JP4101298B2 - タンパク質の製造のための磁気活性化細胞の分類 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明の分野は組み換えＤＮＡ技術を用いる抗体の作製である。
発明の背景
モノクローナル抗体を製造する能力は診断薬及び治療薬に大変革を起こしている。典型的には、抗体を産生するマウスリンパ球を不死化し、従って、マウス抗体を産生する細胞の無限の供給を保証することによりモノクローナル抗体は製造される。しかしながら、多くのヒト用途のために、ヒト抗体を製造することが望ましい。例えば、ヒトへのヒト抗体の投与は投与された抗体に対する潜在的な免疫反応を回避し、それらの反応は抗体が投与された目的を無にする可能性があるので、診断または治療のいずれかの目的のためにヒトに投与される抗体はヒト抗体であることが好ましい。
さらに、ある種の状況では、診断法において検出される抗原に対する抗体を他の動物が作ることができないので、診断目的のためにヒト抗体を用いることが必須である。例えば、他の動物はヒトＲｈ抗原を検出することができる抗体を作ることができないので、ヒト赤血球（ＲＢＣ）のＲｈ表現型を決定するためには、抗−Ｒｈ抗体を含むヒト血清を用いなければならない。
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によるトランスフォーメーションまたは細胞融合を用いてヒトＢリンパ球を不死化することによるインビトロでのヒト抗体の製造は、ネズミの系と比較してＥＢＶによるトランスフォーメーション及び細胞融合の両方の比較的低い効率のために技術的困難をはらんでいる。これらの問題を克服するために、展示Ｍ１３バクテリオファージを用いたヒト抗体の製造方法が開発されている（Ｂｕｒｔｏｎ等、１９９４、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０）。本質的には、抗体産生細胞の集団より得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｍＲＮＡは再編成された免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をコードし、従って、ｃＤＮＡは同じものをコードする。増幅されたｃＤＮＡをＭ１３発現ベクター中にクローン化し、ヒトＦａｂフラグメントを表面上に発現するファージのライブラリーを作製する。目的の抗体を展示するファージを抗原結合により選択し、そしてバクテリア中で増殖させて可溶性のヒトＦａｂ Ｉｇを製造する。従って、通常のモノクローナル抗体合成と異なり、この方法はヒトＩｇを発現する細胞よりむしろヒトＩｇをコードするＤＮＡを不死化する。
バクテリオファージを用いる抗体の作製と関係するいくつかの難題がある。例えば、精製工程は必ずタンパク質の可溶化を伴い、それはあるタンパク質をその上に存在する抗原性部位の破壊を伴って永久的に変性させる可能性があるので、多くのタンパク質を非変性状態で精製することができない。従って、そのようなタンパク質を固相に結合させることができず、それ故、それらに結合する抗体を保有するファージのパンニングのために用いることができない。そのようなタンパク質の例はヒトＲｈ抗原である。
その問題を解決するために、完全なＲＢＣをパンニング抗原として用いる方法が開発された（Ｓｉｅｇｅｌ等、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８３：２３３４−２３４４）。しかしながら、ファージは生来「粘着性」であり、そしてＲＢＣは多数の抗原を細胞表面上に発現するので、適切な抗体を表面上に発現しないファージの十分量もＲＢＣに付着し、従って、その方法は所望する特異性の抗体を発現するファージの単離のためには非実用的になる。
Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ等（１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３９３８−３９４２）は抗体をコードするファージを単離する方法を開示しており、その場合、抗体を発現するファージを抗原を発現する細胞及び抗原を発現しない細胞の混合物とインキュベートする。抗体を発現するファージは抗原を発現する細胞に結合する。ファージとの結合後に、蛍光標識された抗体を抗原発現細胞に特異的に付加し、それらの細胞をそれらに結合した抗体発現ファージと共に混合物から取り出す。蛍光標識された細胞の単離は、高価で時間のかかる方法の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の技術を用いて実施する。
迅速且つ経済的であり、そしてヒトにおける診断及び治療用途のために有用な非常に多数のタンパク質結合タンパク質を与える、組み換えタンパク質、好ましくは抗体を単離する方法に対する必要性が依然としてある。
発明の要約
本発明はタンパク質を発現するウイルスベクター中にＤＮＡライブラリーを作製し、その場合、タンパク質はウイルスベクターの表面上に発現され、そしてそのタンパク質は抗原保有部分に結合することができ、抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し、磁気標識細胞とタンパク質を発現するウイルスを抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下でインキュベートして混合物を形成し、その場合、ウイルスは磁気標識細胞に結合し、ウイルスが結合した細胞を混合物から単離し、そしてそこからタンパク質をコードするＤＮＡを得ることを含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡを単離する方法に関する。
また、本発明はタンパク質を発現するウイルスベクター中にＤＮＡライブラリーを作製し、その場合、タンパク質はウイルスベクターの表面上に発現され、そしてそのタンパク質は抗原保有部分に結合することができ、抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し、磁気標識細胞とタンパク質を発現するウイルスを抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下でインキュベートして混合物を形成し、その場合、ウイルスは磁気標識細胞に結合し、ウイルスが結合した細胞を混合物から単離し、そしてそこからタンパク質を単離することを含んでなるタンパク質を単離する方法にも関する。
一つの態様として、ウイルスベクターはバクテリオファージであり、そして別の態様として、バクテリオファージはＭ１３である。
本発明の一つの態様として、タンパク質は抗体、リガンド及びホルモンよりなる群から選択され、そして別の態様として、タンパク質は抗体であり、それは抗−Ｒｈ赤血球抗体のような抗−赤血球表面抗原抗体であってもよい。
本発明のさらに別の態様として、抗原保有部分はタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、並びにタンパク質、脂質、炭水化物及び核酸の少なくとも一つの複合体よりなる群から選択される。
抗原保有部分は抗原及び受容体よりなる群から選択される膜結合タンパク質であってもよい。別の態様として、膜結合タンパク質はＲｈ抗原のような赤血球抗原のような抗原である。
また、本発明はタンパク質を発現するウイルスベクター中に合成ＤＮＡライブラリーを作製し、抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し、磁気標識細胞とタンパク質を発現するウイルスを抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下でインキュベートして混合物を形成し、その場合、ウイルスは磁気標識細胞に結合し、ウイルスが結合した細胞を混合物から単離し、そしてそれからタンパク質をコードするＤＮＡを得ることを含んでなる抗原保有部分に結合することができるタンパク質をコードするＤＮＡを単離する方法にも関する。
本発明はさらにタンパク質を発現するウイルスベクター中に合成ＤＮＡライブラリーを作製し、抗原保有部分を発現する細胞に磁気標識を付加し、磁気標識細胞とタンパク質を発現するウイルスを抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下でインキュベートして混合物を形成し、その場合、ウイルスは磁気標識細胞に結合し、ウイルスが結合した細胞を混合物から単離し、そしてそれからタンパク質を単離することを含んでなる抗原保有部分に結合することができるタンパク質を単離する方法に関する。
