rekombinantes, lösliches MHC-Klasse-I-Allel aufweist, ein beta-2-Mikroglobulin und endogen geladenes Peptid, indem: eine Genom-DNA oder -cDNA erhalten wird, die mindestens ein MHC-Klasse-I-Molekül codiert; Identifizieren eines MHC-Klasse-I-Allels in der Genom-DNA oder -cDNA; PCR-Amplifizieren des MHC-Klasse-I-Allels in einer für den Locus spezifischen Weise, um ein PCR-Produkt zu erzeugen, welches eine abgestumpfte, lösliche Form des einzelnen MHC-Klasse-I-Allels codiert; Klonen des PCR-Produktes in einen Expressionsvektor, wodurch ein Konstrukt erzeugt wird, welches das einzelne, lösliche MHC-Klasse-I-Allel codiert; Transfizieren einer Säugerzelllinie, um eine Säugerzelllinie zu schaffen, die ein Konstrukt exprimiert, welches ein rekombinantes einzelnes, lösliches MHC-Klasse-I-Allel codiert, wobei die Säugerzelllinie in der Lage ist, Proteine auf natürliche Weise in Peptid-Liganden einzuarbeiten, um in Antigen-bindende Vertiefungen von MHC-Klasse-I-Molekülen geladen zu werden; Kultivieren der Säugerzelllinie unter Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten, einzelnen MHC-Klasse-I-Allels aus dem Konstrukt erlauben, wobei diese Bedingungen auch ein endogenes Laden eines Peptid-Liganden in die Antigen-bindende Vertiefung jedes einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Allel in Gegenwart von beta-2-Mikroglobulin ermöglicht, um die einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexe vor der Ausscheidung der einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexe aus der Zelle zu erzeugen; und Isolieren des Pools einzelner, löslicher MHC-Klasse-I-trimolekularer Komplexe, wobei ein solcher Schritt der Isolierung nicht zu einer selektiven Reinigung spezieller MHC-Klasse-I-trimolekularer Komplexe führt, die darin bestimmte Peptide geladen haben derart, dass der Pool einzelner, löslicher MHC-Klasse-I-trimolekularer Komplexe in den darin geladenen Peptiden nicht verzerrt wird; Mischen des zu untersuchenden Peptids mit den einzelnen, löslichen Klasse-I-trimolekularen Komplexen und Identifizieren mindestens eines einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexes, wobei das zu untersuchende Peptid ein endogen geladenes Peptid verdrängt hat und kompetitiv an dem löslichen MHC-Klasse-I-Allel und beta-2-Mikroglobulin gebunden ist, um den trimolekularen Komplex zu bilden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den Schritt des Behandelns des Pools von einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexen unter Bedingungen, die ein Freisetzen der endogenen Peptide vor dem Mischen des zu untersuchenden Peptids mit dem Pool einzelner, löslicher MHC-Klasse-I-trimolekularer Komplexe bewirken.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Behandelns des Pools von einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexen das Erhitzen des Pools einzelner, löslicher MHC-Klasse-I-trimolekularer Komplexe umfasst, um die Freisetzung der endogenen Peptide zu bewirken.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in den Schritten des Bereitstellens des zu untersuchenden Peptids und des Identifizierens von mindestens einem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex, worin das zu untersuchende Peptid ein endogen geladenes Peptid verdrängt hat, das zu untersuchende Peptid markiert ist, um eine Identifikation von mindestens einem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex von dem ungebundenen, zu untersuchenden Peptid zu ermöglichen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das zu untersuchende Peptid markiert ist mit einer radioaktiven Markierung oder mit einer Fluoreszenzmarkierung.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei in dem Schritt des Identifizierens von mindestens einem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex, worin das zu untersuchende Peptid ein endogen geladenes Peptid verdrängt hat, das zu untersuchende Peptid markiert ist mit einer Fluoreszenzmarkierung und der mindestens eine einzelne, lösliche MHC-Klasse-I-trimolekulare Komplex mit Hilfe der Fluoreszenzpolarisation identifiziert wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Konstrukt ferner einen Anhang codiert, das an dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Allel angebracht ist und die Isolierung des Pools von einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexen unterstützt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Anhang ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem HIS-Schwanz und einem FLAG-Schwanz.