ES2621844T3 - Procedimiento para la selección de un conjunto de moléculas - Google Patents

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Chi-Ying Huang
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Abstract

Procedimiento para la selección de un conjunto de moléculas, cuyo procedimiento comprende las etapas de: (a) proporcionar un conjunto de anticuerpos; (b) dividir el conjunto de anticuerpos en múltiples subconjuntos; (c) cargar cada uno de los subconjuntos en un liposoma para formar un complejo; y (d) poner en contacto el complejo obtenido en la etapa (c) con un agente para detectar si el subconjunto comprende los anticuerpos que tienen especificidad de unión para el agente, mediante lo cual se puede seleccionar el conjunto de anticuerpos.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para la seleccion de un conjunto de moleculas
[0001] La presente invencion se refiere a un procedimiento para la seleccion de un conjunto de anticuerpos. Mas particularmente, la invencion se refiere a un procedimiento para la seleccion de un grupo de anticuerpos que tienen alta selectividad para ciertos marcadores biologicos de interes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
[0002] Las interacciones entre moleculas son necesarias para todas las biorreacciones. Las interacciones entre anticuerpos y antlgenos, y ligandos y receptores son cruciales para iniciar una serie de vlas de respuesta a estlmulos externos. La identificacion de una molecula especlfica implicada en las interacciones es muy importante para la investigation y desarrollo farmaceutico.
[0003] Por ejemplo, despues de la finalization del proyecto genomico humano, se han identificado la mayorla de los genes expresados humanos. Sin embargo, en la era de la proteomica emergente, las protelnas actuan como actores clave en el descubrimiento de estos genes. Con el fin de descifrar eficazmente el misterio de estas protelnas, se han adoptado muchos esfuerzos para generar al menos un anticuerpo para cada gen expresado humano en el genoma humano. Los anticuerpos con su sensibilidad y especificidad inherentes se convierten por lo tanto en las herramientas mas versatiles para proporcionar una relation uno-a-uno con sus protelnas diana. Sin embargo, una de las complejidades es que estas protelnas no siempre se comportan de la misma manera cuando se colocan en celulas diferentes (por ejemplo, cancer). Muchas protelnas son conocidas por su capacidad de translocation en diferentes contextos celulares; as! los correspondientes anticuerpos reconoceran ubicaciones distintas en una celula determinada. Ademas, en muchos casos, las translocaciones de protelnas estan implicadas en la activation de las celulas tumorales. La detection de los movimientos podrla ayudar a diagnosticar el tipo y la etapa del cancer en el futuro. La estrategia de alto rendimiento con la seleccion directa de antlgeno en la membrana celular puede permitir el descubrimiento de dianas terapeuticas potenciales y nuevos marcadores de la enfermedad.
[0004] Sin embargo, aunque se han generado numerosos anticuerpos utiles, las principales limitaciones son dos, es decir, (1) como descubrir directamente antlgenos especlficos (por ejemplo, marcadores de membrana o de superficie) en una celula determinada y (2) como identificar rapidamente los anticuerpos valiosos que reconocen estos antlgenos.
[0005] Tomando las protelnas de membrana como ejemplo, muchas protelnas de membrana estan implicadas en estados patologicos particulares, tales como cancer de pulmon, y a menudo son atractivas dianas terapeuticas. El perfila sistematico y cuantitativo de protelnas de membrana puede facilitar nuestra comprension de sus papeles en la regulation de procesos biologicos en diversos estados patologicos. Aproximadamente del 20 al 30% de los marcos de lectura abiertos de los genomas mas secuenciados se estima que codifican protelnas integrales de membrana (Blonder, J., et al., Enrichment of integral membrane proteins for proteomic analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research, 2002. 1 (4): pag. 351-360; Han, DK, et al, Quantitative profiling of differentiation-induced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Biotechnology, 2001. 19 (10): pag. 946-951). Sin embargo, el proteoma de membrana no se ha mapeado y es un reto experimental debido a la baja abundancia de protelnas de membrana. Ademas, utilizando la proteomica de alto rendimiento y estudios de cribado basados en microarrays, las nuevas dianas identificadas a menudo carecen de anticuerpos para la caracterizacion de su ubicacion y funcion, evitando ademas que los investigadores persigan posibles protelnas de membrana. Es esencial un procedimiento para obtener el perfil de expresion directa para identificar anticuerpos y reconocer receptores (marcadores de superficie o protelnas asociadas a la membrana).
