CN101057147A - 抗体文库筛选的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了筛选分子文库以鉴定和/或选择文库中的一个或多个成员的方法，所述成员是一个或多个配体的备选结合伴侣，所述方法包括：a)使在溶液中的表达文库与一个或多个配体相接触；b)将已经与表达文库的一个或多个成员结合的配体捕获到固相上；以及c)检测配体的存在，从而检测表达文库中的作为配体的备选结合伴侣的一个或多个成员的存在。

Description

抗体文库筛选的方法

技术领域

本发明涉及一种通过其配体分离亲和性文库的成员的新方法。尤其是，本发明涉及一种筛选分子文库(亲和性文库成员)以鉴定或选择其中作为一种或多种配体的备选结合伴侣(binding partners)的一种或多种成员的方法，特别是作为细胞表面配体的备选结合伴侣。本发明的一个优选实施方案提供了改进的文库筛选方法，所述方法将固相选择步骤与用于检测配体存在的聚合酶链反应(PCR)的应用相结合。

背景技术

筛选文库目前成为在药物发现和生物技术中常规的操作(Emili，A.Q，和Cagney，G.(2000)自然生物技术(Nat.Biotechnol).18，393-397；Li，M.(2000)自然生物技术(Nature Biotechnol).18，1251-1256)。一个主要的应用是鉴别具有临床意义的蛋白(Burton，D.R.(2002)自然免疫学综述(Nature Rev.Immunol).2，706-713)。为此目的，对包括数百万个不同成员分子(典型地是蛋白质或肽成员)的文库筛选针对相应配体的亲和力(Winter，G.P.等，WO 90/05144；McCafferty，J.等，WO 92/01047；Breitling，F.等，WO 93/01288)。配体自身可以是细胞(或细胞表面分子)，分子或分子文库，例如活的真核细胞、蛋白质、肽或小的化合物。

尽管一些筛选方法已经被描述过，但应该开发新的或对速度、敏感性、通量和重复性的改进方法以能够产生有前景的备选药物，特别是针对更富有挑战性的配体的药物。另外，当评价筛选方法时，成本效率是一个主要因素。目前，有几种可实施的筛选系统以直接从体内文库和体外文库鉴定成员。被设计进行鉴定药物学相关分子的这些系统的大多数具有共同的特征：每一单个的文库成员的表型与其特定的基因型相连锁。其既通过噬菌体外壳蛋白，细胞膜也通过核糖核酸蛋白复合体。连锁，这些筛选系统功能的一个先决条件，可以针对文库展示而有区别地将所述连锁构建在例如噬菌体(Winter，G.P.等，WO90/05144；McCafferty，J.等，WO 92/01047；Breitling，F.等，WO93/01288；Ladner，R.C，等，WO90/02809；Markland，W.等，WO 92/15679；Harrison，J.L.等(1996)酶学方法(Meth.Enzymol).267，83-109)、细菌(bacteria)(Samuelson，P.等(2002)生物技术杂志(J.Biotechnol).96，129-154)、酵母(yeast)(Wittrup，K.D.等，WO 99/36569；Wittrup，K.D.(2001)当代生物技术评述(Curr.Opin.Biotechnol).12，395-399；Lee，S.Y.等(2003)生物技术动向(Trends in Biotechnol).21，45-52)上，或带核糖体展示(ribosome display)(Kawasaki，G.，WO91/05058；Mattheakis，L.C.等，WO95/11922；

A.等.，WO 98/48008；Schaffitzel，C.等(1999)免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth).231，119-135；Coia，G.等.(2001)免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth).254，191-197)、共价展示(covalent display)(Szostak，J.W.等.WO 98/31700；Szostak，J.W.等.WO 00/47775；Lindqvist，B.H.等.WO 98/37186；Amstutz，P.等.(2001)当代生物技术评述(Curr.Opin.Biotechnol).12，400-405；Wilson，D.S.等。(2001)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98，3750-3755)、CIS展示(CIS-display)(McGregor，D.等.WO04/022746；Odegrip，R.等.(2004)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)101，2806-2810)和细菌双杂交系统(bacterial two-hybridsystems)(Chien等.(1991)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88，9578)。所有这些方法背后的构思是应用系统将这些亲合性分子翻译和展示，所述系统能够富集、分离和鉴别文库成员。

为分离备选分子，相关文库被暴露于配体，在发现抗体时，配体是抗原。通常地配体被固定于固体支持物上。该支持物通常可以是微珠塑料表面、微孔板、或抗原管。可选择地，反应可以在溶液中被标记的配体目标(例如被生物素标记)上进行。该方法包括几个去除非特异和非反应性文库成员(淘洗)的步骤。为纯化溶液中的复合体，必须通过或者固定或者离心步骤捕获所述复合体。一个传统的方法是在可溶性的生物素化配体上捕获亲合性成员，并且在链霉亲和素微珠上固定亲合性复合体(亲合性成员和配体)。通过将微珠用作固体支持物，可选择的对象很多，例如磁珠(例如从Bangs Laboratories，Polysciences inc.，戴诺生物技术(Dynal Biotech)，Miltenyi Biotech或Quantum Magnetic获得)、非磁微珠(例如Pierce和Upstate技术)、单分散性微珠(例如戴诺生物技术和Microparticle Gmbh)和多分散性微珠(例如Chemagen)。磁珠的应用在文献中已经被描述的非常详尽，总体上，在如何应用微珠去捕获蛋白、DNA、病毒、细菌和真核细胞上((Uhlén，M，等(1994)生物磁性分离的进展(in Advances inBiomagnetic Separation)，生物技术出版社(BioTechniques press)，Westborough，MA)，Uhlén，M，等前述文献中提到了直接的阳性分离步骤。也提到了阴性选择步骤使得能够去除混合物中不需要的文库成员。

所有这些例子都基于直接鉴定富集的文库成员，因为被展示的成员分子特异地识别配体。典型地，其包括多克隆ELISA，之后克隆、DNA测序、和单个富集的文库成员在另一系统(例如大肠杆菌、酵母或体外翻译试剂盒)的表达，之后通过例如BiaCore，ELISA和/或亲合性测定对文库成员作进一步分析。在一些情况下，经淘洗后的文库成员的生成池(resulting pool)可以包括几个具有不同亲合力或具有非反应成员的较大池的备选成员。为分离单一的标本，可以应用另一个筛选平台以亚筛选(subscreen)被富集的全套分子。

过滤筛选操作通常被用于较小的链重组(chain-shuffled)文库(达到10⁵个成员)。小的细菌文库被铺于生物检测板上，单个克隆被自动检出以用于高通量筛选(Walter，G.等.(2002)分子医学进展(TrendsMol.Medicine)8，250-253)。细菌文库可以是由lac启动子控制的标签标记的scFv抗体表达文库。该操作把支持滤器上特定的克隆网格模式与将滤器提升置于捕获滤器之上结合起来。捕获滤器可以用相关的亲合性配体(抗原)包被，并置于IPTG生物检测盘的顶部进行表达。通过文库成员在捕获滤器上的特有的标签网格模式应用蛋白印迹(Western blotting)技术鉴定这些文库成员(Stacy，J.E.，等(2003)免疫学方法(J.Immunol.Meth).283，247-259)。该方法被证实非常适合直接筛选小的病人文库(Brekke，O.H.，等，WO 03/095491)。

但是，对于目前文献提到的所有的已经存在的淘洗和筛选方法，均应用整合入文库本身的特性检测和分离相关文库成员。可以是特定的网格模式以用于滤器筛选方法，针对噬菌体展示的噬菌体感染，或应用体外展示文库筛选技术的文库成员富集DNA的PCR信号。

发明内容

但是没有任何可行方法通过其相应配体来鉴定文库成员。到目前为止所有的检测方法涉及到检测亲合性文库成员。相比之下，本发明提供了通过检测其配体(或至少检测与配体相关的单位)来间接鉴定文库成员的新技术。在筛选抗复合性配体例如活细胞的小文库中其具有特别的价值，尽管该方法的应用性并不局限于这些应用。

因此，一言以蔽之，本发明提供了筛选分子文库的方法，以鉴定和/或选择其中一个或多个成员，所述成员作为针对一个或多个配体的备选结合伴侣，所述方法包括：

a)使在溶液中的表达文库与一个或多个配体相接触；

b)将已经与表达文库的一个或多个成员结合的配体捕获到固相上；以及

c)检测的配体存在，从而检测表达文库中的作为配体的备选结合伴侣的一个或多个成员的存在。

根据本发明的待筛选的分子文库可以是任何蛋白质表达文库，即，任何已知的或新近派生出的肽或多肽表达文库。合适的表达文库的例子是公知的，并在本领域得到描述(参见上文讨论)，并且包括展示文库诸如噬菌体展示文库(Winter等人.，等等.，同上文)，细菌(Samuelson等人.，同上文)或酵母展示文库(Wittrup等人.，等等.，同上文)，共价或非共价展示文库诸如核糖体展示文库(例如发表的科罗拉多大学董事(The Regents of the University of Colorado)的专利文件WO92/02536，大学研究公司(University Research Corporation)的专利文件WO93/03172，和Kawasaki的专利文件WO91/05058)，或PROfusion文库(Phylos公司)，其中表达的蛋白结合于编码其的mRNA上，或共价或非共价展示系统，其中表达的蛋白结合在编码其的DNA上(例如通过Actinova Ltd的专利文件WO98/37186所描述的共价连接或通过专利文件WO04/022746所描述的顺式展示系统中的顺式作用蛋白)，或细菌双杂交系统(Chien等人.，同上文)。还可以应用的表达文库的可选择类型例如细菌表达文库或其他文库，其中蛋白作为可溶性片段被表达和分泌(可溶性表达文库)。也可以筛选化学文库，例如合成肽文库或化学分子文库。因此，本发明尽其最大范围地超出蛋白表达文库(生物文库)的筛选扩展到化学文库的筛选。本发明中应用的优选文库是噬菌体展示文库或细菌表达文库。

由表达文库表达的蛋白质可以具有任何适宜的长度，只要所述长度可以足够使蛋白质作为(或潜在作为)配体的结合伴侣发挥作用即可。因此所述蛋白质可以是短的线性肽(例如长度约为5-50或7-30氨基酸的量级)或可以折叠而不是线性的更长肽或多肽。因此，表达文库的蛋白可以被全长基因或其中的片段所编码，例如编码表达文库成员的核苷酸可以是cDNA或mRNA文库或其中的片段，例如产生于特定细胞类型或可以是基因组DNA文库或其中的片段。

优选的表达文库表达多肽结合伴侣，所述多肽结合伴侣是备选配体、受体、酶、底物、抗原、抗体等，或其中的片段，即，亲合性文库，尤其优选的表达文库表达抗体分子或抗体片段，其可以对结合一个或多个已知或未知抗原(配体)的备选物进行筛选。所述抗体表达文库可以以任何适合的方式表达抗体，并可以包括整个抗体分子或抗体片段，诸如单链抗体(例如scFv)、Fab、Fv、Fab’2、二元体、双特异抗体、微型抗体、重链或轻链、三元体、四元体、卵形抗体(cameloidantibody)、单域抗体等。抗体片段的优选方式是scFv片段。

抗体分子或片段可以是任意的免疫球蛋白同种型，例如IgG、IgM或IgA等等，并且表达文库可以包括这些亚型的一种或多种的抗体。许多抗体文库是公知的，并且在本领域被描述，而且可以用本发明方法对对这些文库中的任意一种或最近衍生的文库进行筛选。

当在此处提及表达文库时，该术语可以用于指示在核酸或蛋白质水平上的某一文库，即，被编码蛋白质的表达发生之前或之后。但是明显地，这些的表达文库必须是蛋白质水平上存在，以为了发生与配体的相互作用。因此，为了使接触步骤(a)成功发生，表达文库必须在蛋白质水平上存在(尽管最初它们可以以核酸水平存在)。

用于本发明方法的表达文库的主要的一个先决条件是，当表达文库最初与筛选时与之相对应的配体相结合时，它们必须存在于溶液中。“在溶液中”是指当表达文库最初与筛选时与之相对应的配体相结合时，不与固相连接，即最初的表达文库是非固定化的表达文库。

构建这样的表达文库和编码它们的核酸的方法是公知的，并且在现有技术中已有描述。可以基于该点应用任何已知的表达文库或新近发展或构建的表达文库。例如，这样的文库可以包括天然产生的多肽或其片段，或者全部或部分可以是随机或合成的。例如，对于抗体表达文库，文库可以通过克隆从来自健康供体的淋巴细胞原生种群或者来自富集的淋巴细胞种群的核酸衍生出来，例如来自暴露于抗原或者被疫苗或例如肿瘤细胞所免疫的病人的淋巴细胞(例如，如AffitechAS的专利文件WO03/095491中所述)，或者从根据特定的抗原淘洗而富集的淋巴细胞种群的核酸衍生出来。

表达文库，特别是抗体表达文库可以衍生于任何适合的来源，优选衍生于哺乳动物源，更优选来源于人。也可以使用嵌合表达(chimeric expression)文库或人源化表达文库。也可以通过选择天然出现的支架(scaffold)并包括位于适合位置的随机序列创建文库。可选择地，支架可以以衍生于各种天然出现的框架的一个或多个一致性序列为基础。

通常，用于制备文库结构成分的技术将基于公知的基因工程技术。基于这一点，编码在表达文库中要表达的，且在不同文库成员之间通常发生改变的，因而使文库具有多样性的实际蛋白质或肽或其片段的核酸序列被整合入适合于所要使用的表达系统类型的表达载体中。适合在噬菌体展示、共价和非共价展示、细菌表达等中应用的表达载体是公知的，并在本领域中已有记载(参见例如在上文中，在对本发明中应用的表达文库的适合类型进行的讨论中所指出的参考文献)。如果噬菌体展示是选择的表达文库，则既可以应用噬菌体也可以应用噬粒载体，尽管噬粒载体是优选的。在本发明的表达文库是抗体片段文库的实施方案中，对表达载体进行恰当的设计以使抗体片段以所需要的形式表达将是本领域技术人员在正常的工作中所能作到的。