また、抗原保有部分に結合することができるタンパク質を単離する方法も提供される。それらの方法はタンパク質をコードするＤＮＡからタンパク質を発現させ、その場合、ＤＮＡは本明細書に記述される方法により得られ、そしてそのように発現されたタンパク質を単離することを含んでなる。
また本発明に含まれるものは本明細書に記述される方法に従って得られるタンパク質をコードする単離されたＤＮＡである。
また、本発明は本明細書に記述される方法に従って得られるタンパク質の実質的に純粋な調製物にも関する。
【図面の簡単な説明】
図１は磁気活性化細胞分類を用いる細胞表面Ｆａｂ−ファージパンニングの方法の図である。
図２はヒトＲＢＣの細胞表面ビオチン化を示すグラフである。
図３は本発明の抗原−陽性、抗原−陰性細胞分離方法を実証する一連のグラフである。
図４は抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージ凝集力価を測定したマイクロプレート凝集アッセイの像である。
図５は選択した抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージクローンのＲｈ（Ｄ）結合エピトープの決定を示すマイクロプレート凝集アッセイの像である。
図６はゲルカードアッセイにおけるＦａｂ／ファージ抗体の使用を示す像である。
発明の詳細な説明
本発明により、タンパク質をコードするＤＮＡ及びそれによりコードされるタンパク質を単離する新規な方法が提供され、その場合にタンパク質は好ましくは抗体であり、そのタンパク質は抗原保有部分に特異的に結合することができる。
本明細書に例示されるように、その方法はヒト抗体をコードするバクテリオファージを作製することを含んでなるがそれに限定されない。具体的には本発明において、Ｍ１３糸状ファージライブラリーによりコードされる抗−Ｒｈ（Ｄ）ＲＢＣ Ｆａｂ／ファージ抗体が得られる。高度免疫感作された提供者から得られる抗体産生細胞から、まず抗体産生細胞において発現されるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを得ることによりライブラリーを作製する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びＤＮＡのＩｇをコードするフラグメントに特異的なプライマーを用いてそのようなｃＤＮＡのフラグメントを得る。そのようにして得られたＩｇに特異的なＤＮＡをバクテリオファージ中にクローン化する。ストレプトアビジンを結合した磁気ミクロビーズで前以て被覆した抗原陽性のビオチン化ＲＢＣ標的細胞及び過剰の非標識ＲＢＣの混合物に対してＩｇフラグメントをコードするバクテリオファージをパンニングする。ファージ表面上に抗体を発現するバクテリオファージで、それらの抗体が標的細胞抗原に特異的であるものは標識された細胞に結合する。これらのファージを磁気カラムを用いて非標識細胞に結合したファージ及び細胞に結合しないファージから分離する。そのように分離されたファージは標的細胞上の抗原に特異的な抗体をコードし、展示する。
ファージ抗体ライブラリーを作製するために、まず、ファージ表面上に発現される所望するタンパク質、例えば、所望する抗体を発現する細胞から単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを得る。逆転写酵素を用いてｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成する。Ｉｇフラグメントを特定するｃＤＮＡをＰＣＲにより得、得られたＤＮＡを適当なバクテリオファージベ中にクローン化してＩｇ遺伝子を特定するＤＮＡを含んでなるバクテリオファージＤＮＡライブラリーを作製する。異種起源のＤＮＡを含んでなるバクテリオファージライブラリーの作製方法は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に記述されている。
また、ＰＣＲ増幅されたＩｇをコードするｃＤＮＡのフラグメントよりむしろｃＤＮＡを用いてバクテリオファージライブラリーを得ることもできる。ｃＤＮＡライブラリーの作製はリガンド等のような抗体ではないタンパク質の単離のために有用である。
所望するタンパク質、例えば抗体をコードするバクテリオファージを、その対応する結合タンパク質、例えば抗体が向けられる抗原への結合に利用できるようにタンパク質をその表面上に展示するように設計することができる。従って、特定の抗体を発現するバクテリオファージを対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートした場合、バクテリオファージは細胞に結合する。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しない。
バクテリオファージのパンニング、すなわち、所望する抗体を発現するファージの選択のために、対応する抗原を発現する細胞をビオチンのような検出可能な標識で標識する。次に、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズを細胞に付加する。それらの細胞を抗原を発現しない過剰の非標識細胞と混合する。次に、この細胞混合物をファージライブラリーとインキュベートし、その場合、抗体を発現するファージは抗原を発現する細胞に結合する。混合物中の過剰の非標識細胞の存在は、抗体を発現しないが、それとは別に抗原を発現する細胞に非特異的に結合する可能性があるバクテリオファージを除く手段として役立つ。本発明を実施するための実験方法の詳細は本明細書において実験の詳細の節に与えられる。
結合した抗体発現ファージを有する抗原発現細胞を混合物から磁気的に取り出す。磁気除去の一つの例は、カラムの周りの磁場の選択的存在または非存在下で磁性及び非磁性細胞の混合物をカラム中に流し入れることを含む。あるいはまた、単に試験管の側面に磁石を保持し、それらの細胞を内壁に引き付け、次に溶液から非磁性細胞を注意深く除くことにより、溶液中の非磁性細胞から磁性細胞を分離することができる。
従って、本発明の方法は磁気標識された受容体陽性粒子（すなわち、細胞）及び非標識受容体陰性粒子の混合物に対して負及び正の選択を同時に実施することにより、天然または合成のファージＤＮＡライブラリーに由来する特定のファージ展示リガンドを発現するものに関して組み換えファージの集団を濃縮する方法を含む。
「バクテリオファージ」及び「ファージ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、バクテリアに感染するウイルスをさす。本明細書で用いられる「バクテリオファージライブラリー」または「ファージライブラリー」という用語の使用は、異種起源のＤＮＡ、すなわち、バクテリアウイルスにより生来コードされないＤＮＡを含んでなるバクテリアウイルスの集団を意味する。
「ウイルスベクター」という用語は異種起源のＤＮＡが挿入されているウイルスを含む。ウイルスベクターはバクテリオファージであってもよく、または真核生物ウイルスであってもよい。
本明細書に用いられる「標的細胞」という用語は、所望する抗体を捜し出す抗原を発現する細胞を意味する。
本明細書に用いられる「パンニング」または「パンニングした」という用語は、所望する抗体をコードするファージを選択する工程を意味する。
本明細書に用いられる「Ｆａｂ／ファージ」という用語は、抗体のＦａｂ部分を発現するファージ粒子を意味する。
本明細書に用いられる「ｓｃＦｖ／ファージ」という用語は、単鎖として抗体のＦｖ部分を発現するファージ粒子を意味する。
「過剰の非標識細胞」は、標識細胞の数を超える非標識細胞の量を意味する。好ましくは、標識細胞対非標識細胞の比率は約１：２である。より好ましくは、標識細胞対非標識細胞の比率は約１：４より大きい。さらにより好ましくは、標識細胞対非標識細胞の比率は約１：１０より大きい。
本明細書において例示される本発明の方法は抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの作製を記述するが、本方法はＦａｂ抗体をコードするファージの作製のみに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、単鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）も本発明に含まれる。Ｆａｂ分子は全Ｉｇ軽鎖を含んでなり、すなわち、それらは軽鎖の可変及び定常領域の両方を含んでなるが、重鎖の可変領域及び一番目の定常領域ドメイン（ＣＨ１）のみを含む。単鎖抗体分子はＩｇ Ｆｖフラグメントを含んでなる単鎖のタンパク質を含んでなる。Ｉｇ Ｆｖフラグメントは抗体の重及び軽鎖の可変領域のみを含み、その中に定常領域を含まない。Ｍａｒｋｓ等、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記述された方法に従ってｓｃＦｖ ＤＮＡを含んでなるファージライブラリーを作製することができる。Ｆａｂ ＤＮＡを含んでなるファージライブラリーに対して本明細書に記述したように、所望する抗体の単離のためにそのように作製したファージのパンニングを実施する。
