ES2267134T3

ES2267134T3 - Clasificacion de celulas activadas magneticamente para la produccion de proteinas.

Info

Publication number: ES2267134T3
Application number: ES97911009T
Authority: ES
Inventors: Donald L. Siegel
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2017-10-10
Also published as: EP0935604B1; WO1998016541A1; ATE331727T1; CA2268397A1; CA2268397C; DE69736239D1; JP2002503085A; DE69736239T2; US5876925A; EP0935604A4; AU722978B2; AU4824797A; JP4101298B2; EP0935604A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION INCLUYE PROCEDIMIENTOS DE AISLAMIENTO DE ADN Y DE UNA PROTEINA CODIFICADA POR EL MISMO, LA CUAL ES CAPAZ DE UNIRSE A UNA FRACCION PORTADORA DE UN ANTIGENO. DICHOS PROCEDIMIENTOS CONSISTEN EN GENERAR UNA BIBLIOTECA DE ADN, EXPRESANDO LA PROTEINA EN UN VECTOR VIRAL. SE ADICIONA UN MARCADOR MAGNETICO A LAS CELULAS QUE EXPRESAN LA FRACCION PORTADORA DE ANTIGENO Y LAS CELULAS SE INCUBAN CON EL VIRUS QUE EXPRESA LA PROTEINA, EN PRESENCIA DE UN EXCESO DE CELULAS SIN MARCAR, QUE NO EXPRESAN LA FRACCION PORTADORA DE ANTIGENO, FORMANDO UNA MEZCLA EN LA QUE EL VIRUS SE UNE A LAS CELULAS MARCADAS MAGNETICAMENTE. LAS CELULAS A LAS CUALES ESTA UNIDO EL VIRUS SE AISLAN DE LA MEZCLA, Y A PARTIR DE ELLAS SE OBTIENE EL ADN QUE CODIFICA PARA LA PROTEINA, Y LA CITADA PROTEINA.

Description

Clasificación de células activadas magnéticamente para la producción de proteínas.

Antecedentes de la invención

La capacidad de producir anticuerpos monoclonales ha revolucionado la medicina diagnóstica y terapéutica. Los anticuerpos monoclonales se producen típicamente mediante la inmortalización de linfocitos del ratón productores de anticuerpos asegurándose de esta manera un suplemento continuo de células que producen anticuerpos del ratón. Sin embargo, para muchas aplicaciones humanas, es deseable producir anticuerpos humanos. Por ejemplo, es preferible que los anticuerpos que se administran a los humanos para objetivos diagnósticos o terapéuticos sean anticuerpos humanos, puesto que la administración de anticuerpos humanos a un ser humano evita potenciales reacciones inmunes frente al anticuerpo administrado, las cuales pueden interferir con el objetivo para el cual el anticuerpo fue administrado.

Además, existen ciertas situaciones en las cuales, para propósitos diagnósticos, es esencial que se utilicen anticuerpos humanos puesto que otros animales son incapaces de generar anticuerpos frente al antígeno a ser detectado en el procedimiento diagnóstico. Por ejemplo, a fin de determinar el fenotipo Rh de los glóbulos rojos humanos (GRH), debe utilizarse suero humano que contenga anticuerpo anti-Rh, puesto que otros animales no pueden generar un anticuerpo capaz de detectar el antígeno Rh humano.

La producción de anticuerpos humanos in vitro mediante la inmortalización de linfocitos B humanos utilizando transformación o fusión celular mediada por el virus de Epstein Barr (VEB) ha encontrado dificultades técnicas debido a la eficacia relativamente baja tanto de la transformación inducida por VEB como de la fusión celular en comparación con el sistema murino. Para superar estos problemas, se han desarrollado procesos para la producción de anticuerpos humanos utilizando la exposición en bacteriófagos M13 (Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191-280). Esencialmente, una genoteca de DNAc se genera a partir de ARNm obtenida de una población de células productoras de anticuerpo. El ARNm codifica genes de inmunoglobulina (Ig) reorganizados y, así, el DNAc codifica los mismos. El DNAc amplificado se clona en vectores de expresión M13 generando una genoteca de fagos que expresa fragmentos Fab humanos en su superficie. Los fagos que exhiben el anticuerpo de interés se seleccionan mediante su unión al antígeno y se propagan en bacteria para producir Fab de Ig humana soluble. De esta manera, en contraste con la síntesis de anticuerpo monoclonal convencional, este procedimiento inmortaliza el ADN que codifica la Ig humana en lugar de las células que expresan la Ig humana.

Existen varias dificultades asociadas con la generación de anticuerpos utilizando bacteriófagos. Por ejemplo, muchas proteínas no se pueden purificar en estado no desnaturalizado, de modo que los procedimientos de purificación implican necesariamente la solubilización de la proteína que puede dar lugar a algunas proteínas permanentemente desnaturalizadas con la consiguiente destrucción de sitios antigénicos presentes en ellas. Tales proteínas no pueden entonces unirse a una fase sólida y, por tanto, no se pueden utilizar para seleccionar anticuerpos portados por los fagos que les reconozcan. Un ejemplo de tal proteína es el antígeno Rh humano.

Para resolver el problema, se desarrolló un procedimiento en el cual se utilizó GRHs intactos como el antígeno de selección (Siegel et al., 1994, Blood, 83: 2334-2344). Sin embargo, se descubrió que, puesto que los fagos son intrínsecamente "pegajosos" y los GRHs expresan una multitud de antígenos sobre la superficie celular, una cantidad suficiente de fagos que no expresan el anticuerpo apropiado en su superficie se adhieren también a los GRHs, causando así que el procedimiento no sea práctico para el aislamiento de fagos que expresan anticuerpo de la especificidad deseada.

De Kruif et al (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3938-3942) revelan un procedimiento para el aislamiento de anticuerpos codificados por fagos, en el cual los fagos que expresan el anticuerpo se incuban con una mezcla de células que expresan el antígeno y células que no expresan el antígeno. Los fagos que expresan anticuerpo se unen a las células que expresan el antígeno. Tras la unión de los fagos, un anticuerpo marcado con fluorescencia se añade específicamente a las células que expresan el antígeno, las cuales son eliminadas de la mezcla portando fagos que expresan anticuerpo unidos a ellas. El aislamiento de las células marcadas con fluorescencia se realiza utilizando la técnica de separación de células activadas mediante citometría de flujo (FACS), un procedimiento caro y que tarda mucho tiempo en realizarse.

Hace falta un procedimiento de aislamiento de proteínas recombinantes, preferiblemente anticuerpos que sea rápido y económico y que proporcione una amplia serie de proteínas que se unen a otra proteína útiles para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas en los seres humanos.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un procedimiento de aislamiento de un ADN que codifica una proteína que comprende la generación de una genoteca de ADN en un vector viral que expresa la proteína, en el cual la proteína se expresa sobre la superficie del vector viral y la proteína es capaz de unirse a un resto que contiene el antígeno, la adición de un marcaje magnético a las células que expresan el resto que contiene el antígeno, la incubación del virus que expresa la proteína con las células magnéticamente marcadas en presencia de un exceso de células no marcadas que no expresan el resto que contiene el antígeno para generar una mezcla, en la cual el virus se une a las células magnéticamente marcadas, el aislamiento de las células unidas al virus a partir de la mezcla y la obtención del ADN que codifica la proteína a partir de ellas.

Asimismo, la invención se refiere a un procedimiento de aislamiento de una proteína que comprende la generación de una genoteca de ADN en un vector viral que expresa la proteína, en el cual la proteína se expresa en la superficie del vector viral y la proteína es capaz de unirse a un resto que contiene el antígeno, la adición de un marcaje magnético a las células que expresan el resto que contiene el antígeno, la incubación del virus que expresa la proteína con las células magnéticamente marcadas en presencia de un exceso de células no marcadas que no expresan el resto que contiene el antígeno para formar una mezcla, en la cual el virus se une a las células magnéticamente marcadas, el aislamiento de las células unidas al virus a partir de la mezcla y el aislamiento de la proteína a partir de ellas.

En un aspecto, el vector viral es un bacteriófago y, en otro aspecto, el bacteriófago es M13.

En un aspecto de la invención, la proteína se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un ligando y una hormona y, en otro aspecto, la proteína es un anticuerpo que puede ser un anticuerpo frente al antígeno de superficie de los glóbulos rojos, tal como un anticuerpo anti-Rh de los glóbulos rojos.

Todavía en otro aspecto de la invención, el resto que contiene el antígeno se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un lípido, un carbohidrato, un ácido nucléico y un complejo de al menos de una proteína, un lípido, un carbohidrato o un ácido nucléico.

El resto que contiene el antígeno puede ser una proteína unida a membranas que se selecciona del grupo que consiste en un antígeno y un receptor. En otro aspecto, la proteína unida a membranas es un antígeno, como un antígeno de los glóbulos rojos, tal como el antígeno Rh.

