JP4564062B2 - 抗体ライブラリーをスクリーニングする方法 - Google Patents
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Description
(a) 発現ライブラリーと、一つまたは一つ以上の目標物とを接触させ、
(b) 少なくとも一つの洗浄工程に当該目標物を供し、および
(c) 有機相を介した分離によって、当該発現ライブラリーでの未結合メンバーと、当該発現ライブラリーの一つまたは一つ以上のメンバーに結合した標的物とを分離し、それにより、その他のライブラリーのメンバーから当該標的物に関する結合パートナー候補を分離する、工程を含む、一つまたは一つ以上の目標物に関する結合パートナー候補である一つまたは一つ以上のメンバーを同定または選択するために、分子ライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
AffiSelect法は、ライブラリーメンバー(結合パートナー候補)の検出とは対照的に、そのリガンドを検出することによって(または、少なくともリガンドが会合する物質を検出することによって)、ライブラリーメンバー(結合パートナー候補)を間接的に同定するための新規な方法を提供する。 これは、生体細胞などの複雑なリガンドに対して小さなライブラリーをスクリーニングする際に特に有用であるが、この方法の適用可能性は、これら用途に限定されない。
(a) 溶液中の結合パートナー候補の発現ライブラリーと、一つまたは一つ以上のリガンドとを接触させ、
(b) 固相上の発現ライブラリーの一つまたは一つ以上のメンバーに結合した状態のリガンドを捕捉し、および
(c) リガンドの存在を検出し、それにより、リガンドの結合パートナー候補である発現ライブラリーの一つまたは一つ以上のメンバーの存在を検出する、工程を含む方法を提供する。
(i) 溶液中の一つまたは一つ以上の前記結合パートナー候補を、一つまたは一つ以上の目標物と接触させる工程;
(ii) 固相上の一つまたは一つ以上の結合パートナー候補に結合した状態の目標物を捕捉する工程;および
(iii) 目標物の存在を検出し、それにより、目標物に関する一つまたは一つ以上の結合パートナー候補の存在を検出する工程を含む。
細 胞
二種類のヒト乳癌細胞株(PM-1およびMT-1、Department of Tumorbiology, Norwegian Radium Hospital(DNR)、オスロ、ノルウェー)から提供された腎臓)、肺癌細胞株(A-549、ATCC CCL-185、Viventia Biotech社から提供された腎臓;SW900、ATCC HTB-59、Department of Tumorbiology, DNRから提供された腎臓)、および、内皮細胞株(HUVEC、ATCC CRL-1730、Viventia Biotech社から提供された腎臓)を、パンニング実験に用いた。 双方の乳癌細胞株は、10%のFCS(Gibco BRL)、2mMのL-グルタミン(Cambrex)および10mMのHEPES(Cambrex)を加えたRPMI-1640培地(Cambrex)中で培養した。 A-549は、10%のFCSおよび2mMのグルタミンを加えたHamのF12(BioWhittaker)中で培養した。 内皮細胞株は、10%のFCS、15mg/Lの内皮成長補助剤(Sigma)および50mg/Lのヘパリン(Sigma)を加えたRPMI-1640培地中で培養した。 細胞を、37℃で、5%の二酸化炭素および加湿雰囲気で培養した。各実験では、細胞をPBSで洗浄し、1mMのEDTA含有PBSによって回収し、PBSで一回洗浄し、そして、計測した。 パンニング実験では、細胞を、PBS/3%BSA(Sigma)またはPBS/4%スキムミルク(Merck)のいずれかに再懸濁した。
M-450エポキシビーズ(Dynal)を、レクチン(WGA:小麦胚芽、Triticum vulgaris:Calbiochem)と、製造業者のプロトコルに従ってとカップリングさせた。 要約すれば、エポキシビーズを洗浄し、続いて、0.1Mのホウ酸塩バッファー(pH 8.5)中で10μgのレクチン/107個のビーズと共に、一晩室温で回転させながらインキュベーションした。 ビーズをPBS/0.1%BSAで洗浄を三回行い、4℃で、PBS/0.1%BSA/0.02%アジ化ナトリウム中で、4×108個のビーズ/mlで保存した。