[0006] El cribado aleatorio conlleva mucho tiempo y por lo general es impracticable debido a las diversas condiciones fisiologicas. El uso de anticuerpos individuales para cribar nuevos receptores es imposible debido a la exigencia de mas de 25000 anticuerpos para cubrir todo el genoma. Por otra parte, las celulas cancerosas a menudo tienen multiples receptores sobreexpresados y distintos tipos de celulas que pueden tener diferentes perfiles de ubicacion para la misma protelna diana. Por lo tanto, es necesario desarrollar un procedimiento rapido y eficaz para abordar estas cuestiones al mismo tiempo.
[0007] El documento US 2011/236957 A1 da a conocer composiciones y procedimientos para marcar dianas biologicas utilizando un conjugado de un componente luminiscente y una molecula de reconocimiento unida a una estructura de nucleo de nanopartlculas. Los conjugados de marcaje ofrecen una alta intensidad y bajo ruido de fondo para aplicaciones en la histologla y patologla. El procedimiento comprende: proporcionar una diana biologica para marcar; e incubar la diana biologica con una composition de marcaje de un solo reactivo que comprende (i) una estructura de nucleo de nanopartlculas, (ii) una molecula de reconocimiento especlfica para la diana biologica, y (iii) al menos un componente luminiscente, en el que la incubation consigue el marcaje de la diana biologica con la composicion de marcaje de un solo reactivo.
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[0008] El documento US 2010/119593 A1 da a conocer un liposoma que incluye una membrana de llpidos neutros, un pollmero cargado positivamente, y un pollmero activo de superficie, en el que la membrana de llpidos neutros esta formada como una esfera hueca, el pollmero cargado positivamente esta dispersado en la membrana de llpidos neutros por union no covalente, y el pollmero activo de superficie esta dispersado en la membrana de llpidos neutros mediante union no covalente. El liposoma puede de forma estable adsorber diversas cantidades de biomateriales mediante union no covalente.
[0009] OBRIST ET AL: "Monoclonal antibodies as drug carriers in oncology" TRENDS IN PHARMACOLOGICAL SCIENCES, ELSEVIER, HAYWARTH, GB, vol. 4, 1 de enero de 1983 (1983-01-01), paginas 375-379, ISSN: 01656147,001: 10.1016/0165-6147 (83) 90452-2 da a conocer un procedimiento para detectar una llnea celular de hibridoma de un grupo de celulas de hibridoma que produce un anticuerpo deseado.
[0010] YEN-KU L1U ET AL: "A unique and potent protein binding nature of liposome containing polyethylenimine and polyethylene Glycol: A nondisplaceable property”, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 108, no. 6, 27 junio 2011 (27-06-201), paginas 1318-1327, describe la carga de un conjunto de moleculas (anticuerpos en general) de un vehlculo configurado como liposoma de LPPC, y el reconocimiento de su afinidad de union vis a vis una diana.
[0011] Carol M Y Lee et al. (Nature Protocols, Vol, No. 11, 2007) describe uno de los procedimientos conocidos para la selection de un conjunto de anticuerpos mediante el uso de presentation en fagos.
DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION
[0012] Es un objeto de la presente invention proporcionar un procedimiento mejorado de cribado de expresion de un grupo pequeno para la seleccion de un grupo de anticuerpos que tienen alta selectividad para ciertos marcadores biologicos de interes.
[0013] Este problema se resuelve mediante un procedimiento para la seleccion de un conjunto de anticuerpos como se reivindica en la revindication 1. Otras realizaciones ventajosas son la materia objeto de las reivindicaciones dependientes.
[0014] Segun la presente invencion, se proporciona un procedimiento para seleccionar un conjunto de moleculas que comprenden: a) proporcionar un conjunto de anticuerpos; b) dividir el conjunto de anticuerpos en multiples subconjuntos; c) cargar cada uno de los subconjuntos en un liposoma para formar un complejo; y d) poner en contacto el complejo obtenido en la etapa c) con un agente para detectar si el subconjunto comprende los anticuerpos que tienen especificidad de union para el agente, mediante lo cual se puede seleccionar el conjunto de anticuerpos.
[0015] La presente invencion se describe en detalle en las siguientes secciones. Otras caracterlsticas, objetivos y ventajas de la presente invencion se pueden encontrar facilmente en la description detallada y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0016]
La Figura 1 es una ilustracion esquematica de adsorcion de LPPC (complejo de liposoma/PEI/PEG) con celulas de cancer que reconocen anticuerpos. Los anticuerpos se mezclaron con LPPC marcados con DiO, seguido de bloqueo con PEG1500. Los complejos de LPPC/anticuerpos bloqueados con PEG se incubaron con celulas (por ejemplo, A549) y a continuation se analizaron mediante citometrla de flujo FACScan para determinar sus eficacias de union a la superficie celular. La media de fluorescencia de cada muestra se normalizo usando un control positivo (LPPC marcado con 100% DiO en las celulas) y un control negativo (anticuerpo no unido). La media de fluorescencia de cada muestra se dividio primero por la media de fluorescencia del control positivo. Posteriormente, los valores normalizados se dividieron por la media de fluorescencia del control negativo.