La invención también se refiere a un procedimiento de aislamiento de un ADN que codifica una proteína capaz de unirse a un resto que contiene el antígeno que comprende la generación de una genoteca de ADN sintética en un vector viral que expresa la proteína, la adicíon de un marcaje magnético a las células que expresan el resto que contiene el antígeno, la incubación del virus que expresa la proteína con las células magnéticamente marcadas en presencia de un exceso de células no marcadas que no expresan el resto que contiene el antígeno para formar una mezcla, en el cual el virus se une a las células magnéticamente marcadas, el aislamiento de las células unidas al virus a partir de la mezcla y la obtención del ADN que codifica la proteína a partir de ellas.

La invención se refiere además a un procedimiento de aislamiento de una proteína capaz de unirse a un resto que contiene el antígeno que comprende la generación de una genoteca de ADN sintética en un vector viral que expresa la proteína, añadiendo un marcaje magnético a las células que expresan el resto que contiene el antígeno, la incubación del virus que expresa la proteína con las células magnéticamente marcadas en presencia de un exceso de células no marcadas que no expresan el resto que contiene el antígeno para formar una mezcla, en la cual el virus se une a las células magnéticamente marcadas, el aislamiento de las células unidas al virus a partir de la mezcla y el aislamiento de la proteína a partir de ellas.

También se proporcionan procedimientos mediante los cuales se aísla una proteína capaz de unirse a un resto que contiene el antígeno. Los procedimientos comprenden la expresión de la proteína a partir del ADN que codifica la proteína, donde el ADN se obtiene mediante los procedimientos aquí descritos y el aislamiento de la proteína así expresada.

En la invención se incluye también un ADN aislado que codifica una proteína obtenida de acuerdo con los procedimientos aquí descritos.

La invención se también refiere a una preparación esencialmente pura de una proteína obtenida de acuerdo con los procedimientos aquí descritos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama de una estrategia para la selección de células marcadas en su superficie con fagos que expresan Fab utilizando una separación de células activadas magnéticamente.

Figura 2 es un gráfico que representa la biotinilación de la superficie celular en GRHs humanos.

Figura 3 es una serie de gráficos que validan el procedimiento de la separación de células positivas para antígeno y negativas para antígeno de la invención.

Figura 4 es una imagen de una prueba de aglutinación de placa de microensayo en la cual se midió un título de aglutinación de fagos expresando Fab anti-Rh(D).

Figura 5 es una imagen de una prueba de aglutinación de placa de microensayo que muestra la determinación de un epítopo de unión a Rh(D) para clones seleccionados de fagos expresando Fab anti-Rh(D).

Figura 6 es una imagen que representa el uso de anticuerpos de Fab expuestos en fagos en un ensayo en tarjeta de gel.

Descripción detallada

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento novedoso de aislamiento del ADN que codifica una proteína y la proteína codificada, en el cual la proteína es preferible un anticuerpo, el cual es capaz de unirse específicamente a un resto que contiene el antígeno.

Como se ejemplifica aquí, pero no limitándose a dichos ejemplos, el procedimiento comprende la generación de bacteriófagos que codifican anticuerpos humanos. Específicamente, en la presente invención se obtienen anticuerpos Fab anti-Rh(D) de glóbulos rojos expuestos en fagos codificados por una genoteca en el fago filamentoso M13. La genoteca se genera a partir de células productoras de anticuerpos obtenidas de un donante hiper-inmunizado mediante la obtención en primer lugar de DNAc derivado del ARNm expresado en las células productoras de anticuerpos. Los fragmentos que codifican Ig a partir del DNAc se obtienen utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e iniciadores específicos para tales fragmentos de ADN. El ADN específico de la Ig así obtenido se clona en un bacteriófago. El bacteriófago que codifica los fragmentos de Ig se selecciona frente a una mezcla de células GRH diana biotiniladas positivas para el antígeno pre-recubiertas de microesferas magnéticas conjugadas con streptavidina y un exceso de GRHs no marcados. El bacteriófago que expresa anticuerpos en la superficie de fago cuyos anticuerpos son específicos para el antígeno celular diana, se une a las células marcadas. Estos fagos se separan de los fagos que se han unido a las células no marcadas y de los fagos que no se han unido a las células utilizando una columna magnética. Los fagos
separados de esta manera codifican y exponen un anticuerpo específico para los antígenos de las células diana.

Para generar una genoteca de anticuerpos en fagos, en primer lugar se obtiene una genoteca de ADNc a partir de la ARNm, el cual se aísla de células que expresan la proteína deseada para que se exprese sobre la superficie del fago, por ejemplo el anticuerpo deseado. Las copias de ADNc obtenidas del ARNm se producen utilizando transcriptasa inversa. Los ADNc específicos para fragmentos de Ig se obtienen mediante PCR y el ADN resultante se clona en un vector bacteriófago adecuado para generar una genoteca de ADN en bacteriófago que comprende genes específicos de Ig. Los procedimientos para construir una genoteca de bacteriófagos que comprende ADN heterólogo se conocen bien en el campo y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.).

También se puede obtener una genoteca de bacteriófagos utilizando ADNc en lugar de fragmentos de ADN codificantes de Ig amplificados por PCR. La generación de una genoteca de DNAc es útil para el aislamiento de proteínas que no son anticuerpos, tales como ligandos y similares.

Los bacteriófagos que codifican la proteína deseada, por ejemplo un anticuerpo, se pueden manipular de tal manera que la proteína se muestre en superficie de modo que esté disponible para unirse a su proteína de unión correspondiente, por ejemplo el antígeno contra el cual se dirige el anticuerpo. Así, cuando bacteriófagos que expresan un anticuerpo específico se incuban en la presencia de una célula que expresa el antígeno correspondiente, los bacteriófagos se unirán a la célula. Los bacteriófagos que no expresan el anticuerpo no se unirán a la célula.

Para seleccionar los bacteriófagos, es decir, realizar la selección de los fagos que expresan el anticuerpo deseado, las células que expresan el antígeno correspondiente son marcados con un marcaje detectable, como la biotina. Después se añaden microesferas magnéticas conjugadas con streptavidina a las células. Las células se mezclan con un exceso de células no marcadas que no expresan el antígeno. Esta mezcla celular se incuba después con la genoteca de fagos, de modo que los fagos que expresan el anticuerpo se unen a las células que expresan el antígeno. La presencia de las células no marcadas en exceso en la mezcla sirve para eliminar los bacteriófagos que no expresan el anticuerpo pero que podrían unirse de manera no específica a las células que expresan antígeno. Los detalles de los procedimientos experimentales para la práctica de la presente invención se proporcionan aquí en la sección experimental detallada.

Las células que expresan antígeno y que tienen fagos que expresan anticuerpo unidos a ellas, se eliminan magnéticamente de la mezcla. Un ejemplo de eliminación magnética implica verter la mezcla de células magnéticas y no magnéticas en una columna en presencia o ausencia de un campo magnético selectivo que rodea a la columna. Alternativamente, las células magnéticas se pueden separar de las células no magnéticas en solución mediante la simple sujeción de un imán contra el lado de un tubo de ensayo y atrayendo las células a la pared interior y después eliminando con cuidado las células no magnéticas de la solución.

Así, el procedimiento de la invención implica un proceso para enriquecer una población de fagos recombinantes en aquellos que expresan ligandos específicos de proteínas expuestas en fagos derivadas de las genotecas naturales o sintéticas de ADN mediante la realización simultánea de una selección negativa y positiva contra una mezcla de partículas positivas del receptor marcadas magnéticamente (es decir, células) y de partículas negativas de receptor no marcadas.

Los términos "bacteriófago" y "fago" se utilizan aquí de manera intercambiable y se refieren a virus que infectan a bacterias. El uso de los términos "genoteca de bacteriófagos" o "genoteca de fago" como se utilizan aquí, significa una población de virus bacteriano que comprenden el ADN heterólogo, es decir, un ADN que no es codificado de manera natural por el virus bacteriano.

El término "vector viral" incluye un virus en el cual se ha introducido un ADN heterólogo. El vector viral puede ser un bacteriófago o puede ser un virus eucariótico.

El término "célula diana" como se utiliza aquí, significa una célula que expresa un antígeno contra el cual se busca el anticuerpo deseado.

El término "selección" o "seleccionado" como se utiliza aquí, significa el proceso de selección del fago que codifica el anticuerpo deseado.

El término "fago portador de Fab" como se utiliza aquí, significa una partícula de fago que expresa el fragmento Fab de un anticuerpo.

El término "fago portador de scFv" como se utiliza aquí, significa una partícula de fago que expresa el fragmento Fv de un anticuerpo como cadena simple.

Por "células no marcadas en exceso" se entiende una cantidad de células no marcadas que supera el número de células marcadas. Preferiblemente, la razón de células marcadas respecto a células no marcadas es aproximadamente 1:2. Más preferiblemente, la razón de células marcadas respecto a células no marcadas es mayor que aproximadamente 1:4. Aún más preferentemente, la razón de células marcadas respecto a células no marcadas es mayor que aproximadamente 1:10.