一旦生成，编码不同文库成员(即编码在文库成员之间发生变异的蛋白质或肽，即表达肽)的核酸分子就可以通过标准技术进一步分化，例如通过以被控制的(例如定点诱变)或随机方式包括添加、删除和/或替代一个或多个核苷酸的突变，或通过结构域交换、盒式诱变、链改组等技术。合成的核苷酸可以用于产生分化的核酸序列。因此，所有或部分的编码表达肽的核酸可以被化学合成或衍生于不同有机体或细胞型。

另外，通过例如进行一或多轮抗目标配体或非目标配体(阴性淘洗)的淘洗或选择可能已经在复杂性上缩小了本发明方法中使用的表达文库。这种缩小了的表达文库可选择地用于进一步的分化，例如，用本发明方法进行筛选之前，应用以上讨论的方法。

表达文库的结构成分(expression library constructs)可选择地进一步包括其他适合的组分，例如复制起始位点、用于起始转录的可诱导或不可诱导的启动子、增强子、抗生素抗性基因和标志、一般标签或报告分子、通过例如PCR能够使结构成分扩增的引物结合位点、或其他所需要的序列元件。在文库结构成分中，使得这些附加组分能够行使其所要达到的功能的合适来源和定位将是本领域技术人员在正常的工作中所能作到的。

在文库结构成分和在表达文库成员中的对一般标签或标志的包含在本发明所应用的表达文库中特别重要，并且这样的标签在本发明方法的捕获步骤中被用于促进文库成员与固相的结合，即被用于促进捕获步骤。基于该点，只要能够促进文库成员与固相的结合，任何适用的标签都可以使用。但是，适宜地，这样的标签是亲合性分子，所述分子通过结合被直接或间接固定在固相上的伴侣亲合分子而促进与固相的结合。示范性的例子可以是c-myc标签(例如其可以经抗c-myc抗体被捕获)或His标签(例如其可以经镍表面被捕获)或生物素(例如其可以经链亲合素分子被捕获)，或诸如gp8的噬菌体表面结合蛋白(例如其可以经抗gp8抗体被捕获)，或抗原肽标签例如可以被抗体识别的FLAG或HA。此类标签或标志也可适宜地直接或间接检测到。这样的标签或标志典型地是存在于所有文库成员中的一般标签或标志(即表达文库中的每一成员都有同样的标签或标志)，并且可以用于将文库成员捕获到固相上。本发明方法的检测步骤不需要这样的标签或标志(因为通过检测配体而不是文库成员来完成检测，参见下文详述)。但是，如果需要，这些标签可以用于检测文库成员的存在。在确定配体对文库成员的亲合性中，它们的存在证明非常有用。

一旦在核酸水平获得了适合的表达文库结构成分，它们可以被表达以用于筛选，以及在适合的表达系统中方法的步骤(a)中的应用，这取决于文库结构成分的性质，例如取决于选择的系统是噬菌体展示、体外展示还是细菌表达。适合的表达条件和方法是公知的，并在本领域已有描述。

用于此处的术语“配体”是指任何的趋于在表达文库中欲以识别蛋白样结合伴侣的单位(有时称为“目标配体”)或分子。这样的配体因此可以结合于或是相互作用于被筛选的蛋白表达文库的成员，并且其可以是蛋白质/肽、糖肽、糖类、脂类、糖脂类、化学小分子等。

这样的配体可以是连接在整体细胞上的细胞表面分子或是整体细胞的组成部分，或者可以是，例如游离的、裸露的、单独的或纯化的分子。可存在有单个的配体或多重的配体(例如配体文库)。更优选的配体是细胞表面分子(即原位存在于细胞表面的分子)，特别是细胞表面蛋白或肽，例如细胞表面抗原。这样的配体可以是公知的或未知的意在识别备选结合伴侣的分子。对于在本发明方法中的使用，这样的配体通常附着于适合的部位以为了促进配体的检测步骤，和/或促进配体的轻松操作，例如洗涤步骤等。如果配体是细胞表面分子，则细胞本身提供这样的部位。但是，如果配体是裸露，单独或纯化的分子，则这样的分子容易附着于固相以提供此种部位。

用于此处的术语“细胞”是指任何类型的生物粒子并包括细菌、病毒、真核细胞(包括较低级的真核细胞例如酵母细胞，以及较高级的真核细胞例如哺乳细胞，特别是人类细胞)。细胞可以是天然出现的细胞或细胞混合物(例如衍生于活体组织或一些其它的来源于哺乳动物受试对象的样本)，或细胞系(包括永生化细胞和基因工程细胞系，例如由被编码了特定配体的核酸转化或转染了的细胞，或是被配体文库，例如cDNA文库，转化或转染了的许多细胞)等。也可以使用过量表达所述配体的细胞。细胞的一部分也被包括在本术语的范围之内，例如膜部分、细胞壁部分、细胞壁蛋白、膜蛋白等。

在本发明方法中所使用的优选“细胞”是真核细胞或其膜部分。如上文所提示的，这样的真核细胞(或甚至是其他类型的细胞)可以被随后在细胞表面表达的分子(配体)文库转染，并可以应用于本发明方法以识别所表达分子的备选结合伴侣。这样，本发明提供了筛选与文库相对应的文库的方法，这尤其有利。配体的优选文库是产生于疾病相关单位的文库，例如疾病相关细胞或病理学因子例如病毒或细菌。一个特别优选的配体文库是肿瘤细胞文库(例如cDNA文库)或病毒细胞文库(例如cDNA文库)以能够识别肿瘤或病毒相关蛋白的备选结合伴侣。用于转染的合适的真核细胞(以及其他细胞类型)，例如COS细胞是众所周知的并记载在本领域，可以使用其中的任何细胞。

其他优选的真核细胞是与疾病状态相关的细胞，例如肿瘤细胞或细胞系，例如乳腺癌或肺癌细胞或细胞系，或分离于病人的淋巴细胞(外周血淋巴细胞)，或被病毒感染的细胞以及由此将病毒蛋白递呈在其表面。这样的细胞可以用于本发明方法的筛选以识别表达于疾病相关细胞表面的分子/配体，例如肿瘤相关分子或感染相关分子的备选结合伴侣。

在本发明方法中应用的细胞可以衍生于任何合适的来源，例如细胞可以直接衍生于天然来源，例如哺乳动物受试对象或可以从体外培养物中获取，例如如果使用转染细胞。如果使用体外培养物则所述细胞可以悬浮或作为单层培养，并以活的或固定状态在本发明方法中应用。通常优选的是使用活细胞(特别优选的是活的真核细胞)，因为这时细胞表面的任何配体都以天然的形式存在，这意味着由所述方法选择的备选结合伴侣在此时识别处于天然形式的目标配体，因此增加了所述备选结合伴侣在治疗和诊断上应用的机会。通常优选的是在本发明方法中使用新鲜分离的细胞而不是冷冻或储藏的细胞。但是在本发明方法中可以使用固定细胞，只要这样的被固定细胞仍然处于溶液中即可。

在本发明的实施方案中，在配体是附着于固相表面的分子时，该分子可以衍生于任何合适的来源，即可以是天然出现的蛋白、糖类、脂类、糖脂类等，其可以从该分子的自然环境中分离或纯化，或者其可以是重组的或合成的分子，例如重组蛋白或肽或合成的化学部分。分离的、纯化的或重组的抗原是基于该点上特别优选的配体。

可选择地，实际上是优选地，这样的配体也与编码它们的核酸相关，或者与分子标签的其他形式相关，以能够鉴定配体序列。当使用配体文库时，这一点特别重要，因为这时，优选地需要一个方便的方法以能够使结合于备选结合伴侣的配体的序列能够得到鉴定。使配体关联于编码它们的核酸的方法是众所周知的，并在本领域已有记载，且通过应用例如体外展示系统，如上文所讨论的核糖体展示或共价或非共价展示技术，例如顺式展示等可以方便地完成。可选择地，可以通过亲合连接的其它形式来介导这种关联，例如通过链亲合素-生物素连接。在该点上，配体文库成员的核酸可以连接有生物素分子标签，并被设计成编码链亲合素分子。当文库成员的蛋白被表达时，链亲合素分子就与DNA的生物素分子结合并导致被编码的蛋白和编码其的核酸的连接。

可选择地，这样的配体可以标记有DNA标签，例如不同长度的寡聚核苷酸或者特定的序列标签，随后其可以被解螺旋并用于鉴别配体，例如记载于Brenner等2000，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)97：1665-1670中。

如果配体是裸露的、单独的或纯化的分子而不是表达在细胞膜环境中的分子，则在用本发明方法筛选前它们通常附着于固相上。适合的固相是众所周知的并记载于该领域，且选择合适的固相用于本发明方法是本领域技术人员在正常的工作中所能作到的。但是对于配体所附着的固相优选是微粒和非磁性的，例如聚合物珠。在此处描述的可以在所述方法中使用的非磁性珠的一个例子是5μm的甲基丙烯酸缩水甘油酯微珠((Bangs Laboratories，印第安纳州Carmel))。因此，优选的配体是附着于微粒、非磁性的、固相上的多肽。当配体附着于固相时，固相通常被用于作为促进检测步骤的部分，和/或作为促进轻松的配体操作例如清洗步骤等的部分。为在用于捕获配体-表达文库成员复合体的固相中区别这些固相，可以将这些固相称为“配体结合固相”。

在配体是裸露的、单独的或纯化的分子的实施方案中，则可通过任何合适的方法将它们附着于或固定于合适的固相表面。实际上，将多肽或其它生物分子结合于固体支持物的所适合的方法是众所周知的，并记载于本领域。所述附着可以通过使用亲合相互作用方便地获得，例如多肽或其它配体被设计包含生物素分子，所述生物素分子可以附着于链亲合素包被珠，优选是非磁性的链亲合素珠，其可以由例如商业途径获得。

不论配体是细胞表面分子或附着在合适固相上的相应分子，所述配体包含报告部分或与其相关联，以检测本发明方法的配体。这样的报告部分优选是核酸分子，更优选为DNA分子，其可以通过以核酸为基础的方法进行检测。优选的检测方法是通过PCR，但是可以使用任何合适的方法，例如标记探针的杂交。可选择地，配体可附着于非磁性荧光珠，或附着于具有在显微镜下或通过Coulter Counter ZM(Coulter Electronics Ltd.)可以计数/检测的可辨识的尺寸的其它种类的珠。因此，可以发现这样的报告部分可以采以大量的不同形式，只要有可能检测所述报告部分即可。

这样的报告部分可以内在地与配体相关联。例如，如果配体是细胞表面分子，则要检测的报告部分优选是DNA分子，例如存在于在其上有配体表达或展示的细胞中(例如，对于细胞而言是内源的)的基因(即报告基因)。合适的或优选的报告部分因而是存在于所有细胞类型中的部分，例如管家基因，如β-actin(β-肌动蛋白基因)。

可选择地，外源性的报告部分可以与配体相关联。例如，就细胞来说，外源性的报告部分(例如报告基因)可以通过标准方法，例如转染，包括但不限于脂质转染、逆转录病毒系统或电穿孔法被介导入细胞中。

如果配体是裸露的分子，例如裸露的多肽，则可以通过本领域公知的并有记载的方法将其标记或与适合的报告部分相关联，举例来说，如果配体与它的编码核酸或另一个基于核酸的标签相关联，例如如上文所述，可以在核酸分子范围内便利地提供报告部分。如果配体是附着于微粒固相上的分子，例如多肽，则所述报告部分可以与多肽分开地附着于固相上，例如使用上文所描述地近似方法。特别是，如果使用链亲合素珠，则报告部分优选是生物素化的，包含可以促进报告部分检测的位点或区域的DNA片段，例如，能够使报告基因片段进行PCR扩增的引物位点或探针结合位点。这时每一个珠可以携带生物素化的报告部分和生物素化的多肽(或其它配体)的混合物。

因此可以发现在报告部分和配体之间的这种“关联”可以包括在报告部分和配体之间的直接相互作用，即报告部分和配体是相同分子的一部分，例如配体蛋白和报告部分彼此结合作为同样分子整体的一部分。可选择地，这种“关联”可以是间接的，例如报告部分可以附着于或被包含于配体所附着的部分，例如被包含在配体在其上表达或展示的细胞内，或者被固定于配体附着的固相上。

这样的报告部分优选是通常的与所有展示的配体相关联的报告部分，因此可以用做常规的反应物来检测任何和所有目的配体的存在(以及由此的备选结合伴侣的存在)。

用于此处的与术语“配体”联合使用的“一个或多个”是指一种或多种不同类型的配体，例如一个或多个不同的细胞表面分子或多肽。或者说本发明方法可以用于筛选针对一个配体或许多配体或配体文库(例如可以文库对文库的筛选具有特别的优势)的备选结合伴侣。如果在筛选中涉及到多于一个的目标配体，则它们可以附着于同样或不同的部分或与该部分相关联。例如可以发现如果目标配体是细胞表面分子，则针对大量不同的细胞表面分子的备选结合伴侣可以使用本发明方法进行鉴定。当然，如果需要，该操作可以偏向于选择针对特定细胞表面分子的备选结合伴侣，例如通过选择具有免疫决定性目标部分的细胞，或者是公知的细胞，或者被选择用于过量表达相关配体的细胞，或者被设计成过量表达该配体的细胞。在筛选反应中每一配体当然可以存在多个拷贝(实际上，这是优选的)，例如，如果配体是细胞表面分子，则它的多重拷贝优选地存在于相同的细胞内和/或相同类型或不同类型的多个细胞内。