La Figura 2 es una ilustracion esquematica del liposoma basado en anticuerpos para la detection de farmacos. Se separaron un total de 450 anticuerpos en 50 conjuntos, y estos fueron utilizados para formar complejos liposoma- anticuerpo (LPPC/anticuerpo). Para cribar la eficacia de la union del anticuerpo a la superficie celular, se incubaron 50 complejos LPPC/anticuerpo con diferentes llneas celulares de cancer a 4°C. Los complejos LPPC/anticuerpo con una alta eficacia de union a la superficie celular se priorizaron a continuacion mediante analisis por citometrla de flujo FACScan. A continuacion, se utilizaron anticuerpos individuales del conjunto seleccionado, por ejemplo, conjunto 3A, para determinar sus eficacias de union a la superficie celular mediante incubation con LPPC, seguido por el analisis FACScan. La inmunofluorescencia se uso como un cribado secundario para confirmar la localization subcelular de las dianas seleccionadas.
La Figura 3 muestra el cribado de conjuntos de anticuerpos mediados por liposomas para identificar receptores especlficos en diferentes llneas celulares de cancer. Cincuenta conjuntos de anticuerpos individuales se mezclaron con LPPC marcados con DiO, seguido de incubacion con 3 llneas de celulas diferentes (A549, HT29, y MCF7) y analisis con citometrla de flujo FACScan. Cinco conjuntos (conjunto 2G, 2I, 3A, 3B y Y1C) exhibieron una mejor eficacia de union que las otros conjuntos de anticuerpos ensayados. Estos conjuntos se subdividieron en anticuerpos individuales para probar su eficiencia de union con LPPC, tal como se muestra en la las figuras 4-7. La
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palabra "celula" se refiere a la celula sola sin tincion con DiO. "NC Ab" se refiere a anticuerpo no unido en LPPC.
La figura 4 muestra la comprobacion de la localizacion subcelular de las proteinas priorizadas en el conjunto 3B. (A) Los anticuerpos individuales del conjunto 3B se ensayaron en 3 tipos de celulas cancerosas utilizando el sistema de complejo LPPC/anticuerpo. Muchos de estos anticuerpos se seleccionaron para su posterior verificacion de su localizacion subcelular mediante inmunofluorescencia. (B) 3B-4 (MAPK8, rojo) se localizo en la membrana plasmatica en las celulas HT29 (linea celular de cancer de colon), pero no en celulas A549 (linea celular de adenocarcinoma pulmonar).
La Figura 5 muestra la verificacion de la localizacion subcelular de las proteinas priorizadas en el conjunto 2G. (A) Los anticuerpos individuales del conjunto 2G se ensayaron en 3 tipos de celulas cancerosas utilizando el sistema de complejo LPPC/anticuerpo. Muchos de estos anticuerpos se seleccionaron para su posterior verificacion de su localizacion subcelular mediante inmunofluorescencia. (B) 2G-4 (Nup98, rojo) se localizo en la membrana plasmatica en las celulas A549. 2G-7 (MAG1A9, rojo) se localizo en la membrana plasmatica en las celulas A549 y hT29.
La Figura 6 muestra la verificacion de la localizacion subcelular de las proteinas priorizadas en el conjunto 2I. (A) Los anticuerpos individuales del conjunto 2I se ensayaron en 3 tipos de celulas cancerosas utilizando el sistema de complejo LPPC/anticuerpo. Dos de estos anticuerpos (2I-3 y 2I-6) se seleccionaron para su posterior verificacion de su localizacion subcelular mediante inmunofluorescencia. (B) 2I-3 (PIK3R4, rojo) y (C) 21-6 (NPR2, rojo) se localizaron en la membrana plasmatica en las celulas MCF7.
La Figura 7 muestra la verificacion de la localizacion subcelular de las proteinas priorizadas en el conjunto Y1C. (A) Los anticuerpos individuales del conjunto Y1C se ensayaron en 6 tipos de celulas diferentes utilizando el sistema de complejo LPPC/anticuerpo. Muchos de estos anticuerpos fueron seleccionados para la verificacion de su localizacion subcelular mediante inmunofluorescencia. (B) Y1C-4 (SPAG5, rojo) se localizo en la membrana plasmatica en celulas Mahlavu (linea celular de carcinoma hepatocelular) y MCF7 (linea celular de cancer de mama), pero no en celulas A549 (linea celular de adenocarcinoma de pulmon), hepatocitos y Huh7 (linea celular de carcinoma hepatocelular). (C) Y1C-5 (POLR2A, rojo) se localizo en la membrana plasmatica en celulas A549.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
[0017] La presente invencion proporciona un procedimiento para seleccionar un conjunto de anticuerpos que comprende detectar si el conjunto de anticuerpos tiene especificidad de union a un agente.