Mientras que el procedimiento de la invención, como se ejemplifica aquí, describe la generación de fagos que codifican el fragmento Fab de una molécula de anticuerpo, el procedimiento no se debería interpretar como limitado solamente a la generación de fago que codifica anticuerpos Fab. Más aún, los fagos que codifican anticuerpos de cadena simple (genotecas de anticuerpos en fagos portadores de scFV) se incluyen también en la invención. Las moléculas Fab comprenden la cadena ligera entera de la Ig, es decir, comprenden tanto la región variable como la constante de la cadena ligera pero incluyen solamente la región variable y el primer dominio de la región constante (CH1) de la cadena pesada. Las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla comprenden una sola cadena de proteína que comprende el fragmento de Fv de la Ig. Un fragmento Fv de la Ig sólo incluye las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, sin contener a la región constante. Los genotecas de fagos que comprenden el ADN de scFV se pueden generar siguiendo los procedimientos descritos en Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597. La selección del fago generado de esta manera para el aislamiento de un anticuerpo deseado se realiza como se describe aquí para las genotecas de fagos que comprenden el ADN de Fab.

Debe interpretarse asimismo que la invención incluye a las genotecas sintéticas de exposición en fagos en los cuales las regiones variables de las cadenas pesada y ligera pueden sintetizarse de modo que incluyan casi todas las especificidades posibles. Por lo tanto, las genotecas que exponen anticuerpos pueden ser "naturales" o "sintéticas" (Barbas, 1995, Nature Medicine, 1: 837-839; de Kruif et al., 1995, J. Biol. Mol. 248: 97-105). Las genotecas que exponen anticuerpos que comprenden anticuerpos "naturales" se generan como se describe en la sección de ejemplos experimentales. Las genotecas que exponen anticuerpos que comprenden anticuerpos "sintéticos" se generan siguiendo el procedimiento descrito en Barbas (1995, supra) y en las referencias ahí citadas.

Debería además interpretarse que el procedimiento de la invención incluye la generación de genotecas de exposición en fagos que comprenden fagos distintos del M13, como se ejemplifica aquí. Otro bacteriófago, como el fago lambda puede ser también útiles en el procedimiento de la invención. Se han generado genotecas de exposición en fagos lambda que exponen péptidos codificados por ADN heterólogo en su superficie (Sternberg et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1609-1613). Además, se contempla que el procedimiento de la invención se puede extender para incluir virus distintos a los bacteriófagos, como virus eucarióticos. De hecho, se pueden generar virus eucarióticos que codifican genes adecuados para su administración a un mamífero y que codifican y exponen un anticuerpo capaz de tener por objetivo una tipo celular o tejido específico en el cual el gen debe ser introducido. Por ejemplo, se han generado vectores retrovirales que exponen fragmentos de anticuerpo funcionales (Russell et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 1081-1085).

Los antígenos de los glóbulos rojos frente a los cuales se pueden generar anticuerpos incluyen pero no se limitan a los antígenos Rh incluyendo Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e) y otros antígenos no Rh incluyendo antígenos de glóbulos rojos de los grupos sanguíneos Kell, Duffy, Lutheran y Kidd.

De esta manera, el procedimiento de la invención no se limita solamente al aislamiento del ADN que codifica los anticuerpos anti-Rh(D) pero más bien se puede utilizar para el aislamiento de ADN que codifica anticuerpos dirigidos contra cualquier antígeno de GRHs u otro antígeno celular, tales como -pero no limitados a- antígenos específicos de tumores, antígenos bacterianos y similares. El procedimiento de la invención es también útil para el tipaje de plaquetas mediante la generación de anticuerpos en fagos específicos para un elenco de antígenos de plaquetas clínicamente importantes, principalmente P1^{A1}/P1^{A2}, Bak^{a}/Bak^{b}, Pen^{A}/Pen^{B} y similares.

La invención es además útil para el tipaje de células sanguíneas de la línea blanca del donante para los antígenos HLA con el propósito de hacer corresponder los de los donantes y los aceptores, para hacer corresponder potencialmente los del los transplantes tanto en el caso de órganos o tejidos sólidos (por ejemplo, riñón, corazón, hígado, pulmón) como no sólidos (por ejemplo, médula ósea).

Para detectar la unión de fagos que expresan el anticuerpo dirigido contra uno de estos antígenos que no son de glóbulos rojos, las células distintas a los hematíes se pueden aglutinar o atrapar siguiendo los procedimientos aquí descritos para la aglutinación o retención de glóbulos rojos. Antes de la aglutinación o retención, las células pueden hacerse "visibles" mediante tinción u otra técnica de marcaje para que la aglutinación o retención sea aparente a simple vista o mediante escaneo.

El procedimiento de la invención es más útil para la generación de una proteína que se une a un resto que contiene un antígeno, de modo que el resto que contiene el antígeno no es fácil de purificar en forma soluble. De esta manera, el resto que contiene el antígeno incluye antígenos que se asocian con otras estructuras, normalmente con membranas de la célula, tales como membranas celulares o membranas de los orgánulos celulares.

De acuerdo con la presente invención, el resto que contiene el antígeno puede ser una proteína, un lípido, un carbohidrato o un ácido nucléico o puede ser un complejo de por lo menos dos entre proteínas, lípidos, carbohidratos o ácidos nucléicos, puesto que muchos restos que portan antígenos en las células no consisten en uno sólo de dichos componentes. Preferiblemente, el resto que contiene el antígeno es una proteína de unión a membranas, tal como una proteína antigénica o receptora. Sin embargo, cuando el resto que contiene el antígeno es un carbohidrato, puede ser un carbohidrato expresado sobre un glicolípido, por ejemplo, un antígeno de grupo sanguíneo P u otro
antígeno.

Por el término "resto que contiene el antígeno" como se utiliza aquí, se entiende una molécula a la cual se une un anticuerpo.

El procedimiento de la invención es también útil para la generación de anticuerpos autoinmunes, tales como los implicados en anemia hemolítica autoinmune (AIHA) (Siegel et al., 1994, Structural analysis of red cell autoantibodies, Garratty (ed.), Immunobiology of Transfusion Medicine, Dekker, New York, New York). Utilizando la tecnología aquí descrita, se pueden aislar anticuerpos autoinmunes que dirigidos contra antígenos celulares asociados a la membrana de la superficie celular o a la membrana de orgánulos celulares. Las enfermedades autoinmunes y sus antígenos asociados, frente a los cuales se pueden aislar anticuerpos incluyen pero no se limitan a las siguientes:

Miastenia gravis (receptor de acetilcolina; neuronas), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (mielina; neuronas), enfermedad tiroidea autoinmune (receptor de hormonas estimuladoras del tiroides; células tiroideas), cirrosis biliar primaria (autoantígenos mitocondriales; mitocondrias de hígado), púrpura trombocitopénica idiopática (integrinas de membrana de plaqueta; plaquetas), pemphigus vulgaris (antígenos epidérmicos; epidermis) y síndrome de Goodpasture (antígenos de la membrana basal; células del riñón o pulmones).

De hecho, el procedimiento de la invención es útil para el aislamiento de clones de ADN que codifiquen cualquier anticuerpo dirigido contra un antígeno expresado sobre una célula, la cual puede ser marcada con un marcaje magnético y de la cual se pueden obtener cantidades suficientes en una forma no marcada para proporcionar un exceso de células no marcadas como se requiere en el ensayo.

Además, el procedimiento de la invención no se limita al aislamiento de ADN que codifica anticuerpos pero se puede además utilizar para el aislamiento de ADN que codifica otros péptidos o proteínas que tienen especificidad para proteínas celulares, tales como, por ejemplo -pero que sin limitarse a- ligandos que se unen a proteínas receptoras de la célula, hormonas peptídicas y similares.

La invención tampoco se debería interpretar como limitada al uso de biotina como el agente de marcaje de las células. Se pueden utilizar otros marcajes siempre que su adición a la célula no altere la integridad estructural de ninguna proteína de superficie expresada en ella y siempre que tales marcadores permitan la adición de una microesfera paramagnética u otra sustancia magnética a ellas. Tales marcadores alternativos incluyen pero no se limitan a proteínas de la superficie celular o carbohidratos que puedan conjugarse directamente con microesferas magnéticas que posean grupos activados de amina, carboxilo o tiol. Además, pueden utilizarse colorantes como la fluoresceína o rodamina, que pueden unirse también covalentemente a las células de forma similar a la biotina y a las microesferas magnéticas revestidas con anticuerpos anti-colorante.

La invención incluye las proteínas y el ADN que codifica las mismas que se generan utilizando los procedimientos aquí descritos. Para aislar el ADN que codifica un anticuerpo, por ejemplo, el ADN se extrae a partir de fagos que expresan el anticuerpo obtenidos de acuerdo con los procedimientos de la invención. Tales técnicas de extracción son bien conocidas en el campo y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., (supra).

