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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum
Screenen von Proteinen und Polypeptiden. Insbesonders betrifft die
Erfindung Verfahren, die die Herstellung von Genbanken und die Synthese
einzelner Proteine oder Polypeptide umfassen, die auf unterschiedliche
Weise gescreent werden können.
Besondere Ausführungsformen
umfassen die Verwendung so genannter "Ribosomen-Display"-Protein- oder Polypeptidanordnungen.
Folglich stellt die Erfindung neue praktische Anwendungen von dargebotenen
Protein- oder Polypeptidanordnungen für das Screenen nach biologisch
aktiven Polypeptiden, nach Proteinen, die an Rezeptoren binden,
und nach Wechselwirkungen von Proteinen mit anderen Molekülen bereit.
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Aus
der fortdauernden Initiative, das menschliche Genom zu sequenzieren,
hat sich eine größere Initiative
entwickelt, Polymorphismen oder Mutationen in menschlichen Genen,
die in ursächlichen
Beziehungen zu menschlichen Erkrankungen stehen können, und
außerdem
Veränderungen
in der Expression von Genen, die eine Erkrankung betreffen können, zu
finden. Dies führte
zu vielen Hochdurchsatz-Screening-Technologien,
um solche Polymorphismen, Mutationen oder Veränderungen in der Genexpression
aufzufinden. Ferner werden zurzeit solche Analysen durchgeführt, um
menschliche Reaktionen auf bestimmte Behandlungen zu analysieren
und somit das Ansprechen auf diese Behandlungen vorherzusagen. Allgemein
spiegeln sich Polymorphismen, Mutationen und Genexpressionsveränderungen
in Proteinen wieder, die von diesen Genen produziert werden, und
es sind die Wirkungen dieser Proteine, die direkt die biologischen
Ergebnisse, wie Entwicklung einer Erkrankung oder Reaktion auf eine
Behandlung, bestimmen können.
Außerdem
werden die meisten eukaryotischen Proteine posttranslational modifiziert,
und diese Modifikationen können
nicht auf Genebene analysiert werden. Folglich ist es somit im Vergleich
zu einer Analyse von DNA oder RNA wahrscheinlicher, dass eine Analyse
des Screenings nach Proteinen und Proteinmodifikationen eine genaue
Beziehung von Veränderungen
zu einer Erkrankung liefert.
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Die
Analyse von Proteinzusammenhängen
mit einer Erkrankung wird bis heute durch die 2D- (zweidimensionale)
Proteingelanalyse aus menschlichem Gewebe oder menschlichen Zellen
dominiert. Für
diese Technologie werden in der Regel zelluläre Proteine auf Basis der Ladung
in einer Dimension und auf Basis der Größe in der anderen Dimension
aufgetrennt. Proteine können
entweder in Bezug auf das Elektrophoreselaufmuster eines bekannten
Proteins oder durch Elution des Pro teins aus dem elektrophoretisch
aufgetrennten Fleck und Analyse durch Verfahren, wie Massenspektroskopie
und magnetische Kernresonanz, identifiziert werden. Zu den Beschränkungen
des 2D-Proteingelverfahrens gehören
jedoch die beschränkte
Auflösung
und der Nachweis von Proteinen aus einer Zelle (gewöhnlich werden
nur 5000 zelluläre
Proteine klar nachgewiesen), die Beschränkung für die Identifizierung aufgetrennter
Proteine (beispielsweise erfordert Massenspektroskopie gewöhnlich 100
fmol oder mehr Protein zur Identifikation) und die Schwierigkeit
der Technik. Außerdem
ist die Analyse von posttranslationaler Modifikation von Proteinen
mittels 2D-Gelanalyse beschränkt,
und Protein-Protein-Bindungswechselwirkungen können durch dieses Verfahren
nicht nachgewiesen werden.
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Eine
große
Zahl zellulärer
Vorgänge
wird durch die zeitweilige Wechselwirkung zwischen einem modifizierenden
Enzym und seinem Proteinsubstrat gesteuert. Solche Wechselwirkungen
sind mit herkömmlichen
Verfahren schwierig nachzuweisen. Proteinmodifizierende Enzyme,
wie Kinasen, Phosphatasen, Transferasen, Proteasen usw., steuern
alle Arten grundlegender zellulärer
Vorgänge
(Pawson, Nature, 373 (1995), S. 573), und es wurde ebenfalls gezeigt,
dass sie an Erkrankungsentstehungswegen beteiligt sind. Diese zeitweiligen
Protein/Protein-Wechselwirkungen
können
zu einer Reihe verschiedener Wirkungen führen, von denen einige gemessen
werden können.
Die kinetischen Eigenschaften eines Proteins können verändert werden, was zu einer
veränderten
Bindung von Substraten (Prelich et al., Nature 326, (1989) S. 517)
oder veränderter
Katalyse führt
(Porpaczy et al., Biochim. Biophys. Acta, 749 (1983), S. 172). Protein/Protein-Wechselwirkungen
können
die Bildung einer neuen Bindungsstelle bewirken, z.B. wird eine
ATP-Bindungsstelle durch die Wechselwirkung der a- und b-Untereinheiten
der E.-coli-ATPase gebildet (Weber et al., J. Biol. Chem., 268, (1993),
S. 6241). Die Substratspezifität
eines Proteins kann durch Protein/Protein-Wechselwirkungen verändert werden,
wie das Beispiel der Wechselwirkung verschiedener Transkriptionsfaktoren
mit RNA-Polymerase zeigt, wodurch die Polymerase zu spezifischen
Promotoren gelenkt wird (White & Jackson,
Trends Genet., 8, (1988), S. 284). Alternativ können Protein/Protein-Wechselwirkungen
eine Inaktivierung bewirken, zum Beispiel wenn ein Protein mit einem
Inhibitor wechselwirkt (Vincent & Lazdunski,
Biochemistry, 11, (1972), S. 2967).
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Im
Stand der Technik sind Verfahren offenbart, die auf der Erzeugung
von Proteinen oder Polypeptiden aus Genbanken beruhen. In-vitro-Verfahren
zur Selektion eines Polypeptids bieten potenziell Vorteile gegenüber In-vivo-Verfahren,
indem die Notwendigkeit der Aufnahme von Genen in Zellen beseitigt
und die Umgebung für
die mRNA- und Proteinproduktion kontrolliert wird. In-vitro-Transkriptions- und -Translationsreaktionen
werden seit vielen Jahren als Mittel zur Erzeugung von Polypeptiden
direkt von DNA verwendet, und es wurde gezeigt, dass spezifische
mRNAs durch Immunpräzipitation
von Polysomen (z.B. Payvar, F. und Schimke, R.T., Eur. J. Biochem.,
Bd. 101 (1979) S. 1844–1848)
unter Verwendung von Antikörpern
zur Selektion der spezifischen Polypeptide angereichert werden können. Diese
so genannte "Ribosomen-Display"-Technik wurde vor
kurzem an die Selektion von Peptiden (Mattheakis, L. et al., PNAS
91: 9022, 1994 und PCT95/11922) and Proteinen angepasst (Kawasaki,
G., PCT91/05058 und Hanes & Plückthun,
PNAS, Bd. 94 [10]: 493 7, 1997). Hanes & Plückthun offenbaren ein In-vitro-Verfahren
zum Screenen von korrekt gefalteten, vollständigen Proteinen und deren
codierenden Polynukeotiden mittels In-vitro-Translation des Polynucleotids
in Protein, wobei das ribosomengebundene Protein durch Wechselwirkung
mit einem Liganden/Antigen an einem festen Träger immobilisiert und das wechselwirkende
Protein selektiert sowie die mRNA in DNA revers transkribiert wird.
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Ein
hauptsächlicher
Nachteil bei solchen Verfahren ist jedoch, dass die Proteine oder
Polypeptide als "Pool" erzeugt werden,
der dann gescreent wird.
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Somit
besteht ein Bedarf an Screeningverfahren, die eine schnelle Identifizierung
einzelner Proteine oder Polypeptide gestatten und die wiederum auch
die Identifizierung von Genen gestatten, die solche Proteine oder
Polypeptide codieren.
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Somit
stellt die vorliegende Erfindung unter einem ersten Aspekt ein Verfahren
zum Screenen von Proteinen oder Polypeptiden bereit, das die Herstellung
einer Genbank und die Synthese einzelner Protein oder Polypeptide
umfasst, die dann gescreent werden können. Im Kontext der vorliegenden
Erfindung bedeutet der Ausdruck "einzelne
Proteine oder Polypeptide",
dass die von der Genbank exprimierten Proteine oder Polypeptide
einzeln identifizierbar sind und nicht Teile eines Pools bilden.
So können
zum Beispiel die Proteine oder Polypeptide als Anordnung exprimiert
werden, in der jedes Protein oder Polypeptid einen bestimmten Punkt oder
eine bestimmte Fläche
innerhalb der Anordnung einnimmt. Zum Beispiel kann eine Genbank
in Form von Kolonien oder Plaques erzeugt werden, die wiederum einzeln
gepickt und zu einer Anordnung zusammengestellt werden können. Die
Expression der Gene führt
wiederum zu einer Anordnung von Proteinen oder Polypeptiden ein
einem Anordnungsformat, die jeweils einen bestimmten Punkt oder
eine bestimmte Fläche
einnehmen.
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Die
von den Genbanken erzeugten Proteine oder Polypeptide können als "synthetische Proteine
oder Polypeptide" bezeichnet
werden, die durch In-vitro-Verfahren, wie In-vitro-Transkription
und -Translation, Ribosomen-Display und Phagen-Display, hergestellt werden. So können sie
auf dieser Basis von "natürlichen Proteinen" unterschieden werden,
die direkt aus Gewebe- oder Zellextrakten stammen.
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Die
hier beschriebenen Verfahren ermöglichen
also das Screenen von Proteinen und Polypeptiden und posttranslationalen
Modifikationen unter Verwendung von Genbanken als Ausgangspunkt
für die
Synthese "synthetischer" Proteine oder Polypeptide.
Im Allgemeinen wird dies durch Herstellung von Anordnungen von Proteinen
oder Polypeptiden als Mittel zu deren Screening erzielt. Genauer
gesagt, werden die Anordnungen durch In-vitro-Transkriptions- und
-Translationsverfahren erzeugt.
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Protein"anordnungen" – bei dieser Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden neue Verfahren zum Screenen von
Proteinen und Polypeptiden und posttranslationalen Modifikationen
unter Verwendung von Genbanken als Ausgangspunkt für die Synthese
synthetischer Proteine bereitgestellt. Bei dieser Ausführungsform
liefern diese Genbanken die Basis für die Auftrennung von einzelnen
Proteinen oder Gruppen von Proteinen, um Polypeptide sowie Polypeptidmodifikationen
nachzuweisen. Das Verfahren vermeidet prinzipiell die Verwendung
von Proteingelelektrophorese. Die Erfindung stellt Verfahren zur
Hochdurchsatz-Analyse von Proteinen in normalen und erkrankten Geweben
oder Zellen, hauptsächlich
zum Nachweis von Unterschieden zwischen normalen und Erkrankungsproteinen,
und außerdem
zur Analyse von Proteinveränderungen
in Bezug zu Medikamenten- und anderen Erkrankungsbehandlungen bereit.
Das Verfahren stellt auch eine Hochdurchsatz-Analyse der Bindung
oder biologischen Aktivität
von Banken von Proteinen oder Polypeptiden bereit, wenn diese lebenden
Zellen oder Geweben ausgesetzt werden. Außerdem stellt das Verfahren
auch das Protein-"Fingerprinting" von Individuen als
Alternative zum genetischen Fingerabdruck bereit, um Individuen und
unterschiedliche Gewebe oder Zellen zu identifizieren. Es ist ein
wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass Proteine entweder
in Pools oder in Anordnungen von einzelnen Proteinen analysiert
werden, wodurch, wenn Modifikationen, eine Bindung oder biologische
Aktivität
unter Ver wendung einer Mehrzahl an Verfahren nachgewiesen werden,
die Identität
des Proteins entweder direkt oder indirekt entweder durch seine Position
in einem bestimmten Pool oder seine Position an einer bestimmten
Stelle der Anordnung festgestellt werden kann. Es ist ebenfalls
ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass die Verfahren
den vergleichenden Nachweis von Unterschieden in Proteinen oder
Proteinmodifikationen zwischen verschiedenen Geweben oder Zellen
gestatten und die Verfahren deshalb einen Screen für diese
Unterschiede darstellen.
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Das
Verfahren basiert hauptsächlich
auf der Verwendung von synthetischen Proteinen, die mithilfe von DNA-Rekombinationsverfahren
hergestellt werden, insbesondere von Proteinen, die von einem oder
mehreren Genen durch In-vitro-Transkription
und -Translation (IVTT) hergestellt werden. Ein bevorzugter Aspekt
der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung synthetischer Proteine
mittels IVTT und ihre anschließende
Immobilisierung auf festen Phasen vor den Screenen nach einer Proteinmodifikation
oder Protein/Protein-Bindungswechselwirkungen. Es ist ein entscheidender
Aspekt dieser Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, dass die Herstellung synthetischer Proteine
von Anordnungen von Genen (wie von cDNAs, die in Vektoren kloniert
sind, die so gestaltet sind, dass sie die IVTT erleichtern) auf
eine derartige Weise durchgeführt
wird, dass synthetische Proteine, wenn sie hinsichtlich einer Proteinmodifikation,
Bindung oder biologischen Aktivität getestet worden sind, anhand
der Gene, von denen sie stammen und die diese synthetischen Protein
codieren, leicht identifiziert werden können, wobei die Gensequenz
die Identität
des Proteins enthüllt.
Solche Genanordnungen werden zum Beispiel bereitgestellt, indem
einzelne cDNA-Klone oder Gemische von Klonen an spezifische Loci
in einer Anordnung (wie in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte)
gepickt werden. Nach der IVTT (in der Regel nach Amplifikation der
cDNAs durch Verfahren, wie PCR) können Proteinproben aus allen
Loci der Anordnung entnommen und an spezifischen Loci einer anderen
Anordnung immobilisiert oder darin abgegeben werden, beispielsweise
in andere Mikrotiterplatten oder auf eine feste Phase, wobei die
Proben an einzelnen Loci auf der festen Phase abgegeben werden.
Wenn spezifische Proteinmodifikationen oder Proteinbindungsereignisse
von Proteinproben in der Anordnung nachgewiesen werden, dann kann
das spezifische Gen, das diese Proteine codiert, lokalisiert und
sequenziert werden, um das Protein von Interesse zu identifizieren.
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Es
liegt ebenfalls im Umfang der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung, dass die cDNA-Bank einen Satz variabler Moleküle codieren
kann, wie variabler Immunglobulinregionen (allgemein als einkettige
Fv-Regionen, die als SCAs (single-chain antibodies, einkettige Antikörper) bezeichnet
werden). Wenn diese variablen Moleküle an spezifischen Loci in
Anordnungen abgegeben werden, haben sie die Fähigkeit, an andere spezifische
Moleküle
(in der Regel Proteine) aus Zell- oder Gewebeproben zu binden. Diese Zell-
oder Gewebemoleküle
stellen dann aufgrund der Bindung an die variablen Moleküle in der
Anordnung im Wesentlichen eine geordnete Anordndung von Zell- oder
Gewebemolekülen
bereit. Das Vorliegen von Zell- oder Gewebemolekülen in solchen Anordnungen
oder eine Modifikation dieser Moleküle, beispielsweise durch Phosphorylierung
oder Wechselwirkung mit anderen Proteinen, kann dann in der Anordndung
untersucht werden. Die Identität
solcher Zell- oder Gewebemoleküle
kann anschließend
durch mehrere Verfahren bestimmt werden, insbesondere wenn die ursprünglichen
variablen Moleküle
in Isolation gehalten und zur Gewinnung des (der) Zell- oder Gewebemolekül(s/e) in
Isolation verwendet werden können.
Die Identität
dieser Zell- oder Gewebemoleküle kann
dann durch klassische biologische Mittel oder, wenn es sich bei
diesen um Proteine handelt, durch Proteinsequenzierung oder durch
Verfahren, wie 2D-Gel-Laufeigenschaften, bestimmt werden. Alternativ
kann die Identität
solcher proteinartigen Zell- oder Gewebemoleküle unter Verwendung eines Protein-Display-Systems,
wie des in dieses Patent aufgenommenen Ribosomen-Systems, bestimmt
werden, wobei eine cDNA-Bank zur Herstellung einer Bank von Proteinen,
die mit ihren Genen (oder einer RNA-Darstellung des Gens) verbunden
sind, verwendet wird, so dass nach Bindung an ein spezifisches variables
Molekül
die Identität
des bindenden Proteins durch Bestimmung der Nukleotidsequenz des
damit verbundenen Gens bestimmt werden kann.
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Als
Alternative zur Verwendung von IVTT für die Herstellung synthetischer
Proteine bei der Bildung von Proteinanordnungen ist ein anderer
Aspekt der Mikroanordnungsausführungsform
der Erfindung die Verwendung von "Polypeptid-Display"-Verfahren zur Erzeugung synthetischer
Polypeptide mit geeigneten Phänotypen
aus Genbanken, die eine große
Mischung von Polypeptiden codieren, wodurch die entsprechenden Gene
schnell und leicht gewonnen werden können. Es sind In-vitro-Verfahren
für das
Polypeptid-Display entwickelt worden, die einen größeren Umfang
hinsichtlich des Typs des dargebotenen Proteins gestatten als auf Zellen
basierende Display-Systeme, und insbesondere das Display von Proteinen
in Verbindung mit Ribosomen ("Ribosomen-Display"), das Proteine bereitstellen
kann, die über
den Ribosomenkomplex mit entsprechenden mRNAs verbunden sind, die
dann sequenziert werden können,
um die Identität
des Proteins zu enthül len.