[0018] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "molecula" se refiere a una molecula pequena o una macromolecula implicadas en una reaccion bioquimica. Preferiblemente, la molecula es una macromolecula, tal como una proteina, peptido, nucleotido, oligonucleotido o polinucleotidos. La molecula puede ser natural o artificial. En otro aspecto, la molecula puede estar purificada o mezclada con otros contenidos. En una realizacion preferida de la invencion, el patron de expresion de la molecula es diferente en una condicion normal y en una condicion anormal, tal como una enfermedad. En otra realizacion preferida de la invencion, el patron de expresion de la molecula es diferente en diferentes tipos de celulas. En aun otra realizacion preferida de la invencion, las moleculas son anticuerpos, antigenos, enzimas, sustratos, ligandos, receptores, proteinas asociadas a la membrana celular o marcadores de superficie celular. En una realizacion preferida adicional de la invencion, las moleculas son anticuerpos.
[0019] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "un conjunto de moleculas" se refiere a un grupo de moleculas, en el que las moleculas pueden ser iguales o diferentes.
[0020] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "agente" se refiere a una molecula pequena o una macromolecula implicadas en una reaccion bioquimica. Preferiblemente, el agente es una macromolecula, tal como una proteina, peptido, nucleotido, oligonucleotido o polinucleotidos. El agente puede ser natural o artificial. En otro aspecto, el agente puede estar purificado o mezclado con otros contenidos. Preferiblemente, el agente se encuentra en o sobre una celula. En una realizacion preferida de la invencion, el patron de expresion del agente es diferente en una condicion normal y en una condicion anormal, tal como una enfermedad. En otra realizacion preferida de la invencion, el patron de expresion del agente es diferente en diferentes tipos de celulas. En aun otra realizacion preferida de la invencion, el agente es un anticuerpo, antigeno, enzima, sustrato, ligando, receptor, proteina asociada a la membrana celular o marcador de superficie celular. En una realizacion preferida adicional de la invencion, el agente es un antigeno.
[0021] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "especificidad de union" se refiere a una propiedad que, incluso cuando diferentes moleculas estan presentes, solo las moleculas que tienen la forma especifica complementaria al sitio activo son capaces de unirse al sitio activo del agente.
[0022] Para una facil manipulacion, el conjunto de anticuerpos se encuentra preferiblemente sobre un vehiculo. El modo de localizacion del conjunto de anticuerpos puede ser la union de origen natural o artificial del conjunto de anticuerpos al vehiculo. Segun la presente invencion, el vehiculo es un liposoma.
[0023] La mayoria de los liposomas disponibles en la actualidad se fabrican mediante la conjugacion covalente de moleculas de reconocimiento sobre componentes del liposoma, tales como colesteroles o cadenas laterales de Kpidos modificados con polimeros. La reaccion de acoplamiento puede danar drasticamente la actividad de ciertas
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moleculas de reconocimiento (NOBS, L., et al, Current Methods for attaching targeting ligands to liposomes and nanoparticles. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2004. 93 (8): pag 1980-92 ; Kocbek, P., et al, Targeting cancer cells using PLGA nanoparticles surface modified with monoclonal antibody. Journal of Controlled Release, 2007. 120 (1-2): pag 18-26). Una forma de evitar este problema consiste en la adhesion no covalente de moleculas de reconocimiento al liposoma cationico. Sin embargo, la disociacion de moleculas de reconocimiento de los liposomas plantea otro problema para influir en la actividad del liposoma (NOBS, L., et al.). Este es principalmente debido a la interaccion debil entre las moleculas de reconocimiento y liposomas. Recientemente, se ha desarrollado un vector liposomal, LPPC (complejo liposoma/PEI/PEG) que no solo puede ser convenientemente cargado con farmacos anti- tumorales, sino que tambien puede adsorber fuertemente anticuerpos especlficos de tumores en su superficie, lo que permite que la partlcula se dirija a las celulas cancerosas (Liu, Y.K., et al, A unique and potent protein binding nature of liposome containing polyehtylenimine and polyethylene glicol: a nondisplaceable property. Biotechnology and Bioengineering. 2011. 108 (6): pag. 1318-1327). Ademas, el LPPC puede aislarse por centrifugacion, permitiendo que el complejo LPPC/anticuerpo se purifique facilmente de los anticuerpos no unidos. El LPPC vaclo puede incorporarse facilmente con colorantes fluorescentes para formar una nanopartlcula fluorescente, que ofrece el potencial para el desarrollo de una sonda especlfica adsorbiendo el LPPC fluorescente anticuerpos especlficos.