使配体与表达文库接触的步骤可以在表达文库中合适的结合伴侣与存在的配体相互作用或结合的条件下采用任何合适的方式来完成，使表达文库与配体结合的步骤也一样。这样的条件通常根据表达文库、配体以及与配体相关联的部分的特性而变化。但是，本领域技术人员可以容易地确定促进结合的合适条件。这样一个“接触”步骤通常将发生在合适的溶液或水介质内。因此，如果配体存在于从哺乳动物受试对象例如哺乳动物器官或组织中获得的细胞上，或作为单层细胞培养的细胞上，则通常在与表达文库接触之前通过适当的技术收获或重悬于水介质中。

重要的是，发现可以在细菌表达介质中例如L Broth，以及标准的水介质例如PBS中完成接触步骤。这一点是重要的且令人惊奇，因为其意味着文库成员可以在细菌中表达(例如通过在细菌表达介质例如L Broth中培养它们)，并且从表达平板中直接挑取克隆，以用于本发明的筛选方法。优选地，在加入配体之前，但在文库成员的表达被诱导之后，这样的细菌表达介质与例如无菌水或其它合适的水介质一起被制成等渗的(例如大约140mM NaCl，(LB通常大约为171mMNaCl))。当配体是在活细胞而不是珠子上时，将细菌介质制成等渗性的步骤是特别优选的。

典型的“接触”条件可以包括在冰上或4℃孵育30分钟到4小时。但是可以根据配体、表达文库等的特性适当地变化。表达文库-配体混合物可选择地并优选地可以被温和摇动、混合或旋转。另外可以加入其它合适的试剂例如用以减少非特异性结合的阻断试剂。例如可以使用1-4％BSA或其它合适的阻断试剂(例如牛奶)。但是应该能够理解，接触条件可以由本领域技术人员根据筛选方法的目的进行改变或修正。例如如果孵育温度增加，如增加到室温，可以增加鉴别配体的不同亚类的结合物(binder)的可能性，例如与易于内在化的细胞表面蛋白的结合物。此外，对条件所做的如此修正属于本领域技术人员可以做到的范围之内。

接触步骤优选地在检测板的孔或其他适宜反应的空间或容器内进行。文库成员的一种类型(即表达文库的一个成员)方便地存在于每一孔内或容器内。但是文库成员的多种类型(即表达文库的多个成员)也存在于每一孔内或容器内(见下文详述)。

在本发明方法中(以及因此在接触步骤中)应用的表达文库的大小和复杂性可以根据接触步骤中所包括的目标配体的总拷贝数而变化。例如，本发明方法可以用于筛选达到500000个不同的成员的文库，或具有1×10⁶、1×10⁸或更多的成员的文库。用于筛选的文库优选具有1000到50000个成员，尽管本方法也可以明确地应用于筛选更小的文库，例如具有50到1000，或100到500个成员的文库。

配体拷贝的数量可以根据所存在的配体关联部分的数量改变而方便地改变，例如，当配体是细胞表面分子或附着于固体支持物上的分子时，则可以通过增加或减少在接触混合物中存在的细胞或固体支持物的数量来调节目标配体的数量。此外，可以通过反复实验容易地确定所需要的配体数量，但如果配体是细胞表面分子，则便利地使用5000到200000个细胞。实际上本发明筛选方法的优点在于操作的数量低至5000或1000个，即少于5000或1000个细胞(甚至更低，例如做为检测方法使用的PCR将潜在地能够检测单个细胞)筛选方法也足够敏感而起作用。基于该点，特别是当在衍生于哺乳动物受试对象，例如病人的细胞中筛选时，这样的细胞经常是稀有的资源并且不能大量获得。因此，能够在如此少量的细胞中完成筛选是一个重要优势。此处所附的例子显示在本发明的优选实施方案中，其中检测通过PCR并且表达文库是抗体文库时，只需要40pg的抗体就能够进行检测。这意味着本发明方法适合于根据表达水平非常低的配体分子来分离文库成员，例如当表达的分子少于1000个。

一旦配体与表达文库在使配体结合上一个或多个表达文库成员的条件下相接触，以该方式结合的配体则被捕获到固相上以帮助从反应混合物中的其它组分例如未结合配体中分离、去除或纯化。换句话说，在捕获步骤中，只有结合了表达文库成员的配体才可以被捕获到固相上去。

基于该点的优选的固相是帮助轻松操作和洗涤的微粒固相。磁性固相并且特别是磁性微粒/珠是特别优选的。为了使这些固相与可以附着配体的固相(如上文描述)相区别，这种固相可以被称为“捕获固相”。合适的磁珠可以从挪威Lillestrm的戴诺专业聚合物公司(DynoSpecialty Polymers AS)以及戴诺生物技术公司(DynalBiotech ASA)经商业途径获得。可以用于此处所描述方法的具体例子是从挪威戴诺生物技术公司获得的M-450，M-270或M-280珠。

配体-文库成员复合物可以通过任何合适的方法被捕获到固相上。根据本发明优选的方法包括固相上的捕获分子与伴侣分子或相关联于文库成员分子的标签的相互作用。这样，只有与表达文库成员结合的配体被捕获到固相上。如果需要，不与表达文库成员结合的所有配体可以通过一个或多个清洗固相的步骤，或简单地在捕获发生后通过从反应混合物中将固相分离出来而被移除。因此，可以发现通过表达文库成员而不是配体来促进捕获步骤，从剩余的反应物中分离固相将使得没有结合文库成员的配体被移除。

固相上的捕获分子和伴侣分子或表达文库成员中的标签的相互作用可以方便地以亲合作用为基础，尽管也可以使用其它合适的反应。例如，表达文库成员可以被设计为表达亲合反应的一个组分，并且其它组分可以通过任意手段附着于固相上。这样的亲合相互作用的优选的例子是抗体-抗原相互作用、链亲合素-生物素相互作用。

链亲合素包被珠可以通过商业途径获得，并且它们可以经共轭物的文库成员部分中的生物素分子的存在而用于捕获配体-文库成员共轭物。可选择地，如果表达文库是噬菌体文库，则通过使用在其上附着有抗噬菌体表面蛋白，例如抗gp8的抗体可以容易地完成捕获。可选择地，文库成员可以被设计为表达一个由促进与固相结合的亲合伴侣识别的标签。合适的标签的例子是可以各自被抗c-myc抗体(或其它适合的抗体)或金属离子(例如Ni²⁺)识别的c-myc(或其它抗原肽标签)或His标签，其可以反过来促进捕获到固相。

在抗体被用于协助捕获时，它们可以直接或间接附着于固相上，例如通过合适的二级或三级抗体例如抗IgG抗体。根据所使用的试剂可以以任何合适的方式实现捕获。因此抗体可以附着于固相，此时使固相与包括配体-文库成员复合物的混合物相接触。可选择地，在抗体结合于固相(例如通过二级抗体)以促进配体-文库成员的捕获之前，可以使抗体在反应混合物中结合至文库成员。实际上，这是本发明方法的一个优选实施例。本领域技术人员可以容易地根据温度和时间确定合适的捕获条件。但是典型的条件可以包括在室温或4℃孵育10分钟到2小时(取决于配体或文库成员的稳定性)，优选地伴以温和的摇晃、混合或旋转。为了促进配体-文库成员复合物的捕获，本领域技术人员可以容易地确定所包括的固相的量，或所包括的固相与配体的比率。

在筛选方法中的任何合适的步骤中可以进行一个或多个清洗步骤。例如如上所述，在步骤(b)之后可以进行清洗步骤(或至少是分离步骤)以为了移除没有与表达文库成员结合的配体。也可以在步骤(a)之后进行清洗与配体相关联的部分的一个或多个步骤(例如清洗与配体相关联的细胞或固相)，以移除没有与配体结合的表达文库成员。实际上，这样的清洗步骤是优选的。同样，在本方法进行期间以其它的合适的次数，对与配体相关联的部分或固相可以进行一个或多个清洗步骤，例如移除非结合单位。本领域技术人员可以容易地确定需要进行多少次清洗步骤。

可以通过直接检测配体或至少通过检测与配体相关联的单位(不是文库成员)来完成检测配体存在的步骤。该步骤提供了与现有技术的对比，现有技术通常是通过检测结合于配体的文库成员而不是检测配体来进行检测。

可以通过检测配体上或与配体相关联的报告部分的存在来方便的完成配体存在的检测(以及因此的配体-文库成员复合物的存在，因为非复合的配体应该通过捕获步骤被移除，因为其不与固相相结合)。上文讨论了合适的报告部分。如上文所述，所述报告部分通常存在于所有的配体上或与之相关联，即是所有配体的通用标签。因此，因为同样的报告部分都存在于每一配体上(或相之相关联)，阳性信号的存在说明配体-文库成员共轭物的存在，以及作为配体的备选结合伴侣的文库成员的存在。然而，应当注意的是如果报告部分存在在细胞中，即在配体是细胞表面分子的实施方案中，则在进行检测前，应该暴露所述分子，例如通过细胞裂解或其它破坏细胞的手段。

裂解/破坏细胞以暴露例如存在于细胞内核酸中的报告部分的合适方法是众所周知的，并被记载于本领域。在本发明涉及真核细胞的实施方案中使用的优选的裂解缓冲液包括蛋白酶K，其消化蛋白质并可以在检测步骤之前从DNA中去除组蛋白。在本发明方法中使用的裂解缓冲液也可以包括其它蛋白酶。

如上文所描述的，PCR是优选的检测方法。但是也可以使用报告部分检测的其它合适的方法，例如探针杂交、荧光珠、不同大小的珠子等(见上文)。优选PCR是因为该方法具有高度敏感性(应用PCR甚至一个配体(或细胞)也能检测出)，并且也因为其可以获得关于配体的信息，例如序列信息(例如如果配体与编码其的核酸相关联)，或者配体的识别(如果例如被DNA分子标记以能够进行配体的识别，例如标记上不同大小的DNA分子，或者标记上可以用于特异识别配体的具有特殊序列标签的DNA分子)。

PCR反应可以方便地在溶液中完成(尽管其也可以在固相上完成)，并且以标准方法检测PCR产物存在与否，例如在琼脂糖凝胶上(例如Invitrogen的E-gel 96系统可以在20-30分钟内分析96个样本)。通常在进行PCR(或其它检测步骤)之前，将样本很好地混合。

可以根据报告部分的序列采用公知的并记载于本领域的方法来选择用于扩增全部或部分报告部分的合适的PCR引物。如果检测孔或其它检测空间内的核酸含量是合适的，例如，如果配体由经合适的表达载体(其包含合适的报导部分)被转染入细胞的核酸所编码，或者配体与编码其的DNA相关联，则可以选择PCR引物以扩增编码配体的核酸序列以及报告部分。此点的优势是因为可以将PCR产物直接克隆入合适的载体进行测序，因此进行配体序列的识别。

通过PCR或其他方法检测到阳性信号表明需要对固相(捕获固相)做进一步的检测。例如如果在检测板的孔内溶液中完成PCR，阳性信号说明孔或有疑问的孔包含有至少一个潜在的配体结合伴侣，而需要进一步分析和检测。例如可以对存在于孔内的细菌克隆(或其它文库成员)进行完全筛选，例如通过细胞-ELISA以鉴别表达了配体的备选结合伴侣的克隆(文库成员)。

由PCR或其它方法产生的阳性信号可以通过与背景信号或已知的阴性信号的比较方便地确定。测定和比较所述阳性、背景和/或阴性信号的手段和方法对于本领域技术人员来说是公知的。

因此可以看出，在本发明的优选实施方案中，结合于表达文库成员的配体被捕获到微粒和磁性固相上，并且通过PCR完成检测步骤。在特别优选的实施方案中，配体是与细胞膜，特别是活的细胞膜相关联的细胞表面分子。

对比实验(参见实施例3)显示优选的方法比细胞-ELISA的标准方法具有更显著的高敏感性，其中在优选的方法中，细胞(特别是癌细胞)被scFv包被，附着于磁珠上，并且通过pCR检测配体。在细胞-ELISA的标准方法中，检测步骤是基于表达文库成员而不是配体的检测。在此处所定义的本发明方法(有时被定义为AffiSelect方法)需要比较少的细胞而产生高于背景的良好信号，并且该信号本身强于及好于细胞-ELISA所获得的信号。

本发明方法可以进一步包括其它的步骤。例如，如上文所简要地讨论的，表达文库可以被预淘洗以去除一些不需要的表达文库成员或减少文库的复杂性。所述预淘洗可以是阴性的淘洗步骤，其中在该方法的步骤(a)之前，表达文库与一个或多个不相关的单位接触。例如，表达文库可以用细胞或其膜部分预淘洗，所述细胞不表达或低水平地表达目的配体。例如，如果方法被设计用于鉴定结合于特定类型癌细胞上的表达文库成员，可以使表达文库成员与一个或多个不同或不相关的细胞类型，例如不同类型的肿瘤细胞或非肿瘤类型细胞例如淋巴细胞或内皮细胞或其它不相关的细胞相接触以进行预淘洗。所述阴性预淘洗步骤的目的是去除不结合相关配体的表达文库成员的部分。

可选择地，所述预淘洗步骤可以是阳性的预淘洗步骤，其中表达文库用目标配体淘洗/接触，以富集结合于目标配体的表达文库成员，并因此减少根据本发明方法进行筛选的文库的复杂性。可以在相同或不相同的相关或不相关的单位上进行一个或多个预淘洗步骤。

在本发明的阳性淘洗被用于富集表达文库的实施方案中，用目标配体进行合适轮次，优选是1、2、3或4轮的淘洗以为了富集表达文库并且减少待筛选文库的复杂性。可以使用任何合适的淘洗方法，例如使目标配体附着于固相并且在其上淘洗文库。但是优选的淘洗方法(特别是表达文库是噬菌体展示文库时)要在表达文库成员与目标配体结合的条件下，使发生表达文库与目标配体(例如细胞)的接触步骤，并随后应用在Giordano等(2001，自然医学(Nature Med.)，11：1249-1253)所描述的有机相分离的BRASIL方法的修正方法，以从结合了目标配体(例如结合了细胞)的噬菌体中分离游离噬菌体(在本文实施例5中描述了这样的修正方法)。这样的BRASIL修正方法包括，通过在有机相中从表达文库中未结合成员(例如未结合噬菌体)中分离结合于表达文库成员的目标配体之前，使目标配体(例如在细胞上)经历至少一次，优选是一、二或三次清洗步骤，因而从其它文库成员中分离所述目标配体的备选结合伴侣。如上文所述，在应用本发明方法筛选所富集的文库之前，可以进行一轮或多轮的淘洗(接触和分离)例如1、2、3或4轮的淘洗。