Das erfindungsgemäße Verfahren
kann auch andere Protein-Display-Verfahren
umfassen, wie Phagen-Display.
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Bei
einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden Proteinmodifikationen gescreent, indem eine Genbank hergestellt
wird, die dann zur Erzeugung synthetischer Proteine, beispielsweise mittels
IVTT, verwendet wird, um anschließend mRNA und Protein aus diesen
Vektoren vorzugsweise unter solchen Bedingungen herzustellen, dass
die Ausbeute an synthetischen Volllängenproteinen, die von der mRNA
dissoziiert sind, maximiert wird. Um eine Überrepräsentierung von Proteinen oder
Polypeptiden von häufigen
mRNA-Spezies zu vermeiden, wird die Genbank normalisiert. Durch
den Einbau von modifizierten Aminosäuren, wie Biotinyllysin, oder
den Einbau einer Aminosäuresequenzmarkierung,
die vom Plasmidvektor codiert oder mittels PCR eingebracht wird,
oder durch chemische Modifikation des Proteins kann das synthetische
Protein als nächstes
auf einer festen Phase, wie einer Magnetkugel, über ein Biotin bindendes Protein (z.B.
Streptavidin) oder über
ein an die Sequenzmarkierung bindendes Protein, wie einen Anti-Markierungs-Antikörper, immobilisiert
werden. Bei einem Screen nach einer Proteinmodifikation werden durch
geeignete Verteilung der Ausgangsgene kleine Pools von Proteinen
oder einzelne Proteine in Anordnungen, beispielsweise in Mikrotitervertiefungen,
hergestellt und in diesen Anordnungen immobilisiert.
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Alternativ
können
die synthetischen Proteine in Anordnungen als einzelne kleine Pools
von Proteinen oder einzelne Proteine hergestellt und dann einzeln
(entweder manuell oder unter Verwendung einer automatischen Abgabevorrichtung)
an verschiedene Loci auf einer flachen festen Phase, wie einem Glas-"Chip", überführt werden,
wobei die Proteine mit funktionellen Einheiten auf der festen Phase
wechselwirken, was zur Immobilisierung führt. Als nächstes werden die synthetischen
Proteine mit Extrakten von Geweben oder Zellen behandelt, wodurch
in diesen Geweben oder Zellen vorhandene Enzyme Modifikationen an
den synthetischen Proteinen vornehmen können. Schließlich werden
diese Modifikationen dann unter Verwendung spezifischer Nachweissysteme,
wie fluoreszenzmarkierte Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, nachgewiesen.
Vergleicht man das Signal vom Nachweissystem von mehrfach wiederholten
Anordnungen synthetischer Proteine, die durch unterschiedliche Extrakte
aus Geweben und Zellen modifiziert wurden, dann zeigen Unterschiede
in diesen Signalen zwischen mehrfachen synthetischen Prote inen Unterschiede
in den Proteinmodifizierungaktivitäten aus diesen unterschiedlichen
Geweben oder Zellen.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden Protein-Protein-Bindungswechselwirkungen gescreent, indem
eine Genbank erzeugt wird, die dann zur Erzeugung synthetischer Proteine,
beispielsweise mittels IVTT, vorzugsweise in solchen Vektoren und
unter solchen Bedingungen verwendet wird, dass die Ausbeute an synthetischen
primären
Volllängenproteinen,
die von der mRNA dissoziiert sind, maximiert wird. Durch den Einbau
modifizierter Aminosäuren
oder einer Aminosäuresequenzmarkierung oder
durch chemische Modifikation des Proteins oder unter Verwendung
einer chemisch reaktionsfähigen
festen Phase kann das synthetische primäre Protein auf einer festen
Phase entweder unmittelbar nach der Synthese oder nach der Wechselwirkung
mit sekundären
Proteinen, so dass beliebige Protein-Protein-Wechselwirkungen gebildet
werden, immobilisiert werden. Durch geeignete Verteilung der Ausgangsgene
werden, wie bei Screens nach einer Proteinmodifikation, kleine Pools
von primären
Proteinen oder einzelne Proteine in Anordnungen, beispielsweise
in Mikrotitervertiefungen oder auf Glas-Chips, hergestellt und in
diesen Anordnungen immobilisiert. Als nächstes können diese synthetischen primären Proteine
gegebenenfalls mit Extrakten von Geweben oder Zellen behandelt werden,
wodurch in diesen Geweben oder Zellen vorhandene Enzyme Modifikationen
an den synthetischen Proteinen vornehmen können. Als nächstes gibt man ein oder mehrere (einschließlich einer
Bank von) sekundäre(s/n)
Protein(en) zu, um beliebige geeignete Bindungswechselwirkungen
von geeigneten sekundären
Proteinen mit den primären
Proteinen zu bilden. Gegebenenfalls können diese sekundären Proteine
synthetisch sein und an Ribosomen oder Phagen dargeboten werden,
so dass die Identität
der sekundären
Proteine anschließend
bestimmt werden kann.
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Alternativ
können
die sekundären
Proteine natürliche
Proteine sein, die aus Geweben oder Zellen stammen. Protein-Protein-Bindungswechselwirkungen
zwischen primären
und sekundären
Proteinen können dann
mit einem Spektrum an Verfahren nachgewiesen werden. Beispielsweise
kann das primäre
Protein auf einer festen Phase immobilisiert werden, und das Vorliegen
eines synthetischen sekundären
Proteins kann über
eine Aminosäuresequenzmarkierung,
die in das sekundäre
Protein eingebaut ist, unter Nachweis mit spezifischen Nachweissystemen,
wie fluoreszenzmarkiertem Anti-Markierungs-Antikörper, bestimmt werden. Wenn
das sekundäre
Protein mit seiner codierenden Nukleinsäure verbunden ist, wie bei spielsweise
für das Ribosomen-
oder Phagen-Display, dann kann das sekundäre Protein alternativ durch
einen PCR-Assay nach der damit verbundenen Nukleinsäure nachgewiesen
werden. Alternativ kann die Bindung des sekundären Proteins über die
Wirkung des sekundären
Proteins beim Blockieren einer Stelle auf dem synthetischen primären Protein
nachgewiesen werden, die in dem Assay-System nachgewiesen wird und
blockiert wird, wenn ein sekundäres
Protein bindet. Wenn das sekundäre
Protein ein natürliches
Protein ist, kann es alternativ direkt nach der Bindung, beispielsweise
durch Zugabe eines UV-aktivierbaren Biotinmoleküls, markiert und direkt nachgewiesen
werden, oder es kann laserverdampft und mittels MALDI (Matrix-gestützter Laserdesorptionsionisation) und
Massenspektroskopie nachgewiesen werden. Wenn die Bindung von sekundären Proteinen
an mehrfach wiederholte Anordnungen synthetischer primärer Proteine
zwischen unterschiedlichen Extrakten von Geweben oder Zellen verglichen
wird, dann zeigen Unterschiede in diesen Signalen zwischen mehrfachen
synthetischen Proteinen Unterschiede in den Protein-Protein-Bindungsaktivitäten aus
diesen verschiedenen Geweben oder Zellen.
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Es
ist offensichtlich, dass durch Nachweis eines Spektrums von Proteinmodifikationen
und durch Nachweis von Protein-Protein-Bindung mit einem üblichen
Nachweisformat, wie unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper gegen
Proteinmarkierungen oder -epitope, dann gleichzeitig ein paralleles
Screening nach einer Reihe unterschiedlicher Proteinmodifikationen
durchgeführt
werden kann, um Unterschiede zwischen verschiedenen Geweben und
Zellen zu screenen.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung verwendet man Protein-Protein-Wechselwirkungen
als Basis für
die Herstellung von Anordnungen sekundärer Proteine, insbesondere
natürlicher,
aus Gewebe oder Zellen stammender Proteine, die normalerweise unter
Verwendung von Standardtechnologie sehr schwierig umfassend anzuordnen
wären.
Die primären
Proteine umfassen einen sehr unterschiedlichen Satz von Proteinen,
wie Immunglobulinen, die einen unterschiedlichen Satz von Bindungsspezifitäten für einen
Satz von sekundären
Proteinen, wie natürlichen
Proteinen aus Gewebe- oder Zellextrakten oder synthetischen Proteinen
aus einer an Ribosomen oder Phagen dargebotenen Proteinbank, bereitstellen. Beispielsweise
stammen die primären
Proteine aus einer an Ribosomen dargebotenen Bank von variablen
Regionen einkettiger Antikörper
(SCA), die durch direkte PCR-Amplifikation variabler Immunglobulinregionen
aus Säuger-B-Lymphozyten
und Klonierung in geeignete Vektoren für die In-vitro- Transkription hergestellt
wurde. Mitglieder der SCA-Bank werden entweder einzeln oder in Gruppen
in Mikrotitervertiefungen oder direkt auf einer festen Phase, wie
einem Glas-Chip, angeordnet, und die SCA-Proteine werden mittels
IVTT hergestellt und über
eine Proteinmarkierung oder mittels direkter chemischer Kupplung
an eine feste Phase immobilisiert. Dann wird eine Mischung natürlicher
Proteine aus einem Gewebe- oder Zellextrakt oder eine Mischung synthetischer
Proteine, die aus einer Genbank stammen, (zum Beispiel an Ribosomen
oder Phagen dargebotener Proteine) im Ganzen zu der Anordnung der
primären
Proteine, wie SCAs, hinzugefügt,
wobei die Bindungsspezifität,
die die primären
Proteine für
die sekundären
Proteine besitzen, zu einer Anordnung der sekundären Proteine führt, wobei
entweder einzelne sekundäre
Proteine oder Gruppen von sekundären
Proteinen an einzelne SCAs binden. Die erzielte Anordnung von sekundären Proteinen
wird zwischen verschiedenen Extrakten von Geweben und Zellen verglichen,
dann zeigen Unterschiede in diesen Signalen zwischen mehrfachen
synthetischen Proteinen Unterschiede im Vorliegen von Proteinen
aus diesen verschiedenen Geweben oder Zellen. Alternativ können diese
Proteine auch hinsichtlich verschiedener Modifikationen, wie Phosphorylierung, getestet
werden, indem beispielsweise fluoreszenzmarkierte Antikörper für den Nachweis
dieser Modifikationen verwendet werden.
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Es
ist ein besonderer Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass entweder
synthetische oder natürliche Proteine
in Anordnungen von einzelnen oder mehreren Proteinen aufgeteilt
werden, um Vergleiche im Hinblick auf das Vorliegen oder eine Modifikation
dieser einzelnen einen oder mehreren Proteinmitglieder der Anordnung
zwischen verschiedenen Gewebe- oder Zellextrakten zu ermöglichen
oder eine Analyse der Bindung oder von biologischen Aktivitäten dieser
Proteinmitglieder an lebenden Zellen oder lebendem Gewebe bereitzustellen.
Während
Anordnungen in Mikrotiterplatten leicht durchgeführt werden können, indem
einzelne Mitglieder von Gruppen von Klonen aus einer cDNA-Bank in
die einzelnen Vertiefungen der Platte verteilt werden, führt diese
manuelle (oder robotergesteuerte) Anordnungstechnologie zu der physikalischen
Schranke der Wände
der Vertiefungen zwischen verschiedenen Proben, und dies macht es
schwierig, anschließende
Lösungen,
wie Waschlösungen
und Banken sekundärer
Proteine, schnell und exakt zuzugeben. Außerdem stellt die Verwendung
von Mikrotiterplatten eine Grenze für die Dichte an angeordneten
Proteinen dar, wobei diese Grenze durch die Dichte an Vertiefungen
in den erhältlichen
Mikrotiterplatten vorgegeben wird. Daher ist es wünschenswert, über Verfahren
zu verfügen,
die keine Anordnung von Proteinen ohne physikalische Schranken zwischen
den Proteinen erfordern.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung, bei der Anordnungen von Proteinen ohne physikalische
Schranken hergestellt werden, wird die räumliche Verteilung von Proteinen
in Anordnungen entweder durch direkte räumliche Immobilisierung einzelner
synthetischer Proteine, die beispielsweise über Ribosomen-Display aus einer
Genbank stammen, oder durch räumliche
Immobilisierung von Nukleinsäuren,
insbesondere von synthetischer DNA, erreicht, an die Nukleinsäuren hybridisiert
werden, die mit einer synthetischen Proteinbank verbunden sind,
um Mitglieder der Proteinbank indirekt räumlich zu immobilisieren. Zur
direkten räumlichen
Immobilisierung werden entweder aus einer Gewebe- oder Zellgenbank
stammende synthetische Proteine immobilisiert, oder synthetische
Proteinsonden, wie SCAs, werden derart immobilisiert, dass eine
Mischung sekundärer
Proteine zugegeben werden kann, wodurch diese je nach ihren Bindungsspezifitäten zu einzelnen
Proteinsonden räumlich
verteilt werden. Somit stellt die Erfindung neue Typen von Protein-Chips
bereit (vgl. Hutchens & Yip,
Rapid Comms. Mass Spec. 7, (1993), S. 576). Die Immobilisierung
synthetischer Proteine auf dem Chip wird entweder durch kovalente
oder nichtkovalente Bindung erreicht. Besonders geeignet ist die
Immobilisierung unter Verwendung von Biotineinheiten, die durch
Zugabe von Biotinyllysin-tRNA während
der Translationsreaktion in das Protein eingebaut werden. Nach dem
Einbau von Biotin können
synthetische Proteinmoleküle
dann leicht auf Festphasen-Streptavidin oder Festphasen-Anti-Biotin-Antikörpern immobilisiert
werden. Üblicherweise
wird dies durch Verwendung einer Roboter-Abgabevorrichtung erleichtert,
die mittels In-vitro-Transkription und -Translation hergestellte
Proteinproben auf spezifische Positionen in einer Platte mit mehreren
Vertiefungen oder auf eine feste Phase, wie einen Glas-Chip, aliquotieren
kann. Eine derartige Roboter-Abgabevorrichtung ist besonders wichtig
für die
Herstellung mehrfach wiederholter Anordnungen synthetischer Proteine,
bei denen identische Proteine an identischen Loci innerhalb der
mehrfachen festen Phasen immobilisiert werden. Bei der direkten
Immobilisierung unter Verwendung von Biotinyllysin kann freie Biotinyllysin-tRNA,
die nicht in das synthetische Protein eingebaut wurde, bei einigen
Proben Schwierigkeiten bereiten, wobei die freien Biotingruppen
den Zugang zu immobilisierten Streptavidinmolekülen blockieren. Geeigneterweise
kann dies überwunden
werden, indem die Erschöpfung
der Biotinyllysin-tRNA im Translationsreaktionsgemisch gewährleistet
wird (naszierende Proteine können
dann durch Zugabe von unmodifizierter Lysin-tRNA ver vollständigt werden);
alternative Strategien sind die Verwendung fester Phasen, bei denen
die Anzahl an Biotinbindungsstellen im Überschuss zu den Anzahlen an
mit Lysin verbundenen Biotinmolekülen vorliegt, oder ein Molekularsiebfiltrationsschritt
zur Entfernung kleiner Moleküle,
wie Biotinyllysin-tRNA. Eine andere Strategie besteht darin, in
das Translationsreaktionsgemisch am Ende des Translationszeitraums
eine synthetische mRNA-Matrize zu geben, die ein lysinreiches (Poly)peptid
codiert und die dann überschüssige freie
Biotinyl-tRNAs einbauen kann. Eine derartige Matrize codiert ferner
eine Peptidsequenz (beispielsweise einen Polyhistidinschwanz), die
anschließend
zur Entfernung des lysinreichen synthetischen Proteins aus dem Reaktionsgemisch
verwendet werden kann (zum Beispiel unter Verwendung von Kugeln
mit Antikörpern
gegen den Polyhistidinschwanz). Auf diese Weise werden die freien
Biotinyllysingruppen vor der Immobilisierung der synthetischen Proteine
aus dem Translationsgemisch entfernt.
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Eine
nichtkovalente Anheftung der Proteine kann auch durch Markierung
der Proteine, beispielsweise mit Biotin unter Verwendung eines kommerziell
erhältlichen
Reagenzes, wie Sulfo-SBED (Pierce & Warriner, Chester, GB), das dann
mit Avidin umgesetzt werden, erleichtert werden. Eine kovalente
Anheftung der Proteine kann auch durch Aktivierung der Proteine
mit reaktiven Spezies, um die Vernetzung zu erleichtern, auf eine
beliebige herkömmliche
Weise, wie den in O'Sullivan
et al. (Anal. Biochem. 100 (1997), 108) beschriebenen, erzielt werden.
Eine Anheftung von Proteinen könnte
auch durch Einbau spezifischer Aminosäuresequenzen innerhalb der
synthetischen Proteine, wie endständiger Polyhistidinsequenzen,
die dann entweder an Festphasen-Nickelchelate oder Anti-Polyhistidin-Antikörper als
Mittel zur Erzielung von Immobilisierung binden können, erreicht
werden. Alternative Verfahren zur direkten Bindung synthetischer
Proteine umfassen die Bindung an Ribosomen dargebotener Proteine über die
Immobilisierung der damit verbundenen RNA, beispielsweise unter
Verwendung eines RNA-bindenden Proteins (wie HIV-tat-Protein) oder
durch Hybridisierung der RNA an synthetische DNA-Moleküle auf der
festen Phase.