また、本発明は重及び軽鎖可変領域がほとんど全ての可能な特異性を含むようにそれらを合成することができる合成ファージ展示ライブラリーも含むと解釈されるべきである。従って、抗体展示ライブラリーは「天然」または「合成」（Ｂａｒｂａｓ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：８３７−８３９；ｄｅ Ｋｒｕｉｆ等、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５）であってもよい。「天然の」抗体を含んでなる抗体展示ライブラリーを実験実施例の節に記述したように作製する。「合成の」抗体を含んでなる抗体展示ライブラリーをＢａｒｂａｓ（１９９５、上記）及びその中に引用された参考文献に記述された方法に従って作製する。
本発明の方法はさらに本明細書に例示されるＭ１３以外のファージを含んでなるファージ展示ライブラリーの作製を含むと解釈されるべきである。ラムダファージのような他のバクテリオファージも本発明の方法に有用である可能性がある。表面上に異種起源のＤＮＡによりコードされるペプチドを展示するラムダファージ展示ライブラリーは作製されている（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ等、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１６０９−１６１３）。さらに、本発明の方法を真核生物ウイルスのようなバクテリオファージ以外のウイルスを含むように拡張することができると考えられる。実際、哺乳類への送達のために適当な遺伝子をコードし、そしてその遺伝子が送達される特定の細胞型または組織を標的とすることができる抗体をコード及び展示する真核生物ウイルスを作製することができる。例えば、機能的抗体フラグメントを展示するレトロウイルスベクターが作製されている（Ｒｕｓｓｅｌｌ等、１９９３、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：１０８１−１０８５）。
抗体を作製することができる赤血球抗原はＲｈ（Ｄ）、Ｒｈ（Ｃ）、Ｒｈ（ｃ）、Ｒｈ（Ｅ）、Ｒｈ（ｅ）を初めとするＲｈ抗原、並びにケル式、ダッフィ式、リュテラン式及びキッド式血液型の赤血球抗原を初めとする他の非Ｒｈ抗原を含むがそれらに限定されない。
従って、本発明の方法は抗−Ｒｈ（Ｄ）抗体をコードするＤＮＡの単離のみに限定されず、むしろ、あらゆるＲＢＣ抗原または限定されないが腫瘍特異的抗原、バクテリア抗原等のような他の細胞抗原に対する抗体をコードするＤＮＡの単離のために用いることができる。また、本発明の方法は多数の臨床的に重要な血小板抗原、注目すべきものとしてＰ１^A1／Ｐ１^A2、Ｂａｋ^a／Ｂａｋ^b、Ｐｅｎ^A／Ｐｅｎ^B等に特異的なファージ抗体を作製することにより血小板の型を決めるためにも有用である。
本発明はさらに実質性（例えば、腎臓、心臓、肝臓、肺）及び非実質性（例えば、骨髄）の両方の器官または組織移植の場合に、可能性のある移植適合に関して提供者及び宿主を照合する目的のためにＨＬＡ抗原に関して提供者の白血球の型を決めるために有用である。
こららの非赤血球抗原のいずれかに対する抗体を発現するファージの結合を検出するために、赤血球の凝集または捕捉に関して本明細書に記述した方法に従って非赤血球細胞を凝集または捕捉することができる。凝集または捕捉の前に、凝集または捕捉を肉眼またはスキャナーで識別できるように染色または他の標識化技術により細胞を「目に見える」ようにすることができる。
本発明の方法は抗原保有部分が可溶性形態で容易に精製されない場合に、抗原保有部分に結合するタンパク質を作製するために最も有用である。従って、抗原保有部分は他の構造、通常、細胞膜または細胞小器官膜のような細胞中の膜と結合している抗原を含む。
本発明では、抗原保有部分はタンパク質、脂質、炭水化物または核酸であってもよく、またはそれはタンパク質、脂質、炭水化物及び核酸の少なくとも２つの複合体であってもよく、細胞中の多数の抗原保有部分がこれらの部分のいずれかのみで構成されないことが理解される。好ましくは、抗原保有部分は抗原または受容体タンパク質のような膜結合タンパク質である。しかしながら、抗原保有部分が炭水化物である場合、それは糖脂質上に発現される炭水化物、例えば、Ｐ式血液型抗原または他の抗原であってもよい。
本明細書に用いられる「抗原保有部分」という用語は抗体が結合する分子を意味する。
また、本発明の方法は自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）に関与するもの（Ｓｉｅｇｅｌ等、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｇａｒｒａｔｔｙ（編集）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のような自己免疫抗体の作製のためにも有用である。細胞表面膜に結合しているかまたは細胞小器官膜に結合している細胞抗原に対して向けられる自己免疫抗体を本明細書に記述する技術を用いて単離することができる。自己免疫疾患及び抗体を単離することができるそれらに関係する抗原は以下のもの：重症筋無力症（アセチルコリン受容体；ニューロン）、慢性炎症性脱髄多発性ニュロパシー（ミエリン；ニューロン）、自己免疫性甲状腺疾患（甲状腺刺激ホルモン受容体；甲状腺細胞）、原発性胆汁性肝硬変（ミトコンドリアの自己抗原；肝臓ミトコンドリア）、特発性血小板減少性紫班病（血小板膜インテグリン；血小板）、尋常性天疱瘡（表皮抗原；表皮）及びグッドパスチャー症候群（基底膜抗原；腎臓または肺細胞）を含むがそれらに限定されない。
実際、本発明の方法は細胞上に発現される抗原に対するあらゆる抗体をコードするＤＮＡクローンを単離するために有用であり、その細胞を磁気標識で標識することができ、そしてアッセイで必要とされる過剰の非標識細胞を与えるために十分な量で非標識形態で得ることができる。
さらに、本発明の方法は抗体をコードするＤＮＡの単離に限定されず、むしろ、限定されないが、例えば、細胞受容体タンパク質、ペプチドホルモン等に結合するリガントのような細胞タンパク質に対する特異性を有する他のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡの単離のためにも用いることができる。
また、本発明は細胞標識剤としてビオチンの使用に限定されると解釈されるべきではない。細胞への付加がその上に発現されるあらゆる表面タンパク質の構造保全性を妨げず、そしてそのような標識により常磁性ミクロビーズまたは他の磁気物質をそれに付加することができる場合、他の標識を用いることができる。他のそのような標識は活性化アミン、カルボキシルまたはチオール基を保有する磁気ビーズと直接誘導化する（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅｄ）ことができる細胞表面タンパク質または炭水化物を含むがそれらに限定されない。さらに、フルオレセインまたはローダミンのような染料もビオチンと同様な方法で細胞に共有結合的に結合することができ、そして抗−染料抗体で被覆した磁気ビーズをそれに付加することができる。
本発明は本明細書に記述される方法を用いて作製されるタンパク質及びそれらをコードするＤＮＡを含む。抗体をコードするＤＮＡを単離するために、例えば、本発明の方法に従って得られる抗体発現ファージからＤＮＡを抽出する。そのような抽出技術は当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（上記）に記述されている。
本明細書に用いられる「単離されたＤＮＡ」は、生来存在する状態で隣接する配列から精製されているＤＮＡ配列、セグメントまたはフラグメント、例えば、フラグメントに通常隣接する配列、例えばフラグメントが生来存在するゲノム中でそれに隣接する配列から取り出されているＤＮＡフラグメントをさす。また、その用語はＤＮＡに生来付随する他の成分、例えば、細胞中で生来それに付随するＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製されているＤＮＡにも当てはまる。
また、本発明は本発明の方法に従って単離されるＤＮＡに実質的に相同なＤＮＡも含むと解釈されるべきである。好ましくは、実質的に相同なＤＮＡは本発明の方法を用いて得られるＤＮＡに約５０％相同であり、より好ましくは約７０％相同であり、さらにより好ましくは約８０％相同であり、そして最も好ましくは約９０％相同である。
