DE60026695T2

DE60026695T2 - ISOLIERUNG VON BIOLOGISCHEN MODULATOREN AUS BIBIOTHEKEN MIT BIOLOGISCH VIELFäLTIGEN GENFRAGMENTEN

Info

Publication number: DE60026695T2
Application number: DE60026695T
Authority: DE
Inventors: Michael Paul Mt Claremont WATT; Robert Wayne Nedlands THOMAS
Original assignee: Phylogica Ltd
Current assignee: Phylogica Ltd
Priority date: 1999-05-05
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2020-05-06
Also published as: EP1179059A4; NZ515329A; EP1696038A2; CA2372464C; CA2721199A1; US20050287580A1; US20080139401A1; DE60044514D1; US6994982B1; AU2003302489B8; ATE469979T1; ATE320486T1; AU2003302489B2; EP1696037A2; AU2009251209A1; DE60026695D1; ES2402878T3; CA2372464A1; AU2011200020A1; US20120214709A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des Screenes von Genbibliotheken und insbesondere das Herstellen und Screenen von Bibliotheken natürlicher Domänen, die von Organismen mit bekannten genomischen Sequenzen abgeleitet sind. Weiterhin werden Verfahren zur Steigerung der Vielfältigkeit von solchen biologisch vielfältigen Genfragment Bibliotheken durch Mutagenese Verfahren beschrieben. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Mittel bereit, durch die ein weiter Bereich von Peptid basierten Therapeutika, Prophylaktika und diagnostischen Reagenzien entwickelt werden kann.
Allgemein
In dieser Beschreibung und den folgenden Patentansprüche, außer der Zusammenhang erfordert etwas anderes, wird das Wort "umfassen", oder Variationen, wie "umfasst" oder "umfassend" derart verstanden werden, dass es den Einschluss einer gegebenen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen aber nicht den Ausschluss irgendeiner anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen enthält.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Biologische Interaktion/Aktivitäten, wie Protein:Protein Interaktionen, Antigen:Antikörper Interaktionen, Protein:Nukleinsäure Interaktionen, Protein:Liganden Interaktionen und Nukleinsäure:Nukleinsäure Interaktionen sind in eine große Vielzahl von Vorgängen involviert, die in lebenden Zellen auftreten. Zum Beispiel können der Agonismus und Antagonismus von Rezeptoren durch spezifische Li ganden, Antikörper-Antigen Interaktionen, einschließlich Arzneimitteln, Hormonen, sekundären Botenmolekülen, etc. eine Vielzahl von biologischen Vorgängen, wie unter anderem Genexpression, zelluläre Differenzierung und Wachstum, Enzymaktivität, Metabolitenfluss und Metabolitenverteilung zwischen zellulären Kompartimenten beeinflussen. DNA:Protein und RNA:Protein Interaktionen sind gut bekannt für ihre Wirkungen in der Regulation der Genexpression in sowohl prokaryonten als auch eukaryonten Zellen, zusätzlich dazu sind sie entscheidend für DNA Replikation und im Fall von gewissen Viren, für RNA Replikation. In Fällen, in denen die Vermehrung von Zellen schädlich ist, wie die Replikation eines Pathogens oder einer Krebszelle, sind Mittel, die auf biologische Interaktion/Aktivitäten oder funktionelle Strukturen abzielen, geeignete Kandidaten für die Therapie. Zum Beispiel sind Mittel, welche die Funktion von Membrankanälen blockieren oder cytoplasmatische Membranen auf andere Weise zerstören, attraktive Ziele für antimikrobielle Therapien gegen Pathogene. Weiterhin können Mittel, die mit Antigen spezifischen oder unspezifischen Funktionen des Immunsystems interagieren, immunologische Modulatoren oder Vakzine für Allergie, Autoimmunität, infektiöse Erkrankung, Fruchtbarkeit und Vergiftung bereitstellen. Zum Beispiel können Mittel, welche die Antigenität von mikrobiellen Antigenen, Tumor Antigenen, Allergenen oder Autoantigenen aufweisen, für Vakzine oder Immuntherapie verwendet werden.
Ungewünschte oder ungeeignete Genexpression und/oder zelluläre Differenzierung, zelluläres Wachstum und Metabolismus kann auch, zumindest in den meisten Fällen, der/den biologischen Interaktion/Aktivitäten zugewiesen werden, welche die Bindung und/oder Aktivität von Protein ähnlichen Molekülen, wie unter anderem Transkriptionsfaktoren, Peptidhormonen, Rezeptormolekülen und Enzymen, einschließen. In diesen Fällen sind Therapien vorstellbar, die solche ungeeigneten Interaktionen blockieren und/oder welche die Bildung von ungeeigneten zellulären Strukturen blockieren.
Herstellung von Peptiden durch rekombinante DNA Techniken
Peptide, die einen vielfältigen Bereich von biologischen Funktionen vermitteln oder mit ihnen interferieren, schließen natürliche Peptide und synthetisierte Peptide, die einen Abschnitt oder einen modifizierten Abschnitt eines bekannten Moleküls darstellen, um eine Zielfunktion zu vermitteln, ein. Eine Quelle für solche Peptide sind zufällige Peptid Bibliotheken, die mit zufälligen (oder semizufälligen) Oligonukleotiden, die in Klonierungsstellen eines Plasmid- oder Phagenvektors ligiert sind, konstruiert werden.
Vektoren, die DNA enthalten, die verschiedene Peptide kodiert, werden in Bakterien oder andere Wirte transfiziert oder transformiert und durch Standard Plaque oder Kolonie Reinigungsverfahren kloniert. Klone, die Peptide mit einer gewünschten Aktivität bilden, können durch eine Vielzahl von Screening oder Selektionsverfahren isoliert werden, die im Wesentlichen dieselben sind wie die Screening Verfahren, die verwendet werden, um Polypeptide nachzuweisen, die von cDNA oder cDNA Fragmenten kodiert werden. Diese umfassen die Herstellung von Peptiden als Fusionen mit den Hüllproteinen eines Bakteriophagen oder Fusionen mit bakteriellen Oberflächenproteinen, so dass die Peptide als Tags für Affinitätsreinigungsverfahren verwendet werden können; die Herstellung von Peptiden aus Wirten, die mit einem Phagen infiziert oder mit Plasmiden transformiert wurden, um Arrays von Kolonien oder Plaques zu bilden, die hinsichtlich Liganden Bindungsaktivität oder biologischer Aktivität, wie Inhibieren des Wachstums von Zielbakterien oder das Induzieren der Aktivierung von Genen in Zielbakterien, gescreent werden können; und in positiven Selektionsstrategien, wie den Two Hybrid Klonierungssystemen, in denen das Peptid, das in dem Wirtsorganismus gebildet wurde, an Zielproteine bindet, um Komplexe zu bilden, welche die Expression der Reportergene aktivieren, die in denselben Wirt kloniert sind. Eine der signifikantesten Vorteile von Phagen Display Technologie ist es, dass sie die Herstellung von Bibliotheken mit einer sehr großen Komplexität – d.h. 10¹⁰ bis 10¹¹ einzelne Klone erlaubt.
In gleicher Weise können in "reversen Two Hybrid" oder "gesplitten Two Hybrid" Systemen Bibliotheken mit geeignet exprimierten Peptiden hinsichtlich Blockiermitteln von besonderen Protein/Protein Interaktionen gescreent werden, was wiederum die Expression von gegenselektierbaren Reportergenen, die toxische Produkte kodieren, reduziert.
Modifikation von Peptiden für die Verwendbarkeit und Optimierung
Sobald das aktive Peptid oder ein Liganden bindendes Peptid identifiziert wurde, können sie in einer Vielzahl von Verfahren modifiziert werden, um ihre Verwendbarkeit zu optimieren. Die Modifikation kann umfassen: Alterationen in den Aminosäure Resten, die in das Ziel eingreifen, um ihre Bindungsspezifität und Affinität zu verbessern; Modifikationen, die das Anzeigen des Peptids beeinflussen, einschließlich der Bindungsvalenz und der Einschränkungen bestimmter Konformationen; und Modifikationen, um weitere funktionelle Reste, wie Marker, Toxine und Koaktivatoren, anzuheften.
Synthetische Peptide können andere Reste als die 20 Aminosäuren, die in der Natur vorkommen, einschließen, und/oder sie können durch Mittel wie Oxidation von flankierenden Cystein Resten ringförmig geschlossen werden. Im Fall von Peptiden, die Antikörper Epitope nachahmen, können Träger, welche die T Zell Epitope enthalten, die benötigt werden um Hochaffinitätsimmunantworten zu induzieren, durch genetische Techniken hinzugefügt werden.
Beispiele von Peptiden, die biologische Systeme modulieren
Peptide können als Therapeutika oder Leitmoleküle für das Design von Therapeutika für Erkrankungen einschließlich Infektion, Krebs und metabolischen Störungen ebenso wie für Mittel für Vakzine und Immuntherapie, Transplantation und Diagnostika eingesetzt werden. Die mögliche Verwendbarkeit solcher Peptide wurde durch die folgenden Beispiele gezeigt:
Peptide als antimikrobielle Mittel
Die antimikrobielle Wirkung, die durch natürliche Peptide, die von Fröschen und Insekten gebildet werden und der künstlich synthetisierten kationischen Peptide, wurde gezeigt. Eine große Vielzahl von Antibiotika sind Peptide oder Polypeptide. Die Körnchen von Säuger Neutrophilen bilden Familien von antimikrobiellen Polypeptiden, einschließlich Azurocidin, Cathepsin G und kationische antimikrobielle Peptide (Cationic Antimicrobial Peptides – CAP57 und CAP37). Zusätzlich bilden die Neutrophilen mindestens zwei Familien von antimikrobiellen Peptiden, die Defensine und die Bactenecine. Darüber hinaus sind viele natürliche Antibiotika und Antipilz Arzneimittel aus Peptiden zusammengesetzt. Zum Beispiel bildet die Magainin Familie der antimikrobiellen α-helikalen Peptide, die aus der Haut des afrikanischen Krallenfrosches, Xenopus laevis isoliert werden, tödliche Poren in den Zellmembranen von bestimmten Mikroorganismen. Genauso besitzen manche α-helikale Peptide, die von einer Vielzahl von Insektengattungen stammen, antimikrobielle Aktivität. Kürzlich wurden einige rationale Designansätze verwendet, um neue Peptid Antibiotika zu isolieren. Zum Beispiel verwendeten Tiozzo et al., einen "Sequenzmatrizen" Ansatz, in dem Kandidaten Peptid Sequenzen aus Anordnungen von natürlichen antimikrobiellen Peptiden entwickelt wurden [1]. Die Identifizierung von Virulenz Determinanten in einigen Pathogenen stellen andere attraktive Ziele für eine antimikrobielle Therapie dar. Zum Beispiel haben Balaban und Kollegen [2] kürzlich einen Autoinduktor der Virulenz in Staphylococcus aureus identifiziert, der die Herstellung von bakteriellen Toxinen kontrolliert, die in die Pathogenese involviert sind. Die Toxingene werden durch ein regulatorisches RNA Molekül, RNAIII, induziert, das eine Grenzkonzentration eines endogenen Protein RNAIII aktivierenden Proteins (RAP) induziert [2]. Von Peptid Inhibitoren von RAP kann erwartet werden, dass sie als Virulenz Determinanten wirken. Tatsächlich wird ein natürlich Peptid Inhibitor vom RAP, der als RIP (RNAIII inhibierendes Peptid) bezeichnet wird, von einem nicht pathogenen Stamm von Staphylococcus aureus gebildet, und er scheint das RNAIII Gen zu inhibieren und verringerte Virulenz zu verursachen [2].
Peptid Modulatoren der Wachstumsregulation
Die Fähigkeit von Peptiden, Schlüsselmodulatoren der Wachstumsregulation zu beeinflussen, wurde von Brent und Kollegen gezeigt, die ein Two Hybrid Screening verwendeten, um begrenzte Peptid "Aptamere" aus kombinatorischen Bibliotheken zu identifizieren, die fest an die Cyclin abhängige Kinase 2 binden und deren Funktion inhibieren. Dies zeigt das Potenzial für die Behandlung von Neoplasmen [3].
Peptide können eine ausgezeichnete Spezifität zeigen. Zum Beispiel wurden Peptid Aptamere identifiziert, die zwischen zwei nahe verwandten allelischen Varianten des Ras Proteins unterscheiden können [4]. Darüber hinaus inhibiert ein Peptid Aptamer gegen menschliche Cyclin abhängige Kinase 2 die Kinaseaktivität ausschließlich auf gewissen bestimmten Substraten.
Die Peptid Spezifität wurde auch in vivo gezeigt. In einem kürzlichen Bericht wurde gezeigt, dass die Expression von Aptameren, die Cyclin abhängige Kinasen in transgenen Fliegen erkennen, Entwicklungsabnormalitäten in einer dominant negativen Weise verursacht [5]. Wichtig ist, dass die Spezifität von zwei Aptameren für bestimmte Cdks (wie in Hefe Two Hybrid Assays bestimmt) in dem Drosphila in vivo Assay erhalten blieb. Darüber hinaus unterdrückte die Koexpression der spezifischen Aptamer Ziel Cdk den beobachteten Entwicklungsphänotyp [5]. Dieser Bericht der erfolgreichen gezielten Inhibition eines Enzyms in vivo mit Aptameren etabliert fest die Durchführbarkeit des Prinzips zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien basierend auf interferierenden Peptiden.
Peptid basierte Inhibition: eine aufkommende therapeutische Strategie
In der letzten Zeit wurde viel Aufmerksamkeit auf Peptide als potenzielle therapeutische Mittel gerichtet, weil sie hochspezifisch und einfach synthetisierbar sind. Phagen Display Technologien haben begonnen sich als verwendbar für das Bereitstellen von Leitpeptiden in Arzneimittel Entdeckungsprogrammen zu zeigen.
Der effiziente Transport eines Peptids von außerhalb der Zelle in den Kern einer eukaryonten Zelle kann jetzt durch das Anheften von Sequenzen, wie dem Zielmotiv "Penetratin", das von dem Drosophila Antennapaedia Protein abgeleitet ist, erreicht werden. Kürzlich wurde eine Familie solcher Zielpeptide identifiziert [6]. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die Konjugation von Peptid Sequenzen an das VP22 Protein effizient den Transport des Fusionsproteins zum Kern der Zellen, die benachbart zu den primären Transfektanten liegen, erlaubt [7]. Einige kürzliche Entwicklungen machen es möglich, physikalisch konformationell begrenzte Peptid Domänen auszuwählen, um Peptide zu identifizieren, die mit sehr hoher Affinität in vivo binden, was eine hohe Wirksamkeit begünstigt. Es wurde berichtet, dass Imitatorpeptide Protein Interaktionen und/oder Enzymfunktion inhibieren. Die Beispiele schließen ein Nonapeptid ein, das von der Ribonukleotid Reduktase von Herpes simplex Virus abgeleitet war, das mit einer Enterotoxin Untereinheit zum Transport in Zellen über seinen Rezeptor verbunden war. Es wurde gefunden, dass das Peptid Konjugat Herpes simplex Typ 1 Replikation in ruhenden Vero Zellen inhibiert [8]. Unter Verwendung des detaillierten Wissens der PCNA Interaktionsdomäne von p21^WAF1, das aus Two Hybrid Screens stammte, wurde ein Peptid entwickelt, das wirksam die Interaktion blockierte. Dieses 20-mer band mit ausreichender Affinität, um die SV40 Replikation zu blockieren. Es wurde gefunden, dass eine 20-mer Peptid Sequenz, die von p16 abgeleitet ist, mit Cdk4 und Cdk6 interagiert und die pRB Phosphorylierung und Zellzyklus Progression inhibiert [9]. Die Autoren koppelten das spezifische Inhibitorpeptid an das Penetratin Peptid mit 16 Resten zum effizienten Kerntransport. Von Peptiden wurde sogar gezeigt, dass sie als Inhibitoren in Tiermodellen wirken. Zum Beispiel wurde von einem Tetrapeptid, welches das Substrat der Farnesyl Protein Transferase nachahmt, gezeigt, dass es das Wachstum von Ras abhängigen Tumoren in Nacktmäusen blockiert.
Peptidimitatoren
Peptide, die funktionell den Epitopen gleichen (Mimotope), gebunden von Antikörper, wurden isoliert und als experimentelle Vakzine verwendet, um Antikörper zu induzieren, die gegen Infektion schützen, wie für Hepatitis B, das respiratorische Syncytial Virus, japanische Encephalitis und Streptococcus Lungenentzündung gezeigt wurde. Hochaffinitätsantikörper binden typischerweise komplexe Strukturen, die durch die tertiäre Konformation eines Antigens gebildet werden. Die Peptid Mimotope wandeln im Wesentlichen ein konformationelles Epitop, das von einem vollständigen Protein gebildet wird, in ein kleines Peptid um. Dies besitzt Vorteile, wenn nur gewisse Epitope gewünscht sind, z.B. um die Immunpathologie in RSV Infektion zu verhindern; oder in der Herstellung von rekombinanten Epitopen, wo das vollständige Polypeptid schwierig zu falten sein kann; oder wo das gesamte Antigen ungewünschte biologische Eigenschaften besitzt (Staphylococcus Toxine im toxischen Schocksyndrom). Im Fall von Kohlenhydrat Antigenen können Polypeptide, die das Mimotop enthalten, hergestellt werden, um ein T-Zell unabhängiges Antigen in ein T-Zell abhängiges Antigen für die Herstellung von Hochaffinitätsantikörpern und Immunogenität in jungen Tieren, einschließlich den Menschen, herzustellen. Im Gegensatz zu den Kohlehydraten können Peptid Mimotope als DNA Vakzine hergestellt werden.
Die Möglichkeit der Verwendung von Mimotopen als Antigene für Krebs Immuntherapie wurde für ein Adenokarzinom Antigen gezeigt.
Mimotope können als Antigene verwendet werden, um infektiöse Erkrankung durch den Nachweis eines Antikörpers zu diagnostizieren. Diese Möglichkeit wurde mit der Hepatitis C Infektion gezeigt.
Mimotope, welche die Antigene repräsentieren, die durch Autoantikörper gegen β Inselgewebe in Diabetes erkannt werden, wurden gezeigt, und es wurde vorgeschlagen, dass sie verwendet werden könnten, um die Entwicklung der Erkrankung zu überwachen [10]. Ähnliche Mimotope wurden für Pollenallergene gefunden, die in der Diagnose von allergischer Erkrankung verwendet werden könnten. In diesen beiden Fällen ist es auch möglich, dass die Mimotope zur Therapie durch Modulieren der Immunantwort oder in der Prophylaxe verwendet werden könnten.
Mimotope, die Transplantationsantigene repräsentieren, wurden gezeigt und können somit als Tolerogene oder Blocker verwendet werden, um die Transplantat Abstoßung zu verhindern.
Liganden Interaktionen und Hormon Rezeptor Interaktionen
Peptidimitatoren wurden als Liganden verwendet um biologisch verwendbare Moleküle über Affinität zu reinigen, wie für die Reinigung des Blutgerinnungsproteins, des von Willebrand Faktors gezeigt ist.
Die Modifikation von Enzymaktivität mit Peptid nachahmenden Substanzen wurde ebenfalls gezeigt. Peptidimitatoren können als Hormone verwendet werden, wie für Erythropoietin gezeigt wurde, und sie können modifiziert werden, um die biologische Aktivität zu steigern.
Rekombinante Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver Peptide
Die Verwendung von Fragmenten von spezifischen Genen oder cDNA, um Peptide mit einer biologischen Aktivität des Polypeptids, welches durch das Gen oder einen Inhibitor der Aktivität kodiert wird, kann manchmal erfolgreich sein. In anderen Fällen kann die Aktivität von der Konformation des vollständigen Polypeptids abhängen und kann nicht durch diese Techniken erhalten werden. In vielen Fällen war die Verwendung von zufälligen Peptid Bibliotheken in Phagen oder Plasmiden, um ein Peptid herzustellen, das die biologische Aktivität nachahmt, erfolgreich. Dies schließt das Screenen einer großen Vielzahl von Klonen ein, was einen im Wesentlichen zufälligen Array von Peptiden für ein Peptid der gewünschten Aktivität bildet. Die Aktivität wird manchmal durch ein Peptid vermittelt, das eine Aminosäuresequenz Homologie zeigt, was seine biologische Aktivität erklären könnte, während das Peptid in vielen Fällen als ein Imitator für die Konformation des Polypeptids oder seines Liganden wirkt und keine Sequenzhomologie aufweist. Tatsächlich kann das Peptid ein Imitator eines chemisch verschiedenen Moleküls, wie eines Kohlenhydrats, sein. Es ist auch möglich, den Ansatz der kombi natorischen Bibliothek zu verwenden, um nach Inhibitoren oder Mediatoren von komplexen Funktionen zu screenen, wofür keine Information über die molekularen Interaktionen benötigt wird.
Die Fähigkeit, aktive Peptide aus zufälligen Fragmentbibliotheken zu isolieren kann jedoch hoch variabel sein, und es wurde über Probleme mit Interaktionen mit niedriger Affinität berichtet, insbesondere für Peptide, die benötigt werden, um komplexe Konformationen, wie diskontinuierliche Epitope, die von vielen Antikörpern gebunden werden, zu repräsentieren. Es besteht eine nicht Vorhersagbarkeit dahingehend, dass Bibliotheken die eine reiche Quelle von Peptiden für einen Liganden sind, keine Peptide für andere enthalten können. Während die Fähigkeit, gewünschte Peptide zu erhalten, mit Bibliotheken, die größere zufällige Peptide und mehrere zufällige Peptide enthalten, gesteigert sein sollte, gibt es praktische Schwierigkeiten beim Durchführen von High Throughput Screening oder Affinitätsreinigung, insbesondere seit gezeigt wurde, dass Affinitätsreinigung mit hoher Dichte ineffizient ist. Es besteht auch eine Unsicherheit über den Grad bis zu dem Peptide, die aus den zufälligen Peptid Bibliotheken isoliert wurden, ihre Bindung oder biologische Aktivität beibehalten, wenn sie als Teil von unterschiedlichen Transportstrategien, wie Fusionen mit verschiedenen Polypeptiden, hergestellt werden. Es besteht deshalb eine Möglichkeit, die bestehende Technologie mit neuen Strategien zu ergänzen oder zu verbessern.
Biodiverse Peptid Domänen Bibliotheken von definierten genomischen Quellen
Peptide stellen potenzielle therapeutische und prophylaktische Mittel für menschliche und tierische Erkrankungen, biochemische Störungen und Arzneimittel Nebenwirkungen dar, weil sie mit anderen Molekülen mit hoher Spezifität und Affinität interagieren können. Ein Hauptproblem, das im Gebiet von Peptid Therapeutika und Prophylaktika überwunden werden muss, ist jedoch die Identifizierung von spezifischen Aminosäuresequenzen, die eine gewünschte Antagonist oder Agonist Aktivität gegenüber einer bestimmten biologischen Aktivität in einer bestimmten zellulären Umgebung aufweisen. Solche Arzneimittel aus Kandidaten Peptiden, können besonders schwer aus wirklich zufälligen Peptid Bibliotheken zu isolieren sein, die keine Anreicherung für Sequenzen aufweisen, die molekulare Formen kodieren, die für die Bindung von biologischen Strukturen geeignet sind. Im Gegensatz dazu hat die Natur bereits eine reiche Quelle von solchen Domänen innerhalb einer unzähligen Zahl von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen zusammengebaut, die durch die vielschichtige Auswahl von Genomen kodiert werden, welche die Biosphäre bilden.
Eine große Auswahl von unterschiedlichen Verfahren wurde vorgeschlagen, um das Screenen von biologischen Bibliotheken (wie cDNA Bibliotheken) in einer beschleunigten Weise zu erlauben, um geeignete Peptid oder Polypeptid Moleküle zu identifizieren. Bibliotheken von Tausenden und in einigen Fällen sogar Millionen von Polypeptiden oder Peptiden wurden durch Genexpressionssysteme hergesellt und auf chemischen Trägern oder in biologischen Systemen, die für das Untersuchen biologischer Aktivität geeignet sind, dargestellt. Im Allgemeinen werden solche Bibliotheken entweder von individuellen Genomen von Organismen hergestellt, von denen angenommen wird, dass sie reiche Quellen von neuen Arzneimitteln sein können (wie "extremophile" bakterielle Spezies) oder aus einer Mischung von nicht charakterisierten Genomen, die direkt aus der Umgebung isoliert werden.
Während sich das Screenen von biodiversen Bibliotheken als wertvoll erwiesen hat, neigen solche Bibliotheken dazu, in Richtung der Frequenz, mit der ein bestimmter Organismus in der natürlichen Umgebung gefunden wird, verschoben zu sein, und sie müssen nicht notwendigerweise die tatsächliche Population der Biodiversität repräsentieren, die in einer bestimmten biologischen Probe gefunden wird. Darüber hinaus beabsichtigen solche Screens normalerweise, dass Gene isoliert werden, die für Enzyme kodieren, deshalb werden häufig Versuche unternommen, solche Bibliotheken dahingehend zu verschieben, dass sie größere Inserts enthalten, von denen angenommen werden kann, dass sie biologisch aktive Enzyme kodieren.
In dem US Patent 5,763,239 im Namen von Short et al., wird ein Verfahren zur Normalisierung genomischer DNA Bibliotheken aus einer Umweltprobe in einem Ansatz beschrieben, um dieses Problem der Verschiebung anzugehen. Weil die Bibliotheken, die in diesem Patent erwähnt werden, aus Umweltproben hergestellt werden, von denen wenig über die genomische Konstitution der Bibliothek bekannt ist, schließt das Verfahren komplizierte Normalisierungsverfahren ein, um die genomische Konstitution der Bibliotheken zu normalisieren. Während das Verfahren einige Normalisierung der Genome in einer Umweltprobe erlaubt, sind die Verfahren, die es beschreibt, kompliziert, es besteht ein Risiko, dass seltene genomische DNAs verloren gehen, wenn die Verfahren angewendet werden und/oder das neue Verschiebungen durch das Verfahren eingeführt werden.
Zusätzlich zu dem oben gesagten beruhen gegenwärtige Screening Verfahren häufig auf der Isolierung von genomischen Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von PCR Amplifikationsverfahren, für die wenig über die genomischen Sequenzen bekannt sein kann. In solchen Fällen können Verschiebungen durch Faktoren wie die Anwesenheit von disproportionaler Repräsentierung von wiederholten Sequenzen in bestimmte Genome eingeführt werden. Weil darüber hinaus keine Information über die genomische Konstitution der Umweltprobe bekannt ist, können nur begrenzte bioinformatische Daten von einem Screen der Bibliothek abgeleitet werden. Dieses Problem wird in gewissem Ausmaß in dem US Patent 5,763,239 angegangen, das darauf abzielt, die Wahrscheinlichkeit zu steigern, dass eine genomische Sequenz mit einer niedrigen Kopienzahl in einer Umweltprobe eine Chance haben wird, in einer Bibliothek repräsentiert zu werden.
Es gibt jedoch gegenwärtig keine zur Verfügung stehenden Verfahren zum Screenen normalisierter biodiverser Peptid Domänen Bibliotheken in vivo, in denen die gesamte Zusammensetzung und Komplexität der Bibliothek akkurat geschätzt werden kann und in denen der Screening Vorgang solche umfangreichen bioinformatischen Daten, die für rationales Arzneimittel Design nützlich sind, bereitstellt. Darüber hinaus wurden keine Verfahren beschrieben, die spezifisch für die Konstruktion von natürlichen genomischen Sequenz Bibliotheken ausgestaltet sind, die für die Expression von Domänen per se optimiert wurden, im Gegensatz zu gesamten Polypeptiden. Folglich besteht ein Bedarf für die Entwicklung von Technologien, die das Screenen von Peptid Bibliotheken in großem Maßstab erlauben, die hinsichtlich Sequenzen angereichert sind, die für bioaktive Domänen kodieren, die in der Bestimmung von nützlichen Peptid Therapeutika verwendbar sind, deren Basis nicht notwendigerweise mit der natürlichen Rolle von bestimmten Peptid Domänen verbunden ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Proteine mit verschiedenen Funktionen zeigen Anzeichen, dass sie sich durch den Austausch (Shuffling) von Domänen (z.B. Nervenwachstumsfaktor und Lipoprotein Rezeptoren mit niedriger Dichte) oder durch kleine Modifikationen von verschiedenen Resten innerhalb konservierter Domänen (Serinproteasen) entwickeln. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, diese Entwicklung nachzuahmen, indem Peptid Bibliotheken, die durch bekannte und definierte Nukleotidsequenzfragmente kodiert werden, die eine reiche Quelle von Peptiden sind, die Aminosäuresequenzen enthalten, die sich für verschiedene molekulare Interaktionen entwickelt haben, die nicht notwendigerweise nahe mit der Funktion verwandt sind, die sie innerhalb des Donor Organismus ausführen, verwendet werden. Ebenfalls beschrieben werden Mittel zum weiteren Ausweiten der Diversität von biodiversen Genfragment Bibliotheken durch Mutagenese – entweder in vitro unter Verwendung von PCR Amplifikation unter mutagenen Bedingungen oder in vivo durch Replikation der Bibliothek in "Mutator" bakteriellen Stämmen, die Mutationen in Genen enthalten, die in die Fehlpaarungsreparatur von DNA involviert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen einer Genomfragment Expressionsbibliothek bereit, umfassend die Schritte:

(i) Herstellen einer Genfragment Expressionsbibliothek, die eine Vielzahl von verschiedenen Nukleotidsequenzen von verschiedenen Organismen expri miert, wobei die Bibliothek aus bestimmten Nukleotidsequenzfragmenten aus einem sequenzierten Genom eines Mikroorganismus und/oder einem kompakten Genom einer eukaryoten Spezies hergestellt wird; und
(ii) Untersuchen der Genfragment Expressionsbibliothek, um ein Peptid zu identifizieren, das eine biologische Aktivität aufweist, wobei die biologische Aktivität dadurch gekennzeichnet ist, dass sie von irgendeiner Aktivität, die das Peptid in seiner natürlichen Umgebung aufweist, verschieden ist.

Das Verfahren kann verwendet werden, um einen Modulator oder Mediator einer biologischen Aktivität zu identifizieren, wobei die Aktivität Antigenität und/oder Immunogenität einschließt. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

(i) Herstellen einer Genfragment Expressionsbibliothek, die von definierten Nukleotidsequenzfragmenten abgeleitet ist; und
(ii) Untersuchen der Expressionsbibliothek nach mindestens einer Aminosäuresequenz, die aus Schritt (i) stammt, hinsichtlich einer biologischen Aktivität, wobei diese Aktivität von irgendeiner Aktivität, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung haben kann, verschieden ist.

Es wird verstanden, dass die vorliegende Erfindung eine weitreichende Verwendung zum Identifizieren von Aminosäuresequenzen aufweist, die eine neue Aktivität im Vergleich zu jener, für die sie in ihrer normalen natürlichen Umgebung bekannt sein mögen, haben. Zum Beispiel ist die vorliegende Erfindung insbesondere zum Screenen von Genomfragment Expressionsbibliotheken nach Aminosäuresequenzen verwendbar, die mit bestimmten Antikörpern reagieren, durch zum Beispiel Affinitätschromatographie oder eine Phagen Display Bibliothek. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zum Definieren von Aminosäuren bereit, die essentiell für das Modulieren einer biologischen Aktivität sind, wie zum Beispiel Antikörperbindung. Sie stellt auch ein Mittel zum Isolieren von Aminosäuresequenz Modulatoren oder Mediatoren einer biologischen Aktivität bereit, wel che die Fähigkeit besitzen, unabhängig von den künstlichen Zwängen eines Screening Systems, durch welches sie identifiziert wurden (z.B. Genfusionen etc.), zu funktionieren.
Insbesondere ist die vorliegende Erfindung besonders nützlich zum Identifizieren von neuen Therapeutika, wie Vakzinen oder immuntherapeutischen Antigenen, Antibiotika oder inhibitorischen Agenzien, die als Kandidaten Agonisten und Antagonisten irgendeiner biologischen Aktivität dienen können. Zum Beispiel können biodiverse Genfragment Bibliotheken verwendet werden, um Antigene herzustellen, die für Vakzine oder für Immuntherapie von allergischer Erkrankung oder Autoimmunerkrankung verwendet werden können. Im Fall der Allergen Immuntherapie ist es besonders wünschenswert, ein Peptid mit hoher Affinität zu erhalten (was selten in zufälligen Peptid Bibliotheken ist), weil es als ein monovalentes Antigen verwendet werden kann, um die Kreuzvernetzung von IgE auf Mastzellen zu verhindern.
Dieses System kann auch im High Through-Put Screening nach Agenzien verwendet werden, die auf spezifische Protein:DNA, Peptid:DNA oder Peptid:Protein; Protein:Protein Interaktionen oder eine Struktur, wie die Zellwand oder einen Membran Transport Bestandteil, abzielen.
Ein deutlicher Vorteil der hier beschriebenen Technologie ist es, dass durch die Tatsache der größeren Kontrolle über die Zusammensetzung einer Aminosäuresequenz Expressionsbibliothek durch die Kenntnis ihres definierten Aufbaus, man den phylogenetischen Abstand zwischen den einzelnen Genomen der Bibliothek absichtlich maximieren kann, um einen maximalen Grad an Diversität sicherzustellen, der grundsätzlich mit der Sequenzdiversität von Genomproben, die aus der Umwelt stammen, konkurrieren könnte, ungeachtet der Tatsache, dass solche Proben mehr Spezies Diversität per se enthalten können. Dieser Ansatz wird immer leistungsstärker werden, je weiter die Auswahl der zur Verfügung stehenden Nukleotidsequenzen ansteigt.
Das Verfahren kann verwendet werden, um einen Modulator oder Mediator einer biologischen Aktivität zu identifizieren, wobei die Aktivität Antigenität und/oder Immunogenität einschließt. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

(i) Herstellen einer Genfragment Expressionsbibliothek, die von definierten Nukleotidsequenzfragmenten abgeleitet ist, wobei die Nukleotidsequenz mindestens eine Sequenz von Aminosäuren kodiert;
(ii) Untersuchen der Expressionsbibliothek nach mindestens einer Aminosäuresequenz, die aus Schritt (i) stammt, hinsichtlich einer biologischen Aktivität, wobei die Bibliothek angepasst ist, um eine Auswahl von Aminosäuresequenzen zu zeigen, von denen jede um mindestens eine Aminosäure variieren kann; und
(iii) Identifizieren jener Aminosäuren, die essentiell für das Modulieren der biologischen Aktivität sind, wobei die Aktivität von der Aktivität mit der die Sequenz normalerweise nicht in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert ist, verschieden ist.

Eine Sequenz von Aminosäuren, die besonders wirksam im Modulieren oder Vermitteln einer biologischen Aktivität (z.B. Antigenität oder Immungenität) ist, kann durch Vergleichen der beobachteten Aktivität aus einer Reihe von verschiedenen Aminosäuresequenzen eines ähnlichen Aufbaus ausgewählt werden. Unter Verwendung der Unterschiede in der beobachteten Aktivität ist es möglich, jene Aminosäuren zu identifizieren, die für die Aktivität essentiell sind, und jene, die entweder aufgrund einer Aktivität gewünscht sind oder im umgekehrten Fall, jene, die ein Hindernis beim Erreichen der wirksamen Aktivität darstellen.
Das Verfahren kann eingesetzt werden, um neue antibakterielle Peptide zu identifizieren, die konditionell aus einem Fusionsprotein freigesetzt werden. Dieses Verfahren des Identifizierens eines antibakteriellen Peptids umfasst:

(i) Transformieren oder Transfizieren einer ersten bakteriellen Population von Zellen mit einer Peptid Expressionsbibliothek, die von definierten Nukleotidsequenzfragmenten abgeleitet ist;
(ii) Anziehen der ersten bakteriellen Population für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit die Expression der Aminosäuresequenzen, die von der Bibliothek kodiert werden, stattfindet und dass die Aminosäuresequenzen von ihren verwandten Fusionen freigesetzt werden;
(iii) in Kontakt bringen der exprimierten Aminosäuresequenzen mit pathogenen Bakterien;
(iv) Identifizieren jener Sequenz(en), die in der Lage ist/sind, das Wachstum der pathogenen Bakterien zu inhibieren, oder die pathogenen Bakterien zu töten; und
(v) Auswählen jener Sequenzen aus dem Identifizierungsschritt in Schritt (iv), die nicht mit der Inhibierung des Wachstums der pathogenen Bakterien oder dem Töten der pathogenen Bakterien in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert sind.

Ein Verfahren zum Identifizieren eines Modifikators einer biologischen Aktivität, die mit einer Wirtszelle assoziiert ist, umfasst die Schritte:

(i) Exprimieren eines Reportermoleküls funktionell unter der Kontrolle der biologischen Aktivität in der Zelle, wobei mindestens ein Molekül, das mit der biologischen Aktivität assoziiert ist, eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die funktionell in Verbindung mit einem Promotor angeordnet ist;
(ii) Inkubieren mindestens einer Zelle aus Schritt (i) in der Anwesenheit ein (einer) Aminosäuresequenz(en) aus einer Genfragment Expressionsbibliothek, die von einer definierten genomischen Sequenz abgeleitet ist, unter Bedingungen, welche die Wechselwirkung zwischen der/den Aminosäuresequenz(en) und einem Nukleotid oder einer Aminosäuresequenz, das/die in die biologische Aktivität involviert ist, fördern; und
(iii) Identifizieren mindestens einer Aminosäuresequenz, die in der Anwesenheit der Zellen in der Lage ist, die Expression des Reportermoleküls, oder der biologischen Aktivität, zu modifizieren; und
(iv) Selektieren jener Sequenzen aus Schritt (iii), von denen nicht allgemein bekannt ist, dass sie in der Lage sind, die Expression des Reportermoleküls, oder der biologischen Aktivität, in ihrer natürlichen Umgebung zu modifizieren.

Vorzugsweise wird dieses Verfahren so oft wiederholt, wie es notwendig ist, um sicherzustellen, dass im Wesentlichen alle der Aminosäuren, die von der definierten Nukleotidsequenz kodiert werden, in der biologischen Aktivität repräsentiert sind.
Ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonists einer biologischen Aktivität umfasst die Schritte:

(i) Anordnen der Expression eines Reportermoleküls funktionell unter die Kontrolle einer biologischen Aktivität in einer Zelle, wobei mindestens ein Partner der biologischen Aktivität eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die funktionell in Verbindung mit einem bakteriell exprimierbaren Promotor in einem geeigneten Vektor angeordnet ist, wobei (a) die Nukleotidsequenz von einer Nukleotidsequenz mit bekanntem und sequenziertem Ursprung abgeleitet ist und (b) die biologische Aktivität von der Aktivität verschieden ist, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung haben kann;
(ii) Inkubieren der Zelle in der Anwesenheit einer Kandidaten Verbindung, die hinsichtlich der Fähigkeit, der biologischen Aktivität entgegenzuwirken, getestet werden soll; und
(iii) Selektieren der Zellen, in denen die Expression des Reportermoleküls oder der biologischen Aktivität modifiziert ist.

Irgendeine Nukleotidsequenz mit bekannter Nukleotidzusammensetzung kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz von einem im Wesentlichen sequenzierten Genom eines Mikroorganismus und/oder einer kompakten eukaryonten Spezies (d.h. einer Spezies mit einem hohen Anteil von Sequenzen, die Polypeptide kodieren) abgeleitet. Am meisten bevorzugt ist die Nukleotidsequenz von einem vollständig sequenzierten Genom eines Mikroorganismus und/oder einem kompakten Genom einer eukaryonten Spezies abgeleitet; dies ist ein Genom, das einen hohen Prozentsatz von DNA aufweist, die Polypeptide kodiert.
Wünschenswerterweise umfasst die vorliegende Erfindung eine Peptid Expressionsbibliothek, die aus einer definierten genomischen Sequenz hergestellt wurde, die entweder in einer Isolierung oder in Kombination mit einer anderen definierten genomischen Sequenz vorkommt, um (eine) Aminosäuresequenz(en) zu identifizieren, die geeignete Kandidaten für rationales Arzneimittel Design sein können, während im Wesentlichen zur selben Zeit umfassende Bioinformatikdaten über diese Kandidaten bereitgestellt werden. Die Bioinformatikdaten, die von dem Verfahren abgeleitet sind, können verwendet werden, um jene Aminosäuren zu identifizieren, die für das Modulieren der biologischen Aktivität wichtig sind.
Ein Verfahren zum Identifizieren eines Modulators einer biologischen Aktivität umfasst die Schritte:

(i) Herstellen einer Aminosäure Expressionsbibliothek, die von einer definierten genomischen Sequenz abgeleitet ist;
(ii) in Kontakt bringen einer Aminosäuresequenz, die von der Expressionsbibliothek abgeleitet ist, mit einem Reportermolekül, das funktionell ist unter der Kontrolle einer biologischen Aktivität, die mit einem Wirt assoziiert ist; und
(iii) Identifizieren einer Aminosäuresequenz, die in der Lage ist, die biologische Aktivität zu modulieren, wobei diese Aktivität von irgendeiner Aktivität, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung haben kann, verschieden ist.

Ein Verfahren zum Identifizieren einer Aminosäuresequenz, die in der Lage ist, eine biologische Aktivität in einer Wirtszelle zu modulieren, umfasst die Schritte:

(i) Herstellen einer Bibliothek in einem Wirt, wobei (a) die transformierten Zellen der Bibliothek mindestens eine erste Nukleotidsequenz enthalten, die ein Reportermolekül umfasst oder kodiert, dessen Expression unter der Kontrolle der biologischen Aktivität funktionell ist und eine zweite Nukleotidsequenz, die von einer bekannten genomischen Sequenz abgeleitet ist, die in der Lage ist, die Aminosäuresequenz zu kodieren, wenn sie funktionell unter der Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz angeordnet wird und wobei (b) im Wesentlichen die gesamte bekannte genomische Sequenz innerhalb der Population von transformierten Zellen anwesend ist, welche die Bibliothek bilden, und die biologische Aktivität ist von irgendeiner Aktivität, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung haben kann, verschieden;
(ii) Kultivieren des zellulären Wirtes für eine Zeit und/oder unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit die Expression der zweiten Nukleotidsequenz stattfindet; und
(iii) Auswählen oder Screenen nach Zellen, in denen die Expression des Reportermoleküls modifiziert ist.

Vorzugsweise schließt dieses Verfahren auch die zusätzlichen Schritte ein:

(iv) Vergleichen der Anzahl von Aminosäuresequenzen, die von der bekannten genomischen Sequenz abgeleitet werden können, mit jenen Sequenzen, die biologische Aktivität zeigten; und
(v) Bestimmen jener Aminosäuren, die zum Modifizieren der Reportermolekül Aktivität notwendig sind.

Im Rahmen der Erfindung wird eine Vielzahl von definierten genomischen Sequenzen, die von verschiedenen Organismen abgeleitet sind, in der Genfragment Expressionsbibliothek exprimiert. Wo genomische Sequenzen von mehr als einem Organismus in dem Verfahren verwendet werden, wird jede der Sequenzen vorzugsweise in äquimolaren Mengen bereitgestellt, um sicherzustellen, dass gleiche Anteile der Sequenzen in das Verfahren eingeschlossen werden.
Die Komplexität der Genfragment Expressionsbibliothek kann auch erhöht werden, indem die definierte(n) genomische(n) Sequenz(en), die von jenen Sequenzen abgeleitet sind, Verfahren unterzogen werden, welche die Sequenz(en) falsch lesen oder mutieren. Alternativ, oder zusätzlich dazu, kann die Komplexität der Bibliothek auch erhöht werden, indem die definierte genomische Sequenz in jedem ihrer verschiedenen Leserahmen exprimiert wird. Sie kann auch in ihren reversen Leserahmen exprimiert werden. Indem somit die Expression einer Gensequenz in jedem möglichen Leserahmen erlaubt ist, gibt es für irgendeine bestimmte Sequenz sechs verschiedene mögliche Kombinationen.
Es werden Aminosäuresequenzen durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert, und sie können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst eine Aminosäuresequenz, die in der Lage ist, eine biologische Aktivität oder die Funktion eines biologischen Moleküls zu modulieren oder zu vermitteln, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Verdünnungsmittel.
Ein Vektor (oder ein Pool von bis zu 3 Vektoren), der in der Lage ist, eine Nukleotidsequenz in jedem ihrer möglichen Leserahmen zu exprimieren, und wobei jede der Aminosäuresequenzen, die auf diese Weise hergestellt wird, als eine Fusion mit einer zweiten Aminosäuresequenz exprimiert wird, in der sie in der Konformation beschränkt sind, umfasst mindestens:

(i) eine erste Expressionskassette, umfassend:
(a) eine erste multiple Klonierungsstelle für die Insertion einer Nukleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenz kodiert, wobei die multiple Klonierungsstelle benachbart zu einer oder mehreren zweiten Nukleotidsequenz(en) sein kann, die einen Polypeptid Loop kodierten, so dass ein Fusionspolypeptid zwischen den ersten und zweiten Aminosäuresequenzen hergestellt werden kann;
(b) eine Terminatorsequenz benachbart zu der multiplen Klonierungsstelle und entfernt von der Promotorsequenz und den zweiten Nukleotidsequenzen;
(ii) ein Mittel zum Exprimieren der ersten Nukleotidsequenz in jedem ihrer Leserahmen;
(iii) einen bakteriellen Replikationsursprung und/oder einen Bakteriophagen Replikationsursprung; und
(iv) eine zweite Expressionskassette, die ein bakterielles Selektionsmarkergen kodiert.

Ein Zielmikroorganismus, dessen Wachstum oder andere Funktion inhibiert werden kann, kann modifiziert werden. Dieser Mikroorganismus kann für Screeningzwecke in einer Weise modifiziert werden, die das Screenen erleichtert, wie durch:

(i) Die Einführung von neuen Antibiotika Resistenzmarkern durch homologe Rekombination, durch Transformation von Plasmiden oder durch zufällige Mutagenese und Selektion;
(ii) Die Einführung (durch homologe Rekombination oder Plasmid Transformation) von einem oder mehreren Reportergen(en) (z.B. Luciferase oder β-Galactosidase) unter der Kontrolle eines endogenen Promotors, der mit Pathologie oder Virulenz assoziiert ist. Zum Beispiel könnten die Promotoren für die RNAIII oder RAP Gene von Staphylococcus aureus verwendet werden, um die Expression eines Reportergens zu kontrollieren, das einfach nachgewiesen werden könnte. Solche Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt – siehe zum Beispiel internationales (PCT) Patent WO 90/40979.