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Für eine indirekte
Immobilisierung von Proteinen über
Nukleinsäuren
kann die damit verbundene mRNA in einem Protein-Ribosom-mRNA-Komplex
mit einer Nukleotidsequenzmarkierung hergestellt werden, die ursprünglich von
dem die mRNA codierenden Plasmidvektor codiert wird. Die Nukleotidsequenzmarkierung
kann in der Plasmidvektorpräparation
variabel oder randomisiert sein, beispielsweise indem der Plasmidvektor
unter Verwendung einer synthetischen Region her gestellt wird, die
von einer zufallsgemäßen Oligonukleotidmischung
(mit geeigneten Enden, die mit dem Vektor hybridisieren) codiert
wird, so dass eine Sequenzmarkierung zufallsgemäß zum Beispiel an das 5'-Ende der mRNA platziert
wird. Nach der Herstellung der Protein-Ribosomen-mRNA-Komplexe von
der Genbank können
dann die mRNA-Sequenzmarkierungen an eine Anordnung synthetischer
Oligonukleotide hybridisiert werden, die einzeln über eine
feste Oberfläche, wie
einen Glasobjektträger
(einem "DNA-Biochip"), aufgebracht worden
sind. Auf diese Weise können
schließlich
einzelne Proteine an spezifischen Stellen auf dem Biochip positioniert
werden. Die räumlich
angeordneten Proteine können
dann hinsichtlich einer Modifikation durch Gewebe- oder Zellextrakte
analysiert werden, beispielsweise unter Verwendung fluoreszierender
Antikörper,
um nach diesen Modifikationen zu screenen. Ferner können die
Anordnungen zur Identifizierung von Proteinen verwendet werden,
die an die einzelnen Protein auf dem Biochip binden oder diese modifizieren.
Die Identität
der modifizierten Proteine oder der an Protein-Protein-Wechselwirkungen
beteiligten Proteine kann anschließend aus der bekannten Sequenz
des immobilisierten Oligonukleotids auf dem Chip bestimmt werden,
wobei diese Sequenz als Sonde in der Plasmidbank (zum Beispiel mittels
PCR) eingesetzt wird, um das spezifische Gen zu identifizieren,
das mit der komplementären
Sequenzmarkierung in der Plasmidbank verbunden ist. Die Identität von Proteinen
kann alternativ mittels PCR-Amplifikation der mRNA-Sequenz, die
mit dem einzelnen Protein verbunden ist, erzielt werden. Deshalb betrifft
diese Ausführungsform
einen Protein-Anordnungs-Biochip, wobei im Prinzip einzelne Proteine
an einzelnen Loci auf dem Chip positioniert sind. Alternativ kann
die Identität
des Proteins bestimmt werden, wenn das primäre oder sekundäre Protein
mit einem zufallsgemäßen Satz
von Proteinsequenzmarkierungen hergestellt wird, die zum Beispiel
unter Verwendung einer Mischung von Antikörpern gegen diese Sequenzmarkierungen
abgefragt werden können.
Werden die synthetischen Proteine beispielsweise auf eine Weise
hergestellt, dass ein Terminus entweder eine zufallsgemäße oder
halb zufallsgemäße Abfolge
von Aminosäuren
umfasst, von denen jede durch einen Antikörper aus einer Bank von Antikörpern mit
geeigneten Markierungen nachgewiesen werden kann, dann kann die
Bindung von einem oder mehreren spezifischen Antikörpern die Identität des synthetischen
Proteins bestimmen. Wenn zum Beispiel ein Terminus des Proteins
eine zufallsgemäße 8-Aminosäuren-Sequenzmarkierung
enthält
und eine Bank von SCAs konstruiert und an SCAs angereichert wurde,
die an eine entsprechende Mischung synthetischer Peptide binden,
dann binden einzelne oder kleine Gruppen von SCAs an spezifische
Peptide, und die Peptide (und damit die synthetischen Proteine)
können
anhand der Kenntnis der Spezifität
einzelner SCAs identifiziert werden.
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Von
der vorliegenden Erfindung werden ferner Verfahren umfasst, bei
denen Gemische modifizierter Proteine oder wechselwirkender Proteine
vor der Analyse von Unterschieden zwischen verschiedenen Geweben
oder Zellen vorselektiert werden. Zum Beispiel werden primäre synthetische
Proteine, die durch Display-Verfahren, wie Ribosomen-Display, erzeugt
wurden, wobei einzelne, ein Protein codierende mRNA-Moleküle mit dem
Protein verbunden bleiben, einer Behandlung durch Gewebe- oder Zellextrakte
unterworfen und dann einer Selektion unter Verwendung von auf einer
festen Phase immobilisierten Antikörpern gegen diese Modifikationen
unterworfen. So werden modifizierte Proteine mit den damit verbundenen
Nukleinsäuren
isoliert, und das Profil an isolierten Proteinen kann mit verschiedenen
Mitteln, einschließlich
einer einfachen Analyse von PCR-Produkten, zum Beispiel durch Agarosegelelektrophorese,
und Vergleich der Ergebnisse von Behandlungen mit verschiedenen
Zellen und Geweben bestimmt werden. Ebenso könnten für primäre natürliche Proteine, die dann zum "Fangen" sekundärer synthetischer
Proteine über
Protein-Protein-Bindung verwendet werden, wechselwirkende Proteine
zum Beispiel unter Verwendung eines Antikörpers gegen eine Markierung
an dem sekundären
synthetischen Protein isoliert und ein Profil der wechselwirkenden
Proteine wiederum durch Analyse von PCR-Produkten von den mit dem
synthetischen Protein verbundenen Nukleinsäuren bestimmt werden.
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Von
der vorliegenden Erfindung werden ferner Verfahren umfasst, bei
denen aus Genbanken erzeugte, synthetische Proteine einer Proteingelelektrophorese
zur Analyse von Proteinmodifikation oder Protein-Protein-Bindung
unterzogen werden. Es ist gut dokumentiert, dass posttranslationale
Modifikationen, wie Proteolyse oder Phosphorylierung, die elektrophoretische
Beweglichkeit eines Proteins verändern
(Phizicky & Fields,
Microbiol. Rev., 59, (1995), S. 94). Eine Ausführungsform der Erfindung stellt
deshalb ein Verfahren bereit, wobei mit Erkrankung verbundene Modifikationen
unter Verwendung von 2D-Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Zum
Beispiel wird eine cDNA-Bank für
anschließende
IVTT oder Ribosomen-Display konstruiert. Um die anschließende Reinigung
der Proteine zu erleichtern, kann eine 3'-Markierung, wie His oder Flag, in den
verwendeten Transkriptionsvektor eingebaut werden. Dies wird durch
molekularbiologische Standardtechniken erreicht, die dem Fachmann
geläufig
sind. Um den anschließenden
Nachweis der Proteine zu erleichtern, können sie während des Translationsvorgangs
mit Markierungen, wie 35S oder Biotin, markiert werden. Nach der
Translation können
die Proteine, wenn erforderlich, gereinigt werden, um Ribosomen
und andere Faktoren zu entfernen, beispielsweise mittels Leiten
des Translationsgemischs über
eine Affinitätsmatrix, die
Liganden, wie Anti-Flag-Antikörper oder
Nickel, enthält,
wenn die Proteine 3'-Flag-
oder Polyhistidinmarkierungen besitzen, oder unter Verwendung von
Anti-Ribosom-Antikörpern
zur Entfernung von Ribosomenkomponenten auf einer festen Phase oder
durch einfache Ultrazentrifugation von Ribosomen. Protein aus einer
klinischen Probe (die entweder unmarkiert oder zum Beispiel durch
Umsetzung mit einer fluoreszierenden Einheit markiert sind) wird
dann mit der gereinigten, in vitro translatierten Bank inkubiert,
um entweder eine Modifikation oder Proteinwechselwirkungen mit dem
synthetischen Protein herbeizuführen.
Die Gesamtreaktion wird dann mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt
(Cash, J. Chromatography 698 (1995), S 203), und die erhaltenen
Gele werden unter Verwendung von geeigneter Computersoftware, wie
Phoretix-2D (Phoretix International, Newcastle upon Tyne, GB), analysiert.
Eine Kontrollreaktion wird derart durchgeführt, dass die synthetische
Proteinbank mit Gesamtprotein aus einer anderen klinischen Probe,
zum Beispiel einer normalen Probe, wenn es sich bei der ersten um
eine Erkrankungsprobe handelt, umgesetzt wird. Mit einer Erkrankung zusammenhängende Modifikationen
oder Protein-Protein-Wechselwirkungen werden als einzigartige Banden identifiziert,
die mit den erkrankten Proteinen und nicht mit den Kontrollproteinen
beobachtet werden. Um eine schnelle Identifizierung des Gens zu
erleichtern, das mit dem durch die 2D-Gel-Alyse identifizierten
Protein zusammenhängt,
kann die synthetische Proteinbank zu Beginn in eine Reihe von Pools
unterteilt werden, wobei jeder Pool einen Anteil der Bank enthält. Dies
wird durch Aufteilen des Anfangsgemischs von Genen erreicht. Jeder
Pool wird dann wie oben beschrieben gescreent, um einen Pool zu
identifizieren, der ein Protein von Interesse enthält. Der
Transkriptionsmix für
diesen Pool wird dann erneut unterteilt und das Screeningverfahren
wiederholt. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von allmählich immer
kleineren Pools von Proteinen wiederholt, die an Ribosomen dargeboten
werden, bis ein einzelner Klon identifiziert wird, der das Protein
von Interesse codiert. Alternativ wird nach der Identifizierung
eines potenziell mit einer Erkrankung in Verbindung stehenden Proteins
durch 2D-Gel-Analyse das Protein gemäß Standardprotokollen (Hager & Burgess, Anal. Biochem.,
109, (1980), S. 76) aus den Gel gereinigt, und das gereinigte Protein
wird mittels Panning mit einer scFv-Bank selektiert, um (einen) Antikörper zu
identifizieren, der (die) das Protein erkenn(t/en). Der (die) Antikörper wird
(werden) dann zum Screenen einer syntheti schen Proteinbank verwendet,
die von der cDNA der Erkrankungsprobe hergestellt wurde, um das
Protein mit seiner damit verbundenen Genmarkierung zu identifizieren.
Als alternatives, sehr innovatives Verfahren zur Identifizierung
des Proteins kann jedes rekombinante Protein mit einer Aminosäuresequenzmarkierung
hergestellt werden, die ursprünglich
vom Plasmidvektor codiert und anschließend in das Protein eingebaut
wird, zum Beispiel indem eine Leader-Sequenz in die klonierten cDNAs
eingebaut wird, die vom Vektor oder aus einem Gemisch synthetischer
Oligonukleotide stammt, die dazu verwendet werden, die cDNA für die anschließende Klonierung
in den Vektor zu kopieren. Die Nukleotidsequenzmarkierung kann in
der Plasmidvektorpräparation
variabel oder randomisiert sein, beispielsweise indem der Plasmidvektor
unter Verwendung einer synthetischen Region hergestellt wird, die
von einer zufallsgemäßen Oligonukleotidmischung
(mit geeigneten Enden, die mit dem Vektor hybridisieren) codiert
wird, so dass eine Sequenzmarkierung zufallsgemäß zum Beispiel am 5'-Ende der mRNA platziert
wird. Nach der Herstellung des Proteingemischs, beispielsweise mittels
IVTT oder Ribosomen-Display,
und Auftrennung dieser Proteine durch 2D-Gelelektrophorese können dann
einzelne Proteine analysiert werden, indem sie mit Antikörpern durchmustert
werden, die für
die unterschiedlichen Sequenzpermutationen spezifisch sind.
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Es
ist ersichtlich, dass eine hauptsächliche Anwendung der vorliegenden
Erfindung die Analyse von Proteinen, Proteinmodifikationen und Protein-Protein-Wechselwirkungen
ist, die mit menschlicher Erkrankung oder mit dem Gesundheitsfürsorge-,
dem individuellen oder dem Medikamentenbehandlungsstatus von Menschen
in Zusammenhang stehen. Die Erfindung umfasst die Verwendung "klinischer Proben", wobei sich dieser
Begriff auf Proben bezieht, die Gewebe, Blut oder Anderes sein können, von
dem erwartet werden kann, dass es durch die besondere Erkrankung
betroffen ist. Die Erkrankungsproben beziehen sich auf eine Probe, von
der gezeigt werden kann, dass sie von einer Erkrankung, einem Gesundheitsfürsorgestatus
oder einem Medikamentenbehandlungsstatus betroffen ist. Die normale
Probe betrifft eine Probe, die nicht von der Erkrankung betroffen
ist und einen normalen Gesundheitsfürsorgestatus wiedergibt, aber
zwischen Individuen variieren und für das anschließende Ergebnis
einer Medikamentenbehandlung relevant sein kann. Zu Vergleichszwecken
bei der Suche nach mit Erkrankung in Verbindung stehenden Proteinen
oder Proteinmodifikationen/-wechselwirkungen werden die normalen
und die Erkrankungsproben im Idealfall aufeinander abgestimmt, um
eine durch die Population eingebrachte Heterogenität zu verringern.
Dies kann erzielt werden, indem man normale und Erkrankungsproben
von einem einzigen Patienten gewinnt (z.B. kanzeröses Brustgewebe
und nicht betroffenes Brustgewebe), oder alternativ durch Poolen
von Erkrankungs- und normalen Proben von einer Reihe verschiedener
Patienten.
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Die
Herstellung von cDNA-Banken sowohl aus normalen als auch klinischen
Proben erfolgt mittels Standardtechniken, welche die Isolation von
mRNA, gefolgt von reverser Transkription zur Erzeugung von cDNA,
umfassen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. Aufl., Cold Spring Harbor Press, 1989), oder kann alternativ
unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits, z.B. dem PolyATract-System (Promega,
Southampton, GB), erreicht werden. Die Klonierung der cDNAs in einen
Vektor, der zur Herstellung synthetischer Proteine geeignet ist,
wie beispielsweise In-vitro-Darbietung mittels Ribosomen-Display,
sowie die Bedingungen für
die In-vitro-Darbietung der Proteine sind wie zuvor (zum Beispiel
in Hanes und Plückthun, Proc.
Natl. Acad. Sci. 94 (1997), S. 4937) beschrieben. Die Isolation
von Gesamtprotein aus den Proben wird durch Standardverfahren erzielt,
wie in Bollag & Edelstein
(Protein Methods, Wiley-Leiss, 1991) im Einzelnen erläutert. Ribosomen-Display – Bei der
zweiten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein neues In-vitro-Verfahren für das Ribosomen-Display
bereitgestellt, das die Expression von Volllängenpolypeptiden von einem
Ribosom durch selektive Arretierung der mRNA-Translation am 3'-Ende der mRNA, so
dass der Ribosomenkomplex noch mit dem Volllängenpolypeptid verbunden bleibt,
maximiert. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Proteine,
die an spezifischen Stellen in mRNA-Molekülen gebunden sind, die weitere Translation
der mRNA blockieren, was das Anhalten eines mRNA-Ribosom-Komplexes mit dem
damit verbundenen Polypeptid gestattet. Die Erfindung umfasst auch
optionale Mittel zum Verhindern neuer Translationsstarts kurz vor
dem Polypeptid-Screening.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst erstens die Herstellung einer Bank von DNA-Molekülen, üblicherweise
in einem Plasmidvektor, wobei diese DNA-Moleküle verschiedene Polypeptide
codieren und die diese Polypeptide codierende DNA in mRNA-Moleküle transkribiert
wird. Gewöhnlich
umfasst der Klonierungsvektor für
die DNA-Moleküle
einen stromaufwärts
gelegenen Promotor, wie einen Promotor für T7-RNA-Polymerase. So wird
die gepoolte Bank von DNA-Molekülen beispielsweise
durch Zugabe von T7-DNA-Polymerase und Ribonukleotiden transkribiert,
so dass eine Bank von mRNA-Molekülen
hergestellt wird. Danach wird die Bank von RNA-Molekülen unter
Verwendung einer Ribo somenpräparation,
wie einer E.-coli-S30-Fraktion (Chen HZ und Zubay G, Methods in
Enzymology, Bd. 101 (1983) S 674–690), translatiert. Danach
werden die Ribosomenkomplexe, die miteinander verbundenes Polypeptid,
Ribosom und mRNA umfassen, gewöhnlich hinsichtlich
der Bindung an einen Liganden gescreent, der auf einer festen Phase
immobilisiert ist, und die mRNA wird aus den so erhaltenen immobilisierten
Komplexen für
die reverse Transkription und die Amplifikation mittels PCR freigesetzt,
um DNA-Moleküle
anzureichern, die Polypeptide codieren, die an den Zielliganden
binden. Diese DNA-Moleküle
können
entweder direkt für
die Transkription eingesetzt oder kloniert werden, um die Sequenzen
von DNA zu bestimmen, die Polypeptide codiert, die an den Zielliganden
binden. Für
den Zweck dieser Ausführungsform
der Erfindung wird von der mRNA, die von den DNA-Molekülen codiert
wird, angenommen, dass sie 3 Segmente umfasst, die von 5' nach 3' ein variables Segment,
ein Spacersegment und ein Terminationssegment mit einem optionalen
Anti-Initiationssegment 5' von
dem variablen Segment umfassen. Das Polypeptid soll die Protein-
oder Peptidsequenz bedeuten, die von dem variablen Segment der mRNA über einen
Ribosomenkomplex in Protein translatiert wird. Das variable Segment
soll mRNA-Sequenzen
bedeuten, die das Volllängenpolypeptid
codieren. Das Spacersegment soll mRNA-Sequenzen bedeuten, die Proteinsegmente
codieren, die mit den variablen Segmenten fortlaufend sind und es
gestatten, dass dies fertiggestellten Proteine vollständig aus
dem Ribosom heraustreten und optimale dreidimensionale Strukturen annehmen,
während
sie immer noch über
den Ribosomenkomplex an die sie codierende mRNA gebunden bleiben.
