DE69832622T2 - Methoden zur durchforstung (screenen) von proteinen - Google Patents

Methoden zur durchforstung (screenen) von proteinen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Screenen von Proteinen und Polypeptiden. Insbesonders betrifft die Erfindung Verfahren, die die Herstellung von Genbanken und die Synthese einzelner Proteine oder Polypeptide umfassen, die auf unterschiedliche Weise gescreent werden können. Besondere Ausführungsformen umfassen die Verwendung so genannter "Ribosomen-Display"-Protein- oder Polypeptidanordnungen. Folglich stellt die Erfindung neue praktische Anwendungen von dargebotenen Protein- oder Polypeptidanordnungen für das Screenen nach biologisch aktiven Polypeptiden, nach Proteinen, die an Rezeptoren binden, und nach Wechselwirkungen von Proteinen mit anderen Molekülen bereit.
  • Aus der fortdauernden Initiative, das menschliche Genom zu sequenzieren, hat sich eine größere Initiative entwickelt, Polymorphismen oder Mutationen in menschlichen Genen, die in ursächlichen Beziehungen zu menschlichen Erkrankungen stehen können, und außerdem Veränderungen in der Expression von Genen, die eine Erkrankung betreffen können, zu finden. Dies führte zu vielen Hochdurchsatz-Screening-Technologien, um solche Polymorphismen, Mutationen oder Veränderungen in der Genexpression aufzufinden. Ferner werden zurzeit solche Analysen durchgeführt, um menschliche Reaktionen auf bestimmte Behandlungen zu analysieren und somit das Ansprechen auf diese Behandlungen vorherzusagen. Allgemein spiegeln sich Polymorphismen, Mutationen und Genexpressionsveränderungen in Proteinen wieder, die von diesen Genen produziert werden, und es sind die Wirkungen dieser Proteine, die direkt die biologischen Ergebnisse, wie Entwicklung einer Erkrankung oder Reaktion auf eine Behandlung, bestimmen können. Außerdem werden die meisten eukaryotischen Proteine posttranslational modifiziert, und diese Modifikationen können nicht auf Genebene analysiert werden. Folglich ist es somit im Vergleich zu einer Analyse von DNA oder RNA wahrscheinlicher, dass eine Analyse des Screenings nach Proteinen und Proteinmodifikationen eine genaue Beziehung von Veränderungen zu einer Erkrankung liefert.
  • Die Analyse von Proteinzusammenhängen mit einer Erkrankung wird bis heute durch die 2D- (zweidimensionale) Proteingelanalyse aus menschlichem Gewebe oder menschlichen Zellen dominiert. Für diese Technologie werden in der Regel zelluläre Proteine auf Basis der Ladung in einer Dimension und auf Basis der Größe in der anderen Dimension aufgetrennt. Proteine können entweder in Bezug auf das Elektrophoreselaufmuster eines bekannten Proteins oder durch Elution des Pro teins aus dem elektrophoretisch aufgetrennten Fleck und Analyse durch Verfahren, wie Massenspektroskopie und magnetische Kernresonanz, identifiziert werden. Zu den Beschränkungen des 2D-Proteingelverfahrens gehören jedoch die beschränkte Auflösung und der Nachweis von Proteinen aus einer Zelle (gewöhnlich werden nur 5000 zelluläre Proteine klar nachgewiesen), die Beschränkung für die Identifizierung aufgetrennter Proteine (beispielsweise erfordert Massenspektroskopie gewöhnlich 100 fmol oder mehr Protein zur Identifikation) und die Schwierigkeit der Technik. Außerdem ist die Analyse von posttranslationaler Modifikation von Proteinen mittels 2D-Gelanalyse beschränkt, und Protein-Protein-Bindungswechselwirkungen können durch dieses Verfahren nicht nachgewiesen werden.
  • Eine große Zahl zellulärer Vorgänge wird durch die zeitweilige Wechselwirkung zwischen einem modifizierenden Enzym und seinem Proteinsubstrat gesteuert. Solche Wechselwirkungen sind mit herkömmlichen Verfahren schwierig nachzuweisen. Proteinmodifizierende Enzyme, wie Kinasen, Phosphatasen, Transferasen, Proteasen usw., steuern alle Arten grundlegender zellulärer Vorgänge (Pawson, Nature, 373 (1995), S. 573), und es wurde ebenfalls gezeigt, dass sie an Erkrankungsentstehungswegen beteiligt sind. Diese zeitweiligen Protein/Protein-Wechselwirkungen können zu einer Reihe verschiedener Wirkungen führen, von denen einige gemessen werden können. Die kinetischen Eigenschaften eines Proteins können verändert werden, was zu einer veränderten Bindung von Substraten (Prelich et al., Nature 326, (1989) S. 517) oder veränderter Katalyse führt (Porpaczy et al., Biochim. Biophys. Acta, 749 (1983), S. 172). Protein/Protein-Wechselwirkungen können die Bildung einer neuen Bindungsstelle bewirken, z.B. wird eine ATP-Bindungsstelle durch die Wechselwirkung der a- und b-Untereinheiten der E.-coli-ATPase gebildet (Weber et al., J. Biol. Chem., 268, (1993), S. 6241). Die Substratspezifität eines Proteins kann durch Protein/Protein-Wechselwirkungen verändert werden, wie das Beispiel der Wechselwirkung verschiedener Transkriptionsfaktoren mit RNA-Polymerase zeigt, wodurch die Polymerase zu spezifischen Promotoren gelenkt wird (White & Jackson, Trends Genet., 8, (1988), S. 284). Alternativ können Protein/Protein-Wechselwirkungen eine Inaktivierung bewirken, zum Beispiel wenn ein Protein mit einem Inhibitor wechselwirkt (Vincent & Lazdunski, Biochemistry, 11, (1972), S. 2967).
  • Im Stand der Technik sind Verfahren offenbart, die auf der Erzeugung von Proteinen oder Polypeptiden aus Genbanken beruhen. In-vitro-Verfahren zur Selektion eines Polypeptids bieten potenziell Vorteile gegenüber In-vivo-Verfahren, indem die Notwendigkeit der Aufnahme von Genen in Zellen beseitigt und die Umgebung für die mRNA- und Proteinproduktion kontrolliert wird. In-vitro-Transkriptions- und -Translationsreaktionen werden seit vielen Jahren als Mittel zur Erzeugung von Polypeptiden direkt von DNA verwendet, und es wurde gezeigt, dass spezifische mRNAs durch Immunpräzipitation von Polysomen (z.B. Payvar, F. und Schimke, R.T., Eur. J. Biochem., Bd. 101 (1979) S. 1844–1848) unter Verwendung von Antikörpern zur Selektion der spezifischen Polypeptide angereichert werden können. Diese so genannte "Ribosomen-Display"-Technik wurde vor kurzem an die Selektion von Peptiden (Mattheakis, L. et al., PNAS 91: 9022, 1994 und PCT95/11922) and Proteinen angepasst (Kawasaki, G., PCT91/05058 und Hanes & Plückthun, PNAS, Bd. 94 [10]: 493 7, 1997). Hanes & Plückthun offenbaren ein In-vitro-Verfahren zum Screenen von korrekt gefalteten, vollständigen Proteinen und deren codierenden Polynukeotiden mittels In-vitro-Translation des Polynucleotids in Protein, wobei das ribosomengebundene Protein durch Wechselwirkung mit einem Liganden/Antigen an einem festen Träger immobilisiert und das wechselwirkende Protein selektiert sowie die mRNA in DNA revers transkribiert wird.
  • Ein hauptsächlicher Nachteil bei solchen Verfahren ist jedoch, dass die Proteine oder Polypeptide als "Pool" erzeugt werden, der dann gescreent wird.
  • Somit besteht ein Bedarf an Screeningverfahren, die eine schnelle Identifizierung einzelner Proteine oder Polypeptide gestatten und die wiederum auch die Identifizierung von Genen gestatten, die solche Proteine oder Polypeptide codieren.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung unter einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Screenen von Proteinen oder Polypeptiden bereit, das die Herstellung einer Genbank und die Synthese einzelner Protein oder Polypeptide umfasst, die dann gescreent werden können. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "einzelne Proteine oder Polypeptide", dass die von der Genbank exprimierten Proteine oder Polypeptide einzeln identifizierbar sind und nicht Teile eines Pools bilden. So können zum Beispiel die Proteine oder Polypeptide als Anordnung exprimiert werden, in der jedes Protein oder Polypeptid einen bestimmten Punkt oder eine bestimmte Fläche innerhalb der Anordnung einnimmt. Zum Beispiel kann eine Genbank in Form von Kolonien oder Plaques erzeugt werden, die wiederum einzeln gepickt und zu einer Anordnung zusammengestellt werden können. Die Expression der Gene führt wiederum zu einer Anordnung von Proteinen oder Polypeptiden ein einem Anordnungsformat, die jeweils einen bestimmten Punkt oder eine bestimmte Fläche einnehmen.
  • Die von den Genbanken erzeugten Proteine oder Polypeptide können als "synthetische Proteine oder Polypeptide" bezeichnet werden, die durch In-vitro-Verfahren, wie In-vitro-Transkription und -Translation, Ribosomen-Display und Phagen-Display, hergestellt werden. So können sie auf dieser Basis von "natürlichen Proteinen" unterschieden werden, die direkt aus Gewebe- oder Zellextrakten stammen.
  • Die hier beschriebenen Verfahren ermöglichen also das Screenen von Proteinen und Polypeptiden und posttranslationalen Modifikationen unter Verwendung von Genbanken als Ausgangspunkt für die Synthese "synthetischer" Proteine oder Polypeptide. Im Allgemeinen wird dies durch Herstellung von Anordnungen von Proteinen oder Polypeptiden als Mittel zu deren Screening erzielt. Genauer gesagt, werden die Anordnungen durch In-vitro-Transkriptions- und -Translationsverfahren erzeugt.
  • Protein"anordnungen" – bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden neue Verfahren zum Screenen von Proteinen und Polypeptiden und posttranslationalen Modifikationen unter Verwendung von Genbanken als Ausgangspunkt für die Synthese synthetischer Proteine bereitgestellt. Bei dieser Ausführungsform liefern diese Genbanken die Basis für die Auftrennung von einzelnen Proteinen oder Gruppen von Proteinen, um Polypeptide sowie Polypeptidmodifikationen nachzuweisen. Das Verfahren vermeidet prinzipiell die Verwendung von Proteingelelektrophorese. Die Erfindung stellt Verfahren zur Hochdurchsatz-Analyse von Proteinen in normalen und erkrankten Geweben oder Zellen, hauptsächlich zum Nachweis von Unterschieden zwischen normalen und Erkrankungsproteinen, und außerdem zur Analyse von Proteinveränderungen in Bezug zu Medikamenten- und anderen Erkrankungsbehandlungen bereit. Das Verfahren stellt auch eine Hochdurchsatz-Analyse der Bindung oder biologischen Aktivität von Banken von Proteinen oder Polypeptiden bereit, wenn diese lebenden Zellen oder Geweben ausgesetzt werden. Außerdem stellt das Verfahren auch das Protein-"Fingerprinting" von Individuen als Alternative zum genetischen Fingerabdruck bereit, um Individuen und unterschiedliche Gewebe oder Zellen zu identifizieren. Es ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass Proteine entweder in Pools oder in Anordnungen von einzelnen Proteinen analysiert werden, wodurch, wenn Modifikationen, eine Bindung oder biologische Aktivität unter Ver wendung einer Mehrzahl an Verfahren nachgewiesen werden, die Identität des Proteins entweder direkt oder indirekt entweder durch seine Position in einem bestimmten Pool oder seine Position an einer bestimmten Stelle der Anordnung festgestellt werden kann. Es ist ebenfalls ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass die Verfahren den vergleichenden Nachweis von Unterschieden in Proteinen oder Proteinmodifikationen zwischen verschiedenen Geweben oder Zellen gestatten und die Verfahren deshalb einen Screen für diese Unterschiede darstellen.
  • Das Verfahren basiert hauptsächlich auf der Verwendung von synthetischen Proteinen, die mithilfe von DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, insbesondere von Proteinen, die von einem oder mehreren Genen durch In-vitro-Transkription und -Translation (IVTT) hergestellt werden. Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung synthetischer Proteine mittels IVTT und ihre anschließende Immobilisierung auf festen Phasen vor den Screenen nach einer Proteinmodifikation oder Protein/Protein-Bindungswechselwirkungen. Es ist ein entscheidender Aspekt dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass die Herstellung synthetischer Proteine von Anordnungen von Genen (wie von cDNAs, die in Vektoren kloniert sind, die so gestaltet sind, dass sie die IVTT erleichtern) auf eine derartige Weise durchgeführt wird, dass synthetische Proteine, wenn sie hinsichtlich einer Proteinmodifikation, Bindung oder biologischen Aktivität getestet worden sind, anhand der Gene, von denen sie stammen und die diese synthetischen Protein codieren, leicht identifiziert werden können, wobei die Gensequenz die Identität des Proteins enthüllt. Solche Genanordnungen werden zum Beispiel bereitgestellt, indem einzelne cDNA-Klone oder Gemische von Klonen an spezifische Loci in einer Anordnung (wie in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte) gepickt werden. Nach der IVTT (in der Regel nach Amplifikation der cDNAs durch Verfahren, wie PCR) können Proteinproben aus allen Loci der Anordnung entnommen und an spezifischen Loci einer anderen Anordnung immobilisiert oder darin abgegeben werden, beispielsweise in andere Mikrotiterplatten oder auf eine feste Phase, wobei die Proben an einzelnen Loci auf der festen Phase abgegeben werden. Wenn spezifische Proteinmodifikationen oder Proteinbindungsereignisse von Proteinproben in der Anordnung nachgewiesen werden, dann kann das spezifische Gen, das diese Proteine codiert, lokalisiert und sequenziert werden, um das Protein von Interesse zu identifizieren.
  • Es liegt ebenfalls im Umfang der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass die cDNA-Bank einen Satz variabler Moleküle codieren kann, wie variabler Immunglobulinregionen (allgemein als einkettige Fv-Regionen, die als SCAs (single-chain antibodies, einkettige Antikörper) bezeichnet werden). Wenn diese variablen Moleküle an spezifischen Loci in Anordnungen abgegeben werden, haben sie die Fähigkeit, an andere spezifische Moleküle (in der Regel Proteine) aus Zell- oder Gewebeproben zu binden. Diese Zell- oder Gewebemoleküle stellen dann aufgrund der Bindung an die variablen Moleküle in der Anordnung im Wesentlichen eine geordnete Anordndung von Zell- oder Gewebemolekülen bereit. Das Vorliegen von Zell- oder Gewebemolekülen in solchen Anordnungen oder eine Modifikation dieser Moleküle, beispielsweise durch Phosphorylierung oder Wechselwirkung mit anderen Proteinen, kann dann in der Anordndung untersucht werden. Die Identität solcher Zell- oder Gewebemoleküle kann anschließend durch mehrere Verfahren bestimmt werden, insbesondere wenn die ursprünglichen variablen Moleküle in Isolation gehalten und zur Gewinnung des (der) Zell- oder Gewebemolekül(s/e) in Isolation verwendet werden können. Die Identität dieser Zell- oder Gewebemoleküle kann dann durch klassische biologische Mittel oder, wenn es sich bei diesen um Proteine handelt, durch Proteinsequenzierung oder durch Verfahren, wie 2D-Gel-Laufeigenschaften, bestimmt werden. Alternativ kann die Identität solcher proteinartigen Zell- oder Gewebemoleküle unter Verwendung eines Protein-Display-Systems, wie des in dieses Patent aufgenommenen Ribosomen-Systems, bestimmt werden, wobei eine cDNA-Bank zur Herstellung einer Bank von Proteinen, die mit ihren Genen (oder einer RNA-Darstellung des Gens) verbunden sind, verwendet wird, so dass nach Bindung an ein spezifisches variables Molekül die Identität des bindenden Proteins durch Bestimmung der Nukleotidsequenz des damit verbundenen Gens bestimmt werden kann.
  • Als Alternative zur Verwendung von IVTT für die Herstellung synthetischer Proteine bei der Bildung von Proteinanordnungen ist ein anderer Aspekt der Mikroanordnungsausführungsform der Erfindung die Verwendung von "Polypeptid-Display"-Verfahren zur Erzeugung synthetischer Polypeptide mit geeigneten Phänotypen aus Genbanken, die eine große Mischung von Polypeptiden codieren, wodurch die entsprechenden Gene schnell und leicht gewonnen werden können. Es sind In-vitro-Verfahren für das Polypeptid-Display entwickelt worden, die einen größeren Umfang hinsichtlich des Typs des dargebotenen Proteins gestatten als auf Zellen basierende Display-Systeme, und insbesondere das Display von Proteinen in Verbindung mit Ribosomen ("Ribosomen-Display"), das Proteine bereitstellen kann, die über den Ribosomenkomplex mit entsprechenden mRNAs verbunden sind, die dann sequenziert werden können, um die Identität des Proteins zu enthül len. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch andere Protein-Display-Verfahren umfassen, wie Phagen-Display.
  • Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Proteinmodifikationen gescreent, indem eine Genbank hergestellt wird, die dann zur Erzeugung synthetischer Proteine, beispielsweise mittels IVTT, verwendet wird, um anschließend mRNA und Protein aus diesen Vektoren vorzugsweise unter solchen Bedingungen herzustellen, dass die Ausbeute an synthetischen Volllängenproteinen, die von der mRNA dissoziiert sind, maximiert wird. Um eine Überrepräsentierung von Proteinen oder Polypeptiden von häufigen mRNA-Spezies zu vermeiden, wird die Genbank normalisiert. Durch den Einbau von modifizierten Aminosäuren, wie Biotinyllysin, oder den Einbau einer Aminosäuresequenzmarkierung, die vom Plasmidvektor codiert oder mittels PCR eingebracht wird, oder durch chemische Modifikation des Proteins kann das synthetische Protein als nächstes auf einer festen Phase, wie einer Magnetkugel, über ein Biotin bindendes Protein (z.B. Streptavidin) oder über ein an die Sequenzmarkierung bindendes Protein, wie einen Anti-Markierungs-Antikörper, immobilisiert werden. Bei einem Screen nach einer Proteinmodifikation werden durch geeignete Verteilung der Ausgangsgene kleine Pools von Proteinen oder einzelne Proteine in Anordnungen, beispielsweise in Mikrotitervertiefungen, hergestellt und in diesen Anordnungen immobilisiert.
  • Alternativ können die synthetischen Proteine in Anordnungen als einzelne kleine Pools von Proteinen oder einzelne Proteine hergestellt und dann einzeln (entweder manuell oder unter Verwendung einer automatischen Abgabevorrichtung) an verschiedene Loci auf einer flachen festen Phase, wie einem Glas-"Chip", überführt werden, wobei die Proteine mit funktionellen Einheiten auf der festen Phase wechselwirken, was zur Immobilisierung führt. Als nächstes werden die synthetischen Proteine mit Extrakten von Geweben oder Zellen behandelt, wodurch in diesen Geweben oder Zellen vorhandene Enzyme Modifikationen an den synthetischen Proteinen vornehmen können. Schließlich werden diese Modifikationen dann unter Verwendung spezifischer Nachweissysteme, wie fluoreszenzmarkierte Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, nachgewiesen. Vergleicht man das Signal vom Nachweissystem von mehrfach wiederholten Anordnungen synthetischer Proteine, die durch unterschiedliche Extrakte aus Geweben und Zellen modifiziert wurden, dann zeigen Unterschiede in diesen Signalen zwischen mehrfachen synthetischen Prote inen Unterschiede in den Proteinmodifizierungaktivitäten aus diesen unterschiedlichen Geweben oder Zellen.
  • Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Protein-Protein-Bindungswechselwirkungen gescreent, indem eine Genbank erzeugt wird, die dann zur Erzeugung synthetischer Proteine, beispielsweise mittels IVTT, vorzugsweise in solchen Vektoren und unter solchen Bedingungen verwendet wird, dass die Ausbeute an synthetischen primären Volllängenproteinen, die von der mRNA dissoziiert sind, maximiert wird. Durch den Einbau modifizierter Aminosäuren oder einer Aminosäuresequenzmarkierung oder durch chemische Modifikation des Proteins oder unter Verwendung einer chemisch reaktionsfähigen festen Phase kann das synthetische primäre Protein auf einer festen Phase entweder unmittelbar nach der Synthese oder nach der Wechselwirkung mit sekundären Proteinen, so dass beliebige Protein-Protein-Wechselwirkungen gebildet werden, immobilisiert werden. Durch geeignete Verteilung der Ausgangsgene werden, wie bei Screens nach einer Proteinmodifikation, kleine Pools von primären Proteinen oder einzelne Proteine in Anordnungen, beispielsweise in Mikrotitervertiefungen oder auf Glas-Chips, hergestellt und in diesen Anordnungen immobilisiert. Als nächstes können diese synthetischen primären Proteine gegebenenfalls mit Extrakten von Geweben oder Zellen behandelt werden, wodurch in diesen Geweben oder Zellen vorhandene Enzyme Modifikationen an den synthetischen Proteinen vornehmen können. Als nächstes gibt man ein oder mehrere (einschließlich einer Bank von) sekundäre(s/n) Protein(en) zu, um beliebige geeignete Bindungswechselwirkungen von geeigneten sekundären Proteinen mit den primären Proteinen zu bilden. Gegebenenfalls können diese sekundären Proteine synthetisch sein und an Ribosomen oder Phagen dargeboten werden, so dass die Identität der sekundären Proteine anschließend bestimmt werden kann.
  • Alternativ können die sekundären Proteine natürliche Proteine sein, die aus Geweben oder Zellen stammen. Protein-Protein-Bindungswechselwirkungen zwischen primären und sekundären Proteinen können dann mit einem Spektrum an Verfahren nachgewiesen werden. Beispielsweise kann das primäre Protein auf einer festen Phase immobilisiert werden, und das Vorliegen eines synthetischen sekundären Proteins kann über eine Aminosäuresequenzmarkierung, die in das sekundäre Protein eingebaut ist, unter Nachweis mit spezifischen Nachweissystemen, wie fluoreszenzmarkiertem Anti-Markierungs-Antikörper, bestimmt werden. Wenn das sekundäre Protein mit seiner codierenden Nukleinsäure verbunden ist, wie bei spielsweise für das Ribosomen- oder Phagen-Display, dann kann das sekundäre Protein alternativ durch einen PCR-Assay nach der damit verbundenen Nukleinsäure nachgewiesen werden. Alternativ kann die Bindung des sekundären Proteins über die Wirkung des sekundären Proteins beim Blockieren einer Stelle auf dem synthetischen primären Protein nachgewiesen werden, die in dem Assay-System nachgewiesen wird und blockiert wird, wenn ein sekundäres Protein bindet. Wenn das sekundäre Protein ein natürliches Protein ist, kann es alternativ direkt nach der Bindung, beispielsweise durch Zugabe eines UV-aktivierbaren Biotinmoleküls, markiert und direkt nachgewiesen werden, oder es kann laserverdampft und mittels MALDI (Matrix-gestützter Laserdesorptionsionisation) und Massenspektroskopie nachgewiesen werden. Wenn die Bindung von sekundären Proteinen an mehrfach wiederholte Anordnungen synthetischer primärer Proteine zwischen unterschiedlichen Extrakten von Geweben oder Zellen verglichen wird, dann zeigen Unterschiede in diesen Signalen zwischen mehrfachen synthetischen Proteinen Unterschiede in den Protein-Protein-Bindungsaktivitäten aus diesen verschiedenen Geweben oder Zellen.
  • Es ist offensichtlich, dass durch Nachweis eines Spektrums von Proteinmodifikationen und durch Nachweis von Protein-Protein-Bindung mit einem üblichen Nachweisformat, wie unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper gegen Proteinmarkierungen oder -epitope, dann gleichzeitig ein paralleles Screening nach einer Reihe unterschiedlicher Proteinmodifikationen durchgeführt werden kann, um Unterschiede zwischen verschiedenen Geweben und Zellen zu screenen.
  • Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet man Protein-Protein-Wechselwirkungen als Basis für die Herstellung von Anordnungen sekundärer Proteine, insbesondere natürlicher, aus Gewebe oder Zellen stammender Proteine, die normalerweise unter Verwendung von Standardtechnologie sehr schwierig umfassend anzuordnen wären. Die primären Proteine umfassen einen sehr unterschiedlichen Satz von Proteinen, wie Immunglobulinen, die einen unterschiedlichen Satz von Bindungsspezifitäten für einen Satz von sekundären Proteinen, wie natürlichen Proteinen aus Gewebe- oder Zellextrakten oder synthetischen Proteinen aus einer an Ribosomen oder Phagen dargebotenen Proteinbank, bereitstellen. Beispielsweise stammen die primären Proteine aus einer an Ribosomen dargebotenen Bank von variablen Regionen einkettiger Antikörper (SCA), die durch direkte PCR-Amplifikation variabler Immunglobulinregionen aus Säuger-B-Lymphozyten und Klonierung in geeignete Vektoren für die In-vitro- Transkription hergestellt wurde. Mitglieder der SCA-Bank werden entweder einzeln oder in Gruppen in Mikrotitervertiefungen oder direkt auf einer festen Phase, wie einem Glas-Chip, angeordnet, und die SCA-Proteine werden mittels IVTT hergestellt und über eine Proteinmarkierung oder mittels direkter chemischer Kupplung an eine feste Phase immobilisiert. Dann wird eine Mischung natürlicher Proteine aus einem Gewebe- oder Zellextrakt oder eine Mischung synthetischer Proteine, die aus einer Genbank stammen, (zum Beispiel an Ribosomen oder Phagen dargebotener Proteine) im Ganzen zu der Anordnung der primären Proteine, wie SCAs, hinzugefügt, wobei die Bindungsspezifität, die die primären Proteine für die sekundären Proteine besitzen, zu einer Anordnung der sekundären Proteine führt, wobei entweder einzelne sekundäre Proteine oder Gruppen von sekundären Proteinen an einzelne SCAs binden. Die erzielte Anordnung von sekundären Proteinen wird zwischen verschiedenen Extrakten von Geweben und Zellen verglichen, dann zeigen Unterschiede in diesen Signalen zwischen mehrfachen synthetischen Proteinen Unterschiede im Vorliegen von Proteinen aus diesen verschiedenen Geweben oder Zellen. Alternativ können diese Proteine auch hinsichtlich verschiedener Modifikationen, wie Phosphorylierung, getestet werden, indem beispielsweise fluoreszenzmarkierte Antikörper für den Nachweis dieser Modifikationen verwendet werden.
  • Es ist ein besonderer Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass entweder synthetische oder natürliche Proteine in Anordnungen von einzelnen oder mehreren Proteinen aufgeteilt werden, um Vergleiche im Hinblick auf das Vorliegen oder eine Modifikation dieser einzelnen einen oder mehreren Proteinmitglieder der Anordnung zwischen verschiedenen Gewebe- oder Zellextrakten zu ermöglichen oder eine Analyse der Bindung oder von biologischen Aktivitäten dieser Proteinmitglieder an lebenden Zellen oder lebendem Gewebe bereitzustellen. Während Anordnungen in Mikrotiterplatten leicht durchgeführt werden können, indem einzelne Mitglieder von Gruppen von Klonen aus einer cDNA-Bank in die einzelnen Vertiefungen der Platte verteilt werden, führt diese manuelle (oder robotergesteuerte) Anordnungstechnologie zu der physikalischen Schranke der Wände der Vertiefungen zwischen verschiedenen Proben, und dies macht es schwierig, anschließende Lösungen, wie Waschlösungen und Banken sekundärer Proteine, schnell und exakt zuzugeben. Außerdem stellt die Verwendung von Mikrotiterplatten eine Grenze für die Dichte an angeordneten Proteinen dar, wobei diese Grenze durch die Dichte an Vertiefungen in den erhältlichen Mikrotiterplatten vorgegeben wird. Daher ist es wünschenswert, über Verfahren zu verfügen, die keine Anordnung von Proteinen ohne physikalische Schranken zwischen den Proteinen erfordern.
  • Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung, bei der Anordnungen von Proteinen ohne physikalische Schranken hergestellt werden, wird die räumliche Verteilung von Proteinen in Anordnungen entweder durch direkte räumliche Immobilisierung einzelner synthetischer Proteine, die beispielsweise über Ribosomen-Display aus einer Genbank stammen, oder durch räumliche Immobilisierung von Nukleinsäuren, insbesondere von synthetischer DNA, erreicht, an die Nukleinsäuren hybridisiert werden, die mit einer synthetischen Proteinbank verbunden sind, um Mitglieder der Proteinbank indirekt räumlich zu immobilisieren. Zur direkten räumlichen Immobilisierung werden entweder aus einer Gewebe- oder Zellgenbank stammende synthetische Proteine immobilisiert, oder synthetische Proteinsonden, wie SCAs, werden derart immobilisiert, dass eine Mischung sekundärer Proteine zugegeben werden kann, wodurch diese je nach ihren Bindungsspezifitäten zu einzelnen Proteinsonden räumlich verteilt werden. Somit stellt die Erfindung neue Typen von Protein-Chips bereit (vgl. Hutchens & Yip, Rapid Comms. Mass Spec. 7, (1993), S. 576). Die Immobilisierung synthetischer Proteine auf dem Chip wird entweder durch kovalente oder nichtkovalente Bindung erreicht. Besonders geeignet ist die Immobilisierung unter Verwendung von Biotineinheiten, die durch Zugabe von Biotinyllysin-tRNA während der Translationsreaktion in das Protein eingebaut werden. Nach dem Einbau von Biotin können synthetische Proteinmoleküle dann leicht auf Festphasen-Streptavidin oder Festphasen-Anti-Biotin-Antikörpern immobilisiert werden. Üblicherweise wird dies durch Verwendung einer Roboter-Abgabevorrichtung erleichtert, die mittels In-vitro-Transkription und -Translation hergestellte Proteinproben auf spezifische Positionen in einer Platte mit mehreren Vertiefungen oder auf eine feste Phase, wie einen Glas-Chip, aliquotieren kann. Eine derartige Roboter-Abgabevorrichtung ist besonders wichtig für die Herstellung mehrfach wiederholter Anordnungen synthetischer Proteine, bei denen identische Proteine an identischen Loci innerhalb der mehrfachen festen Phasen immobilisiert werden. Bei der direkten Immobilisierung unter Verwendung von Biotinyllysin kann freie Biotinyllysin-tRNA, die nicht in das synthetische Protein eingebaut wurde, bei einigen Proben Schwierigkeiten bereiten, wobei die freien Biotingruppen den Zugang zu immobilisierten Streptavidinmolekülen blockieren. Geeigneterweise kann dies überwunden werden, indem die Erschöpfung der Biotinyllysin-tRNA im Translationsreaktionsgemisch gewährleistet wird (naszierende Proteine können dann durch Zugabe von unmodifizierter Lysin-tRNA ver vollständigt werden); alternative Strategien sind die Verwendung fester Phasen, bei denen die Anzahl an Biotinbindungsstellen im Überschuss zu den Anzahlen an mit Lysin verbundenen Biotinmolekülen vorliegt, oder ein Molekularsiebfiltrationsschritt zur Entfernung kleiner Moleküle, wie Biotinyllysin-tRNA. Eine andere Strategie besteht darin, in das Translationsreaktionsgemisch am Ende des Translationszeitraums eine synthetische mRNA-Matrize zu geben, die ein lysinreiches (Poly)peptid codiert und die dann überschüssige freie Biotinyl-tRNAs einbauen kann. Eine derartige Matrize codiert ferner eine Peptidsequenz (beispielsweise einen Polyhistidinschwanz), die anschließend zur Entfernung des lysinreichen synthetischen Proteins aus dem Reaktionsgemisch verwendet werden kann (zum Beispiel unter Verwendung von Kugeln mit Antikörpern gegen den Polyhistidinschwanz). Auf diese Weise werden die freien Biotinyllysingruppen vor der Immobilisierung der synthetischen Proteine aus dem Translationsgemisch entfernt.
  • Eine nichtkovalente Anheftung der Proteine kann auch durch Markierung der Proteine, beispielsweise mit Biotin unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reagenzes, wie Sulfo-SBED (Pierce & Warriner, Chester, GB), das dann mit Avidin umgesetzt werden, erleichtert werden. Eine kovalente Anheftung der Proteine kann auch durch Aktivierung der Proteine mit reaktiven Spezies, um die Vernetzung zu erleichtern, auf eine beliebige herkömmliche Weise, wie den in O'Sullivan et al. (Anal. Biochem. 100 (1997), 108) beschriebenen, erzielt werden. Eine Anheftung von Proteinen könnte auch durch Einbau spezifischer Aminosäuresequenzen innerhalb der synthetischen Proteine, wie endständiger Polyhistidinsequenzen, die dann entweder an Festphasen-Nickelchelate oder Anti-Polyhistidin-Antikörper als Mittel zur Erzielung von Immobilisierung binden können, erreicht werden. Alternative Verfahren zur direkten Bindung synthetischer Proteine umfassen die Bindung an Ribosomen dargebotener Proteine über die Immobilisierung der damit verbundenen RNA, beispielsweise unter Verwendung eines RNA-bindenden Proteins (wie HIV-tat-Protein) oder durch Hybridisierung der RNA an synthetische DNA-Moleküle auf der festen Phase.