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem Schritt der Bereitstellung eines zu untersuchenden Peptids das zu untersuchende Peptid identifiziert wird mit Hilfe einer Methoden zum Identifizieren mindestens eines endogen geladenen Peptid-Liganden, der eine infizierte Zelle von einer nichtinfizierten Zelle unterscheidet, welches Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen einer nichtinfizierten Zelllinie, die ein Konstrukt enthält, welches ein einzelnes, lösliches MHC-Klasse-I-Allel codiert, wobei die nichtinfizierte Zelllinie in der Lage ist, auf natürlichem Weg Proteine in Peptid-Liganden einzuarbeiten, die in der Lage sind, in Antigen-bindende Vertiefungen von MHC-Klasse-I-Molekülen geladen zu werden; Infizieren eines Teil der nichtinfizierten Zelllinie mit mindestens einem Mikroorganismus, einem Gen aus einem Mikroorganismus oder einem Tumorgen, wodurch eine infizierte Zelllinie geschaffen wird; Kultivieren der nichtinfizierten Zellinie und der infizierten Zellinie unter Bedingungen, die eine Expression des rekombinanten, einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Allels aus dem Konstrukt ermöglichen, wobei diese Bedingungen ebenfalls ein endogenes Laden eines Peptid-Liganden in die Antigen-bindende Vertiefung jedes rekombinanten, einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Allels in Gegenwart von beta-2-Miktroglobulin ermöglichen, um einzelne, lösliche MHC-Klasse-I-trimolekulare Komplexe vor der Ausscheidung der einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexe aus der Zelle zu erzeugen; Isolieren der ausgeschiedenen, einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexe aus der nichtinfizierten Zelllinie und der infizierten Zelllinie; Abtrennen der endogen geladenen Peptid-Liganden aus den einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexen aus der nichtinfizierten Zelllinie und Abtrennen der endogen geladenen Peptid-Liganden aus den einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexen aus der infizierten Zelllinie; Isolieren der endogen geladenen Peptid-Liganden aus der nichtinfizierten Zelllinie und den endogen geladenen Peptid-Liganden aus der infizierten Zelllinie; Vergleichen der endogen geladenen Peptid-Liganden, die aus der infizierten Zelllinie isoliert wurden, mit den endogen geladenen Peptid-Liganden, die aus der nichtinfizierten Zelllinie isoliert wurden; sowie Identifizieren von mindestens einem endogen geladenen Peptid-Liganden, der auf dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Allel auf der infizierten Zelllinie präsentiert wird, der nichtpräsentiert wird von dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Allel auf der nichtinfizierten Zelllinie.
  10. Verfahren nach Anspruche 9, ferner umfassend den Schritt des Identifizierens eines Quellproteins, aus dem der mindestens eine endogen geladene Peptid-Ligand, der von dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex auf der infizierten Zelllinie präsentiert wird und nicht präsentiert wird durch den einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex auf der nichtinfizierten Zelllinie, erhalten wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in dem Schritt des Identifizierens von mindestens einem endogen geladenen Peptid-Liganden, der von dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex auf der infizierten Zelllinie präsentiert wird, jedoch nicht auf der nichtinfizierten Zelllinie präsentiert wird, der mindestens eine endogen geladene Peptid-Ligand erhalten wird von einem Protein, das codiert wird von mindestens einem der Mikroorganismen, dem Gen von einem Mikroorganismus oder dem Tumorgen, mit dem die Zelllinie infiziert wurde, um die infizierte Zelllinie zu erzeugen.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in dem Schritt des Identifizierens von mindestens einem endogen geladenen Peptid-Liganden, der von dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex auf der infizierten Zelllinie präsentiert wird, der nicht jedoch auf der nichtinfizierten Zelllinie präsentiert wird, der mindestens eine endogen geladene Peptid-Ligand erhalten wird aus einem Protein, das durch die nichtinfizierte Zelllinie codiert wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Protein, das durch die nichtinfizierte Zelllinie codiert wird, von der der mindestens eine endogen geladene Peptid-Ligand erhalten wird, über eine erhöhte Expression in einer Tumorzelllinie verfügt.