Das Terminationssegment soll für
mRNA-Sequenzen stehen, an die sich die Bindungseinheit entweder
direkt oder indirekt anheftet, oder alternativ für mRNA-Sequenzen, die eine
Polypeptidbindungseinheit codieren, die mit dem Spacersegment fortlaufend
ist oder stromaufwärts
davon gelegen ist, an die sich spezifische Proteine anheften und
die Translation blockieren. Die Bindungseinheit soll entweder ein
beliebiges Molekül
bedeuten, das an die mRNA am ribosomalen Komplex binden kann, oder
ein beliebiges Molekül,
das an das translatierte Polypeptid am ribosomalen Komplex binden
kann, was zum Anhalten der Translation führt. Die Bindungseinheit bindet
gewöhnlich
direkt auf sequenzspezifische Weise an mRNA oder kann indirekt an die
mRNA gebunden werden, zum Beispiel nach Hybridisierung eines synthetischen
DNA- oder RNA-Moleküls an
die mRNA und Hinzufügen
der Bindungseinheit über
einen Liganden an diesen Molekülen.
Das optionale Anti-Initiationssegment liegt benachbart zum Translationsinitiationscodon
und stellt Sequenzen für
die Anheftung, gewöhnlich
einer anderen Bindungseinheit, bereit. Das Anti- Initiationssegment verhindert neue Translationsinitiationen
kurz vor dem Screenen der translatierten Polypeptide. Der Zielligand
ist das Molekül,
mit dem die Bank im Hinblick auf die Bindung spezifischer Proteine
und die anschließende
Gewinnung der damit verbundenen mRNA gescreent wird.
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Das
variable Segment der mRNA-Moleküle
umfasst entweder bekannte Volllängenpolypeptidtypen, wie
einkettige Antikörper
(SCAs, die variable Immunglobulinregionen umfassen, die von schweren
und leichten Ketten stammen und miteinander verbunden sind, so dass
eine funktionelle Bindungsdomäne
erhalten wird), oder zufallsgemäße oder
halb-zufallsgemäße Sequenzen.
Chimäre
Sequenzen, die durch zufallsgemäße/halb-zufallsgemäße Verbindung
bekannter Polypeptidtypen oder Regionen hergestellt werden, können ebenfalls
verwendet werden. Bei bekannten Polypeptidtypen, wie SCAs, können spezifische
Segmente der Gene randomisiert werden, wie beispielsweise die CDRs
in SCAs. Zuerst werden große
Sammlungen von DNA-Molekülen,
die bekannte zufallsgemäße oder
halbzufallsgemäße Sequenzen
codieren, hergestellt und dann in den Transkriptionsvektor kloniert.
Dieser Transkriptionsvektor liefert andere Segmente für den Einbau in
die anschließenden
mRNA-Moleküle,
wie nachstehend eingehend erläutert
wird: Der Vektor stellt in der Regel auch ein Translationsinitiationscodon
und eine Ribosomenbindungsstelle für die mRNA bereit. Bei von
der DNA codierten längeren
Polypeptidmolekülen
ist es erforderlich, das Vorliegen von Stoppcodons in der mRNA, die
die Translation terminieren, zu verringern oder zu beseitigen. Es
ist eine Voraussetzung dieser Erfindung, dass solche Stoppcodons,
einschließlich
Stoppcodons, die für
spezifische Proteine natürlich
sind, beseitigt werden, damit Volllängenpolypeptide erhalten werden.
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Bei
DNA, die bekannte Proteine, wie einkettige Antikörper, codiert, erfordert dies
einfach die Beseitigung des üblichen
Stoppcodons oder alternativ die Verwendung von Nonsense-Suppressions-tRNAs
in der Translationsreaktion, um spezifische Aminosäure an der
Position der Stoppcodons einzubringen. Bei Gemischen von zufallsgemäßen oder
halb-zufallsgemäßen DNA-Molekülen, die
mittels chemischer Synthese hergestellt werden, kann die Häufigkeit
Stoppcodons, die in einer beliebigen bestimmten Sequenz auftreten, durch
Manipulation der DNA-Basiszusammensetzung bei der Synthesereaktion
verringert werden, und außerdem
können
Nonsense-Suppressions-tRNAs bei der Translationsreaktion eingesetzt
werden. Das Spacersegment der mRNA-Moleküle liefert eine Polypeptidregion
stromabwärts
des variablen Segments, das den Kanal des Ribosoms durchspannt,
so dass das Volllängenpolypeptid
vollständig
aus dem Ribosom heraustreten kann und richtige Proteinfaltung und
ungehinderter Zugang zum Zielliganden ermöglicht werden. Im Allgemeinen
codiert dieses Segment eine Region von mehr als 50 Aminosäuren sowie
eine Region, bei der es unwahrscheinlich ist, dass sie die Faltung
des Volllängenpolypeptids
behindert, wie beispielsweise eine vollständige Domäne aus einem anderen Protein
oder einen glycin-/alaninreichen Linker, wie (Gly4Ser)10. Bei einigen translatierten
Proteinen kann das Spacersegment einen fortlaufenden Abschnitts
aus dem Proteins selbst umfassen, wobei dieser Abschnitt nicht für die korrekte
Faltung des variablen Segments oder für die Bindung an den Zielliganden
erforderlich ist.
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Das
Terminationssegment liefert eine stromabwärts gelegene mRNA-Sequenz für die direkte
oder indirekte Anheftung einer Bindungseinheit, die derart gestaltet
ist, dass sie die Translationstermination nach der Translation des
vollständigen
variablen Segments verhindert. Ein besonders bevorzugtes Verfahren
zur Anheftung eines Bindungseinheit ist indirekt unter Verwendung
eines synthetischen zwischengeschalteten Oligonukleotidmoleküls, das
zuerst an das Terminationssegment hybridisiert. Wenn ein solches
synthetisches Nukleotid mit einer spezifischen Bindungsstelle für die Bindungseinheit
ausgestattet ist, dann kann die Bindungseinheit ihrerseits an das
hybridisierte synthetische Oligonukleotid binden und sich dadurch
an das stromabwärts
gelegene Ende der mRNA anheften und die Translation blockieren.
Ein Beispiel für
dieses bevorzugte Verfahren ist die Verwendung eines Oligonukleotids,
das ein oder mehrere biotinylierte Nukleotide enthält, so dass
anschließend
Streptavidin binden kann, so dass ein Molekül bereitgestellt wird, das
die Translation blockiert. Die Verwendung von Molekülen, wie
Streptavidin, bietet außerdem
einfache Möglichkeiten
für eine
Vernetzung des naszierenden Proteins mit dem mRNA-Molekül, wobei
das naszierende Protein selbst aufgrund von zu dem In-vitro-Translationsreaktionsgemisch
zugegebenem Biotinyllysin (oder einer anderen biotinylierten Aminosäure) biotinyliert
sein kann. Ein weiteres Beispiel für dieses bevorzugte Verfahren
ist die Verwendung eines Oligonukleotids, das ein oder mehrere Nukleotide
enthält,
das/die mit einem Liganden, wie Fluorescein oder Dinitrophenol,
derivatisiert ist/sind, der dann durch einen monoklonalen Antikörper oder
ein Fragment davon gebunden werden kann. Dies macht auch die Verwendung
bispezifischer Moleküle,
wie bispezifischer Antikörper,
durchführbar,
die einerseits über
das synthetische Oligonukleotid an die mRNA und andererseits aufgrund
einer Aminosäuresequenz
an dem translatieren Protein oder Polypeptid auch an das translatierte
Protein oder Polypeptid binden können.
Andere Verfahren sind u.a. das Versehen des Terminationssegments
mit einer Sequenz, an die ein spezifisches Protein direkt, ohne
jeden dazwischen liegenden Hybridisierungsschritt, bindet. Ein Beispiel
für eine
solche Bindungseinheit ist das Eisenregulationsprotein (iron regulatory
protein, IRP). Das Terminationssegment liefert eine Stem-Loop-Struktur,
die durch Zugabe des IRP unter Bedingungen einer niedrigen Eisenkonzentration
stabilisiert wird, was somit zu einem sterischen Block der Ribosomentranslation
führt.
Anschließend
kann eine Selektion des naszierenden Peptids erfolgen. Die Verwendung
von IRP zur Arretierung des Ribosoms führt einen reversiblen Block
ein, so dass eine Zugabe von Eisen die Wiederaufnahme und somit
die Termination der Translation ermöglichen kann. Dies erleichtert
die Freisetzung der mRNA nach der Selektion des Polypeptids für die anschließende Transkription,
Sequenzierung oder cDNA-Klonierung. Weitere Beispiele für mRNA-Bindungseinheiten,
die an Sequenzen im Terminationssegment binden, sind u.a. das HIV-Protein
tat, das an einen als TAR bezeichneten RNA-Stem-Loop bindet (Dingwall
et al., PNAS, Bd. 86 (1989) S. 6925–6929), La-Antigen, das an
ein RNP-Motiv bindet (Chan EKL und Tan EM, Mol. Cell Biol., Bd.
7 (1987) S. 2588–2591)
und andere Proteine aus RNA-Viren, die an spezifische RNA-Sequenzen entweder
in einzel- oder doppelsträngiger
RNA binden, wobei die Letztere in mRNA über Haarnadelschleifen erzeugt
werden kann. Das Terminationssegment kann alternativ eine Stelle
für die
Anheftung einer Bindungseinheit codieren, die zusätzlich an
das synthetisierte Polypeptid selbst oder an den ribosomalen Proteinkomplex
bindet, um die Bindungseinheit zur Verhinderung von Translationstermination
weiter zu stabilisieren. Gegebenenfalls enthält das Terminationssegment
eine oder mehrere weitere mRNA-Regionen, die die Stabilität von mRNA
gegen Exonukleasen erhöhen,
wie die lpp- (E.-coli-Lipoprotein-) und Phage-T3-Terminatoren. Für den Fachmann ist insbesondere
ersichtlich, dass für
den hauptsächlichen
Aspekt dieser Ausführungsform
der Erfindung mRNAs mit einer Mehrzahl an Terminationssegmenten
hergestellt werden können,
an die eine Mehrzahl an Bindungseinheiten entweder indirekt, über die
anfängliche
Hybridisierung eines synthetischen Oligonukleotids oder eines anderen
Moleküls,
oder direkt über
die Erkennung und Bindung einer Bindungseinheit direkt an das mRNA-Molekül binden
kann.
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Das
benachbarte, optionale Anti-Initiationssegment ist derart gestaltet,
dass es Translationsinitiationen spät in der Translationsreaktion
verhindert, die nicht zu Volllängenproteinen
führen
und daher Polypeptide mit unvollständiger Faltung liefern können, die
eine unspezifische Bindung an Zielliganden bereitstellen könn ten. Das
Anti-Initiationssegment kann beispielsweise eine sekretorische Leader-Sequenz im translatierten
Polypeptid codieren, an die das Signalerkennungspartikel (signal
recognition particle, SRP) gebunden werden kann. Wenn SRP an das
Polypeptid gebunden hat, bewirkt es die Arretierung der weiteren
Translation durch Vernetzung des Polypeptids und der mRNA. Eine
Translationsarretierung kann auch unter Verwendung einer Kombination
der SRP54- und SRP9/14-Unterheiten des SRP erzielt werden (Siegel & Walter, Cell
Biol., Bd. 100 (1985) 1913–1921),
die an das naszierende Peptid bzw. die mRNA binden. Ein weiteres
Beispiel für
Anti-Initiationssequenzen liefern bestimmte eukaryotische Transkriptionsleadersequenzen,
wie diejenige des gp48-Gens des humanen Zytomegalievirus, das eine
stromaufwärts
gelegene 22-Codon-Sequenz enthält,
die die Translation des stromabwärts
gelegenen Cistrons reprimiert (Cao J und Geballe AP, Mol. Cell Biol.,
Bd. 16 (1996) S. 7109–7114).
Es wird angenommen, dass solche Leadersequenzen Peptide codieren,
die das Voranschreiten des Ribosoms zum stromabwärts gelegenen Cistron blockieren.
Weitere Beispiele für
Anti-Initiationssequenzen sind Sequenzen, die von Bindungseinheiten,
wie beispielsweise für
das vorstehende Terminationssegment, erkannt werden, wobei dazu
die von IRP, tat, La-Antigen und anderen viralen Proteinen gebundenen
Sequenzen gehören.
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Daher
stellt die Erfindung Zusammensetzungen von DNA-Banken bereit, die
mRNA-Moleküle
mit variablen, Spacer- und Terminationssegmenten und mit einem optionalen
Anti-Initiationssegment codieren. Vorzugsweise stellt die Erfindung
einen DNA-Vektor bereit, der die Spacer- und Terminationssegmente
codiert; das Anti-Initiationssegment ist optional. Im Allgemeinen
stellt der DNA-Vektor
auch das Translationsinitiationscodon und, für Translationen unter Verwendung
prokaryotischer Ribosomen, eine Ribosomenbindungsstelle einschließlich der
Shine-Dalgarno-Sequenz bereit. Für
eukaryotische Translationssysteme kann auch die Kozak-Translationsinitiationssequenz
mit der Konsensussequenz GCCGCCACCATGG hinzugefügt werden, und es kann wünschenswert
sein, stromaufwärts
der Translationsinitiationsstelle andere bekannte Sequenzen einzubringen,
um die Translation zu verstärken,
wie Enhancer oder Aktivatorsequenzen, einschließlich untranslatierter Leadersequenzen
von bestimmten Viren, wie dem Tabakmosaikvirus. Üblicherweise stellt der DNA-Vektor
auch einen starken Transkriptionspromotor bereit, der in Verbindung
mit einer RNA-Polymerase dazu verwendet wird, ein Bank von mRNA-Molekülen herzustellen,
die der DNA-Bank entspricht. Zu solchen Promotoren gehören diejenigen
für T7-RNA-Polymerase,
T3-RNA-Polymerase und SP6-RNA-Polymerase, und zusätzlich kann
von der DNA auch ein Promotor für
die RNA-abhängige
Polymerase, Qb-Replicase, codiert werden. Der DNA-Vektor stellt
ferner einen starken Transkriptionsterminator bereit, zum Beispiel
den Terminator des E.-coli-Lipoproteins oder den frühen Terminator
des Phagen T3. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden DNA-Fragmente, die die
variablen Segmente enthalten, in den DNA-Vektor kloniert, wobei
die DNA-Fragmente ein Minimum an oder keine Stoppcodons aufweisen.
Bei Banken, die bekannte Polypeptidtypen codieren, wie SCAs, werden
die DNA-Fragmente
unter Verwendung geeigneter Restriktionsstellen unidirektional kloniert.
Für den
Fachmann ist ersichtlich, dass eine Mehrzahl an replizierbaren DNA-Vektoren bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden kann, einschließlich Plasmid-, Bakteriophagen-,
Phagemid- und viraler Vektoren. Es ist ebenfalls deutlich, dass
eine DNA-Amplifikation durch Verfahren, wie PCR, als Alternative
zur Replikation von DNA in lebenden Zellen verwendet werden kann.
Es ist ebenfalls offensichtlich, dass die variablen Segmente zur
Herstellung der DNA-Bank von einer Reihe von Quellen bereitgestellt werden
können,
einschließlich
einer Vektorbank von DNA-Fragmenten, synthetischer DNA oder amplifizierter DNA.
Ferner können
die variablen Segmente als Ergebnis von Mutagenesereaktionen unter
Verwendung einer festen Matrize, zum Beispiel unter Verwendung von
fehleranfälliger
PCR, bereitgestellt werden. Es ist ebenfalls deutlich, dass die
variablen Segmente aus DNA direkt aus dem Genom eines lebenden Organismus
oder aus cDNA-Kopien von mRNAs dieses Organismus bestehen können. Wenn
zum Beispiel die DNA-Bank einkettige Antikörperfragmente umfasst, können diese
Fragmente von mRNA stammen, die variable Immunglobulinregionen codiert
und von B-Zellen innerhalb eines Organismus exprimiert wird. Alternativ
können
die Fragmente von genomischen variablen Regionen stammen. Auf diese
Weise stellt die Erfindung die Herstellung von Banken einkettiger
Antikörper
aus spezifischen Organismen, wie Mensch, bereit.
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Die
Erfindung stellt auch Zusammensetzungen von Banken von mRNA-Molekülen mit
variablen, Spacer- und Terminationssegmenten und mit einem optionalen
Anti-Initiationssegment
bereit. Vorzugsweise stellt die Erfindung eine Bank von mRNA-Molekülen bereit,
die die Spacer- und Terminationssegmente codieren, wobei die Anti-Initiationssequenz
optional ist. Die mRNA-Moleküle
umfassen jeweils ein Translationsinitiationscodon und, für Translationen
unter Verwendung prokaryotischer Ribosomen, eine Ribosomenbindungsstelle,
die die Shine-Dalgarno-Sequenz
umfasst. Für
eine Translation unter Verwendung eukaryotischer Ribosomen kann
die mRNA mit einem 5'-Capping-Nukleotid
synthetisiert oder dieses kann enzymatisch in die vorsynthetisierte
mRNA eingebracht werden. Stromaufwärts der Translationsinitiationsstelle
können
auch die Kozak-Translationsinitiationskonsensussequenz sowie weitere
bekannte Sequenzen zur Verstärkung
der Translation, wie Enhancer oder Aktivatorsequenzen, einschließlich untranslatierter
Leadersequenzen von bestimmten Viren, hinzugefügt werden. Vor oder während des
Translationsvorgangs wird/werden eine oder mehrere Bindungseinheiten
an das Terminationssegment der mRNA-Moleküle gebunden, wodurch die Translation angehalten
wird. Ebenfalls während
des Translationsvorgangs wird/werden eine oder mehrere Bindungseinheiten
an das optionale Anti-Initiationssegment,
das in den mRNA-Molekülen
vorliegt oder von diesen codiert wird, angeheftet und verhindert
somit neue Translationsinitiationen.