  • Für eine indirekte Immobilisierung von Proteinen über Nukleinsäuren kann die damit verbundene mRNA in einem Protein-Ribosom-mRNA-Komplex mit einer Nukleotidsequenzmarkierung hergestellt werden, die ursprünglich von dem die mRNA codierenden Plasmidvektor codiert wird. Die Nukleotidsequenzmarkierung kann in der Plasmidvektorpräparation variabel oder randomisiert sein, beispielsweise indem der Plasmidvektor unter Verwendung einer synthetischen Region her gestellt wird, die von einer zufallsgemäßen Oligonukleotidmischung (mit geeigneten Enden, die mit dem Vektor hybridisieren) codiert wird, so dass eine Sequenzmarkierung zufallsgemäß zum Beispiel an das 5'-Ende der mRNA platziert wird. Nach der Herstellung der Protein-Ribosomen-mRNA-Komplexe von der Genbank können dann die mRNA-Sequenzmarkierungen an eine Anordnung synthetischer Oligonukleotide hybridisiert werden, die einzeln über eine feste Oberfläche, wie einen Glasobjektträger (einem "DNA-Biochip"), aufgebracht worden sind. Auf diese Weise können schließlich einzelne Proteine an spezifischen Stellen auf dem Biochip positioniert werden. Die räumlich angeordneten Proteine können dann hinsichtlich einer Modifikation durch Gewebe- oder Zellextrakte analysiert werden, beispielsweise unter Verwendung fluoreszierender Antikörper, um nach diesen Modifikationen zu screenen. Ferner können die Anordnungen zur Identifizierung von Proteinen verwendet werden, die an die einzelnen Protein auf dem Biochip binden oder diese modifizieren. Die Identität der modifizierten Proteine oder der an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligten Proteine kann anschließend aus der bekannten Sequenz des immobilisierten Oligonukleotids auf dem Chip bestimmt werden, wobei diese Sequenz als Sonde in der Plasmidbank (zum Beispiel mittels PCR) eingesetzt wird, um das spezifische Gen zu identifizieren, das mit der komplementären Sequenzmarkierung in der Plasmidbank verbunden ist. Die Identität von Proteinen kann alternativ mittels PCR-Amplifikation der mRNA-Sequenz, die mit dem einzelnen Protein verbunden ist, erzielt werden. Deshalb betrifft diese Ausführungsform einen Protein-Anordnungs-Biochip, wobei im Prinzip einzelne Proteine an einzelnen Loci auf dem Chip positioniert sind. Alternativ kann die Identität des Proteins bestimmt werden, wenn das primäre oder sekundäre Protein mit einem zufallsgemäßen Satz von Proteinsequenzmarkierungen hergestellt wird, die zum Beispiel unter Verwendung einer Mischung von Antikörpern gegen diese Sequenzmarkierungen abgefragt werden können. Werden die synthetischen Proteine beispielsweise auf eine Weise hergestellt, dass ein Terminus entweder eine zufallsgemäße oder halb zufallsgemäße Abfolge von Aminosäuren umfasst, von denen jede durch einen Antikörper aus einer Bank von Antikörpern mit geeigneten Markierungen nachgewiesen werden kann, dann kann die Bindung von einem oder mehreren spezifischen Antikörpern die Identität des synthetischen Proteins bestimmen. Wenn zum Beispiel ein Terminus des Proteins eine zufallsgemäße 8-Aminosäuren-Sequenzmarkierung enthält und eine Bank von SCAs konstruiert und an SCAs angereichert wurde, die an eine entsprechende Mischung synthetischer Peptide binden, dann binden einzelne oder kleine Gruppen von SCAs an spezifische Peptide, und die Peptide (und damit die synthetischen Proteine) können anhand der Kenntnis der Spezifität einzelner SCAs identifiziert werden.
  • Von der vorliegenden Erfindung werden ferner Verfahren umfasst, bei denen Gemische modifizierter Proteine oder wechselwirkender Proteine vor der Analyse von Unterschieden zwischen verschiedenen Geweben oder Zellen vorselektiert werden. Zum Beispiel werden primäre synthetische Proteine, die durch Display-Verfahren, wie Ribosomen-Display, erzeugt wurden, wobei einzelne, ein Protein codierende mRNA-Moleküle mit dem Protein verbunden bleiben, einer Behandlung durch Gewebe- oder Zellextrakte unterworfen und dann einer Selektion unter Verwendung von auf einer festen Phase immobilisierten Antikörpern gegen diese Modifikationen unterworfen. So werden modifizierte Proteine mit den damit verbundenen Nukleinsäuren isoliert, und das Profil an isolierten Proteinen kann mit verschiedenen Mitteln, einschließlich einer einfachen Analyse von PCR-Produkten, zum Beispiel durch Agarosegelelektrophorese, und Vergleich der Ergebnisse von Behandlungen mit verschiedenen Zellen und Geweben bestimmt werden. Ebenso könnten für primäre natürliche Proteine, die dann zum "Fangen" sekundärer synthetischer Proteine über Protein-Protein-Bindung verwendet werden, wechselwirkende Proteine zum Beispiel unter Verwendung eines Antikörpers gegen eine Markierung an dem sekundären synthetischen Protein isoliert und ein Profil der wechselwirkenden Proteine wiederum durch Analyse von PCR-Produkten von den mit dem synthetischen Protein verbundenen Nukleinsäuren bestimmt werden.
  • Von der vorliegenden Erfindung werden ferner Verfahren umfasst, bei denen aus Genbanken erzeugte, synthetische Proteine einer Proteingelelektrophorese zur Analyse von Proteinmodifikation oder Protein-Protein-Bindung unterzogen werden. Es ist gut dokumentiert, dass posttranslationale Modifikationen, wie Proteolyse oder Phosphorylierung, die elektrophoretische Beweglichkeit eines Proteins verändern (Phizicky & Fields, Microbiol. Rev., 59, (1995), S. 94). Eine Ausführungsform der Erfindung stellt deshalb ein Verfahren bereit, wobei mit Erkrankung verbundene Modifikationen unter Verwendung von 2D-Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Zum Beispiel wird eine cDNA-Bank für anschließende IVTT oder Ribosomen-Display konstruiert. Um die anschließende Reinigung der Proteine zu erleichtern, kann eine 3'-Markierung, wie His oder Flag, in den verwendeten Transkriptionsvektor eingebaut werden. Dies wird durch molekularbiologische Standardtechniken erreicht, die dem Fachmann geläufig sind. Um den anschließenden Nachweis der Proteine zu erleichtern, können sie während des Translationsvorgangs mit Markierungen, wie 35S oder Biotin, markiert werden. Nach der Translation können die Proteine, wenn erforderlich, gereinigt werden, um Ribosomen und andere Faktoren zu entfernen, beispielsweise mittels Leiten des Translationsgemischs über eine Affinitätsmatrix, die Liganden, wie Anti-Flag-Antikörper oder Nickel, enthält, wenn die Proteine 3'-Flag- oder Polyhistidinmarkierungen besitzen, oder unter Verwendung von Anti-Ribosom-Antikörpern zur Entfernung von Ribosomenkomponenten auf einer festen Phase oder durch einfache Ultrazentrifugation von Ribosomen. Protein aus einer klinischen Probe (die entweder unmarkiert oder zum Beispiel durch Umsetzung mit einer fluoreszierenden Einheit markiert sind) wird dann mit der gereinigten, in vitro translatierten Bank inkubiert, um entweder eine Modifikation oder Proteinwechselwirkungen mit dem synthetischen Protein herbeizuführen. Die Gesamtreaktion wird dann mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt (Cash, J. Chromatography 698 (1995), S 203), und die erhaltenen Gele werden unter Verwendung von geeigneter Computersoftware, wie Phoretix-2D (Phoretix International, Newcastle upon Tyne, GB), analysiert. Eine Kontrollreaktion wird derart durchgeführt, dass die synthetische Proteinbank mit Gesamtprotein aus einer anderen klinischen Probe, zum Beispiel einer normalen Probe, wenn es sich bei der ersten um eine Erkrankungsprobe handelt, umgesetzt wird. Mit einer Erkrankung zusammenhängende Modifikationen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen werden als einzigartige Banden identifiziert, die mit den erkrankten Proteinen und nicht mit den Kontrollproteinen beobachtet werden. Um eine schnelle Identifizierung des Gens zu erleichtern, das mit dem durch die 2D-Gel-Alyse identifizierten Protein zusammenhängt, kann die synthetische Proteinbank zu Beginn in eine Reihe von Pools unterteilt werden, wobei jeder Pool einen Anteil der Bank enthält. Dies wird durch Aufteilen des Anfangsgemischs von Genen erreicht. Jeder Pool wird dann wie oben beschrieben gescreent, um einen Pool zu identifizieren, der ein Protein von Interesse enthält. Der Transkriptionsmix für diesen Pool wird dann erneut unterteilt und das Screeningverfahren wiederholt. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von allmählich immer kleineren Pools von Proteinen wiederholt, die an Ribosomen dargeboten werden, bis ein einzelner Klon identifiziert wird, der das Protein von Interesse codiert. Alternativ wird nach der Identifizierung eines potenziell mit einer Erkrankung in Verbindung stehenden Proteins durch 2D-Gel-Analyse das Protein gemäß Standardprotokollen (Hager & Burgess, Anal. Biochem., 109, (1980), S. 76) aus den Gel gereinigt, und das gereinigte Protein wird mittels Panning mit einer scFv-Bank selektiert, um (einen) Antikörper zu identifizieren, der (die) das Protein erkenn(t/en). Der (die) Antikörper wird (werden) dann zum Screenen einer syntheti schen Proteinbank verwendet, die von der cDNA der Erkrankungsprobe hergestellt wurde, um das Protein mit seiner damit verbundenen Genmarkierung zu identifizieren. Als alternatives, sehr innovatives Verfahren zur Identifizierung des Proteins kann jedes rekombinante Protein mit einer Aminosäuresequenzmarkierung hergestellt werden, die ursprünglich vom Plasmidvektor codiert und anschließend in das Protein eingebaut wird, zum Beispiel indem eine Leader-Sequenz in die klonierten cDNAs eingebaut wird, die vom Vektor oder aus einem Gemisch synthetischer Oligonukleotide stammt, die dazu verwendet werden, die cDNA für die anschließende Klonierung in den Vektor zu kopieren. Die Nukleotidsequenzmarkierung kann in der Plasmidvektorpräparation variabel oder randomisiert sein, beispielsweise indem der Plasmidvektor unter Verwendung einer synthetischen Region hergestellt wird, die von einer zufallsgemäßen Oligonukleotidmischung (mit geeigneten Enden, die mit dem Vektor hybridisieren) codiert wird, so dass eine Sequenzmarkierung zufallsgemäß zum Beispiel am 5'-Ende der mRNA platziert wird. Nach der Herstellung des Proteingemischs, beispielsweise mittels IVTT oder Ribosomen-Display, und Auftrennung dieser Proteine durch 2D-Gelelektrophorese können dann einzelne Proteine analysiert werden, indem sie mit Antikörpern durchmustert werden, die für die unterschiedlichen Sequenzpermutationen spezifisch sind.
  • Es ist ersichtlich, dass eine hauptsächliche Anwendung der vorliegenden Erfindung die Analyse von Proteinen, Proteinmodifikationen und Protein-Protein-Wechselwirkungen ist, die mit menschlicher Erkrankung oder mit dem Gesundheitsfürsorge-, dem individuellen oder dem Medikamentenbehandlungsstatus von Menschen in Zusammenhang stehen. Die Erfindung umfasst die Verwendung "klinischer Proben", wobei sich dieser Begriff auf Proben bezieht, die Gewebe, Blut oder Anderes sein können, von dem erwartet werden kann, dass es durch die besondere Erkrankung betroffen ist. Die Erkrankungsproben beziehen sich auf eine Probe, von der gezeigt werden kann, dass sie von einer Erkrankung, einem Gesundheitsfürsorgestatus oder einem Medikamentenbehandlungsstatus betroffen ist. Die normale Probe betrifft eine Probe, die nicht von der Erkrankung betroffen ist und einen normalen Gesundheitsfürsorgestatus wiedergibt, aber zwischen Individuen variieren und für das anschließende Ergebnis einer Medikamentenbehandlung relevant sein kann. Zu Vergleichszwecken bei der Suche nach mit Erkrankung in Verbindung stehenden Proteinen oder Proteinmodifikationen/-wechselwirkungen werden die normalen und die Erkrankungsproben im Idealfall aufeinander abgestimmt, um eine durch die Population eingebrachte Heterogenität zu verringern. Dies kann erzielt werden, indem man normale und Erkrankungsproben von einem einzigen Patienten gewinnt (z.B. kanzeröses Brustgewebe und nicht betroffenes Brustgewebe), oder alternativ durch Poolen von Erkrankungs- und normalen Proben von einer Reihe verschiedener Patienten.
  • Die Herstellung von cDNA-Banken sowohl aus normalen als auch klinischen Proben erfolgt mittels Standardtechniken, welche die Isolation von mRNA, gefolgt von reverser Transkription zur Erzeugung von cDNA, umfassen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Press, 1989), oder kann alternativ unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits, z.B. dem PolyATract-System (Promega, Southampton, GB), erreicht werden. Die Klonierung der cDNAs in einen Vektor, der zur Herstellung synthetischer Proteine geeignet ist, wie beispielsweise In-vitro-Darbietung mittels Ribosomen-Display, sowie die Bedingungen für die In-vitro-Darbietung der Proteine sind wie zuvor (zum Beispiel in Hanes und Plückthun, Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1997), S. 4937) beschrieben. Die Isolation von Gesamtprotein aus den Proben wird durch Standardverfahren erzielt, wie in Bollag & Edelstein (Protein Methods, Wiley-Leiss, 1991) im Einzelnen erläutert. Ribosomen-Display – Bei der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein neues In-vitro-Verfahren für das Ribosomen-Display bereitgestellt, das die Expression von Volllängenpolypeptiden von einem Ribosom durch selektive Arretierung der mRNA-Translation am 3'-Ende der mRNA, so dass der Ribosomenkomplex noch mit dem Volllängenpolypeptid verbunden bleibt, maximiert. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Proteine, die an spezifischen Stellen in mRNA-Molekülen gebunden sind, die weitere Translation der mRNA blockieren, was das Anhalten eines mRNA-Ribosom-Komplexes mit dem damit verbundenen Polypeptid gestattet. Die Erfindung umfasst auch optionale Mittel zum Verhindern neuer Translationsstarts kurz vor dem Polypeptid-Screening.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst erstens die Herstellung einer Bank von DNA-Molekülen, üblicherweise in einem Plasmidvektor, wobei diese DNA-Moleküle verschiedene Polypeptide codieren und die diese Polypeptide codierende DNA in mRNA-Moleküle transkribiert wird. Gewöhnlich umfasst der Klonierungsvektor für die DNA-Moleküle einen stromaufwärts gelegenen Promotor, wie einen Promotor für T7-RNA-Polymerase. So wird die gepoolte Bank von DNA-Molekülen beispielsweise durch Zugabe von T7-DNA-Polymerase und Ribonukleotiden transkribiert, so dass eine Bank von mRNA-Molekülen hergestellt wird. Danach wird die Bank von RNA-Molekülen unter Verwendung einer Ribo somenpräparation, wie einer E.-coli-S30-Fraktion (Chen HZ und Zubay G, Methods in Enzymology, Bd. 101 (1983) S 674–690), translatiert. Danach werden die Ribosomenkomplexe, die miteinander verbundenes Polypeptid, Ribosom und mRNA umfassen, gewöhnlich hinsichtlich der Bindung an einen Liganden gescreent, der auf einer festen Phase immobilisiert ist, und die mRNA wird aus den so erhaltenen immobilisierten Komplexen für die reverse Transkription und die Amplifikation mittels PCR freigesetzt, um DNA-Moleküle anzureichern, die Polypeptide codieren, die an den Zielliganden binden. Diese DNA-Moleküle können entweder direkt für die Transkription eingesetzt oder kloniert werden, um die Sequenzen von DNA zu bestimmen, die Polypeptide codiert, die an den Zielliganden binden. Für den Zweck dieser Ausführungsform der Erfindung wird von der mRNA, die von den DNA-Molekülen codiert wird, angenommen, dass sie 3 Segmente umfasst, die von 5' nach 3' ein variables Segment, ein Spacersegment und ein Terminationssegment mit einem optionalen Anti-Initiationssegment 5' von dem variablen Segment umfassen. Das Polypeptid soll die Protein- oder Peptidsequenz bedeuten, die von dem variablen Segment der mRNA über einen Ribosomenkomplex in Protein translatiert wird. Das variable Segment soll mRNA-Sequenzen bedeuten, die das Volllängenpolypeptid codieren. Das Spacersegment soll mRNA-Sequenzen bedeuten, die Proteinsegmente codieren, die mit den variablen Segmenten fortlaufend sind und es gestatten, dass dies fertiggestellten Proteine vollständig aus dem Ribosom heraustreten und optimale dreidimensionale Strukturen annehmen, während sie immer noch über den Ribosomenkomplex an die sie codierende mRNA gebunden bleiben. Das Terminationssegment soll für mRNA-Sequenzen stehen, an die sich die Bindungseinheit entweder direkt oder indirekt anheftet, oder alternativ für mRNA-Sequenzen, die eine Polypeptidbindungseinheit codieren, die mit dem Spacersegment fortlaufend ist oder stromaufwärts davon gelegen ist, an die sich spezifische Proteine anheften und die Translation blockieren. Die Bindungseinheit soll entweder ein beliebiges Molekül bedeuten, das an die mRNA am ribosomalen Komplex binden kann, oder ein beliebiges Molekül, das an das translatierte Polypeptid am ribosomalen Komplex binden kann, was zum Anhalten der Translation führt. Die Bindungseinheit bindet gewöhnlich direkt auf sequenzspezifische Weise an mRNA oder kann indirekt an die mRNA gebunden werden, zum Beispiel nach Hybridisierung eines synthetischen DNA- oder RNA-Moleküls an die mRNA und Hinzufügen der Bindungseinheit über einen Liganden an diesen Molekülen. Das optionale Anti-Initiationssegment liegt benachbart zum Translationsinitiationscodon und stellt Sequenzen für die Anheftung, gewöhnlich einer anderen Bindungseinheit, bereit. Das Anti- Initiationssegment verhindert neue Translationsinitiationen kurz vor dem Screenen der translatierten Polypeptide. Der Zielligand ist das Molekül, mit dem die Bank im Hinblick auf die Bindung spezifischer Proteine und die anschließende Gewinnung der damit verbundenen mRNA gescreent wird.
