JP2002503085A - タンパク質の製造のための磁気活性化細胞の分類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＤＮＡ及びそれによりコードされるタンパク質を単離する方法を含み、そのタンパク質は抗原保有部分に結合することができる。それらの方法はウイルスベクター中にタンパク質を発現するＤＮＡライブラリーを作製することを含んでなる。抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し、そして抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下でそれらの細胞をタンパク質を発現するウイルスとインキュベートして混合物を形成し、その場合、ウイルスは磁気標識細胞に結合する。結合したウイルスを上に有する細胞を混合物から単離し、それからタンパク質をコードするＤＮＡ及びタンパク質を得る。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の製造のための磁気活性化細胞の分類 発明の分野 本発明の分野は組み換えＤＮＡ技術を用いる抗体の作製である。 発明の背景 モノクローナル抗体を製造する能力は診断薬及び治療薬に大変革を起こしてい る。典型的には、抗体を産生するマウスリンパ球を不死化し、従って、マウス抗 体を産生する細胞の無限の供給を保証することによりモノクローナル抗体は製造 される。しかしながら、多くのヒト用途のために、ヒト抗体を製造することが望 ましい。例えば、ヒトへのヒト抗体の投与は投与された抗体に対する潜在的な免 疫反応を回避し、それらの反応は抗体が投与された目的を無にする可能性がある ので、診断または治療のいずれかの目的のためにヒトに投与される抗体はヒト抗 体であることが好ましい。 さらに、ある種の状況では、診断法において検出される抗原に対する抗体を他 の動物が作ることができないので、診断目的のためにヒト抗体を用いることが必 須である。例えば、他の動物はヒトＲｈ抗原を検出することができる抗体を作る ことができないので、ヒト赤血球（ＲＢＣ）のＲｈ表現型を決定するためには、 抗−Ｒｈ抗体を含むヒト血清を用いなければならない。 エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によるトランスフォーメーションまた は細胞融合を用いてヒトＢリンパ球を不死化することによるインビトロでのヒト 抗体の製造は、ネズミの系と比較してＥＢＶによるトランスフォーメーション及 び細胞融合の両方の比較的低い効率のために技 術的困難をはらんでいる。これらの問題を克服するために、展示Ｍ１３バクテリ オファージを用いたヒト抗体の製造方法が開発されている（Ｂｕｒｔｏｎ等、１ ９９４、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０）。本質的には、抗体 産生細胞の集団より得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｍ ＲＮＡは再編成された免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をコードし、従って、ｃＤ ＮＡは同じものをコードする。増幅されたｃＤＮＡをＭ１３発現ベクター中にク ローン化し、ヒトＦａｂフラグメントを表面上に発現するファージのライブラリ ーを作製する。目的の抗体を展示するファージを抗原結合により選択し、そして バクテリア中で増殖させて可溶性のヒトＦａｂ Ｉｇを製造する。従って、通常 のモノクローナル抗体合成と異なり、この方法はヒトＩｇを発現する細胞よりむ しろヒトＩｇをコードするＤＮＡを不死化する。 バクテリオファージを用いる抗体の作製と関係するいくつかの難題がある。例 えば、精製工程は必ずタンパク質の可溶化を伴い、それはあるタンパク質をその 上に存在する抗原性部位の破壊を伴って永久的に変性させる可能性があるので、 多くのタンパク質を非変性状態で精製することができない。従って、そのような タンパク質を固相に結合させることができず、それ故、それらに結合する抗体を 保有するファージのパンニングのために用いることができない。そのようなタン パク質の例はヒトＲｈ抗原である。 その問題を解決するために、完全なＲＢＣをパンニング抗原として用いる方法 が開発された（Ｓｉｅｇｅｌ等、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８３：２３３４−２３ ４４）。しかしながら、ファージは生来「粘着性」であり、そしてＲＢＣは多数 の抗原を細胞表面上に発現するので、適切な 抗体を表面上に発現しないファージの十分量もＲＢＣに付着し、従って、その方 法は所望する特異性の抗体を発現するファージの単離のためには非実用的になる 。 Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ等（１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ９２：３９３８−３９４２）は抗体をコードするファージを単離する方法 を開示しており、その場合、抗体を発現するファージを抗原を発現する細胞及び 抗原を発現しない細胞の混合物とインキュベートする。抗体を発現するファージ は抗原を発現する細胞に結合する。ファージとの結合後に、蛍光標識された抗体 を抗原発現細胞に特異的に付加し、それらの細胞をそれらに結合した抗体発現フ ァージと共に混合物から取り出す。蛍光標識された細胞の単離は、高価で時間の かかる方法の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の技術を用いて実施する。 迅速且つ経済的であり、そしてヒトにおける診断及び治療用途のために有用な 非常に多数のタンパク質結合タンパク質を与える、組み換えタンパク質、好まし くは抗体を単離する方法に対する必要性が依然としてある。 発明の要約 本発明はタンパク質を発現するウイルスベクター中にＤＮＡライブラリーを作 製し、その場合、タンパク質はウイルスベクターの表面上に発現され、そしてそ のタンパク質は抗原保有部分に結合することができ、抗原保有部分を発現する細 胞に磁気標識を付加し、磁気標識細胞とタンパク質を発現するウイルスを抗原保 有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下でインキュベートして混合物を形 成し、その場合、ウイルスは磁気標識細胞に結合し、ウイルスが結合した細胞を 混合物から単離し、 そしてそこからタンパク質をコードするＤＮＡを得ることを含んでなるタンパク 質をコードするＤＮＡを単離する方法に関する。 また、本発明はタンパク質を発現するウイルスベクター中にＤＮＡライブラリ ーを作製し、その場合、タンパク質はウイルスベクターの表面上に発現され、そ してそのタンパク質は抗原保有部分に結合することができ、抗原保有部分を発現 する細胞に磁気標識を付加し、磁気標識細胞とタンパク質を発現するウイルスを 抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下でインキュベートして混合 物を形成し、その場合、ウイルスは磁気標識細胞に結合し、ウイルスが結合した 細胞を混合物から単離し、そしてそこからタンパク質を単離することを含んでな るタンパク質を単離する方法にも関する。 一つの態様として、ウイルスベクターはバクテリオファージであり、そして別 の態様として、バクテリオファージはＭ１３である。 本発明の一つの態様として、タンパク質は抗体、リガンド及びホルモンよりな る群から選択され、そして別の態様として、タンパク質は抗体であり、それは抗 −Ｒｈ赤血球抗体のような抗−赤血球表面抗原抗体であってもよい。 本発明のさらに別の態様として、抗原保有部分はタンパク質、脂質、炭水化物 、核酸、並びにタンパク質、脂質、炭水化物及び核酸の少なくとも一つの複合体 よりなる群から選択される。 抗原保有部分は抗原及び受容体よりなる群から選択される膜結合タンパク質で あってもよい。別の態様として、膜結合タンパク質はＲｈ抗原のような赤血球抗 原のような抗原である。 また、本発明はタンパク質を発現するウイルスベクター中に合成ＤＮ Ａライブラリーを作製し、抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し、磁 気標識細胞とタンパク質を発現するウイルスを抗原保有部分を発現しない過剰の 非標識細胞の存在下でインキュベートして混合物を形成し、その場合、ウイルス は磁気標識細胞に結合し、ウイルスが結合した細胞を混合物から単離し、そして それからタンパク質をコードするＤＮＡを得ることを含んでなる抗原保有部分に 結合することができるタンパク質をコードするＤＮＡを単離する方法にも関する 。 本発明はさらにタンパク質を発現するウイルスベクター中に合成ＤＮＡライブ ラリーを作製し、抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し、磁気標識細 胞とタンパク質を発現するウイルスを抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細 胞の存在下でインキュベートして混合物を形成し、その場合、ウイルスは磁気標 識細胞に結合し、ウイルスが結合した細胞を混合物から単離し、そしてそれから タンパク質を単離することを含んでなる抗原保有部分に結合することができるタ ンパク質を単離する方法に関する。 