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Die
Erfindung stellt auch Zusammensetzungen von Banken translatierter
Polypeptidmoleküle
mit variablen und Spacersegmenten und einer optionalen Anti-Initiationsleadersequenz
bereit. Diese Proteinmoleküle
liefern variable Volllängensegmente
als Teil einer längeren
Polypeptidkette, die innerhalb der Ribosomen durch die Wechselwirkung
von Bindungseinheiten mit der mRNA angehalten wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Wirkungen mit dem Ribosom, so dass
eine weitere Translation des mRNA-Moleküls verhindert wird. Alternativ
kann sich das 5'-Ende an eine Bindungseinheit
indirekt anheften, beispielsweise über die Hybridisierung eines
synthetischen Oligonukleotids an eine komplementäre Sequenz am 5'-Ende und anschließende Bindung
einer Bindungseinheit an dieses Oligonukleotid, beispielsweise über Biotinmoleküle, die
in das synthetische Oligonukleotid eingebaut sind.
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Für den Fachmann
ist ersichtlich, dass innerhalb des erfindungsgemäßen Verfahrens
verschiedene Mittel verwendet werden können, um die Stabilität von mRNA-Molekülen, insbesondere
gegenüber
dem Abbau durch RNAsen, zu optimieren. Zum Beispiel können verschiedene
Inhibitoren von RNAsen, wie Rnasin und Vanadyl-Ribonukleotid-Komplexe,
in den Transkriptionsreaktionen verwendet werden.
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Alternativ
oder zusätzlich
können
in die mRNA-Moleküle
verschiedene Strukturen eingebracht werden, einschließlich 3'-Stem-Loops, wie
sie üblicherweise
durch Transkriptionsterminatoren bereitgestellt werden. Für den Fachmann
ist ebenfalls ersichtlich, dass Transkriptions- und Translationsreaktionen
entweder getrennt durchgeführt
oder, insbesondere bei prokaryotischen Systemen, zu einer gekoppelten
In-vitro-Transkriptions-/-Translationsreaktion kombiniert werden
können.
Vorzugsweise werden die Transkriptions- und Translationsreaktionen
getrennt durchgeführt,
um die Produktion von mRNA und Polypeptiden, die unterschiedliche optimale
Reagenzien erfordern, zu optimieren.
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Für den Fachmann
ist ersichtlich, dass innerhalb des erfindungsgemäßen Verfahrens
verschiedene Mittel verwendet werden können, um die Faltung und Stabilität von Proteinmolekülen, insbesondere
gegenüber
dem Abbau durch Proteasen, zu optimieren. Für eine korrekte Proteinfaltung
werden in Translationsreaktionen optimale oxidative Proteinfaltungsbedingungen
mit besonderen Maßnahmen
zu Optimierung der Disulfidbindungsbildung verwendet, beispielsweise
durch Verwendung molekularer Chaperone, wie Protein-Disulfidisomerase.
Für die
Stabilität
kann das Peptidmarkierungssystem von E. coli durch Hemmung von ssrA-RNA unter
Verwendung von Verfahren, wie demjenigen von Hanes und Plückthun (s.o.)
inaktiviert werden.
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Protein-Protein-Wechselwirkungen – Diese
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Isolation von Genen
bereit, die dargebotene Proteine oder Polypeptide codieren, die
an einen Liganden binden, indem molekulare Markierungen sowohl am
Protein/Polypeptid als auch am Liganden als Basis für die Isolation
des Gens bereitgestellt werden. Das Verfahren umfasst insbesondere
die Isolation von Genen, wobei der Ligand selbst ein dargebotenes
Protein/Polypeptid ist. Diese Ausführungsform der Erfindung basiert
auf der Bindung eines Polypeptids an einen Liganden (oder ein anderes
Polypeptid), wodurch molekulare Markierungen am Polypeptid und am
Liganden als Basis für
die molekulare Trennung des gebundenen Polypeptid/Liganden von ungebundenem
Polypeptid und Liganden verwendet werden können, wobei das Polypeptid
immer noch mit seinem Gen (oder Gentranskript) verbunden bleibt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Selektion eines Polypeptids,
das an einen Liganden bindet, ist die Bereitstellung molekularer
Markierungen sowohl am Polypeptid als auch an seinem Liganden, wobei
dann Verfahren zur Isolation von Komplexen, die beide molekularen
Markierungen enthalten, angewendet werden. Zum Beispiel kann bei
Verwendung der Ribosomen-Display-Technik die mRNA mit einem RNA-bindenden
Protein (wie HIV-tat-Protein)
markiert werden, während
der Ligand (wenn er ein Polypeptid ist) mit einem Polyhistidinschwanz
markiert werden kann, so dass das anschließende Lei ten einer Bank von
mRNA-Ribosom-Polypeptid-Komplexen über Affinitätsmatrices, die Anti-Markierungs-Antikörper und
Nickel umfassen, bindende Polypeptide mit der damit verbundenen
mRNA selektiert, die dann die Gensequenz liefern kann, die die bindenden
Polypeptide codiert. Alternativ kann bei Verwendung von Ribosomen-Display
nur das Polypeptid zum Beispiel mit einem Polyhistidinschwanz markiert, über Affinitätsmatrices,
wie Nickelchelat, geleitet werden, und jede beliebige, damit verbundene
RNA kann durch einfache Umwandlung in cDNA-Kopien mittels PCR erhalten
werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Selektion von 2
oder mehr bindenden Polypeptiden ist die Verwendung der Ribosomen-Display-Technik
unter Verwendung von di- (oder poly-) cistronischen mRNAs zur Herstellung
von Kandidaten-Bindungspolypeptiden, die von einer oder mehreren
DNA-Banken stammen. Wenn das Cistron für eines der Polypeptide derart
konstruiert ist, dass das translatierte Polypeptid nach der Translation
von der mRNA dissoziiert, und das Cistron für das andere Polypeptid derart
konstruiert ist, dass das translatierte Polypeptid nach der Translation
mit mRNA verbunden bleibt, dann ist die translationale Gegenüberstellung
der 2 Polypeptide zueinander derart, dass eine Bindung, wenn vorhanden,
durch diese Gegenüberstellung
erleichtert wird, wodurch eine molekulare Basis für die Trennung
der Komplexe bereitgestellt wird, die das (die) bindende(n) Polypeptid(e)
und die mRNA enthalten, wobei Letztere dann für die Identität von Genen,
die das (die) bindende(n) Polypeptid(e) codieren, verwendet werden
kann.
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Ein
anderer Aspekt dieser Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung basiert auf der Bindung von 2 Polypeptiden,
von denen eines oder beide mit dem entsprechenden Gen verbunden
sind und die mit anderen Polypeptidketten fusioniert (oder verbunden)
sind, die bei einer Gegenüberstellung
eine selektierbare Eigenschaft erzeugen, die dann die Isolation
lebender Mikroorganismen gestattet, die das (die) Gen(e) für das (die) bindende(n)
Polypeptid(e) codieren. Von besonderem Interesse ist innerhalb dieser
Ausführungsform
die Erzeugung von Enzymaktivitäten
durch die Verbindung von 2 Polypeptiden. Solche erzeugten Enzymaktivitäten können auf
vielerlei Weise zur Selektion verwendet werden. Dazu gehören Enzymaktivitäten, die
molekulare Markierungen erzeugen, die sich an Komplexe von erfolgreich
gepaarten Polypeptiden und den damit verbundenen Genen (oder mRNA)
anheften. Für
das Polypeptid-Display auf Mikroorganismen umfassen diese ferner Enzymaktivitäten, die
Moleküle
in der Nähe
der Mikroorganismen erzeugen (oder freisetzen), was zur Selektion
von Mikroorganismen führt,
die ein von einer DNA-Bank stammendes Polypeptid darbieten, das
an einen Liganden bindet.
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Innerhalb
dieser Ausführungsform
ist ebenfalls die Erzeugung bindender Proteinaktivitäten durch
Verbindung von 2 Polypeptiden von Interesse, wodurch das bindende
Protein indirekt eine selektierbare Eigenschaft erzeugt, die als
Basis zur Identifikation des Gens, das das (die) bindende(n) Protein(e)
codiert, verwendet werden kann. Zum Beispiel kann das bindende Protein
ein DNA-bindendes Protein, wie ein Transkriptionsaktivator, sein,
der ein Gen aktiviert, das für
den Mikroorganismus einen Selektionsvorteil bereitstellt, wie ein Antibiotikaresistenzprotein
oder ein nährstofferzeugendes
Protein.
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Für die Anwendung
der vorliegenden Erfindung auf bindende Polypeptide, die auf Mikroorganismen dargeboten
werden, stellt die Erfindung Verfahren zur Verfügung, bei denen der Ligand
(oder ein zweites Polypeptid) von außen zu dem Mikroorganismus
zugegeben wird, oder Verfahren, bei denen der Ligand intern innerhalb
des Mikroorganismus synthetisiert wird, wobei in beiden Fällen die
Verbindung von Polypeptid und Ligand ein neues Molekül (oder
neue Moleküle)
erzeugen kann, was eine Basis für
die Selektion oder Abtrennung des Mikroorganismus, der das bindende
Polypeptid darbietet, bereitstellt. Die Erfindung kann auf der Komplementierung
einer Enzymaktivität
durch Kombination von 2 (oder mehreren) Untereinheiten eines Enzyms
basieren, die, wenn sie miteinander verbunden sind, die Enzymaktivität wiederherstellen.
Die Wiederherstellung der Enzymaktivität stellt dann entweder die
positive oder negative Selektion des Mikroorganismus, der die Enzymaktivität liefert,
bereit. Bei einem Beispiel für
diese Ausführungsform
der Erfindung wird eine DNA-Bank bereitgestellt, die Variantenpolypeptide
codiert, die in einem Mikroorganismus oder einer Zelle exprimiert
werden können,
wodurch die Gene, die die bindenden Polypeptide codieren, an einen
Abschnitt des Gens fusioniert werden, der ein enzymatisch inaktives
Fragment eines Enzyms codiert, wodurch dieser Enzymabschnitt einen
anderen Abschnitt des Enzyms komplementieren und die Enzymaktivität wiederherstellen kann.
Geeignete Enzyme sind u.a. E.-coli-beta-Galactosidase und C.-perfringens-Phospholipase C.
Der andere Abschnitt des Enzyms wird entweder zur In-vitro-Selektion im Mikroorganismenkulturmedium
oder zur In-vivo-Selektion durch Expression eines Gens, das diesen
Abschnitt codiert, im gleichen Mikroorganismus bereitgestellt. Enzyme,
wie E.-coli-beta-Galactosidase und C.-perfringens-Phospholipase C haben die
Eigenschaft, dass inaktive Untereinheiten des Enzyms sich in Lösung selbst
verbinden und die Enzymaktivität
wiederherstellen können,
und somit stellt die Erfindung eine Situation bereit, wobei das
bindende Polypeptid, fusioniert an ein Gen, das ein inaktives Enzymfragment
codiert, an seinen Liganden binden und die Bindung entweder fördern (wenn
der Ligand an die andere inaktive Untereinheit fusioniert ist) oder
verhindern kann (wenn die Polypeptid-Liganden-Bindung über sterische
Hinderung die Wiederherstellung der Enzymaktivität durch die inaktive Enzymuntereinheit
verhindert). Die Wiederherstellung oder Beseitigung der Enzymaktivität kann auf
den Mikroorganismus, der die Polypeptid/Enzymuntereinheit-Genfusion
exprimiert, eine günstige
oder schädliche Wirkung
haben. Dies ist entweder auf die direkte enzymatische Wirkung des
wiederhergestellten Enzyms, beispielsweise indem es die Umwandlung
eines nichttoxischen Substrats in ein toxisches Produkt bewirkt,
oder die indirekte enzymatische Wirkung des wiederhergestellten
Enzyms zurückzuführen, beispielsweise
indem es die Lyse externer Liposomen bewirkt, die eine toxische
Substanz oder einen essenziellen Nährstoff/Faktor für Wachstum/Vermehrung
des Mikroorganismus enthalten.
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Die
folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Erfindung gegeben
und sollen nicht so verstanden werden, dass sie den Umfang der Erfindung
beschränken.
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Beispiel 1
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Herstellung synthetischer
Protein-Banken und Modifikation durch Gewebe
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Ausgangspunkt
war eine cDNA-Bank-Präparation
aus "Marathon-bereiten" humanen Colon-cDNAs, die
von Clontech UK Ltd. (Basingstoke, GB) bezogen wurden.
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Die
Bank wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer AP1 [5'ccatcctaatacgactcactatagggc]
und AP3 [5'-ttctagaattcagcggccgc(t)30nn] und des Advantage-cDNA-PCR-Kits sowie
der vom Zulieferer (Clontech) empfohlenen Bedingungen amplifiziert.
Das so erhaltene PCR-Produkt wurde unter Verwendung einer T/A-Klonierungsstrategie
in mit SmaI linearisierten pUC19, der gemäß Marchuck et al. (Marchuck
D. et al. 1991, Nucl. Acids Res. 19: 1154) hergestellt worden war,
kloniert. Alternativ wurde eine humane Colon-cDNA-Bank aus humaner
Colon-mRNA konstruiert, die unter Verwendung der in Molecular Cloning,
A Laboratory Manual Hrsg. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, USA beschriebenen
Standardverfahren direkt aus Gewebe isoliert wurde. Die mRNA wurde
unter Verwendung des (in Molecular Cloning s.o. beschriebenen) RNAse-H-Verfahrens
in cDNAs umgewandelt und wiederum in die SmaI-Stelle des pGEMT7/SP6-Plasmids
(Promega, Southampton, GB) kloniert, wodurch ein Promotor für T7-RNA-Polymerase
bereitgestellt wurde. Lange synthetische Oligonucleotide und PCR
wurden einge setzt, um eine stromaufwärts gelegene bakterielle Ribosomenbindungsstelle,
einen stromabwärts
gelegenen Spacer, der vom Gen III des M13-Phagen stammte, und eine
3'-Transkriptionsterminationsregion
von dem E.-coli-lpp-Terminator, wie in Hanes und Plückthun,
Proc. Natl. Acad Sci. 94 (1997), S. 4937 beschrieben, bereitzustellen.
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Die
In-vitro-Transkription der pT7-Plasmide erfolgte unter Verwendung
eines RiboMAXTM-Kits (Promega, Southampton,
GB) nach den Anweisungen des Herstellers. Die so erhaltene mRNA
wurde nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die In-vitro-Translation
wurde unter Verwendung des E.-coli-S30-Extrakt-Systems unter Zugabe von 35S-Methionin
(Promega, Southampton, GB) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die
Ribosomen wurden von den Proteinen durch Behandlung mit EDTA dissoziiert,
wie von Hanes & Plückthun (s.o.)
beschrieben, und die Ribosomen wurden mittels Zentrifugation (100000
g für 30
min) entfernt.
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Es
wurden rohe Proteinextrakte aus einer normalen Colon- und einer
Colorektalkarzinomprobe durch Aufbrechen des Gewebes in eiskaltem
RIPA-Puffer (RIPA-Puffer
= 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % (Vol./Vol.) NP-40, 0,25% Natriumdesoxycholat,
150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF und jeweils 1 μg/ml Aprotinin,
Leupeptin und Peptstatin) hergestellt. Bei einigen Experimenten
wurden auch Phosphataseaktivität-kompetente
Extrakte hergestellt; in diesem Fall wurden Lysate unter Verwendung
von RIPA-Puffer ohne 1 mM Na3VO4 hergestellt.
Die Gewebeproben wurden auf Eis aufgetaut und unter Verwendung eines
sterilen Einweg-Gewebemörsers
("Pellet Pestle" Anachem Ltd., Luton,
GB) aufgebrochen. Die Homogenisation wurde unter Verwendung von
2 Volumina eiskaltem RIPA-Puffer zu 1 Volumen Gewebe durchgeführt. Das
Lysat wurde unter leichtem Schütteln
für 15
Minuten auf Eis inkubiert, dann durch Zentrifugation bei 13000 x
g und 4°C
für 10
Minuten von unlöslichem
Material befreit. Der Überstand
wurde entnommen und unter Verwendung des Bichinchoninsäure-Verfahrens
und der vom Zulieferer (Pierce, Chester GB, Kat.-Nr. 23225) zur Verfügung gestellten
Protokolle hinsichtlich der Proteinkonzentration getestet. Das Lysat
wurde in mehrere Aliquote aufgeteilt, auf Trockeneis schockgefroren
und in flüssigem
Stickstoff aufbewahrt.
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Lysate
von normalem Colon und Colorektaltumor wurden mit den in vitro translatierten
Proteinen durch Inkubation von aufgetautem Lysat für 30 Minuten
bei 37°C in
Gegenwart von 1 mg/ml Vanadylribonukleosid-Komplexen und 10 Einheiten
Rnasin umgesetzt. Das Proteingemisch wurde dann gemäß dem Protokoll von
Cash et al. (Electrophoresis 18 (1997), S. 2580) solubilisiert.
Die löslichen
Proteine wurden dann mittels 2D-PAGE (Cash et al. s.o.) analysiert
und die Proteine mittels Autoradiographie nachgewiesen (Patton et
al., BioTechniques 8 (1990), S. 518). Bilder der Gele wurden unter
Verwendung einer mit einem Bildanalysesystem verbundenen Videokamera
aufgenommen und dann für
die weitere Analyse an Phoretix-2D übermittelt. Die Analyse erfolgte
unter Verwendung von Phoretix-2D-Systemen
nach den Anweisungen des Herstellers.
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Aus
insgesamt 2622 Proteinflecken, die von dem in vitro translatierten
Proteingemisch nachgewiesen wurden, zeigten 12 Flecken Laufunterschiede,
wenn die Behandlungen mit normalen und Colorektalkrebs-Extrakten
verglichen wurden.
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Beispiel 2
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Phosphorylierung synthetischer
Proteine
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Rekombinantes,
gereinigtes Ratten-ERK-2, das eine an den Aminoterminus des Proteins
fusionierte Polyhistidinmarkierung enthielt, wurde von Stratagene,
La Jolla, USA (Kat.-Nr. 20612) bezogen. Bei diesem Produkt handelt
es sich um die nichtaktivierte Form des Proteins, die keine phosphorylierten
Reste enthält.