六名の健常者のPBLから構築し、そして、パンニング実験では、リンカーのHindIII部位をN-末端移動して21個のアミノ酸リンカー配列を生成させた後に、pSEX 81系(Welschof et al., 1997, PNAS, 94:1902-1907, Loeset et al., 2005, J. Immunol. Methods 299:47-62)のファージミドディスプレイシステムにクローニングしたIgM scFvライブラリーを使用した。
一般的な細胞タンパク質に対するファージ結合を除去するため、3.75×1012個のファージ(約2.5×1013cfu/mlのライブラリー150μl)を、2×105〜2×106/ml細胞の非腫瘍起源物と共に、ブロックしたチューブ内で、1時間、4℃で、回転させながらインキュベーションした(=ネガティブな予備的パンニング処理)。 ブロッキング試薬として、PBS/3%BSAまたはPBS/4%ミルクのいずれかを用いた。 あるプロジェクトにおいて、PBLを、ネガティブな予備的パンニング処理工程に使用した。 ネガティブな予備的パンニング処理の後に、PBLをブロック溶液で二回洗浄し、その後、減縮されたファージライブラリー+二回の洗浄液上清を、乳腫瘍細胞と共に、上記したようにして、インキュベーション(パンニング処理)した。
細胞結合ファージから遊離ファージを分離するための四つの方法を試験した。
パンニング処理した後、2×l50μlの腫瘍細胞懸濁液を、2×300μlの有機相溶液(フタル酸ジブチル:シクロヘキサン 9:1[v:v];d=1.03g ml-1)の上面に直接重層した。 10.000gで、10分間、室温(RT)で、遠心分離した後、チューブを、液体窒素中でスナップ凍結し、チューブの底部を薄く切り取り、細胞ペレットを別の(ブロックした)チューブに移した。
パンニング処理した後、腫瘍細胞を遠沈させ(500g、5分間、4℃)、ペレットを、1mlのPBS/0.4%BSAで五回洗浄した。
パンニング処理した後、腫瘍細胞を遠沈させ(500g、5分間、4℃)、PBS/0.1%BSAに、5×106細胞/mlで再懸濁し、レクチンで被覆したビーズ(1:4 細胞:ビーズ比)と共に、回転させながら、20分間、4℃でインキュベーションした。 ビーズを、磁石を用いて、1mlのPBS/0.1%BSAで10回洗浄し、200μlのPBS/0.1%BSAに再懸濁した。
細胞ペレットまたはビーズを、10mlの対数増殖期の大腸菌XL1ブルーに添加し、37℃にて、15分間、60rpmで、次いで、45分間、200rpmで、インキュベーションした。 評価を行うために、異なる濃度の細菌を、LBTAGプレート(LBに30μg/mlのテトラサイクリン(T)、100μg/mlのアンピシリン(A)および100mMグルコース(G)添加)に、そして、以後のパッケージングのために二つの大きな長方形のプレート(243×243×18mm;Nunc社)に接種した。 すべてのプレートは、一晩、37℃で、インキュベーションした。
二つの大きなプレートの細菌を、掻き取って回収した。 細菌を、液体培地中で増殖させ、その菌体中のファージミドを、M13ヘルパーファージ(Stratagene)と共にファージ粒子内に、一晩、30℃で、パッケージングさせた。 翌日、ファージを、PEG/NaClで沈殿させ、1mlのPBS中に再懸濁し、その内の100μlのファージ(約1013cfu)を、次回のパンニング処理に用いた。
30分間、4℃で、PBS/3%BSAによるブロッキングを行った後、腫瘍細胞およびPBLを、1時間、4℃で、各回のパンニング処理で得た100μlのファージ(1:10〜1:106希釈物)と共にインキュベーションした。 PBSで三回の洗浄を行った後、菌体を、1時間、4℃で、100μlのウサギ抗Fd(Sigma;1:4000)抗体と共にインキュベーションした。 PBSでの三回の洗浄を行った後に、モノクローナルセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ-抗ウサギIg抗体(Dako;1:4000)と基質ABTS(Calbiochem)を利用するELISAを構築した。 吸光度を、405nmで測定した(ポリクローナルファージとは対照的に、単一のファージを用いるELISAアッセイが好適な事例での方法論と同様の方法論を用いた)。