本明細書に用いられる場合「相同な」は、２個のポリマー分子間、例えば２個の核酸分子、例えば２個のＤＮＡ分子もしくは２個のＲＮＡ分子間、または２個のポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性をさす。２個の分子の両方のサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められる場合、例えば、２個のＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンで占められる場合、それらはその位置で相同である。２個の配列間の相同性は一致するまたは相同な位置の数の直接関数であり、例えば、２個の化合物配列の位置の半分（例えば、１０サブユニットの長さのポリマーの５つの位置）が相同である場合、それら２個の配列は５０％相同であり、９０％の位置、例えば、１０のうち９が一致するかまたは相同である場合、それら２つの配列は９０％の相同性を有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ ５’及び３’ＴＡＴＧＣＧ ５’は５０％の相同性を有する。
本発明の方法を用いて作製される、例えば抗体を含んでなるタンパク質の実質的に純粋な調製物を得るために、タンパク質をそれが発現されるファージの表面から抽出することができる。そのような抽出のための方法はタンパク質精製の当業者によく知られている。あるいはまた、抗体をコードする単離されたＤＮＡを発現ベクター中にクローン化し、そしてそれからタンパク質を発現させることにより、例えば抗体を含んでなるタンパク質の実質的に純粋な調製物を得ることができる。そのように発現されたタンパク質を当該技術分野においてよく知られている通常のタンパク質精製方法を用いて得ることができる。
本明細書に用いられる場合、「実質的に純粋な」という用語は、生来付随する成分から分離されている化合物、例えばタンパク質またはポリペプチドを説明する。典型的には、サンプル中の全材料の（容量で、湿もしくは乾量で、またはモルパーセントもしくはモル比で）少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９９％が目的の化合物である場合、その化合物は実質的に純粋である。あらゆる適切な方法、例えば、ポリペプチドの場合にはカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析により純度を測定することができる。化合物、例えばタンパク質が生来会合した成分を本質的に含まない場合、または生来の状態でそれに付随する天然の混入物から分離される場合にもそれは実質的に精製される。
また、本発明は本発明の方法に従って得られるタンパク質またはペプチドの類似体も規定する。類似体は天然に存在するタンパク質またはペプチドと保存的アミノ酸配列の相違もしくは配列を変えない修飾またはそれらの両方により異ってもよい。
例えば、保存的アミノ酸変異を作製することができ、それらはタンパク質またはペプチドの一次配列を変えるが、通常、その機能を変えない。保存的アミノ酸置換は典型的に以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
（通常、一次配列を変えない）修飾はインビボまたはインビトロでのポリペプチドの化学的誘導化、例えばアセチル化またはカルボキシル化を含む。また含まれるものはグリコシル化の修飾、例えば、ポリペプチドの合成及びプロセシング中またはさらなるプロセシング工程においてそのグリコシル化様式を修飾することにより；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳類のグリコシル化または脱グリコシル化酵素にポリペプチドをさらすことによりなされるものである。また含まれるものはリン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを有する配列である。
また含まれるものは、タンパク質分解に対する抵抗性を向上するためまたは溶解特性を最適化するために通常の分子生物学技術を用いて修飾されているポリペプチドである。そのようなポリペプチドの類似体は天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有するものを含む。本発明のペプチドは本明細書に挙げられる特定の例示的方法のいずれかの生成物に限定されない。
実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明はポリペプチドの活性フラグメントを規定する。特定のポリペプチドが抗原保有部分に結合する場合、例えば、抗体のフラグメントが全長タンパク質と同様にその対応する抗原に結合する場合、それは活性があるとみなされる。
本明細書に用いられる場合、ポリペプチドに適用される「フラグメント」という用語は、通常、少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約１００個の連続したアミノ酸、より典型的には少なくとも約２００個の連続したアミノ酸、そして通常少なくとも約３００個の連続したアミノ酸の長さである。
本発明はさらに以下の実験実施例を参照することにより詳細に説明される。これらの実施例は例示の目的のためのみに与えられ、他に特定されないかぎり限定するものではない。従って、本発明は以下の実施例に限定されるといかようにも解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に与えられる教示の結果として明らかになるいずれか及び全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
本明細書に記述される実験実施例はＦａｂ／ファージ展示を用いて抗−Ｒｈ（Ｄ）赤血球抗体を単離及び製造するための方法及び結果を与える。
細胞表面に発現される精製できない分子に特異的な、糸状ファージにより展示されるヒトモノクローナル抗体の単離方法を図１に記述する。抗原特異的ファージの捕捉を最適化し、そして関係のないファージ抗体の結合を最小限にするために、正及び負の同時選択方法を用いた。目的の抗原を保有する細胞を磁気ビーズで前以て被覆し、過剰の未修飾の抗原陰性細胞中に希釈する。細胞混合物をＦａｂ／ファージライブラリーとインキュベーションした後、磁気活性化細胞分類を用いて抗原陽性細胞集団を回収し、抗原特異的Ｆａｂ／ファージを溶出し、バクテリア培養で増やす。このプロトコルを磁気標識されたＲｈ（Ｄ）−陽性及び過剰の非標識Ｒｈ（Ｄ）−陰性ヒト赤血球並びにヒト末梢血リンパ球から構築されたＦａｂ／ファージライブラリーで用いた場合、一人の同種免疫個体から多数の独特な臨床的に有用な_γ1κ及び_γ1λ抗−Ｒｈ（Ｄ）抗体を単離した。
本発明の細胞表面選択法は推定される腫瘍特異的抗原の同定のためのような他の系における使用のために容易に適応でき、そして新規なまたは構造に依存する細胞表面エピトープに向けられる自己複製抗体試薬を単離するための迅速で（１カ月以内）高収率の方法を提供する。
Ｆａｂ／ファージ展示ライブラリーの作製
Ｒｈ（Ｄ）−陽性の赤血球（ＲＢＣ）で先に過剰免疫したＲｈ（Ｄ）−陰性の個体からの末梢血から得た２ ｘ １０⁷の単核細胞から別個の_γ1κ及び_γ1λファージライブラリーを構築した。以前に公開された方法（Ｂａｒｂａｓ等、１９９１、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｐｈａｇｅ（Ｐｈａｂｓ）：Ｒａｐｉｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆａｂｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１１９−１２４中；Ｓｉｅｇｅｌ等、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８３：２３３４−２３４４）を利用してファージミドベクターｐＣｏｍｂ３（Ｂａｒｂａｓ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２）を用いてライブラリーを作製した。