[0024] Como se usa en el presente documento, la celula es preferiblemente una celula normal, una celula de cancer, una celula madre, o una celula madre de cancer. La union especlfica entre la molecula y el agente se produce preferiblemente en la celula en una condicion fisiologica o in vivo.
[0025] Para una facil manipulacion, el vehlculo comprende preferiblemente un marcador detectable. Segun los tipos de vehlculo y el marcador detectable, las habilidades de los tecnicos en este campo permiten elegir la manera adecuada para marcar el vehlculo al marcador detectable. En una realizacion preferida de la invencion, el marcador detectable es fluorescente o un isotopo radioactivo.
[0026] Con el fin de aplicar el procedimiento, segun la invencion, en otros aspectos, tales como la administracion de farmacos, el vehlculo preferiblemente comprende ademas al menos uno de un farmaco, un farmaco citotoxico, un factor de crecimiento, una citoquina, una vacuna y un oligonucleotido .
[0027] Preferiblemente, el procedimiento de acuerdo con la invencion comprende ademas la identification de las moleculas. Los tecnicos expertos en este campo pueden aplicar un analisis qulmico, flsico o biologico adecuado para identificar las moleculas.
[0028] Segun la presente invencion, el procedimiento para seleccionar un conjunto de anticuerpos comprende las etapas de:
(a) proporcionar un conjunto de anticuerpos candidatos;
(b) dividir el conjunto de anticuerpos en multiples subconjuntos;
(c) cargar cada uno de los subconjuntos en un liposoma para formar un complejo; y
(d) poner en contacto el complejo obtenido en (c) y el agente para detectar si el subconjunto comprende los anticuerpos que tienen especificidad de union para el agente, mediante lo cual se puede seleccionar el conjunto de anticuerpos.
[0029] Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpos candidatos" se refiere a un grupo de anticuerpos que se sospecha que son los anticuerpos de la invencion que se estan buscando. El conjunto de anticuerpos candidatos puede ser un extracto natural o una combination artificial, tal como por ejemplo un grupo de hibridomas que expresa anticuerpos.
[0030] La condicion de la etapa (d) de contacto es preferiblemente equivalente a una fisiologica. El experto en la tecnica en este campo es capaz de elegir una condicion adecuada.
[0031] En una realizacion preferida de la invencion, el procedimiento comprende ademas dividir el subconjunto en subconjuntos adicionales despues de la etapa (b). Esta etapa y las etapas (b), (c) y (d) pueden llevarse a cabo repetidamente para reducir el numero de anticuerpos en el conjunto.
[0032] Preferiblemente, la etapa (d) comprende ademas poner en contacto el complejo obtenido en (c) y una celula para detectar si el complejo se une a la celula, en el que el agente se encuentra en o sobre la celula. Tal como se usa en el presente documento, la celula es preferiblemente una celula normal, una celula de cancer, una celula madre, o una celula madre de cancer. La union especlfica entre la molecula y el agente se produce preferiblemente en la celula en una condicion fisiologica o in vivo.
[0033] Preferiblemente, la etapa (d) comprende ademas poner en contacto el complejo obtenido en (c) y una celula para detectar si el complejo mata a la celula, en el que el agente se encuentra en o sobre la celula. Tal como se usa en el presente documento, la celula es preferiblemente una celula de cancer.
[0034] Segun la invencion, el concepto de conjunto pequeno se proporciona para identificar los "los anticuerpos de grupos mixtos" para revelar nuevos receptores sobreexpresados en celulas determinadas, por ejemplo, celulas de
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cancer y celulas madre. El concepto subyacente es la subdivision de toda la biblioteca de anticuerpos en conjuntos mas pequenos para aumentar sustancialmente la probabilidad de detectar receptores potenciales (marcadores de superfine o protelnas asociadas a la membrana) para un tipo de celula de cancer determinada. Este procedimiento hace que sea mas facil aislar rapidamente un solo anticuerpo una vez identificado un anticuerpo del grupo de candidatos. Ademas, a diferencia de otros estudios de proteomica y estudios de cribado basados en microarrays, donde las dianas identificadas a menudo carecen de anticuerpos necesarios para la demostracion de su localization en la membrana, nuestro enfoque identifica nuevos receptores de reconocimiento de anticuerpos y puede emplearse inmediatamente en varias aplicaciones.
[0035] En el procedimiento mencionado anteriormente, las moleculas pueden ser marcadores biologicos, y los marcadores biologicos pueden ser antlgenos especlficos de tumores, protelnas asociadas a membrana celulares o marcadores de superficie celular.