腫瘍特異的結合の増加を示した(ポリクローナルファージELISA)のパンニング処理によって得られたScFv DNAを、分泌ベクターpHOG21(Kipriyanov et al., 1997, J. Immunol. Methods, 200: 67-77)内にクローニングし、個々のscFvクローンを、前出の大腸菌XL-1-ブルー(Dorsam et al., 1997, FEBS Letters, 414: 7-13)または96ディープウェル(100〜200マイクロリットル体積)で発現させた。 ディープウェル発現は、一晩、30℃で、1mMのIPTG(Sigma)を用いて行った。 翌日、プレートを、10分間、4000rpmで、4℃で、遠心分離し、(発現されたscFvを含有する)上清を、さらに別の実験に用いた。 発現試料を、AffiSelectに用いる場合には、クローニングしたscFv DNAのポリクローナル回収物でコンピテントXL-1ブルー大腸菌を形質転換し、LB-TAG 22×22cmバイオアッセイトレイ(Corning)上に接種した。 個々のクローンを、QPix2ロボット(Genetix社、英国)を用いて、約4%のグリセロールを添加したLB-TAG成長培地[30μg/mlのテトラサイクリン(T)、100μg/mlのアンピシリン(A)、1%(w/v)グルコース(G)]を入れた384ウェルプレート内に採取し、一晩、37℃で、成長させた。 単一のscFvクローンを、LB-TAG培地を入れた384ウェルプレート内に再接種し、100μMのIPTGで発現させた。 翌日、プレートを遠心分離させる以前に、50μlのPBS/3%BSAを、(100μl発現物を含有する)各ウェルに添加した。
30分間、4℃で、PBS/3%BSAによるブロッキングを行った後、腫瘍細胞およびPBLを、1時間、4℃で、scFv(100μlのディープウェル発現物または10μg/mlの精製scFv)と共にインキュベーションした。 PBSで三回の洗浄を行った後、菌体を、1時間、4℃で、100μlのマウスモノクローナルHRPコンジュゲート抗c-myc(Invitrogen社;1:4000)抗体と共にインキュベーションした。 PBSで三回の洗浄を行った後、基質ABTSを用いるELISAを調製して、405nmでの光吸度を測定した。
5μlの96ディープウェルscFv発現物を、5×l0e4腫瘍細胞(PM-1)またはPBLおよび抗c-myc-FMAT Blue(AppliedBiosystems社)またはマウス抗c-myc抗体(Invitrogen社;1.25μg/ml)+ヤギ抗マウスIgG-Alexa Fluor R647(Molecular Probes社;2.5μg/ml)の組合せを入れた384ウェルプレート内で試験した。 2〜4時間かけてインキュベーションを行った後に、細胞に対するscFvの結合を、8200 Cellular Detection Systemを用いて測定し、二次抗体だけに関するシグナル強度および無関連のscFv結合をネガティブコントロールとした。
5μlの96ディープウェルscFv発現物を、腫瘍細胞(A-549)、PBLおよびHUVECにおいて、AffiSelect法を用いて試験した。 この試験を行うために、2.2×104細胞を、ペレット化し(1600rpm、4℃、5分間)、1時間、4℃で、震盪しながら、5μlの発現試料および45μlのPBS/3%BSAと共にインキュベーションした。 細胞を、150μlのPBS/3%BSAで洗浄し、遠心分離した(1600rpm、4℃、5分間)。 50μlの抗c-myc抗体(Invitrogen社;1:500)をペレットに添加した後、プレートを、1時間、4℃で、震盪しながらインキュベーションした。
1〜5×105細胞を、1時間、4℃で、50μlのscFvディープウェル発現物により染色した。 150μlのPBSを用いた三回の洗浄と遠心分離(1600rpm、5分間、4℃)を行った後に、細胞を、50μlのFITC-コンジュゲート抗c-myc抗体(Invitrogen社;1:30)と共に、1時間、4℃で、インキュベーションした。 細胞を上記したようにして三回洗浄し、200μlのPBS/1〜2%ホルマリン(Sigma)で固定し、FACS装置(Coulter)で測定を行うまで、4℃で保存した。