一旦根据本发明方法检测出作为配体的备选结合伴侣的一个或多个表达文库成员的存在时，可以对此进行进一步分析或应用。所述进一步分析可以包括对结合于配体的表达文库成员(即备选结合伴侣)和配体本身或者二者之一进行进一步的分析。因此本发明方法可以在多肽水平和核酸水平对新的表达文库成员(新结合伴侣)和新配体二者都可以筛选和鉴定，新配体例如新的细胞表面分子或蛋白质，诸如新抗原。

这样的进一步分析通常采取分析单个克隆的形式，所述单个克隆在本方法的步骤(c)中检测。本发明步骤(c)中的阳性信号说明，例如，在进行检测的分析孔或分析空间内含配体的一个或多个备选结合伴侣。便利地，通过返回到所述备选结合伴侣最初被挑选的样板并通过用标准方法分析样板中该位置上的克隆(文库成员)，将这些备选结合伴侣进行进一步的分析。因此备选结合伴侣可以便利地由配体独立地表达和产生。

例如，对于被编码的多肽相对较大的噬菌体展示文库或其它表达文库，如果需要，这样的分析包括将编码备选结合伴侣的DNA克隆入合适的使被编码的多肽以可溶解形式表达的表达系统中(如果需要，在将RNA文库成员逆转录为DNA的PCR之后)。如果例如要筛选的表达文库已经被包含在这样的表达系统中，例如使用细菌表达文库时，则无疑不需要该步骤。

一旦编码备选结合伴侣的DNA被克隆入合适的表达载体中，则可以对编码备选结合伴侣的DNA进行测序或者可以以可溶形式表达备选蛋白，并且对其进行合适的结合研究(应用配体作为靶目标)以在蛋白水平上进一步鉴定其特征。合适的结合研究应取决于备选结合伴侣和配体的性质，并且包括但不限于ELISA、过滤筛选分析、FACS或免疫荧光分析、BiaCore亲合测定或其它定量结合常数的方法、染色组织切片或细胞和其它免疫组织化学方法。文献中已经很好地建立了这样的方法，可以应用它们中的一个或多个分析备选结合蛋白。

对于肽文库而言，备选结合肽上关联的标签可以用于鉴定所选择的肽的序列，并且它们可以在体外合成，并如上文所述对其进行分析，或者编码肽的DNA序列可以被选定并被插入到合适的表达载体中，以及按上文所述对表达的肽进行分析。

作为阴性对照，备选结合伴侣也可以便利地依靠非配体进行筛选，例如不相关的细胞类型或在表面不表达配体或者低水平表达配体的细胞类型，或者不相关的裸露或纯化的分子，如果适宜的话。

在所有的这些方法中，通过使用识别在表达文库成员上的一些种类的标签或标记的试剂以帮助被结合的备选结合伴侣的检测。合适的标签和检测系统是公知的并记载于本领域。

在本发明的配体是未知分子的实施方案中，例如，未知的细胞表面分子，特别是未知的肿瘤细胞表面分子，则也可以容易地分析其特性，并且以应用由表达文库鉴定出的特异结合伴侣为工具鉴定配体。当结合伴侣是抗体分子，特别是scFv分子时，其尤其方便。例如，如上文所述，来自表达文库的这种结合伴侣通常被设计为包含可以帮助检测的标签或标志以及可以用于例如分析未知分子在组织中的分布，例如通过与组织切片的结合(Pereira等人，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，1997，203：11-24)。可选择地，结合伴侣可以被固定在固相上并被用于纯化未知的分子，例如通过亲合色谱法。一旦经过纯化，则未知分子的鉴定可以根据分子特性通过适当的检测而明确。例如，如果未知分子是蛋白，则可以通过肽测序或质谱分析对纯化蛋白进行鉴定，以及采用公知的并记载于本领域的方法通过克隆和DNA测序对其编码DNA进行鉴定。可选择地，可以通过用鉴定过的结合伴侣筛选cDNA文库使编码未知蛋白的DNA容易地得到鉴定。基于这一点，可以使用来自适当来源的高度分化的cDNA。但是，优选使用更小的、经限制性内切酶消化的cDNA文库。例如，如果未知蛋白表达于特殊类型细胞例如肿瘤细胞的表面，则可以由这些细胞方便地制备cDNA文库(例如cDNA展示文库如噬菌体展示文库)，并采用结合伴侣进行筛选(参见上文的Ridgway等人的例子)，例如通过淘洗位于被已鉴定的结合伴侣所附着的固体支持物上的展示文库进行。另外，如果从表达文库中鉴定出的结合伴侣是抗体，则为了分离和鉴定配体，可以进行其它基于抗体的检测，例如免疫沉淀、蛋白印迹、表达分布、免疫组织化学等。

因此，可以发现，本发明方法不仅仅可以用于从适当的表达文库中筛选和鉴定配体的结合伴侣，它们也可以应用于鉴定新的以及未知的配体。该点的重要性在于其可以进行鉴定用于治疗和诊断的新的细胞靶目标，以及潜在应用于治疗和诊断的新的因子，即结合伴侣。

因此本发明也提供了分离和/或鉴定未知配体，包括此处所定义的步骤(a)-(c)(以及可选择地额外的步骤)，(d)分离一个或多个结合于所述未知配体的表达文库成员，以及(e)使用所述文库成员分离和/或鉴定其所结合的配体。

在本发明的优选实施方案中，本发明AffiSelect方法，即此处所定义的方法，可以用于分离和鉴定未知配体。在该实施方案中，在本方法步骤(a)中使用的配体是表达于真核细胞(例如COS细胞)或其它合适的细胞中的配体文库(优选是cDNA文库，更优选是衍生于未知配体表达于其上的靶细胞)，并且表达文库是一个或多个未知配体的结合伴侣，优选是一个或多个抗体分子。

因此，在更进一步的方面，本发明提供了分离和/或鉴定未知配体的方法，该方法包括：

(a)使未知配体的一个或多个特异结合伴侣在溶液中与编码在细胞(优选是真核细胞)中表达的潜在配体的文库(优选是cDNA文库，更优选是衍生于未知配体表达于其上的靶细胞)相接触；

(b)将已经结合至一个或多个特异结合伴侣的配体捕获到固相上的；以及

(c)检测配体的存在，从而检测作为备选未知配体的一个或多个配体的存在。

根据在本文其它地方所描述的进行接触、捕获和检测步骤。特别优选的检测方法是PCR，优选是使用来源于配体文库载体序列(而不是例如管家基因)的引物，以直接扩增被特异结合伴侣识别的配体序列。PCR产物则可以被直接克隆入适当的载体以进行DNA测序和进一步鉴定编码蛋白。

因此本发明方法用于选择、鉴定或分离配体或实质上的新配体的结合伴侣，所述结合伴侣可以被分离、生产或制造以为了各种不同的下游用途。同样地，应用本发明方法鉴定和选择的结合伴侣/蛋白或配体构成了本发明的另一个方面。因此本发明另一个方面提供了筛选、鉴定和/或分离作为配体特异性结合伴侣的文库成员的方法，或者是筛选、鉴定和/或分离实质上源自表达文库的配体的方法，所述方法包括应用如上文所定义的步骤(a)-(c)(以及可选择地额外的步骤)以筛选展示一定特性的分子，以及可选择地(e)鉴定和/或分离作为配体特异性结合伴侣的相关文库成员，以及可选择地(f)应用所述文库成员以鉴定其所结合的配体的筛选表达文库的步骤。

一旦编码具有特定性质的结合伴侣或配体的适当的核酸片段得到鉴定，如果需要，可以对编码多肽的核酸进行亲合力成熟(affinitymaturation)，例如用进一步改进的特性尝试并鉴定结合伴侣。在重新筛选之前，可以通过实施任何常规的诱变，包括但不限于以可控制(例如定点诱变)或随机方式添加、删除和/或替代一个或多个核苷，错配PCR、结构域交换、盒式诱变和链改组等来进行这种亲合力成熟。

当应用本发明方法选择、鉴定、分离和/或纯化一个或多个结合伴侣时，可以生产出这些备选物、或组分、片段、变异株或其衍生物，并且如果需要，可以与至少一种制药学可接受的载体或赋形剂一起配制。本发明也包括如此生产的分子、或组分、片段、变异株或其衍生物。可选择地，这些分子可以采以编码所述蛋白质分子的核酸形式，核酸被依次整合入合适的表达载体和/或被包含在合适的宿主细胞中。因此，编码所述结合伴侣或配体的核酸分子、或包括所述核酸分子的表达载体构成了本发明的另一个方面。

一旦根据本发明，特定的结合伴侣或配体、或组分、片段、变异株或其衍生物经过选择、鉴定等，可以容易地应用(或适应于应用)编码所选择的结合伴侣或配体的表达载体，通过在适当的宿主细胞或系统内表达以及从宿主细胞或系统或生长的培养基或其上清液中分离结合伴侣来产生足够量的分子。可选择地，可以通过其它适当的方法例如通过化学合成编码结合分子的核酸以及在合适的宿主或体外转录系统中表达来产生所述结合伴侣或配体。

因此，根据上文所述的本发明方法，本发明在另一个方面提供了生产特异结合伴侣或配体的方法，所述方法包括鉴定或选择配体或本质上是配体的特异性结合伴侣，生产所述经鉴定的结合伴侣或配体、或组分、片段、变异株或其衍生物以及可选择地与至少一种制药学可接受的载体或赋形剂一起配制所述生产出的结合伴侣或配体的步骤。

所述结合伴侣或配体的变异株或衍生物包括类胨等价物(peptoidequivalents)、具有非肽合成主链的分子和相关于或衍生于最早被鉴定的多肽的多肽，其中，通过单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除对氨基酸序列进行修饰，其中可选择地或另外包括替代或添加经过化学修饰的氨基酸，例如去糖基化和糖基化。方便地，这种衍生物或变异株可以具有与其所衍生于的原始多肽至少60、70、80、90、95或99％的序列一致性。

当结合伴侣是抗体分子时，所述变异株或衍生物进一步包括抗体的一种形式到另一种形式的转化(例如从Fab转化为scFv，反之亦然，或在本文其它处所描述的抗体分子任何形式之间的转化)，或抗体分子转化为特定类型的抗体分子(例如抗体分子转化为IgG或其亚型，例如IgG1或IgG3，其是特别适合于治疗的抗体分子)。

所述变异株或衍生物进一步包括结合伴侣分子或配体与另外的功能组分的关联，所述另外的功能组分例如可以有益于所述结合伴侣或配体在下游的应用。例如结合伴侣或配体可以与将它们定位于机体内特定位点的组分，或有助于例如影象或其它诊断学应用可检测部分相关联。

无疑，这种结合了伴侣分子或配体的组分、片段、变异株或其衍生物的主要的必备条件是它们在其结合能力上保持了其原来的功能活性或者具有经改进的功能活性。

使用本发明方法经分离、检测、选择、鉴定或生产的结合伴侣分子(优选为抗体分子)或配体可以应用于需要具有配体特异性的结合伴侣(例如具有特定抗原特异性的抗体)的任何方法。因此，结合伴侣(优选是抗体分子)或配体可以作为分子工具使用，并且本发明在另一方面提供了包括本文所定义的这种结合伴侣分子或配体分子的试剂。另外，这种分子可以用于体内治疗或预防应用，体内或体外诊断应用或体外分析。

结合伴侣可以以从表达文库中分离出的形式或者被设计的形式或者被转换的形式应用于治疗性应用，例如根据需要将scFv分子转换为IgG或转换为多聚化肽。通过对显示出对配体的激动性或拮抗性结合的该治疗性分子诱导生物活性，例如诱导凋亡(例如癌细胞或病毒感染的细胞)，抑制生长或通过阻断天然配体的结合而刺激从基质中的分离(因而抑制肿瘤的生长和/或扩散)，可以实现治疗效果。由于配体本身，或其多聚物的特性(一些受体通过被交联而被激活)，可以实现这种治疗效果。

当经选择或鉴定等的结合伴侣是抗体多肽，则它们可以应用于体内治疗或预防性应用，例如赋予具体的易感性个体(例如免疫缺陷病人、儿童、孕妇的胎儿、地方病区域的人)以被动免疫。例如如果抗体能够中和与感染或疾病相关的因子，则它们可以被应用与适当的对象以抵抗疾病。可选择地，抗体(或其它形式的结合伴侣)可以附着于其它具有治疗效应的分子，例如附着于细胞毒性因子(小分子或蛋白)、前毒素(pre-toxin)或其它药物，并且被定位于疾病组织或特定的细胞类型，例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。通过设计使该因子具有其它可以应用的功能，例如将scFv转换为Ig后，产生结合例如肿瘤细胞和杀伤细胞的双特异性分子，赋予其刺激巨噬细胞、补体或细胞毒性T细胞的能力，可以实现其它的治疗性效果。

可选择地，这种抗体(或实际上是相互作用于与特定组织或机体位点，或者细胞类型例如肿瘤细胞或病毒感染细胞结合的配体的其它类型的多肽)可以被标签结合，例如，染料、荧光素或放射性标记或酶的可检测性标志，并通过例如成像或标准的免疫组织化学操作应用于体外或体内诊断。其它优选的应用包括治疗性诊断(即应用于诊断和治疗两方面的抗体或结合伴侣)。另外，这种抗体分子或其它结合伴侣可以在分离配体的亲合色谱操作中应用。