  • Das variable Segment der mRNA-Moleküle umfasst entweder bekannte Volllängenpolypeptidtypen, wie einkettige Antikörper (SCAs, die variable Immunglobulinregionen umfassen, die von schweren und leichten Ketten stammen und miteinander verbunden sind, so dass eine funktionelle Bindungsdomäne erhalten wird), oder zufallsgemäße oder halb-zufallsgemäße Sequenzen. Chimäre Sequenzen, die durch zufallsgemäße/halb-zufallsgemäße Verbindung bekannter Polypeptidtypen oder Regionen hergestellt werden, können ebenfalls verwendet werden. Bei bekannten Polypeptidtypen, wie SCAs, können spezifische Segmente der Gene randomisiert werden, wie beispielsweise die CDRs in SCAs. Zuerst werden große Sammlungen von DNA-Molekülen, die bekannte zufallsgemäße oder halbzufallsgemäße Sequenzen codieren, hergestellt und dann in den Transkriptionsvektor kloniert. Dieser Transkriptionsvektor liefert andere Segmente für den Einbau in die anschließenden mRNA-Moleküle, wie nachstehend eingehend erläutert wird: Der Vektor stellt in der Regel auch ein Translationsinitiationscodon und eine Ribosomenbindungsstelle für die mRNA bereit. Bei von der DNA codierten längeren Polypeptidmolekülen ist es erforderlich, das Vorliegen von Stoppcodons in der mRNA, die die Translation terminieren, zu verringern oder zu beseitigen. Es ist eine Voraussetzung dieser Erfindung, dass solche Stoppcodons, einschließlich Stoppcodons, die für spezifische Proteine natürlich sind, beseitigt werden, damit Volllängenpolypeptide erhalten werden.
  • Bei DNA, die bekannte Proteine, wie einkettige Antikörper, codiert, erfordert dies einfach die Beseitigung des üblichen Stoppcodons oder alternativ die Verwendung von Nonsense-Suppressions-tRNAs in der Translationsreaktion, um spezifische Aminosäure an der Position der Stoppcodons einzubringen. Bei Gemischen von zufallsgemäßen oder halb-zufallsgemäßen DNA-Molekülen, die mittels chemischer Synthese hergestellt werden, kann die Häufigkeit Stoppcodons, die in einer beliebigen bestimmten Sequenz auftreten, durch Manipulation der DNA-Basiszusammensetzung bei der Synthesereaktion verringert werden, und außerdem können Nonsense-Suppressions-tRNAs bei der Translationsreaktion eingesetzt werden. Das Spacersegment der mRNA-Moleküle liefert eine Polypeptidregion stromabwärts des variablen Segments, das den Kanal des Ribosoms durchspannt, so dass das Volllängenpolypeptid vollständig aus dem Ribosom heraustreten kann und richtige Proteinfaltung und ungehinderter Zugang zum Zielliganden ermöglicht werden. Im Allgemeinen codiert dieses Segment eine Region von mehr als 50 Aminosäuren sowie eine Region, bei der es unwahrscheinlich ist, dass sie die Faltung des Volllängenpolypeptids behindert, wie beispielsweise eine vollständige Domäne aus einem anderen Protein oder einen glycin-/alaninreichen Linker, wie (Gly4Ser)10. Bei einigen translatierten Proteinen kann das Spacersegment einen fortlaufenden Abschnitts aus dem Proteins selbst umfassen, wobei dieser Abschnitt nicht für die korrekte Faltung des variablen Segments oder für die Bindung an den Zielliganden erforderlich ist.
  • Das Terminationssegment liefert eine stromabwärts gelegene mRNA-Sequenz für die direkte oder indirekte Anheftung einer Bindungseinheit, die derart gestaltet ist, dass sie die Translationstermination nach der Translation des vollständigen variablen Segments verhindert. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Anheftung eines Bindungseinheit ist indirekt unter Verwendung eines synthetischen zwischengeschalteten Oligonukleotidmoleküls, das zuerst an das Terminationssegment hybridisiert. Wenn ein solches synthetisches Nukleotid mit einer spezifischen Bindungsstelle für die Bindungseinheit ausgestattet ist, dann kann die Bindungseinheit ihrerseits an das hybridisierte synthetische Oligonukleotid binden und sich dadurch an das stromabwärts gelegene Ende der mRNA anheften und die Translation blockieren. Ein Beispiel für dieses bevorzugte Verfahren ist die Verwendung eines Oligonukleotids, das ein oder mehrere biotinylierte Nukleotide enthält, so dass anschließend Streptavidin binden kann, so dass ein Molekül bereitgestellt wird, das die Translation blockiert. Die Verwendung von Molekülen, wie Streptavidin, bietet außerdem einfache Möglichkeiten für eine Vernetzung des naszierenden Proteins mit dem mRNA-Molekül, wobei das naszierende Protein selbst aufgrund von zu dem In-vitro-Translationsreaktionsgemisch zugegebenem Biotinyllysin (oder einer anderen biotinylierten Aminosäure) biotinyliert sein kann. Ein weiteres Beispiel für dieses bevorzugte Verfahren ist die Verwendung eines Oligonukleotids, das ein oder mehrere Nukleotide enthält, das/die mit einem Liganden, wie Fluorescein oder Dinitrophenol, derivatisiert ist/sind, der dann durch einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon gebunden werden kann. Dies macht auch die Verwendung bispezifischer Moleküle, wie bispezifischer Antikörper, durchführbar, die einerseits über das synthetische Oligonukleotid an die mRNA und andererseits aufgrund einer Aminosäuresequenz an dem translatieren Protein oder Polypeptid auch an das translatierte Protein oder Polypeptid binden können. Andere Verfahren sind u.a. das Versehen des Terminationssegments mit einer Sequenz, an die ein spezifisches Protein direkt, ohne jeden dazwischen liegenden Hybridisierungsschritt, bindet. Ein Beispiel für eine solche Bindungseinheit ist das Eisenregulationsprotein (iron regulatory protein, IRP). Das Terminationssegment liefert eine Stem-Loop-Struktur, die durch Zugabe des IRP unter Bedingungen einer niedrigen Eisenkonzentration stabilisiert wird, was somit zu einem sterischen Block der Ribosomentranslation führt. Anschließend kann eine Selektion des naszierenden Peptids erfolgen. Die Verwendung von IRP zur Arretierung des Ribosoms führt einen reversiblen Block ein, so dass eine Zugabe von Eisen die Wiederaufnahme und somit die Termination der Translation ermöglichen kann. Dies erleichtert die Freisetzung der mRNA nach der Selektion des Polypeptids für die anschließende Transkription, Sequenzierung oder cDNA-Klonierung. Weitere Beispiele für mRNA-Bindungseinheiten, die an Sequenzen im Terminationssegment binden, sind u.a. das HIV-Protein tat, das an einen als TAR bezeichneten RNA-Stem-Loop bindet (Dingwall et al., PNAS, Bd. 86 (1989) S. 6925–6929), La-Antigen, das an ein RNP-Motiv bindet (Chan EKL und Tan EM, Mol. Cell Biol., Bd. 7 (1987) S. 2588–2591) und andere Proteine aus RNA-Viren, die an spezifische RNA-Sequenzen entweder in einzel- oder doppelsträngiger RNA binden, wobei die Letztere in mRNA über Haarnadelschleifen erzeugt werden kann. Das Terminationssegment kann alternativ eine Stelle für die Anheftung einer Bindungseinheit codieren, die zusätzlich an das synthetisierte Polypeptid selbst oder an den ribosomalen Proteinkomplex bindet, um die Bindungseinheit zur Verhinderung von Translationstermination weiter zu stabilisieren. Gegebenenfalls enthält das Terminationssegment eine oder mehrere weitere mRNA-Regionen, die die Stabilität von mRNA gegen Exonukleasen erhöhen, wie die lpp- (E.-coli-Lipoprotein-) und Phage-T3-Terminatoren. Für den Fachmann ist insbesondere ersichtlich, dass für den hauptsächlichen Aspekt dieser Ausführungsform der Erfindung mRNAs mit einer Mehrzahl an Terminationssegmenten hergestellt werden können, an die eine Mehrzahl an Bindungseinheiten entweder indirekt, über die anfängliche Hybridisierung eines synthetischen Oligonukleotids oder eines anderen Moleküls, oder direkt über die Erkennung und Bindung einer Bindungseinheit direkt an das mRNA-Molekül binden kann.
  • Das benachbarte, optionale Anti-Initiationssegment ist derart gestaltet, dass es Translationsinitiationen spät in der Translationsreaktion verhindert, die nicht zu Volllängenproteinen führen und daher Polypeptide mit unvollständiger Faltung liefern können, die eine unspezifische Bindung an Zielliganden bereitstellen könn ten. Das Anti-Initiationssegment kann beispielsweise eine sekretorische Leader-Sequenz im translatierten Polypeptid codieren, an die das Signalerkennungspartikel (signal recognition particle, SRP) gebunden werden kann. Wenn SRP an das Polypeptid gebunden hat, bewirkt es die Arretierung der weiteren Translation durch Vernetzung des Polypeptids und der mRNA. Eine Translationsarretierung kann auch unter Verwendung einer Kombination der SRP54- und SRP9/14-Unterheiten des SRP erzielt werden (Siegel & Walter, Cell Biol., Bd. 100 (1985) 1913–1921), die an das naszierende Peptid bzw. die mRNA binden. Ein weiteres Beispiel für Anti-Initiationssequenzen liefern bestimmte eukaryotische Transkriptionsleadersequenzen, wie diejenige des gp48-Gens des humanen Zytomegalievirus, das eine stromaufwärts gelegene 22-Codon-Sequenz enthält, die die Translation des stromabwärts gelegenen Cistrons reprimiert (Cao J und Geballe AP, Mol. Cell Biol., Bd. 16 (1996) S. 7109–7114). Es wird angenommen, dass solche Leadersequenzen Peptide codieren, die das Voranschreiten des Ribosoms zum stromabwärts gelegenen Cistron blockieren. Weitere Beispiele für Anti-Initiationssequenzen sind Sequenzen, die von Bindungseinheiten, wie beispielsweise für das vorstehende Terminationssegment, erkannt werden, wobei dazu die von IRP, tat, La-Antigen und anderen viralen Proteinen gebundenen Sequenzen gehören.
  • Daher stellt die Erfindung Zusammensetzungen von DNA-Banken bereit, die mRNA-Moleküle mit variablen, Spacer- und Terminationssegmenten und mit einem optionalen Anti-Initiationssegment codieren. Vorzugsweise stellt die Erfindung einen DNA-Vektor bereit, der die Spacer- und Terminationssegmente codiert; das Anti-Initiationssegment ist optional. Im Allgemeinen stellt der DNA-Vektor auch das Translationsinitiationscodon und, für Translationen unter Verwendung prokaryotischer Ribosomen, eine Ribosomenbindungsstelle einschließlich der Shine-Dalgarno-Sequenz bereit. Für eukaryotische Translationssysteme kann auch die Kozak-Translationsinitiationssequenz mit der Konsensussequenz GCCGCCACCATGG hinzugefügt werden, und es kann wünschenswert sein, stromaufwärts der Translationsinitiationsstelle andere bekannte Sequenzen einzubringen, um die Translation zu verstärken, wie Enhancer oder Aktivatorsequenzen, einschließlich untranslatierter Leadersequenzen von bestimmten Viren, wie dem Tabakmosaikvirus. Üblicherweise stellt der DNA-Vektor auch einen starken Transkriptionspromotor bereit, der in Verbindung mit einer RNA-Polymerase dazu verwendet wird, ein Bank von mRNA-Molekülen herzustellen, die der DNA-Bank entspricht. Zu solchen Promotoren gehören diejenigen für T7-RNA-Polymerase, T3-RNA-Polymerase und SP6-RNA-Polymerase, und zusätzlich kann von der DNA auch ein Promotor für die RNA-abhängige Polymerase, Qb-Replicase, codiert werden. Der DNA-Vektor stellt ferner einen starken Transkriptionsterminator bereit, zum Beispiel den Terminator des E.-coli-Lipoproteins oder den frühen Terminator des Phagen T3. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden DNA-Fragmente, die die variablen Segmente enthalten, in den DNA-Vektor kloniert, wobei die DNA-Fragmente ein Minimum an oder keine Stoppcodons aufweisen. Bei Banken, die bekannte Polypeptidtypen codieren, wie SCAs, werden die DNA-Fragmente unter Verwendung geeigneter Restriktionsstellen unidirektional kloniert. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass eine Mehrzahl an replizierbaren DNA-Vektoren bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, einschließlich Plasmid-, Bakteriophagen-, Phagemid- und viraler Vektoren. Es ist ebenfalls deutlich, dass eine DNA-Amplifikation durch Verfahren, wie PCR, als Alternative zur Replikation von DNA in lebenden Zellen verwendet werden kann. Es ist ebenfalls offensichtlich, dass die variablen Segmente zur Herstellung der DNA-Bank von einer Reihe von Quellen bereitgestellt werden können, einschließlich einer Vektorbank von DNA-Fragmenten, synthetischer DNA oder amplifizierter DNA. Ferner können die variablen Segmente als Ergebnis von Mutagenesereaktionen unter Verwendung einer festen Matrize, zum Beispiel unter Verwendung von fehleranfälliger PCR, bereitgestellt werden. Es ist ebenfalls deutlich, dass die variablen Segmente aus DNA direkt aus dem Genom eines lebenden Organismus oder aus cDNA-Kopien von mRNAs dieses Organismus bestehen können. Wenn zum Beispiel die DNA-Bank einkettige Antikörperfragmente umfasst, können diese Fragmente von mRNA stammen, die variable Immunglobulinregionen codiert und von B-Zellen innerhalb eines Organismus exprimiert wird. Alternativ können die Fragmente von genomischen variablen Regionen stammen. Auf diese Weise stellt die Erfindung die Herstellung von Banken einkettiger Antikörper aus spezifischen Organismen, wie Mensch, bereit.
  • Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen von Banken von mRNA-Molekülen mit variablen, Spacer- und Terminationssegmenten und mit einem optionalen Anti-Initiationssegment bereit. Vorzugsweise stellt die Erfindung eine Bank von mRNA-Molekülen bereit, die die Spacer- und Terminationssegmente codieren, wobei die Anti-Initiationssequenz optional ist. Die mRNA-Moleküle umfassen jeweils ein Translationsinitiationscodon und, für Translationen unter Verwendung prokaryotischer Ribosomen, eine Ribosomenbindungsstelle, die die Shine-Dalgarno-Sequenz umfasst. Für eine Translation unter Verwendung eukaryotischer Ribosomen kann die mRNA mit einem 5'-Capping-Nukleotid synthetisiert oder dieses kann enzymatisch in die vorsynthetisierte mRNA eingebracht werden. Stromaufwärts der Translationsinitiationsstelle können auch die Kozak-Translationsinitiationskonsensussequenz sowie weitere bekannte Sequenzen zur Verstärkung der Translation, wie Enhancer oder Aktivatorsequenzen, einschließlich untranslatierter Leadersequenzen von bestimmten Viren, hinzugefügt werden. Vor oder während des Translationsvorgangs wird/werden eine oder mehrere Bindungseinheiten an das Terminationssegment der mRNA-Moleküle gebunden, wodurch die Translation angehalten wird. Ebenfalls während des Translationsvorgangs wird/werden eine oder mehrere Bindungseinheiten an das optionale Anti-Initiationssegment, das in den mRNA-Molekülen vorliegt oder von diesen codiert wird, angeheftet und verhindert somit neue Translationsinitiationen.
  • Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen von Banken translatierter Polypeptidmoleküle mit variablen und Spacersegmenten und einer optionalen Anti-Initiationsleadersequenz bereit. Diese Proteinmoleküle liefern variable Volllängensegmente als Teil einer längeren Polypeptidkette, die innerhalb der Ribosomen durch die Wechselwirkung von Bindungseinheiten mit der mRNA angehalten wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Wirkungen mit dem Ribosom, so dass eine weitere Translation des mRNA-Moleküls verhindert wird. Alternativ kann sich das 5'-Ende an eine Bindungseinheit indirekt anheften, beispielsweise über die Hybridisierung eines synthetischen Oligonukleotids an eine komplementäre Sequenz am 5'-Ende und anschließende Bindung einer Bindungseinheit an dieses Oligonukleotid, beispielsweise über Biotinmoleküle, die in das synthetische Oligonukleotid eingebaut sind.
  • Für den Fachmann ist ersichtlich, dass innerhalb des erfindungsgemäßen Verfahrens verschiedene Mittel verwendet werden können, um die Stabilität von mRNA-Molekülen, insbesondere gegenüber dem Abbau durch RNAsen, zu optimieren. Zum Beispiel können verschiedene Inhibitoren von RNAsen, wie Rnasin und Vanadyl-Ribonukleotid-Komplexe, in den Transkriptionsreaktionen verwendet werden.
  • Alternativ oder zusätzlich können in die mRNA-Moleküle verschiedene Strukturen eingebracht werden, einschließlich 3'-Stem-Loops, wie sie üblicherweise durch Transkriptionsterminatoren bereitgestellt werden. Für den Fachmann ist ebenfalls ersichtlich, dass Transkriptions- und Translationsreaktionen entweder getrennt durchgeführt oder, insbesondere bei prokaryotischen Systemen, zu einer gekoppelten In-vitro-Transkriptions-/-Translationsreaktion kombiniert werden können. Vorzugsweise werden die Transkriptions- und Translationsreaktionen getrennt durchgeführt, um die Produktion von mRNA und Polypeptiden, die unterschiedliche optimale Reagenzien erfordern, zu optimieren.
