KR102301987B1 - 항체 선별 방법, 박테리아 오염 진단 방법 및 박테리아 오염 진단 키트 - Google Patents

항체 선별 방법, 박테리아 오염 진단 방법 및 박테리아 오염 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체 선별 방법, 박테리아 오염 진단 방법 및 박테리아 오염 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법은 대상 체의 혈청에 LPS(lipopolysaccharide)를 포함하지 않는 비정상 그람 음성균을 제공하여, 상기 비정상 그람 음성균의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체와 상기 비정상 그람 음성균의 제 1 결합체와 비타겟 항체를 포함하는 제 1 혼합물을 얻는 단계, 상기 제 1 혼합물로부터 상기 제 1 결합체와 상기 비타겟 항체를 분리하여 상기 제 1 결합체를 선택적으로 획득하는 단계 및 상기 제 1 결합체를 상기 비정상 그람 음성균과 상기 타겟 항체로 해리시키는 단계 및 상기 타겟 항체를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

항체 선별 방법, 박테리아 오염 진단 방법 및 박테리아 오염 진단 키트{Method of screening antibody, bacteria contamination diagnosis method and bacteria contamination diagnosis kit}
본 발명은 항체 선별 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 항체 선별 방법, 박테리아 오염 진단 방법 및 박테리아 오염 진단 키트에 관한 것이다.
면역계는 인체를 바이러스, 박테리아 또는 오염에 의한 염증으로부터 보호하고 질병의 원인을 제거하기 위하여 항체를 생산한다. 상기 항체는 타겟이 되는 항원과 특이적으로 결합하는 항원-항체 반응을 통해 상기 항원을 무력화하거나 제거함으로써 면역계의 방어 기능을 수행할 수 있다. 최근에는 상기 항원-항체 반응을 이용하여 독소, 단백질, 바이러스, 기생충 또는 세포들을 제거하는 치료 방법들이 개발되고 있으며, 이를 수동적 면역 요법 또는 수동적 혈청 요법이라고 한다.
종래의 수동적 혈청 요법에서는 상기 항체의 생산을 위하여 동물의 면역계에 타겟 항원을 주사하여 체액성 면역계를 활성화하고 상기 면역계의 B 세포가 항체를 생산하도록 한다. 그런데 상기 항원이 동물의 체내에 주사됨으로써 생체의 생리 활성 또는 면역계의 활성에 부적합한 영향을 미치는 경우에 면역계의 활동이 저하되어 항체의 생산이 어려울 수 있다. 혈청 내의 다양한 종류의 항체들로부터 생산의 목적이 되는 타겟 항체를 선별하기 위하여 친화도 크로마토그래피와 같은 분리 방법들이 사용되었으나, 수율이 낮은 문제가 있다.
따라서, 상기 타겟 항체를 획득하기 위해서는, 생체에 부정적인 영향을 미치지 않도록 체외에서 혈청과 항원의 면역 반응을 일으켜 상기 타겟 항체를 생산하는 것이 바람직하다. 상기 타겟 항체의 생산 수율을 높이기 위해서는, 항원-항체 반응과 같이 상기 타겟 항체에 결합 특이성이 뛰어난 선별 수단을 이용하는 것이 요구된다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 체외에서 진행되어 생체의 면역 반응에 의한 부작용을 일으키지 않으며, 타겟 항체에 대한 높은 선택도에 의하여 고수율의 생산이 가능한 항체의 선별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는, 상기 타겟 항체를 이용하여 정확도 및 신뢰도 높은 박테리아 오염 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는, 상기 타겟 항체를 이용하여 전술한 이점을 갖는 박테리아 오염 진단 키트를 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법은 대상 체의 혈청에 LPS(lipopolysaccharide)를 포함하는 정상 그람 음성균 대비 외막에 ⅰ) 상기 LPS를 포함하지 않거나, ⅱ) 상기 LPS의 변형물을 포함하거나, ⅲ) 지질의 지방산 사슬 중 하나 이상이 제거되거나 다른 지방산 사슬로 치환되거나, ⅳ) IVA(4-A) 지질 이외의 지질이 적용된 비정상 그람 음성균을 제공하여, 상기 비정상 그람 음성균의 외막에 선택적으로 결합하는 제 1 타겟 항체와 상기 비정상 그람 음성균의 제 1 결합체와 비타겟 항체를 포함하는 제 1 혼합물을 얻는 단계, 상기 제 1 혼합물로부터 상기 제 1 결합체와 상기 비타겟 항체를 분리하여 상기 제 1 결합체를 선택적으로 획득하는 단계, 상기 제 1 결합체를 상기 비정상 그람 음성균과 상기 제 1 타겟 항체로 해리시키는 단계 및 상기 타겟 항체를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제 1 타겟 항체에 상기 정상 그람 음성균을 처리하여, 상기 제 1 타겟 항체로부터 상기 정상 그람 음성균의 상기 LPS에 선택적으로 결합하는 제 2 타겟 항체를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제 1 타겟 항체를 획득하는 단계는, 상기 비정상 그람 음성균을 제거하여 상기 제 1 타겟 항체와 상기 제 1 결합체로부터 분리된 리던던트 비타겟 항체의 제 2 혼합물을 획득하는 단계, 상기 제 2 