Bioinformatikdaten, die homologe Sequenzen betreffen, die Strukturdomänen in sequenzierten Genomen kodieren, können ausgenutzt werden, um definierte Bibliotheken durch solche Techniken wie degenerierte PCR Techniken oder chemische DNA Synthese zu entwerfen, die auf eine bestimmte Affinitätsdomäne gerichtet sind. Die Diversität einer solchen Bibliothek kann weiter durch Mutagenese Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, gesteigert werden.
Eine High Trough-Put Screening Technik kann für die Identifizierung von Klonen (aus der Bibliothek) verwendet werden, die Aminosäuresequenzen herstellen, die in der Lage sind, das Wachstum zu inhibieren oder Virulenz Gene des pathogenen Zielorganismus zu unterdrücken.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die hier beschriebenen Screening Verfahren unterscheiden sich von bestehenden rationalen Designansätzen, die versuchen, therapeutische Kandidaten Peptide basierend auf Homologien in den Datenbanken zu natürlichen inhibitorischen Pep tiden zu modulieren. Die bestehenden Ansätze fokussieren auf Aminosäuresequenzen, die zuvor aus ihrer natürlichen Quelle aufgrund ihrer inhibitorischen Eigenschaften identifiziert wurden. Im Gegensatz dazu bestimmen die hier beschriebenen Verfahren empirisch Aminosäuresequenzen, die eine biologische Aktivität modulieren können, aus einer breiten Vielzahl von Kandidaten, die in einer genomischen Expressionsbibliothek kodiert werden, die von Nukleotidsequenzen abgeleitet ist, die vollständig bestimmt wurden ohne auf die ursprüngliche Funktion dieser Sequenzen in der Natur Rücksicht zu nehmen.
Es wird angenommen, dass sich natürliche biologisch interaktive Peptid und Polypeptid Domänen durch Selektion aus einer Bank von zur Verfügung stehenden Domänen in jedem Organismus, in dem sie vorkamen, entwickelt haben. Innerhalb irgendeines Organismus gibt es eine riesige Anzahl von unterschiedlichen kodierenden Informationen. Um mit dieser Vielzahl umgehen zu können wurde ein genetischer Screen entworfen, der die Diversität eines Pools von potenziellen biologischen interaktiven Domänen maximiert. Weil die Information, die in dem Screen verwendet wird, von sequenzierter genetischer Information abgeleitet ist, kann darüber hinaus strukturelle Information, die sich bereits in der Natur entwickelt hat, durch Vergleichen von biologisch interaktiven Molekülen mit ähnlichen Sequenzen aus einer sequenzierten und Testnukleotidsequenz, ausgenutzt werden. Diese Information erlaubt wünschenswerterweise die Identifizierung von bestimmten Aminosäuren, die essentiell für die Bindungswirkung der biologischen Aktivität und/oder möglicher besonderer Motive sind, die essentiell für die Bindungsreaktion sind oder zumindest in sie eingeschlossen sind. Somit liefert die vorliegende Erfindung Screening Verfahren zum Identifizieren (einer) potenziellen Aminosäuresequenz(en), die in der Lage ist/sind, biologische Aktivitäten, die Peptide, Oligopeptide, Proteine und/oder Nukleinsäuresequenzen einschließen, zu modulieren oder zu vermitteln.
Die vorliegende Erfindung kann zum Identifizieren eines Modulators oder Mediators einer biologischen Aktivität verwendet werden, wobei die Aktivität Antigenität und/oder Immunogenität einschließt, das Verfahren umfasst die Schritte:

(i) Herstellen einer Genfragment Expressionsbibliothek, die von definierten Nukleotidsequenzfragmenten abgeleitet ist; und
(ii) Untersuchen der Expressionsbibliothek nach mindestens einer Aminosäuresequenz, die von Schritt (i) abgeleitet ist, hinsichtlich einer biologischen Aktivität, wobei diese Aktivität von irgendeiner Aktivität verschieden ist, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung haben kann.

So wie hier verwendet, soll der Begriff "biologische Aktivität" so verstanden werden, dass er biologische Interaktionen einschließt, die zu einer physikalischen Assoziation zwischen zwei oder mehreren Molekülen oder "Partnern" führt. Eine solche Aktivität sollte in ihrem breitesten Zusammenhang interpretiert werden und schließt zum Beispiel Interaktionen wie Peptid:Peptid, Peptid:Protein, Protein:Protein, Antigen:Antikörper, Peptid:Nukleinsäuresequenz, Protein:Nukleinsäuresequenz, Peptid:Ligand und Protein:Ligand, ein. Die Aktivität schließt zum Beispiel ein, aber ist nicht beschränkt auf irgendeine Interaktion, die Antikörper Bindung oder Antigen Bindung moduliert oder vermittelt, oder irgendeine andere Aminosäuresequenz basierte Interaktion, die im Abschnitt Hintergrund dieser Beschreibung beschrieben ist. Vorzugsweise schließt die physikalische Assoziation einen zellulären Vorgang ein, oder alternativ dazu, wird benötigt, damit ein zelluläres Ereignis stattfindet und wobei diese Aktivität verschieden ist von irgendeiner Aktivität, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung haben kann. Zusätzlich soll sie eine Aktivität einschließen, die zur Zerstörung einer biologischen Struktur und/oder Aktivität führt. Die "physikalische Anziehung" kann die Bildung eines induzierten magnetischen Felds oder paramagnetischen Felds, die Bildung einer kovalenten Bindung, wie einer Disulfidbrücken Bildung zwischen Polypeptid Molekülen, eine ionische Wechselwirkung, wie sie in einem ionischen Gitter auftritt, eine Wasserstoff Bindung oder alternativ dazu, eine van der Waals Wechselwirkung, wie eine Dipol-Dipol Wechselwirkung, Dipol induzierte Dipol Wechselwirkung, induzierte Dipol induzierte Dipol Wechselwirkung oder abstoßende Wech selwirkung oder irgendeine Kombination der obigen Anziehungskräfte, einschließen.
Es können Fragmente irgendeiner Nukleotidsequenz einer bekannten Nukleotidzusammensetzung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von Nukleotidsequenzfragmenten bekannt, einschließlich: mechanisches Scheren (z.B. durch Sonifizierung), Spaltung mit einer Nuklease (z.B. durch DNase1), Spaltung mit Restriktionsenzymen, Polymerase Kettenreaktion unter Verwendung degenerierter Primer. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz von einem im Wesentlichen sequenzierten Genom eines Mikroorganismus und/oder einer kompakten eukaryonten Spezies abgeleitet. Weiter bevorzugt ist die Nukleotidsequenz von einem vollständig sequenzierten Genom eines Mikroorganismus und/oder einer kompakten eukaryonten Spezies abgeleitet. Am meisten bevorzugt werden eine Vielzahl von verschiedenen Nukleotidsequenzen in den Genfragment Expressionsbibliotheken exprimiert, wobei die Sequenzen von biodiversen Organismen abgeleitet sind. Somit werden biodiverse Nukleotidsequenzen wünschenswerterweise in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Expressionsbibliotheken verwendet. Wo sequenzierte Genome oder Fragmente davon aus verschiedenen Organismen in dem Verfahren verwendet werden, sollte jedes der Genome oder Fragmente davon in äquimolaren Mengen bereitgestellt werden, um sicherzustellen, dass ein äquimolarer Anteil von sequenzierten Genomen oder Fragmenten davon in das Verfahren eingeschlossen wird.
Diejenigen, die im Gebiet arbeiten, werden erkennen, dass eine Genfragment Expressionsbibliothek unter Verwendung irgendeines im Stand der Technik bekannten Expressionsvektors hergestellt werden kann. Vorzugsweise besitzen die Vektoren, die zur Verwendung in der Bibliothek ausgewählt werden, starke Promotoren, um die Aminosäuresequenz Expression zu verstärken. In einem bakteriellen System schließen die bakteriell exprimierbaren Promotoren, die verwendet werden können, zum Beispiel ein, aber sind nicht beschränkt auf pT7-Select, pET, pZero, pHook, pTYB oder ein Derivat davon. Andere Vektoren, die in dem Vektor verwendet werden können, werden unten detaillierter diskutiert.
Die Aminosäuresequenz(en), die von der Genfragment Expressionsbibliothek abgeleitet ist/sind, kann/können in einer bezüglich der Konformation eingeschränkten oder bezüglich der Konformation nicht eingeschränkten Form verwendet werden. Aminosäuresequenzen, die bezüglich der Konformation in einer eingeschränkten Form exprimiert werden, können innerhalb eines zweiten Polypeptids als ein Fusionsprotein exprimiert werden, so dass sie wirksam in der Sekundärstruktur des zweiten Polypeptids "eingebettet" sind. Alternativ dazu kann/können die Aminosäuresequenz(en) durch oxidierende flankierende Cysteinreste zirkularisiert werden, um die Konformationsdiversität zu limitieren. Dies kann besonders vorteilhaft sein, wo die Aminosäuresequenz(en) in eine Oberflächen exponierte oder funktionelle Stelle eines Proteins eingebettet ist/sind, so dass sie gegenüber der interessierenden biologischen Aktivität zugänglich ist/sind. Zum Beispiel kann/können die Aminosäuresequenz(en) innerhalb einer Thioredoxin (Trx) Polypeptid Schleife exprimiert werden. Ohne durch irgendeine Theorie oder Wirkungsweise gebunden zu sein, limitiert die Expression der Aminosäuresequenz(en) in einer bezüglich der Konformation eingeschränkten Form den Freiheitsgrad und die entropischen Werte, die mit seiner Bindung assoziiert sind, wodurch ein höherer Affinitätsgrad und eine höhere Wechselwirkungsspezifität verliehen werden.
Diejenigen, die im Gebiet arbeiten, werden erkennen, dass die vorliegende Erfindung weitreichende Anwendung besitzt. Beispielweise ist die vorliegende Erfindung insbesondere zum Screenen von Genfragment Expressionsbibliotheken nach (einer) Aminosäuresequenz(en), die mit bestimmten Antikörpern durch zum Beispiel Affinitätschromatographie oder eine Phagen Display Bibliothek reagiert/reagieren, verwendbar. Alternativ dazu können biodiverse Genfragment Bibliotheken verwendet werden, um antigene oder immunogene Sequenzen zu identifizieren, die für Vakzine oder für Immuntherapie von allergischen Erkrankungen oder Autoimmun Erkrankungen verwendet werden können.
Ein Verfahren zum Identifizieren eines Modulators oder Mediators einer biologischen Aktivität, wobei Aktivität Antigenität und/oder Immunogenität einschließt, umfasst die Schritte:

(i) Herstellen einer Genfragment Expressionsbibliothek, die von definierten Nukleotidsequenzfragmenten abgeleitet ist, wobei die Nukleotidsequenz mindestens eine Sequenz von Aminosäuren kodiert;
(ii) Untersuchen der Expressionsbibliothek hinsichtlich mindestens einer Aminosäuresequenz, die von Schritt (i) abgeleitet ist, hinsichtlich einer biologischen Aktivität, wobei die Bibliothek angepasst ist, um eine Vielzahl von Aminosäuresequenzen zu zeigen, von denen jede um mindestens eine Aminosäure variieren kann; und
(iii) Identifizieren jener Aminosäuren, die für das Modulieren der biologischen Aktivität essenziell sind, wobei die Aktivität von der Aktivität verschieden ist, mit der die Sequenz normalerweise nicht in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert ist.

Eine Sequenz von Aminosäuren, die besonders wirksam im Modulieren von biologischer Aktivität ist, kann ausgewählt werden durch Vergleichen der beobachteten biologischen Aktivität aus einer Reihe von verschiedenen Aminosäuresequenzen eines ähnlichen Aufbaus. Durch das Verwenden von Unterschieden in der beobachteten biologischen Aktivität ist es möglich, jene Aminosäuren zu identifizieren, die für biologische Aktivität essenziell sind und jene, die entweder für die Aktivität gewünscht sind, oder im alternativen Fall, jene, die ein Hindernis beim Erreichen wirksamer Aktivität darstellen.
Die vorliegende Erfindung weist weitreichende Anwendung zum Identifizieren von Aminosäuresequenzen auf, die eine neue Aktivität im Vergleich zu jener aufweisen, für die sie in ihrer ursprünglichen natürlichen Umgebung bekannt sind.
Ein Verfahren zum Identifizieren einer Aminosäuresequenz, die entweder antigene oder immunogene Aktivität aufweist, umfasst die Schritte:

(i) Herstellen einer Genfragment Expressionsbibliothek, die von definierten Nukleotidsequenzfragmenten abgeleitet ist, wobei die Nukleotidsequenz mindestens eine Sequenz von Aminosäuren kodiert;
(ii) Untersuchen der Expressionsbibliothek hinsichtlich mindestens einer Aminosäuresequenz, die von Schritt (i) abgeleitet ist, hinsichtlich einer antigenen oder immunogenen Aktivität, wobei die Bibliothek angepasst ist, um eine Vielzahl von Aminosäuresequenzen zu zeigen, von denen jede um mindestens eine Aminosäure variiert;
(iii) Identifizieren jener Aminosäuresequenzen, die für das Modulieren oder Vermitteln der antigenen oder immunogenen Aktivität essentiell sind; und
(iv) Auswählen jener Sequenzen aus dem Identifizierungsschritt in Schritt (iii), die nicht mit der antigenen oder immunogenen Aktivität in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert sind.

Vorzugsweise werden die Genfragment Bibliotheken, die in dieser Ausführungsform der Erfindung eingesetzt werden, verwendet, um Antigene zu identifizieren oder herzustellen, die für Vakzine oder für Immuntherapie von allergischer Erkrankung oder Autoimmunerkrankung verwendet werden können. Im Fall der Allergen Immuntherapie ist es besonders wünschenswert, dass Peptide mit hoher Affinität identifiziert werden (die selten in zufälligen Peptid Bibliotheken sind), weil sie als monovalente Antigene verwendet werden können, um spezifische kreuzvernetzungsimmunologische Reaktionen, wie Kreuzvernetzung von IgE auf Mastzellen, zu vermeiden.
Die erfindungsgemäßen Peptid Bibliotheken können eingesetzt werden, um neue antibakterielle Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die konditionell aus einem Fusionsprotein freigesetzt werden. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein Verfahren zum Identifizieren einer antibakteriellen Aminosäuresequenz bereitgestellt, umfassend:

(i) Transformieren oder Transfizieren einer ersten bakteriellen Population von Zellen mit einer Peptid Expressionsbibliothek, die von definierten Nukleotidsequenzfragmenten abgeleitet ist;
(ii) Anziehen der ersten bakteriellen Population für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit die Expression der Aminosäuresequenzen, die innerhalb der Bibliothek kodiert sind, stattfindet, und zur Freisetzung der Aminosäuresequenzen von ihren jeweiligen Fusionen;
(iii) in Kontakt bringen der exprimierten Aminosäuresequenzen mit pathogenen Bakterien;
(iv) Identifizieren jener Sequenz(en), die in der Lage ist/sind, das Wachstum der pathogenen Bakterien zu inhibieren oder die pathogenen Bakterien abzutöten; und
(v) Auswählen jener Sequenzen aus dem Identifizierungsschritt in Schritt (iv), die nicht mit der Inhibition von Wachstum der pathogenen Bakterien oder dem Töten der pathogenen Bakterien in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert sind.

Es sollte erkannt werden, dass das in dieser Ausführungsform beschriebene Verfahren weitreichende Anwendung zum Identifizieren neuer Aminosäuresequenzen besitzt, die in der Lage sind, das Wachstum von pathogenen Bakterien zu inhibieren oder pathogene Bakterien abzutöten.
In einer stark bevorzugten Form dieser Ausführungsform werden Nukleotidsequenzen, die (ein) Peptid(e) oder (eine) Peptid Fusion(en) kodieren, in die Klonie rungsstelle eines T7-Select Phagenvektors (Invitrogen) mit oder ohne der Einführung einer konditionalen Proteinspaltungsstelle (wie des temperatursensitiven Protein Splicing Elements "Intein", das von dem Element modifiziert wurde, das in dem Saccharomyces cerevisiae VMA1 Gen (z.B. IMPACT T7 System, New England Biolabs) gefunden wurde), kloniert in die Fusionskreuzung des Vektors, eingeführt. Die erste bakterielle Population wird anschließend für einen Zeitraum und unter Bedingungen angezogen, die ausreichend sind, damit die Expression der Peptide, die von der Bibliothek kodiert werden, stattfindet. In Fällen, in denen die konditionelle Spaltung des Peptids aus seinem Fusionszusammenhang gewünscht ist (z.B. das Intein System), kann die bakterielle/Phagenpopulation unter Bedingungen gegeben werden, unter denen Spaltung stattfinden kann (z.B. geringe Temperatur im Fall der Intein Mutantenspaltung). Die einzelnen Klone oder Pools von Klonen in der Bibliothek werden anschließend in Replika Arrays getrennt. Mindestens einer dieser replizierten Arrays wird anschließend lysiert, um einen Lysat Array herzustellen. Es sei angemerkt, dass dies nicht notwendig ist im Falle von lytischen Phagenvektoren, wie T7-Select. Der Lysat Array wird anschließend in eine physikalische Verbindung mit den pathogenen Bakterien gebracht. Jene Lysate, die in der Lage sind, das Wachstum der pathogenen Bakterien zu inhibieren, oder die pathogenen Bakterien abzutöten, können anschließend durch Standard Techniken identifiziert werden.
Zur Erleichterung kann das in dieser Ausführungsform beschriebene Bakterium innerhalb eines bakteriellen Rasens auf festem Medium enthalten sein, jedoch ist dies nicht notwendig für das Ausführen dieser Ausführungsform.
Vorzugsweise umfasst das gegenständliche Verfahren weiterhin den Schritt des Abtastens des Lysats zu dem replizierten Array, um die bakterielle Zelle zu lokalisieren, die dasselbe antibakterielle Peptid exprimiert, wie jenes, das im Lysat exprimiert wurde. Weiter bevorzugt wird die genetische Sequenz, die das Peptid kodiert, zum Zweck der Herstellung des antibakteriellen Peptids, das sie kodiert, isoliert.
In einem Beispiel dieser Ausführungsform werden Escherichia coli BL21 Lysate, die Protein enthalten, das von pET Peptid Bibliotheken exprimiert wird, hinsichtlich ihrer Fähigkeit das Wachstum von pathogenen Mikroorganismen zu inhibieren oder alternativ, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, pathogene Mikroorganismen abzutöten, untersucht, wobei individuelle Klone, die von einer Population von Zellen abgeleitet sind, die mit der gegenständlichen Peptid Bibliothek transformiert oder transfiziert wurden, entweder auf semipermeable Membranen, wie Nitrocellulose oder Nylonmembranen, Replika plattiert werden, oder alternativ für Masterkulturen und Kulturen in denen die Expression der klonierten Peptidsequenz vor der Lyse induziert werden muss, Replika gepickt werden. Replika plattieren und/oder Replika picken kann manuell oder mit der Hilfe von Robotern durchgeführt werden. Proben, die jene Kolonien, in denen die Expression induziert werden soll, enthalten, werden lysiert, zum Beispiel durch Aussetzen gegenüber Chloroform oder durch Infektion mit einem Bakteriophagen, wie T7 Bakteriophage, und auf einem frisch ausgesäten Rasen von pathogenen Bakterien geschichtet.
Im Fall von lytischen Phagen Bibliotheken (wie jene, die in dem T7-Select System hergestellt werden) kann eine doppelseitige Petrischale verwendet werden. In diesem Fall besetzt eine Phagenüberschichtung eine Seite der Schalen, die von den anderen Seiten durch eine gestützte semipermeable Membran (hergestellt aus einem Material, wie Nitrocellulose oder Nylon), getrennt ist, auf der ein ausgesäter Rasen der pathogenen Bakterien liegt. So trennt die semipermeable Membran die Phagenüberschichtung von den pathogenen Bakterien, die jeweils auf verschiedenen Medien angezogen werden können (siehe Beispiel).
Die Fähigkeit der einzelnen Peptid exprimierenden Klone, das Wachstum zu inhibieren oder das fragliche pathogene Bakterium abzutöten, wird untersucht, indem die Anwesenheit einer "Plaque ähnlichen" "Öffnung" oder eines "Lochs" in dem Rasen der pathogenen Bakterien direkt unterhalb der Position nachgewiesen wird, wo das Lysat, welches das exprimierte antibakterielle Peptid enthält, auftritt.
Der Fachmann wird erkennen, dass dieses Verfahren eine Möglichkeit bereitstellt, einen Phagen oder Plasmid Klon zu isolieren, der die Aktivität exprimiert, die das korrespondierende Loch in dem Rasen auf der gegenüberliegenden Seite verursacht hat.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Modifikators einer biologischen Aktivität, die mit einer Wirtszelle assoziiert ist, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Exprimieren eines Reportermoleküls, das unter der Kontrolle der biologischen Aktivität in der Zelle funktional ist, wobei mindestens ein Molekül, das mit der biologischen Aktivität assoziiert ist, eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die funktional in Verbindung mit einem Promotor angeordnet ist;
(ii) Inkubieren mindestens einer Zelle aus Schritt (i) in der Anwesenheit (einer)/von Aminosäuresequenz(en) aus einer Genfragment Expressionsbibliothek, die von einer definierten genomischen Sequenz abgeleitet ist/sind, unter Bedingungen, welche die Wechselwirkung zwischen der/den Aminosäuresequenz(en) und einem Nukleotid oder einer Aminosäuresequenz, die in die biologische Aktivität involviert ist, fördert;
(iii) Identifizieren mindestens einer Aminosäuresequenz, die in der Anwesenheit der Zellen in der Lage ist, die Expression des Reportermoleküls oder der biologischen Aktivität zu modifizieren; und
(iv) Auswählen jener Sequenzen in Schritt (iii), die nicht allgemein als jene erkannt werden, die in der Lage sind, die Expression des Reportermoleküls oder der biologischen Aktivität in ihrer natürlichen Umgebung zu modifizieren.