また、抗原保有部分に結合することができるタンパク質を単離する方法も提供 される。それらの方法はタンパク質をコードするＤＮＡからタンパク質を発現さ せ、その場合、ＤＮＡは本明細書に記述される方法により得られ、そしてそのよ うに発現されたタンパク質を単離することを含んでなる。 また本発明に含まれるものは本明細書に記述される方法に従って得られるタン パク質をコードする単離されたＤＮＡである。 また、本発明は本明細書に記述される方法に従って得られるタンパク質の実質 的に純粋な調製物にも関する。 図面の簡単な説明 図１は磁気活性化細胞分類を用いる細胞表面Ｆａｂ−ファージパンニングの方 法の図である。 図２はヒトＲＢＣの細胞表面ビオチン化を示すグラフである。 図３は本発明の抗原−陽性、抗原−陰性細胞分離方法を実証する一連のグラフ である。 図４は抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージ凝集力価を測定したマイクロプレート 凝集アッセイの像である。 図５は選択した抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージクローンのＲｈ（Ｄ）結合エ ピトープの決定を示すマイクロプレート凝集アッセイの像である。 図６はゲルカードアッセイにおけるＦａｂ／ファージ抗体の使用を示す像であ る。 発明の詳細な説明 本発明により、タンパク質をコードするＤＮＡ及びそれによりコードされるタ ンパク質を単離する新規な方法が提供され、その場合にタンパク質は好ましくは 抗体であり、そのタンパク質は抗原保有部分に特異的に結合することができる。 本明細書に例示されるように、その方法はヒト抗体をコードするバクテリオフ ァージを作製することを含んでなるがそれに限定されない。具体的には本発明に おいて、Ｍ１３糸状ファージライブラリーによりコードされる抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｒ ＢＣＦａｂ／ファージ抗体が得られる。高度免疫感作された提供者から得られる 抗体産生細胞から、まず抗体産生細胞において発現されるｍＲＮＡに由来するｃ ＤＮＡを得ることによりライブラリーを作製する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）及びＤＮＡ のＩｇをコードするフラグメントに特異的なプライマーを用いてそのようなｃＤ ＮＡのフラグメントを得る。そのようにして得られたＩｇに特異的なＤＮＡをバ クテリオファージ中にクローン化する。ストレプトアビジンを結合した磁気ミク ロビーズで前以て被覆した抗原陽性のビオチン化ＲＢＣ標的細胞及び過剰の非標 識ＲＢＣの混合物に対してＩｇフラグメントをコードするバクテリオファージを パンニングする。ファージ表面上に抗体を発現するバクテリオファージで、それ らの抗体が標的細胞抗原に特異的であるものは標識された細胞に結合する。これ らのファージを磁気カラムを用いて非標識細胞に結合したファージ及び細胞に結 合しないファージから分離する。そのように分離されたファージは標的細胞上の 抗原に特異的な抗体をコードし、展示する。 ファージ抗体ライブラリーを作製するために、まず、ファージ表面上に発現さ れる所望するタンパク質、例えば、所望する抗体を発現する細胞から単離される ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを得る。逆転写酵素を用いてｍＲＮＡのｃＤ ＮＡコピーを生成する。Ｉｇフラグメントを特定するｃＤＮＡをＰＣＲにより得 、得られたＤＮＡを適当なバクテリオファージベ中にクローン化してＩｇ遺伝子 を特定するＤＮＡを含んでなるバクテリオファージＤＮＡライブラリーを作製す る。異種起源のＤＮＡを含んでなるバクテリオファージライブラリーの作製方法 は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に記述されている。 また、ＰＣＲ増幅されたＩｇをコードするｃＤＮＡのフラグメントよ りむしろｃＤＮＡを用いてバクテリオファージライブラリーを得ることもできる 。ｃＤＮＡライブラリーの作製はリガンド等のような抗体ではないタンパク質の 単離のために有用である。 所望するタンパク質、例えば抗体をコードするバクテリオファージを、その対 応する結合タンパク質、例えば抗体が向けられる抗原への結合に利用できるよう にタンパク質をその表面上に展示するように設計することができる。従って、特 定の抗体を発現するバクテリオファージを対応する抗原を発現する細胞の存在下 でインキュベートした場合、バクテリオファージは細胞に結合する。抗体を発現 しないバクテリオファージは細胞に結合しない。 バクテリオファージのパンニング、すなわち、所望する抗体を発現するファー ジの選択のために、対応する抗原を発現する細胞をビオチンのような検出可能な 標識で標識する。次に、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズを細胞に付加 する。それらの細胞を抗原を発現しない過剰の非標識細胞と混合する。次に、こ の細胞混合物をファージライブラリーとインキュベートし、その場合、抗体を発 現するファージは抗原を発現する細胞に結合する。混合物中の過剰の非標識細胞 の存在は、抗体を発現しないが、それとは別に抗原を発現する細胞に非特異的に 結合する可能性があるバクテリオファージを除く手段として役立つ。本発明を実 施するための実験方法の詳細は本明細書において実験の詳細の節に与えられる。 結合した抗体発現ファージを有する抗原発現細胞を混合物から磁気的に取り出 す。磁気除去の一つの例は、カラムの周りの磁場の選択的存在または非存在下で 磁性及び非磁性細胞の混合物をカラム中に流し入れる ことを含む。あるいはまた、単に試験管の側面に磁石を保持し、それらの細胞を 内壁に引き付け、次に溶液から非磁性細胞を注意深く除くことにより、溶液中の 非磁性細胞から磁性細胞を分離することができる。 従って、本発明の方法は磁気標識された受容体陽性粒子（すなわち、細胞）及 び非標識受容体陰性粒子の混合物に対して負及び正の選択を同時に実施すること により、天然または合成のファージＤＮＡライブラリーに由来する特定のファー ジ展示リガンドを発現するものに関して組み換えファージの集団を濃縮する方法 を含む。 「バクテリオファージ」及び「ファージ」という用語は本明細書において互換 的に用いられ、バクテリアに感染するウイルスをさす。本明細書で用いられる「 バクテリオファージライブラリー」または「ファージライブラリー」という用語 の使用は、異種起源のＤＮＡ、すなわち、バクテリアウイルスにより生来コード されないＤＮＡを含んでなるバクテリアウイルスの集団を意味する。 「ウイルスベクター」という用語は異種起源のＤＮＡが挿入されているウイル スを含む。ウイルスベクターはバクテリオファージであってもよく、または真核 生物ウイルスであってもよい。 本明細書に用いられる「標的細胞」という用語は、所望する抗体を捜し出す抗 原を発現する細胞を意味する。 本明細書に用いられる「パンニング」または「パンニングした」という用語は 、所望する抗体をコードするファージを選択する工程を意味する。 本明細書に用いられる「Ｆａｂ／ファージ」という用語は、抗体のＦａｂ部分 を発現するファージ粒子を意味する。 本明細書に用いられる「ｓｃＦｖ／ファージ」という用語は、単鎖として抗体 のＦｖ部分を発現するファージ粒子を意味する。 「過剰の非標識細胞」は、標識細胞の数を超える非標識細胞の量を意味する。 好ましくは、標識細胞対非標識細胞の比率は約１：２である。より好ましくは、 標識細胞対非標識細胞の比率は約１：４より大きい。さらにより好ましくは、標 識細胞対非標識細胞の比率は約１：１０より大きい。 本明細書において例示される本発明の方法は抗体分子のＦａｂ部分をコードす るファージの作製を記述するが、本方法はＦａｂ抗体をコードするファージの作 製のみに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、単鎖抗体をコードする ファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）も本発明に含まれる。Ｆａｂ 分子は全Ｉｇ軽鎖を含んでなり、すなわち、それらは軽鎖の可変及び定常領域の 両方を含んでなるが、重鎖の可変領域及び一番目の定常領域ドメイン（ＣＨ１） のみを含む。単鎖抗体分子はＩｇ Ｆｖフラグメントを含んでなる単鎖のタンパ ク質を含んでなる。Ｉｇ Ｆｖフラグメントは抗体の重及び軽鎖の可変領域のみ を含み、その中に定常領域を含まない。Ｍａｒｋｓ等、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ．２２２：５８１−５９７に記述された方法に従ってｓｃＦｖ ＤＮＡ を含んでなるファージライブラリーを作製することができる。Ｆａｂ ＤＮＡを 含んでなるファージライブラリーに対して本明細書に記述したように、所望する 抗体の単離のためにそのように作製したファージのパンニングを実施する。 また、本発明は重及び軽鎖可変領域がほとんど全ての可能な特異性を含むよう にそれらを合成することができる合成ファージ展示ライブラリ ーも含むと解釈されるべきである。