혼합물에 상기 리던던트 비타겟 항체와 특이적으로 결합하는 그람 양성균을 제공하여, 상기 리던던트 비타겟 항체와 상기 그람 양성균의 제 2 결합체를 형성하여, 상기 제 1 타겟 항체와 상기 제 2 결합체를 포함하는 제 3 혼합물을 획득하는 단계 및 상기 제 3 혼합물에서 상기 제 2 결합체와 상기 제 1 타겟 항체를 분리하여 타겟 항체를 선택적으로 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제 1 타겟 항체는 정상 그람 음성균의 외막에도 선택적으로 결합할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제 1 타겟 항체는 상기 정상 그람 음성균의 외막의 표면 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 정상 그람 음성균은 폐렴막대균(Klebsiella penumoniae), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박터(Enterobacter spp.), 살모넬라균(salmonella), 이질균(shigella), 리케차(R. rickettsii), 대장균(E. coli), 콜레라균(V. cholerae), 페스트균(Y. pestis), 임질구균(N. gonorrhoeae), 수막염균(N. meningitidis) 또는 나선상균(spirochaeta) 중 적어도 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 그람 양성균은 포도상구균(staphylococcus), 연쇄상구균(streptococcus), 폐렴균(pneumococcus), 나병균(M. leprae), 디프테리아균(C. diphtheriae), 파상풍균(C. tetani), 탄저균(B. anthracis), 방선균(actinobacteria) 또는 고초균(B. subtilis) 중 적어도 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 박테리아 오염 진단 방법은 대상 체로부터 수득하고 박테리아를 포함하는 피분석물을 준비하는 단계, 상기 피분석물 또는 상기 피분석물로부터 분리하여 획득된 박테리아에 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질과 결합되고, LPS(lipopolysaccharide)를 포함하는 정상 그람 음성균 대비 외막에 ⅰ) 상기 LPS를 포함하지 않거나, ⅱ) 상기 LPS의 변형물을 포함하거나, ⅲ) 지질의 지방산 사슬 중 하나 이상이 제거되거나 다른 지방산 사슬로 치환되거나, ⅳ) IVA(4-A) 지질 이외의 지질이 적용된 비정상 그람 음성균의 외막에 특이적으로 결합하는 제 1 타겟 항체를 제공하는 표지 단계 및 상기 박테리아와 상기 표지 물질의 전기적, 화학적 또는 광학적 반응을 이용하여 상기 박테리아의 식별 또는 농도를 분석하는 단계를 포함하고, 상기 박테리아는 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 표지 단계는 상기 박테리아에 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질과 결합되고, LTA(lipoteichoic acid)을 포함하는 그람 양성균의 상기 LTA에 특이적으로 결합하는 제 2 타겟 항체를 더 제공할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 피분석물을 준비하는 단계는, 상기 피분석물로부터 비중 차이를 이용하여 상기 박테리아를 분리하여 획득할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 표지 단계는 상기 제 1 타겟 항체 또는 상기 제 2 타겟 항체를 준비하는 단계 및 상기 제 1 타겟 항체 또는 상기 제 2 타겟 항체에 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 박테리아 오염 진단 키트는 LPS(lipopolysaccharide)를 포함하는 정상 그람 음성균 대비 외막에 ⅰ) 상기 LPS를 포함하지 않거나, ⅱ) 상기 LPS의 변형물을 포함하거나, ⅲ) 지질의 지방산 사슬 중 하나 이상이 제거되거나 다른 지방산 사슬로 치환되거나, ⅳ) IVA(4-A) 지질 이외의 지질이 적용된 비정상 그람 음성균의 외막에 선택적으로 결합하는 제 1 타겟 항체 및 LTA(lipoteichoic acid)을 포함하는 그람 양성균의 상기 LTA에 선택적으로 결합하는 제 2 타겟 항체를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 박테리아 오염 진단 키트는 상기 제 1 타겟 항체 및 상기 제 2 타겟 항체에 결합된 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 박테리아 오염 진단 키트는 혈소판 오염 진단 키트일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법은 대상 체의 혈청에 LPS((lipopolysaccharide)를 포함하지 않는 비정상 그람 음성균을 제공하여 상기 비정상 그람 음성균의 외막에 특이적으로 결합하는 타겟 항체를 획득함으로써 정상 그람 음성균에 존재하는 LPS와의 항원-항체 반응을 이용하는 항체 선별 방법과 달리, 상기 외막과 특이적으로 결합하는 다양한 종류의 그람 음성균에 대한 항체들을 식별 또는 분석할 수 있다.