1×105細胞を、50μlのscFvディープウェル発現物によって、FACSに関して記載した手順に従って染色を行った。 取り込みを回避するため、場合によっては、scFv発現物と細胞とのインキュベーションを行う前に、細胞を、50μlのPBS/1〜2%ホルマリン(30分間、4℃)で固定し、PBS(1600rpm、5分間、4℃)で、三回、洗浄を行った。 結合したscFvの可視化を、FITC-コンジュゲート抗c-myc抗体を用いて、FACSに関して記載した手順に従って行うか、あるいは、抗c-myc抗体(1時間、4℃; 5μg/ml;Sigma)、その後に、FACSに関して記載した手順に従ってPBSで三回洗浄し、そして、FITC-コンジュゲート抗マウスIgG抗体(1時間、4℃;1:200;Dako)とのインキュベーションをして行った。 FACSに関して記載した手順に従ってPBSで三回洗浄し、そして、固定をした後に、試料を、Guava EasyCyte(Guava Technologies社)で測定を行うまで、4℃で保存した。
試 験 片
ニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell)に固定する細胞の至適濃度を調べるために、試験片(約6×4cm)を、2時間、室温で、PBS中の異なる量の細胞(5×l04〜5×l06細胞/ml)により被覆した。 PBSで二回洗浄した後、膜を、マウスモノクローナル抗MHCクラスI抗体(Dako;1:600)と共に、1時間、室温で、インキュベーションした。 被覆細胞を、HRP-コンジュゲートウサギ-抗マウスIg抗体(Dako;1:10000)とのインキュベーションおよびECL検出(Amersham)によって可視化した。
細胞ELISAで早期に陽性であることが判明したScFvクローンを、フィルタースクリーニングアッセイ(Stacy et al., 2003, J. Immunol. Methods, 283 :247-259)に供して試験した。 すなわち、まず、scFvクローンを、ニトロセルロースフィルター上にアレイ状に整列させた。 そして、IPTGを用いて一晩発現させた後に、scFvを、細胞コートフィルターに対する結合性について試験した。 フィルターを、マウスモノクローナル抗MHCクラスI抗体(1:600)と共にインキュベーションし、結合を、HRP-コンジュゲート抗c-myc抗体(1:10000)およびECL検出によって可視化した。 五つの異なるブロック(PBS/2%BSA、PBS/4%スキムミルク、SuperBlock(Pierce)、カゼインブロッキングバッファー(Sigma)、2%ブロットブロック(BDH))を、そのバックグラウンドシグナルの低減に関して試験を行った。
腫瘍cDNAライブラリーの構築およびパンニング処理
cDNAファージディスプレイライブラリーを、すでに報告(Fossa et al., 2004, Cancer Immunol. Immunother., 53 :431-438)されている通りにして、腫瘍細胞株SW900から構築した。 目的のscFvに相当する抗原を見出すため、バイオパンニング処理を、scFvコートマキシソープチューブ(Nunc)において行った。 すなわち、マキシソープチューブを、一晩、4℃で、回転させながら、10μg/mlのscFv(PBS/3%BSAまたはPBS/4%ミルク中)で被覆した。 翌日、scFv被覆チューブ内に添加する以前に、cDNAファージディスプレイライブラリーを、PBS/3%BSAまたはPBS/4%ミルク中で、15分間、ブロックした。 2時間、室温で、回転させながらライブラリーをインキュベーションした後、チューブをPBS/0.05%tweenで、10回洗浄した後に、PBSで10回洗浄した。 チューブを、5分間回転させながら、500μlの100mM TEA(Sigma)と共にインキュベーションして、結合ファージを溶出した。 溶出されたファージを、500μlの1M Tris-HCl pH7.5で中和した後に、500μlを、10mlのXL1-ブルーの感染に(上記したようにして)用いた。 上記したようにしてパッケージング処理した後に、ファージを、scFv被覆チューブでの次回のパンニング処理に供した。 三回のパンニング処理を終えて回収されたファージを、scFv被覆マキシソーププレート(Nunc)で、ポリクローナルファージELISA(上記参照)によって試験した。