特别是，细胞表面表达蛋白的抗体提供了用于成功开发新的诊断和治疗药物的，经过详细描述的出发点。这在癌症领域尤其如此，其中对特异性细胞表面标志以及与其结合的抗体的认识在药物开发领域无疑是一个瓶颈，并且本发明方法可以应用于鉴别或选择新的细胞表面标志(配体)和抗体(结合伴侣)。目前，只有非常有限数量的细胞表面表达的肿瘤相关或肿瘤特异性决定簇是已知的。因此，这种类型的每一个新的决定簇，以及当然与它们结合的特异性抗体，都将开启在肿瘤治疗上的新的可能性。可能的应用范围包括从用于基于ADCC的治疗的裸露的整个IgG抗体产物，重组寡-特异性(oligo-specific)/寡-价(oligo-valent)的结构成分，到融合蛋白免疫毒素和用于组织特异性和靶向治疗的放射性标记抗体片段，以及用于体内和体外诊断的染料或放射性耦合的抗体。

配体或其片段可以被作为疫苗使用，特别是作为治疗癌症和感染性疾病的疫苗使用(当然取决于所讨论的配体)。配体可以作为激动剂或拮抗剂的靶目标，其采以肽、蛋白或小分子药物的形式，可以例如阻断或诱导类似凋亡或调节细胞生长的功能。配体也可以作为进一步筛选的靶目标使用，以鉴定甚至更多的能够实施上文描写的某些内容的分子。在一些情况下，配体或其片段也可以对其本身具有某些作用，如与天然结合于其的分子的竞争性结合。

如果需要这样的应用，对抗体分子进行合适和恰当的修正，例如转化为用于治疗的IgG1或IgG3类，整合或添加用于成像的标签等，是本领域技术人员公知的。

使用由本领域技术人员能够设计的适当检测可以容易地鉴定用于上文描述的各种应用的最合适的抗体。例如，在一些应用中，其中抗体或结合伴侣的高亲和力或亲合力是重要的，使用标准的检测技术(例如Biacore检测)可以容易地在备选抗体中检测出这些标准。另外，当抗特定感染因子例如细菌、病毒等的抗体经过鉴定时，可以进行适当的检测以评价哪些抗体是中和感染因子的最有效抗体。例如，对于细菌，可以评价对细菌的杀菌和调理噬菌细胞(opsonophagocytic)活性。相似地，对于病毒，可以进行毒力中和研究以鉴定出最好的备选物。

因而本发明在另一个方面提供了使用本文所描述的抗体表达文库以分离、检测、鉴定、选择或生产一种或多种特异结合于一种或多种靶抗原例如一种或多种与特殊疾病、细胞、组织或外来因子相关联的靶抗原的抗体分子。例如可以通过用靶抗原筛选抗体表达文库来进行。

本发明在另一个方面提供了这样的经分离、检测、鉴定、选择或生产的抗体分子(或其它结合伴侣)或配体，以用于治疗或体内诊断或上文所提及的任何其它应用。也涵盖了这种抗体分子(或其它结合伴侣)或配体在生产用于治疗(特别是癌症或感染性疾病的治疗)或体内诊断或上文所提及的任何其它应用中的药物或组合物中的应用。也提供了治疗病人的方法，所述方法包括这种抗体分子(或其它结合伴侣)或配体的适宜剂量的给药。

当在上文所描述的应用和方法中使用所述抗体分子(或其它结合伴侣)或配体时，则对它们可以任何适当的方式用药。例如这种抗体分子(或其它结合伴侣)或配体可以局部用药于需要作用的位点或者可以被单位附着或其它结合，所述单位可以促进抗体分子(或其它结合伴侣)或配体对体内适当位置的定向。

包括如此处限定的抗体分子(或其它结合伴侣)或配体与一种或多种制药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物一起构成了本发明的另一个方面。

另一个方面是病人的诊断或成像方法，所述方法包括对病人用以合适剂量的根据本文所定义的抗体分子(或其它结合伴侣)或配体，以及检测病人中抗体分子的存在、位置和/或数量。

从本发明表达文库中经鉴定、选择等的抗体分子(或其它结合伴侣)或配体可以同样地应用于在体外进行的诊断方法，如果适当，例如可以在获得于或衍生于病人的组织样本或其它类型的样本如血液上进行诊断。

进行治疗或诊断等的优选疾病是癌症、由感染因子引起的感染性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病或退行性疾病。

本文所使用的术语“治疗”(therapy)或“处理”(treatment)包括预防性治疗。术语“治疗”或“处理”包括抗击疾病或治愈疾病或感染，也包括控制或减轻疾病或感染或者与其相关的症状。

本发明方法也可以应用于大规模筛选，即可以用于同时筛选具有达到500000不同成员的表达文库，或是具有1×10⁶或更多成员的文库。方便于这种大规模筛选的是，表达文库可以以位于诸如过滤器或平板的固体支持物上的细菌菌落的形式，和/或在一个或多个检测板(例如，一个或多个384孔或96孔的检测板)内的单个孔内生长的菌落形式提供。例如应用本领域技术人员所公知的方法在过滤器上可以容易地生长30000到300000个菌落，接着可以挑选这些菌落(或者其亚群)并转移到检测板上，此时菌落可以进一步在悬浮液中生长，接着进行诱导或其它的处理，以在多肽水平上表达文库成员，供根据本发明方法的筛选备用。如果文库成员被内在表达，即表达文库不是展示文库，则还需要裂解细胞例如细菌细胞，以能够得到表达文库成员并能够用于筛选。

可以将一个菌落(或一个表达文库成员)挑选到检测板的一个孔内(或其它适当的检测空间)或其可以存在于检测板的一个孔内，并且实际上通常需要的是取得的检测板在每一个孔内只有一个单菌落(单个文库成员)以简化下游的重筛选程序。但是，为了促进大规模的筛选，可以挑选多个菌落(或多个表达文库成员)到检测板的相同的孔内(或其它适当的检测空间)或其可以存在于检测板的相同的孔内，并且多个文库成员可以在检测板的相同的孔内表达。例如可以将达100、300、500或1000个菌落的细菌集中于检测板的一个孔内并诱导以表达文库成员。裂解后，如果需要的话，根据本发明可以使表达文库准备与配体接触。可选择地，并优选地，当菌落位于单个孔内并且在文库成员被集中于同一孔内之前，可以进行文库成员的表达和裂解(如果需要)。其是优选的是因为同一孔内的扩增和表达多个菌落可以导致潜在的问题，例如，如果存在优势文库成员或毒性的文库成员。

当在同一孔内存在多个菌落时，适宜地最好是将来自整个检测板或滤器的限定区域的菌落放入单个孔内。例如可以挑选单个细菌菌落，并在384孔板内(例如90-100个板产生35,000-38,000个菌落)生长和对其诱导(可选择地裂解)。从每一个孔内取1-3μl具有被表达多肽的细菌培养液(其随后可以被裂解)或细胞质裂解液并从其它孔内等体积地集中于96深孔板中的一单个深孔内(集中后体积为768μl)。可以对其它的384孔板进行重复这样的操作，最后形成384×96个克隆(36,864个)以在一块单个的96深孔板内进行分析。实际上实施例显示了如何能够在384个被集中的孔中间检测出单个的阳性孔。另外可以观察出本方法可以容易地扩展到在相对短的时间内(1-2周)筛选出～370000(384×96×10)个不同的菌落。

应当注意的是在本发明实施方案中没有涉及到使用细菌菌落进行表达，例如，当表达文库是体外展示文库例如核糖体或共价或非共价展示文库时，适用的原理相同，即，单个文库成员理想地存在检测板中的单个孔内，其可以作为单个菌落被诱导和筛选，或者可以被诱导并被汇集用于筛选，或者被汇集再进行诱导用于筛选。

根据特定的表达文库的性质来确定适当的诱导/表达和裂解方法以获得用于筛选的可溶性/不可溶性蛋白，并且所述方法是公知的并记载于本领域中。例如Relay^TM 96蛋白筛选系统(Invitrogen)是特别适合使用的96孔或384孔的规格，因为其可以在30分钟内从相同的样本内提取出可溶性蛋白(以及，如果需要，非可溶性蛋白)。

一旦表达文库位于用于检测的适合的规格中，例如已经被分入检测板中的多个孔内，并且多肽以可以进行结合的这种形式被表达，就在适宜的条件下使表达文库与本文其它处所描述的一个或多个配体相接触，以促进表达文库的多肽与配体之间的结合。

在孔内的表达文库与适当的配体在适当的条件下接触，以及如本文其它处所描述的在孔内固相上捕获配体-表达文库复合物，例如用磁珠后，可以在孔内进行报告部分的PCR以评估潜在的阳性。一个96孔的一个阳性信号意味着在384个克隆里至少有一个阳性。这些克隆(相应于一个384孔板)必须进行重新分析(亚筛选)。但是，其将潜在的克隆数从36,864减少到了384。

图7示意性地示出了本方法更小规模的形式，其中在96孔板的每一个孔内集中10-100个克隆，因此每一个96孔板可以筛选1000-10000个克隆。在该特定实施例中(尽管应该理解该方法可以被普及推广)，scFv诱导/裂解培养液被制成等渗的并转移至每孔具有50000个癌细胞的96孔板内。所述细胞在4℃用scFv包被1小时。加入针对scFv标签的抗体的包被磁珠并分离珠-细胞复合物。如果有一些抗体结合于细胞，将分离出相关的癌细胞，并通过PCR检测。因此阳性的PCR信号鉴定出一个小集合的scFv备选物(10-100)以进行进一步的研究。如下文更为详细的描述，根据需要筛选的菌落数(即要筛选的表达文库的大小)，以及可选择地对表达文库中存在的可能的阳性数的估计来选择本方法的适当规模。

本发明在另一个方面提供了筛选分子文库以鉴定和/或选择其中的一个或多个作为一个或多个配体的备选结合伴侣的成员，其包括：

(i)在检测板的单个孔(或其它适合的检测空间)内集中大量的、能够表达表达文库成员的细菌克隆，或集中大量的、已经由大量细菌克隆产生的表达文库成员；

(ii)如果在步骤(i)中集中了大量的细菌克隆，诱导细菌克隆以表达所述的表达文库成员；

(iii)使所述的表达文库成员与一个或多个配体接触；

(iv)确定在其中一个或多个的表达文库成员已经与配体结合的阳性检测孔(或其它适合的检测空间)；

(v)如需要，对存在于阳性检测孔(或其它适合的检测空间)内的克隆进行选择性展开(selective expansion)，并重复步骤(iii)和(iv)；

(vi)鉴定表达了所述配体的结合伴侣的一个或多个细菌克隆。

这种筛选方法(其也可以称为交叉筛选)特别适合于筛选包括非常少的百分比的阳性克隆的文库，如下文所进行的详细描述，集中(也可以称为“压缩”)和选择性展开的方法可以方便地用于筛选达约2,000,000个细菌克隆以及可能该数目的10倍。

在本方法中应用的表达文库可以是如本文其它处所描述的任意蛋白表达文库，优选地，表达文库是抗体表达文库，更优选地是scFv文库。在该方面的方法中，优选地是对已经表达的文库成员进行集中(压缩)。

优选地，可以根据上文所描述的本发明方法步骤(b)和(c)来进行确定步骤，即通过将已经结合于一个或多个表达文库成员的配体捕获在固相上，并检测配体的存在，从而检测一个或多个作为配体的备选结合伴侣的表达文库成员的存在。因此可以发现，本方法提供了示范方法，通过该方法，可以进行上文所讨论的步骤(a)至(c)中定义的筛选方法(即AffiSelect方法)。如果使用上文所描述的步骤(b)和(c)，则所有的优选实施方案以及上文关于实施这些步骤的详细描述可以相同地应用上文的包括集中细菌菌落或表达文库成员的筛选方法。

但是该筛选方法不限于根据上文所描述的由步骤(a)到(c)所定义的包括固相捕获和配体检测的筛选方法，而是筛选大量的表达可溶性多肽的细菌菌落的通用方法。因此所述确定步骤可以包括用以检测表达文库成员与配体的结合的任何适当的方法，例如，使用其它检测方法例如Biacore，ELISA，FMAT(使用8200检测系统-AppliedBiosystems)。

选择性展开步骤(v)通常包括将存在于阳性检测孔(空间)内的克隆以更少压缩(更少地集中)的形式重新平铺，例如铺入更多数量的检测孔(空间)内。优选地，所述扩增步骤使得每一克隆存在于一单个检测孔(空间)中。通过返回到阳性孔克隆的最初源头(集中前、压缩前)并将这些克隆以更少压缩形式重新平铺而实施这种选择性展开步骤。

待进行的选择性展开步骤(v)(以及步骤(iii)和(iv)的重复)的次数，如果有的话，可以由本领域技术人员容易地确定。例如一直进行这种步骤直到每一个克隆存在于单个的检测孔内以有助于使鉴定步骤(vi)更为容易。

通过返回到阳性孔克隆的最初源头(集中前、压缩前)可以方便地实施鉴定步骤(vi)(参见例如图9D的交叉点孔)，并使用根据本文其它处所描述的标准方法进行单克隆分析以在核酸和蛋白水平上鉴定结合伴侣。

在本发明筛选方法的方面，要被集中和筛选的细菌克隆(或者产生要被集中和筛选的表达文库成员的细菌克隆)可以衍生于任何适当的来源，但是适宜地其最初作为细菌融合层的部分而存在，或者是位于平板或滤器上的单独的细菌菌落。可选择地，如果要被筛选的菌落数目相对较少，则这些菌落可以存在于适当的检测板的单独的孔内。如果克隆在平板或滤器上作为融合层或单独的菌落生长，则使用适当的自动控制技术(例如Qpix)或手工方便地挑选要检测的克隆。

作为具体的实施例，如果使用细菌融合层，自动挑选头的针可以挑取5-50个菌落，然后所述菌落可以被转移到适当的检测板如96孔或384孔检测板的单个孔内。通过转移克隆并在384-孔板的单个孔内对其扩增，有可能对每个384-板同时筛选3,800-19,000个克隆。应用例如一百至二百个384-孔板，有可能筛选达四百万个克隆。