또한, LTS 또는 LTA와 같이 생체의 면역 반응을 유도하기 위한 물질을 생체 내에 직접 주사하지 않고 체외에서 진행됨으로써 상기 생체 내의 생리 활성 변화를 수반하지 않고 타겟 항체를 생산 또는 선별할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 박테리아 진단 방법은 전술한 이점을 가져 다양한 종류의 박테리아들을 진단할 수 있어 가용 범위가 넓고, 높은 신뢰도 및 정확도에 의하여 의료 분야 또는 바이오 진단 분야에서 사용 가능할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 박테리아 진단 키트는 전술한 이점을 갖고, 소형화되어 사용 용이성 및 휴대성이 향상될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법의 순서도이다.
도 2a는 정상 그람 음성균의 리포 다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 나타낸 도면이고, 도 2b는 비정상 그람 음성균의 지질 IVA를 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법으로 분리된 그람 양성균에 선택적으로 결합하는 타겟 항체의 형광 세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 그래프이고, 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법으로 분리된 비정상 그람 음성균의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체의 형광 세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 타겟 항체의 그람 양성균과의 결합 여부를 촬영한 형광 이미지이고, 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 항체(TAB)의 그람 음성균과의 결합 여부를 촬영한 형광 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 오염 진단 방법의 순서도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 오염 진단 키트를 나타낸 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 항체를 이용한 그람 양성균의 농도에 따른 형광 세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 표준 곡선이고, 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 항체를 이용한 그람 음성균의 농도에 따른 형광 세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 표준 곡선이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
도면에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 또한, 본 명세서에서 단수로 기재되어 있다 하더라도, 문맥상 단수를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"이란 용어는 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
본 명세서에서 기판 또는 다른 층 "상에(on)" 형성된 층에 대한 언급은 상기 기판 또는 다른 층의 바로 위에 형성된 층을 지칭하거나, 상기 기판 또는 다른 층 상에 형성된 중간 층 또는 중간 층들 상에 형성된 층을 지칭할 수도 있다. 또한, 당해 기술 분야에서 숙련된 자들에게 있어서, 다른 형상에 "인접하여(adjacent)" 배치된 구조 또는 형상은 상기 인접하는 형상에 중첩되거나 하부에 배치되는 부분을 가질 수도 있다.
본 명세서에서, "아래로(below)", "위로(above)", "상부의(upper)", "하부의(lower)", "수평의(horizontal)" 또는 "수직의(vertical)"와 같은 상대적 용어들은, 도면들 상에 도시된 바와 같이, 일 구성 부재, 층 또는 영역들이 다른 구성 부재, 층 또는 영역과 갖는 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 용어들은 도면들에 표시된 방향뿐만 아니라 소자의 다른 방향들도 포괄하는 것임을 이해하여야 한다.
이하에서, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들(및 중간 구조들)을 개략적으로 도시하는 단면도들을 참조하여 설명될 것이다. 이들 도면들에 있어서, 예를 들면, 부재들의 크기와 형상은 설명의 편의와 명확성을 위하여 과장될 수 있으며, 실제 구현시, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 된다. 또한, 도면의 부재들의 참조 부호는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부재를 지칭한다.
용어 "항체"에는 항체, 항체 유도체 또는 이의 단편이 포함될 수 있고, 항체에 관한 상세한 설명은 본 발명의 항체 선별 방법에도 적용된다. 항체는 상기 단편들 중 폴리펩타이드와 같은 항체의 등가물 또는 항체 동족체들은 Fc 영역, 면역글로불린 결합 도메인, 결합 도메인을 모방하는 펩타이드, Fc 영역에 상동성인 영역 또는 적어도 이의 일부를 포함한다. 또한, 항체는 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자 또는 그의 등가물을 포함할 수 있다. 상기 항체들은 온전한(intact) 면역글로불린 분자일 수 있고, Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 F(v) 및 N-글리칸 구조 및 파라토프와 같은 상기 항체의 구성 부분들 및 상기 구성 부분들 중 적어도 일부를 포함할 수도 있다.
상기 항체는 혈청의 기본 구성요소이며, 상기 항체들, 면역글로불린분자들 또는 이의 단편들의 집합체일 수 있고, 항체 또는 면역글로불린의 단일 분자일 수 있다. 상기 항체 분자는 항원 또는 상기 항원의 에피토프와 같은 특이적인 항원 결정기에 결합되거나 상기 항원 결정기와 반응함으로써 면역학적 이펙터 메카니즘을 유도할 수 있다. 상기 항체는 단일특이(monospecific)적일 수 있으며, 상기 항체들의 조성물은 동일한 항체들로 구성되어 모노클로날일 수 있고, 동일한 항원의 다른 에피토프들 또는 다른 항원들의 에피토프들과 반응하는 다른 종류의 항체들을 포함하여 폴리클로날일 수 있다. 각 항체는 상기 항체의 대응하는 항원에 대한 특이적인 결합을 가능케 해주는 독특한 구조를 가지며 모든 천연 항체 분자들은 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄라는 전체적으로 동일한 기본 구조를 가질 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법의 순서도이다.