Vorzugsweise wird das Verfahren so oft wiederholt, wie es notwendig ist, um sicherzustellen, dass im Wesentlichen alle der Aminosäuren, die von der definierten Nukleotidsequenz kodiert werden, gegenüber der biologischen Aktivität ausgesetzt sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Genfragment Expressionsbibliothek in einem pET Vektor hergestellt. So wie jene, die kommerziell von Novagen erhältlich sind. pET Vektoren, die hier beschrieben sind, sind besonders nützlich in solchen Anwendungen, durch die starke T7 Promotorsequenz, die darin enthalten ist, welche die bakterielle Expression in Stämmen, die T7 Polymerase exprimieren, erleichtert. Der Fachmann wird erkennen, dass andere bakterielle Expressionsvektoren genauso verwendet werden können.
In einer stark bevorzugten Form dieser Ausführungsform, wird/werden (eine) Nukleotidsequenz(en), die von einer definierten genetischen Sequenz abgeleitet ist/sind, in einen pET Vektor derart eingebaut, dass die Nukleotidsequenz funktional mit einer geeigneten bakteriellen Translationsinitiationssequenz, wie supra beschrieben, verbunden ist. Eine zweite Nukleotidsequenz kann in Assoziation mit der ersten Nukleotidsequenz weiterhin exprimiert werden, so dass das resultierende Peptid innerhalb der aktiven Stelle der Schleife von Thioredoxin oder innerhalb von oxidierten flankierenden Cysteinresten eingegrenzt ist. Wie in anderen Ausführungsformen der Erfindung kann die zweite Nukleotidsequenz synthetisch und/oder von genomischen Quellen abgeleitet sein.
Die Expression des pET Vektors kann durch Infektion von Bakterien, die das Bibliotheksplasmid enthalten, mit Bakteriophage T7, oder alternativ durch Verwendung von öffentlich zur Verfügung stehenden Stämmen, wie E. coli BL21, die das T7 Polymerase Gen unter lac Kontrolle enthalten, erreicht werden, weil in solchen Stämmen IPTG zu dem Wachstumsmedium hinzugefügt werden kann, um die Expression des T7 Polymerase Gens zu induzieren. Derivate des Stamms BL21 (wie Stamm BL21trxB (DE3)), die eine Mutation in dem Thioredoxin Reduktasegen trxB enthalten, sind besonders nützlich, um sicherzustellen, dass Disulfid Bindungen in dem bakteriellen Zytoplasma oxidiert bleiben.
Diese Ausführungsform ist besonders nützlich zum Identifizieren von Antagonisten einer biologischen Aktivität. In solchen Situationen ist die ungewünschte biologische Aktivität vorzugsweise funktional in der Abwesenheit des Arzneimittels, das gescreent wird, und die Störung dieser Wechselwirkung wird in der Anwesenheit einer Kandidaten Arzneimittelverbindung untersucht, wobei die modifizierte Reportergen Expression in einer Weise nachgewiesen wird, die für andere Ausführungsformen dieser Erfindung beschrieben wurde.
Wo das Reportermolekül letal für die bakterielle Zelle ist, sollte die Expression davon vorzugsweise nicht stattfinden bevor die Aminosäuresequenz(en) Kandidatenverbindung gegenüber der Zelle für einen Zeitraum und unter Bedingungen ausgesetzt war, die ausreichend sind, um der biologischen Aktivität, die zu der Reporterexpression führt, entgegenzuwirken. Folglich liefert eine bevorzugte Form dieser Ausführungsform ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer biologischen Aktivität in einer bakteriellen Zelle, umfassend die Schritte:

(i) Anordnen der Expression eines zytostatischen oder zytotoxischen Reportermoleküls funktional unter die Kontrolle einer biologischen Aktivität in der Zelle, wobei mindestens ein Bindungspartner in der biologischen Aktivität eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die funktional in Verbindung mit einem bakteriell exprimierbaren Promotor angeordnet ist;
(ii) Inkubieren der Zelle in der Anwesenheit mindestens einer Aminosäuresequenz Kandidatenverbindung, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit, der biologischen Aktivität entgegenzuwirken für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit Antagonismus stattfindet, untersucht werden soll, wobei die Aminosäuresequenz Kandidatenverbindung von einer Genfragment Expressionsbibliothek abgeleitet ist, die von einer definierten genomischen Sequenz abgeleitet ist;
(iii) Exprimieren der Bindungspartner unter der Kontrolle des bakteriell exprimierbaren Promotors für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zu der Expression des Reportermoleküls in der Abwesenheit von Antagonismus zu führen; und
(iv) Auswählen von überlebenden oder wachsenden Zellen.

Vorzugsweise ist der induzierbare bakteriell exprimierbare Promotor der T7 Promotor. Unter solchen Umständen kann die Expression des Reportermoleküls durch Infizieren von Zellen mit Bakteriophage T7 induziert werden, der die T7 Polymerasefunktion bereitstellt. Alternativ dazu kann die bakterielle Zelle eine Zelle sein, welche die T7 Polymerase unter lac Kontrolle enthält (z.B. E. coli BL21 Zellen), in diesem Fall kann der Promotor durch das Hinzufügen von IPTG zum Wachstumsmedium induziert werden. Die Kandidatenverbindung kann irgendein kleines Molekül, Arzneimittel, Antibiotikum oder eine andere Verbindung sein, die einzige Voraussetzung ist, dass sie in der Lage ist, in die bakterielle Zelle einzudringen oder von der bakteriellen Zelle aktiv aufgenommen zu werden, oder alternativ dazu durch das Hinzufügen eines Trägermoleküls, das eine solche Aufnahme erleichtert, modifiziert zu werden.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer biologischen Aktivität bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Anordnen der Expression eines Reportermoleküls funktional unter die Kontrolle einer biologischen Aktivität in einer Zelle, wobei mindestens ein Partner der biologischen Aktivität eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die funktional in Verbindung mit einem bakteriell exprimierbaren Promotor in einem geeigneten Vektor angeordnet ist, wobei (a) die Nukleotidsequenz von einer Nukleotidsequenz mit bekanntem und sequenziertem Ursprung abgeleitet ist und (b) die biologische Aktivität von ir gendeiner Aktivität, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung haben kann, verschieden ist;
(ii) Inkubieren der Zelle in der Anwesenheit einer Kandidatenverbindung, die hinsichtlich der Fähigkeit der biologischen Aktivität entgegenzuwirken, getestet werden soll; und
(iii) Auswählen von Zellen, in denen die Expression des Reportermoleküls oder die biologische Aktivität modifiziert ist.

Dieses Verfahren ist besonders nützlich zum Identifizieren neuer Arzneimittel, wie Antibiotika und inhibitorischer Mittel, die als Agonisten und Antagonisten Kandidaten irgendeiner biologischen Aktivität dienen können. Darüber hinaus kann dieses System beim High Through-Put Screenen nach neuen Antibiotika oder anderen inhibitorischen Mitteln verwendet werden, die auf spezifische Aminosäuresequenz:Nukleinsäuresequenz Wechselwirkungen oder Aminosäuresequenz:Aminosäuresequenz Wechselwirkungen abzielen.
Wo das Reportermolekül für die bakterielle Zelle letal ist, sollte seine Expression vorzugsweise nicht erlaubt werden, bis die Kandidatenverbindung gegenüber der Zelle für einen Zeitraum und unter Bedingungen ausgesetzt war, die ausreichend sind, um der biologischen Aktivität, die zur Reporterexpression führt, entgegenzuwirken. Folglich stellt ein bevorzugter Aspekt dieser Ausführungsform ein Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten einer biologischen Aktivität in einer bakteriellen Zelle bereit, umfassend:

(i) Anordnen der Expression eines zytostatischen oder zytotoxischen Reportermoleküls funktional unter die Kontrolle einer biologischen Aktivität in der Zelle, wobei mindestens ein Bindungspartner in der biologischen Aktivität eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die funktional in Verbindung mit einem bakteriell exprimierbaren Promotor angeordnet ist, wobei (a) die Nukleotidsequenz definiert ist und von einer Nukleotidsequenz bekannten Ursprungs abgeleitet ist und (b) die biologische Aktivität verschieden ist von irgendeiner Aktivität, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung aufweisen kann;
(ii) Inkubieren der Zelle in der Anwesenheit einer Kandidatenverbindung, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit, der biologischen Aktivität entgegenzuwirken, untersucht werden soll, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit Antagonismus stattfindet;
(iii) Exprimieren des Bindungspartners unter der Kontrolle des bakteriell exprimierbaren Promotors für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zu der Expression des Reportermoleküls in der Abwesenheit von Antagonismus zu führen; und
(iv) Auswählen von überlebenden oder wachsenden Zellen.

In einem stark bevorzugten Beispiel dieser Ausführungsform ist der induzierbare bakteriell exprimierbare Promotor der T7 Promotor. Der Fachmann wird beobachten, dass irgendein anderer bakterieller induzierbarer Promotor in der Erfindung verwendet werden kann. Diese Ausführungsform wird nur wegen der Einfachheit bezüglich des Promotors beispielhaft dargestellt. Unter solchen Umständen kann die Expression des Reportermoleküls durch Infizieren von Zellen mit Bakteriophage T7 induziert werden, der die T7 Polymerasefunktion bereit stellt. Alternativ dazu kann die bakterielle Zelle eine Zelle sein, welche die T7 Polymerase unter lac Kontrolle (z.B. E. coli BL21 Zellen) enthält, in diesem Fall kann der Promotor durch das Hinzufügen von IPTG zum Wachstumsmedium induziert werden. Die Kandidatenverbindung kann irgendein kleines Molekül, Arzneimittel, Antibiotikum oder andere Verbindung sein, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass sie in der Lage ist, in die bakterielle Zelle einzudringen oder von ihr aktiv aufgenommen zu werden, oder alternativ dazu wird sie/es durch das Hinzufügen eines Trägermoleküls, um eine solche Aufnahme zu erleichtern, modifiziert.
Wünschenswerterweise verwendet die vorliegende Erfindung eine Genfragment Expressionsbibliothek, die aus einer definierten genomischen Sequenz hergestellt wurde, die entweder alleine oder in Kombination mit einer anderen definierten genomischen Sequenz anwesend ist, um (eine) Aminosäuresequenz(en) zu identifizieren, die (ein) geeignete(r) Kandidat(en) für rationales Arzneimittel Design sein kann/können, während sie im Wesentlichen gleichzeitig umfangreiche bioinformatische Daten über jene Kandidaten bereitstellt. Die Bioinformatikdaten, die von dem Verfahren abgeleitet sind, können verwendet werden, um jene Aminosäuren zu identifizieren, die für das Modulieren der biologischen Aktivität wichtig sind.
Unter Verwendung von Kenntnissen der phylogenetischen Verwandtschaft zwischen Mikroorganismen kann ein Gemisch aus bestimmten Genomen entworfen werden, um die Sequenzdiversität der Peptid Expressionsbibliothek zu maximieren. Dieser Ansatz weist einige verschiedene Vorteile gegenüber dem Klonieren und Exprimieren von DNA, die direkt aus der Umgebung gereinigt wird, auf. Zunächst kann die wahre Diversität und die Verschiebung der Bibliothek einfacher abgeschätzt werden. Somit können Maßnahmen implementiert werden, um die Domänendiversität zu maximieren und die Verschiebung gegenüber den Genomen von dominanten Spezies zu minimieren. Zweitens erlaubt das künstliche Anreichern von DNA, die von verschiedenen bekannten Organismen abgeleitet ist, einzigartige Möglichkeiten, um diverse Genome zu überwachen, die zusammen in der Natur vorkommen können. Zum Beispiel könnten die Genome von bestimmten Archaebakterien zusammen mit jenen von obligaten Parasiten, wie Mycoplasmen und/oder verschiedenen Gram positiven und/oder Gram negativen Organismen gleichzeitig gescreent werden. Drittens kann die Ausrichtung (alignment) von Sequenzen, die von einem Screen abgeleitet sind, verwendet werden, um Konsensusmotive zu zeigen. Darüber hinaus können andere potenziell verwandte Motive als potenzielle Arzneimittel Kandidaten ausgeschlossen werden wenn sie aus keinem der Genome identifiziert werden, in denen sie theoretisch vorkommen, trotz umfassendem Screenen bei einer Komplexität, von der vorhergesagt wurde, dass sie alle der potenziellen Domänen abdeckt, die von dem/den Genom(en) kodiert werden, aber welche die benötigte Aktivität nicht zeigen. Diese Information kann verwendet werden, um optimale Peptide zu entwerfen, welche die Konsensusmotive nachahmen, die in dem biologischen Screen identifiziert wurden, während ihnen alternative Reste von strukturell verwandten Peptiden fehlen, die wahrscheinlich in dem umfassenden Screen eingeschlossen waren. Schließlich erleichtert die Verwendung von vereinigten Genomen von sequenzierten Organismen bestimmte aussagekräftige Bioinformatikanalysen, die im Design von therapeutischen Peptiden nützlich sein können.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Modulators einer biologischen Aktivität bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Herstellen einer Genfragment Expressionsbibliothek, die von einer definierten genomischen Sequenz abgeleitet ist;
(ii) in Kontakt bringen einer Aminosäuresequenz, die von der Expressionsbibliothek abgeleitet ist, mit einem Reportermolekül, das funktional unter der Kontrolle einer biologischen Aktivität ist, die mit einem Wirt assoziiert ist; und
(iii) Identifizieren einer Aminosäuresequenz, die in der Lage ist, die biologische Aktivität zu modulieren, wobei diese Aktivität von irgendeiner Aktivität verschieden ist, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung haben kann.

Vorzugsweise ist mindestens einer der Partner in der biologischen Aktivität, die durch diese Ausführungsform vorgesehen sind, ein Peptid, Polypeptid, Protein oder Enzymmolekül oder ein Derivat davon. Gemäß dieser Ausführungsform ist/sind die/der verbleibende(n) Partner ein Molekül, das von der Liste ausgewählt ist, die eine Nukleinsäure, wie einzelsträngige oder doppelsträngige RNA oder DNA, ein Peptid, Polypeptid, Protein, Enzym, Kohlenhydrat, Aminosäure, Nukleotid, Nukleosid, Lipid, Lipoprotein, Vitamin, Coenzym, Reportermolekül, Hormon, chemische Verbindung, zyklisches AMP, Metallion oder sekundäres Botenmole kül, unter anderem, umfasst. Weiter bevorzugt ist die biologische Aktivität eine Protein:Protein Wechselwirkung oder eine Protein:Peptid Wechselwirkung oder eine Protein:Polypeptid Wechselwirkung.
In einer besonders bevorzugten Form liegt die biologische Aktivität zwischen einem ersten Partner umfassend eine Aminosäuresequenz, und einem zweiten Partner, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie DNA oder RNA, oder alternativ dazu eine Aminosäuresequenz oder ein Derivat oder Analog davon.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Identifizieren einer Aminosäuresequenz bereitgestellt, die in der Lage ist, eine biologische Aktivität in einer Wirtszelle zu modulieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Herstellen einer Bibliothek in einem Wirt, wobei (a) die transformierten Zellen der Bibliothek mindestens eine erste Nukleotidsequenz enthalten, die ein Reportermolekül enthält oder kodiert, dessen Expression funktional unter der Kontrolle der biologischen Aktivität ist, und eine zweite Nukleotidsequenz, die von einer bekannten genomischen Sequenz abgeleitet ist, die in der Lage ist, eine Aminosäuresequenz zu kodieren, wenn sie funktional unter der Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz angeordnet ist und wobei (b) im Wesentlichen die Gesamte der bekannten genomischen Sequenz innerhalb der Population von transformierten Zellen, welche die Bibliothek bilden, anwesend ist, und die biologische Aktivität von irgendeiner Aktivität verschieden ist, welche die Aminosäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung aufweisen kann;
(ii) Kultivieren des zellulären Wirtes für einen Zeitraum und/oder unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit die Expression der zweiten Nukleotidsequenz stattfindet; und
(iii) Auswählen oder Screenen von Zellen, in denen die Expression des Reportermoleküls modifiziert ist.

Die zweite Nukleotidsequenz, die in dem Verfahren verwendet wird, kann von irgendeiner bekannten genomischen Sequenz abgeleitet sein. Indem eine ausreichende Anzahl von zweiten Nukleotidspezies verwendet wird, um sicherzustellen, dass die gesamte Sequenz einer bekannten genomischen Sequenz untersucht wird, können Bioinformatikdaten von Sequenzen gesammelt werden, die nicht nur ein positives Ergebnis in dem Testsystem ergaben, sondern auch von solchen Sequenzen, die nicht reagierten. Durch Vergleichen reaktiver Aminosäuresequenzen mit ähnlichen Sequenzen in einem Genom, die entweder eine Reaktion bewirkten oder alternativ dazu, keine Reaktion bewirkten, können Sequenzmotive ebenso wie individuelle Aminosäuren identifiziert werden, die in eine biologische Aktivität verwickelt sein können. Wenn der Screen zusätzlich ausreichend umfassend ist, um eine adäquate Abdeckung sicherzustellen, kann gezeigt werden, dass bestimmte alternative Reste/Motive, die in der Bibliothek vorkommen, suboptimal sind, wenn sie in das Design von Inhibitoren der Aktivität eingebaut werden.
Somit wird in einer bevorzugten Form dieser Ausführungsform ein Verfahren zum Identifizieren (einer) Aminosäuresequenz(en) bereitgestellt, die in der Lage ist/sind, eine biologische Aktivität in einem Wirt zu modulieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Herstellen einer Peptid Bibliothek in einem Wirt, wobei (a) die transformierten Zellen der Bibliothek mindestens eine erste Nukleotidsequenz enthalten, die ein Reportermolekül umfassen oder kodieren, dessen Expression funktional unter der Kontrolle der biologischen Aktivität ist, und eine zweite Nukleotidsequenz, die von einer bekannten genomischen Sequenz abgeleitet ist, die in der Lage ist, die Aminosäuresequenz(en) zu kodieren, wenn sie funktional unter der Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz angeordnet ist, und wobei (b) im Wesentlichen die gesamte bekannte genomische Sequenz innerhalb der Population von transformierten Zellen anwesend ist, welche die Bibliothek bilden;
(ii) Kultivieren des zellulären Wirts für einen Zeitraum und/oder unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit die Expression der zweiten Nukleotidsequenz stattfindet;
(iii) Auswählen oder Screenen nach Zellen, in denen die Expression des Reportermoleküls modifiziert ist;
(iv) Vergleichen der Vielzahl von Aminosäuresequenzen, die von der bekannten genomischen Sequenz abgeleitet sein können, mit jenen Sequenzen, welche die biologische Aktivität modulieren; und
(v) Bestimmen jener Aminosäuren, die für das Modifizieren der Reportermolekül Aktivität essenziell sind.

Ein Vektor, der in der Lage ist, eine Nukleotidsequenz in jeder ihrer möglichen Leserahmen zu exprimieren und wobei jede der Aminosäuresequenzen, die auf diese Weise hergestellt werden, als eine Fusion mit einer zweiten Aminosäuresequenz exprimiert werden, in der sie bezüglich der Konformation eingeschränkt sein können, umfasst mindestens:

(i) eine erste Expressionskassette, umfassend:
(a) eine multiple Klonierungsstelle für die Insertion einer ersten Nukleotidsequenz, welche die erste Aminosäuresequenz kodiert, wobei die multiple Klonierungsstelle benachbart zu einer oder mehreren zweiten Nukleotidsequenzen sein kann, die eine Polypeptid Schleife kodieren, so dass ein Fusionspolypeptid zwischen der ersten und zweiten Aminosäuresequenz hergestellt werden kann;
(b) eine Terminatorsequenz, benachbart zu der multiplen Klonierungsstelle und distal zu der Promotorsequenz und zweiten Nukleotidsequenzen;
(ii) ein Mittel zum Exprimieren der ersten Nukleotidsequenz in jedem ihrer Leserahmen;
(iii) einen bakteriellen Replikationsursprung und/oder einen Bakteriophagen Replikationsursprung; und
(iv) eine zweite Expressionskassette, die ein bakterielles Selektionsmarkergen kodiert.