使用这些384孔板作为细菌菌落的来源，通过将来自单个384孔板中每个孔的克隆集中于96孔板的一单个孔内，可以将这些克隆集中(压缩)在1-2个单个96深孔板而实施本方法步骤(i)(图8)。这时再进行本方法步骤(ii)到(vi)。由本方法步骤(iv)确定的阳性孔相当于～19,000个克隆或一个特定的384孔板。这时可以根据图9G所描述的对该特定的384孔板进行交叉筛选(通过行和列的选择性压缩(其在具体的实施例中是选择性展开)，以及通过实施权利要求的方法(该方法也需要重新筛选交叉点上的6个孔)的步骤(iii)和(iv)进行的亚筛选)。在鉴定了384孔板的单个孔后，仍然需要筛选～50个克隆。可以通过将孔内的细菌全部铺于平板上并对单个挑选的克隆进行另一轮的亚筛选而进行最后部分的筛选。筛选1×10⁶个克隆需要的时间量将是约1-2周。

为了确定实施筛选方法的最有效方式，则优选地实施预筛选步骤以评估阳性克隆的百分比。这可以通过任何适当的方法进行。但是这可以通过将随机选择的克隆集中例如通过在一个检测孔内集中10,100或达约100 000个克隆，并实施预测击中率的AffiSelect方法(如本文描述)，而便利地进行。

如果阳性百分比低至0.0001％(或每1,000,000-1×10⁶个菌落有1个克隆)或甚至更低，则上文所描述的将来自每一块板的每一个孔的所有384个样本集中的方法(按照图8所描述的)是适当的。例如从细菌融合层采集1-2百万个克隆样本，并在384孔板内诱导(每一孔包括约50个细菌，100×384个板)。这时每一个384-板被压缩入深孔板内的一个单孔内，并用PCR和磁珠针对目标进行检测。根据上文描述并参见图9G，对阳性区(包括大约20000个克隆)进行再次展开及亚筛选，即通过集中2行3列(需要重新筛选位于交叉点的6个位置)以最后鉴定单个孔的50个克隆，其可以被单个铺板并筛选。

对于0.01％至0.1％的阳性率(或更低)，理想地筛选几块384板，集中图9G所描述的每第2行和第3列。

对于0.1-3％的阳性率，最好是通过集中单行和单列(16+24)筛选整个384板。此举可以避免重筛选。但是，如果384板来源于10⁶克隆的较大的筛选，384-板的每个孔内包括更多的克隆，需要重新铺板以鉴定单个克隆。

对于0.5％至3％的阳性率，更为方便的办法是集中96孔板上所有的行和列(如图9的板(A)-(C)所描述的)到20个检测位置。

对于2-10％的阳性率，筛选如图9的板(F)中的小区域是可取的。例如，将一个96孔筛选板划分为8个区，每个区包括7行和列，从而将待检测的备选物的数目压缩到56个。

对于大于10％的阳性率，所有的克隆都应该被单独筛选而不进行任何压缩。

如上文所提示的，实施接触和确定步骤的优选方法基本与本文其它地方所描述的方法相同。例如，真核细胞和抗原(配体)用表达并分泌于细菌培养基中的scFv包被(1-2小时)。洗涤配体(细胞或DNA标记的抗原)并加入抗cMyc-标签的抗体(二级抗体)，所述cMyc-标签表达于scFv上。使用具有标签定向的抗体(cMyc)的磁珠，仅在scFv结合靶目标时，用磁珠分离和纯化scFv和配体(真核细胞或DNA标记的抗原)两者的复合物。如果没有scFv结合靶目标，将分离不到复合物，PCR将是阴性的。但是如果有没被洗去的单个的阳性scFv(在达约20,000个其它的scFv之间)，则scFv-靶目标复合物的PCR产物将包括DNA，具有阳性扩增结果。真核细胞管家基因的PCR是一个指征，其显示在表达结合至抗原的scFv的孔中一定存在一些抗体。一个96孔的阳性信号提示在384个克隆中一定有至少一个阳性克隆。必须对这些克隆(对应于一个384-板)进行重新分析(亚筛选)。

附图说明

本发明将参考以下附图在下列的非限制性实施例中对本发明进行更为详尽的描述，附图显示：

图1：在溶液中，对结合至PM-1细胞的鼠IgG Moc31的捕获和检测。本图显示PM-1细胞β-肌动蛋白基因片段PCR产物的2％琼脂糖凝胶分析-用Moc31包被细胞及磁富集后的最后步骤。应用50,000个PM-1细胞和50μl PBS中3％BSA的捕获体积，震荡器上4℃30分钟，使珠∶细胞的比率保持在10∶1。

图2：在PBS/3％BSA或在等渗的细菌表达培养液中对结合至PM-1细胞的鼠IgG Moc31的捕获和检测。本图显示PM-1细胞β-肌动蛋白基因片段PCR产物的2％琼脂糖凝胶分析-如图1所描述，用Moc31包被细胞及磁富集后的最后步骤。将Moc31加入到3％BSA/PBS或表达/裂解培养液(含有100μM的IPTG、100μg/ml的氨苄青霉素和2mg/ml溶菌酶的LB培养液用无菌水和加入的0.3％BSA制成等渗溶液(～140mM NaCl))中。

图3：在PBS/3％BSA中携带不同的抗A-549细胞表面决定簇的scFv的M13噬菌体的捕获和检测。本图显示A-549细胞β-肌动蛋白基因片段PCR产物的凝胶分析(2％琼脂糖)。这是依次用M-13噬菌体和抗gp8抗体(1∶1000)包被A-549细胞并洗涤，以及用固定在Dynabeads M-450上Pan鼠IgG捕获复合体之后的最后步骤。也可以将作为阳性对照的MHC I类抗体(MHC C1.I阳性对照，1∶25)加入到细胞中或不加任何抗体(PBS BSA阴性对照)。另外，使用阳性(β-肌动蛋白基因)和阴性(无DNA)PCR对照。

图4：降低A-549细胞的数量，所述A-549细胞可以用于抗细胞表面决定簇的scFv抗体的间接检测。本图显示A-549细胞β-肌动蛋白基因片段PCR产物的凝胶分析(2％琼脂糖)。这是依次用scFv和抗-cMyc抗体包被和洗涤A-549细胞(从1,000达至100,000个细胞)，以及用Pan鼠IgG Dynabead捕获包被的A-549细胞之后的最后步骤。在本实验中，PhOx scFv是阴性对照抗体，而不应与细胞结合。

图5：比较细胞-ELISA和AffiSelect。图的上部分显示A-549细胞β-肌动蛋白基因片段PCR产物的凝胶分析(2％琼脂糖)(AffiSelect)。这是依次用scFv和抗-cMyc抗体包被，洗涤A-549细胞(100,000个细胞)，以及用Pan鼠IgG Dynabead捕获包被的A-549细胞之后的最后步骤。图的下部分是同样克隆(方法)的细胞ELISA结果，但是是200,000个细胞。

图6：用AffiSelect检测结合至A-549细胞的加标(spiked)的scFv抗体。本图显示A-549细胞β-肌动蛋白基因片段PCR产物的凝胶分析(2％琼脂糖)(AffiSelect)。这是依次用scFv和抗-cMyc抗体包被和洗涤A-549细胞(100,000个细胞)，以及用Pan鼠IgG Dynabead捕获包被的A-549细胞之后的最后步骤。如图所示，在捕获过程中使用不同的珠∶细胞的比率，从10∶1到30∶1。标记为“加标”的样本包含比率为1∶384的阳性对照scFv A(′A′；2μl)和阴性对照PhOx(768μl)，并经超纯水(Milli Q water)校正以达到等渗条件。还示出了捕获体积(珠+细胞的体积)。

图7：筛选抗真核细胞的scFv克隆的本发明方法的示意图。

图8：大量克隆进入384-孔的交叉筛选。(具有低的阳性击中率的文库：1/500,000或1/1,000,000)。本图显示了克隆的选择性压缩和展开。从96×384板取样进入一单个的96深孔板使能够取样18,000,000个克隆。检测板的阳性孔相应于～19,000克隆或一特定的384-板。必须对该板进行根据图9G所描述的交叉筛选(通过行和列的选择压缩)。在鉴定了384板的单个孔后，仍然有～50个克隆需要筛选。通过将孔内的所有细菌铺板并对单个挑选的菌落进行另一轮亚筛选以进行筛选的最后部分。筛选10⁶个克隆的时间量大约是1-2周。

图9：96和384孔板的交叉筛选。(A)从筛选板的A行的每个孔采小体积样本(1-5μl)集中于检测板的单个孔(A1)上。(B)如(A)所示，类似地集中所有的A-H行小体积样本。筛选板的8行可以由检测板的8个孔代表。(C)将筛选板的12个不同的列项集中于检测板的12个单独的孔内(孔A2-H2和A3-D3)。(D)为鉴定筛选板上的克隆，检测板在第3行和第6行显示了2个阳性位置以及第11列显示了1个阳性位置(即孔C1、F1和C3为阳性)，在筛选板鉴定了两个真阳性(见孔C11和F11)。但是，如(E)所描述的具有更多的阳性，筛选板也显示了假阳性(见孔C2、C11、E5、E11、F2和F5)，使得必须对所有的备选物进行亚筛选以挑选出正确的阳性克隆。在这种情况下，最好如(F)所描述筛选检测板的8个区。每一区的(4)行和(3)列可以各自被集中于检测板的7个孔内，最后，在(G)中描述了筛选通过集中行和列而成的384-孔板。但是这需要对中间(交叉点)的6个位置进行重筛选。

图10显示了使用有机相离心(org，修正的BRASIL)和植物凝血素包被的磁珠(珠子)，经过1-4轮(R1-R4)的淘洗后用稀释噬菌体对肺癌细胞系A-549进行的多克隆噬菌体ELISA。

图11显示了AffiSelect PCR结果的例子，其结果显示出在被检测的scFv表达物与细胞(A-549，HUVEC和PBL)结合时，扩增出的β-肌动蛋白基因DNA。在三种细胞类型中都显示了相同的scFv表达样本的结果(以同样的顺序)。箭头注明了scFv表达样本，其显示出肿瘤特异性的DNA扩增。

图12显示了经过2次洗涤和有机相离心的淘洗后所发现的一个scFv的FACS结果。在与淘洗和预淘洗步骤中所使用的同样的细胞类型上检测scFv(A-549，HUVEC和PBL)。

具体实施方式

实施例1：

应用免疫磁性分离和细胞报告基因的PCR对与真核细胞配体的表面决定簇结合的mAb(单克隆抗体)、scFv和噬菌体(文库成员)进行的捕获和检测。

摘要：

本实施例阐明了选择和检测过程。用mAb、scFv或噬菌体(亲合成员)包被真核细胞A-549(Viventia，Inc.惠赠，ATCC CCL-185)，或真核细胞PM-1(Norwegian Radium医院惠赠)(具有细胞表面配体)。如果亲合成员正在结合细胞表面配体，可以由亲合成员产生连接部分，使得易于捕获、检测和亲合成员连接的配体。对被检测的所有亲合成员都显示了这种情况。

材料与方法：

结合于38kDa的跨膜EGP-2上皮细胞粘附分子(De Leij，L.，Helfrich，W.，Stein，R.，和Mattes，M.J.(1994)SCLC-簇-2抗体检测pancarcinoma/上皮糖蛋白EGP-2(SCLC-cluster-2 antibodies detect thepancarcinoma/epithelial glycoprotein EGP-2)国际肿瘤杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl)，8，60-63.)的鼠Moc-31抗体，由Norwegian Radium医院惠赠。鼠抗人HLA-ABC(MHC 1类)购自Dako，蛋白酶K、BSA(第五组分)、吐温20和NP-40购自Sigma。蛋白酶K储备溶液由在50mM Tris-HCl pH 8.0中加入1.5mM CaCl₂至20mg/ml的浓度制备并等分储存于-20℃。用无菌超纯化(Milli Q)水配制所有溶液，并且所有溶液通过高压灭菌或0.22μm的过滤而被无菌化。

用Bürker血球计数仪对真核的人乳腺癌细胞系PM-1进行计数并用具有3％BSA的PBS调整至3.2.×10⁶个细胞/ml。用3％BSA洗涤细胞，并在Greiner 96孔U-板内以400-500×g离心5分钟，每孔含50,000-100,000个PM-1细胞。将PBS/3％BSA中的一抗(与细胞决定簇结合)加入细胞中(100μl的体积)，并在Heidolph Umimax 1010板震荡器上以280rpm震荡以避免沉淀在4℃孵育60分钟。之后以200μl PBS/3％BSA洗涤细胞两次。如果一抗也含标签(例如具有cMyc和His₆标签的scFv抗体)，则在PBS/3％BSA中稀释二抗并加入细胞，并根据上文另外孵育60分钟(例如，鼠抗cmyc(Invitrogen，1∶500)或鼠抗-His(Invitrogen，1∶500))。如果用展示不同的抗细胞表面决定簇(A-549细胞)的scFv抗体的M13噬菌体与细胞一起孵育，则连接部分是鼠抗gp8抗体。这些抗体与噬菌体表面的M13噬菌体gp8蛋白相结合。加入一抗和/或二抗并用3％PBS/BSA洗涤细胞2次之后，加入用Pan鼠IgG包被的顺磁性的Dynalbeads M-450珠(500,000)(戴诺生物技术，奥斯陆)，并在平板震荡器上(400rpm，4℃)孵育20-30分钟。使用磁分离将配体/在其表面具有亲合成员的细胞捕获在Dynalbeads上，并且在PBS/BSA中洗涤3次洗去未结合的配体。蛋白酶K裂解缓冲液(30μl)加入到细胞-珠玫瑰花结中(由1×DynazymeII PCR反应缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.8，1.5mM MgCl₂，50mMKCl和0.15 Triton X-100)加入0.45％(v/v)NP-40，0.45％(v/v)吐温20和200μg/ml蛋白酶K)。样本在位于Eppendorf Mastercycler梯度PCR仪上的密封的(Eppendorf′Pierce it lite′foil)96孔PCR板内在55℃孵育至少60分钟，但通常是55℃过夜，之后经95℃30分钟以灭活酶。