scFv特異的結合の増加を示した試料(ポリクローナルファージELISA)をパンニング処理して得られた腫瘍cDNAを、PCRによって増幅し、HAタグを有する改良分泌ベクターpHOG21内にクローニングした。 腫瘍cDNAクローンを、ニトロセルロースフィルター上にアレイ状に整列させ、IPTGを用いて一晩発現させた後に、scFv被覆フィルター(de Wildt, RM, et al., Nat. Biotechnol. 2000, 18(9), 989-994)に対するその結合性を試験した。 フィルターを、マウスモノクローナル抗HA抗体(0.2μg/ml;Roche)と共にインキュベーションし、結合を、HRP-コンジュゲートウサギ抗マウス抗体(1:10000;Dako)およびECL検出によって可視化した。
ファージライブラリーとの1〜2時間のインキュベーションの後に、二種類の乳癌細胞株およびPBLを有機相を介して遠心分離し、有機相遠心分離後の水層(上相)および有機層(ペレット)における回収に関して試験を行った。 ネガティブコントロールとして、1011個のファージを遠心分離し、有機相を通り抜けた遊離ファージの数を評価した。
1) BRASIL法(Giordano et al., 2001)に基づく単一工程の有機相分離:
パンニング処理した後に、2×l50μlの腫瘍細胞懸濁液を、2×300μlの有機相溶液(フタル酸ジブチル:シクロヘキサン 9:1[v:v];d=1.03g ml-1)の上面に直接重層した。 10,000gで、10分間、室温(RT)で、遠心分離した後に、チューブを液体窒素中でスナップ凍結し、チューブの底部を薄く切り取って、細胞ペレットを、別の(ブロックした)チューブに移した。
パンニング処理した後、腫瘍細胞を遠沈させ(500g、5分間、4℃)、ペレットを、1mlのPBS/0.4%BSAで五回洗浄した。
パンニング処理した後に、腫瘍細胞を遠沈させ(500g、5分間、4℃)、PBS/0.1%BSAに再懸濁し、レクチンで被覆したビーズ(1:4 細胞:ビーズ比)と共に、回転させながら、20分間、4℃でインキュベーションした。 ビーズを、磁石を用いて、1mlのPBS/0.1%BSAで10回洗浄し、200μlのPBS/0.1%BSAに再懸濁した。
四回のパンニング処理を行った後に、分離(適宜、方法1、2または3を用いる)、感染およびパッケージングを行った後に、ポリクローナルファージELISAを、四回の各パンニング処理から得られた各々のファージに関して個別に行い、腫瘍細胞に対しては結合するが、PBLには結合しないファージの増加を検出した。 パンニング処理を二回だけ行った後に、方法2では、ファージの増大が認められたが、方法1および3では、それぞれ、四回目および三回目の処理を行った後に増大が示された。 発現ベクターpHOG21へのサブクローニングを行った後に、各方法での第三回目の処理後に得られた95個のクローンを用いて、scFv ELISAを行った。 方法2は、増大(第二回)の時点だけでなく、そのscFv結合体の量(39/95)を、方法1(四回目、11/94)と方法3(三回目、27/95)での結果とも比較したところ、最良の方法であることが判明した。
ポリクローナルファージELISAの結果から、パンニング処理を二回だけ行った後に認められる腫瘍細胞に対するファージ結合の増加が、方法2および4の双方で認められることが明らかになった。 これとは対照的に、方法2では、三回目および四回目のパンニング処理を行った後に、方法4と比べて、(ファージを、10-2に希釈した後に、曲線が上方に向かっているなど)増大が認められた(図3)。
二つのパンニングプロジェクトで、一回または二回の洗浄および有機相分離の組合せが効果的に使用された。
乳癌細胞株(PM-1)を、ファージscFvディスプレイライブラリーを用いるパンニング処理に供した。 予備的なネガティブパンニング処理を、新鮮なヒトPBLに関して、材料および方法の説明において言及したようにして行った。 これらの実験では、有機相遠心分離前の洗浄の効果、および古典的な方法との比較について検証した(上記参照)。
肺癌細胞株(A-549)を、ファージscFvディスプレイライブラリーを用いるパンニング処理に供した。 予備的なネガティブパンニング処理を、新鮮なヒトPBLおよび内皮細胞株(HUVEC)試料に関して、材料および方法の説明において言及したようにして行った。 これらの実験では、有機相遠心分離を行う以前に二回の洗浄を用いる方法(方法2)と、細胞結合ファージからの遊離体の分離のためにレクチンで被覆したした磁気ビーズを用いる方法(方法4)との直接比較を行った。
異なるブランドの0.5ml容の薄壁PCRチューブについて、有機相遠心分離および凍結乾燥を行った後の切断工程での安定性について試験した。
