DE69736239T2

DE69736239T2 - Magnetisch aktivierte zellsortierung zur herstellung von proteinen

Info

Publication number: DE69736239T2
Application number: DE69736239T
Authority: DE
Inventors: L. Donald Hatboro SIEGEL
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2017-10-11
Also published as: JP2002503085A; EP0935604A4; AU4824797A; JP4101298B2; US5876925A; CA2268397C; DE69736239D1; CA2268397A1; ES2267134T3; ATE331727T1; AU722978B2; WO1998016541A1; EP0935604A1; EP0935604B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Fähigkeit, monoklonale Antikörper herzustellen, hat die diagnostische und therapeutische Medizin revolutioniert. Monoklonale Antikörper werden typischerweise durch Immortalisieren von Antikörper-produzierenden Lymphozyten der Maus hergestellt, wodurch ein unendlicher Vorrat an Zellen sichergestellt wird, die Maus-Antikörper produzieren. Jedoch ist es für viele humane Anwendungen wünschenswert, humane Antikörper zu produzieren. Zum Beispiel ist es vorzuziehen, dass Antikörper, welche Menschen zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken verabreicht werden, humane Antikörper sind, da die Verabreichung humaner Antikörper an Menschen mögliche Immunreaktionen gegen den verabreichten Antikörper umgehen, wobei diese Reaktionen den Zweck, zu dem der Antikörper verabreicht wurde, zunichte machen können.
Darüber hinaus gibt es bestimmte Situationen, in denen es für diagnostische Zwecke erforderlich ist, dass humane Antikörper verwendet werden, da andere Tiere unfähig sind, Antikörper gegen das in dem diagnostischen Verfahren zu detektierende Antigen zu produzieren. Zum Beispiel muss, um den Rh-Phänotyp von humanen roten Blutkörperchen (red blood cells, RBC) zu bestimmen, humanes Serum verwendet werden, das anti-Rh Antikörper enthält, da andere Tiere einen Antikörper, der fähig zum Nachweis des humanen Rh-Antigens ist, nicht produzieren können.
Die Herstellung humaner Antikörper in vitro durch Immortalisieren von humanen B-Lymphozyten unter Verwendung der Epstein Barr Virus (EBV)-vermittelten Transformation oder Zellfusion war aufgrund der relativ geringen Effizienz sowohl der EBV-initiierten Transformation als auch der Zellfusion im Vergleich zu dem murinen System voller technischer Schwierigkeiten. Um diese Probleme zu überwinden, wurden Techniken für die Produktion humaner Antikörper unter Verwendung des M13 Bakteriophagendisplays entwickelt (Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57. 191-280). Im wesentlichen wird dabei eine cDNA-Bibliothek von mRNA erzeugt, die aus einer Population von Antikörper-produzierenden Zel len erhalten wurde. Die mRNA kodiert für rearrangierte Immunglobulin (Ig)-Gene und folglich kodiert die cDNA für dieselben. Amplifizierte cDNA wird in M13 Expressionsvektoren kloniert, wodurch eine Phagenbibliothek erzeugt wird, welche humane Fab-Fragmente auf ihrer Oberfläche exprimiert. Phagen, welche den Antikörper von Interesse aufweisen, werden durch Antigenbindung selektiert und in Bakterien propagiert, um lösliches humanes Fab Ig zu produzieren. Im Gegensatz zur konventionellen Synthese von monoklonalen Antikörpern immortalisiert dieses Verfahren die DNA, welche für humanes Ig kodiert, eher als die Zellen, welche humanes Ig exprimieren.
Mit der Erzeugung von Antikörpern unter Verwendung von Bakteriophagen sind verschiedene Schwierigkeiten verbunden. Zum Beispiel können viele Proteine nicht in einem nicht-denaturierten Zustand gereinigt werden, da Reinigungsverfahren notwendigerweise ein Löslichmachen des Proteins beinhalten, was einige Proteine in einen permanent denaturierten Zustand versetzt, mit einhergehender Zerstörung der auf ihnen vorhandenen antigenen Bereiche. Solche Proteine können folglich nicht an eine feste Phase gebunden werden und können daher nicht zur Selektion von Phagen, die Antikörper tragen, die an sie binden, durch Panning verwendet werden.
Um das Problem zu lösen, wurde ein Verfahren entwickelt, in dem intakte RBCs als Panning-Antigene verwendet wurden (Siegel et al., 1994, Blood 83: 2334-2344). Da Phagen inhärent „klebrig" sind und RBCs eine Vielzahl von Antigenen auf der Zelloberfläche exprimieren, wurde jedoch festgestellt, dass sich eine hinlängliche Menge an Phagen, die nicht den geeigneten Antikörper auf der Oberfläche exprimieren, ebenfalls an die RBCs anheften, wodurch das Verfahren zur Isolation von Phagen, die Antikörper der gewünschten Spezifität exprimieren, unpraktikabel wird.
De Kruif et al. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3938-3942) offenbaren ein Verfahren zum Isolieren von für Antikörper kodierenden Phagen, wobei die Antikörper-exprimierenden Phagen mit einer Mischung aus Antigen-exprimierenden Zellen und Zellen, die kein Antigen exprimieren, inkubiert werden. Die Antikörper-exprimierenden Phagen binden an die Antigen-exprimierenden Zellen. Nach der Bindung mit den Phagen wird ein fluoreszentmarkierter Antikörper spezifisch zu den antigen-exprimierenden Zellen gegeben, wobei die Zellen mit den daran gebundenen Antikörper-exprimierenden Phagen aus der Mischung entfernt werden. Die Isolation von fluoreszent-markierten Zellen wird unter Verwendung der Methode der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (fluorescently-activated cell sorting, FACS) erreicht, einem teuren und zeitaufwändigen Verfahren.
Es bleibt ein Bedarf nach einem Verfahren zum Isolieren rekombinanter Proteine, vorzugsweise Antikörper, das schnell und wirtschaftlich ist und das eine umfangreiche Reihe von Protein-bindenden Proteinen zur Verfügung stellen wird, die nützlich für diagnostische und therapeutische Anwendungen bei Menschen sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Isolieren einer DNA, die für ein Protein kodiert, welches die Erzeugung einer DNA-Bibliothek in einem das Protein exprimierenden Virusvektor umfasst, wobei das Protein auf der Oberfläche des Virusvektors exprimiert wird, und das Protein zur Bindung an einen Antigen-tragenden Rest fähig ist; die Zugabe einer magnetischen Markierung zu den Zellen, die den Antigen-tragenden Rest exprimieren; das Inkubieren des Virus, der das Protein exprimiert, mit den magnetisch markierten Zellen in der Gegenwart eines Überschusses an unmarkierten Zellen, die den Antigen-tragenden Rest nicht exprimieren, um eine Mischung zu bilden, wobei das Virus an die magnetisch markierten Zellen bindet; sowie das Isolieren der an den Virus gebundenen Zellen aus der Mischung und das Erhalten von für das Protein kodierender DNA daraus.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zum Isolieren eines Proteins, das die Erzeugung einer DNA-Bibliothek in einem das Protein exprimierenden Virusvektor umfasst, wobei das Protein auf der Oberfläche des Virusvektors exprimiert wird und das Protein fähig ist, an einen Antigen-tragenden Rest zu binden; die Zugabe einer magnetischen Markierung zu den Zellen, welche den Antigen-tragenden Rest exprimieren; das Inkubieren des das Protein exprimierenden Virus mit den magnetisch markierten Zellen in der Gegenwart eines Überschusses an unmarkierten Zellen, die den Antigen-tragenden Rest nicht exprimieren, um eine Mischung zu bilden, wobei das Virus an die magnetisch markierten Zellen bindet; das Isolieren der an den Virus gebundenen Zellen aus der Mischung und das Isolieren des Proteins daraus.
In einem Aspekt ist der Virusvektor ein Bakteriophage und in einem anderen Aspekt ist der Bakteriophage M13.
In einem Aspekt der Erfindung ist das Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Liganden und einem Hormon, und in einem anderen Aspekt ist das Protein ein Antikörper, der ein anti-rotes Blutkörperchen Oberflächenantigen Antikörper ist, wie zum Beispiel ein anti-Rh rotes Blutkörperchen Antikörper.
In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung ist der Antigen-tragende Rest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Protein, einem Lipid, einem Kohlenhydrat, einer Nukleinsäure und einem Komplex aus mindestens einem Protein, einem Lipid, einem Kohlenhydrat und einer Nukleinsäure.
Der Antigen-tragende Rest kann ein Membran-gebundenes Protein sein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen und einem Rezeptor. In einem weiteren Aspekt ist das Membran-gebundene Protein ein Antigen, wie zum Beispiel ein rotes Blutkörperchen-Antigen, wie zum Beispiel ein Rh-Antigen.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zum Isolieren einer DNA, die für ein Protein kodiert, das fähig zur Bindung an einen Antigen-tragenden Rest ist, welches das Erzeugen einer synthetischen DNA-Bibliothek in einem das Protein exprimierenden Virusvektor umfasst; die Zugabe einer magnetischen Markierung zu Zellen, welche den Antigen-tragenden Rest exprimieren; das Inkubieren des das Protein exprimierenden Virus mit den magnetisch markierten Zellen in der Gegenwart eines Überschusses an unmarkierten Zellen, welche den Antigen-tragenden Rest nicht exprimieren, um eine Mischung zu bilden, wobei das Virus an die magnetisch markierten Zellen bindet; das Isolieren von an den Virus gebundenen Zellen aus der Mischung und das Erhalten der das Protein kodierenden DNA daraus.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zum Isolieren eines Proteins, das fähig zur Bindung an einen Antigen-tragenden Rest ist, welches das Erzeugen einer synthetischen DNA-Bibliothek in einem das Protein exprimierenden Virusvektor umfasst; die Zugabe einer magnetischen Markierung zu den den Antigen-tragenden Rest exprimierenden Zel len; das Inkubieren des das Protein exprimierenden Virus mit den magnetisch markierten Zellen in der Gegenwart eines Überschusses an unmarkierten Zellen, welche den Antigen-tragenden Rest nicht exprimieren, um eine Mischung zu bilden, wobei das Virus an die magnetisch markierten Zellen bindet; das Isolieren der an den Virus gebundenen Zellen aus der Mischung und das Isolieren des Proteins daraus.