도 1을 참조하면, 일 실시예에서, 타겟 항체(TAB) 및 비타겟 항체(NTAB)를 포함하는 대상 체의 혈청(SR)을 준비한다(S100). 상기 대상 체는 토끼, 염소, 돼지와 같은 포유류의 체일 수 있고, 인체일 수도 있다. 다른 실시예에서, 상기 대상 체는 동물의 생체 또는 대상 항원에 의한 질병으로 죽은 동물의 사체일 수 있다. 예시적으로, 타겟 항체(TAB)가 인간의 질병 치료 수단으로 이용되는 경우, 인체와의 적합성을 고려하여 인체로부터 추출된 혈청(SR)을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대상 체로부터 추출된 혈청(SR)을 이용하여 타겟 항체(TAB)의 생산이 체외에서 이루어짐으로써 체내에서 생산되는 경우와 달리 대상 체의 면역 체계 또는 생리 활성의 변화를 수반하지 않는 항체의 생산 및 선별이 가능하다.
일 실시예에서, 혈청(SR)은 셀 펠렛(cell pellet)에 제공될 수 있다. 다른 실시예에서는, 유리, 플라스틱, 고분자와 같은 재료를 포함하는 복수의 웰(well), 셀(cell), 기판 또는 플레이트와 같은 모든 종류의 용기를 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적이며 항체, 항원 또는 혈청(SR)의 반응 영역을 제공할 수 있는 용기는 모두 해당될 수 있고 특정 예에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 도 1과 같이 혈청(SR)은 타겟 항체(TAB) 및/또는 비타겟 항체(NTAB)가 포함된 상태로 제공될 수 있다. 다른 실시예에서, 혈청(SR)에 소정의 항원이 제공되어 혈청(SR)의 면역 반응에 의하여 타겟 항체(TAB) 또는 비타겟 항체(NTAB)가 형성될 수도 있다. 예를 들면, 그람 양성균(GP) 또는 그람 음성균과 같은 항원이 혈청(SR)에 제공된 후, 인큐베이션 과정을 거쳐 항체의 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 상기 인큐베이션 과정은 예시적으로 25 ℃에서 약 1 시간 동안 진행될 수 있다. 이는 비제한적인 예시에 불과하며, 본 발명을 한정하지 않는다.
다음으로, 비정상 그람 음성균(CC)을 제공하여 타겟 항체(TAB)와 비정상 그람 음성균(CC)의 제 1 결합체(BND1)와 비타겟 항체(NTAB)를 포함하는 제 1 혼합물(MX1)을 얻는다(S200). 일 실시예에서, 타겟 항체(TAB)는 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 타겟 항체(TAB)는 외막의 표면 구조에 물리적 또는 화학적으로 선택적인 결합성을 가져 상기 외막의 표면 구조에는 높은 반응성을 보이고, 그람 양성균(GP)이 아닌 다른 박테리아에는 낮은 반응성을 보일 수 있다. 또는, 타겟 항체(TAB)는 상기 외막의 표면 구조와 항원-항체 특이적 반응을 할 수도 있다.
다른 실시예에서, 타겟 항체(TAB)는 상기 외막에 포함된 특정 작용기와 높은 반응성을 보일 수 있다. 예를 들면, 타겟 항체(TAB)가 상기 특정 작용기와 수소 결합, 공유 결합, 비공유 결합 또는 펩타이드 결합과 같은 화학적 결합을 이룰 수 있다. 또 다른 실시예에서, 타겟 항체(TAB)와 상기 외막 사이에는 물리적 또는 화학적 요인에 의하여 인력이 작용하고, 타겟 항체(TAB)와 그람 음성균이 아닌 다른 박테리아와는 인력이 작용하지 않거나, 척력이 작용할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 타겟 항체(TAB)는 그람 음성균의 외막의 표면 단백질에 선택적으로 결합될 수 있다. 상기 표면 단백질은 복수 개의 아미노산으로 구성된 펩타이드일 수 있으며, 상기 아미노산의 개수는 제한되지 않는다. 상기 표면 단백질은 타겟 항체(TAB)와 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호 작용, 공유 결합, 비공유 결합, 정전기 상호 작용, 기하학적 상호 작용 또는 이들의 조합과 같은 다양한 종류의 물리적, 화학적 또는 전기적 반응성에 의하여 선택적 결합성을 가질 수 있다. 이는 비제한적 예시에 불과하며, 본 발명을 제한하지 않는다. 상기 외막과 타겟 항체(TAB)의 선택적 결합성에는 다양한 공지 기술들이 참조될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 타겟 항체(TAB)가 비정상 그람 음성균(CC)의 외막과 선택적 반응성을 보임으로써, 약 160 가지 이상의 종류가 존재하는 리포 다당류(lipopolysaccharide; LPS)의 종류에 구속되지 않고, 약 2 만 종류 이상의 다양한 그람 음성균과 선택적으로 결합할 수 있고, 상기 다양한 종류의 그람 음성균을 검출 또는 선별할 수 있는 항체 선별 방법이 제공될 수 있다. 또한 타겟 항체(TAB)와 상기 LPS의 선택적 결합성을 이용한 항체 선별과는 달리, 상기 LPS의 종류마다 적합한 타겟 항체(TAB)를 제공하지 않더라도, 한 종류의 타겟 항체(TAB)만으로 상기 다양한 종류의 그람 음성균의 면역 또는 검출이 가능하여 가용 범위가 증대된 항체를 선별할 수 있다.