従って、抗体展示ライブラリーは「天然」ま たは「合成」（Ｂａｒｂａｓ）１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １ ：８３７−８３９；ｄｅ Ｋｒｕｉｆ等、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２ ４８ ：９７−１０５）であってもよい。「天然の」抗体を含んでなる抗体展示ラ イブラリーを実験実施例の節に記述したように作製する。「合成の」抗体を含ん でなる抗体展示ライブラリーをＢａｒｂａｓ（１９９５、上記）及びその中に引 用された参考文献に記述された方法に従って作製する。 本発明の方法はさらに本明細書に例示されるＭ１３以外のファージを含んでな るファージ展示ライブラリーの作製を含むと解釈されるべきである。ラムダファ ージのような他のバクテリオファージも本発明の方法に有用である可能性がある 。表面上に異種起源のＤＮＡによりコードされるペプチドを展示するラムダファ ージ展示ライブラリーは作製されている（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ等、１９９５、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１６０９−１６１３）。 さらに、本発明の方法を真核生物ウイルスのようなバクテリオファージ以外のウ イルスを含むように拡張することができると考えられる。実際、哺乳類への送達 のために適当な遺伝子をコードし、そしてその遺伝子が送達される特定の細胞型 または組織を標的とすることができる抗体をコード及び展示する真核生物ウイル スを作製することができる。例えば、機能的抗体フラグメントを展示するレトロ ウイルスベクターが作製されている（Ｒｕｓｓｅｌｌ等、１９９３、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ ．２１：１０８１−１０８５）。 抗体を作製することができる赤血球抗原はＲｈ（Ｄ）、Ｒｈ（Ｃ）、 Ｒｈ（ｃ）、Ｒｈ（Ｅ）、Ｒｈ（ｅ）を初めとするＲｈ抗原、並びにケル式、ダ ッフィ式、リュテラン式及びキッド式血液型の赤血球抗原を初めとする他の非Ｒ ｈ抗原を含むがそれらに限定されない。 従って、本発明の方法は抗−Ｒｈ（Ｄ）抗体をコードするＤＮＡの単離のみに 限定されず、むしろ、あらゆるＲＢＣ抗原または限定されないが腫瘍特異的抗原 、バクテリア抗原等のような他の細胞抗原に対する抗体をコードするＤＮＡの単 離のために用いることができる。また、本発明の方法は多数の臨床的に重要な血 小板抗原、注目すべきものとしてＰ１^A1／Ｐ１^A2、Ｂａｋ^a／Ｂａｋ^b、Ｐｅｎ^A ／Ｐｅｎ^B等に特異的なファージ抗体を作製することにより血小板の型を決める ためにも有用である。 本発明はさらに実質性（例えば、腎臓、心臓、肝臓、肺）及び非実質性（例え ば、骨髄）の両方の器官または組織移植の場合に、可能性のある移植適合に関し て提供者及び宿主を照合する目的のためにＨＬＡ抗原に関して提供者の白血球の 型を決めるために有用である。 こららの非赤血球抗原のいずれかに対する抗体を発現するファージの結合を検 出するために、赤血球の凝集または捕捉に関して本明細書に記述した方法に従っ て非赤血球細胞を凝集または捕捉することができる。凝集または捕捉の前に、凝 集または捕捉を肉眼またはスキャナーで識別できるように染色または他の標識化 技術により細胞を「目に見える」ようにすることができる。 本発明の方法は抗原保有部分が可溶性形態で容易に精製されない場合に、抗原 保有部分に結合するタンパク質を作製するために最も有用である。従って、抗原 保有部分は他の構造、通常、細胞膜または細胞小器官膜のような細胞中の膜と結 合している抗原を含む。 本発明では、抗原保有部分はタンパク質、脂質、炭水化物または核酸であって もよく、またはそれはタンパク質、脂質、炭水化物及び核酸の少なくとも２っの 複合体であってもよく、細胞中の多数の抗原保有部分がこれらの部分のいずれか のみで構成されないことが理解される。好ましくは、抗原保有部分は抗原または 受容体タンパク質のような膜結合タンパク質である。しかしながら、抗原保有部 分が炭水化物である場合、それは糖脂質上に発現される炭水化物、例えば、Ｐ式 血液型抗原または他の抗原であってもよい。 本明細書に用いられる「抗原保有部分」という用語は抗体が結合する分子を意 味する。 また、本発明の方法は自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）に関与するもの（Ｓ ｉｅｇｅｌ等、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒ ｅｄ ｃｅｌｌ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 、Ｇａｒｒａｔｔｙ（編集）Ｉ ｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のような自己免疫抗体 の作製のためにも有用である。細胞表面膜に結合しているかまたは細胞小器官膜 に結合している細胞抗原に対して向けられる自己免疫抗体を本明細書に記述する 技術を用いて単離することができる。自己免疫疾患及び抗体を単離することがで きるそれらに関係する抗原は以下のもの：重症筋無力症（アセチルコリン受容体 ；ニュ一ロン）、慢性炎症性脱髄多発性ニュロパシー（ミエリン；ニュ一ロン） 、自己免疫性甲状腺疾患（甲状腺刺激ホルモン受容体；甲状腺細胞）、原発性胆 汁性肝硬変（ミトコンドリアの自己抗原；肝臓ミトコンドリア）、特発性血小板 減少性紫班病（血小板膜インテグリン； 血小板）、尋常性天疱瘡（表皮抗原；表皮）及びグッドパスチャー症候群（基底 膜抗原；腎臓または肺細胞）を含むがそれらに限定されない。 実際、本発明の方法は細胞上に発現される抗原に対するあらゆる抗体をコード するＤＮＡクローンを単離するために有用であり、その細胞を磁気標識で標識す ることができ、そしてアッセイで必要とされる過剰の非標識細胞を与えるために 十分な量で非標識形態で得ることができる。 さらに、本発明の方法は抗体をコードするＤＮＡの単離に限定されず、むしろ 、限定されないが、例えば、細胞受容体タンパク質、ペプチドホルモン等に結合 するリガントのような細胞タンパク質に対する特異性を有する他のペプチドまた はタンパク質をコードするＤＮＡの単離のためにも用いることができる。 また、本発明は細胞標識剤としてビオチンの使用に限定されると解釈されるべ きではない。細胞への付加がその上に発現されるあらゆる表面タンパク質の構造 保全性を妨げず、そしてそのような標識により常磁性ミクロビーズまたは他の磁 気物質をそれに付加することができる場合、他の標識を用いることができる。他 のそのような標識は活性化アミン、カルボキシルまたはチオール基を保有する磁 気ビーズと直接誘導化する（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅｄ）ことができる細胞表面タ ンパク質または炭水化物を含むがそれらに限定されない。さらに、フルオレセイ ンまたはローダミンのような染料もビオチンと同様な方法で細胞に共有結合的に 結合することができ、そして抗−染料抗体で被覆した磁気ビーズをそれに付加す ることができる。 本発明は本明細書に記述される方法を用いて作製されるタンパク質及びそれら をコードするＤＮＡを含む。抗体をコードするＤＮＡを単離す るために、例えば、本発明の方法に従って得られる抗体発現ファージからＤＮＡ を抽出する。そのような抽出技術は当該技術分野でよく知られており、例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（上記）に記述されている。 本明細書に用いられる「単離されたＤＮＡ」は、生来存在する状態で隣接する 配列から精製されているＤＮＡ配列、セグメントまたはフラグメント、例えば、 フラグメントに通常隣接する配列、例えばフラグメントが生来存在するゲノム中 でそれに隣接する配列から取り出されているＤＮＡフラグメントをさす。また、 その用語はＤＮＡに生来付随する他の成分、例えば、細胞中で生来それに付随す るＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製されているＤＮＡにも 当てはまる。 また、本発明は本発明の方法に従って単離されるＤＮＡに実質的に相同なＤＮ Ａも含むと解釈されるべきである。好ましくは、実質的に相同なＤＮＡは本発明 の方法を用いて得られるＤＮＡに約５０％相同であり、より好ましくは約７０％ 相同であり、さらにより好ましくは約８０％相同であり、そして最も好ましくは 約９０％相同である。 本明細書に用いられる場合「相同な」は、２個のポリマー分子間、例えば２個 の核酸分子、例えば２個のＤＮＡ分子もしくは２個のＲＮＡ分子間、または２個 のポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性をさす。２個の分子の両方の サブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められる場合、例えば、２個 のＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンで占められる場合、それらはその位置 で相同である。