Außerdem werden Verfahren zur Verfügung gestellt, in denen ein Protein isoliert wird, welches fähig ist, an einen Antigen-tragenden Rest zu binden. Die Verfahren umfassen das Exprimieren des Proteins von der für das Protein kodierenden DNA, wobei die DNA durch hierin beschriebene Verfahren erhalten wird, und das Isolieren des so exprimierten Proteins.
Ebenfalls von der Erfindung umfasst ist eine isolierte DNA, die für ein gemäß den hierin beschriebenen Verfahren erhaltenes Protein kodiert.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine im wesentlichen reine Herstellung eines Proteins, das gemäß den hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurde.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm einer Strategie für das Zelloberflächen-Fab Phagen-Panning unter Verwendung der magnetisch aktivierten Zellsortierung.
2 ist ein Graph, der die Zelloberflächen-Biotinylierung von humanen RBCs zeigt.
3 ist eine Serie von Diagrammen, welche das Antigen-positive, Antigen-negative Zellsortierungsverfahren gemäß der Erfindung bestätigt.
4 ist ein Bild eines Mikroplatten-Agglutinationsassays, in dem der anti-Rh(D) Fab/Phagen-Agglutinationstiter gemessen wurde.
5 ist ein Bild eines Mikroplatten-Agglutinationsassays, das die Bestimmung des Rh(D)-Bindungsepitops für ausgewählte anti-Rh(D) Fab/Phagenklone zeigt.
6 ist ein Bild, welches die Verwendung der Fab/Phagen Antikörper in einem Gelkarten-Assay zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren zum Isolieren einer für ein Protein kodierende DNA und des durch sie kodierten Proteins zur Verfügung gestellt, wobei das Protein vorzugsweise ein Antikörper ist und wobei das genannte Protein fähig ist, spezifisch an einen Antigen-tragenden Rest zu binden.
Wie hierin beispielhaft gezeigt wird, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, umfasst das Verfahren das Erzeugen von Bakteriophagen, die für humane Antikörper kodieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden im Speziellen anti-Rh(D) RBC Fab/Phagen Antikörper, die von einer M13 filamentösen Phagenbibliothek kodiert werden, erhalten. Die Bibliothek wird aus Antikörper-produzierenden Zellen erzeugt, die von einem hyperimmunisierten Donor erhalten wurden, indem zunächst die cDNA gewonnen wird, die von der in den Antikörperproduzierenden Zellen exprimierten mRNA abgeleitet ist. Unter Verwendung der Polymerasenkettenreaktion (PCR) und spezifischen Primern für solche DNA-Fragmente werden für Ig kodierende Fragmente der cDNA erhälten. Die so erhaltene Ig-spezifische DNA wird in einen Bakteriophagen kloniert. Bakteriophagen, welche für die Ig-Fragmente kodieren, werden durch Panning gegen eine Mischung aus Antigen-positiven, biotynilierten RBC-Zielzellen, die mit Streptavidin-konjugierten magnetischen Mikrokügelchen vorbeschichtet wurden und einem Überschuss an unmarkierten RBCs selektiert. Bakteriophagen, welche Antikörper auf der Phagenoberfläche exprimieren, wobei die Antikörper spezifisch für das Zielzell-Antigen sind, binden an die markierten Zellen. Diese Phagen werden von den Phagen, die an unmarkierte Zellen gebunden sind sowie von Phagen, die nicht an die Zellen gebunden sind, unter Verwendung einer magnetischen Säule getrennt. Die so getrennten Phagen kodieren und zeigen einen Antikörper, der spezifisch für Antigene auf den Zielzellen ist.
Um eine Phagen-Antikörper-Bibliothek zu erzeugen, wird zunächst eine cDNA-Bibliothek aus mRNA erhalten, die aus Zellen isoliert wurde, die das gewünschte Protein, das auf der Phagenoberfläche exprimiert werden soll, zum Beispiel den gewünschten Antikörper, expri miert. cDNA-Kopien der mRNA werden unter Verwendung der reversen Transkriptase hergestellt. cDNA, die Ig-Fragmente spezifiziert, wird durch PCR erhalten, und die resultierende DNA wird in einen geeigneten Bakteriophagenvektor kloniert, um eine Bakteriophagen-DNA-Bibliothek zu erzeugen, welche DNA enthält, die für Ig-Gene spezifisch ist. Die Techniken zur Herstellung einer Bakteriophagenbibliothek, die heterologe DNA umfasst, sind auf dem Gebiet wohlbekannt und werden zum Beispiel in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben.
Eine Bakteriophagenbibliothek kann außerdem unter Verwendung von cDNA anstelle von PCR-amplifizierten für Ig kodierenden cDNA-Fragmenten erhalten werden. Die Erzeugung einer cDNA-Bibliothek ist nützlich zur Isolation von Proteinen, die nicht Antikörper sind, wie zum Beispiel Liganden und dergleichen.
Bakteriophagen, welche für das gewünschte Protein, zum Beispiel einen Antikörper, kodieren, können so verändert werden, dass das Protein auf ihrer Oberfläche in einer solchen Weise dargestellt wird, dass es für die Bindung an sein zugehöriges Bindungsprotein zur Verfügung steht, zum Beispiel das Antigen, gegen das der Antikörper gerichtet ist. Folglich werden die Bakteriophagen, wenn die einen spezifischen Antikörper exprimierenden Phagen in Gegenwart einer Zelle inkubiert werden, die das dazugehörige Antigen exprimiert, an die Zelle binden. Bakteriophagen, welche den Antikörper nicht exprimieren, werden nicht an die Zelle binden.
Zum Panning der Bakteriophagen, d. h. der Selektion von Phagen, die den gewünschten Antikörper exprimieren, werden Zellen, die das entsprechende Antigen exprimieren, mit einer nachweisbaren Markierung wie zum Beispiel Biotin markiert. Streptavidin-konjugierte magnetische Kügelchen werden anschließend zu den Zellen gegeben. Die Zellen werden mit einem Überschuss an unmarkierten Zellen, die das Antigen nicht exprimieren, gemischt. Diese Zellmischung wird anschließend mit der Phagenbibliothek inkubiert, wobei die den Antikörper exprimierenden Phagen an die das Antigen exprimierenden Zellen binden. Die Gegenwart des Überschusses an unmarkierten Zellen in der Mischung dient als Mittel zum Entfernen von Bakteriophagen, die den Antikörper nicht exprimieren, die jedoch auf andere Weise unspezifisch an die Antigen-exprimierenden Zellen binden könnten. Die Details der experimentellen Vorgehensweisen zur Ausführung der vorliegenden Erfindung werden hierin in dem Abschnitt zu den experimentellen Details zur Verfügung gestellt.
Antigen-exprimierende Zellen, die einen an sie gebundenen Antikörper-exprimierenden Phagen aufweisen, werden magnetisch aus der Mischung entfernt. Ein Beispiel der magnetischen Trennung umfasst das Auftragen der Mischung aus magnetischen und nicht magnetischen Zellen auf eine Säule in der selektiven Gegenwart oder Abwesenheit eines magnetischen Feldes, welches die Säule umgibt. Alternativ können die magnetischen Zellen von den nicht magnetischen Zellen in Lösung getrennt werden, indem einfach ein Magnet an die Seite eines Teströhrchens gehalten wird und die Zellen an die Innenwand anzieht und anschließend die nicht magnetischen Zellen vorsichtig aus der Lösung entfernt werden.
Folglich umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung eine Methode zur Anreicherung einer Population rekombinanter Phagen mit solchen Phagen, welche die spezifischen auf den Phagen gezeigten Liganden exprimieren, die aus natürlichen oder synthetischen Phagen DNA-Bibliotheken stammen, indem gleichzeitig eine negative und positive Selektion gegen eine Mischung aus magnetisch-markierten Rezeptor-positiven Partikeln (d. h. Zellen) und unmarkierten Rezeptor-negativen Partikeln durchgeführt wird.
Die Begriffe „Bakteriophage" und „Phage" werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Viren, die Bakterien infizieren. Durch die Verwendung der Begriffe „Bakteriophagenbibliothek" oder „Phagenbibliothek", wie hierin verwendet, wird eine Population von Bakterienviren bezeichnet, die heterologe DNA umfassen, d. h. DNA, die normalerweise nicht durch das Bakterienvirus kodiert wird.
Der Begriff „Virusvektor" schließt einen Virus ein, in den eine heterologe DNA insertiert wurde. Der Virusvektor kann ein Bakteriophage sein oder kann ein eukaryontischer Virus sein.
Durch den Begriff „Zielzelle", wie hierin verwendet, wird eine Zelle bezeichnet, die ein Antigen exprimiert, gegen welches der gewünschte Antikörper angestrebt wird.
Durch die Bezeichnung „Panning" oder „durch Panning selektiert", wie hierin verwendet, wird der Vorgang des Auswählens eines Phagens, der für den gewünschten Antikörper kodiert, bezeichnet.
Durch den Begriff „Fab/Phage", wie hierin verwendet, wird ein Phagenpartikel bezeichnet, der den Fab-Teil eines Antikörpers exprimiert.
Durch den Begriff „scFv/Phage", wie hierin verwendet, wird ein Phagenpartikel bezeichnet, der den Fv-Teil eines Antikörpers als Einzelkette exprimiert.
Durch „Überschuss an unmarkierten Zellen" wird eine Menge an unmarkierten Zellen bezeichnet, welche die Anzahl markierter Zellen überschreitet. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis von markierten Zellen zu unmarkierten Zellen etwa 1 : 2. Bevorzugter ist das Verhältnis von markierten Zellen zu unmarkierten Zellen größer als etwa 1 : 4. Noch bevorzugter ist das Verhältnis von markierten Zellen zu unmarkierten Zellen größer als etwa 1 : 10.