In einer alternativen Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor weiterhin eine zweite Expressionskassette, die ein selektierbares Markergen funktional verbunden mit zwei oder mehreren Promotorsequenzen und angeordnet oberhalb einer Terminatorsequenz aufweist, wobei eine der Promotorsequenzen ein bakteriell exprimierbarer Promotor ist, und wobei eine der Promotorsequenzen ein Hefe exprimierbarer Promotor ist.
In einer anderen alternativen Ausführungsform ist der gegenständliche Vektor weiterhin modifiziert, um die induzierbare extrazelluläre Expression durch Signalpeptid Fusionen und/oder konditionale Lysesysteme bereitzustellen. Konditionale Lyse kann erreicht werden durch Expression eines induzierbaren lytischen Gens in bakteriellen Zellen, durch Einführen solcher Sequenzen in eine Expressionskassette zwischen einem induzierbaren bakteriellen Promotor (wie dem lac, tac oder den strenger regulierten araBAD Promotoren) und einer transkriptionalen Terminationssequenz, in Tandemanordnung mit den Promotor- und Terminatorsequenzen, die bereits in den gegenständlichen Expressionskassetten anwesend sind.
In einer noch weiteren Ausführungsform wird die konditionale Lyse von Bakterien, die das Peptid/Polypetid exprimieren, durch alternative Mittel durchgeführt, wie durch Infektion mit einem geeigneten Bakteriophagen oder durch Aussetzen gegenüber geeigneten chemischen Mitteln, wie Chloroform und/oder SDS. In einer besonders bevorzugten Form der Erfindung schließt der Vektor auch eine dritte Expressionskassette ein, welche die konditionale Expression eines lytischen Gens (wie jene Gene, die von Bakteriophagen gebildet werden) erlaubt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch (eine) Aminosäuresequenz(en), die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert wurde(n), ebenso wie die Verwendung jener Moleküle in einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst (eine) Aminosäuresequenz(en), die in der Lage ist/sind, eine biologische Aktivität oder die Funktion eines biologischen Moleküls zu modulieren, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Biodiverse Nukleotidsequenzfragmente
Wo sequenzierte Genome von verschiedenen Organismen in den obigen Ausführungsformen verwendet werden, sollte jedes der Genome in äquimolaren Mengen bereitgestellt werden, um sicherzustellen, dass ein gleicher Anteil der sequenzierten Genome in das Verfahren eingeschlossen wird. Weil die Genome eine bekannte Größe aufweisen, können Standard Normalisierungsverfahren angewendet werden, um sicherzustellen, dass die Konzentration des Genoms eines Organismus nicht proportional größer ist als jene eines Genoms eines anderen Organismus. Solche Verfahren zum Angleichen genomischer Konzentrationen sind dem Fachmann gut bekannt und schließen beispielsweise die Zugabe von proportional mehr DNA zu dem Pool von Genomen, die größer sind, ein, um die Tendenz von Fragmenten aus solchen Genomen zu kompensieren, die unterrepräsentiert sind, wenn eine gleiche Menge von DNA von jedem Genom kombiniert wird. Zusätzlich ist die Normalisierung durch andere Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, wie in dem US Patent 5,763,239 offenbart, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung versucht, den Evolutionsvorgang durch künstliches Kombinieren von Domänen von verschiedenen Genomen, von denen es unwahrscheinlich ist, dass sie sich gleichzeitig entwickeln, zu beschleunigen. Vorzugsweise werden die genomischen Expressionsbibliotheken aus evolutionär ver schiedenen Organismen hergestellt. Zum Beispiel können die Organismen entweder abgeleitet sein von: kompakten eukaryonten Genomen, wie Fugu rubripes, Caenorhabditis elegans, Saccharomyces cerevisiae; und/oder von prokaryonten Mikroorganismen, die genetisch charakterisiert wurden, wie E. coli, Aquifex aeliticus, Methanococcus jannaschii, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Neisseria meningiditis, Synechocystis sp Bordetella pertussis, Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, Borellia burgdorferi, Methanobacterium thermoautotrophicum, Mycoplasma pneumoniae, Archaeoglobus fulgidis und Vibrio harveyi. Der Fachmann ist sich bewusst, dass die Zahl der sequenzierten Genome schnell ansteigt. Zusammenstellung von sequenzierten Genomen können einfach durch Bezug auf das weltweite Netz erhalten werden (z.B. siehe die folgenden URLs hinsichtlich Details):
http://www.tigr.org./tdb/mdb/html
http://www.sanger.ac.uk
http://www.genome.ad.jp/kegg/java/org_proj.html
http://www-fp.mcs.anl.gov/~gaasterland/genomes.html
http://www.ncgr.org/
http://www.cbs.dtu.dk/databases/DOGS/index.html
http.//geta.life.uiuc.edu/~nikos/genomes.html
und dass die hier beschriebenen Verfahren auf irgendeinen Untersatz des gesamten Pools der sequenzierten Genome anwendbar sind.
Die definierte Nukleotidsequenz, von der die bekannte Nukleotidsequenz abgeleitet ist, ist nicht nur auf jene Sequenzen beschränkt, die Aminosäuren in natürlich abgeleiteten Proteinen kodieren, sondern sie schließen auch nicht kodierende Nukleotidsequenzen ein. Somit sollte verstanden werden, dass die zweite Nukleotidsequenz von einem 5' UTR, einem Intron (wo anwendbar), einem 3' UTR oder alternativen Leserahmen/Orientierungen des klonierten Fragments abgeleitet sein können.
Diversität innerhalb eines Pools von sequenzierten Nukleotidsequenzen kann auch erweitert werden, indem die Sequenzen Verfahren unterworfen werden, die diese Fragmente falsch lesen oder mutieren. Somit kann, in einer Ausführungsform der Erfindung, das Verfahren auch einen Schritt des künstlichen Mutierens der Domänenbibliotheken einschließen. Solche Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
Ein Weg, um dieses Ziel zu erreichen, würde die Mutation der bekannten genomischen Sequenz vor der Insertion in einen Expressionsvektor einschließen. Somit kann, in einer bevorzugten Form, das erfindungsgemäße Verfahren den Schritt einschließen: Unterwerfen der bekannten Nukleotidsequenz gegenüber Mutagenese vor der Insertion in den Expressionsvektor. Dies kann zum Beispiel durch Amplifizieren der sequenzierten Genome unter Verwendung von mutagenen PCR Verfahren erreicht werden, wie jene, die den Schritt des Durchführens der PCR Reaktion in der Anwesenheit von Mangan einschließen. Es wurde mit einer Fehlerrate von 0,5 Basen pro 100 bp/Zyklus berechnet, das acht mutagene Zyklen Basenaustausche in 90% der PCR Produkte bilden werden, und fast 50% werden 2 oder 3 Substitutionen aufweisen.
Ein anderer Weg, über den die Domänenbibliotheken mutiert werden können, wäre durch Expression von Nukleotidfragmenten in Zellen, die modifiziert sind, um Sequenzinformation zu mutieren. Solche Stämme sind in gewissen Enzymen defizient, was ihre Mutationsrate ungefähr 5.000- bis 10.000-fach höher macht als in dem Wildtyp Ausgangsstamm. Somit kann das Verfahren den Schritt einschließen: Exprimieren der biodiversen Genfragmente in einer oder mehreren Zelllinien, die in mindestens einem DNA-Reparaturenzym defizient ist/sind. Wenn sie einmal konstruiert ist, kann die Plasmid Bibliothek zum Beispiel in bakteriellen Stämmen amplifiziert werden, die in der Fehlpaarungsreparatur (z.B. Stämme mit der mutS, mutD und/oder mutT Mutation) amplifiziert werden, was zu der Bildung von Mutationen führt. In einem Beispiel dieser Ausführungsform werden Peptid Bibliotheken, die von der Expression von genomischer DNA abgeleitet sind, in bakteriellen Stämmen amplifiziert oder vermehrt, die defizient in der Epsilon (ε) Untereinheit der DNA Polymerase III (d.h. dnaQ und mutD Allele) und/oder defizient in der Fehlpaarungsreparatur sind. Die Escherichia coli Mutatorstämme, welche die mutY und/oder mutM und/oder mutD und/oder mutTK und/oder mutA und/oder mutC und/oder mutS Allele besitzen, sind besonders nützlich für solche Anwendungen. Bakterielle Stämme, die solche Mutationen tragen, sind für den Fachmann einfach erhältlich.
Wo Fragmente vor der Bildung einer Expressionsbibliothek mutiert werden, sollten sowohl mutierte als auch nicht mutierte Fragmente vorzugsweise in derselben Präparation kombiniert werden, und sie werden vorzugsweise unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren exprimiert. Die mutierten und nicht mutierten Bibliotheken werden dieselben Selektionsvorgänge durchlaufen. Die Spezifität und biologische Aktivität der Peptide sollte anschließend verglichen und untersucht werden.
Um die Diversität innerhalb der sequenzierten genomischen Peptid Bibliothek zu erhöhen, können die fragmentierten sequenzierten Genome auch in jedem ihrer verschiedenen Leserahmen exprimiert werden. Die Expression von solchen Sequenzen in dieser Weise kann durch irgendein Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, erreicht werden, einschließlich zum Beispiel Ligieren der Fragmente an Adaptoren und/oder Linker in den drei verschiedenen Leserahmen oder durch Anordnen der Fragmente unter der Kontrolle (einer)/von internen ribosomen Eintrittsstelle(n) (IRES) und/oder Sequenzen, die transkriptionales/translationales Verrutschen verleihen. Wenn Adaptoren verwendet werden, kann ein einzelner Vektor jeden der verschiedenen Adaptoren enthalten, oder jeder Adaptor kann in einem anderen Vektor bereitgestellt werden.
Die Fragmente können auch in den reversen Leserahmen exprimiert werden. Wenn somit die Expression einer Gensequenz in jedem möglichen Leserahmen ermöglicht wird, gibt es für irgendeine bestimmte Peptid Sequenz sechs verschiedene mögliche Kombinationen.
Die Anwesenheit von Klonen in allen Leserahmen erlaubt das gleichzeitige Screenen von zufälligen Peptiden, die in Leserahmen exprimiert werden, die in der Natur nicht vorkommen, zusammen mit einer Vielzahl von natürlichen Peptid Domänen, die in dem geeigneten Leserahmen kloniert sind. Dies erlaubt einen Vergleich des relativen Erfolgs der Isolierung von Inhibitoren aus natürlichen Peptid Bibliotheken, im Gegensatz zu zufälligen Peptid Bibliotheken. Die hier beschriebenen Screening Verfahren sind auch auf das Screenen von Bibliotheken von begrenzten oder nicht begrenzten zufälligen Peptiden, die von künstlichen, nicht biologischen Quellen abgeleitet sind, anwendbar.
Definitionen
So wie hier verwendet, soll der Satz "normalerweise nicht assoziiert in seiner natürlichen Umgebung" eine Aktivität betreffen, mit der die Aminosäuresequenz nicht typischerweise assoziiert ist. Weiterhin, so wie hier verwendet, soll "natürliche Umgebung" derart verstanden werden, dass sie die biologische Umgebung, in der die Aminosäuresequenz typischerweise in der Natur gefunden wird, betrifft.
So wie hier verwendet, soll der Begriff "Domäne" so verstanden werden, dass er eine funktionale Einheit einer/von Aminosäuresequenz(en), die Aktivität in Isolierung oder in einem künstlichen Zusammenhang besitzt/besitzen, bedeutet, und er schließt nicht notwendigerweise irgendwelche strukturellen Merkmale ein.
So wie hier verwendet, soll "Aminosäuresequenz" Peptide, Oligopeptide und Polypeptide einschließlich Derivate und Analoga davon, einschließen, die eine Zahl von Resten im Bereich von 1 bis 500 umfassen.
So wie hier verwendet, soll der Begriff "Aptamer" verstanden werden, dass er die hochspezifischen, normalerweise bezüglich der Konformation eingegrenzten Peptide, die mit der Klasse in Verbindung stehen, die von Brent und Kollegen (3) beschrieben wurde, umfasst.
So wie hier verwendet, soll der Begriff "Aktivität" so verstanden werden, dass er irgendeine enzymatische Aktivität, strukturelle oder Konformationsänderung, die innerhalb oder außerhalb der Zelle stattfindet, einschließt.
So wie hier verwendet, soll der Begriff "Genfragment Expressionsbibliothek" so verstanden werden, dass er irgendwelche Expressionsbibliotheken einschließt, die unter Verwendung von Inserts hergestellt wurden, die von genomischen Fragmenten oder PCR Produkten einer Vielzahl von verschiedenen prokaryonten Genomen und/oder kompakten eukaryonten Genomen abgeleitet sind.
So wie hier verwendet, soll der Begriff "Derivat" so verstanden werden, dass er Mutanten, Teile oder Fragmente eines vollständigen Polypeptids, so wie hier definiert, die funktional äquivalent sind, betrifft. Derivate schließen modifizierte Peptide ein, in denen Liganden mit einer oder mehreren der Aminosäurereste, die darin enthalten sind, verknüpft sind, wie funktionale Gruppen, Kohlenhydrate, Enzyme, Proteine, Polypeptide oder Reportermoleküle, wie Radionuklide oder Fluoreszenzverbindungen. Glykosylierte, fluoreszierende, acylierte oder alkylierte Formen der gegenständlichen Peptide sind auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Verfahren zur Derivatisierung von Proteinen und Peptiden sind im Stand der Technik gut bekannt.
"Analoga" eines Peptids, Proteins, Polypeptids oder Enzyms sind funktional äquivalente Moleküle, die eines oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäureanaloga aufweisen, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Die Begriffe "Wirt" und "zellulärer Wirt" oder ähnliche Begriffe betreffen prokaryonte und eukaryonte Zellen, die in der Lage sind, die Expression eines Reportermoleküls unter der Kontrolle einer biologischen Aktivität zu unterstützen, unabhängig davon ob die biologische Aktivität oder das Reportermolekül in der Zelle endogen ist oder nicht.
Der Fachmann wird erkennen, dass eine "transformierte Zelle" eine Zelle ist, in die eine exogene Nukleinsäure eingeführt wurde, wobei die exogene Nukleinsäure entweder in das Wirtszellgenom integriert ist, oder alternativ dazu, darin als ein extra chromosomales genetisches Element, wie unter anderem ein Plasmid, Episom oder künstliches Chromosom aufrechterhalten wird.
Die erfindungsgemäße transformierte Zelle kann irgendeine Zelle ein, die in der Lage ist, die Expression von exogener DNA zu unterstützen, wie eine bakterielle Zelle, Insektenzelle, Hefezelle, Säugerzelle oder Pflanzenzelle. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Zelle eine bakterielle Zelle, Säugerzelle oder eine Hefezelle. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Zelle eine Hefezelle.
Der Begriff "Expression" betrifft mindestens die Transkription einer Nukleotidsequenz, um ein RNA Molekül herzustellen. Der Begriff "Expression" kann auch die kombinierte Transkription und Translation einer Nukleotidsequenz, um ein Peptid, Polypeptid, Protein oder Enzymmolekül herzustellen, oder alternativ dazu, den Vorgang der Translation von mRNA, um ein Peptid, Polypeptid, Protein oder Enzymmolekül herzustellen, betreffen.
Unter "funktional unter der Kontrolle" wird verstanden, dass ein gegebener erster Parameter durch einen gegebenen zweiten Parameter reguliert oder kontrolliert wird.
Im vorliegenden Zusammenhang, wo die Expression des Reportermoleküls funktional unter der Kontrolle einer biologischen Aktivität ist, ist die Expression modifiziert (d.h. verstärkt, induziert, aktiviert, verringert oder reprimiert), wenn ein Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das in der Lage ist, die Bildung der biologischen Aktivität zu verstärken, zu induzieren, zu aktivieren, zu verringern oder zu reprimieren, exprimiert wird. Folglich ist es für gewöhnlich nicht ausreichend, wenn nur ein Partner in der biologischen Aktivität anwesend ist, damit eine solche modifizierte Expression des Reportermoleküls stattfindet, jedoch kann es einige Expression des Reportermoleküls in der Anwesenheit von nur einem Partner geben.
So wie hier verwendet, ist der Begriff "Peptid Bibliothek" ein Satz von verschiedenen Nukleotidsequenzen, der einen Satz von Aminosäuresequenzen kodiert, wobei die Nukleotidsequenzen vorzugsweise in einem geeigneten Plasmid, Cosmid, Bakteriophagen oder Virusvektormolekül enthalten sind, das für die Aufrechterhaltung und/oder Replikation in einem zellulären Wirt geeignet ist. Der Begriff "Peptid Bibliothek" umfasst weiterhin zufällige Aminosäuresequenzen, die von einer bekannten genomischen Sequenz abgeleitet sind, wobei die Aminosäuresequenzen von einer zweiten Nukleotidsequenz kodiert werden, die zum Beispiel durch Scheren oder teilweise Spaltung von genomischer DNA unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen oder Nukleasen DNase1, wie unter anderen Ansätzen, erhalten werden.
Bevorzugte Peptid Bibliotheken gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung sind "repräsentative Bibliotheken", die einen Satz von Aminosäuresequenzen oder Nukleotidsequenzen, welche dieselben kodieren, umfassen, was praktisch alle möglichen Kombinationen von Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen für eine zuvor definierte und spezifische Länge von jeweils Peptid- oder Nukleinsäuremolekül einschließt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Peptid Bibliothek Zellen, Viruspartikel oder Bakteriophagenpartikel, die einen vielfältigen Satz von Nukleotidsequenzen umfassen, die einen vielfältigen Satz von Aminosäuresequenzen kodieren, wobei die Mitglieder dieses vielfältigen Satzes von Nukleotidsequenzen funktional unter der Kontrolle einer Promotorsequenz angeordnet sind, die in der Lage ist, die Expression der Nukleotidsequenz in der Zelle, dem Viruspartikel oder dem Bakteriophagenpartikel zu steuern.
Folglich kann die Aminosäuresequenz, die durch die zweite Nukleotidsequenz kodiert wird, irgendeine Sequenz von Aminosäuren mit mindestens ungefähr 1 bis 100 Aminosäuren in der Länge und vorzugsweise 1 bis 60 Aminosäuren in der Länge umfassen, und kann von der Expression von bekannten Nukleotidsequen zen abgeleitet sein, die durch eines einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, wie zum Beispiel zufällige synthetische Herstellung. Weiter bevorzugt ist die Peptid Einheit ein 6 bis 20 Aminosäuren Peptid. Die Verwendung von größeren Nukleotidfragmenten, insbesondere der Einsatz von zufällig gescherter Nukleinsäure, die von bakteriellen, Hefe oder tierischen Genomen abgeleitet ist, ist nicht ausgeschlossen.
Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Aminosäuresequenz als ein Fusionsprotein mit einem nukleären Zielmotiv exprimiert werden, das in der Lage ist, das Targeting des Peptids in den Kern der Wirtszelle, wo Transkription stattfindet, zu erleichtern, insbesondere das SV40 nukleäre Lokalisationssignal, das in Hefe und Säugerzellen funktional ist.
Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Aminosäuresequenz als ein Fusionsprotein mit einer Peptidsequenz exprimiert werden, die in der Lage ist, die Penetration oder die Aufnahme des Peptids durch eine isolierte Zelle zu verstärken, zu steigern oder ihr zu helfen, wie wenn die gegenständliche Aminosäuresequenz ex vivo synthetisiert und zu isolierten Zellen in Kultur hinzugefügt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Peptid Sequenz, die in der Lage ist, die Penetration oder Aufnahme zu verstärken, zu steigern oder ihr zu helfen, funktional in höheren eukaryonten Zellen; zum Beispiel die Drosophila Pentrationstargeting Sequenz. Gemäß dieser Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein mindestens die Aminosäuresequenz:
oder ein Homolog, Derivat oder Analog davon, wobei Xaa irgendein Aminosäurerest ist und n einen Wert von größer als oder gleich 1 aufweist. Vorzugsweise wird der Wert von n mindestens 5, weiter bevorzugt zwischen ungefähr 5 und ungefähr 20, noch weiter bevorzugt zwischen ungefähr 15 und ungefähr 35 und noch weiter bevorzugt zwischen ungefähr 30 und ungefähr 50 und noch weiter bevorzugt zwischen ungefähr 35 und ungefähr 55 liegen. In einer noch weiter bevorzugten Aus führungsform liegt der Wert von n zwischen mindestens ungefähr 40 und mindestens ungefähr 60.
Die Bezugnahme hier auf einen "Promotor" soll in ihrem breitesten Zusammenhang verstanden werden und schließt die transkriptionalen regulatorischen Sequenzen eines klassischen genomischen Gens, einschließlich der TATA Box, die für die akkurate Transkriptionsinitiation in eukaryonten Zellen benötigt wird, mit oder ohne einer CCAAT Box Sequenz und zusätzlichen regulatorischen Elementen (d.h. oberhalb liegende aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer), ein. Promotoren können auch kein TATA Box Motiv aufweisen, jedoch umfassen sie eines oder mehrere "Initiatorelemente" oder, wie in dem Fall von Hefe abgeleiteten Promotorsequenzen, umfassen einen oder mehrere "oberhalb gelegene Aktivatorsequenzen" oder "UAS" Elemente. Für die Expression in prokaryonten Zellen, wie Bakterien, sollte der Promotor mindestens die -35 Box und -10 Box Sequenzen enthalten.
Ein Promotor ist für gewöhnlich oberhalb oder 5' eines Strukturgens angeordnet, dessen Expression er reguliert. Weiterhin sind die regulatorischen Elemente, die einen Promotor umfassen, für gewöhnlich innerhalb von 2 kb der Startstelle der Transkription des Gens angeordnet.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff "Promotor" auch verwendet, um ein synthetisches oder Fusionsmolekül oder Derivat zu beschreiben, das die Expression des gegenständlichen Reportermoleküls in einer Zelle verleiht, aktiviert oder verstärkt. Bevorzugte Promotoren enthalten zusätzliche Kopien von einem oder mehreren spezifischen regulatorischen Elementen, um die Expression des Gens weiter zu verstärken und/oder um die räumliche Expression und/oder temporäre Expression zu verändern. Zum Beispiel können Hefe regulatorische Elemente, die Galactose, Phosphat oder Kupfer Induzierbarkeit verleihen, benachbart zu einer heterologen Promotorsequenz angeordnet werden, welche die Expression des Reporters antreibt, wodurch eine konditionale Induzierbarkeit der Expression des Gens durch das Hinzufügen des geeigneten Induktors zu dem Wachstums medium verliehen wird.
Anordnen eines Gens funktional unter der Kontrolle einer Promotorsequenz bedeutet, dass das Gen positioniert wird, so dass seine Expression durch die Promotorsequenz kontrolliert wird. Promotoren sind normalerweise 5' (oberhalb) zu den Genen positioniert, die sie kontrollieren. Bei der Konstruktion von heterologen Promotor/Strukturgen Kombinationen ist es allgemein bevorzugt, den Promotor in einer Entfernung von der Gentranskriptions Startseite zu positionieren, dies ist ungefähr die gleiche, wie die Entfernung zwischen diesem Promotor und dem Gen, das er in seiner natürlichen Umgebung kontrolliert; d.h. das Gen, von dem der Promotor abgeleitet ist. Wie im Stand der Technik bekannt ist, kann einige Schwankung in dieser Entfernung ohne Verlust der Promotorfunktion angepasst werden. Genauso ist die bevorzugte Positionierung eines regulatorischen Sequenzelements bezüglich eines heterologen Gens, das unter seiner Kontrolle angeordnet werden soll, durch die Positionierung des Elements in seiner natürlichen Umgebung definiert, d.h. der Gene, von denen es abgeleitet ist. Wie wiederum im Stand der Technik bekannt ist, kann einige Schwankung in dieser Entfernung ebenfalls stattfinden.
Beispiele von Promotoren, die zur Verwendung in der Regulation der Expression des Reportermoleküls und/oder der Aminosäuresequenz und/oder der Polypeptid Bindungspartner in einer Zelle geeignet sind, schließen virale, Pilz, Hefe, Insekten, tierische und von Pflanzen abgeleitete Promotoren ein. Bevorzugte Promotoren sind in der Lage, Expression in einer eukaryonten Zelle zu vermitteln, insbesondere einer Hefe- und Säugerzelle. Der Promotor kann die Expression eines Gens konstitutiv oder differenziell bezüglich des Gewebes, in der die Expression stattfindet, oder bezüglich der Entwicklungsstufe, zu der die Expression stattfindet, oder als Antwort auf externe Stimuli, wie unter anderem Umweltstress oder Hormone, regulieren.
Besonders bevorzugte Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung schließen jene natürlich auftretende und synthetische Promotoren ein, die Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren enthalten, weiter bevorzugt für Helix-Loop(Schleife)-Helix (HLH) Transkriptionsfaktoren, Zinkfingerproteine, Leucinzipperproteine und ähnliches. Bevorzugte Promotoren können auch synthetische Sequenzen sein, die eine oder mehrere oberhalb gelegene Operatorsequenzen umfassen, wie LexA Operatorsequenzen oder aktivierende Sequenzen, die von irgendeinem der Promotoren abgeleitet sind, auf die hier Bezug genommen wird, wie GAL4 DNA Bindungsstellen.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Wahl des Promotors von der Natur der Zelle, die transformiert wird und von dem Molekül, das exprimiert wird, abhängt. Solche Personen werden einfach in der Lage sein, funktionale Kombinationen von minimalen Promotorsequenzen und Operatoren für die Zelltypen zu bestimmen, in denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein Hefepromotor, Säugerpromotor, eine bakterielle oder Bakteriophagen Promotorsequenz, die ausgewählt ist aus der Liste, die GAL1, CUP1, PGK1, ADH2, PHO5, PRB1, GUT1, SP013, ADH1, CMV, SV40, T7, SP6, lac oder tac Promotorsequenzen umfasst.
Während die Erfindung vorzugsweise in Hefezellen durchgeführt wird, ziehen die Erfinder eindeutig in Erwägung, dass Modifikationen umfasst sind, in denen die Erfindung vollständig in Säugerzellen durchgeführt wird, unter Verwendung von Promotoren, die funktional in Säugerzellen sind, um die Expression der verschiedenen Assay Bestandteile anzutreiben, in Kombination mit einem entgegengesetzt gerichteten selektiven Reportergen, das funktional in Säugerzellen ist. Solche Ausführungsformen sind innerhalb des Könnens des Fachmanns.
Für die Expression in Säugerzellen ist es bevorzugt, dass der Promotor die CMV Promotorsequenz ist, weiter bevorzugt der CMV-IE Promotor oder alternativ der SV40 Promotor und insbesondere die SV40 späte Promotorsequenz. Diese und andere Promotorsequenzen, die für die Expression von Genen in Säugerzellen geeignet sind, sind im Stand der Technik gut bekannt.
Beispiele von Säugerzellen, die hier umfasst sind, die für die Expression geeignet sind, schließen COS, VERO, HeLa, Maus C127, chinesische Hamsterovar (CHO), WI-38, Babyhamsternieren (BHK) oder MDCK Zelllinien unter anderem ein. Eine große Vielzahl von Zelllinien wie diese sind für den Fachmann einfach erhältlich.
Die Voraussetzung zur Herstellung intakter Polypeptide in bakteriellen Zellen und insbesondere in Escherichia coli Zellen, ist die Verwendung eines starken Promotors mit einer wirksamen Ribosomen Bindestelle, wie der Shine-Dalgarno Sequenz, die in Expressionsvektoren eingebaut werden kann, welche die erste und die zweite Nukleotidsequenz oder andere genetische Konstrukte, die zur Durchführung der verschiedenen alternativen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, tragen. Typische Promotoren, die für die Expression in bakteriellen Zellen, wie E. coli geeignet sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf den lacZ Promotor, Temperatur sensitive λ_L oder λ_K Promotoren, SP6, T3 oder T7 Promotoren oder zusammengesetzte Promotoren, wie der IPTG induzierbare tac Promotor. Eine Vielzahl anderer Vektorsysteme zur Expression des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls in E. coli sind im Stand der Technik gut bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in Ausubel et al. (1987) und/oder Sambrook et al. (1989). Zahlreiche Quellen von genetischen Sequenzen, die für die Expression in Bakterien geeignet sind, stehen auch öffentlich in verschiedenen Plasmidkonstrukten zur Verfügung, wie zum Beispiel unter anderem, pKC30 (λ_L), pKK1733 (tac), pET-3 (T7) oder die pQE Serie von Expressionsvektoren.
Geeignete prokaryonte Zellen zur Expression schließen unter anderem Staphylococcus, Corynebacterium, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus sp. und Pseudomonas sp. ein. Bakterielle Stämme, die für den vorliegenden Zweck geeignet sind, sind im relevanten Stand der Technik gut bekannt.
Wo es beabsichtigt ist, dass der Promotor die Expression des Reportermoleküls reguliert, ist es besonders bevorzugt, dass der Promotor eine oder mehrere Er kennungssequenzen für die Bindung einer DNA Bindungsdomäne einschließt, die von einem Transkriptionsfaktor abgeleitet ist, zum Beispiel eine GAL4 Bindungsstelle oder eine LexA Operatorsequenz.
So wie hier verwendet, soll der Begriff "Reportermolekül" verstanden werden, dass er irgendein Molekül betrifft, das in der Lage ist, ein identifizierbares oder nachweisbares Ergebnis zu liefern.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Reportermolekül ein Enzym, Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das ein sichtbares Produkt umfasst, oder mindestens, wenn es in Anwesenheit eines Substratmoleküls inkubiert wird, das Substrat in ein sichtbares Produkt umwandeln kann, so dass Zellen, die das Reportermolekül exprimieren, einfach nachgewiesen werden können. Zum Beispiel kann die Expression von Reportergenen, die Polypeptide kodieren, die selbst fluoreszieren, oder die bewirken, dass ein zweites Molekül fluoresziert, funktional mit der biologischen Aktivität, die untersucht wird, verbunden werden, um den Nachweis von Zellen zu erleichtern, in denen die Expression des Reportermoleküls anwesend oder abwesend ist. Solche Anwendungen sind insbesondere in High Throughput Arzneimittel Screening Ansätzen nützlich, wo es gewünscht ist, schnell eine große Anzahl von Arzneimittel Kandidaten hinsichtlich ihrer agonistischen/antagonistischen Eigenschaften bezüglich der fraglichen biologischen Aktivität zu screenen. Bevorzugte Reportermoleküle gemäß dieser Ausführungsform schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf das Escherichia coli β-Galactosidase Enzym, das Firefly Luciferase Protein und das grün fluoreszierende Protein oder Mutanten davon, die rot verschobene oder blau verschobene Emissionsspektren oder verstärkten Output besitzen. Dem Fachmann ist bekannt, wie er genetische Sequenzen, die solche Reportermoleküle kodieren, bei der Durchführung der hier beschriebenen Erfindung ohne unzumutbare Versuche verwenden kann. Zum Beispiel kann die kodierende Sequenz des Gens, das für ein solches Reportermolekül kodiert, zur Verwendung in der interessierenden Zelllinie (z.B. menschliche Zellen, Hefezellen) in Übereinstimmung mit bekannten Codon Nutzungspräferenzen modifiziert sein. Zusätzlich kann die Translationseffizienz von mRNA, die von nicht eukaryonten Quellen abgeleitet ist, durch Mutieren der korrespondierenden Gensequenz oder durch anderweitiges Einführen einer Kozak Konsensus Translationsinitiationsstelle in die Gensequenz verbessert werden.
Vorzugsweise erlaubt das Reportermolekül kolorimetrische Identifizierung seiner Expression entweder durch direkte Fluoreszenz (z.B. grünes fluoreszierendes Protein) oder durch eine Farbänderung in der Anwesenheit eines geeigneten Substrats (z.B. die Herstellung einer blauen Farbe mit β-Galactosidase in der Anwesenheit des Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-galactosid (d.h. X-GAL).
Besonders bevorzugte Reportermoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung, sind jene, die ein verändertes Zellwachstum oder Überlebensfähigkeit, einschließlich der Fähigkeit, Zelltod zu induzieren, liefern. Im vorliegenden Zusammenhang umfasst das Reportermolekül entweder das erste Nukleinsäuremolekül oder es wird von dem ersten Nukleinsäuremolekül kodiert. Folglich ist dem Fachmann bekannt, dass das Reportermolekül einer solchen Ausführungsform vorzugsweise ein Peptid, Polypeptid, Enzym, Abzym oder ein anderes Proteinmolekül, oder alternativ, ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ist.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Reportermolekül in der Lage, direkt oder indirekt das Wachstum und/oder die Überlebensfähigkeit der Wirtszelle zu inhibieren, zu verstärken oder auf andere Weise zu modulieren. Eine direkte Modulation des Zellwachstums und/oder der Überlebensfähigkeit liegt vor, wenn die Expression des Reportermoleküls eine direkte Konsequenz auf das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit besitzt. Indirekte Modulation von Zellwachstum und/oder Überlebensfähigkeit liegt vor, wo die Expression des Reportermoleküls keine direkte Konsequenz auf das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit hat, jedoch kann die Expression unter anderem das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit modulieren, wenn die Zellen in der Anwesenheit eines geeigneten Cofaktors oder Substratmoleküls kultiviert werden.
Wo das Reportermolekül ein Peptid, Polypeptid, Enzym, Abzym oder ein anderes Proteinmolekül ist, das eine zytostatische Verbindung, antimitotische Verbindung, ein Toxin, Mitogen oder eine wachstumsregulatorische Substanz, wie ein Hormon oder ein Protein, das essenziell für das Zellwachstum oder die Überlebensfähigkeit ist, umfasst, kann es eine direkte Wirkung auf das Zellwachstum oder die Überlebensfähigkeit haben, wenn es darin exprimiert wird. Genauso kann ein Reportermolekül, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, eine direkte Wirkung auf das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit haben, zum Beispiel wenn das Reportermolekül eine Ribozym, ein Antisense Molekül, Minizym oder Cosuppressionsmolekül ist, das auf die Expression eines Gens abzielt, das in der Lage ist, das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit zu modifizieren.
Wo es für das Reportermolekül wünschenswert ist, dass es eine indirekte Wirkung auf das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit hat, kann dies zum Beispiel durch gekoppelte Expression des Reportermoleküls mit der Herstellung einer zytostatischen Verbindung, antimitotischen Verbindung, Toxin oder einem negativen wachstumsregulatorischen Molekül erreicht werden.
In einer Ausführungsform ist das Reportermolekül ein Enzym, das, wenn es in der Wirtszelle exprimiert wird, die Umsetzung eines Substratmoleküls katalysiert, das nicht in der Lage ist, das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit zu verändern oder zu beeinflussen, um ein Produkt herzustellen, das ein Toxin, eine zytostatische Verbindung oder eine antimitotische Verbindung umfasst. Gemäß dieser Ausführungsform führt die Expression des Reportermoleküls in der Anwesenheit des Substrats zur Herstellung einer ausreichend hohen Konzentration des Toxins, der zytostatischen Verbindung oder der antimitotischen Verbindung, um das Zellwachstum zu verringern oder zu Zelltod zu führen.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Reportermolekül ein Enzym, das, wenn es in der Wirtszelle exprimiert wird, die Umwandlung eines zytostatischen oder antimitotischen Substratmoleküls katalysiert, um ein Produkt herzustellen, das nicht in der Lage ist, das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit zu modifizieren. Gemäß dieser Ausführungsform wachsen Zellen, die in der Anwesenheit des Substratmoleküls inkubiert werden, nicht oder sie teilen sich nicht so schnell wie Zellen, die nicht damit inkubiert werden. Dem gegenüber wird in Zellen, die in der Anwesenheit des zytostatischen oder antimitotischen Substratmoleküls das Reportermolekül exprimieren, die Zellteilung und/oder das Zellwachstum wieder aufgenommen, wenn die Konzentration des Substrats in der Zelle verringert wird.
In einer alternativen Ausführungsform verstärkt das Reportermolekül direkt oder indirekt das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit, zum Beispiel durch gekoppelte Expression des Reportermoleküls mit der Herstellung eines Mitogens oder eines positiven wachstumsregulatorischen Moleküls.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Reportermolekül ein Enzym, das, wenn es in der Wirtszelle exprimiert wird, die Umwandlung einer ersten Verbindung katalysiert, die inaktiv in der Modulation des Zellwachstums und/oder der Überlebensfähigkeit ist, um ein Mitogen oder ein positives wachstumsregulatorisches Molekülprodukt herzustellen. Gemäß dieser Ausführungsform wachsen Zellen, die in der Anwesenheit des Substratmoleküls inkubiert werden, und teilen sich in einer normalen Geschwindigkeit, im Vergleich zu anderen Zellen. Die Expression des Enzym Reportermoleküls in der Anwesenheit des Substratmoleküls führt zu verstärktem Zellwachstum und/oder Zellteilung, weil die Konzentration des Mitogens oder positiven wachstumsregulatorischen Moleküls in der Zelle erhöht ist. Als eine Konsequenz wachsen Zellen, in denen das Reportermolekül als ein Ergebnis der biologischen Aktivität erhöht ist, schneller und/oder teilen sich schneller als die umgebenden Zellen in der Bibliothek, was ihren Nachweis erleichtert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäuresequenz, die unter Verwendung des obigen Verfahrens identifiziert wurde, in der Lage, die Expression des Reportermoleküls zu modulieren. Folglich kann die Aminosäuresequenz ein Agonist oder ein Antagonist der biologischen Aktivität sein, unter deren Expression das Reportermolekül funktional angeordnet ist. Wo die Aminosäuresequenz ein agonistisches Molekül ist, wird die Reportermolekül Expression gesteigert oder verstärkt oder aktiviert sein, und abhängig davon ob das Reportermo lekül direkt oder indirekt das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit steigert oder reduziert oder nicht, wird jeweils das Zellwachstum gesteigert oder verringert sein. In solchen Ausführungsformen der Erfindung ist es jedoch eindeutig unerwünscht, dass das Reportermolekül zu Zelltod führt, weil es nicht möglich wäre, die Zellen, die das gewünschte Peptid exprimieren, zu gewinnen. Wo die Aminosäuresequenz ein Antagonist der biologischen Aktivität ist, wird die Reportermolekül Expression verringert oder reprimiert oder inaktiviert sein, und, abhängig ob das Reportermolekül direkt oder indirekt das Zellwachstum und/oder die Überlebensfähigkeit steigert oder reduziert oder nicht, wird das Zellwachstum jeweils reduziert oder gesteigert sein. Wo das Reportermolekül direkt oder indirekt zu Zelltod führt, erleichtert der Antagonismus der biologischen Aktivität durch die antagonistische Aminosäuresequenz das Überleben der Zellen im Vergleich zu Zellen, die den Antagonist nicht exprimieren, aber das Reportermolekül exprimieren.
Beispiele von geeigneten Hefe positiv selektierbaren Reportergenen (geeignet für die Isolierung von Peptid Agonisten) schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf HIS3 und LEU2, deren Protein Produkte es Zellen, die diese Reportergene exprimieren, erlauben auf geeignetem Zellkulturmedium zu überleben. Umgekehrt existieren einige Hefe gegenselektierbare Reportergene (geeignet für die Isolierung von Peptid Antagonisten), einschließlich dem URA3 Gen, wobei URA3 Expression toxisch für eine Zelle ist, die dieses Gen in der Anwesenheit des Arzneimittels 5-Fluororotsäure (5FOA) exprimiert. Andere gegenselektierbare Reportergene schließen CYH1 und LYS2 ein, die jeweils Letalität in der Anwesenheit der Arzneimittel Cycloheximid und alpha Aminoadipat (αAA) verleihen. Für die Gegenselektion in Bakterien sind korrespondierende Reportergene, die toxische Produkte kodieren, verfügbar, einschließlich: SacB, CcdB und das Säuger GATA-1 Gen, dessen Expression in E. coli toxisch ist.
Es werden Standard Verfahren verwendet, um die erste und zweite Nukleotidsequenz in den zellulären Wirt einzuführen. Im Fall von Hefezellen kann dies durch Verschmelzen (Mating) im großen Maßstab oder Transformation erreicht werden.
In einer Ausführungsform sind die erste und die zweite Nukleotidsequenz jeweils innerhalb eines getrennten genetischen Konstrukts enthalten, das weiterhin ein selektierbares Markergen umfasst, um den Nachweis von transformierten Zellen zu erleichtern, zum Beispiel ein Antibiotikaresistenz selektierbares Markergen. Vorzugsweise sind die selektierbaren Markergene für jedes genetische Konstrukt unterschiedlich, so dass die Anwesenheit eines oder beider genetischer Konstrukte in einer einzelnen Zelle ermöglicht wird. Die erste und die zweite Nukleotidsequenz können somit in den zellulären Wirt durch Shotgun Cotransformation und Selektion auf einem geeigneten Medium, um hinsichtlich der Anwesenheit von beiden selektierbaren Markergenen zu selektieren, eingeführt werden.
Alternativ dazu kann die erste und die zweite Nukleinsäuresequenz durch sequenzielle Transformation eingeführt werden, die von Selektion hinsichtlich der geeigneten Markergene nach jedem Transformationsereignis begleitet wird.
Alternativ dazu kann die erste und die zweite Nukleotidsequenz in getrennte Populationen von Wirtszellen eingeführt werden, die anschließend verschmolzen werden, und jene Zellpopulationen, die beide Nukleotidsequenzen enthalten, werden auf Medien selektiert, die das Wachstum von Wirtszellen erlauben, die erfolgreich mit dem ersten und dem zweiten Nukleinsäuremolekül transformiert wurden.
Alternativ dazu kann die erste und die zweite Nukleotidsequenz auf einem einzigen genetischen Konstrukt enthalten sein und in die Wirtszellpopulation in einem einzigen Schritt eingeführt werden. In einer solchen Ausführungsform der Erfindung wird die zufällige Peptidbibliothek für gewöhnlich unter Verwendung eines Vektors hergestellt, der mindestens die erste Nukleotidsequenz funktional unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors mit oder ohne Operatorsequenz angeordnet, und ein selektierbares Markergen enthält, wobei die Insertionsstelle für die zweite Nukleotidsequenz derart ausgewählt ist, dass die eingebaute zweite Nukleotidsequenz exprimiert werden kann.
Diese Ausführungsformen können zusätzlich zu den Schritten, die in Verbindung mit dem Einführen von einer oder mehreren Nukleinsäuremolekülen durchgeführt werden müssen, die einen oder mehrere Polypeptid Bindungspartner der biologischen Aktivität kodieren, verwendet werden, wobei Variationen davon supra beschrieben sind.
Die gewählten Wirtszellen können auf Medien gescreent werden, welche die Bestandteile enthalten, die benötigt werden, um das gegenselektierbare Reportermolekül zu verwenden. Wirtszellen, die ein Peptid exprimieren, das die biologische Aktivität inhibiert, sind nicht in der Lage, das gegenselektierbare Reportergen adäquat zu transkribieren, wodurch es der Wirtszelle ermöglicht wird, in dem Selektionsmedium zu leben. Jene Wirtszellen, welche die Aminosäuresequenzen exprimieren, die nicht in der Lage sind, die biologische Aktivität zu inhibieren, transkribieren das Reportergen, was zu der Bildung eines Produkts führt, das toxisch auf die Wirtszelle in der Anwesenheit des Selektionsmediums ist.
Das genetische Konstrukt kann in der Form eines autonom replizierenden Vektors vorliegen oder kann genetische Sequenzen umfassen, welche die Integration in das Wirtszellgenom erleichtern.
Alternativ dazu kann die erste Nukleotidsequenz, die das Reportermolekül kodiert, in das Chromosom der Wirtszelle durch homologe Rekombination der Produkte der Polymerase Kettenreaktion (PCR) oder von Sequenzen auf einem anderen DNA Molekül, das nicht in der Lage ist, autonom in Hefezellen zu replizieren, integriert werden.
Gemäß der Natur der interessierenden biologischen Aktivität, kann die erste Nukleotidsequenz funktional in Zusammenhang mit irgendeiner Promotorsequenz angeordnet werden, die einzige Voraussetzung ist, dass der Promotor in der Lage ist, die Genexpression in der gewählten Wirtszelle zu regulieren. Für gewöhnlich wird die Wirtszelle variieren, um der Promotorsequenz zu entsprechen. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf die Isolierung von Peptiden, die in der Lage sind, irgendeine biologische Aktivität zu modulieren.
Tatsächlich wird die vorliegende Erfindung die Identifizierung und Isolierung von Aminosäuresequenzen erleichtern, welche die Expression eines Reportermoleküls modulieren oder vermitteln, indem irgendein regulatorischer Schritt, der benötigt wird, damit die Expression stattfindet, agonisiert oder antagonisiert wird, nicht nur Schritte, die später in dem Signaltransduktionsweg liegen, wie DNA-Protein Wechselwirkungen oder Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren. Wo es gewünscht ist, eine spezifische Aminosäuresequenz zu isolieren, die in der Lage ist, eine bestimmte biologische Aktivität zu modulieren, ist es nur notwendig, die Expression der ersten Nukleotidsequenz mit der interessierenden biologischen Aktivität funktional zu verbinden. Dies wird getan, indem die erste Nukleotidsequenz funktional in Verbindung mit einer Promotorsequenz angeordnet wird, die durch die biologische Aktivität reguliert wird, oder alternativ dazu durch genetisches Manipulieren einer Promotorsequenz, die funktional mit dem ersten Nukleinsäuremolekül verbunden ist, wodurch der Promotor unter funktionaler Kontrolle der biologischen Aktivität angeordnet wird.
In dem Fall von Aminosäuresequenzen, die eine Protein:DNA Wechselwirkung modulieren oder vermitteln, die für Genexpression oder die Modulation von Genexpression benötigt wird, zum Beispiel um ein Peptidmolekül zu isolieren, das direkt mit einem cis-wirkenden Enhancer oder Silencer Element wechselwirkt, oder ein Protein, an welches das Element bindet, kann dieses Ziel erreicht werden, indem das cis-wirkende Element in eine Promotorsequenz eingeführt wird, mit der die erste Nukleotidsequenz funktional verbunden ist. Auf diese Weise wird die Expression des Reportermoleküls funktional unter der Kontrolle des cis-wirkenden Elements angeordnet, und die Modulation der Genexpression wird stattfinden, wenn das geeignete Proteinmolekül entweder an das cis-wirkende DNA Element oder an das Protein, welches das Element erkennt, bindet.
Im Fall einer Protein:Protein Wechselwirkung kontrollierenden Genexpression, wird der Promotor, der die Expression des ersten Nukleinsäuremoleküls kontrolliert, ausgewählt, so dass er die notwendigen cis-wirkenden Elemente enthält, an welche mindestens eines der in die Wechselwirkung involvierten Proteine bindet. Wo keine vollständige Kenntnis der cis-wirkenden Sequenzen oder der trans-wirkenden Faktoren, die in die Regulation der Genexpression involviert sind, vorliegt, aber die Promotorsequenz und der Zelltyp, in dem die Expression stattfindet, bekannt sind, kann die erste Nukleotidsequenz funktional in Verbindung mit dieser Promotorsequenz angeordnet werden, und das resultierende Nukleinsäuremolekül kann in diesen Zelltyp eingeführt werden. Eine solche Beziehung bildet die Basis von "Two Hybrid" Screening Ansätzen. Wo das interessierende Peptid irgendeinen Schritt, der für die Expression oder die Aktivierung, Repression oder Verstärkung von Genexpression benötigt wird, antagonisiert oder agonisiert, wird die Wirkung durch Wahrnehmen einer veränderten Expression des Reportermoleküls identifiziert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin den Nachweis von Aminosäuresequenzen, die eine biologische Aktivität in einer Säugerzelle modulieren, wobei die Expression des gegenselektierbaren Reportergens funktional unter die Kontrolle einer Säuger exprimierbaren Promotorsequenz angeordnet ist, die in der pathogenen Situation abweichend aktiv ist, zum Beispiel ein Onkogen Promotor, wie MYC. Die Aktivität eines solchen Promotors würde in Zellen, die eine Aminosäuresequenz exprimieren, die in der Lage ist, den Onkogen Promotor in einer Säugerzelle zu inhibieren, direkt blockiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Identifizieren einer Aminosäuresequenz bereitgestellt, die in der Lage ist, eine Protein:Protein Wechselwirkung in einer Wirtszelle zu antagonisieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Herstellen einer Peptidbibliothek in einem zellulären Wirt, wobei die transformierten Zellen der Bibliothek mindestens eine erste Nukleotidsequenz enthalten, die ein Reportermolekül umfasst oder kodiert, das in der Lage ist, das Wachstum und/oder die Überlebensfähigkeit der Wirtszelle zu verringern, dessen Expression funktional unter der Kontrolle der Protein:Protein Wech selwirkung steht, und eine zweite Nukleotidsequenz, die von einer definierten genomischen Sequenz abgeleitet ist, die in der Lage ist, die Aminosäuresequenz zu kodieren, wenn sie funktional unter der Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz angeordnet wird, und wobei (b) im Wesentlichen die gesamte definierte genomische Sequenz innerhalb der Population von transformierten Zellen, welche die Bibliothek bilden, anwesend ist;
(ii) Kultivieren des zellulären Wirts für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit die Expression der zweiten Nukleotidsequenz stattfindet; und
(iii) Auswählen der Zellen, in denen die Expression des Reportermoleküls antagonisiert, reprimiert oder verringert ist.