  • Für den Fachmann ist ersichtlich, dass innerhalb des erfindungsgemäßen Verfahrens verschiedene Mittel verwendet werden können, um die Faltung und Stabilität von Proteinmolekülen, insbesondere gegenüber dem Abbau durch Proteasen, zu optimieren. Für eine korrekte Proteinfaltung werden in Translationsreaktionen optimale oxidative Proteinfaltungsbedingungen mit besonderen Maßnahmen zu Optimierung der Disulfidbindungsbildung verwendet, beispielsweise durch Verwendung molekularer Chaperone, wie Protein-Disulfidisomerase. Für die Stabilität kann das Peptidmarkierungssystem von E. coli durch Hemmung von ssrA-RNA unter Verwendung von Verfahren, wie demjenigen von Hanes und Plückthun (s.o.) inaktiviert werden.
  • Protein-Protein-Wechselwirkungen – Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Isolation von Genen bereit, die dargebotene Proteine oder Polypeptide codieren, die an einen Liganden binden, indem molekulare Markierungen sowohl am Protein/Polypeptid als auch am Liganden als Basis für die Isolation des Gens bereitgestellt werden. Das Verfahren umfasst insbesondere die Isolation von Genen, wobei der Ligand selbst ein dargebotenes Protein/Polypeptid ist. Diese Ausführungsform der Erfindung basiert auf der Bindung eines Polypeptids an einen Liganden (oder ein anderes Polypeptid), wodurch molekulare Markierungen am Polypeptid und am Liganden als Basis für die molekulare Trennung des gebundenen Polypeptid/Liganden von ungebundenem Polypeptid und Liganden verwendet werden können, wobei das Polypeptid immer noch mit seinem Gen (oder Gentranskript) verbunden bleibt. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Selektion eines Polypeptids, das an einen Liganden bindet, ist die Bereitstellung molekularer Markierungen sowohl am Polypeptid als auch an seinem Liganden, wobei dann Verfahren zur Isolation von Komplexen, die beide molekularen Markierungen enthalten, angewendet werden. Zum Beispiel kann bei Verwendung der Ribosomen-Display-Technik die mRNA mit einem RNA-bindenden Protein (wie HIV-tat-Protein) markiert werden, während der Ligand (wenn er ein Polypeptid ist) mit einem Polyhistidinschwanz markiert werden kann, so dass das anschließende Lei ten einer Bank von mRNA-Ribosom-Polypeptid-Komplexen über Affinitätsmatrices, die Anti-Markierungs-Antikörper und Nickel umfassen, bindende Polypeptide mit der damit verbundenen mRNA selektiert, die dann die Gensequenz liefern kann, die die bindenden Polypeptide codiert. Alternativ kann bei Verwendung von Ribosomen-Display nur das Polypeptid zum Beispiel mit einem Polyhistidinschwanz markiert, über Affinitätsmatrices, wie Nickelchelat, geleitet werden, und jede beliebige, damit verbundene RNA kann durch einfache Umwandlung in cDNA-Kopien mittels PCR erhalten werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Selektion von 2 oder mehr bindenden Polypeptiden ist die Verwendung der Ribosomen-Display-Technik unter Verwendung von di- (oder poly-) cistronischen mRNAs zur Herstellung von Kandidaten-Bindungspolypeptiden, die von einer oder mehreren DNA-Banken stammen. Wenn das Cistron für eines der Polypeptide derart konstruiert ist, dass das translatierte Polypeptid nach der Translation von der mRNA dissoziiert, und das Cistron für das andere Polypeptid derart konstruiert ist, dass das translatierte Polypeptid nach der Translation mit mRNA verbunden bleibt, dann ist die translationale Gegenüberstellung der 2 Polypeptide zueinander derart, dass eine Bindung, wenn vorhanden, durch diese Gegenüberstellung erleichtert wird, wodurch eine molekulare Basis für die Trennung der Komplexe bereitgestellt wird, die das (die) bindende(n) Polypeptid(e) und die mRNA enthalten, wobei Letztere dann für die Identität von Genen, die das (die) bindende(n) Polypeptid(e) codieren, verwendet werden kann.
  • Ein anderer Aspekt dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basiert auf der Bindung von 2 Polypeptiden, von denen eines oder beide mit dem entsprechenden Gen verbunden sind und die mit anderen Polypeptidketten fusioniert (oder verbunden) sind, die bei einer Gegenüberstellung eine selektierbare Eigenschaft erzeugen, die dann die Isolation lebender Mikroorganismen gestattet, die das (die) Gen(e) für das (die) bindende(n) Polypeptid(e) codieren. Von besonderem Interesse ist innerhalb dieser Ausführungsform die Erzeugung von Enzymaktivitäten durch die Verbindung von 2 Polypeptiden. Solche erzeugten Enzymaktivitäten können auf vielerlei Weise zur Selektion verwendet werden. Dazu gehören Enzymaktivitäten, die molekulare Markierungen erzeugen, die sich an Komplexe von erfolgreich gepaarten Polypeptiden und den damit verbundenen Genen (oder mRNA) anheften. Für das Polypeptid-Display auf Mikroorganismen umfassen diese ferner Enzymaktivitäten, die Moleküle in der Nähe der Mikroorganismen erzeugen (oder freisetzen), was zur Selektion von Mikroorganismen führt, die ein von einer DNA-Bank stammendes Polypeptid darbieten, das an einen Liganden bindet.
  • Innerhalb dieser Ausführungsform ist ebenfalls die Erzeugung bindender Proteinaktivitäten durch Verbindung von 2 Polypeptiden von Interesse, wodurch das bindende Protein indirekt eine selektierbare Eigenschaft erzeugt, die als Basis zur Identifikation des Gens, das das (die) bindende(n) Protein(e) codiert, verwendet werden kann. Zum Beispiel kann das bindende Protein ein DNA-bindendes Protein, wie ein Transkriptionsaktivator, sein, der ein Gen aktiviert, das für den Mikroorganismus einen Selektionsvorteil bereitstellt, wie ein Antibiotikaresistenzprotein oder ein nährstofferzeugendes Protein.
  • Für die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf bindende Polypeptide, die auf Mikroorganismen dargeboten werden, stellt die Erfindung Verfahren zur Verfügung, bei denen der Ligand (oder ein zweites Polypeptid) von außen zu dem Mikroorganismus zugegeben wird, oder Verfahren, bei denen der Ligand intern innerhalb des Mikroorganismus synthetisiert wird, wobei in beiden Fällen die Verbindung von Polypeptid und Ligand ein neues Molekül (oder neue Moleküle) erzeugen kann, was eine Basis für die Selektion oder Abtrennung des Mikroorganismus, der das bindende Polypeptid darbietet, bereitstellt. Die Erfindung kann auf der Komplementierung einer Enzymaktivität durch Kombination von 2 (oder mehreren) Untereinheiten eines Enzyms basieren, die, wenn sie miteinander verbunden sind, die Enzymaktivität wiederherstellen. Die Wiederherstellung der Enzymaktivität stellt dann entweder die positive oder negative Selektion des Mikroorganismus, der die Enzymaktivität liefert, bereit. Bei einem Beispiel für diese Ausführungsform der Erfindung wird eine DNA-Bank bereitgestellt, die Variantenpolypeptide codiert, die in einem Mikroorganismus oder einer Zelle exprimiert werden können, wodurch die Gene, die die bindenden Polypeptide codieren, an einen Abschnitt des Gens fusioniert werden, der ein enzymatisch inaktives Fragment eines Enzyms codiert, wodurch dieser Enzymabschnitt einen anderen Abschnitt des Enzyms komplementieren und die Enzymaktivität wiederherstellen kann. Geeignete Enzyme sind u.a. E.-coli-beta-Galactosidase und C.-perfringens-Phospholipase C. Der andere Abschnitt des Enzyms wird entweder zur In-vitro-Selektion im Mikroorganismenkulturmedium oder zur In-vivo-Selektion durch Expression eines Gens, das diesen Abschnitt codiert, im gleichen Mikroorganismus bereitgestellt. Enzyme, wie E.-coli-beta-Galactosidase und C.-perfringens-Phospholipase C haben die Eigenschaft, dass inaktive Untereinheiten des Enzyms sich in Lösung selbst verbinden und die Enzymaktivität wiederherstellen können, und somit stellt die Erfindung eine Situation bereit, wobei das bindende Polypeptid, fusioniert an ein Gen, das ein inaktives Enzymfragment codiert, an seinen Liganden binden und die Bindung entweder fördern (wenn der Ligand an die andere inaktive Untereinheit fusioniert ist) oder verhindern kann (wenn die Polypeptid-Liganden-Bindung über sterische Hinderung die Wiederherstellung der Enzymaktivität durch die inaktive Enzymuntereinheit verhindert). Die Wiederherstellung oder Beseitigung der Enzymaktivität kann auf den Mikroorganismus, der die Polypeptid/Enzymuntereinheit-Genfusion exprimiert, eine günstige oder schädliche Wirkung haben. Dies ist entweder auf die direkte enzymatische Wirkung des wiederhergestellten Enzyms, beispielsweise indem es die Umwandlung eines nichttoxischen Substrats in ein toxisches Produkt bewirkt, oder die indirekte enzymatische Wirkung des wiederhergestellten Enzyms zurückzuführen, beispielsweise indem es die Lyse externer Liposomen bewirkt, die eine toxische Substanz oder einen essenziellen Nährstoff/Faktor für Wachstum/Vermehrung des Mikroorganismus enthalten.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Erfindung gegeben und sollen nicht so verstanden werden, dass sie den Umfang der Erfindung beschränken.
  • Beispiel 1
  • Herstellung synthetischer Protein-Banken und Modifikation durch Gewebe
  • Ausgangspunkt war eine cDNA-Bank-Präparation aus "Marathon-bereiten" humanen Colon-cDNAs, die von Clontech UK Ltd. (Basingstoke, GB) bezogen wurden.
  • Die Bank wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer AP1 [5'ccatcctaatacgactcactatagggc] und AP3 [5'-ttctagaattcagcggccgc(t)30nn] und des Advantage-cDNA-PCR-Kits sowie der vom Zulieferer (Clontech) empfohlenen Bedingungen amplifiziert. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde unter Verwendung einer T/A-Klonierungsstrategie in mit SmaI linearisierten pUC19, der gemäß Marchuck et al. (Marchuck D. et al. 1991, Nucl. Acids Res. 19: 1154) hergestellt worden war, kloniert. Alternativ wurde eine humane Colon-cDNA-Bank aus humaner Colon-mRNA konstruiert, die unter Verwendung der in Molecular Cloning, A Laboratory Manual Hrsg. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, USA beschriebenen Standardverfahren direkt aus Gewebe isoliert wurde. Die mRNA wurde unter Verwendung des (in Molecular Cloning s.o. beschriebenen) RNAse-H-Verfahrens in cDNAs umgewandelt und wiederum in die SmaI-Stelle des pGEMT7/SP6-Plasmids (Promega, Southampton, GB) kloniert, wodurch ein Promotor für T7-RNA-Polymerase bereitgestellt wurde. Lange synthetische Oligonucleotide und PCR wurden einge setzt, um eine stromaufwärts gelegene bakterielle Ribosomenbindungsstelle, einen stromabwärts gelegenen Spacer, der vom Gen III des M13-Phagen stammte, und eine 3'-Transkriptionsterminationsregion von dem E.-coli-lpp-Terminator, wie in Hanes und Plückthun, Proc. Natl. Acad Sci. 94 (1997), S. 4937 beschrieben, bereitzustellen.
  • Die In-vitro-Transkription der pT7-Plasmide erfolgte unter Verwendung eines RiboMAXTM-Kits (Promega, Southampton, GB) nach den Anweisungen des Herstellers. Die so erhaltene mRNA wurde nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die In-vitro-Translation wurde unter Verwendung des E.-coli-S30-Extrakt-Systems unter Zugabe von 35S-Methionin (Promega, Southampton, GB) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Ribosomen wurden von den Proteinen durch Behandlung mit EDTA dissoziiert, wie von Hanes & Plückthun (s.o.) beschrieben, und die Ribosomen wurden mittels Zentrifugation (100000 g für 30 min) entfernt.
  • Es wurden rohe Proteinextrakte aus einer normalen Colon- und einer Colorektalkarzinomprobe durch Aufbrechen des Gewebes in eiskaltem RIPA-Puffer (RIPA-Puffer = 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % (Vol./Vol.) NP-40, 0,25% Natriumdesoxycholat, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF und jeweils 1 μg/ml Aprotinin, Leupeptin und Peptstatin) hergestellt. Bei einigen Experimenten wurden auch Phosphataseaktivität-kompetente Extrakte hergestellt; in diesem Fall wurden Lysate unter Verwendung von RIPA-Puffer ohne 1 mM Na3VO4 hergestellt. Die Gewebeproben wurden auf Eis aufgetaut und unter Verwendung eines sterilen Einweg-Gewebemörsers ("Pellet Pestle" Anachem Ltd., Luton, GB) aufgebrochen. Die Homogenisation wurde unter Verwendung von 2 Volumina eiskaltem RIPA-Puffer zu 1 Volumen Gewebe durchgeführt. Das Lysat wurde unter leichtem Schütteln für 15 Minuten auf Eis inkubiert, dann durch Zentrifugation bei 13000 x g und 4°C für 10 Minuten von unlöslichem Material befreit. Der Überstand wurde entnommen und unter Verwendung des Bichinchoninsäure-Verfahrens und der vom Zulieferer (Pierce, Chester GB, Kat.-Nr. 23225) zur Verfügung gestellten Protokolle hinsichtlich der Proteinkonzentration getestet. Das Lysat wurde in mehrere Aliquote aufgeteilt, auf Trockeneis schockgefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
  • Lysate von normalem Colon und Colorektaltumor wurden mit den in vitro translatierten Proteinen durch Inkubation von aufgetautem Lysat für 30 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 1 mg/ml Vanadylribonukleosid-Komplexen und 10 Einheiten Rnasin umgesetzt. Das Proteingemisch wurde dann gemäß dem Protokoll von Cash et al. (Electrophoresis 18 (1997), S. 2580) solubilisiert. Die löslichen Proteine wurden dann mittels 2D-PAGE (Cash et al. s.o.) analysiert und die Proteine mittels Autoradiographie nachgewiesen (Patton et al., BioTechniques 8 (1990), S. 518). Bilder der Gele wurden unter Verwendung einer mit einem Bildanalysesystem verbundenen Videokamera aufgenommen und dann für die weitere Analyse an Phoretix-2D übermittelt. Die Analyse erfolgte unter Verwendung von Phoretix-2D-Systemen nach den Anweisungen des Herstellers.
  • Aus insgesamt 2622 Proteinflecken, die von dem in vitro translatierten Proteingemisch nachgewiesen wurden, zeigten 12 Flecken Laufunterschiede, wenn die Behandlungen mit normalen und Colorektalkrebs-Extrakten verglichen wurden.
  • Beispiel 2
  • Phosphorylierung synthetischer Proteine
  • Rekombinantes, gereinigtes Ratten-ERK-2, das eine an den Aminoterminus des Proteins fusionierte Polyhistidinmarkierung enthielt, wurde von Stratagene, La Jolla, USA (Kat.-Nr. 20612) bezogen. Bei diesem Produkt handelt es sich um die nichtaktivierte Form des Proteins, die keine phosphorylierten Reste enthält. Es wurden 0,5 μg nichtaktiviertes ERK-2 mit 5 μl (die 2 mg/ml Gesamtprotein enthielten) A431-Zelllysat (Upstate Biotechnologies, Lake Placid, NY, USA Kat.-Nr. 12–110) oder alternativ im Haus aus in Gewebekultur gezüchteten Zellen hergestellt, umgesetzt. Das Verfahren zur Umsetzung eines Zell- oder Gewebelysats mit einem Zielprotein wird als Konditionierungsreaktion bezeichnet.
  • Es wurden Zelllysate hergestellt, indem etwa 5 × 106 subkonfluente Zellen in 500 μl eiskaltem RIPA-Puffer suspendiert wurden. Von den Zellen wurde zuvor mit eiskalter PBS das Medium abgewaschen, und sie wurden unter leichtem Schütteln für 15 Minuten in RIPA-Puffer auf Eis inkubiert. Das Lysat wurde mittels Zentrifugation bei 13000 x g und 4°C für 10 Minuten von unlöslichem Material befreit. Der Überstand wurde entnommen und unter Verwendung des Bichinchoninsäure-Verfahrens und der vom Zulieferer (Pierce, Chester GB, Kat.-Nr. 23225) zur Verfügung gestellten Protokolle hinsichtlich der Proteinkonzentration getestet. Das Lysat wurde in mehrere Aliquote aufgeteilt, auf Trockeneis schockgefroren und vor der Verwendung in der Konditionierungsreaktion in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Lysate von Gewebeproben und anderen Zellproben wurden auf die gleiche Weise verarbeitet.