  14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in dem Schritt des Infizierens eines Teils der nichtinfizierten Zelllinie der Teil der nichtinfizierten Zelllinie mit HIV infiziert wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem Schritt der Bereitstellung eines zu untersuchenden Peptids das zu untersuchende Peptid mit Hilfe einer Methode zum Identifizieren von mindestens einem endogen geladenen Peptid-Liganden identifiziert wird, der eine infizierte Zelle von einer nichtinfizierten Zelle unterscheidet, welches Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen einer nichtinfizierten Zelllinie, die ein Konstrukt enthält, das ein einzelnes, lösliches MHC-Klasse-I-Allel codiert, wobei die nichtinfizierte Zelllinie in der Lage ist, auf natürliche Weise Proteine in Peptid-Liganden einzuarbeiten, die in Antigen-bindende Vertiefungen von MHC-Klasse-I-Molekülen geladen werden können; Infizieren eines Teils der nichtinfizierten Zelllinie mit mindestens einem Mikroorganismus, einem Gen aus einem Mikroorganismus oder einem Tumorgen, wodurch eine infizierte Zelllinie geschaffen wird; Kultivieren der nichtinfizierten Zelllinie und der infizierten Zelllinie unter Bedingungen, die die Expression des rekombinanten, einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Allels aus dem Konstrukt ermöglichen, wobei diese Bedingungen ebenfalls ein endogenes Laden eines Peptid-Liganden in die Antigen-bindende Vertiefung jedes rekombinanten, einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Molekül-Allels in Gegenwart von beta-2-Mikroglobulin ermöglichen, um einzelne, lösliche MHC-Klasse-I-trimolekulare Komplexe vor der Ausscheidung der einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexe aus der Zelle zu erzeugen; Isolieren der ausgeschiedenen, einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexe aus der nichtinfizierten Zelllinie und der infizierten Zelllinie; Abtrennen der endogen geladenen Peptid-Liganden aus den einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplexen aus der nichtinfizierten Zelllinie und Abtrennen der endogen geladenen Peptid-Liganden von den einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekukaren Komplexen aus der infizierten Zelllinie; Isolieren der endogen geladenen Peptid-Liganden aus der nichtinfizierten Zelllinie und der endogen geladenen Peptid-Liganden aus der infizierten Zelllinie; Vergleichen der endogen geladenen Peptid-Liganden, die aus der nichtinfizierten Zelllinie isoliert wurden, mit den endogen geladenen Peptid-Liganden, die aus der infizierten Zelllinie isoliert wurden; sowie Identifizieren von mindestens einem endogen geladenen Peptid-Liganden, der von dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-Allel auf der nichtinfizierten Zelllinie präsentiert wird, der nicht von dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex auf der infizierten Zelllinie präsentiert wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, ferner umfassend den Schritt des Identifizierens eines Quellproteins, aus dem mindestens ein endogen geladener Peptid-Ligand, der von dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex auf der nichtinfizierten Zelllinie präsentiert wird und nicht von dem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex auf der infizierten Zelllinie präsentiert wird, erhalten wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei in dem Schritt des Infizierens eines Teils der nichtinfizierten Zelllinie der Teil der nichtinfizierten Zelllinie mit HIV infiziert wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem Schritt des Identifizierens von mindestens einem einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex der trimolekulare Komplex identifiziert wird, indem ein Antikörper verwendet wird, welcher den einzelnen, löslichen MHC-Klasse-I-trimolekularen Komplex mit einem darin geladenen Peptid erkennt.
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