Vorzugsweise schließt das gegenständliche Verfahren den zusätzlichen ersten Schritt oder späteren Schritt des Einführens in den zellulären Wirt einer oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle ein, die einen oder mehrere Polypeptid Bindungspartner kodierten, die in die biologische Aktivität involviert sind, funktional unter der Kontrolle von einer oder mehreren Promotorsequenzen. Solche Ausführungsformen sind detailliert supra beschrieben.
Gemäß diesen Ausführungsformen ist es bevorzugt, dass das Reportermolekül ein Peptid, Polypeptid, Enzym oder ein anderes Proteinmolekül umfasst, das in der Lage ist, ein unschädliches Substratmolekül in eine zytostatische Verbindung, antimitotische Verbindung oder ein Toxin umzuwandeln, so dass die antagonisierte Expression des Reportermoleküls durch das gegenständliche Peptid den Zelltod verhindert oder zumindest eine Reduktion im Zellwachstum und/oder der Überlebensfähigkeit in der Anwesenheit des Substrats verhindert. Weiter bevorzugt ist im Hefesystem das Reportergen unter anderem URA3 und/oder CYH2, wie LYS2. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Reportermolekül das Produkt des URA3 Gens, das, wenn es exprimiert wird, 5-Fluororotsäure (5FOA) in ein toxisches Produkt umwandelt.
Ein Beispiel dieser Ausführungsform nutzt die Tatsache, dass die meisten aktiven eukaryonten Transkriptionsaktivatoren modular sind und eine DNA Bindungsdomäne und eine DNA Aktivierungsdomäne aufweisen, wobei die DNA Bindungsdomäne und die DNA Aktivierungsdomäne auf demselben Proteinmolekül enthalten sein können, oder alternativ dazu auf getrennten Molekülen, die wechselwirken, um die Genexpression zu regulieren. Gemäß dieser Ausführungsform ist die Expression des Reportermoleküls funktional unter der Kontrolle einer Protein:Protein Wechselwirkung angeordnet, zum Beispiel zwischen den onkogenen Proteinen SCL und LMO2, die aneinander binden, um einen aktiven künstlichen Transkriptionsfaktor zu bilden. Die Transkription des Reportergens kann deshalb als ein Indikator verwendet werden, dass zwei Proteine wechselwirken, wobei eines der interessierenden Proteine mindestens eine DNA Bindungsdomäne umfasst und an ein Operator Promotorelement oberhalb des Reportergens bindet, und das zweite interessierende Protein mindestens eine DNA Aktivierungsdomäne umfasst. Die Bindung des DNA Bindungsproteins an den Operator, in der Anwesenheit einer funktionalen Aktivierungsdomäne, startet die Transkription des Reportergens. Der URA3 Reporter wirkt dadurch als ein gegenselektierbarer Marker.
Diese Ausführungsform der Erfindung kann angepasst werden an die Identifizierung von Aminosäuresequenzen, die andere Protein:Protein Wechselwirkungen modulieren, durch funktionales Austauschen der DNA Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors gegen eine andere DNA Bindungsdomäne, die spezifisch ist für ein anderes cis-wirkendes Element in dem Promotor, der die Expression des Reportermoleküls reguliert. Verfahren zur Herstellung solcher Fusionsproteine sind dem Fachmann gut bekannt. In solchen Fällen wird die Auswahl einer geeigneten DNA Bindungsdomäne von der Natur der DNA Bindungsstelle, die oberhalb des Reportergens angeordnet ist, abhängen.
Zum Beispiel können Fusionsproteine zwischen einem Onkoprotein und einer DNA Bindungsdomäne und/oder einer DNA Aktivierungsdomäne hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Sequenz von Nukleotiden, welche die Reste 176 bis 331 von SCL kodiert oder zu ihr komplementär ist, mit der LexA DNA Bindungsdomäne fusioniert werden, und eine Nukleotidsequenz, die LMO2 kodiert, kann mit einer DNA Aktivierungsdomäne fusioniert werden (oder vice versa).
Die vorliegende Erfindung ist auch besonders nützlich zum Identifizieren von Aminosäuresequenzen, die Protein:Protein Wechselwirkungen inhibieren, die normalerweise schädliche Wirkungen hervorrufen (mit Ausnahme der schädlichen Wirkung von manchen Reportermolekülen), zum Beispiel Wechselwirkungen, die Onkogen Produkte involvieren. Besondere Beispiele von Onkogenen, deren Produkte Transkriptionsfaktoren bilden, die zu Tumorigenese beitragen, schließen SCL und irgendeines oder mehrere von DRG, E47 und/oder LMO2 ein.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Identifizieren einer Aminosäuresequenz bereitgestellt, die in der Lage ist, eine Protein:Protein Wechselwirkung in einer Wirtszelle zu modifizieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Herstellen einer Peptid Bibliothek in einem Wirt, wobei (a) die transformierten Zellen der Bibliothek enthalten: (1) mindestens eine erste Nukleotidsequenz, die ein Reportermolekül umfasst oder kodiert, wobei die Nukleotidsequenz funktional mit einer Operatorsequenz oder einer Transkriptionsfaktor Bindungsstelle verbunden ist; (2) eine zweite Nukleotidsequenz, die von einer definierten genomischen Sequenz abgeleitet ist, welche die Aminosäuresequenz kodiert, wenn sie funktional unter der Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz angeordnet ist; und (3) eine oder mehrere weitere dritte Nukleotidsequenzen, die ein oder mehrere Polypeptide, Proteine oder Fusionsproteine kodieren, wobei mindestens eines der Polypeptide, Proteine oder Fusionsproteine mindestens eine DNA Bindungsdomäne einschließt, die in der Lage ist, an die Operatorsequenz oder die Transkriptionsfaktor Bindungsstelle zu binden, und mindestens eines der Polypeptide, Proteine oder Fusionsproteine schließt mindestens eine DNA Aktivierungsdomäne oder ein Derivat davon ein, die in der Lage ist, die Expression der ersten Nukleotidse quenz zu aktivieren, wenn sie auf den Promotor/Operator durch Wechselwirkung mit einem anderen Protein, das die verwandte DNA Bindungsdomäne trägt, gezielt wird; und (b) im Wesentlichen die vollständige definierte genomische Sequenz innerhalb der Population der transformierten Zellen, welche die Bibliothek bilden, anwesend ist;
(ii) Kultivieren der Wirtszelle für einem Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit die Expression der zweiten und weiteren Nukleotidsequenzen stattfindet; und
(iii) Auswählen der Zellen, in denen die Expression des Reportermoleküls aktiviert, inhibiert oder auf andere Weise modifiziert ist.