일 실시예에서, 타겟 항체(TAB)는 정상 그람 음성균의 외막에도 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 정상 그람 음성균은 상기 외막에 LPS를 포함하는 그람 음성균을 의미한다. 상기 정상 그람 음성균은 폐렴막대균(Klebsiella penumoniae), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박터(Enterobacter spp.), 살모넬라균(salmonella), 이질균(shigella), 리케차(R. rickettsii), 대장균(E. coli), 콜레라균(V. cholerae), 페스트균(Y. pestis), 임질구균(N. gonorrhoeae), 수막염균(N. meningitidis) 또는 나선상균(spirochaeta)일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 타겟 항체(TAB)가 비정상 그람 음성균(CC) 뿐만 아니라 정상 그람 음성균의 외막에도 선택적으로 결합함으로써, 정상 그람 음성균마다 상이할 수 있는 LPS의 종류에 제한되지 않고, 정상 그람 음성균을 검출 또는 분석할 수 있는 이점이 있다.
일 실시예에서, 혈청(SR)에 제공되는 비정상 그람 음성균(CC)의 농도는 106 cells/ml 내지 108 cells/ml의 범위 내일 수 있고, 바람직하게는 107 cells/ml일 수 있다. 상기 농도가 임계 하한 값 미만인 경우에는 타겟 항체(TAB)와의 결합이 충분히 형성되지 않아 제 1 결합체(BND1)를 선택적으로 획득하는 단계(S300)에서 결합하지 못한 타겟 항체(TAB)가 제거되어 타겟 항체(TAB)의 수득률이 낮아질 수 있다. 상기 농도가 임계 상한 값을 초과하는 경우에는 제 1 결합체(BND1)에 불가피하게 흡착되는 리던던트 비타겟 항체(RDAB)의 양이 많아지고, 리던던트 비타겟 항체(RDAB)를 제거하기 위하여 반복적인 제거 단계들이 요구되어 복잡한 단계들이 추가적으로 요구될 수 있다. 일 실시예에서, 혈청(SR)과 비정상 그람 음성균(CC)의 혼합 부피는 1:1인 것이 바람직하다.
도 2a는 정상 그람 음성균의 리포 다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 나타낸 도면이고, 도 2b는 비정상 그람 음성균(CC)의 지질 IVA를 나타낸 도면이다.
도 2a를 참조하면, 일 실시예에서, 정상 그람 음성균은 외막에 리포 다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 포함할 수 있다. 도 2a에서는 설명의 편의를 위하여 하나의 LPS만을 도시하고 있으나, 정상 그람 음성균은 다수의 LPS를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 정상 그람 음성균은 6 개의 지방산 사슬(11)을 갖는 지질 A(10) 및 지질 A(10)에 결합된 다당류(20)를 포함할 수 있다. 지질 A(10)는 LPS가 그람 음성균의 외막에 고정시킬 수 있다. 또한, 지질 A(10)의 6 개의 지방산 사슬(11)은 사이토카인을 생성을 유발하여 염증 반응을 발생시킬 수 있다.
일 실시예에서, 비정상 그람 음성균(CC)은 LPS를 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 비정상 그람 음성균(CC)은 LPS의 변형물을 포함할 수 있다. 상기 변형물은 상기 LPS의 구성 요소인 6 개의 지방산 사슬(11), 지질 A(10) 또는 다당류(20) 중 적어도 하나 이상이 제거되거나, 다른 물질로 치환되거나, 지방산 사슬(11), 지질 A(10) 또는 다당류(20) 중 일부분이 제거될 수 있다. 예를 들어, 비정상 그람 음성균(CC)의 다당류(20)가 단당류, 이당류, 펩티드 또는 이들의 조합으로 치환될 수 있다.
다른 실시예에서, LPS의 지방산 사슬(11) 중 적어도 하나 이상이 제거될 수 있다. 예를 들어, 비정상 그람 음성균(CC)의 지질 A(10)에서 지방산 사슬(11)이 1개, 2개 또는 복수의 지방산 사슬들(11)이 제거될 수 있다. 또는, LPS의 6 개의 지방산 사슬(11) 중 적어도 하나 이상이 지방산 사슬(11)의 적어도 어느 일부분이 제거된 짧은 지방산 사슬로 치환될 수 있다. 이는 비제한적인 예시로서, 다양한 종류의 지방산 사슬(11)의 변형들일 적용될 수 있다.