２個の配列間の相同性は一致するまたは相同な位置の数の直接関 数であり、例えば、２個の化合物配列の位置の半分（例えば、１０サブユニット の長さのポリマーの５つの位置）が相同である場合、それら２個の配列は５０％ 相 同であり、９０％の位置、例えば、１０のうち９が一致するかまたは相同である 場合、それら２つの配列は９０％の相同性を有する。例として、ＤＮＡ配列３’ ＡＴＴＧＣＣ５’及び３’ＴＡＴＧＣＧ５’は５０％の相同性を有する。 本発明の方法を用いて作製される、例えば抗体を含んでなるタンパク質の実質 的に純粋な調製物を得るために、タンパク質をそれが発現されるファージの表面 から抽出することができる。そのような抽出のための方法はタンパク質精製の当 業者によく知られている。あるいはまた、抗体をコードする単離されたＤＮＡを 発現ベクター中にクローン化し、そしてそれからタンパク質を発現させることに より、例えば抗体を含んでなるタンパク質の実質的に純粋な調製物を得ることが できる。そのように発現されたタンパク質を当該技術分野においてよく知られて いる通常のタンパク質精製方法を用いて得ることができる。 本明細書に用いられる場合、「実質的に純粋な」という用語は、生来付随する 成分から分離されている化合物、例えばタンパク質またはポリペプチドを説明す る。典型的には、サンプル中の全材料の（容量で、湿もしくは乾量で、またはモ ルパーセントもしくはモル比で）少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも ２０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、 より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最 も好ましくは少なくとも９９％が目的の化合物である場合、その化合物は実質的 に純粋である。あらゆる適切な方法、例えば、ポリペプチドの場合にはカラムク ロマトグラフィー、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析により純度を測定すること ができる。化合物、例えばタンパク質が生来会合した成分を本 質的に含まない場合、または生来の状態でそれに付随する天然の混入物から分離 される場合にもそれは実質的に精製される。 また、本発明は本発明の方法に従って得られるタンパク質またはペプチドの類 似体も規定する。類似体は天然に存在するタンパク質またはペプチドと保存的ア ミノ酸配列の相違もしくは配列を変えない修飾またはそれらの両方により異って もよい。 例えば、保存的アミノ酸変異を作製することができ、それらはタンパク質また はペプチドの一次配列を変えるが、通常、その機能を変えない。保存的アミノ酸 置換は典型的に以下の群内の置換を含む： グリシン、アラニン； バリン、イソロイシン、ロイシン； アスパラギン酸、グルタミン酸； アスパラギン、グルタミン； セリン、トレオニン； リシン、アルギニン； フェニルアラニン、チロシン。 （通常、一次配列を変えない）修飾はインビボまたはインビトロでのポリペプ チドの化学的誘導化、例えばアセチル化またはカルボキシル化を含む。また含ま れるものはグリコシル化の修飾、例えば、ポリペプチドの合成及びプロセシング 中またはさらなるプロセシング工程においてそのグリコシル化様式を修飾するこ とにより；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳類のグリコシ ル化または脱グリコシル化酵素にポリペプチドをさらすことによりなされるもの である。また含まれるものはリン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシ ン、ホス ホセリンまたはホスホトレオニンを有する配列である。 また含まれるものは、タンパク質分解に対する抵抗性を向上するためまたは溶 解特性を最適化するために通常の分子生物学技術を用いて修飾されているポリペ プチドである。そのようなポリペプチドの類似体は天然に存在するＬ−アミノ酸 以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有す るものを含む。本発明のペプチドは本明細書に挙げられる特定の例示的方法のい ずれかの生成物に限定されない。 実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明はポリペプチドの活性フラグメ ントを規定する。特定のポリペプチドが抗原保有部分に結合する場合、例えば、 抗体のフラグメントが全長タンパク質と同様にその対応する抗原に結合する場合 、それは活性があるとみなされる。 本明細書に用いられる場合、ポリペプチドに適用される「フラグメント」とい う用語は、通常、少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、典型的には少なくと も約１００個の連続したアミノ酸、より典型的には少なくとも約２００個の連続 したアミノ酸、そして通常少なくとも約３００個の連続したアミノ酸の長さであ る。 本発明はさらに以下の実験実施例を参照することにより詳細に説明される。こ れらの実施例は例示の目的のためのみに与えられ、他に特定されないかぎり限定 するものではない。従って、本発明は以下の実施例に限定されるといかようにも 解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に与えられる教示の結果として明ら かになるいずれか及び全ての変形を包含すると解釈されるべきである。 本明細書に記述される実験実施例はＦａｂ／ファージ展示を用いて抗 −Ｒｈ（Ｄ）赤血球抗体を単離及び製造するための方法及び結果を与える。 細胞表面に発現される精製できない分子に特異的な、糸状ファージにより展示 されるヒトモノクローナル抗体の単離方法を図１に記述する。抗原特異的ファー ジの捕捉を最適化し、そして関係のないファージ抗体の結合を最小限にするため に、正及び負の同時選択方法を用いた。目的の抗原を保有する細胞を磁気ビーズ で前以て被覆し、過剰の未修飾の抗原陰性細胞中に希釈する。細胞混合物をＦａ ｂ／ファージライブラリーとインキュベーションした後、磁気活性化細胞分類を 用いて抗原陽性細胞集団を回収し、抗原特異的Ｆａｂ／ファージを溶出し、バク テリア培養で増やす。このプロトコルを磁気標識されたＲｈ（Ｄ）−陽性及び過 剰の非標識Ｒｈ（Ｄ）−陰性ヒト赤血球並びにヒト末梢血リンパ球から構築され たＦａｂ／ファージライブラリーで用いた場合、一人の同種免疫個体から多数の 独特な臨床的に有用な_γ1κ及び_γ1λ抗−Ｒｈ（Ｄ）抗体を単離した。 本発明の細胞表面選択法は推定される腫瘍特異的抗原の同定のためのような他 の系における使用のために容易に適応でき、そして新規なまたは構造に依存する 細胞表面エピトープに向けられる自己複製抗体試薬を単離するための迅速で（１ カ月以内）高収率の方法を提供する。 Ｆａｂ／ファージ展示ライブラリーの作製 Ｒｈ（Ｄ）−陽性の赤血球（ＲＢＣ）で先に過剰免疫したＲｈ（Ｄ）−陰性の 個体からの末梢血から得た２ｘ１０⁷の単核細胞から別個の_γ1κ及び_γ1λファ ージライブラリーを構築した。以前に公開された方法（Ｂａｒｂａｓ等、１９９ １、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｍｍｕ ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｐｈａｇｅ（Ｐｈａｂｓ）：Ｒａｐｉｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆａｂｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａ ｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１１９−１２４ 中；Ｓｉｅｇｅｌ等、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８３：２３３４−２３４４）を利 用してファージミドベクターｐＣｏｍｂ３（Ｂａｒｂａｓ、１９９１、Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２）を用いて ライブラリーを作製した。 簡潔に言えば、提供者の細胞のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、ポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）及びＳｉｌｖｅｒｍａｎ等（１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ ｖｅｓｔ ．