Während das Verfahren gemäß der Erfindung, wie hierin beispielhaft dargestellt, die Erzeugung von Phagen beschreibt, die für den Fab-Teil eines Antikörpermoleküls kodieren, sollte das Verfahren nicht als allein auf die Erzeugung eines für Fab Antikörper kodierenden Phagens beschränkt gesehen werden. Vielmehr sind Phagen, die für Einzelketten-Antikörper (scFv/Phagen-Antikörperbibliotheken) kodieren, ebenfalls von der Erfindung umfasst. Fab-Moleküle umfassen die gesamte Ig leichte Kette, d. h., sie umfassen sowohl die variable als auch die konstante Region der leichten Kette, umfassen jedoch nur die variable Region und die erste Domäne der konstanten Region (CH1) der schweren Kette. Einketten Antikörpermoleküle umfassen eine einzige Kette des Proteins, welches das Ig Fv-Fragment umfasst. Ein Ig Fv-Fragment umfasst nur die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers, wobei darin keine konstante Region enthalten ist. Phagenbibliotheken, die scFV-DNA umfassen, können erzeugt werden, indem den in Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597 beschriebenen Verfahren gefolgt wird. Das Panning der so erzeugten Phagen zur Isolation eines gewünschten Antikörpers wird wie hierin für Phagenbibliotheken beschrieben, die Fab-DNA umfassen, durchgeführt.
Die Erfindung ist ferner so aufzufassen, dass sie synthetische Phagen-Displaybibliotheken umfasst, in welchen die variablen Regionen der schweren und leichten Kette so synthetisiert werden können, dass sie fast sämtliche mögliche Spezifitäten einschließen. Daher können Antikörper-Displaybibliotheken „natürlich" oder „synthetisch" sein (Barbas, 1995, Nature Medicine 1: 837-839; de Kruif et al. 1995, J. Mol. Biol. 248: 97-105). Antikörper-Displaybibliotheken, die „natürliche" Antikörper umfassen, werden wie in dem experimentellen Beispielabschnitt beschrieben erzeugt. Antikörper-Displaybibliotheken, die „synthetische" Antikörper umfassen, werden erzeugt, indem dem in Barbas (1995, s. o.) beschriebenen Verfahren und den dann zitierten Referenzen gefolgt wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist weiterhin so zu verstehen, dass es die Erzeugung von Phagen-Displaybibliotheken, welche andere Phagen als M13, wie hierin veranschaulicht, umfasst. Andere Bakteriophagen, wie zum Beispiel der Lambda-Phage, können ebenfalls nützlich in dem Verfahren gemäß der Erfindung sein. Lambda-Phagen-Displaybibliotheken, die durch heterologe DNA kodierte Peptide auf ihrer Oberfläche darstellen, wurden erzeugt (Sternberg et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1609-1613). Darüber hinaus ist vorgesehen, dass das Verfahren gemäß der Erfindung auf andere Viren als Bakteriophagen ausgeweitet werden können, wie zum Beispiel auf eukaryontische Viren. Tatsächlich können eukaryontische Viren erzeugt werden, welche für Gene kodieren, die für die Verabreichung an einen Säugers geeignet sind und die für einen Antikörper kodieren und einen Antikörper tragen, der fähig ist, eine spezifische Zellart oder ein spezifisches Gewebe zu targeten, an welche(s) das Gen verabreicht werden soll. Zum Beispiel wurden retrovirale Vektoren erzeugt, die funktionelle Antikörperfragmente aufweisen (Russels, et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 1081-1085).
Die Antigene der roten Blutkörperchen, gegen welche Antikörper erzeugt werden können, schließen Rh-Antigene, einschließlich Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e) und andere Nicht-Rh-Antigene ein, einschließlich der roten Blutkörperchen-Antigene in den Kell-, Duffy-, Lutheran- und Kidd-Blutgruppen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Folglich ist das Verfahren gemäß der Erfindung nicht allein auf die Isolation von DNA beschränkt, die für anti-Rh(D) Antikörper kodiert, sondern kann vielmehr für die Isolation von DNA verwendet werden, die für Antikörper kodiert, die gegen jegliche RBC-Antigene oder andere Zellantigene, wie zum Beispiel das Tumor-spezifische Antigen, gegen bakterielle Antigene und dergleichen gerichtet sind, wobei sie nicht auf diese beschränkt sind. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist außerdem nützlich zur Typisierung von Blutplättchen durch Erzeugen von Phagenantikörpern, die spezifisch für eine Anzahl klinisch wichtiger Blutplättchen-Antigene sind, vor allem für P1^A1/P1^A2, Bak^a/Bak^b, Pen^A/Pen^B und dergleichen.
Die Erfindung ist weiterhin nützlich zur Typisierung von weißen Blutzellen von Spendern aufgrund von HLA-Antigenen zum Zwecke der Zuordnung von Spendern und Empfängern für die potentielle Transplantatzuordnung im Falle der Transplantation sowohl von soliden (zum Beispiel Niere, Herz, Leber, Lunge) als auch von nicht-soliden (zum Beispiel Knochenmark) Organen und Geweben.
Um die Bindung eines Phagen nachzuweisen, der einen gegen eines dieser nicht von roten Blutkörperchen stammendes Antigen gerichteten Antikörper exprimiert, können die nichtroten Blutzellen agglutiniert oder zurückgehalten werden, indem das hierin für die Agglutination oder das Trapping von roten Blutkörperchen beschriebene Verfahren verwendet wird. Vor der Agglutination oder dem Trapping können die Zellen durch Färben oder andere Markierungsmethoden „sichtbar" gemacht werden, damit die Agglutination oder das Trapping für das bloße Auge oder den Scanner sichtbar wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist am Nützlichsten zur Erzeugung eines Proteins, das an einen Antigen-tragenden Rest bindet, wobei der Antigen-tragende Rest nicht leicht in löslicher Form zu reinigen ist. Folglich schließt der Antigen-tragende Rest Antigene ein, die mit anderen Strukturen assoziiert sind, gewöhnlich Membranen in der Zelle, wie zum Beispiel Zellmembranen oder Membranen der Zellorganellen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann der Antigen-tragende Rest ein Protein, ein Lipid, ein Kohlenhydrat oder eine Nukleinsäure sein, oder er kann ein Komplex aus wenigstens zwei Teilen eines Proteins, eines Lipids, eines Kohlenhydrates oder einer Nukleinsäure sein, wobei klar ist, dass viele Antigen-tragende Reste in Zellen nicht aus einer dieser Komponenten allein zusammengesetzt sind. Vorzugsweise ist der Antigen-tragende Rest ein Membran-gebundenes Protein, wie zum Beispiel ein Antigen oder ein Rezeptorprotein. Jedoch kann er, falls der Antigen-tragende Rest ein Kohlenhydrat ist, ein Kohlenhydrat sein, das auf einem Glycolipid exprimiert wird, zum Beispiel ein P-Blutgruppen-Antigen oder ein anderes Antigen.
Durch den Begriff „Antigen-tragender Rest", wie hierin verwendet, wird ein Molekül bezeichnet, an welches der Antikörper bindet.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist außerdem nützlich zur Erzeugung von Autoimmunantikörpern, wie zum Beispiel solcher, die an der autoimmun-hämolytischen Anämie (AIHA) beteiligt sind (Siegel et al., 1994, Structural analysis of red cell autoantibodies, Garratty (Herausg.) Immunobiology of Transfusion Medicine, Dekker, New York, New York). Autoimmunantikörper, die gegen Zellantigene gerichtet sind, welche mit der Zelloberflächenmembran assoziiert sind oder mit der Membran von Zellorganellen, können unter Verwendung der hierin beschriebenen Methode isoliert werden. Autoimmunkrankheiten und ihre assoziierten Antigene, gegen welche Antikörper isoliert werden können, schließen die folgenden ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Myasthenia gravis (Acetylcholinrezeptor; Neuronen), chronisch entzündliche demyelisierende Polyneuropathy (Myelin; Neuronen), autoimmune Schilddrüsenerkrankung (Thyreoidea-stimulierendes Hormon Rezeptor; Thyreoidzellen), primäre biliäre Zirrhose (mitochondriale Autoantigene; Lebermitochondrien), idiopathische thrombocytopenische Purpura (Blutplättchenmembranintegrine, Blutplättchen), Pemphigus vulgaris (epidermale Antigene, Epidermis) und Goodpasture-Syndrom (Basalmembranantigene; Nieren- und Lungenzellen).
Tatsächlich ist das Verfahren gemäß der Erfindung nützlich zur Isolation von DNA-Klonen, die für irgendeinen gegen ein auf einer Zelle exprimiertes Antigen gerichteten Antikörper kodieren, wobei die Zelle mit einer magnetischen Markierung markiert werden kann, und wobei die Zelle in ausreichenden Mengen in einer nicht markierten Form erhalten werden kann, um einen Überschuss an unmarkierten Zellen, wie er in dem Assay benötigt wird, zur Verfügung zu stellen.
Darüber hinaus ist das Verfahren gemäß der Erfindung nicht auf die Isolation von DNA beschränkt, die für Antikörper kodiert, sondern kann vielmehr ebenso zur Isolation von DNA verwendet werden, die für andere Peptide oder Proteine kodiert, welche eine Spezifität für Zellproteine aufweisen, wie zum Beispiel Liganden, die Zellrezeptorproteine binden, Peptidhormone und dergleichen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Die Erfindung sollte außerdem nicht als auf die Verwendung von Biotin als das Mittel zur Zellmarkierung beschränkt betrachtet werden. Andere Markierungen können verwendet werden, vorausgesetzt dass ihre Zugabe zu einer Zelle die strukturelle Integrität jeglicher darauf exprimierter Oberflächenproteine nicht stört und vorausgesetzt, dass solche Markierungen die Zugabe paramagnetischer Mikrokügelchen oder anderer magnetischer Substanzen erlauben. Andere solche Markierungen schließen Zelloberflächenproteine oder Kohlenhydrate ein, die direkt mit magnetischen Kügelchen derivatisiert werden können und die aktivierte Amin-, Carboxyl- oder Thiolgruppen besitzen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Darüber hinaus können Farbstoffe wie zum Beispiel Fluorescein oder Rhodamin ebenfalls kovalent an die Zellen angefügt werden, in ähnlicher Weise wie Biotin, und magnetische Kügelchen, die mit anti-Farbstoff Antikörpern beschichtet sind, können daran angefügt werden.
Die Erfindung umfasst Proteine und die für dieselben kodierenden DNAs, welche unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren erzeugt werden. Um die für einen Antikörper kodierende DNA zu isolieren, wird die DNA zum Beispiel aus Antikörper-exprimierenden Phagen extrahiert, die in Übereinstimmung mit den Verfahren gemäß der Erfindung erhalten werden. Solche Extraktionsmethoden sind auf dem Gebiet wohlbekannt und zum Beispiel in Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben.