[0036] Hay muchas aplicaciones potenciales del procedimiento de acuerdo con la invention. En una implementation practica de la invencion, este cribado es la identification de los receptores relacionados con la enfermedad expresados diferencialmente mediante la comparacion de las celulas normales y enfermas. Conjugando liposomas con uno o multiples anticuerpos, las celulas tumorales pueden recibir una dosis alta relativa de los farmacos en comparacion con los tejidos normales, proporcionando una estrategia de tratamiento alternativa. El receptor identificado puede utilizarse para la administration de farmacos a traves de, por ejemplo, el liposoma.
[0037] En una implementacion practica adicional de la invencion, la identificacion de marcadores de superficie celular especlficos se lleva a cabo en otras situaciones. Por ejemplo, este enfoque puede ser usado para identificar marcadores de superficie para la investigation de celulas madre, por ejemplo, en celulas madre mesenquimales (MSCs), celulas madre neurales (NSC), celulas madre pluripotentes y celulas madre de cancer, y para identificar la marcadpres de diferenciacion especlfica del tipo de celula. El marcador o marcadores de superficie identificados se pueden usar para identificar y aislar las celulas (o subpoblaciones) de interes de un conjunto heterogeneo. En otras palabras, los marcadores de superficie celular identificados se pueden utilizar para el analisis y clasificacion de celulas a traves de, por ejemplo, citometrla de flujo.
[0038] En aun otra implementacion practica de la invencion, el procedimiento es la rapida caracterizacion de receptores potenciales (marcadores de superficie o protelnas asociadas a la membrana) a partir de grandes grupos de anticuerpos monoclonales o policlonales, generados a partir de peptidos o de presentation en fagos. En general, hay una falta de procedimientos de analisis sistematico para resolver receptores potenciales a partir de estos inventarios de anticuerpos. Usando el cribado de expresion de anticuerpos basados en conjuntos pequenos, es posible rastrear miles de anticuerpos dentro de un corto perlodo de tiempo.
[0039] Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar a los expertos en la tecnica a obtener una mejor comprension de la presente invencion.
EJEMPLOS
Procedimientos
Celulas incubadas con complejos LPPC/anticuerpo
[0040] En este ejemplo, el LPPC (complejo liposoma/PEI/PEG) se marco con colorante de fluorescencia verde DiO durante 30 minutos. A continuation, se incubaron 20 mg de LPPC marcado con DiO con 1 mg de un conjunto de anticuerpos de 9 anticuerpos durante 30 minutos. A continuacion, se bloquearon los complejos LPPC/anticuerpo con PEG1500 durante 30 minutos y se centrifugaron a 5900 xg durante 5 minutos para eliminar el exceso de PEG. Finalmente, los complejos LPPC/anticuerpo bloqueados con PEG se incubaron con 3X105 celulas durante 30 minutos para permitir la union con antlgenos en la superficie celular. La eficacia de la union se midio por citometrla de flujo FACScan. La media de fluorescencia de cada muestra se normalizo usando un control positivo (LPPC marcado con 100% DiO en las celulas) y un control negativo (anticuerpo no unido). La media de fluorescencia de cada muestra se dividio primero por la media de fluorescencia del control positivo. Posteriormente, los valores normalizados se dividieron por la media de fluorescencia del control negativo; el corte fue un cambio de 3 veces para la clasificacion como un resultado positivo.
Inmunofluorescencia
[0041] Para caracterizar la localizacion de protelnas seleccionadas, las celulas se tineron con anticuerpo mediante inmunofluorescencia. Las celulas se lavaron con solution salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con 3,7% de formaldehldo en PBS durante 5 minutos a 25°C, seguido de lavado con PBS 3 veces durante 10 minutos. Las celulas se permeabilizaron durante 5 minutos en PBS que contenla 0,5% de Triton X-100 y se bloquearon en suero de cabra normal al 5% durante 30 minutos. Las celulas fijadas se sondaron con el anticuerpo primario (por ejemplo, SPAG5) en PBS con suero de cabra normal al 1% a 4°C durante la noche. El ADN se tino con 4,6-diamidino-2-
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fenilindol (DAPI, 2 mg/ml). Las imageries inmunofluorescentes de las celulas se adquirieron utilizando un microscopio confocal de barrido laser Olympus FV1000 LSM Fluoview (Olympus).