为了通过检测PM-1细胞检测配体，进行PCR。从MWG Biotech购得扩增真核细胞管家基因β-肌动蛋白基因的短区域(～400bp)的引物：β-act正向，caagagatggccacggctgct，和β-act反向，tccttctgcatcctgtcggca。Dynazyme II聚合酶(每个反应0.8U，Finnzymes)与其10×缓冲液一起使用。通常，每个反应使用5μl的模板(蛋白酶K处理的细胞)，在30μl的反应中使用200μM dNTP混合物(Fermentas)和77μM引物。使用PCR仪运行常规的Taq聚合酶PCR程序(上文所提及的)：开始94℃5分钟，接着35个循环94℃(1分钟)，66℃(1分钟)和72℃(1分钟)，以72℃(5分钟)和4℃(储存)结束。将样本放入2％琼脂糖凝胶中用电泳分析产物。

结果/讨论：

用Moc-31抗体或抗人HLA-ABC包被PM-1细胞。图1显示了用不同量的Moc-31 IgG抗体包被的PM-1细胞。即使低到0.1ng的IgG加入到细胞中，也有信号(PCR的条带位于400bp)。这相当于40pg的scFv抗体或浓度在0.8μg/L时的大肠杆菌表达培养物的50μl。此外，这相当于每个PM-1细胞16,000个Moc31分子的密度。从相应的HLA-ABC试验记录到的数据显示了同样的结果(数据未示出)。这些试验清晰地显示出可以用抗体包被细胞以为了用PCR间接检测IgG连接部分(模拟亲合成员)。只有在细胞和珠之间存在连接，才可以分离细胞并用PCR检测它们的存在。

为了检测是否能在细菌表达培养液中用抗体包被PM-1真核细胞，还实施了另一个实验。为了使用细菌表达培养液，其必须用无菌水制成等渗的(等渗的PBS包含138mM NaCl，而LB肉汤细菌表达培养液具有较高的NaCl浓度(171mM))。检测PM-1细胞用的LB表达/培养液也包含100μM IPTG，100μg/ml氨苄青霉素和2mg/ml溶菌酶，在将其加入PM-1细胞之前，其被加入0.3(w/v)％BSA(终浓度)。富集的PM-1细胞的PCR产物在凝胶上的分析结果清晰地显示可以用等渗LB包被真核细胞(图2)。因为其可以从表达的平板中直接筛选大量的细菌克隆因而是重要的。要注意的是阴性对照的β-肌动蛋白基因PCR产物的水平高于图1的水平，使得在该实验中难以取得比1ng更好的检测。

上文显示的关于鼠IgG抗体的近似结果也在捕获由具有c-myc和His₆-标签的scFv抗体包被的真核细胞中得到显示(此处未显示结果，但是在实施例2中得到说明)。但是，用需要作为一抗的scFv抗体包被细胞但在细胞中加入二级的鼠IgG抗体以结合c-myc和His₆-标签。这使得有可能在捕获被包被的细胞中仍可以用由pan鼠IgG包被的磁珠。

另外，也可以用展示不同的抗细胞决定簇(A-549细胞)的scFv抗体的M13噬菌体包被真核细胞。在该实验中，首先用M13噬菌体包被A-549细胞，之后洗涤并加入鼠抗gp8抗体。这些抗体在噬菌体的表面结合M13噬菌体gp8蛋白。再次洗涤A-549-噬菌体-抗体复合物，并且用噬菌体-抗体连接结合Dynabeads M-450 Pan鼠IgG捕获A-549细胞。再次用对A-549细胞内的β-肌动蛋白基因的PCR进行检测(图3)。只有形成了在珠和细胞之间的连接(噬菌体-gp8抗体-Pan鼠IgG)，才可以用PCR检测A-549细胞。该结果显示被检测的大多数的具有展示出的scFv的M13噬菌体样本与A-549细胞结合(16个样本中有15个)

总之，通过检测其所结合的配体来间接检测潜在文库成员例如IgG抗体、scFv抗体以及具有附着的scFv的M13噬菌体是成功的。由于检测步骤位于配体分子上(或至少直接与配体分子相连的单位)，因此现在可以不仅仅检测生物文库也可以检测化学文库。

实施例2：

降低作为配体使用的细胞数量-最优化

摘要：

通过将细胞数量(配体)降低到每反应5,000个是否可以间接检测与细胞表面决定簇结合的scFv抗体？理论上讲，如果消除了背景，则即使是配体DNA的单细胞PCR扩增也可以进行，但是这可能需要实施两个不同的PCR反应。

材料与方法：

见实施例1：

通常，在96U-板内检测每个ELISA孔内的1,000-100,000个细胞。5μl表达的scFv稀释入50μl的包被体积(PBS中的3％BSA)使用。珠的数量对1,000-100,000个细胞保持在5∶1，但是对于1,000到5,000个细胞，提高到10∶1。

结果/讨论

降低表达了可在AffiSelection步骤中使用的配体的细胞数量是重要的。在培养物中生长真核细胞是耗时的并需要大量额外的资源。为发现用于本技术的A-549癌细胞的最小量，细胞数从100,000降到1,000。图4提示可以将表达配体的细胞数降到5,000个，并仍然检测包被了scFv的富集细胞。

这提示了不进行任何额外的PCR优化(对单细胞)，仍然可以用一个PCR反应检测5,000个细胞，使操作相当具有成本效益。

实施例3：

比较常规的细胞ELISA与AffiSelect的检测水平

摘要：

AffiSelect操作提供比常规的细胞ELISA好得多的敏感性。在常规的细胞ELISA中没有检测出的几个scFv成员通过AffiSelect与A-549细胞结合而得到鉴定。

材料与方法：

见实施例1关于AffiSelect的详细描述。

用标准操作方法对A-549细胞进行细胞-ELISA：96-孔微孔板用PBS/3％BSA在4℃阻断过夜。将细胞(200,000)加入到每一个孔内。细胞被重悬并在PBS/3％BSA中洗涤(3次)，用一抗或抗体HLA ABC(MHC I类)IgG孵育，并在平板震荡器(280rpm)在4℃孵育60分钟，在PBS/3％BSA中洗涤，加入抗cmyc(1∶4000)并在4℃再次孵育60分钟(280rpm)。在PBS/3％BSA中洗涤(在4℃3次100μl)后，细胞在4℃在以含3％BSA的PBS稀释的抗鼠IgG-HRP中重悬60分钟(280rpm)。最后，如上文描述再次洗涤后，加入TMB底物溶液(100μl)并在室温孵育15分钟。移去上清液(75μl)在450nm分析。

结果/讨论

图5比较了细胞ELISA和AffiSelect的信号。主要不同在于细胞ELISA通过直接方法在配体表面检测亲合成员，但是AffiSelect是在亲合纯化步骤后专一检测配体(细胞)。为得到高于背景的足够好的信号，细胞ELISA(200,000)比AffiSelect(100,000)需要使用更多的细胞。但是AffiSelect的信号仍然更强更好。

实施例4：

小文库筛选的模拟-通过与A-549细胞结合，细菌表达的微量的scFv抗体可以被检测到。

摘要：

本实施例阐明稀释样本的选择和检测方法。收集A-549真核细胞并用加标的阳性对照scFv以阳性对照scFv∶阴性对照scFv为1∶384的比例孵育。使用不同的珠∶细胞比，并且在20∶1或30∶1时，可以得到β-肌动蛋白基因DNA的良好的PCR信号，相当于大量的A-549细胞，并再次提示scFv与细胞表面决定簇相结合。

材料与方法：

参见实施例1。但是实施例1所描述的方法与本实施例4的方法的不同之处在于，其现在可以筛选更大的体积。这意味着用10ml的塑料管代替96U-孔板，1ml孵育体积(细胞+单克隆抗体/scFv抗体)和0.5到1ml的捕获体积(细胞+珠)，以及在4℃混合1小时(30分钟用于捕获)，在整个孵育过程中缓慢倾斜和旋转(摇滚器)。另外在整个步骤中使用更大量的洗涤体积(1-2.5ml)。更大量的孵育体积有助于通过集中样本筛选更多个克隆。每管中的A-549细胞(配体)的数量稳定地保持在100,000，并加入不同数量的珠(从超出10倍到超出30倍的珠)。

结果与讨论：

将一结合至A-549细胞的表面标志的scFv抗体，scFvA，以1∶384的比率在非结合的scFv抗体PhOx中稀释，并与A-549细胞一起孵育。该比率相当于从384-板的有383个阴性孔中挑取一个阳性克隆的概率。为了模拟伴有低阳性击中频率(例如，每1,000或10,000个有1个)的大数量克隆的筛选(40,000个克隆＝105×384-孔板)该比率是重要的。与单个孔的筛选不同，纯化配体的本方法允许将384-板的所有孔集中到一个单管内，并对几个克隆在同一时间进行快速筛选。通过洗涤(如上个实施例中所描述)移去对配体没有亲合力的抗体，并且仅在具有结合了配体的阳性抗体时，才形成有助于纯化的配体和珠之间的连接。

使用不同的珠∶细胞的比率。在10∶1的比率时，不能够间接检测与细胞结合的scFv(图6，spike 0.5和1ml)。但是，对于20∶1和30∶1的比率，对于加标的样本具有良好的PCR信号。所记录的阴性对照scFv PhOx的近似的背景结合低得多。所有的阳性筛选对照(未稀释的scFv A，MHC，和阳性PCR对照(+))，以及阴性筛选对照LB和BSA(图6)都很好。这提示了甚至对于稀释的scFv抗体也可以发现良好的PCR信号。这也与实施例1所显示的结果相一致。

用表1可以比较scFv抗体的检测极限与肿瘤细胞表面上决定簇的数量的关系。即使只检测50μl含有非常低的scFv蛋白浓度的表达培养物，摩尔数超过了scFv与50,000个肿瘤细胞的低表达表面决定簇(每个细胞1,000个决定簇)的200∶1的比率仍然是可能的。本方法因而非常适合在低表达配体决定簇(低于1,000)分子上分离文库成员。由于检测潜在地可能在一单个的细胞上进行。挑选到这种克隆的能力应该是理想的。

表1：表达的scFv(以mg或μg/l计)与能够由scFv包被的真核细胞决定簇的数量的比率的比较

细胞决定簇scFv	20mg/l	1mg/l	100μg/l	1μg/l
					每个细胞10每个细胞1,00010,000100,000500,000	4.0×107∶1400,000∶140,000∶14,000∶11600∶1	20,000∶12000∶1200∶1	2,000∶1200∶120∶1	200∶120∶12∶1

50μl的scFv表达培养物加入到50,000个肿瘤细胞中(scFv分子量＝30,000)

实施例5：

用AffiSelect从抗肺癌细胞系的噬菌体展示富集的人抗体文库中挑选目标scFv克隆。

摘要：

根据肺癌细胞系上的潜在表面抗原运用我们内部的C.B.A.S.淘洗技术对人抗体噬菌体文库进行淘洗。从被分离的噬菌体展示富集的scFv克隆的多克隆混合物(“文库”)中鉴定抗肿瘤细胞系的个别scFv克隆，并与两个阴性细胞类型HUVEC和PBL的PCR模式相比较。所鉴定的阳性克隆用FACS(流式细胞术)证实。这阐明了AffiSelect可以用于筛选富集的抗体文库以鉴定与目标细胞表面决定簇结合的单个克隆。

材料与方法：

细胞

肺癌细胞系(A-549，ATCC CCL-185；由Viventia公司惠赠)，以及内皮细胞系(HUVEC，ATCC CRL-1730；由Viventia公司惠赠)被用于淘洗和筛选实验。A-549在添加有10％FCS和2mM谷酰胺的Ham′s F12(BioWhittaker)中培养，相似地内皮细胞系在添加有10％FCS，15mg/l内皮细胞生长因子添加物(Sigma)和50mg/l肝素(Sigma)的RPMI-1640培养基中培养。培养物置于37℃，保持5％的CO₂和湿润的环境。在含1mM EDTA的PBS中收集细胞，并在此前和此后增加在PBS中洗涤的步骤，用Bürker血球仪对细胞计数。用lymphoprep液(Axis-Shield)从人新鲜血或淡黄色覆层中分离外周血淋巴细胞(PBL)。细胞重悬于含3％BSA(Sigma)或4％脱脂乳(Merck)的PBS中。

植物凝集素包被的磁珠

根据厂家的操作手册，将植物凝集素(麦胚凝集素(WGA)：WheatGerm，Triticum vulgaris；Calbiochem)固定在M-450环氧树脂珠(戴诺)上。在具有10μg植物凝集素/10⁷个珠子pH 8.5的硼酸盐缓冲液中洗涤并孵育戴诺珠子，伴以缓慢倾斜和旋转在室温下过夜。这时在PBS/0.1％BSA中洗涤三次并以4×10⁸个珠子/ml在PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化钠中4℃储存。

噬菌体scFv展示富集

在淘洗实验中使用的是由6个健康供体的PBL构建的，并被克隆入基于pSEX 81(Welschof等人，1997，美国科学院院刊(PNAS)94：1902-1907，Lset，等人，2005，免疫学方法(J.Immunol.Methods)299：47-62)的噬粒(phagemid)展示系统的IgM scFv文库。

通过在预阻断管(PBS中含3％BSA或4％牛奶)中将3.75×10¹²个噬菌体(2.5×10¹³cfu/ml的150μl文库)与2×10⁵-2×10⁶个/ml的非肿瘤细胞一起孵育，在4℃下旋转1小时(＝阴性的预淘洗)，以除去与普通细胞蛋白结合的噬菌体。