Un ADN "aislado", como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia de ADN, un segmento o un fragmento que ha sido purificado de las secuencias que lo flanquean en su estado natural, por ejemplo, un fragmento de la ADN que ha sido separado de las secuencias que son normalmente adyacentes a dicho fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el cual existe naturalmente. El término también se aplica al ADN que ha sido purificado sustancialmente de otros componentes que acompañan de manera natural al ADN, por ejemplo, el ARN o el ADN o proteínas que lo acompañan naturalmente en la célula.

Se debe interpretar que la invención también incluye ADNs que son esencialmente homólogos al ADN aislado de acuerdo con el procedimiento de la invención. Preferiblemente, el ADN que es esencialmente homólogo posee alrededor de un 50% de homología, más preferiblemente alrededor de un 70% de homología, aún más preferiblemente alrededor de un 80% de homología y óptimamente alrededor de un 90% de homología al ADN obtenido utilizando el procedimiento de la invención.

"Homólogo", como se utiliza aquí, se refiere a la similitud de la secuencia de cada subunidad entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucléico, por ejemplo, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN o entre dos moléculas de polipéptidos. Cuando la posición de una subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones que coinciden o son homólogas, por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en las secuencias de dos compuestos son homólogas entonces las dos secuencias poseen un 50% de homología, si el 90% de las posiciones, por ejemplo 9 de 10, coinciden o son homólogas, las dos secuencias comparten un 90% de homología. Como ejemplo, las secuencias de ADN 3'ATTGCC 5'y 3'TATGCG 5'comparten un 50% de homología.

Para obtener una preparación esencialmente pura de una proteína que comprende, por ejemplo, un anticuerpo generado utilizando los procedimientos de la invención, la proteína se puede extraer de la superficie del fago sobre la cual está expresada. Los procedimientos para tal extracción son bien conocidos para los profesionales en el campo de la purificación de proteínas. Alternativamente, una preparación esencialmente pura de una proteína que comprende, por ejemplo, un anticuerpo, se puede obtener mediante la clonación de un ADN aislada que codifica el anticuerpo en un vector de expresión y la expresión de la proteína a partir de éste. La proteína expresada de esta manera se puede obtener utilizando procedimientos corrientes de purificación de proteínas bien conocidos en este campo.

Como se utiliza aquí, el término "esencialmente puro" describe un compuesto, por ejemplo, una proteína o polipéptido que ha sido separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Típicamente, un compuesto es esencialmente puro cuando por lo menos el 10%, más preferiblemente por lo menos el 20%, más preferiblemente por lo menos el 50%, más preferiblemente por lo menos el 60%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 90% y, óptimamente, por lo menos el 99% del material total (por volumen, por peso húmedo o seco o por porcentaje molar o fracción molar) en una muestra es el compuesto de interés. La pureza se puede medir mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, en el caso de polipéptidos mediante cromatografía en columna, mediante electroforesis en gel o mediante análisis de HPLC. Un compuesto, por ejemplo, una proteína, es también purificado esencialmente cuando está prácticamente libre de componentes naturalmente asociados o cuando es separado de los contaminantes naturales que lo acompañan en su estado natural.

La presente invención también proporciona análogos de proteínas o péptidos obtenidos de acuerdo con los procedimientos de la invención. Los análogos pueden ser distintos de las proteínas o péptidos que se encuentran en la naturaleza en virtud de diferencias conservativas en sus secuencias aminoacídicas o en virtud de modificaciones que no afectan a su secuencia o en virtud de ambas.

Por ejemplo, se pueden generar cambios conservativos de aminoácidos que, aunque alteran la secuencia primaria de la proteína o péptido, normalmente no alteran su función. Las sustituciones conservativas de aminoácidos típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos:

: glicina, alanina;

: valina, isoleucina, leucina;

: ácido aspártico, ácido glutámico;

: asparagina, glutamina;

: serina, treonina;

: lisina, arginina;

: fenilalanina, tirosina.

Las modificaciones (que normalmente no alteran la secuencia primaria) incluyen sustitución química de polipéptidos in vivo o in vitro, por ejemplo, acetilación o carboxilación. Asimismo se incluyen las modificaciones de glicosilación, por ejemplo, aquellas generadas mediante modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en pasos de procesamiento subsiguientes; por ejemplo, mediante la exposición del polipéptido a enzimas que afectan a la glicosilación, por ejemplo, enzimas glicosilantes o desglicosilantes de mamíferos. Asimismo se abarcan las secuencias que tienen residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

Asimismo se incluyen los polipéptidos que han sido modificados utilizando técnicas ordinarias de biología molecular para mejorar su resistencia a degradación proteolítica o para optimizar sus propiedades de solubilidad. Los análogos de tales polipéptidos incluyen aquellos que contienen residuos distintos a los aminoácidos L que se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, aminoácidos D o aminoácidos sintéticos que no existen en la naturaleza. Los péptidos de la invención no se limitan a los productos de ninguno de los procesos de los ejemplos específicos que se enumeran aquí.

Además de polipéptidos esencialmente íntegros, la presente invención proporciona los fragmentos activos de dichos polipéptidos. Un polipéptido específico se considera activo si se une a un resto que contiene un antígeno, por ejemplo, si un fragmento de un anticuerpo se une a su antígeno correspondiente de la misma manera que a la proteína íntegra.

Como se utiliza aquí, el término "fragmento" aplicado a un polipéptido, tendrá normalmente por lo menos alrededor de 50 aminoácidos contiguos, típicamente por lo menos alrededor de cien aminoácidos contiguos, más típicamente por lo menos alrededor de doscientos aminoácidos consecutivos y, por lo general, por lo menos alrededor de trescientos aminoácidos contiguos de longitud.

La invención se describe además en detalle por referencia en los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan solamente con propósitos ilustrativos y no pretenden ser limitantes salvo que se especifique de otra manera. Por lo tanto, la invención no debería ser de ninguna modo interpretada como limitante a los siguientes ejemplos sino más bien debería interpretarse que abarca cualquiera y todas las variaciones que se ponen en evidencia como resultado de las instrucciones aquí proporcionadas.

Los ejemplos experimentales aquí descritos proporcionan procedimientos y resultados para el aislamiento y producción de anticuerpos anti-Rh(D) de glóbulos rojos utilizando la exposición de Fab en fagos.

En la Figura 1 se describe un procedimiento para el aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos expuestos por fagos filamentosos específicos para moléculas no purificables expresadas en la superficie celular. Para optimizar la captura del fago específico para el antígeno y minimizar la unión de anticuerpos irrelevantes de los fagos, se utilizó una estrategia de selección simultáneamente positiva y negativa. Las células que portan el antígeno de interés se pre-recubren con microesferas magnéticas y se diluyen en un exceso de células no modificadas negativas para el antígeno. Tras incubación de la mezcla de células con una genoteca de Fab expuesta en fagos, la población celular positiva para el antígeno se recupera utilizando una separación de células activadas magnéticamente y los fagos que exponen Fab específica del antígeno se eluyen y propagan en un cultivo bacteriano. Cuando este protocolo se utilizó con glóbulos rojos humanos Rh(D) positivos marcados magnéticamente y glóbulos rojos humanos Rh(D) negativos no marcados en exceso y una genoteca de Fab expuesta en fagos construida a partir de linfocitos sanguíneos periféricos humanos, una docena de anticuerpos anti-Rh(D) _{\gamma 1}K y _{\gamma 1}\lambda únicos, clínicamente útiles, se aislaron de un único individuo aloinmunizado.

El procedimiento de selección de superficie celular de la presente invención es fácilmente adaptable para su uso en otros sistemas, tales como para la identificación de candidatos de antígenos específicos de tumores y proporciona una estrategia rápida (menos de un mes) y de alto rendimiento para el aislamiento de reactivos auto-replicativos de anticuerpos dirigidos a epítopos de superficie celular novedosos o dependientes de la conformación.

Construcción de genotecas de exposición de Fab en fagos

Se construyeron por separado genotecas en fagos _{\gamma 1}K y _{\gamma 1}\lambda a partir de 2 x 10^{7} células mononucleares derivadas de sangre periférica de un individuo Rh(D) negativo previamente hiperinmunizado con glóbulos rojos (GRHs) Rh(D) positivos. El vector fagémido pComb3 (Barbas, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982) se utilizó para crear las genotecas utilizando procedimientos previamente publicados (Barbas et al., 1991, Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (Phabs): Rapid selection of antigen-specific Fabs. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119-124; Siegel et al., 1994, Blood, 83: 2334-2344).

En breve, se preparó ADNc a partir de ARNm de células del donante y se amplificaron los segmentos del DNAc de la inmoglobulina (Ig) de las cadenas pesada y ligera utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la batería de Igs humanas descrita por Kang et al., (1991, "Combinatorial Immunoglobulin Libraries on the Surface of Phage (Phabs): Rapid Selection of Antigen-Specific Fabs". Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 111-118) suplementada por las de Silverman et al., (1995, J. Clin. Invest. 96: 417-426). Los productos de PCR de las cadenas pesada y ligera se clonaron en pComb3 y se electroporaron en E. coli. Tras co-infección con el fago helper VCSM13 (Stratagene, La Jolla, CA), el ADN de las Ig se empaquetó en las partículas de fagos filamentosos que expresan las moléculas Fab humanas fusionadas a la proteína del revestimiento del bacteriófago codificada por el
gen III.