Eine „isolierte DNA", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, ein Segment oder ein Fragment, das von den Sequenzen gereinigt wurde, die sie in einem natürlich vorkommenden Zustand flankieren, wie zum Beispiel ein DNA-Fragment, das von den Sequenzen abgetrennt wurde, die normalerweise benachbart zu dem Fragment liegen, wie zum Beispiel die Sequenzen, die zu dem Fragment in einem Genom, in dem es natürlicherweise vorkommt, benachbart sind. Der Begriff ist auch auf eine DNA anwendbar, die im wesentlichen von anderen Komponenten, welche natürlicherweise mit der DNA assoziiert sind, wesentlich gereinigt sind, zum Beispiel RNA oder DNA oder Proteine, die normalerweise in der Zelle gemeinsam mit ihr vorkommen.
Die Erfindung sollte außerdem so aufgefasst werden, dass sie DNAs umfasst, die im wesentlichen homolog zu der gemäß dem Verfahren der Erfindung isolierten DNA sind. Vorzugsweise ist die DNA, die im wesentlichen homolog ist, etwa 50 % homolog, bevorzugt etwa 70 %, noch bevorzugter etwa 80 % homolog und am meisten bevorzugt etwa 90 % homolog zu der unter Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung erhaltenen DNA.
„Homolog", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Sequenzähnlichkeit einer Untereinheit zwischen zwei polymeren Molekülen, zum Beispiel zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen, zum Beispiel zwei DNA-Molekülen oder zwei RNA-Molekülen, oder zwischen zwei Peptidmolekülen. Wenn eine Position einer Untereinheit in beiden Molekülen von derselben monomeren Untereinheit besetzt ist, zum Beispiel wenn eine Position in jeder der beiden DNA-Moleküle durch ein Adenin besetzt ist, dann sind sie an dieser Position homolog. Die Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine direkte Funktion der Anzahl von übereinstimmenden oder homologen Positionen, zum Beispiel wenn die Hälfte (zum Beispiel 5 Positionen in einem Polymer mit einer Länge von 10 Untereinheiten) der Positionen in zwei Sequenzen der Verbindung homolog sind, dann sind die beiden Sequenzen 50 % homolog, wenn 90 % der Positionen, zum Beispiel 9 von 10 übereinstimmen oder homolog sind, dann teilen diese Sequenzen 90 % Homologie. Zum Beispiel teilen die DNA-Sequenzen 3' ATTGCC 5' und 3' TATGCG 5' 50 % Homologie.
Um eine im wesentlichen reine Herstellung eines Proteins zu erhalten, das zum Beispiel einen Antikörper umfasst, der unter Verwendung der Verfahren gemäß der Erfindung erzeugt wurde, kann das Protein von der Oberfläche der Phagen, auf der es exprimiert ist, extrahiert werden. Die Methoden für eine solche Extraktion sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Proteinreinigung wohlbekannt. Alternativ kann eine im wesentlichen reine Herstellung eines Proteins, das zum Beispiel einen Antikörper umfasst, durch Klonieren einer isolierten DNA, die für den Antikörper kodiert, in einen Expressionsvektor und durch Exprimieren des Proteins von diesem Vektor erhalten werden. Das so exprimierte Protein kann unter Verwendung gewöhnlicher Proteinreinigungsmethoden, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, erhalten werden.
Wie hierin verwendet, beschreibt der Begriff „im wesentlichen rein" eine Verbindung, zum Beispiel ein Protein oder ein Polypeptid, das von Bestandteilen, die normalerweise zusam men mit ihm auftreten, getrennt wurde. Typischerweise ist eine Verbindung im wesentlichen rein, wenn wenigstens 10 %, bevorzugter wenigstens 20 %, bevorzugter wenigstens 50 %, bevorzugter wenigstens 60 %, bevorzugter wenigstens 75 %, bevorzugter wenigstens 90 % und am meisten bevorzugt wenigstens 99 % des gesamten Materials (des Volumens, des feuchten oder trockenen Gewichts oder des Molprozentanteils oder der Molfraktion) in einer Probe die Verbindung von Interesse ist. Die Reinheit kann durch jedes geeignete Verfahren bestimmt werden, zum Beispiel im Falle von Polypeptiden durch Säulenchromatographie, Gelelektrophorese oder HPLC-Analyse. Eine Verbindung, zum Beispiel ein Protein, ist also im wesentlichen rein, wenn es im wesentlichen frei von natürlicherweise assoziierten Bestandteilen ist oder wenn es von den nativen Kontaminanten, welche es in seinem natürlichen Zustand begleiten, getrennt wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Analoga von Proteinen oder Peptiden zur Verfügung, die in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung erhalten wurden. Analoga können sich von den natürlich vorkommenden Proteinen oder Peptiden durch konservative Aminosäuresequenzunterschiede oder durch Modifikationen, welche die Sequenz nicht beeinträchtigen, oder durch beides unterscheiden.
Zum Beispiel können konservative Aminosäureaustausche vorgenommen werden, welche – obwohl sie die Primärsequenz des Proteins oder Peptids verändern – dessen Funktion normalerweise nicht verändern. Konservative Aminosäureaustausche umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen:
Glycin, Alanin;
Valin, Isoleucin, Leucin;
Asparaginsäure, Glutaminsäure;
Asparagin, Glutamin;
Serin, Threonin;
Lysin, Arginin;
Phenylalanin, Tyrosin.
Modifikationen (welche die Primärsequenzen normalerweise nicht verändern) schließen die in vivo oder in vitro chemische Derivatisierung von Polypeptiden, zum Beispiel Acetylierung oder Carboxylierung ein. Außerdem eingeschlossen sind Modifikationen der Glycosylierung, zum Beispiel solche, die durch Modifizieren des Glycosylierungsmusters eines Polypeptids während dessen Synthese und Prozessierung oder in weiteren Prozessierungsschritten durchgeführt wird; zum Beispiel durch Behandeln des Polypeptids mit Enzymen, welche die Glycosylierung beeinflussen, wie zum Beispiel mit glycosylierenden oder deglycosylierenden Enzymen des Säugers. Außerdem sind Sequenzen umfasst, welche phosphorylierte Aminosäurereste aufweisen, zum Beispiel Phosphotyrosin, Phosphoserin oder Phosphothreonin.
Ebenfalls eingeschlossen sind Polypeptide, welche unter Verwendung gewöhnlicher molekularbiologischer Techniken modifiziert wurden, um ihre Resistenz gegenüber der proteolytischen Degradation zu verbessern oder die Löslichkeitseigenschaften zu optimieren. Analoga solcher Polypeptide schließen solche ein, die andere Reste als die natürlicherweise vorkommenden L-Aminosäuren enthalten, zum Beispiel D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende synthetische Aminosäuren. Die Peptide gemäß der Erfindung sind nicht auf die Produkte irgendwelcher der spezifischen, beispielhaft genannten, hierin aufgelisteten Methoden beschränkt.
Zusätzlich zu den im wesentlich vollständig langen Polypeptiden, stellt die vorliegende Erfindung aktive Fragmente der Polypeptide zur Verfügung. Ein bestimmtes Polypeptid wird als aktiv angesehen, wenn es an einen Antigen-tragenden Rest bindet, zum Beispiel, wenn ein Fragment eines Antikörpers an dessen entsprechendes Antigen auf dieselbe Weise bindet, wie das vollständig lange Protein.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Fragment", sofern es ein Polypeptid betrifft, normalerweise wenigstens etwa 50 aufeinander folgende Aminosäuren lang sein, typischerweise wenigstens etwa 100 aufeinander folgende Aminosäuren, noch typischer wenigstens etwa 200 aufeinander folgende Aminosäuren und üblicherweise wenigstens etwa 300 aufeinander folgende Aminosäuren.
Die Erfindung wird durch Verweis auf die folgenden experimentellen Beispiele weiter im Detail beschrieben. Diese Beispiele werden nur zum Zwecke der Veranschaulichung zur Verfügung gestellt und sind nicht als beschränkend gedacht, es sei denn, etwas anderes ist angegeben. Folglich sollte die Erfindung nicht als in irgendeiner Weise auf die folgenden Beispiele beschränkt betrachtet werden, sondern sollte so aufgefasst werden, dass sie jegliche und sämtliche Variationen umfasst, die als Ergebnis der hierin zur Verfügung gestellten Lehre offensichtlich werden.
Die hierin beschriebenen experimentellen Beispiele stellen Verfahren und Ergebnisse zur Isolation und Produktion von anti-Rh(D) rotes Blutkörperchen Antikörpern unter Verwendung des Fab/Phagen-Displays zur Verfügung.
In 1 wird ein Verfahren für die Isolation von durch filamentösen Phagen präsentierten humanen, monoklonalen Antikörpern beschrieben, die für nicht reinigbare, auf der Zelloberfläche exprimierte Moleküle spezifisch sind. Um das Einfangen Antigen-spezifischer Phagen zu optimieren und die Bindung irrelevanter Phagenantikörper zu minimieren, wurde eine gleichzeitige positive und negative Selektionsstrategie verwendet. Zellen, welche das Antigen von Interesse tragen, werden mit magnetischen Kügelchen vorbeschichtet und werden in einem Überschuss unmodifizierter Antigen-negativer Zellen verdünnt. Nach der Inkubation der Zellmischung mit einer Fab/Phagenbibliothek wird die Antigen-positive Zellpopulation unter Verwendung der magnetisch aktivierten Zellsortierung zurückgewonnen und Antigen-spezifische Fab/Phagen werden eluiert und in einer Bakterienkultur propagiert. Als dieses Protokoll mit magnetisch markierten Rh(D)-positiven und einem Überschuss an nicht markierten Rh(D)-negativen humanen roten Blutkörperchen und einer Fab/Phagenbibliothek, die aus humanen peripheren Blutlymphozyten konstruiert wurde, verwendet wurde, wurden Dutzende einzigartiger, klinisch nützlicher _ylΚ und _ylλ anti-Rh(D) Antikörper aus einem einzigen allo-immunisierten Individuum isoliert.
Das Zelloberflächen-Selektionsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist einfach für die Verwendung in anderen Systemen adaptierbar, wie zum Beispiel zur Identifizierung möglicher Tumor-spezifischer Antigene und stellt einen raschen (weniger als einen Monat) Ansatz mit hoher Ausbeute zur Isolierung selbst-replizierender Antikörperreagenzien zur Verfügung, die gegen neue oder konformations-abhängige Zelloberflächenepitope gerichtet sind.