다른 실시예에서 비정상 그람 음성균(CC)은 지질 IVA(4-A)(200)를 제외한 지질을 포함할 수 있다. 예시적으로, 비정상 그람 음성균(CC)은 정상 그람 음성균의 LPS 대신 상기 지질 IVA(4-A)(200)를 제외한 지질을 포함할 수 있다. 상기 지질은 지방산(fatty acids), 글리세린 인지질(glycerophospholipids), 인지질(sphingolipids), 스테롤(sterols), 프레놀(prenols), 폴리케타이드(polyketides), 이들의 조합 또는 이들의 변형 물질일 수 있다. 이는 비제한적인 예시에 불과하며, 다양한 종류의 LPS의 변형들이 적용될 수 있으며, 다양한 공지 기술들이 참조될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 비정상 그람 음성균(CC)은 LPS를 포함하지 않을 수 있다. 이 경우, 비정상 그람 음성균(CC)은 LPS와 동일한 기능을 하는 화합물, 고분자, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, LPS를 포함하지 않더라도 상기 LPS와 동일한 기능을 하는 화합물, 고분자, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합에 의하여 비정상 그람 음성균(CC)이 손상 또는 파괴되지 않고 유지될 수 있다.
도 2b를 참조하면, 일 실시예에서, 비정상 그람 음성균(CC)은 정상 그람 음성균의 LPS 대신에 지질 IVA(4-A)(200)를 포함할 수 있다. 지질 IVA(4-A)(200)는 4 개의 지방산 사슬(11)을 포함할 수 있다. 또한, 지질 IVA(4-A)(200)는 LPS의 다당류(20)를 포함하지 않을 수 있다. 지질 IVA(4-A)(200)는 비제한적 예시에 불과하며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
다시 도 1을 참조하면, 다음으로, 제 1 혼합물(MX1)로부터 상기 제 1 결합체(BND1)와 비타겟 항체(NTAB)를 분리하여 제 1 결합체(BND1)를 선택적으로 획득할 수 있다(S300). 일 실시예에서는, 제 1 혼합물(MX1)을 원심분리하여 제 1 결합체(BND1)를 침전시켜, 비타겟 항체(NTAB)로부터 제 1 결합체(BND1)를 분리할 수 있다. 예시적으로는, 제 1 혼합물(MX1)을 소정 시간 동안 방치하여 제 1 결합체(BND1)가 중력에 의하여 침전될 수도 있다. 침전된 제 1 결합체(BND1)를 분리하기 위하여 제 1 결합체(BND1) 상부에 잔류하는 혼합 용액을 제거할 수 있고, 침전된 제 1 결합체(BND1)를 추출할 수도 있다. 다른 실시예에서는, 거름, 증류, 밀도차이를 이용하는 공정, 원심 분리(centrifuge), 스피닝 밴드 추출(spinning band extraction), Pulsating Sieve Tray or Packed Columns Extraction Systems 또는 액체 혼합-침강(mixer-settler) 방식이 이용될 수 있다. 또는, 단백질 크로마토그래피를 이용하여 상부의 비타겟 항체(NTAB)를 제거할 수 있다. 전술한 원심분리 또는 크로마토그래피는 예시적이며, 제 1 혼합물(MX1)에서 제 1 결합체(BND1)와 비타겟 항체(NTAB)를 분리하는 자기력, 전기력 또는 용해도를 이용한 다양한 다른 공지의 기술이 사용될 수 있다.
다음으로, 제 1 결합체(BND1)를 비정상 그람 음성균(CC)과 타겟 항체(TAB)로 해리시킬 수 있다(S400). 일 실시예에서는, 제 1 결합체(BND1)에 산 용액을 처리할 수 있다. 예를 들면, 글라이신-염산 버퍼(glycine-HCl buffer pH 2.7, 0.1M)을 이용할 수 있다. 다른 실시예에서는, 염화나트륨(NaCl) 또는 염화마그네슘(MgCl2), 요소, 또는 구아니딘 염(guanidinium salt)과 같은 화합물을 이용할 수 있다. 전술한 물질들의 pH 및 농도는 항원-항체의 종류, 결합성, 반응 조건과 같은 요인들에 따라 적절히 조절될 수 있다.
다음으로, 일 실시예에서, 비정상 그람 음성균(CC)을 제거하여 타겟 항체(TAB)를 획득할 수 있다. 예를 들면, 비정상 그람 음성균(CC)과 타겟 항체(TAB)의 밀도 차이를 이용하여 비정상 그람 음성균(CC)을 침전시켜 제거하거나, 타겟 항체(TAB)를 추출하거나, 원심 분리기를 이용는 물리적인 방법으로 타겟 항체(TAB)를 획득할 수 있다. 다른 실시예에서는, 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 이는 비제한적인 예시이며, 다양한 항체 획득 방법들이 적용될 수 있다.