９６：４１７−４２６）のものにより補足されたＫａｎｇ等により記 述された（１９９１、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕ ｌｉｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｐｈａｇ ｅ（Ｐｈａｂｓ）：Ｒａｐｉｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ− Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆａｂｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ」Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１１１−１１８中）一連のヒト Ｉｇプライマーを用いて重鎖及び軽鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）ｃＤＮＡセグメン トを増幅した。重及び軽鎖ＰＣＲ産物をｐＣｏｍｂ３中にクローン化し、大腸菌 中にエレクトロポレーションした。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を同時感染させると、Ｉｇ ＤＮＡは糸 状ファージ粒子中にパーッケージされ、それは遺伝子IIIバクテリオファージ外 被タンパク質に融合されたヒ トＦａｂ分子を発現する。 抗−Ｒｈ（Ｄ）クローンに対するＦａｂファージ展示ライブラリーのパンニン グ １０％のヘマトクリット値で細胞を５００μｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ −ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と室 温（ＲＴ）で４０分間インキュベートすることにより、Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ を細胞表面でビオチン化した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄した後、 ８ｘ１０⁶のビオチン化Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを１０μｌのストレプトアビジ ンで覆われた常磁性ミクロビーズ（ＭＡＣＳストレプトアビジンミクロビーズ、 Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）と共に１００μｌ ＰＢＳの全容量でＲＴで１時間インキュベートした。未反応のビーズを洗浄に より除き、次に、磁気ビーズで覆われたＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを１０倍過剰（ ８ｘ１０⁷）のＲｈ（Ｄ）−陰性（未修飾の）ＲＢＣ並びに〜３ｘ１０¹¹コロニ ー形成単位（ｃｆｕ）の（上記のように調製した）_γ1κ及び_γ1λ Ｆａｂ／フ ァージライブラリーのいずれかと２％脱脂粉乳を含有する４０μｌ ＰＢＳ（Ｍ ＰＢＳ、Ｃａｒｎａｔｉｏｎ、Ｎｅｓｔｌｅ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇ ｌｅｎｄａｌｅ、ＣＡ）の最終容量で混合した。 ３７℃で２時間のインキュベーション後、ＲＢＣ／ファージ懸濁液を２％ Ｍ ＰＢＳで前以て平衡化したＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気型ＭＳカラム（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上に１０μｌ／分の流速で添加し た。磁気ビーズで覆われたＲＢＣがカラムの非常に最上部に即座に付着し、それ を詰まらせ、そしてＲｈ（Ｄ）陰性 の非ビオチン化ＲＢＣの捕捉を引き起こすのを防ぐために、カラムの周りの磁場なしに この添加工程を実施した。カラムの排除体積は４０μｌよりわずかに大き いので、ＲＢＣ／ファージインキュベーション混合物を磁場なしで添加すること は、抗原陰性及び抗原陽性ＲＢＣを流れ出さずにカラムの全体にわたって均一に 分布させる。いったん添加すると、カラムを磁場中（ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離 装置、Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に２分間置 いてＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを接着させ、そして一連の５００μｌの洗浄をよく 冷えたＭＰＢＳで実施し、続いてＰＢＳで最終洗浄した。最初の２回のパンニン グでは全部で３回の洗浄を実施し、そしてその後の全てのパンニングでは全部で ６回の洗浄を実施した。各パンニングでは、最初の洗浄を１０μｌ／分の流速で 実施し、その間に大部分のＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣはカラムから流れ出た。その 後の全ての洗浄を２００μｌ／分で実施した。最後の洗浄後にカラムを磁場から 取り出し、ビーズで被覆され／ファージで被覆されたＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを ５ｃｃ注射器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋ ｅｓ、ＮＪ）からのプランジャを用いて５００μｌ ＰＢＳでカラムから流し出 した。 それらのＲＢＣをすぐに１３，０００ｘｇで５秒間遠心分離し、次に、２００ μｌの７６ｍＭクエン酸塩、ｐＨ２．４中に再懸濁してＲｈ（Ｄ）抗原を変性さ せ、結合したファージを溶出させた。断続的にボルテックスしながらＲＴで１０ 分のインキュベーション期間の後、ファージ溶出液及び細胞残渣を１８μｌの２ Ｍトリス塩基で中和し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したスーパー （ｓｕｐｅｒ）培地（ＳＢ）（Ｂａｒｂａｓ等、１９９１、上記）中で生育した 大腸菌のＸＬ１ −Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ａ）Ｏ．Ｄ．＝１． ０ １０ｍＬに添加した。ＲＴで１５分間インキュベーションし、その間にＲｈ （Ｄ）バインダーに対して濃縮されたファージライブラリーをバクテリア培養物 に感染させた後、４０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサ イクリンを含有する前以て温めた３７℃のＳＢを添加してそれぞれ２０μｇ／ｍ ｌ及び１０μｇ／ｍｌの最終抗生物質濃度を生じた。少量の培養物（〜１００μ ｌ）をすぐに取り出し、ＬＢ／カルベニシリンプレート上で滴定して全溶出液中 に含まれるファージの数を決定した。培養物の残りを３００ＲＰＭで３７℃で１ 時間振盪した。続いて、追加の抗生物質、追加のＳＢ及びＶＣＳＭ１３ヘルパー ファージを添加し、記述されたように（Ｓｉｅｇｅｌ等、１９９４、上記）培養 物を３０℃で一晩生育した。 ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）沈殿によりファージミド粒子を培 養上清から精製し（Ｂａｒｂａｓ等、１９９１、上記）、１％ウシ血清アルブミ ン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ中に再懸濁し、そして一晩透析して次の回のパンニング中 にＲＢＣを溶解する可能性がある残存しているＰＥＧを除いた。このように、得 られたファージ調製物は次の回のパンニングの原材料として使える。バクテリア 増幅により導入される可能性がある軽鎖アイソタイプ複製のあらゆる偏りを防ぐ ために_γ1κ及び_γ1λファージライブラリーを別個にパンニングした。 抗−Ｒｈ（Ｄ）反応性に関するポリクローナルＦａｂ／ファージライブラリー 及び個々のファージクローンのスクリーニング 結合した抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージを有するＲＢＣ間に凝集を引き起こ すために架橋抗体として抗−Ｍ１３抗体を用いてＲｈ（Ｄ）抗 原に対するＦａｂ／ファージの特異性を評価した。一連のパンニングからのポリ クローナルＦａｂ／ファージの１００μｌアリコートまたは個々のＦａｂ／ファ ージ溶出液クローンから得られたモノクローナルＦａｂ／ファージを特定の表現 型（すなわち、Ｒｈ（Ｄ）−陰性または陽性）のＲＢＣの３％懸濁液５０μｌと インキュベートした。 ３７℃で１時間のィンキュベーション後、ＲＢＣを２ｍｌの冷えたＰＢＳで３ 回洗浄して結合しないＦａｂ／ファージを除いた。得られたＲＢＣペレットをヒ ツジ抗−Ｍ１３抗体（５−Ｐｒｉｍｅ ３−Ｐｒｉｍｅ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ ）の１０μｇ／ｍｌ溶液１００μｌ中に再懸濁し、９６ウェルマイクロタイター プレートの丸底のウェルに移した。プレートを静置したままにし(〜２時間）、 次に読み取った。陰性反応を有するウェルは鮮明な〜２ｍｍの直径のＲＢＣスポ ットを示し、一方、陽性反応、すなわち、凝集を有するウェル中では、凝集した ウェル中のＲＢＣがウェルの全床面を覆う薄い広がりを形成する。 