Erzeugen von Fab/Phagen-Displaybibliotheken
Getrennte _ylΚ und _ylλ Phagenbibliotheken wurden aus 2 × 10⁷ mononukleären Zellen konstruiert, die aus dem peripheren Blut von einem Rh(D)-negativen Individuum stammten, das zuvor mit Rh(D)-positiven roten Blutkörperchen (RBCs) hyperimmunisiert wurde. Der Phagemidvektor pComb3 (Barbas, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982) wurde verwendet, um die Bibliotheken unter Verwendung zuvor veröffentlichter Verfahren zu erzeugen (Barbas et al., 1991, Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (Phabs): Rapid selection of antigen-specific Fabs. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119-124; Siegel et al., 1994, Blood 83: 2334-2344).
Kurz beschrieben wurde cDNA aus der mRNA der Donorzellen hergestellt, und cDNA-Segmente der schweren Kette und leichten Kette von Immunglobulin (Ig) wurden unter Verwendung der Polymerasenkettenreaktion (PCR) und der Reihe von humanen Ig-Primern, die von Kang et al. (1991, „Combinatorial Immunoglobulin Libraries on the Surface of Phage (Phabs): Rapid Selection of Antigen-Specific Fabs. Methods: A Companion to Methods" in Enzymology 2: 111-118) beschrieben wurden und durch die von Silverman et al. (1995, J. Clin. Invest. 96: 417-426) ergänzt wurden, amplifiziert. Die PCR-Produkte der schweren und leichten Kette wurden in pComb2 kloniert und in E. coli elektroporiert. Bei Coinfektion mit dem VCSM13 Helferphagen (Stratagene, La Jolla, CA) wurde die Ig-DNA in filamentöse Phagenpartikel verpackt, welche humane Fab-Moleküle fusioniert an das Gen III Bakteriophagen-Hüllprotein exprimieren.
Selektieren der Fab-Phagen-Displaybibiotheken nach anti-Rh(D) Klonen durch Panning
Rh(D)-positive RBCs wurden an der Zelloberfläche durch Inkubieren der Zellen mit einem Hämatokrit von 10 % mit 500 μg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce Chemical, Rockford, IL) für 40 Minuten bei Raumtemperatur (RT) biotyniliert. Nach 5 Waschgängen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (phosphate-buffered saline, PBS), wurden 8 × 10⁸ biotinylierte Rh(D)-positive RBCs mit 10 ml Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Mikrokügelchen (MACS Streptavidin Microbeads, Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA) für 1 Stunde bei RT in einem Gesamtvolumen von 100 μl PBS inkubiert. Nicht-reagierte Kügelchen wurden durch Waschen entfernt und anschließend wurden die mit magnetischen Kügelchen beschichteten, Rh(D)-positiven RBCs mit einem 10-fachen Überschuss (8 × 10⁷) an Rh(D)-negativen (nicht modifizierten) RBCs und ~ 3 × 10¹¹ Kolonie-bildenden Einheiten (colony-forming units, cfu) von jeweils der _ylΚ und _ylλ Fab/Phagenbibliotheken (die wie oben hergestellt wurden) in einem Endvolumen von 40 μl PBS, enthaltend 2 % fettfreie Trockenmilch (MPBS, Carnation, Nestle Food Products, Glendale, CA), gemischt.
Im Anschluss an eine 2-stündige Inkubation bei 37°C wurde die RBC/Phagensuspension mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 μl/Minute auf eine MiniMACS MS-Magnetsäule (Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA), die mit 2 % MPBS voräquilibriert wurde, geladen. Dieser Beladungsschritt wurde ohne ein magnetisches Feld um die Säule herum durchgeführt, um zu verhindern, dass sich die mit magnetischen Kügelchen beschichteten RBCs sofort in dem oberen Teil der Säule anhaften, sie verstopfen und das Abfangen Rh(D)-negativer, nicht biotinylierter RBCs verursachen. Das Beladen der RBC/Phagen-Inkubationsmischung in Abwesenheit eines magnetischen Feldes sorgt dafür, dass sich die Antigen-negativen und Antigen-positiven RBCs gleichmäßig innerhalb der Säule verteilen ohne herauszulaufen, da das aus der Säule ausgeschlossene Volumen etwas größer als 40 μl ist. Sobald sie beladen war, wurde die Säule für 2 Minuten in ein magnetisches Feld gestellt (MiniMACS magnetic separation unit, Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA), um den Rh(D)-positiven RBCs die Anhaftung zu ermöglichen, und eine Reihe von 500 μl Waschschritten wurden mit eiskaltem MPBS durchgeführt, gefolgt von einem letzten Waschschritt mit PBS. Insgesamt 3 Waschschritte wurden für die ersten beiden Runden des Pannings durchgeführt, und insgesamt 6 Waschschritte wurden für alle anschließenden Pannings durchgeführt. Für jedes Panning wurde ein erster Waschschritt mit einer Fließrate von 10 μl/Minute durchgeführt, während dessen der Großteil der Rh(D)-negativen RBCs von der Säule gewaschen wurde. Alle anschließenden Waschschritte wurden mit 200 μl/Minute durchgeführt. Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurde die Säule aus dem magnetischen Feld entfernt und die mit Kügelchen beschichteten/mit Phagen beschichteten Rh(D)-positiven RBCs wurden mit 500 μl unter Verwendung des Stopfens einer 5 cc Spritze (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) von der Säule gespült.
Die RBCs wurden sofort für 5 Sekunden bei 13.000 × g zentrifugiert und anschließend in 200 μl 76 mM Citrat, pH 2,4, resuspendiert, um das Rh(D)-Antigen zu denaturieren und die gebundenen Phagen zu eluieren. Im Anschluss an eine 10-minütige Inkubationszeit bei RT mit dazwischen liegendem Vortexen wurde das Phageneluat und die Zelltrümmer mit 18 μl 2 M Trisbase neutralisiert und zu 10 ml eines SL1-Blue Stammes von E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) mit einer 0. D. = 1,0 gegeben, der in Super Broth (SB) (Barbas et al., 1991, s. o.), ergänzt mit 10 μl/ml Tetracyclin gewachsen ist. Nach einer Inkubation für 15 Minuten bei RT, während dessen die mit Rh(D)-bindenden Phagen angereicherte Phagenbibliothek die Bakterienkultur infizieren konnte, wurden 10 ml des auf 37°C vorgewärmten SB, enthaltend 40 μl/ml Carbenicillin/10 μl/ml Tetracyclin, dazugegeben, um Endkonzentrationen der Antibiotika von 20 μ/ml bzw. 10 μl/ml zu erreichen. Ein kleines Aliquot der Kultur (~ 100 μl) wurde sofort entnommen und auf LB/Carbenicillinplatten getitert, um die Anzahl der in dem gesamten Eluat enthaltenen Phagen zu bestimmen. Der Rest der Kultur wurde bei 37°C für 1 Stunde bei 300 RPM geschüttelt. Zusätzliche Antibiotika, zusätzliches SB und VCSM13 Helferphagen wurden anschließend dazugegeben, und die Kultur wurde über Nacht bei 30°C wie beschrieben wachsen gelassen (Siegel et al., 1994, s. o.).
Phagemidpartikel wurden mit Hilfe einer Polyethylenglycol 8000 (PEG) Präzipitation aus dem Kulturüberstand gereinigt (Barbas et al., 1991, s. o.), in 1 % bovinem Serumalbumin (BSA)/PBS resuspendiert und über Nacht dialysiert, um restliches PEG zu entfernen, das die RBCs während der folgenden Runden des Pannings lysieren könnte. Folglich dient die resultierende Phagenpräparation als Eingangsmenge für die nächste Runde des Pannings. Die _ylΚ und _ylλ Phagenbibliotheken wurden getrennt voneinander dem Panning unterzogen, um jegliche Verzerrung in der Replikation des leichte Kette-Isotyps, die möglicherweise durch die bakterielle Amplifikation entstanden ist, zu vermeiden.
Screening von polyklonalen Fab/Phagenbibliotheken und individuellen Phagenkolonien nach anti-Rh(D)-Reaktivität
Die Spezifität der Fab/Phagen für das Rh(D)-Antigen wurde unter Verwendung eines anti-M13 Antikörpers als Brückenantikörper zur Induktion einer Agglutination zwischen den RBCs, die anti-Rh(D) Fab/Phagen gebunden haben, bestimmt. 100 μl Aliquots der Fab/Phagen aus den Panning-Runden oder der monoklonalen Fab/Phagen, die aus individuellen Fab/Phagen-Eluatklonen stammen, wurden mit 50 μl einer 3 % Suspension von RBCs mit definiertem Phänotyp (d. h. Rh(D)-negativ oder -positiv) inkubiert.
Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die RBCs dreimal mit 2 ml kaltem PBS gewaschen, um ungebundene Fab/Phagen zu entfernen. Die resultierenden RBC-Pellets wurden in 100 μl einer 10 μg/ml Lösung von anti-M13 Antikörper aus dem Schaf (5-Prime 3-Prime, Boulder, CO) resuspendiert und in die Vertiefungen mit rundem Boden einer 96-Well Mikrotiterplatte transferiert. Die Platten wurden ruhig stehen gelassen (~ 2 Stunden) und anschließend ausgewertet. Vertiefungen mit einer negativen Reaktion zeigen scharfe RBC-Spots mit ~ 2 mm Durchmesser, während in Vertiefungen mit positiven Reaktionen, d. h. einer Agglutination, die RBCs in agglutinierten Vertiefungen einen dünnen Teppich bilden, der den gesamten Boden der Vertiefung überzieht.
Für die Hämagglutinationsassays unter Verwendung von Minisäulen-Gelkarten (ID-Micro-Typing System, Ortho Diagnostics, Raritan, NJ) (Lapierre et al., 1990, Transfusion 30: 109-113) wurden 25 μl Fab/Phagenklone mit 50 μl Aliquots von RBCs (0,8 % Suspension in Micro Typing System Puffer, Ortho Diagnostics) gemischt. Die Gemische wurden in die Reservoirs oberhalb der Minisäulen gegeben, welche Dextranacrylamid-Kügelchen enthielten, die zuvor in 100 μl/ml anti-M13 Antikörper suspendiert wurden. Nach der Inkubation bei 37°C wurden die Gelkarten bei 70 × g 10 Minuten lang zentrifugiert und ausgewertet.