Selección de clones de Fab anti-Rh(D) a partir de genotecas de exposición en fagos

Se biotinilaron en la superficie celular GRHs Rh(D) positivos mediante incubación de las células a un hematocrito del 10% con 500 \mug/ml de sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce Chemical, Rockford, IL) durante 40 minutos a temperatura ambiente (RT). Tras 5 lavados con tampón fosfato salino (PBS), se incubaron 8 x 10^{6} GRHs Rh(D) positivos biotinilados con 10 \mul de microesferas paramagnéticas recubirtas de streptavidina (MACS Streptavidin Microbeads, Mitenyi Biotec, Sunnyvale, CA) durante 1 hora a RT en un volumen total de 100 \mul de PBS. Las microesferas que no habían reaccionado se eliminaron mediante lavado y entonces los GRHs Rh(D) positivos recubiertos de microesferas magnéticas se mezclaron con un exceso de 10 veces (8 x 10^{7}) de GRHs Rh(D) negativos (no modificados) y \sim3 x 10^{11} unidades formadoras de colonia (ufc) de cada genoteca de exposición de Fab en fagos _{\gamma 1}K y _{\gamma 1}\lambda (preparadas como se ha descrito anteriormente) en un volumen final de 40 \mul de PBS contieniendo un 2% de leche desnatada en polvo (MPBS, Carnation, Nestle Food Products, Glendale, CA).

Tras una incubación de 2 horas a 37ºC, se cargó la suspensión de GRHs/fagos a una velocidad de flujo de 10 \mul/minuto a una columna MiniMACS magnética de tipo MS (Mitenyi Biotec, Sunnyvale, CA) que había sido pre-equilibrada con 2% de MPBS. Este paso de carga se realizó sin un campo magnético alrededor de la columna para prevenir que los GRHs revestidos de microesferas magnéticas se adhiriesen instantáneamente a la parte superior de la columna, atascándola y causando la retención de los GRHs Rh(D) negativos no biotinilados. La carga de la mezcla de incubación GRHs/fagos en ausencia de un campo magnético causa que los GRHs negativos y positivos para el antígeno se distribuyan homogéneamente por toda la columna sin perderse, puesto que el volumen excluido de la columna es ligeramente mayor a 40 \mul. Una vez cargada, la columna se somete a un campo magnético (unidad de separación magnética de MiniMACS, Mitenyi Biotec, Sunnyvale, CA) durante 2 minutos para permitir que los GRHs Rh(D) positivos se adhieren y se realiza una serie de lavados con 500 \mul con MPBS frío seguida de un lavado final con PBS. Se realizó un total de 3 lavados para las primeras dos rondas de selección y se realizó un total de 6 lavados para todas las selecciones subsiguientes. Para cada proceso de selección, el primer lavado se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 10 \mul/minuto, tiempo durante el cual la mayoría de los GRHs Rh(D) negativos se lavó de la columna. Todos los lavados subsiguientes se realizaron a 200 \mul/minuto. Tras el último lavado, se eliminó del campo magnético de la columna y los GRHs Rh(D) positivos revestidos de microesferas y revestidos de fagos se eluyeron de columna con 500 \mul de PBS utilizando el émbolo de una jeringa de 5 cc (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Los GRHs se centrifugaron inmediatamente durante 5 segundos a 13.000 x g y después se resuspendieron en 200 \mul de citrato 76 mM, pH 2,4, para desnaturalizar el antígeno Rh(D) y eluir fago unido. Tras un periodo de incubación de 10 minutos a RT agitando intermitentemente en vórtex, el eluído del fago y los restos celulares se neutralizaron con 18 \mul de Tris base 2M y se añadieron a 10 ml de D.O.=1,0 de la cepa azul XL1 de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) crecida en medio Super (SB) (Barbas et al., 1991, supra) suplementada con 10 \mug/ml de tetraciclina. Tras una incubación de 15 minutos a RT, durante los cuales se permitió que la genoteca de fagos enriquecida en clones específicos para Rh(D) infectase al cultivo bacteriano, se añadieron 10 ml de SB precalentado a 37ºC que contenían 40 \mug/ml de carbenicilina y 10 \mug/ml de tetraciclina para generar las concentraciones finales de antibióticos de 20 \mug/ml y 10 \mug/ml, respectivamente. Se eliminó inmediatamente una pequeña alícuota de cultivo (\sim100 \mul) y se calculó el título sobre placas de LB/carbenicilina para determinar el número de fagos contenidos en el eluido total. El resto del cultivo se agitó a 37ºC durante una hora a 300 RPM. Posteriormente se añadieron antibióticos adicionales, SB adicional y fago helper VCSM13 y el cultivo creció durante la noche a 30ºC como se ha descrito en (Siegel et al., 1994, supra).

Las partículas de fagémido se purificaron del sobrenadante del cultivo mediante precipitación con polietilenglicol 8000 (PEG) (Barbas et al., 1991, supra), resuspendidas en 1% de albumina de suero bovino (BSA)/PBS y se dializaron durante la noche para eliminar el PEG residual que podría lisar los GRHs durante rondas subsiguientes de selección. De esta manera, la preparación de fago resultante sirve como iniciador para la ronda siguiente de selección. Las genotecas en _{\gamma 1}K y _{\gamma 1}\lambda se seleccionaron separadamente para prevenir cualquier predisposición en la replicación del isotipo de la cadena ligera posiblemente introducida por la amplificación en bacterias.

Rastreo de las genotecas de Fab policlonales en fagos y las colonias de fago individuales en función de su reactividad anti-Rh(D)

Se valoró la especificidad de las Fab expuestas en fagos para el antígeno Rh(D) utilizando anticuerpo anti-M13 como anticuerpo puente para inducir la aglutinación entre los GRHs que han unido fagos que exponen Fab anti-Rh(D). Alícuotas de 100 \mul de Fab/fago policlonal obtenido de las rondas de seleccción o Fab/fago monoclonal derivado de clones individuales eluidos de Fab/fago, se incubaron con 50 \mul de una suspensión al 3% de GRHs del fenótipo definido (es decir, Rh(D)-negativo o –positivo).

Tras una incubación de 1 hora a 37ºC, los GRHs se lavaron 3 veces con 2 ml de PBS frío para eliminar Fab/fagos no unidos. Los sedimentos de GRHs resultantes se resuspendieron en 100 \mul de una solución de 10 \mug/ml de anticuerpo anti-M13 de oveja (5-Prime 3-Prime, Boulder, CO) y se transfirió a los pocillos de fondo redondo de una placa microensayo de 96 pocillos. Las placas se dejaron en reposo (\sim2 horas) y después se leyeron. Los pocillos que tienen una reacción negativa muestran puntos definidos de \sim2 mm de diámetro de GRHs, mientras que en los pocillos que tienen reacciones positivas, es decir, aglutinación, los GRHs en los pocillos aglutinados forman una tapete fino revistiendo el fondo entero del pocillo.

Para las pruebas de hemaglutinación utilizando tarjetas de minicolumnas de gel (ID-Micro-Typing System, Ortho Diagnostics, Raritan, NJ) (Lapierre et al.,1990, Transfusion, 30: 109-113), 25 \mul de clones de Fab/fago se mezclaron con alícuotas de 50 \mul de GRHs (suspensiones al 0,8% en el tampón de Micro-Typing System, Ortho Diagnostics). Las mezclas se colocaron en los depósitos encima de las minicolumnas que contienen microesferas de dextrano-acrilamida previamente suspendidas en 100 \mul/ml de anticuerpo anti-M13. Tras una incubación a 37ºC, las tarjetas de gel se centrifugaron a 70 x g durante 10 minutos y se leyeron.

\newpage

Procedimientos diversos

La preparación de los GRHs marcados con fluorescencia para citometría de flujo se realizó como se describe aquí y las muestras se analizaron utilizando un microfluorímetro FACScan equipado con el software Lysis II (V 1.1) (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). El ADN plasmídico se preparó a partir de los clones bacterianos (Qiawell Plus, Qiagen, Chatsworth, CA). El ADN de doble cadena se secuenció utilizando iniciadores reversos de la región constante de la cadena ligera o de la cadena pesada de la Ig o iniciadores únicos del vector pComb3 que hibridan en 5-prima respecto a las cadenas de Ig respectivas (Barbas et al.,1991, supra; Roben et al., 1995, J. Immunol. 154: 6437-6445) y secuenciación automatizada fluorescente (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias se analizaron utilizando el software de secuenciación MacVector versión 5.0 (Oxford Molecular Group, Oxford, UK) y la base de datos de Tomlinson de genes de Ig de líneas germinales (Tomlinson et al., 1996, V Base Sequence Directory. MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, UK).