连续进行两个阴性的预淘洗步骤。首先，文库与PBL细胞一起孵育，在淘洗后用阻断液洗涤PBL两次。接着，该预淘洗的噬菌体文库加上两次洗涤的上清与HUVEC细胞在预阻断管内一起孵育，在4℃下旋转1-2小时。在进行两轮的第二次阴性预淘洗洗涤之后，根据上文描述(淘洗)，上清加洗涤的上清与目的肺肿瘤细胞一起孵育。

为了从细胞结合的噬菌体中分离游离的噬菌体，接着进行下面的洗涤步骤。要么通过根据BRASIL方法(Giordano等人，2001，自然 医学(Nature Med.)11；1249-1253)的修正的有机相法分离，所述BRASIL方法包括在有机相分离之前的一或两个洗涤步骤，要么通过植物凝集素包被的磁珠进行。对于修正的BRASIL方法，淘洗后的2×150μl肿瘤细胞悬液在由300μl PBS/0.4％BSA重悬之前在1mlPBS/0.4％BSA中经历一或两个洗涤步骤。然后这些细胞(2×150μl)被分层于2×300μl有机相溶液(邻苯二甲酸二丁酯∶环己烷为9∶1[v∶v]；d＝1.03g ml^-1)的顶端，并在室温(RT)下在10,000×g离心10分钟。这些管在液氮中被速冻，管的底部被切去，并且细胞团块被转到另一个(被阻断的)管。对于磁珠洗涤程序，淘洗后的肿瘤细胞被旋转沉底(500×g，5分钟4℃)，在PBS/0.1％BSA中以5×106个细胞/ml重悬，并与植物凝集素包被的珠子一起孵育(细胞∶珠子的比率为1∶4)，在4℃下旋转20分钟。使用磁体在1ml PBS/0.1％BSA中洗涤珠子10次，并在200μl PBS/0.1％BSA中重悬。

对于感染而言，细胞团块或珠子被加入到处于对数生长期的10ml大肠杆菌(E.Coli)XL1 Blue中，并在37℃以60rpm孵育15分钟，之后在200rpm孵育45分钟。将细菌以不同的浓度平铺在小LB-TAG板(LB中加入100μg/ml氨苄青霉素，30μg/ml四环素，100mM葡萄糖)上用于评估，并在两个近似的大的长方形平板(243×243×18mm；Nunc)上进行之后的包装。所有的平板在37℃孵育过夜。

从两个大板进行刮取细菌。然后细菌在液体培养基中增殖，并且这些细胞中的噬粒与M13辅助噬菌体(Stratagene)一起被包装入噬菌体粒子中，30℃过夜。第二天用PEG/NaCl沉淀噬菌体，并在1ml PBS中重悬，在重悬液中使用100μl噬菌体(大约10¹³cfu)用于新一轮的淘洗。

多克隆噬菌体ELISA

肿瘤细胞和PBL细胞与每一轮淘洗后的100μl噬菌体(1∶10-1∶10⁶的稀释物)在预阻断(PBS/3％BSA)ELISA孔内于4℃一起孵育1小时。之后，细胞与100μl兔抗Fd(Sigma；1∶4000)抗体于4℃一起孵育1小时。以马辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG抗体(Dako；1∶4000)和底物ABTS(Calbiochem)进行ELISA。在405nm处检测吸收值。在每个孵育步骤之间，孔在PBS中洗涤3次。

大肠杆菌中scFv的表达和纯化

显示出肿瘤特异性结合(多克隆噬菌体ELISA)增加的淘洗轮次作为克隆入分泌载体pHOG21(Kipriyanov等人，1997，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，200：67-77)的备选。scFv DNA的多克隆收集物被转化入感受态的XL-1 Blue大肠杆菌细胞中，并在LB-TAG22×22cm生物分析盘中(Corning)铺板。用QPix2自动装置(英国Genetix有限公司)挑取单个克隆进入包含添加了～4％甘油的LB-TAG生长培养基的384-孔板(100μg/ml氨苄青霉素(A)，30μg/ml四环素(T)，1％(w/v)葡萄糖(G))内，并于37℃过夜生长。从384-孔板(LB-TAG w/甘油)接种用于表达的LB-TAG培养基，并以上文所描述的方法进行表达(Drsam等人，1997，FEBS Letters，414：7-13)或在96深孔规格(100-200微升体积)板内进行。于30℃在具有100μM IPTG(Sigma)的LB-TA中进行表达。将细菌细胞悬液加入PBS/3％BSA并在-20℃冻存。进行再次溶化后，于4℃4000rpm离心10分钟，上清液(含表达的scFv)用于进一步的实验。

AffSelect方法

参见实施例1。

但是，在此实验中，根据肿瘤细胞(A-549)、PBL和HUVEC使用AffSelect方法对96深孔scFv表达物的5μl等份进行检测。因此，离心2.2×10⁴个细胞(1600rpm，4℃，5分钟)并与5μl表达样本和45μlPBS/3％BSA一起于4℃震荡孵育1小时。用150μl PBS/3％BSA洗涤细胞并离心(1600rpm，4℃，5分钟)。加入50μl抗c-myc抗体(Invitrogen；1∶500)到细胞沉淀之后，平板被再次于4℃震荡孵育1小时。

根据前文所述，细胞被洗涤两次并与5×10⁶个珠子/ml(细胞∶珠子比率＝1∶5)的25μl M-450pan鼠IgG珠(戴诺)悬液一起于4℃震荡孵育1小时。在磁体上用100μl PBS/3％BSA洗涤细胞两次之后，细胞被重悬于100μl PBS中并被转到PCR平板中。

珠子样本在包含蛋白酶K(200μg/ml)，0.45％吐温20和0.45％NP40的30μl PCR缓冲液在55℃孵育过夜，之后储存于-20℃备用。在90℃30分钟热灭活蛋白酶K之后，样本被置于磁体上，取5μl上清用人β-肌动蛋白基因特异性引物进行PCR。

PCR的条件根据实施例1所描述。

FACS(流式细胞分选)

1-5×10⁵个细胞用50μl scFv深孔表达物于4℃染色1小时。用150μlPBS洗涤3次，并离心(1600rpm，5分钟，4℃)之后，细胞与50μl FITC偶联的抗c-myc抗体(Invitrogen；1∶30)一起于4℃孵育1小时。根据上文洗涤细胞3次，用200μl PBS/1-2％福尔马林(Sigma)固定，并于4℃储存待流式细胞仪(Coulter)检测。

结果/讨论

多克隆噬菌体ELISA的结果揭示，仅仅经过2轮的淘洗之后，使用两种洗涤方法(珠子方法或修正的BRASIL方法)都可以发现噬菌体与肿瘤细胞的结合的增高。相比之下，使用修正的BRASIL方法，在第3和第4轮淘洗之后，获得了比珠子方法更高的富集(图10)。

在两次洗涤和有机相离心之后，用AffiSelecT检测3轮淘洗之后的scFv表达物对PBL，HUVEC和肿瘤细胞系A-549的特异性(图11)。如图11的实施例所示，8个所检测的抗肿瘤细胞系的scFv表达物显示出了PCR扩增的β-肌动蛋白基因DNA，但是在HUVEC和PBL中没有发现这样的产物。这显示出，在这种情况下，8个被检测的scFv样本与肿瘤细胞系相结合，但没有结合HUVEC或PBL。

在通过FACS的检测确定肿瘤细胞系特异的特异性结合之后(图12显示了示例的克隆)，发现了10个独特的并且肿瘤细胞系特异性的克隆。

这显示出AffiSelect是从小抗体文库中挑选备选物的敏感方法。通过AffiSelect鉴定并被FACS所证实的阳性克隆确认该选择方法非常适合于挑选结合于细胞表面决定簇的scFv备选物。

Claims (43)

1.一种筛选分子文库以鉴定和/或选择其中作为一个或多个配体的备选结合伴侣的一个或多个成员的方法，所述方法包括：

a)使在溶液中的表达文库与一个或多个配体相接触；

b)将已经与表达文库的一个或多个成员结合的配体捕获到固相上；以及

c)检测配体的存在，从而检测表达文库中的作为配体的备选结合伴侣的一个或多个成员的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达文库是噬菌体展示文库或细菌表达文库。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达文库是抗体表达文库。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗体表达文库包括scFv抗体。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，表达文库成员包括促进捕获步骤(b)的标签或标记。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述配体是细胞表面分子或附着于固相上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞表面分子以全细胞的组分或细胞的膜部分提供。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述细胞是真核细胞。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞与疾病状态相关联。

10，根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是肿瘤细胞。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞被编码所述配体的核酸转导或转染，或者被编码配体文库的核酸转导或转染，或者是过度表达所述配体的细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述文库衍生于肿瘤细胞或病毒细胞。

13.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，附着于固相的所述配体与编码其的核酸相关联或者与分子标签相关联。

14.根据权利要求6或13所述的方法，其特征在于，所述配体附着的所述固相是微粒及非磁性的。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述配体包括报告部分或与其相关联以能够检测配体。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述报告部分是DNA分子。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述配体是细胞表面分子，以及所述报告部分是存在于表达所述配体的细胞内的DNA分子。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述DNA分子是内源性的管家基因或是外源性的报告部分。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中提供了多于一个的配体。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其特征在于，在细菌表达培养物的存在下实施所述接触步骤。

21.根据权利要求6至12或15至20中任一项所述的方法，其特征在于，提供的细胞少于5000或1000个。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的固相磁性的并且优选是微粒。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其特征在于，通过在固相上的捕获分子与和表达文库成员相关联的标签或分子之间的相互作用促进所述捕获步骤。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其特征在于，通过检测位于配体上或与之相关联的报告部分的存在来实施所述检测步骤。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，检测步骤是通过PCR进行的。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其特征在于，表达文库的多个成员存在于相同的检测空间内，并使之与一个或多个配体相接触。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括一个或多个淘洗步骤，在淘洗步骤中通过用目标配体淘洗文库减少了将在步骤(a)中使用的表达文库的复杂性。

28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述淘洗步骤包括(i)使表达文库与目标配体相接触，(ii)使目标配体接受至少一次洗涤步骤，以及(iii)目标配体的分离，通过有机相的分离从表达文库的非结合成员中分离出结合了表达文库成员的所述配体，因此从其它的文库成员中分离了所述目标配体的备选结合伴侣。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其特征在于，所述备选结合伴侣或配体被进一步地分析。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括一步骤，其中所述备选结合伴侣独立于配体被表达或产生。

31.一种分离和/或鉴定未知配体的方法，所述方法包括在权利要求1至30中任一项所定义的步骤，并且进一步包括(d)分离一个或多个与所述未知配体结合的表达文库成员，以及(e)使用所述文库成员以分离和/或鉴定其所结合的配体。

32.一种选择、鉴定和/或分离作为配体的特异结合伴侣的文库成员的方法，或一种从表达文库中选择、鉴定和/或分离配体的方法，所述方法包括在权利要求1至30中任一项所定义的步骤，以选择展示一定特性的分子，并且所述方法可选择地(e)鉴定和/或分离作为配体的特异结合伴侣的相关文库成员，以及(f)使用所述文库成员以鉴定其所结合的配体。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其特征在于，权利要求31的步骤(e)或权利要求32的步骤(f)包括使用所述文库成员以筛选由细胞制备的cDNA文库，在所述细胞上表达未知的配体。

34.一种分离和/或鉴定未知配体的方法，所述方法包括：

(a)使一个或多个作为未知配体的特异性结合伴侣在溶液中与在细胞中表达的潜在的配体文库相接触；

(b)将已经与特异性结合伴侣的一个或多个结合的配体捕获到固相上；以及

(c)检测配体的存在，从而检测作为备选的未知配体的一个或多个配体的存在。

35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，使用在权利要求1至26中任一项所定义的方法鉴定或选择所述一个或多个特异性结合伴侣。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其特征在于，所述文库衍生于细胞，在所述细胞上表达有所述未知配体。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括生产或表达所述经鉴定的结合伴侣或配体，或组分、片段、变异体，或其衍生物的步骤，以及可选择地与至少一种制药学上可接受的载体或赋形剂一起配制所述结合伴侣或配体。

38.一种结合蛋白或配体，所述结合蛋白或配体是使用在权利要求1至37中任一项所定义的方法而被鉴定、选择、分离、生产、表达或配制的。

39.结合伴侣或配体在体外检测或体外诊断检测中的应用，所述结合伴侣或配体是使用在权利要求1至37中任一项所定义的方法而被鉴定、选择、分离、生产、表达或配制的。

40.结合伴侣或配体在生产用于治疗或体内诊断的药物或组合物中的应用，所述结合伴侣或配体是使用在权利要求1至37中任一项所定义的方法而被鉴定、选择、分离、生产、表达或配制的。

41.一种治疗病人的方法，所述方法包括以适当剂量的结合伴侣或配体给药，所述结合伴侣或配体是使用在权利要求1至37中任一项所定义的方法而被鉴定、选择、分离、生产、表达或配制的。

42.一种筛选分子文库以鉴定和/或选择文库中的一个或多个成员的方法，所述成员是一个或多个配体的备选结合伴侣，所述方法包括：

(i)在单个检测空间内集中大量的能够表达表达文库成员的细菌克隆，或集中由大量细菌克隆产生的表达文库成员；

(ii)如果在步骤(i)集中了大量的细菌克隆，诱导细菌克隆以表达所述的表达文库成员；

(iii)使所述的表达文库成员与一个或多个配体接触；

(iv)确定阳性的检测空间，在所述阳性检测空间中一个或多个的表达文库成员与配体结合；

(v)如果需要，对存在于阳性检测空间内的克隆进行选择性展开，并重复步骤(iii)和(iv)；

(vi)鉴定表达了所述配体的结合伴侣的一个或多个克隆。

43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，根据权利要求1至25中任一项所定义的步骤(b)和(c)实施所述检测步骤(iv)。

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