일 실시예에서, 타겟 항체(TAB)를 획득하는 단계는 후술되는 단계들을 포함할 수 있다. 먼저, 비정상 그람 음성균(CC)을 제거하여 타겟 항체(TAB)와 제 1 결합체(BND1)로부터 분리된 리던던트 비타겟 항체(RDAB)의 제 2 혼합물(MX2)을 획득할 수 있다(S500). 비정상 그람 음성균(CC)과 타겟 항체(TAB)의 결합체인 제 1 결합체(BND1)에는 리던던트 비타겟 항체(RDAB)가 일부 흡착될 수 있다. 리던던트 비타겟 항체(RDAB)는 제 1 결합체(BND1)에 흡착되지 않은 비타겟 항체(NTAB)와 동일 종류의 항체이거나, 비타겟 항체(NTAB)와 상이한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 항체일 수 있다. 제 1 결합체(BND1)에 흡착되어 있던 리던던트 비타겟 항체(RDAB)는 제 1 결합체(BND1)를 비정상 그람 음성균(CC)과 타겟 항체(TAB)로 해리시키는 단계(S400)에서 제 1 결합체(BND1)로부터 분리될 수 있다.
일 실시예에서, 비정상 그람 음성균(CC), 타겟 항체(TAB) 및 리던던트 비타겟 항체(RDAB)가 포함되어 있는 혼합 용액을 10,000 rpm 내지 15,000 rpm, 바람직하게는 11,000 rpm의 회전 속도로 원심 분리하여 비정상 그람 음성균(CC)을 침전시킬 수 있다. 이후, 침전된 비정상 그람 음성균(CC)을 제거하여 침전되지 않고 상부에 잔류하는 타겟 항체(TAB)와 리던던트 비타겟 항체(RDAB)를 포함하는 제 2 혼합물(MX2)을 얻을 수 있다. 다른 실시예에서는 상부에 잔류하는 제 2 혼합물(MX2)을 피펫, 스포이드와 같은 추출이 가능한 실험 도구들을 이용하여 추출할 수도 있다.
다음으로, 제 2 혼합물(MX2)에 리던던트 비타겟 항체(RDAB)와 특이적으로 결합하는 그람 양성균(GP)을 제공하여, 리던던트 비타겟 항체(RDAB)와 그람 양성균(GP)의 제 2 결합체(BND2)를 형성하여, 타겟 항체(TAB)와 상기 제 2 결합체(BND2)를 포함하는 제 3 혼합물(MX3)을 획득할 수 있다(S600). 이는 비정상 그람 음성균(CC)을 이용하여 비타겟 항체(NTAB)를 걸러내는 과정(S100 내지 S500)에서 비타겟 항체(NTAB)의 일부가 비정상 그람 음성균(CC)에 흡착되어 혼합 용액에 잔류하는 리던던트 비타겟 항체(RDAB)를 완벽하게 제거하기 위한 과정이다. 그람 양성균(GP)은 비타겟 항체(NTAB)와 항원-항체 반응을 함으로써 제 2 결합체(BND2)를 형성할 수 있다.
일 실시예에서, 제 2 항원과 비타겟 항체(NTAB)의 반응을 촉진하기 위하여 전술한 것과 같이 인큐베이션을 수행할 수 있다. 상기 인큐베이션은, 예를 들면 25 ℃에서 약 1 시간 동안 수행될 수 있다.
다음으로, 제 3 혼합물(MX3)에서 상기 제 2 결합체(BND2)와 상기 타겟 항체(TAB)를 분리하여 타겟 항체(TAB)를 선택적으로 획득할 수 있다(S700). 타겟 항체(TAB)를 얻기 위해서 제 2 결합체(BND2)를 혼합 용액에서 제거하거나 혼합 용액에서 타겟 항체(TAB)를 포함하는 용액 부분을 선택적으로 선별할 수 있다. 제 2 결합체(BND2)와 타겟 항체(TAB)를 분리하는 방법으로는 제 1 결합체(BND1)와 비타겟 항체(NTAB)를 분리하여 제 1 결합체(BND1)를 선택적으로 얻는 단계(S300)의 개시 사항을 참조할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 항체 선별 방법은 제 3 혼합물(MX3)을 얻는 단계(S600) 및 타겟 항체(TAB)를 선택적으로 얻는 단계(S700)를 적어도 2 회 이상 반복할 수 있다. 상기 단계들(S600, S700)을 반복 실시함으로써 타겟 항체(TAB)와 혼합되어 있는 리던던트 비타겟 항체(RDAB)를 제거하여 비타겟 항체(NTAB)가 잔류하지 않는 높은 수득률의 타겟 항체(TAB)를 선택적으로 얻을 수 있다. 일 실시예에서, 상기 단계들(S600, S700)은 2 회 반복될 수 있으며, 타겟 항체(TAB)의 수득률을 높이기 위하여 더 많은 횟수가 반복될 수도 있다.