Diseño experimental para la incubación celular y protocolos de separación

Las condiciones experimentales descritas anteriormente para la selección de fagos anti-GRH reactivos a partir de genotecas de Fab expuestas en fagos se determinaron tras la realización de una serie de estudios iniciales dirigidos a optimizar el proceso de separación celular y perfeccionar el rendimiento total de Fab/fago de específico de antígeno. Los parámetros principales investigados incluyen:

Biotinilación: Se buscaron las condiciones que biotinilaran la superficie de los GRHs de manera que un número suficiente de microesferas magnéticas recubiertos de streptavidina se uniesen a las células causando que los GRHs fueran retenidos por una columna magnética. En este caso, se debe evitar que una biotinilación excesiva pueda destruir la antigenicidad del antígeno Rh(D) o que pueda hacer que las células absorban anticuerpo inespecíficamente. Para abordar este asunto, GRHs Rh(D)-positivos/Kell-negativos (Kell es un antígeno de los GRHs); (Walker, ed. 1993, Technical Manual,11th Edition, Bethesda: American Association of Blood Banks) se incubaron con un rango de concentraciones de sulfo-NHS-LC-biotina y el grado de biotinilación se calculó mediante citometría de flujo utilizando straptavidina conjugada con fluoresceína.

Para determinar el grado de biotinilación en la superficie celular, alícuotas de 5 \mul de suspensiones al 3% de los GRHs Rh(D)-positivos/Kell-negativos biotinilados en distintas concentraciones de reactivos de biotina se incubaron con 200 \mul de una dilución 1/100 de FITC-streptavidina (Jackson ImmunoResearch, Bar Harbor, Maine) durante 30 minutos a 4ºC (Figura 2). La mezcla se lavó con tampón fosfato salino (PBS) y se analizó mediante microfluorimetría de flujo (-\square-). Asimismo se analizó en alícuotas de células la retención de antigenicidad Rh(D) (-\Delta-) (es decir, tinción específica) o la ausencia de colorante no específico (-\medcirc-) mediante la incubación de las células con 100 \mul de suero de tipaje bien anti-Rh(D) o bien anti-Kell, respectivamente, lavando las células y después tiñéndolas con una dilución 1/100 de IgG anti-humano de cabra conjugada con FITC (Jackson ImmunoResearch).

Se observó una respuesta lineal, no saturada (Figura 2). Se determinó la retención de la antigenicidad Rh(D) utilizando el suero de tipaje anti-Rh(D) y se encontró que no estaba afectada por la conjugación de las proteínas de la superficie celular con biotina en todas las concentraciones de biotina examinadas (Figura 2). Además, los GRHs Kell negativos no adsorbieron inespecíficamente anticuerpos anti-Kell.

Cada muestra de GRHs biotinilada se incubó después con un exceso de microesferas magnéticas recubiertas de streptavidina y se hizo pasar por una columna de separación magnética. Se determinó que la columna puede retener hasta 10^{8} GRHs para las muestras de GRHs biotiniladas con 500 \mug/ml o más de reactivo de biotina. Puesto que los experimentos reales de selección de GRHs/fago se diseñaron para usar sólo \sim10^{7} de células Rh(D) positivas (véase abajo), la biotinilación de GRHs a 500 \mug/ml se determinó como suficiente.

Concentración de GRHs Rh(D) positivos y Rh(D) negativos en la mezcla de incubación

Antes de la realización de experimentos de selección de Fab/fagos, la capacidad de la técnica de separación de células magnéticamente activadas para discernir las células Rh(D) positivas y Rh(D) negativas se determinó utilizando suero de tipaje anti-Rh(D) y citometría de flujo (Figura 3). Los GRHs Rh(D) positivos biotinilados y recubiertos con microesferas de streptavidina (8 x 10^{6} células) se mezclaron con un exceso de 10 veces de GRHs Rh(D) negativos no recubiertos (8 x 10^{7} células) en un volumen de 40 \mul de PBS conteniendo un 2% de leche desnatada en polvo (MPBS) y la mezcla se incluyó en una columna MiniMACS. La columna se lavó y las células unidas se eluyeron como se describe aquí. Las alícuotas de GRHs contenidas en la mezcla original (panel a), el lavado de la columna (panel b) y el eluído de columna (panel c) se tiñeron con suero de tipaje anti-Rh(D) e IgG anti-humano de cabra conjugada con FITC como se describe en la Figura 2. Los citogramas de flujo muestran que aunque el \sim90% de las células en la carga de la columna fueron Rh(D) negativas (panel a), casi todas ellas se lavaron de la columna (panel b), rindiendo un eluído de columna constituido casi exclusivamente por células Rh(D) positivas (panel c). Puesto que sólo el \sim6% del eluído final comprendía células Rh(D) negativas (panel c) y las células Rh(D) negativas estaban presentes inicialmente en un exceso de 10 veces respecto a las células Rh(D) positivas, solamente el \sim0,6% de las células iniciales Rh(D) negativas inmunoadsorbentes contaminaron la preparación final positiva para el antígeno. Esta eficiencia de separación celular se consideró adecuada para los experimentos de selección subsiguientes con
Fab/fago.

En el experimento arriba descrito, para evitar que se atore la columna de separación magnética, fue necesario cargar la columna en la ausencia de un campo magnético. Esto necesitó un volumen de reacción menor o igual a 40 \mul para que ninguno de los materiales se escape de la columna. Desde un punto de vista teórico (Kretzschmar et al., 1995, Anal. Biochem. 224: 413-419), se puede calcular la concentración adecuada de células requeridas para que en un volumen de 40 \mul se capture más del 50% de Fab/fago específico para un antígeno de superficie celular determinado. Tal cálculo es función del número de sitios antigénicos por célula y la constante de disociación (K_{D}) de Fab/fago unido. Utilizando un valor de \sim100.000 sitios antigénicos Rh(D) por cada GRH (fenotipo "-D-/-D-") (Mollison et al., 1993, Blood Transfusion in Clinical Medicine, Oxford, Blackwell Scientific Publications) y la afinidad de Fab/fago deseada en el rango de K_{D} = 10^{-8} a 10^{-9} M, serían necesarios 8 x 10^{6} de GRHs Rh(D) positivos en un volumen de reacción de 40 \mul. Dado este número de células Rh(D) positivas, se encontró que un exceso de 10 veces de GRHs Rh(D) negativos era la cantidad máxima de células negativas para el antígeno que podía ser separada de manera eficaz de los GRHs positivos para el antígeno por la columna magnética (Figura 3).

Construcción y selección de genotecas de Fab expuestas en fagos

Las genotecas de fagos _{\gamma 1}K y _{\gamma 1}\lambda se prepararon como se describe aquí y se encontró que contenían 7 x 10^{7} y 3 x 10^{8} transformantes independientes respectivamente. La Tabla 1 tabula los resultados de la selección para las genotecas.

Una prueba de aglutinación de GRHs utilizando anticuerpo secundario anti-M13 como anticuerpo puente se utilizó para detectar la actividad anti-Rh(D) de los Fab/fagos seleccionados de las genotecas policlonales y clones de Fab/fago individuales cogidos al azar (Figura 4). Los resultados mostrados son un ejemplo representativo del ensayo, mostrando una reactividad negativa frente a los GRHs Rh(D) negativos y una fuerte reactividad positiva frente a los GRHs Rh(D) positivos para la genoteca de _{\gamma 1}K (selección #2) hasta una dilución de 1/2048.

En el caso de la genoteca en _{\gamma 1}K, un enriquecimiento significativo para la unión de fagos parece ocurrir tras una sola ronda de selección, mientras que un enriquecimiento significativo para la genoteca en _{\gamma 1}\lambda ocurre durante la segunda ronda. Esto se refleja por tanto por un marcado incremento en el porcentaje de fago unido durante una determinada ronda de selección como por la capacidad de las genotecas policlonales de Fab/fago en _{\gamma 1}K y _{\gamma 1}\lambda para aglutinar los GRHs Rh(D) positivos tras la primera y segunda ronda de selección, respectivamente (Tabla 1, Figura 4).

Los Fab/fagos monoclonales se prepararon de colonias bacterianas individuales cogidas al azar, obtenidas durante cada ronda de selección. Fue aparente que en la tercera ronda de selección, todos los clones tenían especificidad anti-Rh(D) (Tabla 1). Para confirmar que estos Fab/fagos tenían especificidad anti-Rh(D) y que no se estaban uniendo a otros antígenos no relacionados que pudieran estar casualmente presentes en un determinado GRH Rh(D) positivo y ausentes en un determinado GRH Rh(D) negativo utilizado en los ensayos de aglutinación, se ensayaron los clones frente a un panel de 11 GRHs Rh(D) negativos y positivos de diversa especificidad de grupo sanguíneo para verificar su especificidad anti-Rh(D) (Walker, 1993, supra).