簡潔に言えば、提供者の細胞のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びＳｉｌｖｅｒｍａｎ等（１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：４１７−４２６）のものにより補足されたＫａｎｇ等により記述された（１９９１、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｐｈａｇｅ（Ｐｈａｂｓ）：Ｒａｐｉｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆａｂｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ」Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１１１−１１８中）一連のヒトＩｇプライマーを用いて重鎖及び軽鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）ｃＤＮＡセグメントを増幅した。重及び軽鎖ＰＣＲ産物をｐＣｏｍｂ３中にクローン化し、大腸菌中にエレクトロポレーションした。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を同時感染させると、Ｉｇ ＤＮＡは糸状ファージ粒子中にパーッケージされ、それは遺伝子IIIバクテリオファージ外被タンパク質に融合されたヒトＦａｂ分子を発現する。
抗−Ｒｈ（Ｄ）クローンに対するＦａｂファージ展示ライブラリーのパンニング
１０％のヘマトクリット値で細胞を５００μｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と室温（ＲＴ）で４０分間インキュベートすることにより、Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを細胞表面でビオチン化した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄した後、８ ｘ １０⁶のビオチン化Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを１０μｌのストレプトアビジンで覆われた常磁性ミクロビーズ（ＭＡＣＳストレプトアビジンミクロビーズ、Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）と共に１００μｌ ＰＢＳの全容量でＲＴで１時間インキュベートした。未反応のビーズを洗浄により除き、次に、磁気ビーズで覆われたＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを１０倍過剰（８ ｘ １０⁷）のＲｈ（Ｄ）−陰性（未修飾の）ＲＢＣ並びに〜３ ｘ １０¹¹コロニー形成単位（ｃｆｕ）の（上記のように調製した）_γ1κ及び_γ1λ Ｆａｂ／ファージライブラリーのいずれかと２％脱脂粉乳を含有する４０μｌ ＰＢＳ（ＭＰＢＳ、Ｃａｒｎａｔｉｏｎ、Ｎｅｓｔｌｅ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｌｅｎｄａｌｅ、ＣＡ）の最終容量で混合した。
３７℃で２時間のインキュベーション後、ＲＢＣ／ファージ懸濁液を２％ ＭＰＢＳで前以て平衡化したＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気型ＭＳカラム（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上に１０μｌ／分の流速で添加した。磁気ビーズで覆われたＲＢＣがカラムの非常に最上部に即座に付着し、それを詰まらせ、そしてＲｈ（Ｄ）陰性の非ビオチン化ＲＢＣの捕捉を引き起こすのを防ぐために、カラムの周りの磁場なしにこの添加工程を実施した。カラムの排除体積は４０μｌよりわずかに大きいので、ＲＢＣ／ファージインキュベーション混合物を磁場なしで添加することは、抗原陰性及び抗原陽性ＲＢＣを流れ出さずにカラムの全体にわたって均一に分布させる。いったん添加すると、カラムを磁場中（ＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離装置、Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に２分間置いてＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを接着させ、そして一連の５００μｌの洗浄をよく冷えたＭＰＢＳで実施し、続いてＰＢＳで最終洗浄した。最初の２回のパンニングでは全部で３回の洗浄を実施し、そしてその後の全てのパンニングでは全部で６回の洗浄を実施した。各パンニングでは、最初の洗浄を１０μｌ／分の流速で実施し、その間に大部分のＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣはカラムから流れ出た。その後の全ての洗浄を２００μｌ／分で実施した。最後の洗浄後にカラムを磁場から取り出し、ビーズで被覆され／ファージで被覆されたＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを５ｃｃ注射器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）からのプランジャを用いて５００μｌ ＰＢＳでカラムから流し出した。
それらのＲＢＣをすぐに１３，０００ ｘ ｇで５秒間遠心分離し、次に、２００μｌの７６ｍＭクエン酸塩、ｐＨ２．４中に再懸濁してＲｈ（Ｄ）抗原を変性させ、結合したファージを溶出させた。断続的にボルテックスしながらＲＴで１０分のインキュベーション期間の後、ファージ溶出液及び細胞残渣を１８μｌの２Ｍトリス塩基で中和し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足したスーパー（ｓｕｐｅｒ）培地（ＳＢ）（Ｂａｒｂａｓ等、１９９１、上記）中で生育した大腸菌のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）Ｏ．Ｄ．＝１．０ １０ｍＬに添加した。ＲＴで１５分間インキュベーションし、その間にＲｈ（Ｄ）バインダーに対して濃縮されたファージライブラリーをバクテリア培養物に感染させた後、４０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する前以て温めた３７℃のＳＢを添加してそれぞれ２０μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの最終抗生物質濃度を生じた。少量の培養物（〜１００μｌ）をすぐに取り出し、ＬＢ／カルベニシリンプレート上で滴定して全溶出液中に含まれるファージの数を決定した。培養物の残りを３００ＲＰＭで３７℃で１時間振盪した。続いて、追加の抗生物質、追加のＳＢ及びＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを添加し、記述されたように（Ｓｉｅｇｅｌ等、１９９４、上記）培養物を３０℃で一晩生育した。
ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）沈殿によりファージミド粒子を培養上清から精製し（Ｂａｒｂａｓ等、１９９１、上記）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ中に再懸濁し、そして一晩透析して次の回のパンニング中にＲＢＣを溶解する可能性がある残存しているＰＥＧを除いた。このように、得られたファージ調製物は次の回のパンニングの原材料として使える。バクテリア増幅により導入される可能性がある軽鎖アイソタイプ複製のあらゆる偏りを防ぐために_γ1κ及び_γ1λファージライブラリーを別個にパンニングした。
抗−Ｒｈ（Ｄ）反応性に関するポリクローナルＦａｂ／ファージライブラリー及び個々のファージクローンのスクリーニング
結合した抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージを有するＲＢＣ間に凝集を引き起こすために架橋抗体として抗−Ｍ１３抗体を用いてＲｈ（Ｄ）抗原に対するＦａｂ／ファージの特異性を評価した。一連のパンニングからのポリクローナルＦａｂ／ファージの１００μｌアリコートまたは個々のＦａｂ／ファージ溶出液クローンから得られたモノクローナルＦａｂ／ファージを特定の表現型（すなわち、Ｒｈ（Ｄ）−陰性または陽性）のＲＢＣの３％懸濁液５０μｌとインキュベートした。
３７℃で１時間のインキュベーション後、ＲＢＣを２ｍｌの冷えたＰＢＳで３回洗浄して結合しないＦａｂ／ファージを除いた。得られたＲＢＣペレットをヒツジ抗−Ｍ１３抗体（５−Ｐｒｉｍｅ ３−Ｐｒｉｍｅ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）の１０μｇ／ｍｌ溶液１００μｌ中に再懸濁し、９６ウェルマイクロタイタープレートの丸底のウェルに移した。プレートを静置したままにし（〜２時間）、次に読み取った。陰性反応を有するウェルは鮮明な〜２ｍｍの直径のＲＢＣスポットを示し、一方、陽性反応、すなわち、凝集を有するウェル中では、凝集したウェル中のＲＢＣがウェルの全床面を覆う薄い広がりを形成する。