Resultados
Establecimiento de complejos LPPC/anticuerpo para el cribado de nuevos receptores y protefnas asociadas a la membrana
[0042] El complejo LPPC/anticuerpo se purifica facilmente de los anticuerpos no unidos. Ademas, los LPPC vaclos se pueden incorporar facilmente con colorantes fluorescentes para formar nanopartlculas fluorescentes, que ofrecen el potencial para el desarrollo de sondas especlficas, adsorbiendo el LPPC anticuerpos especlficos. El complejo anticuerpo/LPPC fluorescente sirve como una herramienta muy util para la deteccion de antlgenos de superficie sin conjugacion qulmica. La eficacia de la union se puede medir mediante un citometro de flujo FACScan (Figura 1). Estos procesos se pueden realizar de manera facil y terminar en un pequeno tubo de ensayo, y los resultados demuestran que nuestro enfoque es factible para la identificacion de nuevos receptores y/o protelnas asociadas a la membrana.
Cribado de la expresion de anticuerpos en un conjunto pequeno para la identificacion de receptores especlficos de cancer y/o protefnas asociadas a la membrana.
[0043] La cuestion que queremos abordar es si podemos identificar receptores (marcadores de superficie o protelnas asociadas a la membrana) a traves del cribado de anticuerpos. Para demostrar la viabilidad de esta idea, se recogieron primero 450 anticuerpos para este estudio. A continuacion, 9 anticuerpos por grupo se seleccionaron al azar y se mezclaron juntos antes de cargar los LPPC fluorescentes. Un total de 50 conjuntos de LPPC- anticuerpos se incubaron inicialmente con 3 llneas celulares diferentes: celulas de cancer de pulmon (A549), cancer de colon (HT29) y cancer de mama (MCF7). Los complejos anticuerpo-LPPC se sometieron a continuacion a analisis FACScan (Figura 2). Basandose en los resultados del cribado primario, muchos conjuntos, incluyendo 3A, 3B, Y1C, 2I y 2G, revelaron mayores capacidades de union a la membrana en las celulas de cancer probadas que los otros conjuntos analizados (Figura 3). Al examinar cuidadosamente la localizacion subcelular de cada anticuerpo a partir de estos 5 conjuntos seleccionados a traves de GO (componente celular) y busquedas en PubMed, se encontro que cada uno de estos 5 conjuntos seleccionados contenla protelnas de membrana conocidas, que, por supuesto, tienen mejores eficiencias de union a la membrana. Sin embargo, el conjunto 2I parecla tener diferentes eficacias de union entre las llneas celulares ensayadas (por ejemplo, la eficacia de union fue mayor en las celulas HT29 que en las celulas A549 y MCF7). Se planteo la posibilidad de que diferentes anticuerpos pueden haber reconocido distintas localizaciones de protelnas ensayadas en diferentes celulas. Por lo tanto, postulamos que podemos ser capaces de identificar nuevos receptores y/o protelnas asociadas a la membrana a partir de estos 5 conjuntos seleccionados, que fueron seleccionados para estudios adicionales, utilizando anticuerpos individuales de cada grupo (Figuras 4-7). Asl, despues de la primera ronda de cribado, se ensayaron 9 anticuerpos individuales de un grupo positivo (por ejemplo, 3A) para determinar que anticuerpos son receptores potenciales (o protelnas asociadas a la membrana) para las celulas cancerosas mediante su carga de nuevo en LPPC fluorescentes (Figura 2). Varios anticuerpos de estos 5 conjuntos, por ejemplo, 3A-9 (o PDGFRB) y Y1C-4 (o SPAG5) (Tabla 1), no solo se recuperaron receptores bien conocidos, sino tambien demostraron la posibilidad de identificar potenciales protelnas asociadas a la membrana en celulas de cancer.
Caracterizacion de la localizacion subcelular de protefnas priorizadas del cribado de un conjunto pequeno
[0044] Se redescubrieron varios receptores conocidos en este cribado, por ejemplo, 3A-9 (o PDGFRB, vease la Tabla 1) y 3B-7 (o KRAS2, vease la Tabla 1). Ademas, muchos anticuerpos pareclan tener afinidades distintas hacia diferentes llneas celulares. Por ejemplo, Y1C-5 tenia mayor afinidad a las celulas A549 y HT29 que a las celulas MCF7, mientras que Y1C-4 tenia mayor afinidad a las celulas MCF7 que a celulas A549 y HT29. A fin de validar estas observaciones, hemos creado un cribado de inmunofluorescencia secundario para confirmar la localizacion en la membrana de las protelnas priorizadas identificadas a partir del cribado inicial del LPPC. Para ampliar la aplicacion de este enfoque, se caracterizo la localizacion subcelular de dianas seleccionadas no solo en las celulas iniciales analizadas de cancer de pulmon (A549), cancer de colon (HT29) y cancer de mama (MCF7), sino tambien se extendio el estudio en otras llneas de celulas de cancer, incluyendo celulas de carcinoma hepatocelular (Mahlavu). Los resultados mostraron que 3B-4 (Figura 4), 2G-4 y 2G-7 (Figura 5), 21-3 y 2I-6 (Figura 6), y Y1C-4 e Y1C-5 (Figura 7) se localizaban en la membrana plasmatica con especificidad de tipo celular. Por ejemplo, Y1C-4 (o SPAG5, vease la Tabla 1) fue localizado en la membrana plasmatica en celulas de carcinoma hepatocelular (Mahlavu) pero no en celulas de cancer de pulmon (A549, Figura 7). SPAG5, una protelna asociada al huso mitotico, es conocida por regular la alineacion correcta de los cromosomas durante la metafase, y su expresion esta implicada en el cancer de mama y el cancer de pulmon de celulas no pequenas. Ademas, el agotamiento de SPAG5 causo la perdida de la cohesion de cromatidas hermanas. En general, la expresion de SPAG5 fue muy baja durante la interfase y estaba regulada por crecimiento y localizada en los cinetocoros y polos del huso en la metafase. Se necesitan mas estudios para diseccionar la via de senalizacion mediada por SPAG5 en la membrana celular en el cancer de hlgado. Un resumen de los resultados de inmunofluorescencia se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1: Verificacion de la localizacion subcelular del anticuerpo con prioridad a traves de inmunofluorescencia (IF).