Análisis de los clones a nivel genético

Para investigar la diversidad genética entre los clones anti-Rh(D) escogidos al azar, se preparó ADN plasmídico de cada uno de los clones y se identificaron las secuencias nucleotídicas de las correspondientes cadenas ligera y pesada de la Ig. En la Tabla 2 se enumera un número de atributos para cada clon incluyendo el nombre de la línea germinal más relacionada del gen de la cadena ligera o pesada de la Ig. Un análisis más detallado a nivel de nucleótido reveló que entre todos los clones de unión a anti-Rh(D) había un gran número de secuencias únicas de ADN de las cadenas ligera y pesada (Tabla 3). A causa de la recombinación al azar entre segmentos de los genes de las cadenas ligera y pesada que ocurre durante la generación de una genoteca de Fab de exposición en fagos (Barbas et al.,1991, supra), es evidente que estas cadenas pesadas y cadenas ligeras se combinan para formar casi 50 anticuerpos anti-Rh(D) diferentes.

Un análisis detallado de la alineación múltiple entre las secuencias de aminoácidos predichas revelaron un total de 25 proteínas únicas para la cadena pesada, 18 proteínas únicas para la cadena ligera kappa y 23 proteínas únicas para la cadena ligera lambda. Debido al efecto combinatorio durante la construcción de genoteca, estos segmentos de los genes de las cadenas ligera y pesada se aparearon para producir 50 únicos anticuerpos Fab (20 _{\gamma 1}K y 30 _{\gamma 1}\lambda). Particularmente, todas las veinticinco cadenas pesadas únicas y casi todas las dieciocho cadenas ligeras kappa derivaban de sólo 5 V_{H}III o 4 V_{K}I genes de la línea germinal respectivamente, mientras que las cadenas ligeras lambda derivaban de una serie más diversa de genes de la línea germinal. El análisis de las secuencias nucleotídicas de las cadenas ligera y pesada de alrededor de sesenta clones negativos de las genotecas no seleccionadas se realizó para verificar la heterogeneidad en la representación de la familia de las regiones variables antes de la selección. Se encontraron clones que representaban a las familias V_{H} I (13%), III (36%), IV (31%), V (15%) y VI (5%); las familias V_{K} I (43%), II (14%), III (29%) y IV (14%); y las familias de V_{\gamma} I (48%), II (4%), III (9%), IV (4%), V (9%), VI (17%) y VII (9%).

Análisis de los clones a nivel de proteína

Para investigar la diversidad en la alta especificidad (especificidad frente al epítopo del antígeno Rh(D)) entre los clones anti-Rh(D), se realizaron experimentos de aglutinación con clones seleccionados y con series de GRHs raros Rh(D) positivos obtenidos de individuos cuyos GRHs producían un antígeno Rh(D) que carece de ciertos epítopos. Examinando el patrón de aglutinación de un anticuerpo anti-Rh(D) particular con dichos conjuntos de GRHs mutados posibilita la identificación del epítopo específico del Rh(D) al cual se dirige el anticuerpo (Mollison et al., 1993, supra). Un ejemplo representativo de tal experimento se muestra en la Figura 5 y los epítopos de Rh(D) para los clones de Fab/fago anti-Rh(D) seleccionados se tabulan en la Tabla 2.

Se realizaron experimentos de aglutinación con GRHs negativos para anti-Rh(D) (rr), GRHs Rh(D) positivos (R_{2}R_{2}) y GRHs Rh(D) positivos "parciales" (mosaicos de IIIa, IVa, Va, VI, VII). Los resultados mostrados son un ejemplo representativo del ensayo para 5 clones de Fab/fago anti-Rh(D) escogidos al azar (Figura 5).

1

\vskip1.000000\baselineskip

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 1 La ronda de selección, donde  0  representa la genoteca de
Fab/fago inicial, antes del proceso de selección\cr  2 
 \begin{minipage}[t]{150mm} El número de unidades formadoras
colonia (UFCs) del fago ( \Phi ) incubado con la mezcla de GRHs
Rh(D) positivos/negativos\end{minipage} \cr  3 El número
total de UFCs de  \Phi  contenidos en el eluído\cr  4 (cantidad de
 \Phi  al inicio y al final del proceso de selección) x 100\cr  5
Incremento en número de veces del % de fagos unidos en comparación
con la ronda de selección anterior.\cr  6 Título de aglutinación;
véase el texto y la Figura 4\cr  7   \begin{minipage}[t]{150mm}
Número de clones de Fab/fago unidos a Rh(D) respecto al
número total de clones rastreados en cada ronda de selección; para
los detalles, véase la Tabla 2 para más
detalle\end{minipage} \cr}

3

4

5

6

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 1  \begin{minipage}[t]{153mm} Nomenclatura: el prefijo
 KPO  denota la  genoteca de Fab/fago  \gamma 1K, selección
0 ,  KP1  denota la  genoteca de Fab/fago  \gamma 1K,
selección 1 , etc.\end{minipage} \cr  2 Aglutinación
negativa o positiva frente a GRH Rh  (D) positivo\cr  3 Familia
génica de la región variable de la cadena pesada de la Ig según
Tomlinson  et al .,  supra \cr  4
 \begin{minipage}[t]{153mm} El gen de región variable de la
cadena pesada de la Ig más estrechamente relacionado según Tomlinson
 et al .,  supra \end{minipage} \cr  5 Familia génica
de la región variable de la cadena ligera de la Ig según Tomlinson
 et al .,  supra \cr  6  \begin{minipage}[t]{153mm} El
gen de región variable de la cadena ligera de la Ig más
estrechamente relacionado según Tomlinson  et al .,
 supra \end{minipage} \cr  7
 \begin{minipage}[t]{153mm} El epítopo Rh(D) según se
determinó mediante el patrón de aglutinación de GRHs raros (véase la
Figura 5 y su
texto)\end{minipage} \cr}

7

8

9

10

11

12

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 1   \begin{minipage}[t]{153mm}Nomenclatura: el prefijo
 LPO  denota la  genoteca de Fab/fago  \gamma 1 \lambda ,
selección 0 ,  LP1  denota la  genoteca de Fab/fago
 \gamma 1 \lambda , selección 1 , etc.\end{minipage} \cr  2
Aglutinación negativa o positiva frente a GRH Rh  (D)
positivo\cr  3 Familia génica de la región variable de la cadena
pesada de la Ig según Tomlinson  et al .,  supra \cr  4 
 \begin{minipage}[t]{153mm}El gen de región variable de la
cadena pesada de la Ig más estrechamente relacionado según Tomlinson
 et al .,  supra \end{minipage} \cr  5 Familia génica
de la región variable de la cadena ligera de la Ig según Tomlinson
 et al .,  supra \cr  6   \begin{minipage}[t]{153mm}El
gen de región variable de la cadena ligera de la Ig más
estrechamente relacionado según Tomlinson  et al .,
 supra \end{minipage} \cr  7 
 \begin{minipage}[t]{153mm}El epítopo Rh(D) según se
determinó mediante el patrón de aglutinación de GRHs raros (véase la
Figura 5 y su
texto)\end{minipage} \cr}

TABLA 3

Resumen del análisis de los clones de Fab/fago
Número de cadenas pesadas únicas	25
Número de cadenas ligeras K únicas	18
Número de cadenas ligeras \lambda únicas	23
Número de anticuerpos \gamma1K	20
Número de anticuerpos \gamma1\lambda	30
Número de especificidades para el epítopo Rh(D) representadas	5

Uso de anticuerpos Fab expuestos en fagos como reactivos para el tipaje de bancos de sangre

La capacidad de las preparaciones de Fab anti-Rh(D) expuestos en fagos para distinguir de manera precisa hematíes Rh(D) negativos de Rh(D) positivos en ensayos de hemaglutinación en placas microensayo (Figuras 4 y 5) proporciona una evidencia de que un ensayo en gel (Lapierre et al., 1990, Transfusion 30: 109-1130) utilizado por los bancos de sangre para determinar el fenotipo de hematíes utilizando antisueros convencionales podría ser adaptado para usarse con Fab generados en fago.

El ensayo en gel comprende una tarjeta de plástico de aproximadamente 5 x 7 cm, que contiene 6 minicolumnas cada una de ellas contendiendo unos 20 microlitros de microesferas de dextrano-acrilamida suspendidas en globulina anti-humana (reactivo de Coombs). Los glóbulos rojos a tipar se incuban con el antisuero humano deseado y se centrifugan a través del gel. Los hematíes que son positivos para antígenos a los cuales está dirigido el antisuero aglutinan en cuanto entran en contacto con la globulina anti-humana y quedan atrapados dentro o encima de la matriz del gel. Los hematíes que no reaccionan sedimentan a través de las partículas del gel y forman un sedimento en fondo del microtubo. Puesto que el ensayo en gel ofrece un número de ventajas sobre los métodos tradicionales utilizados en los bancos de sangre para determinar el fenotipo de los hematíes, incluyendo un volumen menor de reactivo, la eliminación de un paso de lavado de células y una interpretación más objetiva de los resultados, muchos bancos de sangre han adoptado esta nueva tecnología. Como se muestra en la Figura 6, el Fab anti-Rh(D) expuesto en fagos puede ser utilizado con tarjetas de gel modificadas que contengan anticuerpo anti-M13.