ミニカラムゲルカード（ＩＤ−ミクロタイピングシステム（Ｍｉｃｒｏ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）を利用する赤血球凝集反応アッセイ（Ｌａｐｉｅｒｒｅ等、１９９０、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３０：１０９−１１３）では、２５μｌのＦａｂ／ファージクローンをＲＢＣ（ミクロタイピングシステムバッファー、Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ中０．８％の懸濁液）の５０μｌアリコートと混合した。１００μｌ／ｍｌの抗−Ｍ１３抗体中に先に懸濁したデキストラン−アクリルアミドビーズを含有するミニカラムの上の容器に混合物を入れた。３７℃でインキュベーション後、ゲルカードを７０ ｘ ｇで１０分間遠心分離し、読み取った。
様々な方法
フローサイトメトリーのための蛍光標識されたＲＢＣの調製を本明細書に記述したように実施し、Ｌｙｓｉｓ II（バージョン１．１）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を備えたＦＡＣＳｃａｎミクロ蛍光計（ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を用いてサンプルを分析した。バクテリアクローンからプラスミドＤＮＡを調製した（Ｑｉａｗｅｌｌ Ｐｌｕｓ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）。軽鎖もしくは重鎖Ｉｇ定常領域リバースプライマーまたはそれぞれのＩｇ鎖の５’にアニールする独特なｐＣｏｍｂ３ベクタープライマー（Ｂａｒｂａｓ等、１９９１、上記；Ｒｏｂｅｎ等、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４３７−６４４５）及び自動化蛍光シークエンシング（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて二本鎖ＤＮＡをシークエンスした。Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒバージョン５．０シークエンシングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）及びＩｇ生殖細胞系遺伝子のＴｏｍｌｉｎｓｏｎデータベース（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ等、１９９６、Ｖ Ｂａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて配列を分析した。
細胞インキュベーション及び分離プロトコルの実験設計
細胞分離工程及び抗原特異的Ｆａｂ／ファージの最終収率を最適化するための一連の初期研究を実施した後、抗−ＲＢＣ−反応性ファージに関してＦａｂ／ファージライブラリーをパンニングするための上記の実験条件を決定した。調べた主要なパラメーターは以下のものを含んだ。
ビオチン化 ストレプトアビジンで覆われた磁気ビーズの十分な数が細胞に結合してそれらのＲＢＣを磁気カラムで保持させるようにＲＢＣ表面をビオチン化する条件を探した。この場合、Ｒｈ（Ｄ）抗原の抗原性を破壊する可能性があるかまたは細胞が抗体を非特異的に吸着するようになる可能性がある過剰のビオチン化を避けなければならない。この問題を検討するために、Ｒｈ（Ｄ）−陽性／ケル−陰性ＲＢＣ（ケルはＲＢＣ抗原である；（Ｗａｌｋｅｒ、編集、１９９３、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ、第１１版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓ））を一連のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン濃度と共にインキュベートし、フルオレセインを結合したストレプトアビジンを利用してフローサイトメトリーによりビオチン化の程度を評価した。
細胞表面のビオチン化の程度を評価するために、異なるビオチン試薬濃度でビオチン化されたＲｈ（Ｄ）−陽性／ケル−陰性ＲＢＣの３％懸濁液の５μｌアリコートを１／１００希釈のＦＩＴＣ−ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）２００μｌと４℃で３０分間インキュベートした（図２）。混合物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、フローミクロ蛍光定量法により分析した（−□−）。また、１００μｌの抗−Ｒｈ（Ｄ）または抗−ケルタイピング血清のいずれかそれぞれと細胞をインキュベートし、細胞を洗浄し、次にそれらを１／１００希釈のＦＩＴＣ−ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で染色することにより、Ｒｈ（Ｄ）−抗原性の保持（−△−）（すなわち、特異的染色）または非特異的染色の欠如（−○−）に関しても細胞のアリコートを分析した。
直線状の飽和しない反応が見られた（図２）。抗−Ｒｈ（Ｄ）タイピング血清を用いてＲｈ（Ｄ）抗原性の保持を評価し、試験した全てのビオチン濃度でビオチンでの細胞表面タンパク質の誘導化により影響を受けないことが見いだされた（図２）。さらに、それらのケル−陰性ＲＢＣは抗−ケル抗体を非特異的に吸着しなかった。
次に、各ビオチン化ＲＢＣサンプルを過剰のストレプトアビジン被覆磁気ミクロビーズとインキュベートし、磁気分離カラムに添加した。５００μｇ／ｍｌより多いかまたはそれに等しいビオチン試薬でビオチン化されたＲＢＣサンプルでは、１０⁸ものＲＢＣをカラムにより保持することができると測定された。実際のＲＢＣ／ファージパンニング実験は〜１０⁷のみのＲｈ（Ｄ）−陽性細胞を用いるように設計されたので（以下参照）、５００μｇ／ｍｌでのＲＢＣビオチン化が十分であると決定された。
インキュベーション混合物中のＲｈ（Ｄ）−陽性及びＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣの濃度
Ｆａｂ／ファージパンニング実験を実施する前に、Ｒｈ（Ｄ）−陽性及びＲｈ（Ｄ）−陰性細胞を分離する磁気活性化細胞分離技術の能力を抗−Ｒｈ（Ｄ）タイピング血清及びフローサイトメトリーを用いて評価した（図３）。２％の脱脂粉乳を含有する４０μｌ容量のＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中で、ストレプトアビジン−ミクロビーズで被覆されたビオチン化Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ（８ ｘ １０⁶細胞）を１０倍過剰のＲｈ（Ｄ）−陰性の被覆されていないＲＢＣ（８ ｘ １０⁷細胞）と混合し、混合物をＭｉｎｉＭＡＣＳカラムに添加した。カラムを洗浄し、結合した細胞を本明細書に記述するように溶出させた。元の混合物中（パネルａ）、カラム洗浄液（パネルｂ）及びカラム溶出液（パネルｃ）中に含まれるＲＢＣのアリコートを図２で記述したように抗−Ｒｈ（Ｄ）タイピング血清及びＦＩＴＣ−ヤギ抗−ヒトＩｇＧで染色した。フローサイトグラムから、カラム添加物中の〜９０％の細胞はＲｈ（Ｄ）−陰性であるが（パネルａ）、それらのほとんど全てはカラムから流れ出て（パネルｂ）、ほとんど完全にＲｈ（Ｄ）−陽性細胞であるカラム溶出液をもたらす（パネルｃ）ことが示される。最終溶出液の〜６％のみがＲｈ（Ｄ）−陰性細胞を含んでなり（パネルｃ）、そしてＲｈ（Ｄ）−陰性細胞は最初Ｒｈ（Ｄ）−陽性細胞に対して１０倍過剰で存在したので、最初の抗原−陰性の免疫吸着剤（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ）細胞の〜０．６％だけが最終の抗原−陽性調製物に混入した。細胞分離のこの効率は次のＦａｂ／ファージでのパンニング実験のために適切と考えられた。
上記の実験において、磁気分離カラムを詰まらせることを避けるために、磁場なしにカラムに添加することが必要であった。これは材料がカラムから流れ出ないように４０μｌ未満またはそれに等しい反応容量を必要とした。理論に基づいて（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ等、１９９５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：４１３−４１９）、与えられた細胞表面抗原に特異的なＦａｂ／ファージの５０％より多くを捕捉するために４０μｌの容量中に必要な細胞の適切な濃度を計算することができる。そのような計算は細胞当たりの抗原部位の数及び結合したＦａｂ／ファージの解離定数（Ｋ_D）の関数である。ＲＢＣ（表現型「−Ｄ−／−Ｄ−」）当たり〜１００，０００Ｒｈ（Ｄ）抗原部位の値（Ｍｏｌｌｉｓｏｎ等、１９９３、Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｃｌｉｃａｔｉｏｎｓ）及びＫ_D＝１０^-8ないし１０^-9Ｍの範囲の所望するＦａｂ／ファージ親和性を用いると、４０μｌの反応容量中８ ｘ １０⁶のＲｈ（Ｄ）−陽性細胞を必要とする。この数のＲｈ（Ｄ）−陽性細胞を仮定すると、１０倍過剰のＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣが磁気カラムで抗原−陽性ＲＢＣから効率よく分離することができる抗原−陰性細胞の最大量であることが見いだされた（図３）。