Es wurden 0,5 μg
nichtaktiviertes ERK-2 mit 5 μl
(die 2 mg/ml Gesamtprotein enthielten) A431-Zelllysat (Upstate Biotechnologies,
Lake Placid, NY, USA Kat.-Nr. 12–110) oder alternativ im Haus
aus in Gewebekultur gezüchteten
Zellen hergestellt, umgesetzt. Das Verfahren zur Umsetzung eines
Zell- oder Gewebelysats mit einem Zielprotein wird als Konditionierungsreaktion
bezeichnet.
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Es
wurden Zelllysate hergestellt, indem etwa 5 × 106 subkonfluente
Zellen in 500 μl
eiskaltem RIPA-Puffer suspendiert wurden. Von den Zellen wurde zuvor
mit eiskalter PBS das Medium abgewaschen, und sie wurden unter leichtem
Schütteln
für 15
Minuten in RIPA-Puffer auf Eis inkubiert. Das Lysat wurde mittels Zentrifugation
bei 13000 x g und 4°C
für 10
Minuten von unlöslichem
Material befreit. Der Überstand
wurde entnommen und unter Verwendung des Bichinchoninsäure-Verfahrens
und der vom Zulieferer (Pierce, Chester GB, Kat.-Nr. 23225) zur
Verfügung
gestellten Protokolle hinsichtlich der Proteinkonzentration getestet.
Das Lysat wurde in mehrere Aliquote aufgeteilt, auf Trockeneis schockgefroren
und vor der Verwendung in der Konditionierungsreaktion in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Lysate von Gewebeproben und anderen Zellproben wurden auf die gleiche
Weise verarbeitet.
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Die
Konditionierungsreaktion wurde bei 37°C für 15 Minuten durchgeführt und
dann auf Eis gestellt. Die Reaktion wurde für den Nachweis von phosphoryliertem
ERK-2 gleichmäßig (bezogen
auf das Volumen) in zwei Röhrchen
aufgeteilt, wobei entweder magnetische Sortierung (Röhrchen 1)
oder Bindung an Mikrotiterplattenvertiefungen (Röhrchen 2) verwendet wurde,
wobei in beiden Fällen
Anti-Histidin-Antikörper als
Fangreagenz verwendet wurde.
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Im
Röhrchen
1 wurde ERK-2 unter Verwendung von Magnetkugeln (Dynal, Wirral GB,
Kat.-Nr. 110.11) eingefangen, die mit einem Anti-Histidin-Antikörper (Sigma,
Poole, GB, Kat.-Nr. H1029) unter Verwendung der vom Zulieferer empfohlenen
Beschichtungsbedingungen vorbeschichtet worden waren. Die Fangreaktion
erfolgte bei 4°C
1 Stunde bei durchgehendem, konstantem leichtem Mischen, um die
Kugeln in Suspension zu halten. Nach dem Einfangen wurden die Kugeln
unter Verwendung eines Magnetteilchenkonzentrators gesammelt und
ausgiebig in PBS gewaschen. Die Kugeln wurden in einem Endvolumen
von 40 μl
resuspendiert, und 10-μl-Aliquote
wurden in Mikrotiterplattenvertiefungen überführt und einzeln mit Verdünnungen
von entweder einem Antikörper
gegen phosphoryliertes ERK (Upstate Biotechnologies, Kat.-Nr. 05-481),
einem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-HRP-Konjugat-Cocktail (Zymed,
Cambridge, GB, Kat.-Nr. 136620), einer polyklonalen Anti-Phosphoserin/Phosphothreonin/Phosphotyrosin-Zubereitung
(Zymed, Kat.-Nr. 90-0200) oder einem negativen Kontroll-Antikörper-HRP-Konjugat, der für humane
leichte Immunglobulinketten spezifisch war (The Binding Site, Birmingham
GB, Kat.-Nr. APO015), umgesetzt. Die Antikörper wurden für 1 Stunde
bei 4°C
inkubiert und anschließend
mit entsprechenden Sekundärreagenzien/chromogenen
Substraten nachgewiesen. Die Platten wurden bei 450 nm gelesen.
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Im
Röhrchen
2 wurde ERK-2 unter Verwendung von Mikrotiterplattenvertiefungen
eingefangen, die über
Nacht mit einem Anti-Histidin-Antikörper (Sigma, Poole GB, Kat.-Nr.
H1029) beschichtet und durch 40-minütige Inkubation mit einer Lösung aus
PBS/5% (Gew./Vol.) BSA bei Raumtemperatur vorblockiert worden waren.
Die Konditionierungsreaktion wurde unter Verwendung von PBS auf
ein Gesamtvolumen von 100 μl
verdünnt
und auf die Mikrotiterplatte überführt. Die
Fangreaktion erfolgte für
1 Stunde bei Raumtemperatur. Phosphoryliertes ERK-2 wurden in einem
direkten ELISA-Format unter Verwendung der Antikörperreihe, einschließlich eines
negativen Kontrollreagenzes, wie oben angegeben, nachgewiesen.
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Unter
Verwendung beider vorstehender Nachweisverfahren wurde das Vorliegen
von phosphoryliertem ERK-2 nach der Inkubation mit Lysaten von A431-Zellen
eindeutig nachgewiesen.
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Beispiel 3
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Verfahren zur Herstellung
in vitro translatierter cDNA-Klone für Anordnungen auf mit Streptavidin
beschichteten Platten.
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Ein
cDNA-Bank von gesamtem humanem fötalem
Gehirn wurde von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, USA) bezogen.
Die Bank wurde unidirektional in den Lambda-Vektor Uni-ZAP XR kloniert
mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 1,3 kbp geliefert. Es
wurde abgeschätzt,
dass die Bank 2 × 106 pfu enthielt und mit einem Titer von etwa
2,4 × 1010 pfu/ml geliefert worden war. Die Lambda-Uni-ZAP-XR-Stammbank wurde
nach einer einzigen Amplifikationsrunde geliefert. An diesem 1 x
amplifizierten Material wurde eine Massenexzisionsreaktion (siehe
unten) durchgeführt,
so dass Manipulationen, wie Plattierung, Replikaproduktion und Herstellung
einer Bank von Stammklonen, auf der Ebene von Einzelklonen lebensfähiger E.
coli und nicht als lytische Plaques nach einer Lambda-Phageninfektion
durchgeführt
werden konnten (Jerseth, B. et al. (1992) Strategies 5: 81–83). Die
restliche Bank wurde unter Verwendung von Standardverfahren (Molecular Cloning,
A Laboratory Manual Hrsg. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, USA) ein weiteres
Mal amplifiziert, und mehrere Glycerinstammlösungen wurden als Stammbank
bei –80°C abgelegt.
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Die
Bank wurden gemäß vom Zulieferer
(Stratagene, La Jolla, USA) zur Verfügung gestellter Protokolle
für die
Massenexzisionsreaktion und Plattierung als Bakterienkolonien vorbereitet.
Kurz gesagt, wurden die mit der Bank gelieferten Bakterienstämme (XL-1
Blue und SOLR')
auf Selektionsmedium (LB-Tetrazyklin bzw. LB-Kanamycin) ausplattiert,
und Einzelkolonien wurden für
die Übernachtkultur
bei 30°C
in 50 ml LB-Brühe
[10 g/l NaCl, 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, pH 7,0], die mit
0,2% (Gew./Vol.) Maltose und 10 mM MgSO4 angereicht
war, gepickt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt
und in 10 mM MgSO4 in einer Dichte von 8 × 108 Zellen/ml (OD600 =
1,0) resuspendiert. XL-1- Blue-Zellen
wurden mit einem Teil der Lambda-Uni-ZAP-XR-Bank in einer Multiplizität der Infektion
von 1:10 Lambda-Phagen:Zellen vereinigt. Der auf M13 basierende
Helferphagenstamm ExAssist (Stratagene, La Jolla, USA) wurde in
einem Verhältnis
von 10:1 Helferphage:Zellen hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 15 Minuten
bei 37°C
inkubiert. Es wurden 20 ml LB-Brühe
zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C unter Schütteln für weitere drei Stunden inkubiert.
Das Gemisch wurde für
20 Minuten bei 70°C
erhitzt, und die Zelltrümmer
wurden mittels Zentrifugation gesammelt. Der Überstand, der die ausgeschnittenen
Phagemide enthielt, wurde gesammelt, und 1 μl wurde zu 200 μl SOLR'-Zellen gegeben.
Das Gemisch wurde auf LB-Ampicillin-Platten plattiert und über Nacht
bei 37°C
inkubiert. Üblicherweise
führte
dies zu vielen 1000 Kolonien auf jeder Platte, und die weitere Verdünnung der
Präparation
von ausgeschnittenen Phagemiden war erforderlich, um geeignete Plattierungsdichten
zum Picken von Kolonien zu erhalten.
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Um
das Gridding-Verfahren durchführbar
zu machen, wurde die Gesamtanzahl an cDNA-Einzelklonen verringert,
wobei aber die Repräsentanz
der Bank beibehalten wurde. Diese Normalisierung wurde gemäß dem Verfahren
von Soares et al. (Soares, M. B. et al. 1994, Proc. Natl. Acad.
Sci USA Bd. 91: 922–923)
erreicht. Das Verfahren erforderte die Herstellung einzelsträngiger Moleküle mittels
Helferphageninfektion der Phagemid-Bank. Die einzelsträngigen zirkulären Moleküle wurden
einer kontrollierten Primerextension unterworfen, gefolgt von Denaturieren
und erneutem Hybridisieren unter Bedingungen, unter denen sich sehr
abundante Moleküle
wieder verbanden (niedrige Cot) und aus
dem Gemisch durch Hydroxy-apatit-Säulenchromatographie entfernt
werden konnten. Zirkuläre
Moleküle,
die nicht wieder assoziierten, wurden aus dem Durchfluss gewonnen
und direkt in kompetente Bakterien transformiert.
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Eine
Einzelstrangrettung wurde an der Phagemid-Bank unter Verwendung
des Helferphagen VCM13 und vom Zulieferer (Stratagene) zur Verfügung gestellter
Protokolle durchgeführt.
Gerettete einzelsträngige DNA
wurde gemäß dem Verfahren
von Soares et al. (Soares et al. s.o.) gereinigt, wobei besondere
Schritte zur Beseitigung von kontaminierender doppelsträngiger DNA
durchgeführt
wurden. Eine kontrollierte Primerextension erfolgte an gereinigter
einzelsträngiger
zirkulärer
DNA unter Verwendung des Primers 5'ggaaacagctatgaccatg, wobei die Bedingungen
von Soares et al. verwendet wurden. DNA-Polymerase stammte von Boehringer,
die Nukleotidtriphosphate von Life Technologies (Paisley, GB). Das
als Markierung verwendete α32P-dCTP war von Amersham International (Amersham, GB).
Die Hydroxyapatit-Säulenchromatographie wurde
bei 60°C
wie in Soares et al. beschrieben durchgeführt. Nach der Gewinnung der
normalisierten einzelsträngigen
zirkulären
Moleküle
wurde die gereinigte DNA direkt in kompetente XL1-blue-E.-coli-Zellen
transformiert und wie zuvor beschrieben auf LB-Ampicillin-Platten ausplattiert.
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Einzelkolonien
von XL1-blue-Zellen aus der normalisierten Bank wurden zur weiteren
Analyse und Replikaherstellung gepickt. Kurz gesagt, wurden die
Kolonien manuell in Platten mit 96 Vertiefungen, die 100 μl LB-Ampicillin-Medium
enthielten, gepickt und für
3 Stunden bei 37°C
gezüchtet.
Von jeder Platte wurde unter Verwendung einer BioRobot9600- (Qiagen
UK Ltd., Crawley GB) Laborarbeitsstation ein Replikat hergestellt. Der
Roboter wurde derart programmiert, dass er 50 μl der Kultur in Medium, das
10% (Vol./Vol.) Glycerin enthielt, pipettierte, und diese Platte
wurde verschlossen und als Stammplatte bei –80°C aufbewahrt. Die restlichen
50 μl der
Kultur wurden in einen Flachbodenblock mit 96 Vertiefungen mit quadratischen
2-ml-Vertiefungen, die 1,8 ml LB-Ampicillin-Medium enthielten, überimpft. Eine mikroporöse Klebefolie
wurde oben auf jeden Block aufgebracht und der Block über Nacht
bei 37°C
unter Überkopfschütteln inkubiert.
Nach der Inkubation wurde aus jeder der 96 Vertiefungen Phagemid-DNA unter Verwendung
von Standardprogrammen an einem BioRobot9600 (Qiagen UK Ltd., Crawley
GB) und der vom Zulieferer (Qiagen UK Ltd., Crawley GB) bereitgestellten
QIAwell-Ultra-Reagenzsysteme präpariert.
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Ein
Teil der gereinigten DNA wurde direkt als Matrizen für eine verbundene
In-vitro-Transkription-Translation
(IVTT) unter Verwendung von T3-RNA-Polymerase und eines von Promega
UK Ltd. (Southampton, GB) gelieferten Kaninchenretikulozytenlysat-Systems
eingesetzt. Die verbleibende DNA wurde für die Aufbewahrung bei –20°C verschlossen.
Der IVTT-Reaktionsmix wurde mit 2% (Vol./Vol.) tRNA-Biotinyllysin
(Promega UK Ltd, Southampton, GB) angereichert, so dass die in vitro
translatierten Proteine auf einer mit Streptavidin beschichteten
festen Phase eingefangen werden konnten. Die IVTT-Reaktionen wurden
in Anordnungen mit 96 Vertiefungen in einem Gesamtvolumen von 25 μl bei 30°C für 60 Minuten
durchgeführt.
Nach der Inkubation wurden 5 μl
von jeder Reaktion in 100 μl
TSB pH 8,0 (50 mM Tris, 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl) überführt, die
zuvor in die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten,
vorblockierten Reacti-BindTM-Platte (Pierce,
Chester, GB) gegeben worden waren. Die restliche IVTT-Reaktionsplatte
wurde für
die Aufbewahrung bei –20°C ver schlossen.
Die Reacti-BindTM-Streptavidin-Platte wurde
für 60
Minuten unter leichtem Schütteln
bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bindung des biotinylierten
IVTT-Produkts an die Plattenoberfläche zu begünstigen. Die Platte wurde unter
Verwendung von 3 × 200 μl Waschpuffer
(TBS, 0,1% (Gew./Vol.) BSA, 0,05% (Vol./Vol.) Tween 20) gewaschen,
bevor sie in Gewebeproteinbindungsassays verwendet wurde.
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Beispiel 4
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Verfahren zur Durchführung einer
Gewebeextraktmodifikation von in vitro translatierten Proteinanordnungen und
Nachweis von Phosphorylierung der Proteine in den Anordnungen.
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Proben
von humanem Hirngewebe wurden von NeuroResouce (London, GB) bezogen.
Aufeinander abgestimmte Proben von normalem Hirn und Hirn mit Alzheimer-Krankheit
wurden geliefert. Im Allgemeinen wurden jeweils 1–10 g von
jeder Probe geliefert, wobei die Proben in allen Fällen von
einer bekannten subanatomischen Stelle stammten und in vollständigen klinischen
Einzelheiten kreuzindiziert waren. Alle Proben wurden zum Zeitpunkt
der Probennahme schockgefroren, auf Trockeneis versandt und vor
der Verarbeitung unter flüssigem
Stickstoff aufbewahrt. Die Verarbeitung erfolgt unter Bedingungen
der Kategorie 2.
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Phosphorylierungskompetente
Hirngewebeextrakte wurden durch Aufbrechen des Gewebes in eiskaltem
RIPA-Puffer hergestellt. Bei einigen Experimenten wurden auch Phosphataseaktivität-kompetente
Extrakte hergestellt; in diesem Fall wurden Lysate unter Verwendung
von RIPA-Puffer ohne 1 mM Na3VO4 hergestellt. Die
Gewebeproben wurden auf Eis aufgetaut und unter Verwendung eines
sterilen Einweg-Gewebemörsers ("Pellet Pestle" Anachem Ltd., Luton,
GB) aufgebrochen. Die Homogenisation wurde unter Verwendung von
2 Volumina eiskaltem RIPA-Puffer
zu 1 Volumen Gewebe durchgeführt.
Das Lysat wurde unter leichtem Schütteln für 15 Minuten auf Eis inkubiert,
dann durch Zentrifugation bei 13000 x g und 4°C für 10 Minuten von unlöslichem
Material befreit. Der Überstand
wurde entnommen und hinsichtlich der Proteinkonzentration unter Verwendung
des Bichinchoninsäure-Verfahrens
und der vom Zulieferer (Pierce, Chester GB, Kat.-Nr. 23225) zur
Verfügung
gestellten Protokolle getestet. Das Lysat wurde in mehrere Aliquote
aufgeteilt, auf Trockeneis schockgefroren und in flüssigem Stickstoff
aufbewahrt.
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Das
Hirngewebelysat wurde mit der IVTT-Proteinanordnung in einem Format
mit 96 Vertiefungen durch Inkubation des aufgetauten Lysats mit
der gewaschenen Anordnung für
30 Minuten bei 37°C
umgesetzt. Im Allgemeinen wurden 10 μl Lysat zu jeder Vertiefung
der Proteinanordnung gegeben. Nach der Inkubation wurden die Platten
x 3 unter Verwendung von 200 μl
Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen und mit einer von mehreren
verdünnten
Anti-Phosphoprotein-Antikörperzubereitungen
inkubiert. Eine Phosphotyrosinmodifikation wurden unter Verwendung
eines monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-HRP-Konjugat-Cocktails (Zymed, Cambridge,
GB, Nr. 136620) nachgewiesen. Eine Phosphoserin-/Phosphothreoninmodifikation
wurde unter Verwendung einer polyklonalen Anti-Phosphoserin-/-Phosphothreonin-/-Phosphotyrosin-Zubereitung
(Zymed, Cambridge, GB, Kat.-Nr. 90-0200) nachgewiesen. In allen
Fällen
erfolgte die Antikörperinkubation
unter Verwendung in TBS mit 5% BSA verdünnter Antikörper für mindestens 1 Stunde bei 37°C oder in
einigen Fällen eine Übernachtinkubation
bei 4°C.