Verschiedene Verfahren
Die Herstellung von fluoreszent-markierten RBCs für die Durchflusszytometrie wurde wie hierin beschrieben durchgeführt, und Proben wurden unter Verwendung eines FACScan Mikrofluorimeters, das mit der Lysis II (Vers. 1.1) Software (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) ausgerüstet war, analysiert. Plasmid-DNA wurde aus Bakterienklonen hergestellt (Qiawell Plus, Qiagen, Chatsworth, CA). Doppelsträngige DNA wurde unter Verwendung von reversen Primern der Ig konstanten Region der leichten Ketten oder schweren Ketten oder von eindeutigen pComb3-Vektorprimern, die 5' der entsprechenden Ig-Kette annealen (Barbas et al., 1991, s. o.; Roben et al., 1995, J. Immunol. 154: 6437-6445) und der automatisierten Fluoreszenzsequenzierung (Applied Biosystems, Foster City, CA) sequenziert. Die Sequenzen wurden unter Verwendung der MacVector Version 5,0 Sequenzierungssoftware (Oxford Molecular Group, Oxford, UK) und der Tomlinson Datenbank für Ig-Keimbahngene (Tomlinson et al., 1996, V Base Sequence Directory. MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, UK) analysiert.
Experimentelle Anordnung der Protokolle zur Zellinkubation und Zelltrennung
Die experimentellen Bedingungen, die oben für das Panning von Fab/Phagen-Bibliotheken nach anti-RBC-reaktiven Phagen beschrieben wurden, wurden nach Durchführung einer Reihe von Anfangsstudien bestimmt, die darauf abzielten, das Verfahren zur Zellauftrennung und die Endausbeute an Antigen-spezifischen Fab/Phagen zu optimieren. Die hauptsächlich untersuchten Parameter umfassen:
Biotinylierung Es wurden Bedingungen angestrebt, welche die RBC-Oberfläche in einer Weise biotinylieren würde, dass eine ausreichende Anzahl an Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen an die Zellen binden würde, was dazu führt, dass die RBCs von der magnetischen Säule zurückgehalten werden. In diesem Fall ist eine Überbiotinylierung, welche die Antigenität des Rh(D)-Antigens zerstören könnte oder dazu führen könnte, dass die Zellen unspezifisch Antikörper absorbieren, zu vermeiden. Um dieses Problem anzugehen, wurden Rh(D)-positive/Kell-negative RBCs (wobei Kell ein RBC-Antigen ist; (Walker, Ausg. 1993, Technical Manual, 11t^h Edition, Bethesda: American Association of Blood Banks) mit einer Reihe von Sulfo-NHS-LC-Biotin Konzentrationen inkubiert, und der Grad an Biotinylierung wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluorescein-konjugiertem Streptavidin untersucht.
Um den Grad an Zelloberflächen-Biotinylierung zu bestimmen, wurden 5 μl Aliquots von 3 % Suspensionen von Rh(D)-positiven/Kell-negativen RBCs, die mit verschiedenen Konzentrationen an Biotinreagenz biotinyliert wurden, mit 200 μl einer 1/100 Verdünnung von FITC-Streptavidin (Jackson ImmunoResearch, Bar Harbor, Maine) für 30 Min. bei 4°C inkubiert (2). Das Gemisch wurde mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit Hilfe der Durchflussmikrofluorimetrie (-☐-) analysiert. Aliquots von Zellen wurden außerdem auf die Beibehaltung der Rh(D)-Antigenität untersucht (-Δ-) (d. h., die spezifische Färbung) oder auf das Fehlen einer nicht spezifischen Färbung (-O-), indem die Zellen mit 100 μl von entweder anti-Rh(D) bzw. anti-Kell-Typisierungsserum inkubiert wurden, die Zel len gewaschen und anschließend mit einer 1/100 Verdünnung von FITC-Ziege anti-humanem IgG (Jackson ImmunoResearch) gefärbt wurden.
Eine lineare, nicht sättigende Antwort wurde beobachtet (2). Die Beibehaltung der Rh(D)-Antigenität wurde durch Verwendung von anti-Rh(D) Typisierungsserum bestimmt, und es wurde festgestellt, dass sie durch die Derivatisierung der Zelloberflächenproteine mit Biotin bei allen getesteten Biotinkonzentrationen unbeeinflusst war (2). Darüber hinaus absorbierten die Kell-negativen RBCs die anti-Kell Antikörper nicht unspezifisch.
Jede biotinylierte RBC-Probe wurde anschließend mit einem Überschuss an Streptavidin-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und auf eine magnetische Trennsäule gegeben. Es wurde festgestellt, dass bei RBC-Proben, die mit mehr als oder gleich 500 μg/ml Biotinreagenz biotinyliert wurden, ganze 10⁸ RBCs von der Säule zurückgehalten werden konnten. Da die tatsächlichen RBC-Phagen Panning-Experimente so konstruiert wurden, dass sie nur ~ 10⁷ Rh(D)-positive Zellen verwenden (siehe unten), wurde die RBC-Biotinylierung mit 500 μg/ml als ausreichend bestimmt.
Konzentration der Rh(D)-positiven und Rh(D)-negativen RBCs in dem Inkubationsgemisch
Vor der Durchführung der Fab/Phagen Panning-Experimente wurde die Fähigkeit der magnetisch-aktivierten Zellsortierungsmethode zur Trennung von Rh(D)-positiven und Rh(D)-negativen Zellen unter Verwendung von anti-Rh(D) Typisierungsserum und der Durchflusszytometrie bestimmt (3). Mit Streptavidin-Mikrokügelchen beschichtete, biotinylierte Rh(D)-positive RBCs (8 × 10⁸ Zellen) wurden mit einem zehnfachen Überschuss an Rh(D)-negativen unbeschichteten RBCs (8 × 10⁷ Zellen) in einem 40 μl-Volumen von PBS, enthaltend 2 % fettfreie Trockenmilch (MPBS), gemischt und das Gemisch wurde auf eine MiniMACS-Säule aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen und die gebundenen Zellen wurden wie hierin beschrieben eluiert. RBC-Aliquots, die in dem ursprünglichen Gemisch enthalten waren (Abbildung a), der Waschschritt von der Säule (Abbildung b) und das Säuleneluat (Abbildung c) wurden mit anti-Rh(D) Typisierungsserum und FITC Ziege antihumanem IgG, wie in 2 beschrieben, gefärbt. Die Durchflusszytogramme zeigen, dass – obwohl ~ 90 % der Zellen in der Säulenladung Rh(D)-negativ waren (Abbildung a) – fast alle von der Säule heruntergewaschen wurden (Abbildung b), was ein Säuleneluat ergibt, das fast ausschließlich aus Rh(D)-positiven Zellen besteht (Abbildung c). Da nur ~ 6 % des Endeluates Rh(D)-negative Zellen enthält (Abbildung c) und Rh(D)-negative Zellen ursprünglich in einem zehnfachen Überschuss im Vergleich zu Rh(D)-positiven Zellen vorhanden waren, kontaminierten nur ~ 0,6 % der ursprünglichen Antigen-negativen immunabsorbierten Zellen die endgültige Antigen-positive Präparation. Diese Effizienz der Zelltrennung wurde als adäquat für die anschließenden Panning-Experimente mit Fab/Phagen erachtet.
In dem oben beschriebenen Experiment war es notwendig, die Säule in Abwesenheit eines magnetischen Feldes zu beladen, um ein Verstopfen der magnetischen Trennsäule zu vermeiden. Dies erforderte ein Reaktionsvolumen von weniger als oder gleich 40 μl, so dass nichts von dem Material aus der Säule laufen würde. Auf einer theoretischen Grundlage (Kretzschmar et al., 1995, Anal. Biochem. 224: 413-419) lässt sich die geeignete Konzentration an Zellen berechnen, die in einem 40 μl Volumen benötigt wird, um mehr als 50 % der Fab/Phagen abzufangen, die spezifisch für ein bestimmtes Zelloberflächen-Antigen sind. Solch eine Berechnung ist eine Funktion der Anzahl von Antigen-Bereichen pro Zelle und der Dissoziationskonstante (K_D) der gebundenen Fab/Phagen. Unter Verwendung eines Wertes von ~ 100.000 Rh(D)-Antigenbereichen pro RBC (Phänotyp „-D-/-D-") (Mollison et al., 1993, Blood Transfusion in Clinical Medicine, Oxford, Blackwell Scientific Publications) und der gewünschten Fab/Phagen-Affinität im Bereich von K_D = 10^–8 bis 10^–9, würden dann 8 × 10⁸ Rh(D)-positive RBCs in einem 40 μl Reaktionsvolumen benötigt. Angesichts dieser Zahl Rh(D)-positiver Zellen wurde festgestellt, dass ein zehnfacher Überschuss an Rh(D)-negativen RBCs die maximale Menge an Antigen-negativen Zellen ist, die effektiv von Antigen-positiven RBCs mit Hilfe der magnetischen Säule getrennt werden könnten (3).
Konstruktion und Panning von Fab/Phagen-Bibliotheken
_ylΚ und _ylλ Phagenbibliotheken wurden wie hierin beschrieben hergestellt, und es wurde festgestellt, dass sie 7 × 10⁷ und 3 × 10⁸ unabhängige Transformanten enthalten. Tabelle 1 stellt die Panning-Ergebnisse für die Bibliotheken tabellarisch dar.
Ein RBC-Agglutinationsassay unter Verwendung eines anti-M13 sekundären Antikörpers als Brückenantikörper wurde verwendet, um eine anti-Rh(D) Fab/Phagenaktivität in den durch Panning untersuchten polyklonalen Bibliotheken und den individuellen, zufällig ausgewählten Fab/Phagenklonen nachzuweisen (4). Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentative Beispiele des Assays, die eine negative Reaktivität gegenüber Rh(D)-negativen RBCs und eine stark positive Reaktivität gegenüber Rh(D)-positiven RBCs für die _ylΚ-Bibliothek (Panning # 2) bis zu einer Verdünnung von 1/2048 zeigen.
Im Falle der _ylΚ-Bibliothek scheint eine signifikante Anreicherung der bindenden Phagen nach nur einer Runde des Pannings aufzutreten, während für die _ylλ-Bibliothek eine signifikante Anreicherung während der zweiten Runde auftritt. Dies wird sowohl von der starken Zunahme bei dem prozentualen Anteil der gebundenen Phagen während einer bestimmten Runde des Pannings als auch durch die Fähigkeit der polyklonalen _ylΚ- und _ylλ-Fab/Phagen-Bibliothek zur Agglutination von Rh(D)-positiven RBCs nach ein bzw. zwei Runden des Pannings widergespiegelt (Tabelle 1, 4).