Ｆａｂ／ファージライブラリーの構築及びパンニング
_γ1κ及び_γ1λファージライブラリーを本明細書に記述したように調製し、それらはそれぞれ７ ｘ １０⁷及び３ ｘ １０⁸の独立した形質転換体を含有することが見いだされた。表１にこれらのライブラリーのパンニング結果を要約する。
パンニングしたポリクローナルライブラリー及び個々の無作為に選択したＦａｂ／ファージクローン中の抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージ活性を検出するために架橋抗体として抗−Ｍ１３二次抗体を利用するＲＢＣ凝集アッセイを用いた（図４）。示される結果はＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣに対する陰性反応性及び１／２０４８の希釈までの_γ1κライブラリー（パンニング＃２）のＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣに対する強い陽性反応性を示すアッセイの代表的な例である。
_γ1κライブラリーの場合、結合ファージの著しい濃縮は１回のみのパンニング後に起こるようであり、一方、_γ1λライブラリーの著しい濃縮は２回目中に起こる。これはそれぞれ１及び２回のパンニング後に、示した回のパンニング中に結合したファージのパーセント及びＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣを凝集するポリクローナル_γ1κ及び_γ1λＦａｂ／ファージライブラリーの能力の両方の急激な増加により示される（表１、図４）。
各回のパンニング中に得られた無作為に選択した個々のバクテリアコロニーからモノクローナルＦａｂ／ファージを調製した。３回目のパンニングまでに全てのクローンが抗−Ｒｈ（Ｄ）特異性を有することは明らかであった（表１）。これらのＦａｂ／ファージが抗−Ｒｈ（Ｄ）特異性を有し、そして凝集アッセイにおいて用いた特定のＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ上に偶然存在し且つ特定のＲｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣ上にない可能性がある他の関係のない抗原に結合していないことを確かめるために、異なる血液型特異性の１１のＲｈ（Ｄ）−陰性及び−陽性ＲＢＣのパネルに対してクローンをスクリーニングしてそれらの抗−Ｒｈ（Ｄ）特異性を確かめた（Ｗａｌｋｅｒ、１９９３、上記）。
遺伝子レベルでのクローンの分析
無作為に選択した抗−Ｒｈ（Ｄ）クローン間の遺伝的多様性を調べるために、プラスミドＤＮＡをクローンの各々から調製し、対応する重及び軽鎖Ｉｇヌクレオチド配列を同定した。表２に、最も近縁の生殖細胞系重または軽鎖Ｉｇ遺伝子の名称を初めとする各クローンの多数の特性を挙げる。ヌクレオチドレベルでのより詳細な分析から、全ての抗−Ｒｈ（Ｄ）結合クローンの中に多数の独特な重及び軽鎖ＤＮＡ配列があることが示された（表３）。Ｆａｂ／ファージ展示ライブラリーの作製中に起こる重及び軽鎖遺伝子セグメントのランダムシャッフリングのために、これらの重鎖及び軽鎖が組合わさってほぼ５０の異なる抗−Ｒｈ（Ｄ）抗体を形成することは明らかである。
予測されるアミノ酸配列の詳細な複数整列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）分析から、全部で２５の独特な重鎖、１８の独特なκ軽鎖及び２３の独特なλ軽鎖タンパク質が示された。ライブラリー構築中の組み合わせ作用のために、これらの重及び軽鎖遺伝子セグメントは対になって５０の独特なＦａｂ抗体（２０_γ1κ及び３０_γ1λ）を生じた。興味深いことに、全ての２５の独特な重鎖及びほとんど全ての１８の独特なκ軽鎖はそれぞれ５つのＶ_HIIIまたは４つのＶκＩ生殖細胞系遺伝子のみに由来し、一方、λ軽鎖はより多様な組の生殖細胞系遺伝子に由来した。選択前の可変領域ファミリー表示の不均質性を確かめるために、パンニングしていないライブラリーからの６０を越える陰性クローンからの重及び軽鎖ヌクレオチド配列の分析を実施した。Ｖ_HファミリーＩ（１３％）、III（３６％）、IV（３１％）、Ｖ（１５％）及びVI（５％）；ＶκファミリーＩ（４３％）、II（１４％）、III（２９％）及びIV（１４％）；並びにＶγファミリーＩ（４８％）、II（４％）、III（９％）、IV（４％）、Ｖ（９％）、VI（１７％）及びVII（９％）を示すクローンが存在した。
タンパク質レベルでのクローンの分析
抗−Ｒｈ（Ｄ）クローン中の細かい特異性（Ｒｈ（Ｄ）抗原エピトープ特異性）の多様性を調べるために、選択したクローン及びＲＢＣがある種のエピトープを欠いているＲｈ（Ｄ）抗原を産生する個体から得られた稀なＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣの組を用いて凝集実験を実施した。そのような突然変異体ＲＢＣの組での特定の抗−Ｒｈ（Ｄ）抗体の凝集のパターンを調べることにより、抗体が向けられるＲｈ（Ｄ）上の特定のエピトープを同定することができる（Ｍｏｌｌｉｓｏｎ等、１９９３、上記）。そのような実験の代表的な例を図５に示し、そして選択した抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージクローンのＲｈ（Ｄ）エピトープを表２に要約する。
抗−Ｒｈ（Ｄ）−陰性ＲＢＣ（ｒｒ）、Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ（Ｒ₂Ｒ₂）及び「部位的」Ｒｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣ（モザイクIIIａ、IVａ、Ｖａ、VI、VII）で凝集実験を実施した。示される結果は５個の無作為に選択した抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージクローンのアッセイの代表的な例である（図５）。

血液銀行タイピング試薬としてのＦａｂ／ファージ抗体の使用
マイクロプレート赤血球凝集反応アッセイにおいてＲｈ（Ｄ）−陰性とＲｈ（Ｄ）−陽性ＲＢＣとを正確に識別する抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージ調製物の能力（図４及び５）は、通常の抗血清を用いてＲＢＣの表現型を決めるために血液銀行により用いられるゲル試験（Ｌａｐｉｅｒｒｅ等、１９９０、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３０：１０９−１１３０）をＦａｂ／ファージでの使用のために適応させることができる証拠を与えた。
ゲル試験は抗−ヒトグロブリン（クームス試薬）中に懸濁した約２０μｌのデキストラン−アクリルアミドビーズを各々入れた６本のミニカラムを含有する約５ ｘ ７ｃｍのプラスチックカードを含んでなる。型を決める赤血球を適切なヒト抗血清とインキュベートし、ゲルを通して遠心分離する。抗血清が向けられる抗原に関して陽性であるＲＢＣは抗−ヒトグロブリンに遭遇すると凝集し、ゲルマトリックス中または上に捕捉されるようになる。反応性でないＲＢＣはゲル粒子を通って沈殿し、マイクロチューブの底にペレットを形成する。ゲル試験はＲＢＣ表現型タイピングの伝統的な血液銀行法より減少した試薬容量、細胞洗浄工程の削除及び結果のより客観的な解釈を初めとする多数の利点を与えるので、多数の血液銀行機関はこの新規な技術を適応している。図６に示されるように、抗−Ｍ１３抗体を含むように改変されたゲルカードで抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージを用いることができる。
アッセイを実施するために、Ｒｈ（Ｄ）−陰性または−陽性の赤血球を抗−Ｒｈ（Ｄ）Ｆａｂ／ファージ（_γ1κライブラリー、パンニング＃２）の希釈物とインキュベートし、抗−Ｍ１３抗体中に懸濁したビーズを含有するミクロカラム中に遠心分離した。未希釈のＦａｂ／ファージストックはマイクロプレート沈降アッセイのものと同様の５ ｘ １０¹²ｃｆｕ／ｍｌの力価を有した（図４）。このアッセイに用いたＦａｂ／ファージの量はマイクロプレートアッセイのものの１／４であるので、１／６２５希釈物中に存在するＦａｂ／ファージの量は図４の１／２０４８希釈物中に存在するものにほぼ等しい。従って、陽性結果を生じるために必要なＦａｂ／ファージの数は両方のアッセイで本質的に等しい。