Para realizar el ensayo, glóbulos rojos sanguíneos Rh(D) negativos o positivos se incuban con diluciones de Fab anti-Rh(D) expuesto en fagos (genoteca _{\gamma}_{1}K, panning #2) y se centrifugan en microcolumnas que contienen microesferas suspendidas en anticuerpo anti-M13. La solución madre no diluida de Fab expuesto en fago tenía un título de 5 x 10^{12} ufc/ml similar al del ensayo de puesta a punto de la placa microensayo (Figura 4). Puesto que el volumen de Fab expuesto en fagos utilizado en este ensayo es un cuarto del utilizado en el ensayo en placa microensayo, la cantidad de Fab expuesto en fagos presente en la dilución 1/625 es aproximadamente igual al presente en la dilución 1/2048 de la Figura 4. Por tanto, el número de Fab expuesto en fagos requerido para obtener un resultado positivo es esencialmente equivalente en ambos ensayos.

En otros ensayos que fueron realizados como se acaba de describir, cuando el anticuerpo anti-M13 se eliminó del ensayo no se observó aglutinación de glóbulos rojos. Además, el anticuerpo anti-IgG no reacciona con Fabs recombinantes expresados en la superficie del bacteriófago. Sólo las células Rh positivas que se hicieron reaccionar con fago anti-Rh aglutinaron cuando el anticuerpo anti-M13 estaba presente en el ensayo. Debe apreciarse que cuando se utilizaron altas concentraciones de anti-M13, incluso las células Rh negativas parecían aglutinar. Esto es un artefacto que resulta del entrecruzamiento de fago no unido (es decir, no reaccionado) que da lugar a una reacción cruzada en presencia de grandes cantidades de anticuerpo anti-M13 y forma una matriz semi-impenetrable a través de la cual no todas las células anti-Rh negativas pueden pasar. En los experimentos que aquí se describen, una concentración de anti-M13 de 100 \mug/ml se consideró óptima para la aglutinación y para la prevención de falsos positivos. Dependiendo de las concentraciones precisas de reactivos y de células utilizadas en el ensayo, la concentración de anti-M13 puede desviarse de este número.

Para determinar la sensibilidad relativa del Micro Typing System modificado con anti-M13, se añadieron a las columnas de las tarjetas de Micro Typing System 100 \mug/ml de anticuerpo anti-M13. Los glóbulos rojos Rh negativos o Rh positivos se incubaron con anticuerpos anti-Rh de fago sin diluir o en diluciones seriadas 5 veces (1/5, 1/25, 1/125, 1/625 y 1/3125). Las tarjetas se centrifugaron y las muestras se sometieron a un ensayo de aglutinación. El ensayo en tarjetas Micro Typing System modificadas fue capaz de detectar aglutinación anti-Rh a una dilución de entre 1/625 y 1/3125.

Procedimientos para el aislamiento de anticuerpos específicos de tumores

Los Fab expuestos en fagos específicos para células tumorales son útiles para el diagnóstico in vitro (ensayos de laboratorio de muestras de biopsias, fluidos o sangre), el marcaje in vivo de tumores/metástasis (acoplamiento de anticuerpo a una sonda apropiada para la toma de imágenes) o para el tratamiento de tumores malignos (acoplamiento de anticuerpos a toxinas químicas radiactivas). Los anticuerpos específicos de tumores son también útiles para la identificación de nuevos antígenos o marcadores en las células tumorales que pueden constituir la base para vacunas antitumorales. Además, los anticuerpos específicos de tumores útiles para la generación de anticuerpos anti-idiotípicos pueden también constituir la base para vacunas antitumorales.

Los anticuerpos antitumorales se generan esencialmente como se ha descrito aquí para la generación de anticuerpos anti-Rh. Células tumorales, por ejemplo, pero no limitadas a, células de melanoma maligno, se biotinilan en su superficie, se marcan con microesferas magnéticas de estreptavidina y se mezclan entonces con un exceso de melanocitos normales. Las genotecas en fagos de Fab se generan a partir de linfocitos de sangre periférica de pacientes con melanoma que poseen anticuerpos antitumorales terapéuticamente útiles. Un número de pacientes con melanoma que se han "curado", lo han hecho aparentemente mediante una respuesta inmune humoral (es decir, anticuerpos). Estas genotecas en fago de Fab se incuban con la mezcla de células. Los fagos portadores de Fabs dirigidos frente a epítopos específicos de células malignas se unirán a las células malignas y pueden aislarse entonces utilizando la estrategia de panning mediante columna magnética.

Aislamiento de fagos portadores de Fab que identifican factores de virulencia bacterianos

La estrategia aquí descrita puede utilizarse para aislar fagos portadores de Fab capaces de detectar las diferencias entre bacterias virulentas y sus congéneres no patogénicos. En este caso, se etiqueta magnéticamente la cepa virulenta de bacteria, se diluye con la bacteria no patógena y se añade una genoteca de fagos portadores de Fabs que ha sido generada a partir de linfocitos obtenidos de individuos infectados con la cepa virulenta. Los fagos portadores de Fab que se aíslan de esta manera pueden ser útiles para la identificación de nuevos antígenos bacterianos frente a los cuales pueden desarrollarse compuesto antibacterianos y/o vacunas.

Claims

1. Un procedimiento para el aislamiento de un ADN que codifica una proteína que se une a un resto que contiene un antígeno, dicho procedimiento comprende

la generación de una genoteca de exposición en fagos que comprende una pluralidad de vectores virales, de modo que al menos uno de dichos vectores virales expresen dicha proteína en su superficie y comprendan dicho ADN, siendo dicho ADN heterólogo con respecto a dicho vector viral;

la adición de un marcaje magnético a las células portadoras de dicho resto portador de antígeno en su superficie;

la incubación de dicha genoteca de exposición en fagos con dichas células marcadas magnéticamente en presencia de un exceso de células no marcadas que no expresan dicho resto portador de antígeno para formar una mezcla, de modo que al menos uno de dichos vectores virales se una a las células marcadas magnéticamente;

el aislamiento de células marcadas magnéticamente de dicha mezcla, de modo que al menos uno de dichos vectores virales es aislado a partir de dicha mezcla; y

la obtención de ADN que codifica dicha proteína a partir de dicho vector viral aislado.

2. Un procedimiento de aislamiento de una proteína que se une a un resto portador de antígeno, dicho procedimiento comprende

la generación de una genoteca de exposición en fagos que comprende una pluralidad de vectores virales, de modo que al menos uno de dichos vectores virales comprende un ADN heterólogo que codifica dicha proteína y expresa dicha proteína en su superficie;

la adición de un marcaje magnético a las células que portan dicho resto portador de antígeno en su superficie;

el aislamiento de dicha proteína a partir de dicho vector viral aislado.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el cual dicho vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector bacteriófago M13, un vector bacteriófago lambda y un vector retroviral eucariótico.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el cual dicho vector viral es un vector del bacteriófago M13.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el cual dicha proteína se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un ligando y una hormona.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el cual dicha proteína es un anticuerpo.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el cual el dicho anticuerpo es un anticuerpo frente al antígeno de superficie de los glóbulos rojos.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el cual el dicho anticuerpo es un anticuerpo frente al Rh de los glóbulos rojos.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el cual el dicho anticuerpo es un anticuerpo frente al Rh(D) de los glóbulos rojos.

10. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el cual dicho resto portador de antígeno se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un lípido, un carbohidrato, un ácido nucléico y un complejo de al menos una proteína, un lípido, un carbohidrato o un ácido nucléico.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el cual dicho resto portador de antígeno es una proteína unida a membrana.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el cual dicha proteína unida a membrana se selecciona del grupo que consiste en un antígeno y una receptor protéico.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el cual dicha proteína asociada a membrana es un antígeno.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el cual dicho antígeno es un antígeno de los glóbulos rojos.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el cual dicho antígeno es un antígeno Rh.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el cual dicha genoteca de exposición en fagos es una genoteca de exposición en fagos sintética.

17. El procedimiento de la reivindicación 2, en el cual dicha genoteca de ADN es una genoteca de exposición en fagos sintética.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el cual dichas células marcadas magnéticamente se aíslan de dicha mezcla mediante el paso de dicha mezcla por una columna de separación magnética y la elusión de dichas células no marcadas a partir de dicha columna.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el cual dicha mezcla se hace pasar por dicha columna en ausencia de un campo magnético.

20. El procedimiento de la reivindicación 2, en el cual dichas células marcadas magnéticamente se aíslan a partir de dicha mezcla haciendo pasar dicha mezcla por una columna de separación magnética y eluyendo dichas células no marcadas a partir de dicha columna.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el cual dicha mezcla se hace pasar por dicha columna en ausencia de un campo magnético.