  • Die Konditionierungsreaktion wurde bei 37°C für 15 Minuten durchgeführt und dann auf Eis gestellt. Die Reaktion wurde für den Nachweis von phosphoryliertem ERK-2 gleichmäßig (bezogen auf das Volumen) in zwei Röhrchen aufgeteilt, wobei entweder magnetische Sortierung (Röhrchen 1) oder Bindung an Mikrotiterplattenvertiefungen (Röhrchen 2) verwendet wurde, wobei in beiden Fällen Anti-Histidin-Antikörper als Fangreagenz verwendet wurde.
  • Im Röhrchen 1 wurde ERK-2 unter Verwendung von Magnetkugeln (Dynal, Wirral GB, Kat.-Nr. 110.11) eingefangen, die mit einem Anti-Histidin-Antikörper (Sigma, Poole, GB, Kat.-Nr. H1029) unter Verwendung der vom Zulieferer empfohlenen Beschichtungsbedingungen vorbeschichtet worden waren. Die Fangreaktion erfolgte bei 4°C 1 Stunde bei durchgehendem, konstantem leichtem Mischen, um die Kugeln in Suspension zu halten. Nach dem Einfangen wurden die Kugeln unter Verwendung eines Magnetteilchenkonzentrators gesammelt und ausgiebig in PBS gewaschen. Die Kugeln wurden in einem Endvolumen von 40 μl resuspendiert, und 10-μl-Aliquote wurden in Mikrotiterplattenvertiefungen überführt und einzeln mit Verdünnungen von entweder einem Antikörper gegen phosphoryliertes ERK (Upstate Biotechnologies, Kat.-Nr. 05-481), einem monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-HRP-Konjugat-Cocktail (Zymed, Cambridge, GB, Kat.-Nr. 136620), einer polyklonalen Anti-Phosphoserin/Phosphothreonin/Phosphotyrosin-Zubereitung (Zymed, Kat.-Nr. 90-0200) oder einem negativen Kontroll-Antikörper-HRP-Konjugat, der für humane leichte Immunglobulinketten spezifisch war (The Binding Site, Birmingham GB, Kat.-Nr. APO015), umgesetzt. Die Antikörper wurden für 1 Stunde bei 4°C inkubiert und anschließend mit entsprechenden Sekundärreagenzien/chromogenen Substraten nachgewiesen. Die Platten wurden bei 450 nm gelesen.
  • Im Röhrchen 2 wurde ERK-2 unter Verwendung von Mikrotiterplattenvertiefungen eingefangen, die über Nacht mit einem Anti-Histidin-Antikörper (Sigma, Poole GB, Kat.-Nr. H1029) beschichtet und durch 40-minütige Inkubation mit einer Lösung aus PBS/5% (Gew./Vol.) BSA bei Raumtemperatur vorblockiert worden waren. Die Konditionierungsreaktion wurde unter Verwendung von PBS auf ein Gesamtvolumen von 100 μl verdünnt und auf die Mikrotiterplatte überführt. Die Fangreaktion erfolgte für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Phosphoryliertes ERK-2 wurden in einem direkten ELISA-Format unter Verwendung der Antikörperreihe, einschließlich eines negativen Kontrollreagenzes, wie oben angegeben, nachgewiesen.
  • Unter Verwendung beider vorstehender Nachweisverfahren wurde das Vorliegen von phosphoryliertem ERK-2 nach der Inkubation mit Lysaten von A431-Zellen eindeutig nachgewiesen.
  • Beispiel 3
  • Verfahren zur Herstellung in vitro translatierter cDNA-Klone für Anordnungen auf mit Streptavidin beschichteten Platten.
  • Ein cDNA-Bank von gesamtem humanem fötalem Gehirn wurde von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, USA) bezogen. Die Bank wurde unidirektional in den Lambda-Vektor Uni-ZAP XR kloniert mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 1,3 kbp geliefert. Es wurde abgeschätzt, dass die Bank 2 × 106 pfu enthielt und mit einem Titer von etwa 2,4 × 1010 pfu/ml geliefert worden war. Die Lambda-Uni-ZAP-XR-Stammbank wurde nach einer einzigen Amplifikationsrunde geliefert. An diesem 1 x amplifizierten Material wurde eine Massenexzisionsreaktion (siehe unten) durchgeführt, so dass Manipulationen, wie Plattierung, Replikaproduktion und Herstellung einer Bank von Stammklonen, auf der Ebene von Einzelklonen lebensfähiger E. coli und nicht als lytische Plaques nach einer Lambda-Phageninfektion durchgeführt werden konnten (Jerseth, B. et al. (1992) Strategies 5: 81–83). Die restliche Bank wurde unter Verwendung von Standardverfahren (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Hrsg. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, USA) ein weiteres Mal amplifiziert, und mehrere Glycerinstammlösungen wurden als Stammbank bei –80°C abgelegt.
  • Die Bank wurden gemäß vom Zulieferer (Stratagene, La Jolla, USA) zur Verfügung gestellter Protokolle für die Massenexzisionsreaktion und Plattierung als Bakterienkolonien vorbereitet. Kurz gesagt, wurden die mit der Bank gelieferten Bakterienstämme (XL-1 Blue und SOLR') auf Selektionsmedium (LB-Tetrazyklin bzw. LB-Kanamycin) ausplattiert, und Einzelkolonien wurden für die Übernachtkultur bei 30°C in 50 ml LB-Brühe [10 g/l NaCl, 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, pH 7,0], die mit 0,2% (Gew./Vol.) Maltose und 10 mM MgSO4 angereicht war, gepickt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt und in 10 mM MgSO4 in einer Dichte von 8 × 108 Zellen/ml (OD600 = 1,0) resuspendiert. XL-1- Blue-Zellen wurden mit einem Teil der Lambda-Uni-ZAP-XR-Bank in einer Multiplizität der Infektion von 1:10 Lambda-Phagen:Zellen vereinigt. Der auf M13 basierende Helferphagenstamm ExAssist (Stratagene, La Jolla, USA) wurde in einem Verhältnis von 10:1 Helferphage:Zellen hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Es wurden 20 ml LB-Brühe zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C unter Schütteln für weitere drei Stunden inkubiert. Das Gemisch wurde für 20 Minuten bei 70°C erhitzt, und die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation gesammelt. Der Überstand, der die ausgeschnittenen Phagemide enthielt, wurde gesammelt, und 1 μl wurde zu 200 μl SOLR'-Zellen gegeben. Das Gemisch wurde auf LB-Ampicillin-Platten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Üblicherweise führte dies zu vielen 1000 Kolonien auf jeder Platte, und die weitere Verdünnung der Präparation von ausgeschnittenen Phagemiden war erforderlich, um geeignete Plattierungsdichten zum Picken von Kolonien zu erhalten.
  • Um das Gridding-Verfahren durchführbar zu machen, wurde die Gesamtanzahl an cDNA-Einzelklonen verringert, wobei aber die Repräsentanz der Bank beibehalten wurde. Diese Normalisierung wurde gemäß dem Verfahren von Soares et al. (Soares, M. B. et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA Bd. 91: 922–923) erreicht. Das Verfahren erforderte die Herstellung einzelsträngiger Moleküle mittels Helferphageninfektion der Phagemid-Bank. Die einzelsträngigen zirkulären Moleküle wurden einer kontrollierten Primerextension unterworfen, gefolgt von Denaturieren und erneutem Hybridisieren unter Bedingungen, unter denen sich sehr abundante Moleküle wieder verbanden (niedrige Cot) und aus dem Gemisch durch Hydroxy-apatit-Säulenchromatographie entfernt werden konnten. Zirkuläre Moleküle, die nicht wieder assoziierten, wurden aus dem Durchfluss gewonnen und direkt in kompetente Bakterien transformiert.
  • Eine Einzelstrangrettung wurde an der Phagemid-Bank unter Verwendung des Helferphagen VCM13 und vom Zulieferer (Stratagene) zur Verfügung gestellter Protokolle durchgeführt. Gerettete einzelsträngige DNA wurde gemäß dem Verfahren von Soares et al. (Soares et al. s.o.) gereinigt, wobei besondere Schritte zur Beseitigung von kontaminierender doppelsträngiger DNA durchgeführt wurden. Eine kontrollierte Primerextension erfolgte an gereinigter einzelsträngiger zirkulärer DNA unter Verwendung des Primers 5'ggaaacagctatgaccatg, wobei die Bedingungen von Soares et al. verwendet wurden. DNA-Polymerase stammte von Boehringer, die Nukleotidtriphosphate von Life Technologies (Paisley, GB). Das als Markierung verwendete α32P-dCTP war von Amersham International (Amersham, GB). Die Hydroxyapatit-Säulenchromatographie wurde bei 60°C wie in Soares et al. beschrieben durchgeführt. Nach der Gewinnung der normalisierten einzelsträngigen zirkulären Moleküle wurde die gereinigte DNA direkt in kompetente XL1-blue-E.-coli-Zellen transformiert und wie zuvor beschrieben auf LB-Ampicillin-Platten ausplattiert.
  • Einzelkolonien von XL1-blue-Zellen aus der normalisierten Bank wurden zur weiteren Analyse und Replikaherstellung gepickt. Kurz gesagt, wurden die Kolonien manuell in Platten mit 96 Vertiefungen, die 100 μl LB-Ampicillin-Medium enthielten, gepickt und für 3 Stunden bei 37°C gezüchtet. Von jeder Platte wurde unter Verwendung einer BioRobot9600- (Qiagen UK Ltd., Crawley GB) Laborarbeitsstation ein Replikat hergestellt. Der Roboter wurde derart programmiert, dass er 50 μl der Kultur in Medium, das 10% (Vol./Vol.) Glycerin enthielt, pipettierte, und diese Platte wurde verschlossen und als Stammplatte bei –80°C aufbewahrt. Die restlichen 50 μl der Kultur wurden in einen Flachbodenblock mit 96 Vertiefungen mit quadratischen 2-ml-Vertiefungen, die 1,8 ml LB-Ampicillin-Medium enthielten, überimpft. Eine mikroporöse Klebefolie wurde oben auf jeden Block aufgebracht und der Block über Nacht bei 37°C unter Überkopfschütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurde aus jeder der 96 Vertiefungen Phagemid-DNA unter Verwendung von Standardprogrammen an einem BioRobot9600 (Qiagen UK Ltd., Crawley GB) und der vom Zulieferer (Qiagen UK Ltd., Crawley GB) bereitgestellten QIAwell-Ultra-Reagenzsysteme präpariert.
  • Ein Teil der gereinigten DNA wurde direkt als Matrizen für eine verbundene In-vitro-Transkription-Translation (IVTT) unter Verwendung von T3-RNA-Polymerase und eines von Promega UK Ltd. (Southampton, GB) gelieferten Kaninchenretikulozytenlysat-Systems eingesetzt. Die verbleibende DNA wurde für die Aufbewahrung bei –20°C verschlossen. Der IVTT-Reaktionsmix wurde mit 2% (Vol./Vol.) tRNA-Biotinyllysin (Promega UK Ltd, Southampton, GB) angereichert, so dass die in vitro translatierten Proteine auf einer mit Streptavidin beschichteten festen Phase eingefangen werden konnten. Die IVTT-Reaktionen wurden in Anordnungen mit 96 Vertiefungen in einem Gesamtvolumen von 25 μl bei 30°C für 60 Minuten durchgeführt. Nach der Inkubation wurden 5 μl von jeder Reaktion in 100 μl TSB pH 8,0 (50 mM Tris, 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl) überführt, die zuvor in die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten, vorblockierten Reacti-BindTM-Platte (Pierce, Chester, GB) gegeben worden waren. Die restliche IVTT-Reaktionsplatte wurde für die Aufbewahrung bei –20°C ver schlossen. Die Reacti-BindTM-Streptavidin-Platte wurde für 60 Minuten unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bindung des biotinylierten IVTT-Produkts an die Plattenoberfläche zu begünstigen. Die Platte wurde unter Verwendung von 3 × 200 μl Waschpuffer (TBS, 0,1% (Gew./Vol.) BSA, 0,05% (Vol./Vol.) Tween 20) gewaschen, bevor sie in Gewebeproteinbindungsassays verwendet wurde.
  • Beispiel 4
  • Verfahren zur Durchführung einer Gewebeextraktmodifikation von in vitro translatierten Proteinanordnungen und Nachweis von Phosphorylierung der Proteine in den Anordnungen.
  • Proben von humanem Hirngewebe wurden von NeuroResouce (London, GB) bezogen. Aufeinander abgestimmte Proben von normalem Hirn und Hirn mit Alzheimer-Krankheit wurden geliefert. Im Allgemeinen wurden jeweils 1–10 g von jeder Probe geliefert, wobei die Proben in allen Fällen von einer bekannten subanatomischen Stelle stammten und in vollständigen klinischen Einzelheiten kreuzindiziert waren. Alle Proben wurden zum Zeitpunkt der Probennahme schockgefroren, auf Trockeneis versandt und vor der Verarbeitung unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Verarbeitung erfolgt unter Bedingungen der Kategorie 2.
  • Phosphorylierungskompetente Hirngewebeextrakte wurden durch Aufbrechen des Gewebes in eiskaltem RIPA-Puffer hergestellt. Bei einigen Experimenten wurden auch Phosphataseaktivität-kompetente Extrakte hergestellt; in diesem Fall wurden Lysate unter Verwendung von RIPA-Puffer ohne 1 mM Na3VO4 hergestellt. Die Gewebeproben wurden auf Eis aufgetaut und unter Verwendung eines sterilen Einweg-Gewebemörsers ("Pellet Pestle" Anachem Ltd., Luton, GB) aufgebrochen. Die Homogenisation wurde unter Verwendung von 2 Volumina eiskaltem RIPA-Puffer zu 1 Volumen Gewebe durchgeführt. Das Lysat wurde unter leichtem Schütteln für 15 Minuten auf Eis inkubiert, dann durch Zentrifugation bei 13000 x g und 4°C für 10 Minuten von unlöslichem Material befreit. Der Überstand wurde entnommen und hinsichtlich der Proteinkonzentration unter Verwendung des Bichinchoninsäure-Verfahrens und der vom Zulieferer (Pierce, Chester GB, Kat.-Nr. 23225) zur Verfügung gestellten Protokolle getestet. Das Lysat wurde in mehrere Aliquote aufgeteilt, auf Trockeneis schockgefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
  • Das Hirngewebelysat wurde mit der IVTT-Proteinanordnung in einem Format mit 96 Vertiefungen durch Inkubation des aufgetauten Lysats mit der gewaschenen Anordnung für 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Im Allgemeinen wurden 10 μl Lysat zu jeder Vertiefung der Proteinanordnung gegeben. Nach der Inkubation wurden die Platten x 3 unter Verwendung von 200 μl Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen und mit einer von mehreren verdünnten Anti-Phosphoprotein-Antikörperzubereitungen inkubiert. Eine Phosphotyrosinmodifikation wurden unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-HRP-Konjugat-Cocktails (Zymed, Cambridge, GB, Nr. 136620) nachgewiesen. Eine Phosphoserin-/Phosphothreoninmodifikation wurde unter Verwendung einer polyklonalen Anti-Phosphoserin-/-Phosphothreonin-/-Phosphotyrosin-Zubereitung (Zymed, Cambridge, GB, Kat.-Nr. 90-0200) nachgewiesen. In allen Fällen erfolgte die Antikörperinkubation unter Verwendung in TBS mit 5% BSA verdünnter Antikörper für mindestens 1 Stunde bei 37°C oder in einigen Fällen eine Übernachtinkubation bei 4°C. Die Platten wurden vor dem Nachweis mit entsprechenden Sekundärreagenzien/chromogenen Substraten gemäß Standardprotokollen (Antibodies A Laboratory Manual Hrsg. Harlow, E. und Lane, D. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988 New York, USA) wie vorstehend gewaschen. Die Platten wurden bei 492 nm gelesen.
  • Beispiel 5
  • Verfahren zum Nachweis von Protein-Protein-Bindung unter Verwendung markierter Gewebeproteine an in vitro translatierten Proteinanordnungen.
  • Die Proteine eines Hirngewebelysats wurden unter Verwendung des von Sigma (Poole, GB) gelieferten FluroTagTM-FITC-Konjugationssystems mit Fluorescein markiert. Üblicherweise wurden 5 mg Hirnprotein mit 250 μl einer Verdünnung einer 1 mg/ml Fluorosceinisothiocyanat- (FITC-) Lösung in 0,1 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer umgesetzt. Man ließ die Markierungsreaktion für 2 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen, bevor sie mittels G-25-Sephadex-Säulenchromatographie von nicht eingebautem FITC gereinigt wurde. Die Säulen und Verfahren waren wie im FluroTagTM-Kit (Sigma, Poole, GB) bereitgestellt. Das Säuleneluat, das die markierten Hirnproteine enthielt, wurde lichtgeschützt bei 4°C aufbewahrt.
  • Markiertes Gewebelysat wurden wie zuvor mit der IVTT-Proteinanordnung umgesetzt. Zum Nachweis von markierten Hirnproteinen, die durch Mitglieder der IVTT-Proteinanordnung eingefangen worden waren, wurde die Platte wie vorstehend gewaschen und mit einem Anti-Fluorescein-Antikörper (Sigma Nr. F- 5636, Sigma, Poole, GB) inkubiert. Der Antikörper wurde 1/2500 in TBS verdünnt, das 5% BSA enthielt, und für 30–60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Antikörper wurde unter Verwendung eines Anti-Maus-HRP-Komplexes, gefolgt von Umsetzung mit dem chromogenen Substrat o-Phenylendiamin (Sigma, Poole GB) gemäß Standardverfahren (Antibodies, A Laboratory Manual, s.o.) nachgewiesen. Die Platten wurden bei 492 nm gelesen.