Die Proteine, die in die interessierende biologische Aktivität involviert sind, die von dem zweiten Nukleinsäuremolekül kodiert werden, werden in der Wirtszelle synthetisiert, die entweder von einer oder mehreren fremden Nukleotidsequenzen kodiert werden, die in die Wirtszelle transformiert oder in das Genom der Zelle integriert wurden. Jedoch erstreckt sich die vorliegende Erfindung eindeutig auf Situationen, in denen diese Sequenzen auch von endogenen Wirtszellgenen kodiert werden.
Gemäß dieser Ausführungsform bindet die DNA Bindungsdomäne an die Operatorsequenz und, in der Anwesenheit der DNA Aktivierungsdomäne, findet die Expression des Reportermoleküls statt. Wo die zweite Nukleotidsequenz ein Peptid kodiert, das die DNA Bindung und/oder DNA Aktivierung antagonisiert oder inhibiert, ist die Expression des Reportermoleküls reprimiert, verringert oder auf andere Weise inhibiert. Alternativ dazu, wo die zweite Nukleotidsequenz eine Aminosäuresequenz kodiert, welche die DNA Bindung und/oder DNA Aktivierung agonisiert oder verstärkt, wird die Expression des Reportermoleküls aktiviert, verstärkt oder auf andere Weise gesteigert.
Der Fachmann wird erkennen, dass die DNA Bindungsdomäne und die DNA Akti vierungsdomäne auf einem einzigen Aminosäuremolekül enthalten sein können, oder alternativ dazu, können sie auf getrennten Aminosäuremolekülen enthalten sein, die miteinander wechselwirken, um die Reportergen Expression zu regulieren.
Genauso können die erste und/oder zweite und/oder weitere Nukleotidsequenzen auf einem einzigen Nukleinsäuremolekül enthalten sein, zum Beispiel in einem genetischen Konstrukt, oder alternativ dazu, können eine, zwei, drei oder mehr der Sequenzen auf getrennten Nukleinsäuremolekülen enthalten sein. Wo eine oder mehrere der Nukleotidsequenzen auf getrennten Nukleinsäuremolekülen enthalten sind, ist jede dieser Nukleotidsequenzen weiterhin vorzugsweise funktional mit seiner eigenen Promotorsequenz verbunden. Alternativ dazu, wo zwei oder mehr der Nukleotidsequenzen auf denselben Nukleinsäuremolekülen enthalten sind, können die Nukleotidsequenzen unter der Kontrolle eines einzigen Promotors exprimiert werden, oder alternativ dazu, unter der Kontrolle von getrennten Promotorsequenzen.
Der Fachmann wird erkennen, dass die supra beschriebenen Alternativen gleichermaßen auf diese Ausführungsform der Erfindung anwendbar sind.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform umfasst das gegenständliche Verfahren weiterhin den Schritt des Isolierens der zweiten Nukleinsäuresequenz aus der Wirtszelle und das Sequenzieren des Nukleinsäuremoleküls und das Ableiten der Aminosäuresequenz, die dadurch kodiert wird. Nachdem die Sequenz identifiziert wurde, kann sie anschließend mit ähnlichen Sequenzen innerhalb der bekannten Nukleotidsequenz verglichen werden, um jene Aminosäuren zu identifizieren, die für die Modulation von biologischer Aktivität essenziell sind. Synthetische Peptide können anschließend basierend auf der abgeleiteten, so erhaltenen Aminosäuresequenz, hergestellt werden. Der Fachmann ist in solchen Techniken versiert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Aminosäuresequenzen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert wurden.
Vorzugsweise sind die Aminosäuresequenzen Agonisten oder Antagonisten von Protein:Protein oder Protein:DNA Wechselwirkungen. Weiter bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Peptide, Oligopeptide oder Polypeptide Antagonisten von Protein:Protein Wechselwirkungen oder Protein:DNA Wechselwirkungen und noch weiter bevorzugt, Antagonisten von Protein:Protein Wechselwirkungen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform antagonisieren oder inhibieren die erfindungsgemäßen Peptide Wechselwirkungen, die schädliche Wirkungen in eukaryonten Zellen hervorrufen, insbesondere menschlichen oder tierischen Zellen. Weiter bevorzugt antagonisieren oder inhibieren die erfindungsgemäßen Aminosäuren Wechselwirkungen, die eines oder mehrere Onkoproteine involvieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst eindeutig die Verwendung der Aminosäuresequenzen oder Fragmente oder Derivate davon in der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Mensch oder Tier. Verfahren zur Behandlung schließen ihre Verwendung in antibiotischen Peptid Therapieschemata, wie in den Behandlungsprotokollen für Patienten mit bakteriellen, Pilz oder viralen Infektionen, ein. Ihre Verwendung in Behandlungsprotokollen für die Patienten schließen ihre Verabreichung als Mittel zum Inhibieren des Wachstums des infizierenden Mikroorganismus und/oder zum Inhibieren seiner Virulenz ein. Die Verwendung von solchen Peptiden zur Verstärkung der Wirkungen von anderen antimikrobiellen Mitteln ist ebenfalls vorgesehen (z.B. siehe internationale PCT Anmeldung: WO 96/24684).
Folglich schließt ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung ein, umfassend ein Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das in der Lage ist, eine biologische Aktivität zu modulieren, und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst eine pharmazeutische Zusammenset zung, wobei das Peptid, Oligopeptid und Polypeptid das Wachstum und/oder die Virulenz eines Pathogens antagonisiert, und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel. Diese Bestandteile werden als die aktiven Bestandteile bezeichnet.
Die pharmazeutischen Formen, die für die injizierbare Verwendung geeignet sind, schließen sterile wässrige Lösungen (wo wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein, oder sie können in der Form einer Creme oder anderen Form, die für die topische Verabreichung geeignet ist, vorliegen. Alternativ dazu können injizierbare Lösungen eingekapselt in Liposomen verabreicht werden, um ihrem Transport über die Zellmembran zu helfen. Alternativ dazu oder zusätzlich können solche Präparationen Bestandteile von sich selbst zusammenlagernden Porenstrukturen enthalten, um den Transport über die zelluläre Membran zu erleichtern. Sie muss stabil unter den Bedingungen der Herstellung und der Lagerung sein und muss gegenüber der kontaminierenden/zerstörenden Wirkung von Umweltmikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium mit zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und ähnliches), geeignete Gemische davon und pflanzliche Öle enthalten. Die geeignete Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin durch die Aufrechterhaltung der benötigten Partikelgröße im Fall von Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, aufrechterhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Antipilzmittel, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thirmerosal und ähnliches erreicht werden. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid, einzuschließen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln in den Zusammensetzungen erreicht werden, welche die Absorption verzögern, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt durch Einschließen der aktiven Verbindungen in der benötigten Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit verschiedenen der anderen Bestandteile, die oben aufgezählt sind, wie benötigt, gefolgt durch gefilterte Sterilisation. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einschließen der verschiedenen sterilisierten aktiven Bestandteile in ein steriles Vehikel, hergestellt, welches das basische Dispersionsmedium und die benötigten anderen Bestandteile von jenen, die oben aufgezählt wurden, enthält. Im Falle von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechnik, die ein Pulver des aktiven Bestandteils plus irgendeines zusätzlichen gewünschten Bestandteils aus einer zuvor steril gefilterten Lösung davon, liefern.
Wenn die aktiven Bestandteile in geeigneter Weise geschützt sind, können sie oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem assimilierbaren essbaren Träger, oder sie können in einer harten oder weichen Schalen-Gelatinekapsel eingeschlossen sein, oder sie können in Tabletten verpresst sein, oder sie können direkt in das Nahrungsmittel oder die Diät eingeschlossen sein. Für die orale therapeutische Verabreichung kann die aktive Verbindung in Trägerstoffe eingeschlossen sein, und in der Form von verdaubaren Tabletten, bukkalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Plätzchen bzw. Oblaten oder ähnlichem verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparationen sollten mindestens 1 Gewichts-% der aktiven Verbindung enthalten. Der Prozentsatz der Zusammensetzungen und Präparationen kann selbstverständlich variiert werden, und kann geeigneterweise zwischen ungefähr 5 bis ungefähr 80% des Gewichts der Einheit betragen. Die Menge der aktiven Verbindung in solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist derart, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird. Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen und Präparationen werden hergestellt, so dass eine Dosiseinheitform zwischen ungefähr 0,1 μg und 20 g der aktiven Verbindung enthält.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und ähnliches können auch die Bestandteile, die im Folgenden aufgezählt sind, enthalten: ein Bindemittel, wie Gummi, Akazia, Maisstärke oder Gelatine; Trägerstoffe, wie Dicalciumphosphat, ein zersetzendes Mittel, wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und ähnliches; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat; und ein Süßmittel, wie Sucrose, Lactose oder Saccharin können hinzugefügt werden, oder ein Geschmacksmittel, wie Pfefferminz, das Öl von Wintergrün oder Kirschgeschmack. Wenn die Dosiseinheitform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu Materialien des obigen Typs einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen oder um auf andere Weise die physikalische Form der Dosiseinheit zu modifizieren, anwesend sein. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kaspeln mit Shellac, Zucker oder beidem beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Verbindung, Sucrose als ein Süßmittel, Methyl- und Propylparaben als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff und Geschmacksstoffe, wie Kirsch- oder Orangengeschmack enthalten. Selbstverständlich sollte jedes Material, das in der Herstellung irgendeiner Dosiseinheitform verwendet wird, pharmazeutisch rein und im Wesentlichen nicht toxisch in den verwendeten Mengen sein. Zusätzlich dazu kann/können die aktive(n) Verbindung(en) in Präparationen und Formulierungen zur verzögerten Freisetzung eingeschlossen werden.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf Formen, die für die topische Anwendung, wie Cremes, Lotionen und Gele, geeignet sind.
Pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel schließen irgendeines und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und Antipilzmittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und ähnliches ein. Eine Ausnahme besteht insofern als irgendein herkömmliches Medium oder Mittel mit dem aktiven Bestandteil unverträglich ist, die Verwendung davon in den therapeutischen Zusammensetzungen ist umfasst. Ergänzende aktive Bestandteile können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden.
Es ist insbesondere vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Dosiseinheit form zur erleichterten Verabreichung und Uniformität der Dosis zu formulieren. Dosiseinheitform, so wie hier verwendet, betrifft die physikalisch unterschiedlichen Einheiten, die als einzelne Dosierungen für zu behandelnde Säugerpatienten geeignet sind; jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge des aktiven Materials, von der berechnet wurde, dass sie die gewünschte therapeutische Wirkung in Assoziation mit dem benötigten pharmazeutischen Träger hervorruft. Die Beschreibung für die neuen erfindungsgemäßen Dosiseinheitformen werden diktiert von und hängen direkt ab von (a) den einzigartigen Merkmalen des aktiven Materials und der bestimmten therapeutischen Wirkung, die erreicht werden soll, und (b) den Beschränkungen, die der Technik des Kompoundierens eines solchen aktiven Materials für die Behandlung von Erkrankungen in lebenden Patienten mit einem erkrankten Zustand, in dem die körperliche Gesundheit beeinträchtigt ist, wie hier im Detail offenbart, inhärent ist.
Der prinzipielle aktive Bestandteil wird für die einfache und wirksame Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger in Dosiseinheitform kompoundiert. Eine Einheitdosisform kann zum Beispiel die prinzipielle aktive Verbindung in Mengen im Bereich von 0,5 μg bis ungefähr 2000 mg enthalten. Ausgedrückt in Anteilen, ist die aktive Verbindung im Allgemeinen in von ungefähr 0,5 μg bis ungefähr 2000 mg/ml des Trägers anwesend. In dem Fall, in dem die Zusammensetzungen ergänzende aktive Bestandteile enthalten, werden die Dosen durch Bezugnahme auf die gewöhnliche Dosis und Art der Verabreichung der Bestandteile bestimmt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch genetische Moleküle, wie einen Vektor, enthalten, der in der Lage ist, Zielzellen zu transfizieren, wobei der Vektor ein Nukleinsäuremolekül trägt, das in der Lage ist, solche schädlichen biologischen Wechselwirkungen/Aktivitäten zu inhibieren. Der Vektor kann zum Beispiel ein viraler Vektor sein.
BEISPIELE
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden vollständiger in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen beschrieben. Es wird jedoch verstanden, dass diese detaillierte Beschreibung nur für die Zwecke der beispielhaften Darstellung der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Sie sollte nicht in irgendeiner Weise als eine Beschränkung der breiten Beschreibung der Erfindung, wie sie oben angegeben ist, verstanden werden.
Verfahren zur molekularen Klonierung, Immunologie und Proteinchemie, die nicht explizit in den folgenden Beispielen beschrieben sind, sind in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt. Allgemeine Texte, die herkömmliche Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinante DNA Techniken des Standes der Technik beschreiben, schließen zum Beispiel ein: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover Hrsg., DNA Cloning: A Practical Approach, Band I und II, MRL Press, Ltd., Oxford, UK (1985); und Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Associates/Wiley Intersciences, New York.
Beispiel 1
DIE HERSTELLUNG VON BIODIVERSEN GENFRAGMENT BIBLIOTHEKEN
Die genomische DNA eines diversen Panels von Mikroorganismen, die ausgewählt wurden, um die genetische Diversität über das Panel zu maximieren, wurden auf Fragmente reduziert, die für das Exprimieren von Peptiden geeignet sind. Techniken, die geeignet sind, dieses Ergebnis zu erzielen, schließen ein: mechanisches Scheren, teilweise DNA-ase1 Spaltung und die Verwendung von Kombinationen von Restriktionsendonukleasen.
Jedes Genom wurde anschließend zu dem Pool im direkten Verhältnis zu seiner Größe und Komplexität hinzugefügt. Mehr DNA von großen Genomen als kleine Genome wurde hinzugefügt, um eine adäquate Repräsentierung sicherzustellen.
Eine Peptid Bibliothek wurde anschließend hergestellt durch Spalten von Aliquots der gepoolten DNA mit allen 6 Kombinationen von 2 Restriktionsenzymen aus einem Satz, der Alu I, Bst U I, Hae III und Rsa I enthält. Diese Enzyme sind glatt schneidende Restriktionsendonukleasen, die 4 verschiedene Basenpaar Erkennungssequenzen aufweisen, und somit wird jede Kombination Fragmente mit Größen herstellen, in denen der 90–120 bp Bereich vorherrscht. Diese sind zur Klonierung geeignet, und die Länge der DNA ist ausreichend, um Peptide von ungefähr 30 Aminosäureresten zu kodieren, die im Bereich der Größen von Sequenzen liegen, über die in strukturell konservierten Regionen von Peptiden berichtet wurde. In den Fällen, in denen Linker anstelle von Adaptoren an die genomischen Fragmente ligiert werden, kann der genomische Spaltungspool vor weiterer Spaltung durch die Behandlung mit einer geeigneten Methylase (in diesem Beispiel EcoR1 Methylase) geschützt werden.
Die gespaltenen Fragmente wurden durch native Acrylamid Gelelektrophorese gefolgt durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt.
Anschließend wurden die Linker an die DNA Fragmente durch Standardverfahren ligiert. 3 Leserahmen von Linkern wurden verwendet. Wo die Fragmente in eine EcoR1 Stelle kloniert werden sollen, können äquimolare Mengen der folgenden 3 selbst anlagernden Linker verwendet werden:
Wo es beabsichtigt war, dass die Klonierung gerichtet ist, wurde eine äquimolare Menge eines anderen Linkers hinzugefügt, welche der zweiten 3' Restriktionsstelle entspricht – z.B. zur Klonierung in die EcoR1 und HindIII Stellen eines Vektors (z.B. eine äquimolare Anzahl von Molen) (zu den kombinierten EcoR1 Linkern) wurde der folgende Linker zu der Ligation hinzugefügt: d(pCCAAGCTTGG).
Die Linker wurden anschließend mit der/den Restriktionsendonuklease(n) gespalten, die ihren Erkennungssequenzen entsprechen, und geeignete Größen gespaltene Fragmente wurden durch Standardtechniken gereinigt, die Agarosegel Elektrophorese, Sucrose oder Kaliumacetat Gradienten oder Größenausschluss Chromatographie einschließen,
Die genomischen Fragmente, die flankierende Linker oder Adaptoren enthalten (siehe Beispiel 4 unten) wurden anschließend in einen pT7-Select Expressionsvektor durch Standardverfahren für Bibliothekenherstellung kloniert.
Beispiel 2
BGF Bibliothekherstellung
Biodiverse Genfragment Bibliotheken können hergestellt werden unter Verwendung angepasster Fragmente von gepoolter genomischer DNA aus einem evolutionär diversen Satz von kompakten Genomen. Um die Diversität des Pools zu maximieren, kann die relative Konzentration von DNA in dem Pool von größeren Genomen im Verhältnis zu der Gesamt haploiden Genomgröße erhöht werden. Die genomischen Inserts können unter Verwendung von mechanischem Scheren (z.B. Sonifizieren) gefolgt von Reparatur und Ligation von Linker Oligonukleotiden oder Adaptoren fragmentiert werden. Alternativ dazu können sie durch Polymerase Extension von teilweise degenerierten Oligonukleotiden, die an die denaturierte genomische DNA angelagert sind, gefolgt von Amplifikation unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion (PCR) hergestellt werden.
In diesem Beispiel wiesen die Oligonukleotide, die in der primären Extension mit dem Klenow Fragment von DNA Polymerase I (bei 15–25 Grad Celsius) verwendet wurden, die Sequenz auf:
(Unter Verwendung von *, um eine universelle Base, wie 5-Nitro-indol anzuzeigen)
vorwärts gerichteter Primer:
rückwärts gerichteter Primer:
N entspricht degenerierten Nukleotiden (z.B. entweder dATP, dCTP, dGTP oder dTTP). Darüber hinaus kann jede der universellen Basen: Desoxyinosin oder 5-Nitroindol (oder funktional äquivalente Analoga) an irgendeiner oder allen 'N' Positionen der Primer, insbesondere an der 3' terminalen Position substituiert werden. Somit kann die Länge der 'N' Reihen von 6 bis 8 Nukleotiden variiert werden.
Gemäß diesem Beispiel waren die Primer für die nested PCR Amplifikation des Produkts der Klenow Extensionsreaktion:
vorwärts gerichteter Primer:
rückwärts gerichteter Primer:
Die PCR Amplifikation wurde unter Verwendung eines "Touchdown" Protokolls mit "Heiß-Start" Enzym durchgeführt, um die Spezifität zu maximieren.
Die anfängliche Extension und PCR Amplifikation wurde vollständig mit Klenow Polymerase durchgeführt, wobei mehr Polymerase in jedem Zyklus als in dem ursprünglichen Bericht der PCR hinzugefügt wurde. Dies erlaubte es, dass der gesamte Zyklus zwischen der Denaturierungstemperatur (90–100 Grad Celsius) und einer niedrigen Annealing Temperatur (15–25 Grad Celsius) durchgeführt werden konnte, was das Potenzial minimierte, dass das Annealing gegenüber der Amplifi kation von A/T reichen Sequenzen verschoben wurde. Für diesen Ansatz besaßen die Primer die Form:
vorwärts gerichteter Primer: GAGAATTCANNNNNNNN*
rückwärts gerichteter Primer: GAGAATTCNNNNNNNN*
Methylierte Nukleotide können in die PCR Reaktion (aber nicht in die Primer eingebaut) eingeschlossen werden, um die Produkte vor interner Spaltung mit Restriktionsenzymen während der Klonierung zu schützen.
In einer bevorzugten Form des Beispiels kann auch mutagene PCR unter Verwendung von alternativen Nukleotiden und/oder der Verwendung eines Manganpuffers ebenfalls eingesetzt werden, um die Sequenzdiversität der Inserts zu erhöhen.
Die resultierenden PCR Produkte wurden mit EcoR1 alleine oder mit EcoR1 und Xma1 (wo der rückwärts gerichtete Primer eine Xma1 Stelle aufweist) vor dem Klonieren in Vektoren der pBLOCK Serie gespalten.
Die Bibliotheken wurden gemäß dem Standardverfahren unter Verwendung der am höchsten wirksamen kommerziell erhältlichen kompetenten Zellen viz. XL10-Gold (Stratagene) hergestellt, um sicherzustellen, dass die Komplexität größer als 10⁷ unabhängige Klone beträgt.
Beispiel 3
IMITATOREN BIBLIOTHEKEN UNTER VERWENDUNG VON BIODIVERSEN GENFRAGMENTEN
Dieses Beispiel stellt den Nachweis von Imitatoren des wichtigsten Hausstaubmilben Allergens Der p 1 dar.
DNA im 90–120 bp Bereich jeder der Doppelspaltungen wurde isoliert und vereinigt, an Linker in allen Leserahmen ligiert und in den Phagen Display Vektor T7 Select 1.1 oder den Vektor T7 Select 415 kloniert. Einige DNA Fragmente lagen außerhalb des Bereichs des 90–120 bp Bereichs und wurden nicht kloniert, aber die Redundanz des Spaltungsverfahrens sollte eine Repräsentierung der meisten Sequenzen erlauben. Die Verwendung eines Pools von 3 Leserahmen von Linkern und/oder eines translationalen Verschiebungssignals in der Herstellung der Bibliothek stellte sicher, dass alle 6 Leserahmen der Inserts repräsentiert waren. Die Gesamt Genomgröße eines biodiversen Panels von Mikroorganismen betrug ungefähr 35 Mb. Dieser Vorgang bildete ungefähr 12 × 10⁶ verschiedene Fragmente, was die Klonierung in allen Leserahmen und Orientierungen erlaubte. Die zuletzt genannten zulassend kodierte ca. 1/6 der Sequenzen für natürliche Peptide. Das T7 Select ist ein molekulares Klonierungssystem mit hoher Verpackungswirksamkeit, und es wurde entwickelt, um die Peptide zu zeigen, die von der klonierten DNA als C terminale Fusionen auf einem Phagen Hüllprotein kodiert wurden, das für Affinitätsreinigungsvorgänge zugänglich ist. Eine Minderheit der nicht natürlichen Peptide war kleiner als der geschätzte Größenbereich, weil sie durch Stoppcodons verkürzt sind. Der T7 Select 1.1 oder der Vektor T7 Select 415 zeigt das Peptid in niedriger und hoher Kopienzahl, so dass hohe und niedrige Affinitätswechselwirkungen für die Affinitätsreinigung verwendet werden können.
Die weitere Diversität wurde durch PCR Mutagenese gebildet, welche die Amplifikation unter Bedingungen durchführt, die hohe Fehlerraten begünstigt. Es wurde mit einer Fehlerrate von 0,5 Basen pro 100 bp/Zyklus (was erreicht werden kann) berechnet, das acht mutagene Zyklen Basenaustausche in 90% der PCR Produkte bildet, und nahezu 50% werden 2 oder 3 Substitutionen aufweisen. Es wurden Linker hinzugefügt, um die Primersequenzen für die PCR bereitzustellen, und eine abschließende High Fidelity PCR wurde mit verlängerten Linkern durchgeführt, um Klonierungsstellen bereitzustellen. Die mutierten Fragmente besaßen eine 10 × Diversifizierung der Sequenzen in einer Menge von DNA, die einfach verpackt wurde.
Phagen aus der Bibliothek, die oben konstruiert wurde, die Peptide zeigten, die an humanes und murines IgG und IgE anti-Der p 1 binden, wurden unter Verwendung von Verfahren, die auf jenen beruhen, die für Pollenallergene [11] und andere Antigene beschrieben sind, isoliert. Sie sind essenzielle Standardprotokolle für die Affinitätsreinigung von Phagen Display Antigenen. Solche Verfahren wurden für filamentöse Phagen Display Systeme und das T7 Select Klonierungssystem beschrieben.
Der Antikörper wurde aus Der p 1 gekoppelter Sepharose^TM affinitätsgereinigt und verwendet, um ELISA Vertiefungen zu beschichten, um einen Phagen durch ein Panning Verfahren immun zu selektieren. Es wurden einige Zyklen der Selektion und Phagen Amplifikation wie empfohlen durchgeführt. Es wurden verschiedene Arten von Aftinitätsreinigungsverfahren verwendet, um den Phagen zu selektieren, so dass es einen Spielraum gibt, eine Vielzahl von Verfahren zu verwenden. Humane IgE Antikörper wurden aus dem Serum von allergischen Patienten, und IgG wurde aus dem Serum von allergischen und nicht allergischen Patienten isoliert. Monoklonale Maus IgG Antikörper, von denen bekannt ist, dass sie ein unterschiedliches Epitop erkennen, wurden verwendet, um Peptide zu isolieren, welche die verschiedenen Epitope nachahmen.
Nach Selektion und Amplifikation des Phagen, der die Peptide zeigt, kann eine weitere Reinigung unter Verwendung von Plaque Immunoassays erhalten werden, die mit Anti Der p 1 Antikörpern [11; 12] durchgeführt werden. Ein solcher Vorgang ermöglicht die Isolierung von individuellen Klonen, die mit den Antikörpern reagieren. Überkreuz Immunoassays wurden mit verschiedenen humanen und Maus Antikörper Präparationen durchgeführt, um die Frequenz abzuschätzen und um die isolierten geteilten Peptid Imitatoren zu isolieren. Der Phage wurde anschließend für eine weitere Studie beruhend auf der Sequenz des Peptids, der serologischen Reaktivität und der beabsichtigten Verwendung ausgewählt. Die Spezifität der Antikörper Imitator Wechselwirkung wurde durch Inhibitionsassays gegen andere gereinigte Milben Allergene und durch Western Blotten von Antiserum gegen komplexe Protein Quellen, Allergene und mikrobielle Extrakte getestet.
Die Antikörper Bindungsaktivität von Imitatoren kann oft durch Feinjustierung der Aminosäuresequenz verbessert werden. Klone, die Peptide kodieren, die mit Anti Der p 1 reagieren, wurden hinsichtlich Antikörperbindung durch zufällige Mutagenese unter Verwendung von PCR, die für Fehlpaarung durch Mn⁺⁺ und hohe Nukleotidkonzentrationen verstärkt war, optimiert. Die Sequenzen, welche die Klonierungsstelle flankieren, werden als die Primer verwendet. Eine abschließende High Fidelity PCR unter Verwendung der Primer, die verlängert waren, um Restriktionsenzymsequenzen zur erneuten Klonierung in den Displayvektor bereitzustellen, wurden zur Klonierung durchgeführt. Der Phage, der die mutierten Inserts enthielt, wurde anschließend verwendet, um E. coli zu transformieren und Plaques für Immunoscreening herzustellen. Die Klone, welche die höchste Antikörper Bindungsaktivität zeigten, wurden gepickt.
Die Peptide, die durch das beschriebene Reinigungsverfahren identifiziert wurden, wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit nicht nur das Epitop des Der p 1 Allergens zu imitieren, sondern auch ein Imitator zu sein, das Tiere und Menschen immunisieren kann, um Anti Der p 1 Antikörper zu induzieren, getestet. Dies wurde in den folgenden Weisen durchgeführt: mit einem synthetischen Peptid, das chemisch an einen immunogenen Träger gekoppelt war, mit einem Peptid, das genetisch an einen Träger durch molekulare Klonierungstechniken fusioniert war und durch Verwendung des Phagen, der das Peptid als Immunogene zeigte.
Die Fähigkeit der Peptide, an IgE gegenüber dem Der p 1 Allergen zu binden, kann für diagnostische Techniken verwendet werden, die nicht nur die Anwesenheit von Antikörper nachweisen, sondern die auch die Diversität der Immunantwort und das Muster der Epitoperkennung zeigen können. Die Fähigkeit, als ein Imitator zu wirken und antiallergene IgG Antikörper zu induzieren, kann in verschiedenen immunotherapeutischen Strategien verwendet werden. Wichtig ist, dass Konstrukte hergestellt werden können, was es ermöglicht, dass das Peptid als ein monovalentes Immunogen verwendet werden kann und somit allergene Reaktio nen verhindert, die durch Kreuzvernetzung von IgE Molekülen in allergischen Patienten verursacht werden.
Beispiel 4
SCREENING VON PEPTID BIBLIOTHEKEN, DIE BIODIVERSE GENFRAGMENTE FÜR ANTIMIKROBIELLE MITTEL KODIEREN
Um neue Peptide mit Antibiotika Aktivität gegen einen multiresistenten Staphylococcus aureus Stamm zu isolieren, wurde der folgende Ansatz verwendet.
Eine biodiverse Genfragment Bibliothek wurde zunächst durch die Verfahren, die in Beispiel 1 beschrieben sind, in einem T7 Phagenvektor hergestellt. Beispiele von T7 Phagenvektoren, die in diesem Teil des Verfahrens verwendet werden können, schließen ein: T7Select415-1b, T7Select1-1b, T7Select1-2a, T7-Select1-2b und/oder T7Select1-2c (Novagen), die eine Komplexität von größer als 1.000.000 individuelle Klonen aufweisen.
Die Bibliothek wurde mit einer Multiplizität von mindestens eins auf einem Rasen von entweder E. coli BL21 (im Fall von T7Select415-1b) oder den komplementierenden Wirten E. coli BLT5403 oder E. coli BLT5615 (für die anderen Vektoren) ausplattiert, um eine Plaque Diversität von unter Semikonfluenz zu erlauben.
Die Platten wurden doppelseitig verwendet, wobei sie einer Weise hergestellt wurden, die dualen Kulturschalen, die miteinander durch die Unterseite verbunden sind, gleichen. Solche Platten besaßen deshalb zwei Verschlüsse an den gegenüberliegenden Oberflächen. Die aneinandergrenzende Oberfläche der zwei Seiten der Platten wurden aus Nitrocellulose oder Nylonmembran hergestellt, die durch ein Gitter unterstützt wurde, das aus einem festen Material, wie Plastik, hergestellt war. Die gegenüberliegende Seite der Platte in Richtung der Seite, welche die BL21 abgeleitete T7 Plaqueüberschichtung enthielt, enthielt Medium, das für das Wachstum von Staphylococcus aureus geeignet ist. Nach dem Ausplattieren der Bibliothek war Staphylococcus aureus auf der Oberfläche der Platte, die das geeignete Medium in der minimalen Dichte enthielt, die benötigt wird, um einen Rasen zu erhalten.
Die Platten wurden anschließend bei 37 Grad Celsius inkubiert bis die T7 Phagenplaques auftraten und der Staphylococcus aureus Rasen auftritt. Irgendwelche Unstimmigkeiten in dem Staphylococcus aureus Rasen kann die Diffusion eines inhibitorischen Arzneimittels reflektieren, das von einem Phagenplaque an einer korrespondierenden Position auf der gegenüberliegenden Seite der Platte gebildet wird. Die Plaques wurden anschließend bis zur Klonalität gereinigt und hinsichtlich inhibitorischer Eigenschaften in anschließenden zweiten, dritten und/oder vierten Screens untersucht.
Die Inserts von reinen Plaques wurden anschließend unter Verwendung von PCR amplifiziert und unter Verwendung von Vektorprimern sequenziert. Die Inserts der Klone wurden anschließend subkloniert und durch Standard bakterielle Expressionsverfahren unter Verwendung von Vektoren, wie PET14b, pMAL-c2 oder pTYB1 gereinigt und hinsichtlich minimal inhibitorischer Konzentration (MIC) durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, untersucht.
Die Sequenz der inhibitorischen Peptide kann anschließend verwendet werden, um synthetische Peptid basierte Arzneimittelkandidaten zu entwerten, die hinsichtlich antimikrobieller Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus getestet werden können.
Beispiel 5
AUSWÄHLEN VON BLOCKERN VON PROTEIN/PROTEIN
WECHSELWIRKUNGEN AUS BIODIVERSEN GENFRAGMENT
BIBLIOTHEKEN IN HEFE
Reverse Two Hybrid Bibliotheken wurden hergestellt und unter Verwendung des Vektors pBLOCK-1, wie in unserer früheren Beschreibung beschrieben (siehe PCT/AU99/00018) unter Verwendung von genomischen Inserts, die wie supra in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurden, mit dem Hinzufügen von EcoR1 Linkern und kloniert in die EcoR1 Stelle des Vektors gescreent.
Offensichtliche Variationen dieses Verfahrens sind dem Fachmann bekannt, wie die Möglichkeit Adaptoren anstelle von Linkern zu verwenden, alternative Klonierungsstellen zu verwenden und zusätzliche Sequenzen in die Linker einzuschließen. Zum Beispiel kann ein Pool der folgenden angelagerten Adaptoren anstelle der Linker verwendet werden: (jeder Strang der Adaptorsequenz ist in Richtung 5' nach 3' gezeigt).
Adaptor 1
Adaptor 2
Adaptor 3
Adaptoren, wie die hier gezeigten, können Motive kodieren, die für die Expression oder Begrenzung bezüglich der Konformation (z.B. in diesem Fall; duale Shine-Dalgarno und Kozak Sequenzen, flankierende Cysteinreste und Stoppcodons) nützlich sind.
Die Bibliothek wurde transformiert oder in einem Hefestamm verschmolzen, der die zwei Proteine, deren Wechselwirkung man blockieren will, und gegenselektierbare Reportergene, deren Expression von dieser Wechselwirkung abhängt, enthält. Das detaillierte Verfahren für reverses Two Hybrid Screening ist in unserer Beschreibung PCT/AU99/00018 beschrieben.
REFERENZEN