ミニカラムゲルカード（ＩＤ−ミクロタイピングシステム（Ｍｉｃｒｏ Ｔｙ ｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒａｒｉｔ ａｎ、ＮＪ）を利用する赤血球凝集反応アッセイ（Ｌａｐｉｅｒｒｅ等、１９９ ０、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３０：１０９−１１３）では、２５μｌのＦａｂ ／ファージクローンをＲＢＣ（ミクロタイピングシステムバッファー、Ｏｒｔｈ ｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ中０．８％の懸濁液）の５０μｌアリコートと混合 した。１００μｌ／ｍｌの抗−Ｍ１３抗体中に先に懸濁したデキストラン−アク リルアミドビーズを含有するミニカラムの上の容器に混合物を入れた。３７℃で インキュベーション後、ゲルカードを７０ｘｇで１０分間遠心分離し、 読み取った。 様々な方法 フローサイトメトリーのための蛍光標識されたＲＢＣの調製を本明細書に記述 したように実施し、Ｌｙｓｉｓ II（バージョン１．１）ソフトウェア（Ｂｅｃ ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を備えたＦ ＡＣＳｃａｎミクロ蛍光計（ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を用いてサン プルを分析した。バクテリアクローンからプラスミドＤＮＡを調製した（Ｑｉａ ｗｅｌｌ Ｐｌｕｓ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）。軽鎖もし くは重鎖Ｉｇ定常領域リバースプライマーまたはそれぞれのＩｇ鎖の５’にアニ ールする独特なｐＣｏｍｂ３ベクタープラィマー（Ｂａｒｂａｓ等、１９９１、 上記；Ｒｏｂｅｎ等、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４３７−６４ ４５）及び自動化蛍光シークエンシング（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて二本鎖ＤＮＡをシークエンスした 。Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒバージョン５．０シークエンシングソフトウェア（Ｏｘ ｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）及びＩｇ生 殖細胞系遺伝子のＴｏｍｌｉｎｓｏｎデータベース（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ等、１ ９９６、Ｖ Ｂａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ、ＭＲＣ Ｃｅ ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄ ｇｅ、ＵＫ）を用いて配列を分析した。 細胞インキュベーション及び分離プロトコルの実験設計 細胞分離工程及び抗原特異的Ｆａｂ／ファージの最終収率を最適化するための 一連の初期研究を実施した後、抗−ＲＢＣ−反応性ファージに 関してＦａｂ／ファージライブラリーをパンニングするための上記の実験条件を 決定した。調べた主要なパラメーターは以下のものを含んだ。 ビオチン化 ストレプトアビジンで覆われた磁気ビーズの十分な数が細胞 に結合してそれらのＲＢＣを磁気カラムで保持させるようにＲＢＣ表面をビオチ ン化する条件を探した。この場合、Ｒｈ（Ｄ）抗原の抗原性を破壊する可能性が あるかまたは細胞が抗体を非特異的に吸着するようになる可能性がある過剰のビ オチン化を避けなければならない。この問題を検討するために、Ｒｈ（Ｄ）−陽 性／ケル−陰性ＲＢＣ（ケルはＲＢＣ抗原である；（Ｗａｌｋｅｒ）編集、１９ ９３、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ、第１１版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ：Ａｍ ｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓ ））を 一連のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン濃度と共にインキュベートし、フルオレ セインを結合したストレプトアビジンを利用してフローサイトメトリーによりビ オチン化の程度を評価した。 細胞表面のビオチン化の程度を評価するために、異なるビオチン試薬濃度でビ オチン化されたＲｈ（Ｄ）−陽性／ケル−陰性ＲＢＣの３％懸濁液の５μｌアリ コートを１／１００希釈のＦＩＴＣ−ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉ ｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）２００μｌ と４℃で３０分間インキュベートした（図２）。混合物をリン酸緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）で洗浄し、フローミクロ蛍光定量法により分析した（−□−）。また、１ ００μｌの抗−Ｒｈ（Ｄ）または抗−ケルタイピング血清のいずれかそれぞれと 細胞をインキュベートし、細胞を洗浄し、次にそれらを１／１００希釈のＦＩＴ Ｃ−ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ）で染色することにより、Ｒｈ（Ｄ）−抗原性の保持（−△−）（すなわ ち、特異的染色）または非特異的染色の欠如（−○−）に関しても細胞のアリコ ートを分析した。 直線状の飽和しない反応が見られた（図２）。抗−Ｒｈ（Ｄ）タイピング血清 を用いてＲｈ（Ｄ）抗原性の保持を評価し、試験した全てのビオチン濃度でビオ チンでの細胞表面タンパク質の誘導化により影響を受けないことが見いだされた （図２）。さらに、それらのケル−陰性ＲＢＣは抗−ケル抗体を非特異的に吸着 しなかった。 次に、各ビオチン化ＲＢＣサンプルを過剰のストレプトアビジン被覆磁気ミク ロビーズとインキュベートし、磁気分離カラムに添加した。５００μｇ／ｍｌよ り多いかまたはそれに等しいビオチン試薬でビオチン化されたＲＢＣサンプルで は、１０⁸ものＲＢＣをカラムにより保持することができると測定された。実際 のＲＢＣ／ファージパンニング実験は〜１０⁷のみのＲｈ（Ｄ）−陽性細胞を用 いるように設計されたので（以下参照）、５００μｇ／ｍｌでのＲＢＣビオチン 化が十分であると決定された。 インキュベーション混合物中のＲｈ（Ｄ）−陽性及びＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣ の濃度 Ｆａｂ／ファージパンニング実験を実施する前に、Ｒｈ（Ｄ）−陽性及びＲｈ （Ｄ）−陰性細胞を分離する磁気活性化細胞分離技術の能力を抗−Ｒｈ（Ｄ）タ イピング血清及びフローサイトメトリーを用いて評価した（図３）。２％の脱脂 粉乳を含有する４０μｌ容量のＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中で、ストレプトアビジン− ミクロビーズで被覆されたビオチン化Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ（８ｘ１０⁶細胞 ）を１０倍過剰のＲｈ（Ｄ ）−陰性の被覆されていないＲＢＣ（８ｘ１０⁷細胞）と混合し、混合物をＭｉ ｎｉＭＡＣＳカラムに添加した。カラムを洗浄し、結合した細胞を本明細書に記 述するように溶出させた。元の混合物中（パネルａ）、カラム洗浄液（パネルｂ ）及びカラム溶出液（パネルｃ）中に含まれるＲＢＣのアリコートを図２で記述 したように抗−Ｒｈ（Ｄ）タイピング血清及びＦＩＴＣ−ヤギ抗−ヒトＩｇＧで 染色した。フローサイトグラムから、カラム添加物中の〜９０％の細胞はＲｈ（ Ｄ）−陰性であるが（パネルａ）、それらのほとんど全てはカラムから流れ出て （パネルｂ）、ほとんど完全にＲｈ（Ｄ）−陽性細胞であるカラム溶出液をもた らす（パネルｃ）ことが示される。最終溶出液の〜６％のみがＲｈ（Ｄ）−陰性 細胞を含んでなり（パネルｃ）、そしてＲｈ（Ｄ）−陰性細胞は最初Ｒｈ（Ｄ） −陽性細胞に対して１０倍過剰で存在したので、最初の抗原−陰性の免疫吸着剤 （ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ）細胞の〜０．６％だけが最終の抗原−陽性調製 物に混入した。細胞分離のこの効率は次のＦａｂ／ファージでのパンニング実験 のために適切と考えられた。 上記の実験において、磁気分離カラムを詰まらせることを避けるために、磁場 なしにカラムに添加することが必要であった。これは材料がカラムから流れ出な いように４０μｌ未満またはそれに等しい反応容量を必要とした。理論に基づい て（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ等、１９９５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４ ：４１３−４１９）、与えられた細胞表面抗原に特異的なＦａｂ／ファージの５ ０％より多くを捕捉するために４０μｌの容量中に必要な細胞の適切な濃度を計 算することができる。そのような計算は細胞当たりの抗原部位の数及び結合した Ｆａｂ／ファージの解離定数（Ｋ_D）の関数である。