Die Platten wurden vor dem Nachweis mit entsprechenden Sekundärreagenzien/chromogenen
Substraten gemäß Standardprotokollen
(Antibodies A Laboratory Manual Hrsg. Harlow, E. und Lane, D. Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1988 New York, USA) wie vorstehend
gewaschen. Die Platten wurden bei 492 nm gelesen.
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Beispiel 5
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Verfahren zum Nachweis
von Protein-Protein-Bindung unter Verwendung markierter Gewebeproteine
an in vitro translatierten Proteinanordnungen.
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Die
Proteine eines Hirngewebelysats wurden unter Verwendung des von
Sigma (Poole, GB) gelieferten FluroTagTM-FITC-Konjugationssystems
mit Fluorescein markiert. Üblicherweise
wurden 5 mg Hirnprotein mit 250 μl
einer Verdünnung
einer 1 mg/ml Fluorosceinisothiocyanat- (FITC-) Lösung in
0,1 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer
umgesetzt. Man ließ die
Markierungsreaktion für
2 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen, bevor sie mittels G-25-Sephadex-Säulenchromatographie
von nicht eingebautem FITC gereinigt wurde. Die Säulen und
Verfahren waren wie im FluroTagTM-Kit (Sigma,
Poole, GB) bereitgestellt. Das Säuleneluat,
das die markierten Hirnproteine enthielt, wurde lichtgeschützt bei
4°C aufbewahrt.
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Markiertes
Gewebelysat wurden wie zuvor mit der IVTT-Proteinanordnung umgesetzt.
Zum Nachweis von markierten Hirnproteinen, die durch Mitglieder
der IVTT-Proteinanordnung eingefangen worden waren, wurde die Platte
wie vorstehend gewaschen und mit einem Anti-Fluorescein-Antikörper (Sigma
Nr. F- 5636, Sigma,
Poole, GB) inkubiert. Der Antikörper
wurde 1/2500 in TBS verdünnt,
das 5% BSA enthielt, und für 30–60 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Der Antikörper wurde unter Verwendung
eines Anti-Maus-HRP-Komplexes, gefolgt von Umsetzung mit dem chromogenen
Substrat o-Phenylendiamin (Sigma, Poole GB) gemäß Standardverfahren (Antibodies,
A Laboratory Manual, s.o.) nachgewiesen. Die Platten wurden bei
492 nm gelesen.
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Beispiel 6
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Durch eine Ribosomen-Display-Bank
identifizierte Protein-Protein-Bindungspartner
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Bei
diesem Beispiel wird die in vitro translatierte Proteinanordnung
zum Durchsuchen einer Ribosomen-Display-Bank nach Bindungspartnern
verwendet, und die in der Bank vorliegenden Gene für Bindungspartner
werden mittels reverser Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)
identifiziert. Für
den Zweck dieses Beispiels ist die Ribosomen-Display-Bank im Wesentlichen
wie im Beispiel 1 beschrieben und besteht in der Praxis zum Zeitpunkt
der Verwendung zum Screenen der IVTT-Proteinanordnung aus einer
großen
Population (109–1012)
an Ribosomen, die jeweils einzeln mittels Verknüpfung mit dessen zugehörigem mRNA-Molekül an ein
naszierendes Protein gebunden sind.
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Die
Bank wurde 1 zu 5 in eiskaltem Verdünnungspuffer (50 mM Tris-Acetat
pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 50 mM Magnesiumacetat, 0,1% Tween
20 mit 200 u/ml RNasin (Promega UK Ltd., Southampton GB)) verdünnt. Es
wurden 50 μl
der verdünnten
Bank zu jeder Vertiefung der IVTT-Proteinanordnung gegeben und bei
4°C für 1 Stunde
unter leichtem Schütteln
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen der Anordnung
5 Mal unter Verwendung von 100 μl
eiskaltem Verdünnungspuffer
gewaschen. Die mRNA aus jedem der gebundenen mRNA/Ribosom/Protein-Komplexe
wurde durch Zugabe von 20 μl
50 mM Tris-Acetat pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 20 mM EDTA und
Inkubieren auf Eis für
10 Minuten unter leichtem Schütteln
eluiert. Die eluierte mRNA wurde in einer zweiten Platte mit 96
Vertiefungen gesammelt und mittels Fällung mit Ethanol bei –20°C über Nacht
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual s.o.) in Gegenwart von 20 μg Glykogen-Carrier
(Boehringer, Lewes, GB) aufkonzentriert. Die so erhaltene mRNA wurde
als Matrize für
die reverse Transkription mit M-MLV-reverser Transkriptase (RT)
verwendet. Kurz gesagt, wurde die mRNA bei 70°C für 10 Minuten in Gegenwart von
1 nM der Primers RD3 [5'(T)18nn] hitzedenaturiert. Das Gemisch wurde
auf Eis abgekühlt,
bevor 200 u M-MLV-RT und ihr Reaktions puffer (Life Technologies,
Paisley, GB) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde für 60 Minuten
bei 37°C
inkubiert, dann zur Inaktivierung der RT für 15 Minuten nach 70°C überführ. Das
anschließende
DNA:RNA-Hybrid wurde als Matrize für eine PCR unter Verwendung
der Primer T75L [5'cggtttccctctagaaata]
und RD3 und verwendet, wobei der Zyklus 95°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden,
72°C für 30 Sekunden × 40 durchgeführt wurde.
Thermostabile DNA-Polymerase (ExpandTM High
Fidelity), Reaktionspuffer und Nukleotidtriphosphate waren von Boehringer
(Boehringer, Lewes, GB). Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese
analysiert (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, s.o.). Das Vorliegen
eines PCR-Produkts identifizierte mutmaßliche positive Bindungspartner
in der IVTT-Proteinanordnung. Die Proteinanordnung wurde dekodiert
und Phagemid-DNA für
die Sequenzanalyse identifiziert. PCR-Produkte aus der Polysomen-Display-Bank
wurden unter Verwendung des Primers T75L direkt sequenziert. Die
Sequenzierung erfolgte unter Verwendung von Farbstoffterminator-Chemie gemäß vom Zulieferer
(Amersham International, Amersham GB) zur Verfügung gestellter Protokolle.
Die Reaktionen wurden unter Verwendung eines automatisierten Sequenziersystems
(Applied Biosystems, Warrington, GB) analysiert.
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Beispiel 7
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Mikroanordnungen einer
in vitro translatierten Protein-Bank auf einer mit Streptavidin
beschichteten Glasoberfläche.
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Eine
Miniaturisierung der IVTT-Proteinanordnung wurde durch Gridding
einzelner IVTT-Proteine mit einem Roboter auf eine Glasoberfläche, an
die zuvor Streptavidin gebunden worden war, erzielt. Die Glas-"Chips" mit dem kovalent
an eine Oberfläche
gebundenen Streptavidin wurden von Radius Inc. (Medfield, MA, USA)
bezogen. Die Glas-Chips waren 55 mm × 25 mm groß. Unter Verwendung des Gridding-Roboters (Radius
Inc., Medfield, MA, USA) wurden jeweils 0,5 μl der 96 IVTT-Reaktionen auf
die trockene Oberfläche des
Chips in einer niedrig dichten Anordnung von 8 auf 12 aufgetragen.
Bei weiteren Experimenten wurden Anordnungen in doppelter Dichte
von 192 einzelnen Proteinen pro Glas-Chip hergestellt. Bei anschließenden Experimenten
wurden Anordnungen sehr hoher Dichte hergestellt, die sich zum Screenen
mit hohem Durchsatz eigneten. Nach dem Gridding wurde die Chipoberfläche unter
Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, und die
Objektträger
wurden bei 4°C
in PBS mit 3% (Gew./Vol.) BSA und 0.02% Natriumazid aufbewahrt.
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Die
IVTT-Protein-Chipanordnungen wurden mit Gewebelysaten behandelt
und im Prinzip wie im Beispiel 2 angegeben mit Anti-Phosphoprotein-Antikörpern sondiert.
Die Protein-Chipanordnungen wurden vor der Inkubation mit Hirngewebelysaten
durch Eintauchen in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) ausgiebig gewaschen. Überschüssige Waschlösung wurde
vom Objektträger
abgeschüttelt,
bevor 15 μl
Hirngewebelysat direkt auf die Oberfläche über dem Bereich, der die Proteinanordnung
umfasste, aufgetragen wurden. Über der
Gewebelysatlösung
wurde ein Glasdeckglas aufgebracht, das dazu diente, das Lysat über den
gesamten Bereich der Anordnung zu verteilen und mittels Kapillarwirkung
zu halten, um einen signifikanten Lösungsverlust während der
anschließenden
Inkubation zu stoppen. Die Inkubation erfolgte für 30 Minuten bei 37°C, wobei
der Glas-Chip in einen angefeuchteten Behälter eingebracht wurde. Nach
der Inkubation wurde das Deckglas entfernt und der Objektträger durch
Eintauchen in Waschpuffer gewaschen. Der Glas-Chip wurde mit einem
oder Kombination von Anti-Phosphoprotein-Antikörpern, die wie im Beispiel
2 verdünnt
wurden, inkubiert. Die Antikörperlösung wurde
in einem kleinen Volumen (10–20 μl) zur Proteinanordnung
gegeben und wie zuvor unter einem Deckglas an Ort und Stelle gehalten.
Der Nachweis von gebundenem Antikörper erfolgte durch Verwendung
chromogener Substrate, die einen unlöslichen Niederschlag auf dem
Glasobjektträger
ergaben. Üblicherweise
wurde das Substrat DAB (Diaminobenzidintetrahydrochlorid) (Sigma,
Poole, GB) verwendet. Positive Signale in niedrig dichten Anordnungen
wurden durch visuelle Untersuchung der Anordnung unter kleiner Vergrößerung identifiziert.
Bei einigen Experimenten wurde ein verstärkt chemilumineszentes Substrat (Pierce & Warriner Ltd.,
Chester GB) in Kombination mit Peroxidasekonjugierten Primär- oder
Sekundärantikörpern verwendet.
Positive Signale wurden unter Verwendung eines Molecular Imager
FX- (BioRad Laboratories Ltd., Herts, GB) Phosphorbildgebungssystems
nachgewiesen.
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An
den IVTT-Protein-Glas-Chip-Anordnungen wurden Protein-Protein-Bindungsassays
unter Verwendung von FITC-markiertem Hirnprotein und im Prinzip
wie im Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Es wurden 10–20 μl FITC-markierte
Hirnproteinzubereitung direkt auf die Oberfläche einer gewaschenen IVTT-Proteinanordnung
aufgebracht. Ein Glasdeckglas wurde über der markierten Gewebelysatlösung aufgebracht,
und der ganze Objektträger
wurde für
30 Minuten bei 37°C
in einem feuchtgehaltenen Behälter
inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Deckglas entfernt und der
Objektträger
durch Eintauchen in Waschpuffer gewaschen.
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Bei
einigen Experimenten wurde das gebundene, FITC-markierte Protein
direkt mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Für die Mikroskopie
wurde die Proteinanordnung mit einem Tropfen Anti-fade-Montiermittel
(Vector Labs, Peterborough, GB) und einem herkömmlichen Deckglas für die Öl-Immersionsfluoreszenzmikroskopie
bedeckt. Das Mikroskop war ein Nikon Typ 105, das mit einem FITC-kompatiblen
Filtersatz für
die Fluoreszenzmikroskopie ausgerüstet war. Die Position von
Proteinflecken, die ein positives Signal ergaben, wurde anhand dreistelliger
Ablesungen auf der X-Y-Achse vom Mikroskopstativ unter Fluoreszenzbeleuchtung
dekodiert. Diese Ablesungen nach Untersuchung eines Indexflecks,
der vor dem Roboter-Gridding in jede Glasoberfläche geätzt worden war, zu den Proteinanordnungskoordinaten
in Bezug gesetzt. Der Indexfleck wurde unter normaler Beleuchtung
identifiziert und lieferte die X-Y-Ablesungen für seine Position in Bezug zur
Proteinanordnung.
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Einige
Experimente erfolgten unter indirektem Nachweis des gebundenen markierten
Proteins. Dazu wurde ein monoklonaler Anti-FITC-Antikörper verwendet,
gefolgt von einem Anti-Maus-Peroxidase-Konjugat und kolorimetrischem
Nachweis unter Verwendung von DAB als Reportersubstrat. In diesem
Fall stammten die Reagenzien von Sigma (Poole, GB), und die Inkubationen
wurden unter Verwendung kleiner Volumina (10–20 μl) der verdünnten Antikörper durchgeführt, die
wie zuvor beschrieben direkt auf die Glasoberfläche aufgebracht und unter Deckgläsern gehalten
wurden. Positive Signale wurden durch visuelle Untersuchung der
Anordnung bei kleiner Vergrößerung unter
normaler Beleuchtung identifiziert. Weitere Experimente verwendeten
ebenfalls ein verstärkt
chemilumineszentes Substrat (Pierce & Warriner Ltd., Chester GB) und Bildgebung
unter Verwendung eines Phosphorbildgebungssystems wie vorstehend.
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Beispiel 8
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Verfahren zur Herstellung
einer Bank von auf einer Festphasenanordnung immoblisierten einkettigen
Antikörpern
für die
Umsetzung mit Gewebeextrakten.
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Ein
Extrakt von normalem humanem Gehirn, der wie im Beispiel 4 hergestellt
wurde, wurde zur Immunisierung von zwei BalbC-Mäusen verwendet. Es wurden 2
Dosen intraperitoneal mit einem Abstand von 4 Wochen dazwischen
verabreicht. 3 bis 4 Tage nach der 2. Impfung wurden die Mäuse getötet und
die Milzen mittels Dissektion entfernt. Eine 25 cm2 große Gewebekulturflasche
wurde mit den Hirnextraktproteinen zu 25 μg/ml in Carbonat/Bicarbonat-Puffer
pH 9,0 beschichtet. Nach einer Inkubation für 1 Stunde bei 37°C wurde die
Antigenzubereitung entfernt und steriler Blockierungspuffer (2%
Trockenmagermilch in PBS) zugegeben und für 1 Stunde inkubiert. Nach
3-maligem Waschen mit PBS wurden 25 ml Milzzellsuspension in Gewebekulturmedium
zu der Flasche gegeben und über
Nacht bei 37°C
in einer 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Das Medium, das
die nicht anhaftenden Milzzellen enthielt, wurde entfernt. Durch
Zugabe von 1,5 ml des Extraktionspuffers aus dem QuickPrepTM-mRNA-Reinigungskit (Pharmacia, St. Albans,
GB) zu der Flasche und Schwenken über die Oberfläche wurde
dann die RNA-Präparation
aus den anhaftenden selektierten Zellen eingeleitet. Dann wurden
3 ml Elutionspuffer hinzugefügt
und gemischt. Die Flascheninhalte wurden dann in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, und
die QuickPrepTM-mRNA-Präparation
wurde nach den Anweisungen des Herstellers fortgesetzt.
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Das
Pharmacia Recombinant Phage Antibody-System (Pharmacia, Milton Keynes,
GB) wurde zur Herstellung einer Bank von einkettigen Maus-Fvs (ScFv)
gegen humanes Hirn verwendet. Die Erststrang-cDNA wurde aus der
mRNA unter Verwendung von M-MuLV-reverser Transkriptase und zufallsgemäßen Hexamerprimern
hergestellt. Die Gene für
die schweren und leichten Antikörperketten
wurden dann unter Verwendung spezifischer Primer für die schwere
und leichte Kette, die komplementär zu konservierten Sequenzen
waren, die die variablen Antikörperdomänen flankieren,
amplifiziert. Die Produkte mit 340 und 325 Basenpaaren, die für die DNA
der schweren bzw. der leichten Kette erzeugt wurden, wurden nach
einer Agarosegelelektrophorese getrennt gereinigt. Diese wurden
dann zu einem einzigen ScFv-Konstrukt assembliert, wobei ein DNA-Linker-Primer-Mix verwendet
wurde, in dem die VH-Region über
ein (Gly4Ser)3-Peptid mit der VL-Region verknüpft erhalten wurde. Die assemblierten
ScFv wurden mit Primern amplifiziert, die derart gestaltet waren,
dass sie Sfi 1- und Not 1-Stellen an den 5'- bzw. 3'-Enden einfügten, so dass ein 800-bp-Produkt
erhalten wurde. Die ses Fragment wurde gereinigt, nacheinander mit
SfiI und NotI gespalten und erneut gereinigt.
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Zur
Herstellung einer in vitro transkribierten und translatierten ScFv-Bank
wurde der Vektor pBluescript SK+ durch Einbringen des Linkers zwischen
die HindIII- und
die Eco RI-Stelle in der Region der multiplen Klonierungsstelle
modifiziert: Linkersequenz:
-
Die
amplifizierten ScFv wurden zwischen die SfiI- und NotI-Stellen dieses
Vektors kloniert, so dass sie in der richtigen Orientierung für die Transkription
vom T7-Promotor eingebracht wurden. Alternativ wurde eine humane
natürliche
Phagen-Antikörper-Bank
(Nissin, MRC) verwendet. Die Phagemid-DNA wurde präpariert und
nacheinander mit SfiI und NotI gespalten. Die ScFv-Fragmente wurden
gereinigt und in den oben beschriebenen pBluescript SK+-Vektor kloniert.