1. Tiozzo, E., Rocco, G., Tossi, A. & Romeo, D. (1998). Biochemical and Biophysical Research Communications, 249, 202–206,
2. Balaban, N., Goldkorn, T., Nhan, R., Dang, L., Scott, RM, R., Rasooly, A., Wright, S., Larrick, J., Rasooly, R. & Carlson, J. (1998). Science, 280, 438–440.
3. Colas, P., Cohen, B., Jessen, T., Grishina, I., McCoy, J., Brent, R. (1996). Nature, 380, 548–550
4. Xu, C., Mendelsohn, A. & Brent, R. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12473–12478.
5. Kolonin, M. & Finley, R. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14266–14271.
6. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. (1994). Journal of Biological Chemistry, 269, 10444–10450.
7. Phelan, A. (1998). Nature Biotechnology, 16, 440–443.
8. Marcello, A., Loregion, A., Cross, A., Marsden, H., Hirst, T., Palu, G. (1994). Proc Natl Acad Sci U.S.A, 91, 8994–8998.
9. Fåhraeus, E., Paramio, J. M., Ball, K. L., Lain, S., Lane, D. P. (1996). Current Biology, 6, 84–91,
10. Mennuni, C., Santini, C., Lazzaro, D., Dotta, F., Farilla, L., Fierabracci, A., Bottazzo, G. F., Di Mario, U., Cortese, R. & Luzzago, A. (1997). Journal of Molecular Biology, 268, 599–606.
11. Leitner, A., Vogel, M., Radauer, C., Breiteneder, H., Stadler, B. M., Scheiner, O., Kraft, D. & Jensen-Jarolim, E. (i998). European Journal of Immunology, 28, 2921–7.
12. Pincus, S. H., Smith, M. J., Jennings, H. J., Burritt, J. B. & Glee, P. M. (1998). Journal of Immunology, 160, 293–8.

Claims

Verfahren zum Screenen einer Genomfragment Expressionsbibliothek umfassend die Schritte: (i) Herstellen einer Genfragment Expressionsbibliothek, die eine Vielzahl von verschiedenen Nukleotidsequenzen von verschiedenen Organismen exprimiert, wobei die Bibliothek aus bestimmten Nukleotidsequenzfragmenten aus einem sequenzierten Genom eines Mikroorganismus und/oder einem kompakten Genom einer eukaryoten Spezies hergestellt wird; und (ii) Untersuchen der Genfragment Expressionsbibliothek, um ein Peptid zu identifizieren, das eine biologische Aktivität aufweist, wobei die biologische Aktivität dadurch gekennzeichnet ist, dass sie von irgendeiner Aktivität, die das Peptid in seiner natürlichen Umgebung aufweist, verschieden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäurefragmente von einem Organismus stammen, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Fugu rubripes, Caenorhabditis elegans, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Aquifex aeliticus, Methanococcus jannaschii, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Neisseria meningiditus, Synechocystis sp., Bordetella pertussis, Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, Borellia burgdorferi, Menthbacterium thermoautotrophicum, Mycoplasma pneumoniae, Archaeoglobus fulgidis, und Vibrio harveyi, besteht.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei jedes der Genome, das in dem Verfahren verwendet wird, in gleichen molaren Mengen bereitgestellt wird, um sicherzustellen, dass ein gleicher Anteil der Nukleinsäurefragmente in das Verfahren eingeschlossen wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Peptid, das durch das Nukleinsäurefragment kodiert wird, eine Aminosäuresequenz von mindestens ungefähr 1 bis 100 Aminosäuren in der Länge, wie ungefähr 30 Aminosäuren in der Länge umfasst.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Komplexität der Genfragment Expressionsbibliothek erhöht wird indem die Nukleinsäurefragmente Verfahren unterworfen werden, welche die Sequenz falsch lesen oder mutieren.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Komplexität der Genfragment Expressionsbibliothek durch Amplifizieren der sequenzierten Genome unter Verwendung von mutagener PCR erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Komplexität der Genfragment Expressionsbibliothek durch Exprimieren der Nukleinsäurefragmente in Zellen, die modifiziert sind, um Nukleinsäuren zu mutieren, erhöht wird.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Komplexität der Genfragment Expressionsbibliothek durch Exprimieren des Nukleinsäurefragments in jedem seiner verschiedenen Leserahmen erhöht wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Nukleinsäurefragmente in einem reversen Leserahmen exprimiert werden.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Genfragment Bibliothek eine Phagendisplay Bibliothek ist und wobei die Phagendisplay Bibliothek durch Screenen der Bibliothek nach Peptiden, die mit bestimmten Antikörpern reagieren, durch Affinitätschromatographie untersucht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Identifizieren eines Modifizierers einer biologischen Aktivität, wobei das Untersuchen der Expres sionsbibliothek umfasst: (i) Exprimieren eines Reportermoleküls, das unter der Kontrolle der biologischen Aktivität operabel ist, in einer Zelle, wobei mindestens ein Molekül, das mit der biologischen Aktivität assoziiert ist, ein Polypeptid umfasst, das von einer Nukleinsäure kodiert wird, die operabel in Verbindung mit einem Promotor angeordnet ist; (ii) Inkubieren der Zelle aus Schritt (i) in der Anwesenheit eines Peptids aus der Genfragment Expressionsbibliothek unter Bedingungen, welche die Wechselwirkung zwischen dem Peptid und einer Nukleinsäure oder einem Polypeptid, das mit der biologischen Aktivität assoziiert ist, fördern; (iii) Identifizieren eines Peptids, das in der Anwesenheit der Zellen in der Lage ist, die Expression des Reportermoleküls zu modifizieren; und (iv) Selektieren des Peptids aus Schritt (iii), von dem nicht allgemein bekannt ist, dass es in der Lage ist, die Expression des Reportermoleküls in der Natur zu modifizieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die biologische Aktivität antibakterielle Aktivität ist und die Genfragment Expressionsbibliothek in eine erste bakterielle Population von Zellen transformiert oder transfiziert wird und wobei das Untersuchen der Expressionsbibliothek umfasst: (i) Anziehen der ersten bakteriellen Population für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit die Expression der Peptide, die von der Genfragment Expressionsbibliothek kodiert werden, stattfindet und dass die Peptide von ihren jeweiligen verwandten Verbindungen freigesetzt werden; (ii) in Kontakt bringen der exprimierten Peptide mit pathogenen Bakterien; (iii) Identifizieren jener Sequenz(en), die in der Lage ist/sind, das Wachstum der pathogenen Bakterien zu inhibieren, oder die pathogenen Bakterien zu töten; und (iv) Auswählen jener Peptide aus dem Identifizierungsschritt in Schritt (iv), die nicht mit der Inhibierung des Wachstums der pathogenen Bakterien oder dem Töten der pathogenen Bakterien in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert sind.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei die biologische Aktivität eine antigene Aktivität oder immunogene Aktivität ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die biologische Aktivität die Bindung von Immunglobulin E an Mastzellen ist.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Peptid ein Modulator oder Mediator einer biologischen Aktivität ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das Peptid ein Antagonist einer biologischen Aktivität ist.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Peptid weiter untersucht wird durch: (i) Anordnen der Sequenzen der Aminosäuren irgendwelcher Peptide, die in dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche identifiziert wurden; und (ii) Identifizieren von Konsensusmotiven.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, weiter umfassend den Schritt des Isolierens des identifizierten Peptids.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, weiter umfassend den Schritt des Isolierens des Nukleinsäurefragments, welches das identifizierte Peptid kodiert.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Genfragment Expressionsbibliothek durch ein Verfahren hergestellt wird, das Klonieren von Nukleinsäurefragmenten umfasst, die in der Lage sind, einen Satz von Peptiden zu kodieren, die operabel unter der Kontrolle einer Promotorsequenz angeordnet sind, die in der Lage ist, die Expression der Nukleinsäurefragmente in einer Zelle, einem Viruspartikel oder einem Bakteriophagenpartikel, zu steuern.