  • Beispiel 6
  • Durch eine Ribosomen-Display-Bank identifizierte Protein-Protein-Bindungspartner
  • Bei diesem Beispiel wird die in vitro translatierte Proteinanordnung zum Durchsuchen einer Ribosomen-Display-Bank nach Bindungspartnern verwendet, und die in der Bank vorliegenden Gene für Bindungspartner werden mittels reverser Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) identifiziert. Für den Zweck dieses Beispiels ist die Ribosomen-Display-Bank im Wesentlichen wie im Beispiel 1 beschrieben und besteht in der Praxis zum Zeitpunkt der Verwendung zum Screenen der IVTT-Proteinanordnung aus einer großen Population (109–1012) an Ribosomen, die jeweils einzeln mittels Verknüpfung mit dessen zugehörigem mRNA-Molekül an ein naszierendes Protein gebunden sind.
  • Die Bank wurde 1 zu 5 in eiskaltem Verdünnungspuffer (50 mM Tris-Acetat pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 50 mM Magnesiumacetat, 0,1% Tween 20 mit 200 u/ml RNasin (Promega UK Ltd., Southampton GB)) verdünnt. Es wurden 50 μl der verdünnten Bank zu jeder Vertiefung der IVTT-Proteinanordnung gegeben und bei 4°C für 1 Stunde unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen der Anordnung 5 Mal unter Verwendung von 100 μl eiskaltem Verdünnungspuffer gewaschen. Die mRNA aus jedem der gebundenen mRNA/Ribosom/Protein-Komplexe wurde durch Zugabe von 20 μl 50 mM Tris-Acetat pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 20 mM EDTA und Inkubieren auf Eis für 10 Minuten unter leichtem Schütteln eluiert. Die eluierte mRNA wurde in einer zweiten Platte mit 96 Vertiefungen gesammelt und mittels Fällung mit Ethanol bei –20°C über Nacht (Molecular Cloning, A Laboratory Manual s.o.) in Gegenwart von 20 μg Glykogen-Carrier (Boehringer, Lewes, GB) aufkonzentriert. Die so erhaltene mRNA wurde als Matrize für die reverse Transkription mit M-MLV-reverser Transkriptase (RT) verwendet. Kurz gesagt, wurde die mRNA bei 70°C für 10 Minuten in Gegenwart von 1 nM der Primers RD3 [5'(T)18nn] hitzedenaturiert. Das Gemisch wurde auf Eis abgekühlt, bevor 200 u M-MLV-RT und ihr Reaktions puffer (Life Technologies, Paisley, GB) zugegeben wurden. Das Gemisch wurde für 60 Minuten bei 37°C inkubiert, dann zur Inaktivierung der RT für 15 Minuten nach 70°C überführ. Das anschließende DNA:RNA-Hybrid wurde als Matrize für eine PCR unter Verwendung der Primer T75L [5'cggtttccctctagaaata] und RD3 und verwendet, wobei der Zyklus 95°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden × 40 durchgeführt wurde. Thermostabile DNA-Polymerase (ExpandTM High Fidelity), Reaktionspuffer und Nukleotidtriphosphate waren von Boehringer (Boehringer, Lewes, GB). Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese analysiert (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, s.o.). Das Vorliegen eines PCR-Produkts identifizierte mutmaßliche positive Bindungspartner in der IVTT-Proteinanordnung. Die Proteinanordnung wurde dekodiert und Phagemid-DNA für die Sequenzanalyse identifiziert. PCR-Produkte aus der Polysomen-Display-Bank wurden unter Verwendung des Primers T75L direkt sequenziert. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung von Farbstoffterminator-Chemie gemäß vom Zulieferer (Amersham International, Amersham GB) zur Verfügung gestellter Protokolle. Die Reaktionen wurden unter Verwendung eines automatisierten Sequenziersystems (Applied Biosystems, Warrington, GB) analysiert.
  • Beispiel 7
  • Mikroanordnungen einer in vitro translatierten Protein-Bank auf einer mit Streptavidin beschichteten Glasoberfläche.
  • Eine Miniaturisierung der IVTT-Proteinanordnung wurde durch Gridding einzelner IVTT-Proteine mit einem Roboter auf eine Glasoberfläche, an die zuvor Streptavidin gebunden worden war, erzielt. Die Glas-"Chips" mit dem kovalent an eine Oberfläche gebundenen Streptavidin wurden von Radius Inc. (Medfield, MA, USA) bezogen. Die Glas-Chips waren 55 mm × 25 mm groß. Unter Verwendung des Gridding-Roboters (Radius Inc., Medfield, MA, USA) wurden jeweils 0,5 μl der 96 IVTT-Reaktionen auf die trockene Oberfläche des Chips in einer niedrig dichten Anordnung von 8 auf 12 aufgetragen. Bei weiteren Experimenten wurden Anordnungen in doppelter Dichte von 192 einzelnen Proteinen pro Glas-Chip hergestellt. Bei anschließenden Experimenten wurden Anordnungen sehr hoher Dichte hergestellt, die sich zum Screenen mit hohem Durchsatz eigneten. Nach dem Gridding wurde die Chipoberfläche unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, und die Objektträger wurden bei 4°C in PBS mit 3% (Gew./Vol.) BSA und 0.02% Natriumazid aufbewahrt.
  • Die IVTT-Protein-Chipanordnungen wurden mit Gewebelysaten behandelt und im Prinzip wie im Beispiel 2 angegeben mit Anti-Phosphoprotein-Antikörpern sondiert. Die Protein-Chipanordnungen wurden vor der Inkubation mit Hirngewebelysaten durch Eintauchen in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) ausgiebig gewaschen. Überschüssige Waschlösung wurde vom Objektträger abgeschüttelt, bevor 15 μl Hirngewebelysat direkt auf die Oberfläche über dem Bereich, der die Proteinanordnung umfasste, aufgetragen wurden. Über der Gewebelysatlösung wurde ein Glasdeckglas aufgebracht, das dazu diente, das Lysat über den gesamten Bereich der Anordnung zu verteilen und mittels Kapillarwirkung zu halten, um einen signifikanten Lösungsverlust während der anschließenden Inkubation zu stoppen. Die Inkubation erfolgte für 30 Minuten bei 37°C, wobei der Glas-Chip in einen angefeuchteten Behälter eingebracht wurde. Nach der Inkubation wurde das Deckglas entfernt und der Objektträger durch Eintauchen in Waschpuffer gewaschen. Der Glas-Chip wurde mit einem oder Kombination von Anti-Phosphoprotein-Antikörpern, die wie im Beispiel 2 verdünnt wurden, inkubiert. Die Antikörperlösung wurde in einem kleinen Volumen (10–20 μl) zur Proteinanordnung gegeben und wie zuvor unter einem Deckglas an Ort und Stelle gehalten. Der Nachweis von gebundenem Antikörper erfolgte durch Verwendung chromogener Substrate, die einen unlöslichen Niederschlag auf dem Glasobjektträger ergaben. Üblicherweise wurde das Substrat DAB (Diaminobenzidintetrahydrochlorid) (Sigma, Poole, GB) verwendet. Positive Signale in niedrig dichten Anordnungen wurden durch visuelle Untersuchung der Anordnung unter kleiner Vergrößerung identifiziert. Bei einigen Experimenten wurde ein verstärkt chemilumineszentes Substrat (Pierce & Warriner Ltd., Chester GB) in Kombination mit Peroxidasekonjugierten Primär- oder Sekundärantikörpern verwendet. Positive Signale wurden unter Verwendung eines Molecular Imager FX- (BioRad Laboratories Ltd., Herts, GB) Phosphorbildgebungssystems nachgewiesen.
  • An den IVTT-Protein-Glas-Chip-Anordnungen wurden Protein-Protein-Bindungsassays unter Verwendung von FITC-markiertem Hirnprotein und im Prinzip wie im Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Es wurden 10–20 μl FITC-markierte Hirnproteinzubereitung direkt auf die Oberfläche einer gewaschenen IVTT-Proteinanordnung aufgebracht. Ein Glasdeckglas wurde über der markierten Gewebelysatlösung aufgebracht, und der ganze Objektträger wurde für 30 Minuten bei 37°C in einem feuchtgehaltenen Behälter inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Deckglas entfernt und der Objektträger durch Eintauchen in Waschpuffer gewaschen.
  • Bei einigen Experimenten wurde das gebundene, FITC-markierte Protein direkt mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Für die Mikroskopie wurde die Proteinanordnung mit einem Tropfen Anti-fade-Montiermittel (Vector Labs, Peterborough, GB) und einem herkömmlichen Deckglas für die Öl-Immersionsfluoreszenzmikroskopie bedeckt. Das Mikroskop war ein Nikon Typ 105, das mit einem FITC-kompatiblen Filtersatz für die Fluoreszenzmikroskopie ausgerüstet war. Die Position von Proteinflecken, die ein positives Signal ergaben, wurde anhand dreistelliger Ablesungen auf der X-Y-Achse vom Mikroskopstativ unter Fluoreszenzbeleuchtung dekodiert. Diese Ablesungen nach Untersuchung eines Indexflecks, der vor dem Roboter-Gridding in jede Glasoberfläche geätzt worden war, zu den Proteinanordnungskoordinaten in Bezug gesetzt. Der Indexfleck wurde unter normaler Beleuchtung identifiziert und lieferte die X-Y-Ablesungen für seine Position in Bezug zur Proteinanordnung.
  • Einige Experimente erfolgten unter indirektem Nachweis des gebundenen markierten Proteins. Dazu wurde ein monoklonaler Anti-FITC-Antikörper verwendet, gefolgt von einem Anti-Maus-Peroxidase-Konjugat und kolorimetrischem Nachweis unter Verwendung von DAB als Reportersubstrat. In diesem Fall stammten die Reagenzien von Sigma (Poole, GB), und die Inkubationen wurden unter Verwendung kleiner Volumina (10–20 μl) der verdünnten Antikörper durchgeführt, die wie zuvor beschrieben direkt auf die Glasoberfläche aufgebracht und unter Deckgläsern gehalten wurden. Positive Signale wurden durch visuelle Untersuchung der Anordnung bei kleiner Vergrößerung unter normaler Beleuchtung identifiziert. Weitere Experimente verwendeten ebenfalls ein verstärkt chemilumineszentes Substrat (Pierce & Warriner Ltd., Chester GB) und Bildgebung unter Verwendung eines Phosphorbildgebungssystems wie vorstehend.
  • Beispiel 8
  • Verfahren zur Herstellung einer Bank von auf einer Festphasenanordnung immoblisierten einkettigen Antikörpern für die Umsetzung mit Gewebeextrakten.
  • Ein Extrakt von normalem humanem Gehirn, der wie im Beispiel 4 hergestellt wurde, wurde zur Immunisierung von zwei BalbC-Mäusen verwendet. Es wurden 2 Dosen intraperitoneal mit einem Abstand von 4 Wochen dazwischen verabreicht. 3 bis 4 Tage nach der 2. Impfung wurden die Mäuse getötet und die Milzen mittels Dissektion entfernt. Eine 25 cm2 große Gewebekulturflasche wurde mit den Hirnextraktproteinen zu 25 μg/ml in Carbonat/Bicarbonat-Puffer pH 9,0 beschichtet. Nach einer Inkubation für 1 Stunde bei 37°C wurde die Antigenzubereitung entfernt und steriler Blockierungspuffer (2% Trockenmagermilch in PBS) zugegeben und für 1 Stunde inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit PBS wurden 25 ml Milzzellsuspension in Gewebekulturmedium zu der Flasche gegeben und über Nacht bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Das Medium, das die nicht anhaftenden Milzzellen enthielt, wurde entfernt. Durch Zugabe von 1,5 ml des Extraktionspuffers aus dem QuickPrepTM-mRNA-Reinigungskit (Pharmacia, St. Albans, GB) zu der Flasche und Schwenken über die Oberfläche wurde dann die RNA-Präparation aus den anhaftenden selektierten Zellen eingeleitet. Dann wurden 3 ml Elutionspuffer hinzugefügt und gemischt. Die Flascheninhalte wurden dann in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, und die QuickPrepTM-mRNA-Präparation wurde nach den Anweisungen des Herstellers fortgesetzt.
  • Das Pharmacia Recombinant Phage Antibody-System (Pharmacia, Milton Keynes, GB) wurde zur Herstellung einer Bank von einkettigen Maus-Fvs (ScFv) gegen humanes Hirn verwendet. Die Erststrang-cDNA wurde aus der mRNA unter Verwendung von M-MuLV-reverser Transkriptase und zufallsgemäßen Hexamerprimern hergestellt. Die Gene für die schweren und leichten Antikörperketten wurden dann unter Verwendung spezifischer Primer für die schwere und leichte Kette, die komplementär zu konservierten Sequenzen waren, die die variablen Antikörperdomänen flankieren, amplifiziert. Die Produkte mit 340 und 325 Basenpaaren, die für die DNA der schweren bzw. der leichten Kette erzeugt wurden, wurden nach einer Agarosegelelektrophorese getrennt gereinigt. Diese wurden dann zu einem einzigen ScFv-Konstrukt assembliert, wobei ein DNA-Linker-Primer-Mix verwendet wurde, in dem die VH-Region über ein (Gly4Ser)3-Peptid mit der VL-Region verknüpft erhalten wurde. Die assemblierten ScFv wurden mit Primern amplifiziert, die derart gestaltet waren, dass sie Sfi 1- und Not 1-Stellen an den 5'- bzw. 3'-Enden einfügten, so dass ein 800-bp-Produkt erhalten wurde. Die ses Fragment wurde gereinigt, nacheinander mit SfiI und NotI gespalten und erneut gereinigt.
  • Zur Herstellung einer in vitro transkribierten und translatierten ScFv-Bank wurde der Vektor pBluescript SK+ durch Einbringen des Linkers zwischen die HindIII- und die Eco RI-Stelle in der Region der multiplen Klonierungsstelle modifiziert: Linkersequenz:
    Figure 00420001
  • Die amplifizierten ScFv wurden zwischen die SfiI- und NotI-Stellen dieses Vektors kloniert, so dass sie in der richtigen Orientierung für die Transkription vom T7-Promotor eingebracht wurden. Alternativ wurde eine humane natürliche Phagen-Antikörper-Bank (Nissin, MRC) verwendet. Die Phagemid-DNA wurde präpariert und nacheinander mit SfiI und NotI gespalten. Die ScFv-Fragmente wurden gereinigt und in den oben beschriebenen pBluescript SK+-Vektor kloniert.
  • Für die Verwendung als Festphasenanordnung wurden einzelne pBluescript-Klone gepickt und wie im Beispiel 3 in Platten mit mehreren Vertiefungen gezüchtet. DNA-Präparation, IVTT und Anordnung der biotinylierten Proteine erfolgten wie im Beispiel 3.
  • Für die Verwendung als Phagen-Antikörper-Bank wurde nach dem Pharmacia-Protokoll vorgegangen. Die assemblierten ScFv wurden mit Primern amplifiziert, die derart gestaltet waren, dass SfiI- und NotI-Stellen am 5'- bzw. 3'-Ende eingeführt wurden, was ein 800-bp-Produkt ergab. Dieses Fragment wurde gereinigt, nacheinander mit Sfi 1 und Not 1 gespalten, erneut gereinigt und in mit SfiI und NotI gespaltenen pCANTAB 5-Phagemidvektor ligiert. pCANTAB 5 enthält das für das Phagen-Gen-3-Protein (g3p) codierende Gen, und der ScFv wird in Nachbarschaft zur g3-Signalsequenz eingesetzt, so dass er als g3p-Fusionsprotein exprimiert wird. Kompetente E.-coli-TG1-Zellen wurden mit dem pCantab 5/ScFv-Phagemid transformiert, dann anschließend mit dem M13KO7-Helferphagen infiziert. Der so erhaltene rekombinante Phage enthielt DNA, die die ScFv- Gene codierte, und bot eine oder mehrere Kopien des rekombinanten Antikörpers als Fusionsproteine an seinen Spitzen dar.
  • Auf Phagen dargebotene ScFv, die an humane Hirnantigene binden, wurden dann selektiert oder mittels Panning angereichert. Kurz gesagt, wurde eine Hirnantigenzubereitung auf die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen aufgebracht. Nach Blockieren mit 2% Magermilch in PBS wurde die Phagenzubereitung aufgebracht und für 1 Stunde inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen mit PBS wurden Vertiefungen, die mit Hirnantigen reagierende rekombinante Phagen enthielten, mit einem Anti-M13-Antikörper nachgewiesen, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, und mit dem chromogenen Substrat o-Phenylendiamin sichtbar gemacht.
  • Beispiel 9
  • Gitterförmig aufgetragene und mit markiertem Gewebeprotein behandelte IVTT-Display-Bank.