Monoklonale Fab/Phagen wurden aus zufällig ausgewählten individuellen Bakterienkolonien hergestellt, die während jeder Runde des Pannings erhalten wurden. Es war offensichtlich, dass zum Zeitpunkt der dritten Runde des Pannings sämtliche Klone eine anti-Rh(D) Spezifität aufweisen (Tabelle 1). Um zu bestätigen, dass diese Fab/Phagen eine anti-Rh(D) Spezifität haben und nicht an andere unbeteiligte Antigene binden, die zufällig auf den Rh(D)-positiven RBCs vorhanden sind auf den Rh(D)-negativen RBCs fehlen, die in den Agglutinationsassays verwendet werden, wurden die Klone gegen eine Serie von 11 Rh(D)-negativen und -positiven RBCs mit verschiedenen Blutgruppenspezifitäten gescreent, um ihre anti-Rh(D)-Spezifität zu überprüfen (Walker, 1993, s. o.).
Klonale Analyse auf der genetischen Ebene
Um die genetische Diversität unter den zufällig ausgewählten anti-Rh(D)-Klonen zu untersuchen, wurde von jedem der Klone Plasmid-DNA hergestellt, und die entsprechenden Nukleotidsequenzen der schweren und leichten Kette von Ig wurden identifiziert. In Tabelle 2 ist eine Reihe von Merkmalen für jeden Klon aufgelistet, einschließlich des Namens des nächst verwandten Keimliniengens der schweren oder leichten Kette von Ig. Eine detailliertere Analyse auf der Nukleotidebene offenbarte, dass unter sämtlichen der anti-Rh(D)-bindenden Klone eine große Anzahl einzigartiger DNA-Sequenzen der schweren und leichten Kette waren (Tabelle 3). Aufgrund der zufälligen Mischung von Gensegmenten der schweren und leichten Ketten, die während der Erzeugung einer Fab/Phagen-Displaybibliothek auftritt (Barbas et al., 1991, s. o.), ist offensichtlich, dass diese schweren Ketten und leichten Ketten zur Bildung von fast 50 verschiedenen anti-Rh(D) Antikörpern kombiniert wurden.
Eine detaillierte Analyse durch mehrfaches Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenzen offenbarte insgesamt 25 einzigartige Proteine der schweren Kette, 18 einzigartige Proteine der Κ-leichten Kette und 23 einzigartige Proteine der λ-leichten Kette. Aufgrund des kombinatorischen Effekts während der Bibliothekskonstruktion paarten sich diese Gensegmente für die schwere und leichte Kette, um 50 einzigartige Fab Antikörper (20 _ylΚ und 30 _γlλ) zu bilden. Interessanterweise waren sämtliche der 25 einzigartigen schweren Ketten und fast alle der 18 einzigartigen leichten Ketten nur von 5 V_HIII bzw. vier V_ΚI-Keimliniengenen abgeleitet, während die Lambda leichten Ketten von einer verschiedenartigeren Reihe von Keimliniengenen abgeleitet waren. Die Analysen der Nukleotidsequenzen der schweren und leichten Ketten aus über sechzig negativen Klonen aus den nicht durch Panning untersuchten Bibliotheken wurden durchgeführt, um die Heterogenität in der Familie der variablen Region vor der Selektion zu überprüfen. Es waren Klone vorhanden, welche die V_H-Familien I (13 %), III (36 %), IV (31 %), V (15 %) und VI (5 %) repräsentieren; die V_Κ-Familien I (43 %), II (14 %), III (29 %) und IV (14 %); und die V_γ-Familien I (48 %), II (4 %), III (9 %), IV (4 %), V (9 %), VI (17 %) und VII (9 %) waren vorhanden.
Klonale Analyse auf der Proteinebene
Um die Diversität der Feinspezifität (Rh(D)-Antigen-Epitopspezifität) unter den anti-Rh(D) Klonen zu untersuchen, wurden Agglutinationsexperimente mit ausgewählten Klonen und mit Serien von seltenen Rh(D)-positiven RBCs, die von Individuen erhalten wurden, deren RBCs ein Rh(D)-Antigen produzieren, dem bestimmte Epitope fehlen, durchgeführt. Die Untersuchung des Agglutinationsmusters eines bestimmten anti-Rh(D) Antikörpers mit solchen Sets von mutierten RBCs ermöglicht die Identifikation des spezifischen Epitops aus Rh(D), gegen welches der Antikörper gerichtet ist (Mollison et al., 1993, s. o.). Ein repräsentatives Beispiel eines solchen Experimentes ist in 5 gezeigt, und die Rh(D)-Epitope für die ausgewählten anti-Rh(D) Fab/Phagenklone sind in Tabelle 2 tabellarisch aufgeführt.
Die Agglutinationsexperimente wurden mit anti-Rh(D)-negativen RBCs (rr), Rh(D)-positiven RBCs (R₂R₂) und „teilweise" Rh(D)-positiven RBCs (Mosaike IIIa, IVa, Va, VI, VII) durchgeführt. Die gezeigten Ergebnisse sind ein repräsentatives Beispiel des Assays für 5 zufällig ausgewählte anti-Rh(D) Fab/Phagenklone (5).

¹ Panning-Runde, wobei „0" für die ursprüngliche, noch nicht einem Panning unterzogene Fab/Phagen-Bibliothek steht
² Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten (CFUs) von Phagen (Φ), inkubiert mit Rh(D)-positiven/negativen RBC-Gemischen
³ Gesamtzahl an CFUs von in dem Eluat enthaltenden Φ
⁴ (Φ Output/Φ Input) × 100
⁵ fache Zunahme an % gebundenen Phagen im Vergleich zu der vorhergehenden Panning-Runde
⁶ Agglutinationstiter; siehe Text und 4
⁷ Anzahl an Rh(D)-bindenden Fab/Phagenklonen pro Gesamtzahl an Klonen, die in der Panning-Runde untersucht wurden; siehe Tabelle 2 für Details.

¹ Nomenklatur: das Präfix „KPO" bezeichnet „_γlΚ-Fab/Phagen-Bibliothek, Panning 0", „KP1" bezeichnet „_γlΚ-Fab/Phagenbibliothek, Paning 1", usw.
² negative oder positive Agglutination gegen Rh(D)-positive RBC
³ Genfamilie der variablen Region der Ig schweren Kette gemäß Tomlinson et al., s. o.
⁴ am nächsten verwandtes Gen für die variable Region der Ig schweren Kette gemäß Tomlinson et al., s. o.
⁵ Genfamilie der variablen Region der Ig leichten Kette gemäß Tomlinson et al., s. o.
⁶ am nächsten verwandtes Gen der variablen Region der Ig leichten Kette gemäß Tomlinson et al., s.o.
⁷ Rh(D)-Epitop wie durch ein seltenes RBC-Agglutinationsmuster definiert (s. 5 und Text).

¹ Nomenklatur: das Präfix „LPO" bezeichnet „_γlλ-Fab/Phagen-Bibliothek, Panning 0", „KP1" bezeichnet „_γlλ-Fab/Phagenbibliothek, Paning 1", usw.
² negative oder positive Agglutination gegen Rh(D)-positive RBC
³ Genfamilie der variablen Region der Ig schweren Kette gemäß Tomlinson et al., s. o.
⁴ am nächsten verwandtes Gen für die variable Region der Ig schweren Kette gemäß Tomlinson et al., s. o.
⁵ Genfamilie der variablen Region der Ig leichten Kette gemäß Tomlinson et al., s. o.
⁶ am nächsten verwandtes Gen der variablen Region der Ig leichten Kette gemäß Tomlinson et al., s.o.
⁷ Rh(D)-Epitop wie durch ein seltenes RBC-Agglutinationsmuster definiert (s. 5 und Text).

Verwendung von Fab/Phagen Antikörpern als Blutbank-Typisierungsreagenzien
Die Fähigkeit der anti-Rh(D) Fab/Phagen-Herstellungen, Rh(D)-negative von Rh(D)-positiven RBCs in Mikroplatten-Hämagglutinationsassays genau zu unterscheiden (4 und 5) stellte den Beweis zur Verfügung, dass ein Geltest (Lapiene et al., 1990, Transfusion 30: 109-1130), der von Blutbanken verwendet wird, um RBCs unter Verwendung konventioneller Antisera zu phänotypisieren, für die Verwendung mit Fab/Phagen adaptiert werden könnte.
Der Geltest umfasst eine Plastikkarte von etwa 5 × 7 cm, die 6 Minisäulen enthält, die jeweils mit etwa 20 μl Dextranacrylamid-Kügelchen gefüllt sind, die in anti-humanem Globulin suspendiert sind (Coombs-Reagenz). Rote Blutkörperchen, die typisiert werden sollen, werden mit den gewünschten humanen Antiseren inkubiert und durch das Gel zentrifugiert. RBCs, die für Antigene positiv sind, gegen welche das Antiserum gerichtet ist, agglutinieren in dem Moment, in dem sie auf das anti-humane Globulin treffen und werden in oder über der Gelmatrix zurückgehalten. RBCs, die nicht reagiert haben, sedimentieren durch die Gelpartikel und bilden ein Pellet am Fuße des Mikroreaktionsgefäßes. Da der Geltest eine Anzahl von Vorteilen gegenüber den herkömmlichen Blutbankverfahren zur RBC-Phänotypisierung bietet, einschließlich verringerter Reagenzvolumina, der Eliminierung eines Zell-Waschschrittes und einer objektiveren Interpretation der Ergebnisse, haben viele Blutbankeinrichtungen diese neue Technologie übernommen. Wie in 6 gezeigt, kann ein anti-Rh(D) Fab/Phage für Gelkarten verwendet werden, die so verändert sind, dass sie den anti-M13 Antikörper enthalten.