ＲＢＣ（表現型「-Ｄ-／-Ｄ -」）当たり〜１００，０００Ｒｈ（Ｄ）抗原部位の値（Ｍｏｌｌｉｓｏｎ等、 １９９３、Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ 、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｃｌｉｃａｔｉｏｎｓ）及びＫ_D＝１０^-8ないし１０^-9Ｍの範囲の所望する Ｆａｂ／ファージ親和性を用いると、４０μｌの反応容量中８ｘ１０⁶のＲｈ（ Ｄ）−陽性細胞を必要とする。この数のＲｈ（Ｄ）−陽性細胞を仮定すると、１ ０倍過剰のＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣが磁気カラムで抗原−陽性ＲＢＣから効率よ く分離することができる抗原−陰性細胞の最大量であることが見いだされた（図 ３）。 Ｆａｂ／ファージライブラリーの構築及びパンニング _γ1κ及び_γ1λファージライブラリーを本明細書に記述したように調製し、そ れらはそれぞれ７ｘ１０⁷及び３ｘ１０⁸の独立した形質転換体を含有することが 見いだされた。表１にこれらのライブラリーのパンニング結果を要約する。 パンニングしたポリクローナルライブラリー及び個々の無作為に選択したＦａ ｂ／ファージクローン中の抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージ活性を検出するため に架橋抗体として抗−Ｍ１３二次抗体を利用するＲＢＣ凝集アッセイを用いた（ 図４）。示される結果はＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣに対する陰性反応性及び１／２ ０４８の希釈までの_γ1κライブラリー（パンニング＃２）のＲｈ（Ｄ）−陽性 ＲＢＣに対する強い陽性反応性を示すアッセイの代表的な例である。 _γ1κライブラリーの場合、結合ファージの著しい濃縮は１回のみのパンニン グ後に起こるようであり、一方、_γ1λライブラリーの著しい濃縮 は２回目中に起こる。これはそれぞれ１及び２回のパンニング後に、示した回の パンニング中に結合したファージのパーセント及びＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを凝 集するポリクローナル_γ1κ及び_γ1λＦａｂ／ファージライブラリーの能力の両 方の急激な増加により示される（表１、図４）。 各回のパンニング中に得られた無作為に選択した個々のバクテリアコロニーか らモノクローナルＦａｂ／ファージを調製した。３回目のパンニングまでに全て のクローンが抗−Ｒｈ（Ｄ）特異性を有することは明らかであった（表１）。こ れらのＦａｂ／ファージが抗−Ｒｈ（Ｄ）特異性を有し、そして凝集アッセイに おいて用いた特定のＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ上に偶然存在し且つ特定のＲｈ（Ｄ ）−陰性ＲＢＣ上にない可能性がある他の関係のない抗原に結合していないこと を確かめるために、異なる血液型特異性の１１のＲｈ（Ｄ）−陰性及び一陽性Ｒ ＢＣのパネルに対してクローンをスクリーニングしてそれらの抗−Ｒｈ（Ｄ）特 異性を確かめた（Ｗａｌｋｅｒ、１９９３、上記）。 遺伝子レベルでのクローンの分析 無作為に選択した抗−Ｒｈ（Ｄ）クローン間の遺伝的多様性を調べるために、 プラスミドＤＮＡをクローンの各々から調製し、対応する重及び軽鎖Ｉｇヌクレ オチド配列を同定した。表２に、最も近縁の生殖細胞系重または軽鎖Ｉｇ遺伝子 の名称を初めとする各クローンの多数の特性を挙げる。ヌクレオチドレベルでの より詳細な分析から、全ての抗−Ｒｈ（Ｄ）結合クローンの中に多数の独特な重 及び軽鎖ＤＮＡ配列があることが示された（表３）。Ｆａｂ／ファージ展示ライ ブラリーの作製中に起こる重及び軽鎖遺伝子セグメントのランダムシャッフリン グのために、これらの重鎖及び軽鎖が組合わさってほぼ５０の異なる抗−Ｒｈ（ Ｄ ）抗体を形成することは明らかである。 予測されるアミノ酸配列の詳細な複数整列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍ ｅｎｔ）分析から、全部で２５の独特な重鎖、１８の独特なκ軽鎖及び２３の独 特なλ軽鎖タンパク質が示された。ライブラリー構築中の組み合わせ作用のため に、これらの重及び軽鎖遺伝子セグメントは対になって５０の独特なＦａｂ抗体 （２０_γ1κ及び３０_γ1λ）を生じた。興味深いことに、全ての２５の独特な重 鎖及びほとんど全ての１８の独特なκ軽鎖はそれぞれ５つのＶ_HIIIまたは４つの ＶκＩ生殖細胞系遺伝子のみに由来し、一方、λ軽鎖はより多様な組の生殖細胞 系遺伝子に由来した。選択前の可変領域ファミリー表示の不均質性を確かめるた めに、パンニングしていないライブラリーからの６０を越える陰性クローンから の重及び軽鎖ヌクレオチド配列の分析を実施した。Ｖ_HファミリーＩ（１３％） 、III（３６％）、IV（３１％）、Ｖ（１５％）及びVI（５％）；Ｖκファミリ ーＩ（４３％）、II（１４％）、III（２９％）及びIV（１４％）；並びにＶγ ファミリーＩ（４８％）、II（４％）、III（９％）、IV（４％）、Ｖ（９％） 、VI（１７％）及びVII（９％）を示すクローンが存在した。 タンパク質レベルでのクローンの分析 抗−Ｒｈ（Ｄ）クローン中の細かい特異性（Ｒｈ（Ｄ）抗原エピトープ特異性 ）の多様性を調べるために、選択したクローン及びＲＢＣがある種のエピトープ を欠いているＲｈ（Ｄ）抗原を産生する個体から得られた稀なＲｈ（Ｄ）−陽性 ＲＢＣの組を用いて凝集実験を実施した。そのような突然変異体ＲＢＣの組での 特定の抗−Ｒｈ（Ｄ）抗体の凝集のパターンを調べることにより、抗体が向けら れるＲｈ（Ｄ）上の特定の エピトープを同定することができる（Ｍｏｌｌｉｓｏｎ等、１９９３、上記）。 そのような実験の代表的な例を図５に示し、そして選択した抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａ ｂ／ファージクローンのＲｈ（Ｄ）エピトープを表２に要約する。 抗−Ｒｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣ（ｒｒ）、Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ（Ｒ₂Ｒ₂）及 び「部位的」Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ（モザイクIIIａ、IVａ、Ｖａ、VI、VII） で凝集実験を実施した。示される結果は５個の無作為に選択した抗−Ｒｈ（Ｄ） Ｆａｂ／ファージクローンのアッセイの代表的な例である（図５）。 血液銀行タイピング試薬としてのＦａｂ／ファージ抗体の使用 マイクロプレート赤血球凝集反応アッセイにおいてＲｈ（Ｄ）−陰性とＲｈ（ Ｄ）−陽性ＲＢＣとを正確に識別する抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージ調製物の 能力（図４及び５）は、通常の抗血清を用いてＲＢＣの表現型を決めるために血 液銀行により用いられるゲル試験（Ｌａｐｉｅｒｒｅ等、１９９０、Ｔｒａｎｓ ｆｕｓｉｏｎ ３０：１０９−１１３０）をＦａｂ／ファージでの使用のために 適応させることができる証拠を与えた。 ゲル試験は抗−ヒトグロブリン（クームス試薬）中に懸濁した約２０μｌのデ キストラン−アクリルアミドビーズを各々入れた６本のミニカラムを含有する約 ５ｘ７ｃｍのプラスチックカードを含んでなる。型を決める赤血球を適切なヒト 抗血清とインキュベートし、ゲルを通して遠心分離する。抗血清が向けられる抗 原に関して陽性であるＲＢＣは抗−ヒトグロブリンに遭遇すると凝集し、ゲルマ トリックス中または上に捕捉されるようになる。反応性でないＲＢＣはゲル粒子 を通って沈殿し、マイクロチューブの底にペレットを形成する。ゲル試験はＲＢ Ｃ表現型 タイピングの伝統的な血液銀行法より減少した試薬容量、細胞洗浄工程の削除及 び結果のより客観的な解釈を初めとする多数の利点を与えるので、多数の血液銀 行機関はこの新規な技術を適応している。図６に示されるように、抗−Ｍ１３抗 体を含むように改変されたゲルカードで抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージを用い ることができる。 アッセイを実施するために、Ｒｈ（Ｄ）−陰性または−陽性の赤血球を抗−Ｒ ｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージ（_γ1κライブラリー、パンニング＃２）の希釈物と インキュベートし、抗−Ｍ１３抗体中に懸濁したビーズを含有するミクロカラム 中に遠心分離した。未希釈のＦａｂ／ファージストックはマイクロプレート沈降 アッセイのものと同様の５ｘ１０¹²ｃｆｕ／ｍｌの力価を有した（図４）。この アッセイに用いたＦａｂ／ファージの量はマィクロプレートアッセイのものの１ ／４であるので、１／６２５希釈物中に存在するＦａｂ／ファージの量は図４の １／２０４８希釈物中に存在するものにほぼ等しい。従って、陽性結果を生じる ために必要なＦａｂ／ファージの数は両方のアッセイで本質的に等しい。 ちょうど記述したように実施した他のアッセイにおいて、抗−Ｍ１３抗体をア ッセイから除くと、赤血球の凝集は見られなかった。