Anticuerpo
Nombre Localizacion conocida Localizacion ensayada en A549 Localizacion ensayada en MCF7 Localizacion ensayada en HT29 Nota
3A-6
BUB1B nucleo, citosol citosol citosol citosol, membrana plasmatica
3A-9
PDGFRB membrana plasmatica membrana plasmatica membrana plasmatica membrana plasmatica control positivo
3B-4
MAPK8 nucleo , citosol citosol citosol citosol, membrana plasmatica
3B-6
PRKCA citosol, membrana plasmatica citosol citosol citosol
3B-7
KRAS2 membrana plasmatica, mitocondria citosol citosol citosol, membrana plasmatica control positivo
Y1C-4
SPAG5 nucleo , citosol nucleo nucleo, membrana plasmatica nucleo
Y1C-5
POLR2A nucleo, nucleoplasma citosol, membrana plasmatica ND ND
Y1C-6
MAD2L1 nlucleo, citosol nucleo, citosol ND ND
2G-3
IQGAP1 nucleo, citosol, membrana plasmatica citosol citosol expresion baja
2G-4
NUP98 nucleo, nucleoplasma citosol, membrana plasmatica citosol expresion baja
2G-7
MAG1A9 desconocido citosol, membrana plasmatica citosol citosol, membrana plasmatica
2I-3
PIK3R4 citosol citosol citosol citosol, membrana plasmatica
2I-6
NPR2 membrana plasmatica nucleo, citosol nucleo, citosol nucleo, citosol, membrana plasmatica
ND: no determinado

Claims (10)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la seleccion de un conjunto de moleculas, cuyo procedimiento comprende las etapas de:
    (a) proporcionar un conjunto de anticuerpos;
    (b) dividir el conjunto de anticuerpos en multiples subconjuntos;
    (c) cargar cada uno de los subconjuntos en un liposoma para formar un complejo; y
    (d) poner en contacto el complejo obtenido en la etapa (c) con un agente para detectar si el subconjunto comprende los anticuerpos que tienen especificidad de union para el agente, mediante lo cual se puede seleccionar el conjunto de anticuerpos.
  2. 2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales.
  3. 3. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente se localiza en o sobre la celula.
  4. 4. Procedimiento, segun la reivindicacion 3, en el que la celula es una celula normal, una celula de cancer, una celula madre o una celula madre de cancer.
  5. 5. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente es un anticuerpo, antlgeno, enzima, sustrato, ligando, receptor, protelna asociada a la membrana celular o marcador de superficie celular.
  6. 6. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el liposoma comprende un marcador detectable, y en el que el marcador detectable preferiblemente es fluorescente o un isotopo radioactivo.
  7. 7. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el liposoma comprende ademas un farmaco, un farmaco citotoxico, un factor de crecimiento, una citoquina, una vacuna y/o un oligonucleotido.
  8. 8. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas identificar los anticuerpos.
  9. 9. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas dividir un subconjunto de los multiples subconjuntos obtenidos en la etapa (b) en subconjuntos adicionales, en el que
    la etapa de dividir el subconjunto de los multiples subconjuntos obtenidos en la etapa (b) en subconjuntos adicionales y las etapas (b), (c) y (d) se realizan repetidamente para reducir el numero de anticuerpos en el conjunto.
  10. 10. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (d) comprende ademas poner en contacto el complejo obtenido en (c) y una celula para detectar si el complejo se une a la celula o mata la celula, en el que el agente se localiza en o sobre la celula.
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