  • Eine IVTT-Display-Bank von einkettigen Antikörpern wurde an vitro translatiert und wie im Beispiel 3 auf einer Streptavidin-Oberfläche angeordnet. Die Anordnung von einkettigen Antikörpern wurde mit FITC-markierten Hirnproteinen, die wie im Beispiel 5 hergestellt wurden, umgesetzt. Das Reaktionsverfahren und der Nachweis von Protein:Protein-Bindung erfolgten wie im Beispiel 5. Die Muster positiver Signale von wiederholten IVTT-Anordnungen, die mit unterschiedlichen Gewebeproteinen behandelt worden waren, wurden verglichen. Zur Identifizierung einzelner Proteine an spezifischen Loci auf den Anordnungen wurde das entsprechende Gen des einkettigen Antikörpers von der Stammplatte der BankcDNAs gewonnen. Gene für einkettige Antikörper von Interesse wurden dann erneut einer IVTT im größeren Maßstab unterzogen und entweder zur Gewinnung und Identifizierung von Bindungspartnern aus einer IVTT-Protein-Bank, wie im Beispiel 6 beschrieben, oder zur Gewinnung und Identifizierung von natürlichem Gewebeprotein (mittels 2D-Gelen), wie im Beispiel 1 beschrieben, verwendet.
  • Beispiel 10
  • Verwendung von DNA-Chips zur Herstellung eines Ribosome-Display
  • Um eine Polysomen-Display-Bank für die anschließende Immobilisierung auf einem DNA-Chip herzustellen, wird die Bank im Wesentlichen wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt, ausgenommen dass einer der Primer, der zum Klonieren der cDNAs in die IVTT-Vektoren verwendet wird, einen gemischten Primer mit einem Abschnitt variabler Sequenz innerhalb der transkribierten Sequenz umfasst, der derart gestaltet ist, dass er an die DNA-Moleküle auf dem Chip hybridisiert. Alternativ wird der Plasmidpool aus der Display-Bank mit einem einmal in der transkribierten Sequenz spaltenden Restriktionsenzym gespalten, und ein gemischtes synthetisches Oligonukleotid wird einkloniert. Somit wird die Bank derart konstruiert, dass jedes erzeugte mRNA-Molekül eine einzigartige Sequenzmarkierung enthält; diese besteht aus mindestens 15 Nukleotiden, vorzugsweise etwa 20 Nukleotiden.
  • Die Experimente zum Testen des DNA-Chip-Proteinanordnungsverfahrens wurden unter Verwendung eines Paars von modifizierten Genen für einkettige Antikörper (scAbs) durchgeführt. Zwei modifizierte scAbs wurden hergestellt, die aus N-terminalen Epitopmarkierungen, der variablen Region der schweren Kette (VH), einem 14 Aminosäuren langen Linker (EGKSSGSGSESKVD), der variablen Region der leichten Kette (VL), fusioniert an die cDNA für die humane konstante κ-Region, bestanden. Die Sequenz der humanen konstanten κ-Region, die eine Polyhistidinmarkierung am 3'-Ende enthielt, wurde derart modifiziert, dass die Stoppcodons deletiert waren. Die humane konstante κ-Region wird eingeführt, damit sie als Spacer wirkt, so dass eine korrekte Faltung von naszierenden einkettigen Fv möglich ist, während sie immer noch an einen Ribosomenkomplex in einem In-vitro-Translationssystem gebunden sind.
  • Diese Konstrukte wurden in den Vektor pET 5c (Rosenberg AH et al., Gene, 56: 125–135, 1987) kloniert, der einen T7-Promotor, gefolgt von der Ribosomenbindungsstelle des T7-Gens 10, bereitstellt. Die scAb-Konstrukte wurden in den Vektor an einer NdeI-Stelle eingebracht, so dass die Sequenz, die die Epitopmarkierung codierte, auf das erste Atg des T7-Gens 10 folgte. Das erste Konstrukt bestand aus einem scAb gegen Pseudomonas aeruginosa (Molloy P. et al. Journal of applied Bacteriology, 78: 359–365, 1995) mit dem am N-Terminus hinzugefügten FLAG-Epitop (MDYKDDDK) (Knappik A und Plückthun A, BioTechniques, 17: 754–761, 1994). Das zweite bestand aus einem scAb, der aus dem Antikörper 340 (Durrant LG et al. Prenatal Diagnosis, 14: 131–140, 1994) mit einer Polyhistidinmarkierung am N-Terminus hergestellt wurde.
  • Diese Plasmide dienten als Ausgangsmaterialien für anschließende Derivate. Der Anti-Pseudomonas aeruginosa- (α-Ps-) scAb und der 340-scAb wurden wie folgt konstruiert. DNA für den α-Ps-scAb im Vektor pPM1His (Molloy P et al., s.o.) wurde mit den Primern RD 5' FLAG:
    5'gcggatcccatatggactacaaagacgatgacgacaaacaggtgcagctgcag3' (Genosys Biotechnologies Europe Ltd., Cambridge, GB) und RD 3':
    5'gcgaattcgtggtggtggtggtggtgtgactctcc3' (Genosys) amplifiziert, die die 5'-FLAG-Epitopesequenz einführten bzw. das 3'-Stoppcodon entfernten. Das Reaktionsgemisch umfasste 0,1 μg Matrizen-DNA, 2,6 Einheiten ExpandTM High Fidelity PCR-Enzymmix (Boehringer Mannheim, Lewes, GB), Expand HF-Puffer (Boehringer Mannheim), 1,5 mM MgCl2, 200 μM Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) (Life Technologies, Paisley, GB) und 25 pmol von jedem Primer. Die Zyklen waren 96°C 5 Minuten, gefolgt von [95°C 1 Minute, 50°C 1 Minute, 72°C 1 Minute] mal 5, [95°C 45 Sekunden, 50°C 1 Minute, 72°C 1 Minute 30 Sekunden] mal 8, [95°C 45 Sekunden, 50°C 1 Minute, 72°C 2 Minuten] mal 5, beendet wurde mit 72°C 5 Minuten. Das erhaltene 1123-bp-Produkt wurde mit BamHI und EcoRI gespalten und in den Vektor pUC 19 (Boehringer Mannheim) kloniert. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Thermo Sequenase-Zyklus-Sequenzierungskits mit radioaktiv markiertem Terminator und [33P]-Didesoxynukleotiden (Amersham Life Science, Amersham, GB) bestätigt. Das Konstrukt wurde als NdeI-bis-EcoRI-Fragment (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual Hrsg. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, USA) in den pET5c-Vektor (Promega UK Ltd., Southampton, GB) kloniert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Wizard® Plus SV Minipreps-DNA-Reingungssystems (Promega UK Ltd.) oder in einem größeren Maßstab mit dem Qiagen Plasmid Midi-Kit (Qiagen Ltd., Crawley, GB) präpariert. Das so erzeugte neue Plasmid wurde als pET5c FLAG-αPs scAb bezeichnet.
  • Der 340-scAb wurde hergestellt, indem VH und VK des 340-Antikörpers anstelle der α-Ps-VH und -VK in ppM1His eingesetzt wurden. Die 340-VH wurde mit den Primern 5'cagctgcaggagtctgggggaggcttag3' (Genosys) und
    5'tcagtagacggtgaccgaggttccttgaccccagta3' (Genosys) amplifiziert. Das Reaktionsgemisch umfasste 0,1 μg Matrizen-DNA, 2,6 Einheiten ExpandTM High Fidelity PCR-Enzymmix, Expand HF-Puffer, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs und 25 pmol von jedem Primer. Die Zyklen waren 96°C 5 Minuten, gefolgt von [95°C 1 Minute, 50°C 1 Minute, 72°C 1 Minute] mal 5, [95°C 45 Sekunden, 50°C 1 Minute, 72°C 1 Minute 30 Sekunden] mal 8, [95°C 45 Sekunden, 50°C 1 Minute, 72°C 2 Minuten] mal 5, wobei mit 72°C 5 Minuten geendet wurde. Das 357-bp-Produkt wurde mit PstI und BstEII gespalten und in mit PstI und BstEII gespaltenes pPM1His kloniert (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, s.o.). Ebenso wurde die 340-VK mit den Primern 5'gtgacattgagctcacacagtctcct3' und
    5'cagcccgttttatctcgagcttggtccg3' (Genosys) amplifiziert. Das 339-bp-Produkt wurde mit SstI und XhoI gespalten und in mit SstI und XhoI gespaltenes, modifiziertes pPM1His (vorstehend hergestellt) kloniert. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Thermo Sequenase-Zyklus-Sequenzierungskits mit radioaktiv markiertem Terminator und [33P]-Didesoxynukleotiden (Amersham) bestätigt. DNA für den 340-scAb im Vektor pPM1His wurde mit den Primern RD 5'HIS:
    5'gcggatcccatatgcaccatcatcaccatcaccaggtgcagctgcag3' (Genosys) und RD 3' (siehe oben) amplifiziert, die die 6 Histidinreste am 5'-Ende einführten bzw. das 3'-Stoppcodon entfernten. Die Reagenzien und Bedingungen für die Amplifizierung waren genau wie bei dem α-Ps-Konstrukt. Das erhaltene 1114-bp-Produkt wurde mit BamHI und EcoRI gespalten und in den Vektor pUC19 (siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, s.o.) kloniert. Die DNA-Sequenz wurde wie vorstehend bestätigt, und das Konstrukt wurde als NdeI-bis-EcoRI-Fragment in den pET5c-Veltor kloniert, um das Plasmid pEt5c HIS 340 scAb herzustellen.
  • Modellgene wurden derart modifiziert, dass sie eine Nukleinsäure-"Fangdomänen"-Sequenz enthielten. Die verwendeten synthetischen Oligonukleotide waren wie folgt:
    Fangdomäne:
    5'-aga ata cag ggt cca aat aga atc cag ggt
    cap3inner:
    5'-ctacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaataattc
    cap3outer:
    5'-agcgaattcaccctggattctatttggaccctgtattctacctataaaaatagg
    cap5inner:
    5'-ggtttccctctagaatacagggtccaaatagaatccagggtaagaaggagatatacatatg
    cap5outer:
    5'-atatatatgtcgacgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaatac
    T7loop:
    5'atatatatgtcgacgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacg
  • Die Fangdomänensequenz stammte von dem SFFV-Freund-Erythroleukämievirus, und von ihr ist zuvor gezeigt worden, dass sie keine komplementäre Sequenz in Säuger-cDNA-Datenbanken besitzt [Tavitian et al. (1998), Nature Medicine 4: 467–471]. Die Fangdomäne wurde entweder in die 5'-UTR-Region der oben be schriebenen Modellgene eingebracht oder in die 3'-Region dieser Gene fusioniert. Die Konstrukte wurden als CAPS- bzw. CAP3-Variante bezeichnet. Die Insertion der CAPS- und CAP3-Domänen wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern erzielt, die derart gestaltet waren, dass sie für jedes der verfügbaren Modellgene universell waren. Für die Insertion von CAPS wurden zwei serielle PCRs unter Verwendung der Primer CAPS inner und RD3, gefolgt von einer zweiten PCR mit den Primern CAPS outer und RD3, durchgeführt. Das erhaltene Produkt wurde gereinigt und direkt in einer In-vitro-Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die Insertion der CAP3-Domäne verlief gemäß dem gleichen Schema, wobei aber der Primer CAP3innner in der primären PCR mit dem Primer T7loop verwendet wurde, gefolgt von einer sekundären PCR unter Verwendung der Primer CAP3outer und T7loop. Das gereinigte Produkt wurde direkt in einer In-vitro-Transkriptionsreaktion eingesetzt. Die Transkriptionsreaktionen wurden unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase und des RiboMAX-Systems (Promega, Southampton GB) unter den vom Zulieferer empfohlenen Bedingungen durchgeführt.
  • RNA wurde an ein synthetisches DNA-Oligonukleotid hybridisiert, das kovalent an die Oberfläche einer Mikrotiterplatte gebunden war. Das Fangoligonukleotid hatte eine zu der Fangdomäne innerhalb der RNA komplementäre Sequenz. Bei einigen Experimenten wurde das Fangoligonukleotid über eine 5'-Amino-Linkereinheit angeheftet, und bei anderen Experimenten erfolgt die Anheftung über das 3'-Ende des Moleküls. Mikrotiterplatten mit angehefteten Oligonukleotiden wurden vertragsgemäß von GenoSys Biotechnologies Europe Ltd. (Cambridge, GB) geliefert. Die Hybridisierungsreaktion wurde für 60 Minuten bei 55°C in einem Reaktionspuffer, der Tetramethylammoniumchlorid enthielt, wie von Maskos und Southern (Maskos U & Southern E.M. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 1675–1678) beschrieben, durchgeführt. Die Waschschritte nach der Hybridisierung erfolgten bis zu hochstringenten Bedingungen unter Verwendung von Verdünnungen eines SSPE-Puffers, der 0,1% (Vol./Vol.) SDS enthielt, (1 × SSPE-Puffer = 180 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat pH 7,7, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure).
  • Nach dem letzten Waschschritt wurde eine In-vitro-Translationsreaktion durch Zugabe von 25 μl Kaninchenretikulozytenlysat (Promega), das mit einem vollständigen Aminosäuregemisch angereichert war, gestartet. Bei einigen Experimenten wurde ein Aminosäuremix minus Methionin verwendet, in diesem Fall wurde 35S-Methionin (Amersham) hinzugefügt. Die Translationsreaktion erfolgte bei 30°C für 60 Minuten und wurde dann auf Eis gestellt. Die Vertiefungen wurden unter Verwendung von eiskaltem PBS, das 1% (Gew./Vol.) BSA enthielt, gewaschen. Die Translationsprodukte wurden unter Verwendung von Antikörpern gegen entweder das Flag- oder das his6-Epitop, die gentechnologisch in jedes der Modellgenkonstrukte eingeführt worden waren, nachgewiesen. Die Antikörper wurden in PBS verdünnt zu den gewaschenen Vertiefungen gegeben. Die Inkubationen erfolgten für 60 Minuten bei 4°C unter leichtem Schütteln. Ein Sekundärreagenz (Anti-Maus-HRP-Konjugat) wurde in der empfohlenen Verdünnung in PBS hinzugegeben und für weitere 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden vor der Farbentwicklung mit dem chromogenen Substrat dreimal unter Verwendung von 200 μl PBS gewaschen. Die Platten wurden bei 492 nm gelesen. Wenn 35S-Methionin zum Reaktionsmix gegeben worden war, wurden die Translationsprodukte mittels Szintillationszählung nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten eine erfolgreiche Immobilisierung des richtigen Proteins aufgrund der Anheftung an seine mit ihm verbundene mRNA, die wiederum aufgrund der komplementären Sequenzregion an die entsprechende DNA hybridisierte.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001

Claims (10)

  1. Verfahren zum Screenen von Proteinen oder Polypeptiden zur Identifizierung eines biologisch aktiven Proteins oder Polypeptids von Interesse, umfassend die Schritte: (i) Herstellen einer Genbank, (ii) Exprimieren synthetischer Proteine oder Polypeptide aus der Polynukleotid-Bank, wobei die Polynukleotide in einer Anordnung verteilt sind, durch eine In-vitro-Transkription und Translation (IVTT), wodurch eine Anordnung von individuell identifizierbaren Proteinen oder Polypeptiden erzeugt werden. (iii) Immobilisieren der Proteine oder Polypeptide in der durch Schritt ii erhaltenen Anordnung, (iv) Zusammenbringen der immobilisierten Proteine oder Polypeptide in der Anordnung von Schritt iii mit einer Probe, (v) Auswählen einzelner Proteine oder Polypeptide, für die Wechselwirkungen mit der Probe nachgewiesen wurden, aus der Anordnung von Schritt iv, und (vi) Identifizieren des aus Schritt v ausgewählten Proteins oder Polypeptids von Interesse, durch Sequenzieren des entsprechenden Polynukleotids aus der ursprünglichen Genbank, die das ausgewählte Protein oder Polypeptid codieren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Genbank eine DNA- oder RNA-Bank ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Immobilisation auf festen Phasen erzielt wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die feste Phase eine Mikrotiterplatte ist, wobei die Proteine oder Polypeptide an bestimmten Stellen auf der Oberfläche der Platte an bestimmten Stellen immobilisiert sind.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Wechselwirkungen mit den Proben Protein-Protein-Bindungs-Wechselwirkungen sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Protein-Protein-Wechselwirkungen zu einer enzymatischen Modifikation der synthetischen Proteine oder Polypeptide in der Anordnung führen..
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Probe ein spezifisches Gewebemolekül, ein spezifisches Zellmolekül, ein Zellextrakt oder ein Gewebeextrakt ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Probe eine Kontrollprobe, die nicht von einem spezifischen Erkrankungs-, Gesundheitsfürsorge- oder Medikamentenbehandlungsstatus betroffen ist und eine erkrankte Probe umfasst, die von einem spezifischen Erkrankungs-, Gesundheitsfürsorge- oder Medikamentenbehandlungsstatus betroffen ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Genbank eine cDNA-Bank ist, die Polynukleotide umfasst, welche einzelkettige Antikörper (SCA) codieren.
  10. Verfahren für Hochdurchsatz-Analyse-Proteine- oder -Polypeptide in normalen und erkrankten Geweben oder Zellen, um die Unterschiede zwischen normalen und erkrankten Proteinen nachzuweisen, wobei das Verfahren die Schritte nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst, wobei eine Kontrollprobe verwendet wird, die nicht von einem spezifischen Erkrankungs-, Gesundheitsfürsorge- oder Medikamentenbehandlungsstatus betroffen ist, und eine Probe verwendet wird, die von einem spezifischen Erkrankungs-, Gesundheitsfürsorge- oder Medikamentenbehandlungsstatus betroffen ist.
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