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Für die Verwendung
als Festphasenanordnung wurden einzelne pBluescript-Klone gepickt
und wie im Beispiel 3 in Platten mit mehreren Vertiefungen gezüchtet. DNA-Präparation,
IVTT und Anordnung der biotinylierten Proteine erfolgten wie im
Beispiel 3.
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Für die Verwendung
als Phagen-Antikörper-Bank
wurde nach dem Pharmacia-Protokoll
vorgegangen. Die assemblierten ScFv wurden mit Primern amplifiziert,
die derart gestaltet waren, dass SfiI- und NotI-Stellen am 5'- bzw. 3'-Ende eingeführt wurden,
was ein 800-bp-Produkt ergab. Dieses Fragment wurde gereinigt, nacheinander
mit Sfi 1 und Not 1 gespalten, erneut gereinigt und in mit SfiI
und NotI gespaltenen pCANTAB 5-Phagemidvektor ligiert. pCANTAB 5
enthält
das für
das Phagen-Gen-3-Protein (g3p) codierende Gen, und der ScFv wird
in Nachbarschaft zur g3-Signalsequenz eingesetzt, so dass er als
g3p-Fusionsprotein exprimiert wird. Kompetente E.-coli-TG1-Zellen
wurden mit dem pCantab 5/ScFv-Phagemid transformiert, dann anschließend mit dem M13KO7-Helferphagen infiziert. Der
so erhaltene rekombinante Phage enthielt DNA, die die ScFv- Gene codierte, und
bot eine oder mehrere Kopien des rekombinanten Antikörpers als
Fusionsproteine an seinen Spitzen dar.
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Auf
Phagen dargebotene ScFv, die an humane Hirnantigene binden, wurden
dann selektiert oder mittels Panning angereichert. Kurz gesagt,
wurde eine Hirnantigenzubereitung auf die Vertiefungen von Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen aufgebracht. Nach Blockieren mit 2% Magermilch
in PBS wurde die Phagenzubereitung aufgebracht und für 1 Stunde
inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen mit PBS wurden Vertiefungen, die
mit Hirnantigen reagierende rekombinante Phagen enthielten, mit
einem Anti-M13-Antikörper
nachgewiesen, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, und
mit dem chromogenen Substrat o-Phenylendiamin sichtbar gemacht.
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Beispiel 9
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Gitterförmig aufgetragene
und mit markiertem Gewebeprotein behandelte IVTT-Display-Bank.
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Eine
IVTT-Display-Bank von einkettigen Antikörpern wurde an vitro translatiert
und wie im Beispiel 3 auf einer Streptavidin-Oberfläche angeordnet.
Die Anordnung von einkettigen Antikörpern wurde mit FITC-markierten
Hirnproteinen, die wie im Beispiel 5 hergestellt wurden, umgesetzt.
Das Reaktionsverfahren und der Nachweis von Protein:Protein-Bindung
erfolgten wie im Beispiel 5. Die Muster positiver Signale von wiederholten
IVTT-Anordnungen, die mit unterschiedlichen Gewebeproteinen behandelt
worden waren, wurden verglichen. Zur Identifizierung einzelner Proteine
an spezifischen Loci auf den Anordnungen wurde das entsprechende
Gen des einkettigen Antikörpers
von der Stammplatte der BankcDNAs gewonnen. Gene für einkettige
Antikörper
von Interesse wurden dann erneut einer IVTT im größeren Maßstab unterzogen
und entweder zur Gewinnung und Identifizierung von Bindungspartnern
aus einer IVTT-Protein-Bank, wie im Beispiel 6 beschrieben, oder
zur Gewinnung und Identifizierung von natürlichem Gewebeprotein (mittels
2D-Gelen), wie im Beispiel 1 beschrieben, verwendet.
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Beispiel 10
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Verwendung von DNA-Chips
zur Herstellung eines Ribosome-Display
-
Um
eine Polysomen-Display-Bank für
die anschließende
Immobilisierung auf einem DNA-Chip herzustellen, wird die Bank im
Wesentlichen wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt, ausgenommen
dass einer der Primer, der zum Klonieren der cDNAs in die IVTT-Vektoren
verwendet wird, einen gemischten Primer mit einem Abschnitt variabler
Sequenz innerhalb der transkribierten Sequenz umfasst, der derart
gestaltet ist, dass er an die DNA-Moleküle auf dem Chip hybridisiert.
Alternativ wird der Plasmidpool aus der Display-Bank mit einem einmal
in der transkribierten Sequenz spaltenden Restriktionsenzym gespalten,
und ein gemischtes synthetisches Oligonukleotid wird einkloniert.
Somit wird die Bank derart konstruiert, dass jedes erzeugte mRNA-Molekül eine einzigartige
Sequenzmarkierung enthält;
diese besteht aus mindestens 15 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 20
Nukleotiden.
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Die
Experimente zum Testen des DNA-Chip-Proteinanordnungsverfahrens
wurden unter Verwendung eines Paars von modifizierten Genen für einkettige
Antikörper
(scAbs) durchgeführt.
Zwei modifizierte scAbs wurden hergestellt, die aus N-terminalen Epitopmarkierungen,
der variablen Region der schweren Kette (VH), einem 14 Aminosäuren langen
Linker (EGKSSGSGSESKVD), der variablen Region der leichten Kette
(VL), fusioniert an die cDNA für
die humane konstante κ-Region, bestanden.
Die Sequenz der humanen konstanten κ-Region, die eine Polyhistidinmarkierung
am 3'-Ende enthielt,
wurde derart modifiziert, dass die Stoppcodons deletiert waren.
Die humane konstante κ-Region
wird eingeführt,
damit sie als Spacer wirkt, so dass eine korrekte Faltung von naszierenden
einkettigen Fv möglich
ist, während
sie immer noch an einen Ribosomenkomplex in einem In-vitro-Translationssystem
gebunden sind.
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Diese
Konstrukte wurden in den Vektor pET 5c (Rosenberg AH et al., Gene,
56: 125–135,
1987) kloniert, der einen T7-Promotor, gefolgt von der Ribosomenbindungsstelle
des T7-Gens 10, bereitstellt. Die scAb-Konstrukte wurden in den
Vektor an einer NdeI-Stelle eingebracht, so dass die Sequenz, die
die Epitopmarkierung codierte, auf das erste Atg des T7-Gens 10
folgte. Das erste Konstrukt bestand aus einem scAb gegen Pseudomonas
aeruginosa (Molloy P. et al. Journal of applied Bacteriology, 78:
359–365,
1995) mit dem am N-Terminus hinzugefügten FLAG-Epitop (MDYKDDDK)
(Knappik A und Plückthun
A, BioTechniques, 17: 754–761,
1994). Das zweite bestand aus einem scAb, der aus dem Antikörper 340
(Durrant LG et al. Prenatal Diagnosis, 14: 131–140, 1994) mit einer Polyhistidinmarkierung
am N-Terminus hergestellt wurde.
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Diese
Plasmide dienten als Ausgangsmaterialien für anschließende Derivate. Der Anti-Pseudomonas aeruginosa-
(α-Ps-)
scAb und der 340-scAb wurden wie folgt konstruiert. DNA für den α-Ps-scAb
im Vektor pPM1His (Molloy P et al., s.o.) wurde mit den Primern
RD 5' FLAG:
5'gcggatcccatatggactacaaagacgatgacgacaaacaggtgcagctgcag3' (Genosys Biotechnologies
Europe Ltd., Cambridge, GB) und RD 3':
5'gcgaattcgtggtggtggtggtggtgtgactctcc3' (Genosys) amplifiziert,
die die 5'-FLAG-Epitopesequenz einführten bzw.
das 3'-Stoppcodon
entfernten. Das Reaktionsgemisch umfasste 0,1 μg Matrizen-DNA, 2,6 Einheiten
ExpandTM High Fidelity PCR-Enzymmix (Boehringer
Mannheim, Lewes, GB), Expand HF-Puffer (Boehringer Mannheim), 1,5
mM MgCl2, 200 μM Desoxynukleotidtriphosphate
(dNTPs) (Life Technologies, Paisley, GB) und 25 pmol von jedem Primer.
Die Zyklen waren 96°C
5 Minuten, gefolgt von [95°C
1 Minute, 50°C
1 Minute, 72°C
1 Minute] mal 5, [95°C
45 Sekunden, 50°C
1 Minute, 72°C
1 Minute 30 Sekunden] mal 8, [95°C
45 Sekunden, 50°C
1 Minute, 72°C
2 Minuten] mal 5, beendet wurde mit 72°C 5 Minuten. Das erhaltene 1123-bp-Produkt
wurde mit BamHI und EcoRI gespalten und in den Vektor pUC 19 (Boehringer
Mannheim) kloniert. Die DNA-Sequenz
wurde unter Verwendung des Thermo Sequenase-Zyklus-Sequenzierungskits
mit radioaktiv markiertem Terminator und [33P]-Didesoxynukleotiden
(Amersham Life Science, Amersham, GB) bestätigt. Das Konstrukt wurde als
NdeI-bis-EcoRI-Fragment (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual Hrsg.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory
Press 1989, New York, USA) in den pET5c-Vektor (Promega UK Ltd.,
Southampton, GB) kloniert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des
Wizard® Plus
SV Minipreps-DNA-Reingungssystems (Promega UK Ltd.) oder in einem
größeren Maßstab mit dem
Qiagen Plasmid Midi-Kit (Qiagen Ltd., Crawley, GB) präpariert.
Das so erzeugte neue Plasmid wurde als pET5c FLAG-αPs scAb bezeichnet.
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Der
340-scAb wurde hergestellt, indem VH und VK des 340-Antikörpers anstelle
der α-Ps-VH
und -VK in ppM1His eingesetzt wurden. Die 340-VH wurde mit den Primern
5'cagctgcaggagtctgggggaggcttag3' (Genosys) und
5'tcagtagacggtgaccgaggttccttgaccccagta3' (Genosys) amplifiziert.
Das Reaktionsgemisch umfasste 0,1 μg Matrizen-DNA, 2,6 Einheiten
ExpandTM High Fidelity PCR-Enzymmix, Expand
HF-Puffer, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs und
25 pmol von jedem Primer. Die Zyklen waren 96°C 5 Minuten, gefolgt von [95°C 1 Minute,
50°C 1 Minute,
72°C 1 Minute]
mal 5, [95°C
45 Sekunden, 50°C
1 Minute, 72°C
1 Minute 30 Sekunden] mal 8, [95°C 45
Sekunden, 50°C
1 Minute, 72°C
2 Minuten] mal 5, wobei mit 72°C
5 Minuten geendet wurde. Das 357-bp-Produkt wurde mit PstI und BstEII
gespalten und in mit PstI und BstEII gespaltenes pPM1His kloniert (siehe
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, s.o.). Ebenso wurde die
340-VK mit den Primern 5'gtgacattgagctcacacagtctcct3' und
5'cagcccgttttatctcgagcttggtccg3' (Genosys) amplifiziert.
Das 339-bp-Produkt wurde mit SstI und XhoI gespalten und in mit
SstI und XhoI gespaltenes, modifiziertes pPM1His (vorstehend hergestellt)
kloniert. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Thermo Sequenase-Zyklus-Sequenzierungskits
mit radioaktiv markiertem Terminator und [33P]-Didesoxynukleotiden
(Amersham) bestätigt.
DNA für
den 340-scAb im Vektor pPM1His wurde mit den Primern RD 5'HIS:
5'gcggatcccatatgcaccatcatcaccatcaccaggtgcagctgcag3' (Genosys) und RD
3' (siehe oben)
amplifiziert, die die 6 Histidinreste am 5'-Ende einführten bzw. das 3'-Stoppcodon entfernten.
Die Reagenzien und Bedingungen für
die Amplifizierung waren genau wie bei dem α-Ps-Konstrukt. Das erhaltene
1114-bp-Produkt wurde mit BamHI und EcoRI gespalten und in den Vektor
pUC19 (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, s.o.) kloniert.
Die DNA-Sequenz wurde wie vorstehend bestätigt, und das Konstrukt wurde
als NdeI-bis-EcoRI-Fragment in den pET5c-Veltor kloniert, um das Plasmid pEt5c
HIS 340 scAb herzustellen.
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Modellgene
wurden derart modifiziert, dass sie eine Nukleinsäure-"Fangdomänen"-Sequenz enthielten.
Die verwendeten synthetischen Oligonukleotide waren wie folgt:
Fangdomäne:
5'-aga ata cag ggt
cca aat aga atc cag ggt
cap3inner:
5'-ctacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaataattc
cap3outer:
5'-agcgaattcaccctggattctatttggaccctgtattctacctataaaaatagg
cap5inner:
5'-ggtttccctctagaatacagggtccaaatagaatccagggtaagaaggagatatacatatg
cap5outer:
5'-atatatatgtcgacgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaatac
T7loop:
5'atatatatgtcgacgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacg
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Die
Fangdomänensequenz
stammte von dem SFFV-Freund-Erythroleukämievirus, und von ihr ist zuvor
gezeigt worden, dass sie keine komplementäre Sequenz in Säuger-cDNA-Datenbanken
besitzt [Tavitian et al. (1998), Nature Medicine 4: 467–471]. Die
Fangdomäne
wurde entweder in die 5'-UTR-Region
der oben be schriebenen Modellgene eingebracht oder in die 3'-Region dieser Gene
fusioniert. Die Konstrukte wurden als CAPS- bzw. CAP3-Variante bezeichnet.
Die Insertion der CAPS- und CAP3-Domänen wurde mittels PCR unter
Verwendung von Primern erzielt, die derart gestaltet waren, dass
sie für
jedes der verfügbaren
Modellgene universell waren. Für
die Insertion von CAPS wurden zwei serielle PCRs unter Verwendung
der Primer CAPS inner und RD3, gefolgt von einer zweiten PCR mit
den Primern CAPS outer und RD3, durchgeführt. Das erhaltene Produkt
wurde gereinigt und direkt in einer In-vitro-Transkriptionsreaktion
eingesetzt. Die Insertion der CAP3-Domäne verlief gemäß dem gleichen
Schema, wobei aber der Primer CAP3innner in der primären PCR mit
dem Primer T7loop verwendet wurde, gefolgt von einer sekundären PCR
unter Verwendung der Primer CAP3outer und T7loop. Das gereinigte
Produkt wurde direkt in einer In-vitro-Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die
Transkriptionsreaktionen wurden unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase
und des RiboMAX-Systems (Promega, Southampton GB) unter den vom
Zulieferer empfohlenen Bedingungen durchgeführt.
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RNA
wurde an ein synthetisches DNA-Oligonukleotid hybridisiert, das
kovalent an die Oberfläche
einer Mikrotiterplatte gebunden war. Das Fangoligonukleotid hatte
eine zu der Fangdomäne
innerhalb der RNA komplementäre
Sequenz. Bei einigen Experimenten wurde das Fangoligonukleotid über eine
5'-Amino-Linkereinheit
angeheftet, und bei anderen Experimenten erfolgt die Anheftung über das
3'-Ende des Moleküls. Mikrotiterplatten
mit angehefteten Oligonukleotiden wurden vertragsgemäß von GenoSys
Biotechnologies Europe Ltd. (Cambridge, GB) geliefert. Die Hybridisierungsreaktion
wurde für
60 Minuten bei 55°C
in einem Reaktionspuffer, der Tetramethylammoniumchlorid enthielt,
wie von Maskos und Southern (Maskos U & Southern E.M. (1992) Nucleic Acids
Res. 20: 1675–1678)
beschrieben, durchgeführt.
Die Waschschritte nach der Hybridisierung erfolgten bis zu hochstringenten
Bedingungen unter Verwendung von Verdünnungen eines SSPE-Puffers,
der 0,1% (Vol./Vol.) SDS enthielt, (1 × SSPE-Puffer = 180 mM NaCl,
10 mM Natriumphosphat pH 7,7, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure).
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Nach
dem letzten Waschschritt wurde eine In-vitro-Translationsreaktion
durch Zugabe von 25 μl
Kaninchenretikulozytenlysat (Promega), das mit einem vollständigen Aminosäuregemisch
angereichert war, gestartet. Bei einigen Experimenten wurde ein
Aminosäuremix
minus Methionin verwendet, in diesem Fall wurde 35S-Methionin (Amersham)
hinzugefügt.
Die Translationsreaktion erfolgte bei 30°C für 60 Minuten und wurde dann
auf Eis gestellt. Die Vertiefungen wurden unter Verwendung von eiskaltem
PBS, das 1% (Gew./Vol.) BSA enthielt, gewaschen. Die Translationsprodukte
wurden unter Verwendung von Antikörpern gegen entweder das Flag-
oder das his6-Epitop, die gentechnologisch in jedes der Modellgenkonstrukte
eingeführt
worden waren, nachgewiesen. Die Antikörper wurden in PBS verdünnt zu den
gewaschenen Vertiefungen gegeben. Die Inkubationen erfolgten für 60 Minuten
bei 4°C
unter leichtem Schütteln.
Ein Sekundärreagenz
(Anti-Maus-HRP-Konjugat) wurde in der empfohlenen Verdünnung in
PBS hinzugegeben und für
weitere 30 Minuten bei 4°C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden vor der Farbentwicklung mit dem
chromogenen Substrat dreimal unter Verwendung von 200 μl PBS gewaschen.
Die Platten wurden bei 492 nm gelesen. Wenn 35S-Methionin
zum Reaktionsmix gegeben worden war, wurden die Translationsprodukte
mittels Szintillationszählung nachgewiesen.
Die Ergebnisse zeigten eine erfolgreiche Immobilisierung des richtigen
Proteins aufgrund der Anheftung an seine mit ihm verbundene mRNA,
die wiederum aufgrund der komplementären Sequenzregion an die entsprechende
DNA hybridisierte.
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