108個および1011個のファージを、100および200μlの有機相と共に、10mlの対数増殖期の大腸菌XL1-ブルー(Stratagene)を感染させるために使用した。 菌体を、37℃で、15分間、60rpmで、次いで、45分間、200rpmで、インキュベーションし、異なる濃度でLBTAGプレート上に接種した。 37℃で、一晩、インキュベーションコロニーの数を計測した。
一回の洗浄後に有機相遠心分離を行う乳癌パンニング処理によって得られた二つのscFvクローン(クローン1および2、図1および2を参照)を、その目標物を同定するために使用した。
Claims (37)
- 一つまたは一つ以上の目標物に関する結合パートナー候補である一つまたは一つ以上のメンバーを同定または選択するために、分子ライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の工程、すなわち;
(a) 発現ライブラリーと、一つまたは一つ以上の目標物とを接触させ、
(b) ある割合で非結合発現ライブラリーメンバーを除去する少なくとも一つの洗浄工程に当該目標物を供し、および
(c) 有機相を介した分離によって、当該発現ライブラリーでの未結合メンバーと、当該発現ライブラリーの一つまたは一つ以上のメンバーに結合した目標物とを分離し、それにより、その他のライブラリーのメンバーから当該目標物に関する結合パートナー候補を分離する、工程を含む、分子ライブラリーをスクリーニングする方法。 - 前記発現ライブラリーが、ファージディスプレイライブラリーまたは細菌発現ライブラリーである請求項1に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーが、抗体発現ライブラリーである請求項1または2に記載の方法。
- 前記抗体発現ライブラリーが、scF-v抗体を含む請求項3に記載の方法。
- 前記目標物が、細胞表面分子であるか、または固相に付着している請求項1乃至4のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞表面分子が、全細胞の成分または細胞の膜画分として提供される請求項5に記載の方法。
- 前記目標物が、抗原である請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が、前記目標物をコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトされているか、または、目標物のライブラリーをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトされているか、あるいは、前記目標物を過剰発現する細胞である請求項5乃至7のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が、真核細胞である請求項5乃至8のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が、疾患状態と関連している請求項5乃至9のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が、癌細胞である請求項5乃至10のいずれかに記載の方法。
- 前記固相が、微粒子固相である請求項5に記載の方法。
- 一つ以上の目標物が、工程(a)で供される請求項1乃至12のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも二つ、少なくとも三つ、または、少なくとも四つの洗浄工程が、工程(b)で供される請求項1乃至13のいずれかに記載の方法。
- 一つ、二つ、三つ、または、四つの洗浄工程が、工程(b)で実施される請求項1乃至13のいずれかに記載の方法。
- 有機相を介した前記分離が、遠心分離によって実施される請求項1乃至15のいずれかに記載の方法。
- 一つまたは一つ以上のプレパンニング工程、すなわち、前記発現ライブラリーと、一つまたは一つ以上の非関連物とを接触せしめる工程が、工程(a)に先駆けて実施される請求項1乃至16のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)〜工程(c)が、一度または一度以上の回数で反復される請求項1乃至17のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)〜工程(c)が、一度、二度または三度の回数で反復される請求項1乃至18のいずれかに記載の方法。