Um das Assay durchzuführen, wurden Rh(D)-negative oder -positive rote Blutkörperchen mit Verdünnungen von anti-Rh(D) Fab/Phagen (_γlΚ-Bibliothek, Panning # 2) inkubiert und in Mikrosäulen zentrifugiert, welche in anti-M13 Antikörper suspendierte Kügelchen enthalten. Die unverdünnte Fab/Phagen-Stammlösung wies einen Titer von 5 × 10¹² cfu/ml auf, ähnlich dem in dem Microplate Settling Assay (4). Da das Volumen der in diesem Assay verwendeten Fab/Phagen ein Viertel des Volumens in dem Mikroplattenassay beträgt, entspricht die Menge an in der 1/625-Verdünnung vorhandenen Fab/Phagen in etwa der in der 1/2048-Verdünnung in 4 vorhandenen Menge. Daher ist die Anzahl der zum Erzielen eines positiven Ergebnisses erforderlichen Fab/Phagen in beiden Assays im wesentlichen gleich.
In anderen Assays, die wie gerade beschrieben durchgeführt wurden, wurde keine Agglutination der roten Blutkörperchen beobachtet, wenn der anti-M13 Antikörper aus dem Assay eliminiert wurde. Darüber hinaus reagiert der anti-IgG Antikörper nicht mit rekombinanten Fabs, die auf der Oberfläche des Bakteriophagen exprimiert werden. Nur Rh-positive Zellen, die mit anti-Rh Fab/Phagen zur Reaktion gebracht wurden, wurden agglutiniert, wenn der anti-M13 Antikörper in dem Assay vorhanden war. Es sollte berücksichtigt werden, dass – wenn hohe Konzentrationen an anti-M13 Antikörper verwendet wurden – sogar Rh-negative Zellen agglutiniert zu sein schienen. Dies ist ein Artefakt, der aus der Kreuzvernetzung ungebundener (d. h. nicht reagierter) Phagen resultiert, die in Gegenwart hoher Mengen an anti-M13 Antikörper kreuzvernetzt werden und eine semi-undurchlässige Matte bilden, durch die nicht alle Rh-negativen Fällen durchdringen können. In den hierin beschriebenen Experimenten wurde eine anti-M13 Konzentration von etwa 100 μg/ml als optimal für die Agglutination und zur Vermeidung falsch positiver Resultate angesehen. Abhängig von den genauen Konzentrationen der in den Assay verwendeten Reagenzien und Zellen kann die Konzentration an anti-M13 von dieser Zahl abweichen.
Um die relative Sensitivität eines anti-M13 modifizierten Mikro Typing Systems zu untersuchen, wurde den Säulen der Karten des Micro Typing Systems 100 μg/ml anti-M13 Antikörper zugegeben. Rh-negative oder Rh-positive rote Blutkörperchen wurden mit unverdünnten oder mit 5-fachen Serienverdünnungen (1/5, 1/25, 1/125, 1/625 und 1/3125) der anti-Rh Phagenantikörper inkubiert. Die Karten wurden zentrifugiert, und die Proben wurden auf Agglutination untersucht. Das modifizierte Micro Typing System Kartenassay war in der Lage, eine anti-Rh-Antiagglutination bei einer Verdünnung zwischen 1/625 und 1/3125 nachzuweisen.
Verfahren zur Isolation von tumorspezifischen Antikörpern
Fab/Phagen, die spezifisch für Tumorzellen sind, sind nützlich in vitro Diagnose (Laborassays von Biopsien, Flüssigkeits- oder Blutproben), zur in vivo Markierung eines Tumors/einer Metastase (Koppeln des Antikörpers an die Imaging-Sonde) oder zur Behandlung einer Malignität (Koppeln der Antikörper an chemische oder radioaktive Toxine). Tumorspezifische Antikörper sind außerdem nützlich zur Identifikation neuer Antigene oder Marker auf Tumorzellen, welche die Grundlage für anti-Tumorvakzine bilden können. Darüber hinaus können tumorspezifische Antikörper, welche zur Erzeugung anti-idiotypischer Antikörper nützlich sind, außerdem die Grundlage für anti-Tumorvakzine bilden.
Anti-Tumor Antikörper werden im wesentlichen wie hierin für die Erzeugung von anti-Rh Antikörpern beschrieben erzeugt. Tumorzellen, zum Beispiel (jedoch ohne auf diese beschränkt zu sein) maligne Melanomzellen, werden an der Zelloberfläche biotinyliert, mit Streptavidin-magnetischen Mikrokügelchen markiert und werden anschließend mit einem Überschuss an normalen Melanozyten gemischt. Fab/Phagen-Bibliotheken werden aus den peripheren Blutlymphozyten von Melanom-Patienten, die therapeutisch nützliche anti-Tumor Antikörper aufweisen, erzeugt. Eine Anzahl von Melanom-Patienten, die sich selbst „geheilt" haben, haben dies offensichtlich durch Bilden einer humoralen (d. h. Antikörper) Immunantwort getan. Diese Fab/Phagen-Bibliotheken werden mit dem Gemisch von Zellen inkubiert. Fab/Phagen, die gegen für maligne Zellen spezifische Epitope gerichtet sind, werden die malignen Zellen binden und können anschließend unter Verwendung des magnetischen Säulen-Panning-Ansatzes isoliert werden.
Isolation von Fab/Phagen, die bakterielle Virulenzfaktoren identifizieren
Der hierin beschriebene Ansatz kann verwendet werden, um Fab/Phagen zu isolieren, die fähig sind, Unterschiede zwischen den virulenten Bakterien und ihren nicht-pathogenen Gegenstücken zu detektieren. In diesem Fall wird der virulente Bakterienstamm magnetisch markiert, mit den nicht pathogenen Gegenstücken verdünnt und eine Fab/Phagen-Bibliothek, die aus Lymphozyten erzeugt ist, die von Individuen stammen, die mit dem virulenten Stamm infiziert wurden, wird dazugegeben. Die auf diese Weise isolierten Fab/Phagen können nützlich zur Identifikation von neuen bakteriellen Antigenen sein, gegen welche antibakterielle Verbindungen und/oder Impfstoffe entwickelt werden können.

Claims

Ein Verfahren zum Isolieren einer DNA, die für ein einen Antigen-tragenden Rest bindendes Protein kodiert, wobei das genannte Verfahren umfaßt Erzeugen einer Phagendisplaybibliothek, die eine Vielzahl von Virusvektoren umfasst, wobei mindestens einer der genannten Virusvektoren das genannte Protein auf seiner Oberfläche exprimiert und die genannte DNA umfasst, wobei die DNA in Bezug auf den genannten Virusvektor heterolog ist; Zusetzen einer magnetischen Markierung zu Zellen, die den genannten Antigen-tragenden Rest auf ihrer Oberfläche tragen; Inkubieren der genannten Phagendisplaybibliothek mit der genannten magnetisch markierten Zellen in Gegenwart eines Überschusses nicht-markierter Zellen, die nicht den genannten Antigen-tragenden Rest exprimieren, unter Bildung eines Gemisches, wobei der genannte mindestens eine Virusvektor an die genannten magnetisch markierten Zellen bindet; Isolieren der magnetisch markierten Zellen aus dem genannten Gemisch, wobei der genannte mindestens eine Virusvektor aus dem Gemisch isoliert wird; und Erhalten von für das genannte Protein kodierender DNA aus dem genannten isolierten Virusvektor.
Ein Verfahren zum Isolieren eines Proteins, das einen Antigen-tragenden Rest bindet, wobei das genannte Verfahren umfasst Erzeugen einer Phagendisplaybibliothek, die eine Vielzahl von Virusvektoren umfasst, wobei mindestens einer der genannten Virusvektoren eine heterologe DNA umfasst, die für das genannte Protein kodiert und das genannte Protein auf seiner Oberfläche exprimiert; Zusetzen einer magnetischen Markierung zu den Zellen, die den genannten Antigen-tragenden Rest auf ihrer Oberfläche tragen; Inkubieren der genannten Phagendisplaybibliothek mit den genannten magnetisch markierten Zellen in Gegenwart eines Überschusses von nicht-markierten Zellen, die nicht den genannten Antigen-tragenden Rest exprimieren, unter Bildung eines Gemisches; wodurch der genannte mindestens eine Virusvektor an die genannten magnetisch markierten Zellen bindet; Isolieren magnetisch markierter Zellen aus dem Gemisch, wodurch der genannte mindestens eine Virusvektor aus dem Gemisch isoliert wird; und Isolieren des genannten Proteins aus dem genannten isolierten Virusvektor.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der genannte Virusvektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Bakteriophagen M13 Vektor, einem Bakteriophagen Lambda-Vektor und einem eukaryontischen retroviralen Vektor.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei der genannte Virusvektor ein Bakteriophagen M13 Vektor ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das genannte Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Liganden und einem Hormon.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das genannte Protein ein Antikörper ist.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei der genannte Antikörper ein anti-Rotes Blutkörperchen Oberflächenantigen Antikörper ist.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der genannte Antikörper ein anti-Rh Rotes Blutkörperchen Antikörper ist.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei der genannte Antikörper ein anti-Rh(D) Rotes Blutkörperchen Antikörper ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der genannte Antigen-tragende Rest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Protein, einem Lipid, einem Kohlenwasserstoff, einer Nukleinsäure und einem Komplex aus mindestens einem Protein, einem Lipid, einem Kohlenwasserstoff und einer Nukleinsäure.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei der genannte Antigen-tragende Rest ein Membran-gebundenes Protein ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei das genannte Membrangebundene Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antigen und einem Rezeptorprotein.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das genannte Membrangebundene Protein ein Antigen ist.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei das genannte Antigen ein Rotes Blutkörperchen Antigen ist.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei das genannte Antigen ein Rh Antigen ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannte Phagendisplaybibliothek eine synthetische Phagendisplaybibliothek ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die genannte DNA-Bibliothek eine synthetische Phagendisplaybibliothek ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genannten magnetisch markierten Zellen aus einem Gemisch isoliert werden, indem das genannte Gemisch auf eine magnetische Trennsäule aufgetragen wird und die genannten nicht-markierten Zellen von der Säule eluiert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 18, wobei das genannte Gemisch bei Abwesenheit eines Magnetfelds auf die genannte Säule aufgetragen wird.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die genannten magnetisch markierten Zellen aus dem genannten Gemisch isoliert werden, indem das genannte Gemisch auf eine magnetische Trennsäule aufgetragen wird und die genannten nicht-markierten Zellen von der genannten Säule eluiert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 20, wobei das genannte Gemisch bei Abwesenheit eines Magnetfeldes auf die genannte Säule aufgetragen wird.