ちょうど記述したように実施した他のアッセイにおいて、抗−Ｍ１３抗体をアッセイから除くと、赤血球の凝集は見られなかった。さらに、抗−ＩｇＧ抗体はバクテリオファージの表面上に発現された組み換えＦａｂと反応しない。抗−Ｍ１３抗体がアッセイに存在する場合、抗−Ｒｈファージと反応したＲｈ−陽性細胞のみが凝集した。高濃度の抗−Ｍ１３抗体を用いた場合に、Ｒｈ−陰性細胞さえ凝集されるように見えることに注意すべきである。これは結合しない（すなわち、反応しない）ファージの架橋の結果生じるアーチファクトであり、それらのファージは多量の抗−Ｍ１３抗体の存在下で架橋されるようになり、全てのＲｈ−陰性細胞が横切ることができるとは限らない半不可入性のマットを形成する。本明細書に記述した実験では、約１００μｇ／ｍｌの抗−Ｍ１３濃度が凝集のため及び偽陽性結果の防止のための最適であると考えられた。アッセイに用いる試薬及び細胞の正確な濃度により、抗−Ｍ１３の濃度はこの数から外れてもよい。
抗−Ｍ１３改変されたミクロタイピング系の相対的感度を評価するために、ミクロタイピング系カードのカラムに１００μｇ／ｍｌの抗−Ｍ１３抗体を添加した。Ｒｈ−陰性またはＲｈ−陽性赤血球を未希釈または５倍連続希釈（１／５、１／２５、１／１２５、１／６２５及び１／３１２５）の抗−Ｒｈファージ抗体とインキュベートした。カードを遠心分離し、サンプルを凝集に関して評価した。改変されたミクロタイピング系カードアッセイは１／６２５ないし１／３１２５の間の希釈で抗−Ｒｈ凝集を検出することができた。
腫瘍特異的抗体の単離のための方法
腫瘍細胞に特異的なＦａｂ／ファージはインビトロでの診断（生検、体液または血液サンプルのラボアッセイ）、腫瘍／転移のインビボ標識化（イメージングプローブへの抗体の結合）または悪性腫瘍の処置（化学的もしくは放射性毒素への抗体の結合）のために有用である。また、腫瘍特異的抗体は腫瘍細胞上の新規な抗原またはマーカーの同定のためにも有用であり、それらは抗−腫瘍ワクチンの基礎を成すことができるる。さらに、抗−イディオタイプ抗体の作製のために有用な腫瘍特異的抗体も抗−腫瘍ワクチンの基礎を成すことができる。
抗−腫瘍抗体は本質的に抗−Ｒｈ抗体の作製のために本明細書に記述したように作製される。腫瘍細胞、限定されないが例えば悪性黒色腫細胞を細胞表面でビオチン化し、ストレプトアビジン−磁気ミクロビーズで標識し、次に過剰の正常メラニン細胞と混合する。治療的に有用な抗−腫瘍抗体を保有する黒色腫患者の末梢血リンパ球からＦａｂ／ファージライブラリーを作製する。外見上自分自身を治療した多数の黒色腫患者は体液性（すなわち、抗体）免疫反応を高めることによりそのようにした。これらのＦａｂ／ファージライブラリーを細胞の混合物とインキュベートする。悪性腫瘍細胞に特異的なエピトープに向けられるＦａｂ／ファージは悪性腫瘍細胞に結合し、次に、磁気カラムパンニング方法を利用してそれらを単離することができる。
バクテリアのビルレント因子を同定するＦａｂ／ファージの単離
ビルレントバクテリア及びそれらの非病原性同等物の間の違いを検出することができるＦａｂ／ファージを単離するために本明細書に記述した方法を用いることができる。この場合、バクテリアのビルレント株を磁気標識し、非病原性同等物で希釈し、ビルレント株に感染した個体から得られたリンパ球から作製されるＦａｂ／ファージライブラリーを添加する。このようにして単離されるＦａｂ／ファージは新規なバクテリアの抗原の同定のために有用である可能性があり、それらに対して抗菌性化合物及び／またはワクチンを開発することができる／
本明細書に引用される各々及び全ての特許、特許出願及び公開物の開示は本明細書で全部引用することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は特定の態様に関して開示されているが、当業者が本発明の真の趣旨及び範囲から逸れずに本発明の他の態様及び変形を考案できることは明らかである。付加した請求の範囲は全てのそのような態様及び同等な変形を含むと解釈されると考えられる。

Claims (21)

1. 抗原保有部分に結合するタンパク質をコードするＤＮＡを単離する方法であって、
   少なくとも１つのウイルスベクターが表面に該タンパク質を発現し、そして該ウイルスベクターに関して異種起源の該ＤＮＡを含むものである複数のウイルスベクターを含んでなるファージディスプレイライブラリーを作製する工程；
   該抗原保有部分を表面に担持する細胞に磁気標識を付加する工程；
   該抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下で該磁気標識細胞とファージディスプレイライブラリーをインキュベートして混合物を形成し、それにより該少なくとも１つのウイルスベクターを該磁気標識細胞に結合する工程；
   磁気標識細胞を該混合物から単離し、それにより該少なくとも１つのウイルスベクターを該混合物から単離する工程；及び
   単離されたウイルスベクターから該タンパク質をコードするＤＮＡを得る工程
   を含んでなる上記の方法。
2. 抗原保有部分に結合するタンパク質を単離する方法であって、
   少なくとも１つのウイルスベクターが表面に該タンパク質を発現し、そして該タンパク質をコードする異種起源のＤＮＡを含むものである複数のウイルスベクターを含んでなるファージディスプレイライブラリーを作製する工程；
   該抗原保有部分を表面に担持する細胞に磁気標識を付加する工程；
   該抗原保有部分を発現しない過剰の非標識細胞の存在下で該磁気標識細胞と該ファージディスプレイライブラリーをインキュベートして混合物を形成し、それにより該少なくとも１つのウイルスベクターを該磁気標識細胞に結合する工程；
   磁気標識細胞を該混合物から単離し、それにより該少なくとも１つのウイルスベクターを該混合物から単離する工程；及び
   該単離されたウイルスベクターから該タンパク質を単離する工程を含んでなる上記の方法。
3. ウイルスベクターがバクテリオファージＭ１３ベクター、バクテリオファージラムダベクター及び真核生物レトロウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１または２記載の方法。
4. ウイルスベクターがバクテリオファージＭ１３ベクターである、請求項３記載の方法。
5. タンパク質が抗体、リガンド及びホルモンよりなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。
6. タンパク質が抗体である、請求項５記載の方法。
7. 抗体が抗−赤血球細胞表面抗原抗体である、請求項６記載の方法。
8. 抗体が抗−Ｒｈ赤血球抗体である、請求項７記載の方法。
9. 抗体が抗−Ｒｈ（Ｄ）赤血球抗体である、請求項７記載の方法。
10. 抗原保有部分がタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、並びにタンパク質、脂質、炭水化物及び核酸の少なくとも１つの複合体よりなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。
11. 抗原保有部分が膜結合タンパク質である、請求項１０記載の方法。
12. 膜結合タンパク質が抗原及び受容体タンパク質よりなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
13. 膜結合タンパク質が抗原である、請求項１２記載の方法。
14. 抗原が赤血球抗原である、請求項１３記載の方法。
15. 抗原がＲｈ抗原である、請求項１４記載の方法。
16. ファージディスプレイライブラリーが合成ファージディスプライライブラリーである請求項１記載の方法。
17. ファージディスプレイライブラリーが合成ファージディスプライライブラリーである請求項２記載の方法。
18. 請求項１記載の方法であって、磁気標識細胞が磁気分離カラムに該混合物を供給してカラムから非標識細胞を溶出することにより該混合物から単離される、上記の方法。
19. 混合物が磁界の存在しない磁気分離カラムに供給される請求項１８記載の方法。
20. 請求項２記載の方法であって、磁気標識細胞が磁気分離カラムに該混合物を供給してカラムから非標識細胞を溶出することにより該混合物から単離される、上記の方法。
21. 混合物が磁界の存在しない磁気分離カラムに供給される請求項２０記載の方法。

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