- 前記発現ライブラリーの一つまたは一つ以上のメンバーが結合した前記目標物を、さらに分析に供する請求項1乃至19のいずれかに記載の方法。
- 前記分析が、前記結合パートナー候補および/または目標物をさらに分析するためのものである請求項20に記載の方法。
- 前記目標物から前記結合パートナー候補を分離、除去、溶出または単離する工程、あるいは前記目標物から前記結合パートナー候補を単離して発現または生成させる工程をさらに含む請求項1乃至21のいずれかに記載の方法。
- 前記結合パートナー候補のための分析が、(i)溶液内の一つまたは一つ以上の前記発現ライブラリーと、一つまたは一つ以上の目標物とを接触させ、(ii)前記結合パートナー候補の一つまたは一つ以上のメンバーに結合した目標物を固相上に固定し、および(iii)目標物の存在を検出し、それにより、当該目標物に関する一つまたは一つ以上の結合パートナー候補の存在を検出する、工程を含む、請求項21または22に記載の方法。
- 前記目標物が、請求項5乃至12のいずれかに記載のものである請求項23に記載の方法。
- 前記結合パートナー候補が、固定工程(ii)の進行を促すタグまたはマーカーを含む請求項23または24に記載の方法。
- 前記目標物が、前記目標物の検出を可能にするレポーター部分を含んでいるか、または当該レポーター部分と関連している請求項23乃至25のいずれかに記載の方法。
- 前記レポーター部分が、DNA分子である請求項26に記載の方法。
- 前記目標物が、細胞表面分子であり、かつ前記レポーター部分が、前記目標物を発現している細胞内に存在するDNA分子である請求項26または請求項27に記載の方法。
- 前記DNA分子が、内因性ハウスキーピング遺伝子または外因性レポーター部分である請求項27または28に記載の方法。
- 工程(ii)の前記固相が、 磁性体であり、好ましくは、微粒子である請求項23乃至29のいずれかに記載の方法。
- 前記固定工程が、前記結合パートナー候補と関連するタグまたは分子と、固相での固定分子との間の相互作用によって進行が促される請求項23乃至30のいずれかに記載の方法。
- 前記検出工程が、目標物に対するレポーター部分または当該目標物が関連するレポーター部分の存在を検出することによって行われる請求項23乃至31のいずれかに記載の方法。
- 前記検出工程が、PCRによって行われる請求項32に記載の方法。
- 未確認目標物を単離および/または同定する方法であって、請求項1乃至33のいずれかに記載の工程を含み、かつ(d)当該未確認目標物に結合した一つまたは一つ以上の発現ライブラリーのメンバーを単離し、および(e)当該ライブラリーのメンバーを用いて、そこに結合している目標物を単離および/または同定する、ことを含む方法。
- 目標物に対して特異的な結合パートナーであるライブラリーのメンバーを選択、同定および/または単離する方法、または発現ライブラリーから目標物を選択、同定および/または単離する方法であって、当該方法が、特定の性状を示す分子を選択するための請求項1乃至33のいずれかに記載の工程を含み、かつ、(e)目標物に対して特異的な結合パートナーである関連するライブラリーのメンバーを同定および/または単離することを任意に含み、および、(f)当該ライブラリーのメンバーを用いて、そこに結合している目標物を同定することを任意に含む方法。
- 請求項34の工程(e)または請求項35の工程(f)が、未確認目標物を発現している細胞から調製したcDNAライブラリーをスクリーニングするための前記ライブラリーのメンバーを用いることを含む請求項34または35に記載の方法。
- 目標物または当該目標物に対して特異的な結合パートナーであるライブラリーメンバーを、選択または同定、および発現する方法であって、当該方法が、請求項1乃至36のいずれかに記載の工程、および、当該結合パートナーまたは当該目標物を発現する工程を含む方法。
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GBGB0422431.7A GB0422431D0 (en) | 2004-10-08 | 2004-10-08 | Method |
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