さらに、抗−ＩｇＧ抗体は バクテリオファージの表面上に発現された組み換えＦａｂと反応しない。抗−Ｍ １３抗体がアッセイに存在する場合、抗−Ｒｈファージと反応したＲｈ−陽性細 胞のみが凝集した。高濃度の抗−Ｍ１３抗体を用いた場合に、Ｒｈ−陰性細胞さ え凝集されるように見えることに注意すべきである。これは結合しない（すなわ ち、反応しない）ファージの架橋の結果生じるアーチファクトであり、それらの ファージは多量の抗−Ｍ１３抗体の存在下で架橋されるようになり、全てのＲｈ −陰性細胞が横切ることができるとは限らない半不可入性のマットを形成する。 本明細書に記述した実験では、約１００μｇ／ｍｌの抗−Ｍ１３濃度が凝集のた め及び偽陽性結果の防止のための最適であると考えられた。アッセイに用いる試 薬及び細胞の正確な濃度により、抗−Ｍ１３の濃度はこの数から外れてもよい。 抗−Ｍ１３改変されたミクロタイピング系の相対的感度を評価するために、ミ クロタイピング系カードのカラムに１００μｇ／ｍｌの抗−Ｍ１３抗体を添加し た。Ｒｈ−陰性またはＲｈ−陽性赤血球を未希釈または５倍連続希釈（１／５、 １／２５、１／１２５、１／６２５及び１／３１２５）の抗−Ｒｈファージ抗体 とインキュベートした。カードを遠心分離し、サンプルを凝集に関して評価した 。改変されたミクロタイピング系カードアッセイは１／６２５ないし１／３１２ ５の間の希釈で抗−Ｒｈ凝集を検出することができた。 腫瘍特異的抗体の単離のための方法 腫瘍細胞に特異的なＦａｂ／ファージはインビトロでの診断（生検、体液また は血液サンプルのラボアッセイ）、腫瘍／転移のインビボ標識化（イメージング プローブへの抗体の結合）または悪性腫瘍の処置（化学的もしくは放射性毒素へ の抗体の結合）のために有用である。また、腫瘍特異的抗体は腫瘍細胞上の新規 な抗原またはマーカーの同定のためにも有用であり、それらは抗−腫瘍ワクチン の基礎を成すことができるる。さらに、抗−イディオタイプ抗体の作製のために 有用な腫瘍特異的抗体も抗−腫瘍ワクチンの基礎を成すことができる。 抗−腫瘍抗体は本質的に抗−Ｒｈ抗体の作製のために本明細書に記述したよう に作製される。腫瘍細胞、限定されないが例えば悪性黒色腫細 胞を細胞表面でビオチン化し、ストレプトアビジン−磁気ミクロビーズで標識し 、次に過剰の正常メラニン細胞と混合する。治療的に有用な抗−腫瘍抗体を保有 する黒色腫患者の末梢血リンパ球からＦａｂ／ファージライブラリーを作製する 。外見上自分自身を治療した多数の黒色腫患者は体液性（すなわち、抗体）免疫 反応を高めることによりそのようにした。これらのＦａｂ／ファージライブラリ ーを細胞の混合物とインキュベートする。悪性腫瘍細胞に特異的なエピトープに 向けられるＦａｂ／ファージは悪性腫瘍細胞に結合し、次に、磁気カラムパンニ ング方法を利用してそれらを単離することができる。 バクテリアのビルレント因子を同定するＦａｂ／ファージの単離 ビルレントバクテリア及びそれらの非病原性同等物の間の違いを検出すること ができるＦａｂ／ファージを単離するために本明細書に記述した方法を用いるこ とができる。この場合、バクテリアのビルレント株を磁気標識し、非病原性同等 物で希釈し、ビルレント株に感染した個体から得られたリンパ球から作製される Ｆａｂ／ファージライブラリーを添加する。このようにして単離されるＦａｂ／ ファージは新規なバクテリアの抗原の同定のために有用である可能性があり、そ れらに対して抗菌性化合物及び／またはワクチンを開発することができる／ 本明細書に引用される各々及び全ての特許、特許出願及び公開物の開示は本明 細書で全部引用することにより本明細書に組み込まれる。 本発明は特定の態様に関して開示されているが、当業者が本発明の真の趣旨及 び範囲から逸れずに本発明の他の態様及び変形を考案できることは明らかである 。付加した請求の範囲は全てのそのような態様及び同等な変形を含むと解釈され ると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． タンパク質をコードするＤＮＡを単離する方法であって、 該タンパク質を発現するウイルスベクター中にＤＮＡライブラリーを作製 し、その場合、該タンパク質は該ウイルスベクターの表面上に発現され、そして 該タンパク質は抗原保有部分に結合することができ； 該抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し； 該抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下で該磁気標識細胞 と該タンパク質を発現するウイルスをインキュベートして混合物を形成し、その 場合、該ウイルスは該磁気標識細胞に結合するものであり； ウイルスが結合した細胞を該混合物から単離し、そしてそれから該タンパク 質をコードするＤＮＡを得ることを含んでなる方法。 ２． タンパク質を単離する方法であって、 該タンパク質を発現するウイルスベクター中にＤＮＡライブラリーを作製 し、その場合、該タンパク質は該ウイルスベクターの表面上に発現され、そして 該タンパク質は抗原保有部分に結合することができ； 該抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し； 該抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下で該磁気標識細胞 と該タンパク質を発現するウイルスをインキュベートして混合物を形成し、その 場合、該ウイルスは該磁気標識細胞に結合するものであり； ウイルスが結合した細胞を該混合物から単離し、そしてそれから該タンパ ク質を単離することを含んでなる方法。 ３． 該ウイルスベクターがバクテリオファージである、請求の範囲 １または２の方法。 ４． 該バクテリオファージがＭ１３である、請求の範囲３の方法。 ５． 該タンパク質が抗体、リガンド及びホルモンよりなる群から選択される 、請求の範囲１または２の方法。 ６． 該タンパク質が抗体である、請求の範囲５の方法。 ７． 該抗体が抗−赤血球細胞表面抗原抗体である、請求の範囲６の方法。 ８． 該抗体が抗−Ｒｈ赤血球抗体である、請求の範囲７の方法。 ９． 該抗原保有部分がタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、並びにタンパク 質、脂質、炭水化物及び核酸の少なくとも１つの複合体よりなる群から選択され る、請求の範囲１または２の方法。 １０． 該抗原保有部分が膜結合タンパク質である、請求の範囲９の方法。 １１． 該膜結合タンパク質が抗原及び受容体タンパク質よりなる群から選択 される、請求の範囲１０の方法。 １２． 該膜結合タンパク質が抗原である、請求の範囲１１の方法。 １３． 該抗原が赤血球抗原である、請求の範囲１２の方法。 １４． 該抗原がＲｈ抗原である、請求の範囲１３の方法。 １５． 抗原保有部分に結合することができるタンパク質を単離する方法で、 該タンパク質をコードするＤＮＡから該タンパク質を発現させ、その場合、該Ｄ ＮＡは請求の範囲１の方法により得られ、そしてそのように発現された該タンパ ク質を単離することを含んでなる方法。 １６． 請求の範囲１の方法に従って得られるタンパク質をコードする単離さ れたＤＮＡ。 １７． 請求の範囲２または１５の方法に従って得られるタンパク質の実質的 に純粋な調製物。 １８． 抗原保有部分に結合することができるタンパク質をコードするＤＮＡ を単離する方法であって、 該タンパク質を発現するウイルスベクター中に合成ＤＮＡライブラリーを 作製し； 該抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し； 該抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下で該磁気標識細胞 と該タンパク質を発現するウイルスをインキュベートして混合物を形成し、その 場合、該ウイルスは該磁気標識細胞に結合するものであり； ウイルスが結合した細胞を該混合物から単離し、そしてそれから該タンパ ク質をコードするＤＮＡを得ることを含んでなる方法。 １９． 抗原保有部分に結合することができるタンパク質を単離する方法であ って、 該タンパク質を発現するウイルスベクター中に合成ＤＮＡライブラリーを 作製し； 該抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し； 該抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下で該磁気標識細胞 と該タンパク質を発現するウイルスをインキュベートして混合物を形成し、その 場合、該ウイルスは該磁気標識細胞に結合するものであり； ウイルスが結合した細胞を該混合物から単離し、そしてそれから該タンパ ク質を単離することを含んでなる方法。 ２０． 抗原保有部分に結合することができるタンパク質を単離する方法であ って、該タンパク質をコードするＤＮＡから該タンパク質を発現させ、その場合 、該ＤＮＡは請求の範囲１７の方法により得られ、そしてそのように発現された 該タンパク質を単離することを含んでなる方法。 ２１． 請求の範囲１８の方法に従って得られるタンパク質をコードする単離 されたＤＮＡ。 ２２． 請求の範囲１９または２０の方法に従って得られるタンパク質の実質 的に純粋な調製物。