일 실시예에서, 상기 항체 선별 방법은 제 2 결합체(BND2)가 제거된 혼합 용액으로부터 타겟 항체(TAB)를 정제하는 단계(S800)를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC), 단백질-G 크로마토그래피 또는 단백질-A 크로마토그래피 중 적어도 어느 하나 이상을 이용할 수 있다. 단백질 A는 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)에서 발견되는 세포 표면 단백질이다. 이는 포유동물 항체, 특히 IgG 클래스(class) 항체의 Fc 영역에 결합하는 성질을 가진다.
일 실시예에서, 단백질-A 크로마토그래피를 이용하여 분리한 이후, 용매에 용리(elution)시킨 후 농축시키는 단계를 더 포함할 수 있다(S900). 항체, 특히 단일클론 IgG의 정제에의 이의 사용은, 공지기술에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들면, Langone 등, 상기; Hjelm 등 공저의 1972년판 FEBS Lett. 28권의 73-76 쪽을 참조할 수 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 그 전체가 포함된다.
일 실시예에 따른 항체 선별 방법은, 도 1에서 전술한 항체 선별 방법에서 비정상 그람 음성균(CC) 대신에 그람 양성균(GP)을 이용하고, 그람 양성균(GP) 대신에 그람 음성균을 이용하여 그람 양성균(GP)에 특이적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')를 획득할 수도 있다. 그람 양성균(GP)에 특이적으로 결합하는 타겟 항체 선별 방법은, 대상 체의 혈청(SR)에 그람 양성균(GP)을 제공하여, 그람 양성균(GP)에 특이적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')와 그의 제 1 결합체(BND1)와 비타겟 항체(NTAB)를 포함하는 제 1 혼합물(MX1)을 얻는 단계, 제 1 혼합물(MX1)로부터 제 1 결합체(BND1)와 비타겟 항체(NTAB)를 분리하여 제 1 결합체(BND1)를 선택적으로 획득하는 단계, 제 1 결합체(BND1)를 그람 양성균(GP)과 타겟 항체(TAB')로 해리시키는 단계 및 타겟 항체(TAB')를 획득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 그람 양성균(GP)에 특이적으로 결합하는 항체 선별 방법에 관한 상세한 설명은 모순되지 않는 범위 내에서 도 1의 개시 사항들을 참조할 수 있다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법으로 분리된 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)의 형광 세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 그래프이고, 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체 선별 방법으로 분리된 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)의 형광 세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 그래프이다.
도 3a는 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')를 이용한 FACS 분석 그래프이다. 전술한 것과 같이, 일 실시예에 따른 항체 선별 방법은, 도 1에서 전술한 항체 선별 방법에서 비정상 그람 음성균(CC) 대신에 그람 양성균(GP)을 이용하고, 그람 양성균(GP) 대신에 그람 음성균을 이용하여 그람 양성균(GP)에 특이적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')를 획득할 수 있다. 도 3a 및 도 3b를 참조하면, 제 1 곡선(c1)은 타겟 항체(TAB, TAB')를 그람 양성균(GP)과 반응시킨 분석 그래프이고, 제 2 곡선(c2)은 타겟 항체(TAB, TAB')를 그람 음성균과 반응시킨 분석 그래프이며, 제 3 곡선(c3)은 비교예의 그래프이다. 일 실시예에서, 그람 양성균(GP)은 B. subtilis이고, 그람 음성균은 BL21일 수 있으나, 이는 비제한적인 예시로서 본 발명을 한정하지 않는다.
도 3a를 참조하면, 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')의 경우, 제 1 곡선(c1)이 나타내는 세기(intensity)가 제 2 곡선(c2)이 나타내는 세기에 비하여 큰 것을 알 수 있다. 이는, 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')가 그람 양성균(GP)에 강하게 결합함을 의미한다. 도 3b를 참조하면, 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)의 경우, 제 2 곡선(c2)이 나타내는 세기(intensity)가 제 1 곡선(c1)이 나타내는 세기에 비하여 큰 것을 알 수 있다. 이는, 그람 음성균에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)가 그람 음성균에 더 강하게 결합함을 의미한다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 타겟 항체(TAB)의 그람 양성균(GP)과의 결합 여부를 촬영한 형광 이미지이고, 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 항체(TAB)의 그람 음성균과의 결합 여부를 촬영한 형광 이미지이다.
일 실시예에서, 상기 그람 양성균(GP)은 고초균(B. subtilis), 리스테리아 모노키토게네스(L. monocytogenes) 또는 황색포도상구균(S. aureus)을 포함할 수 있고, 상기 그람 음성균은 대장균(BL21), DH5 알파 셀(DH5α), HB101 또는 JM110을 포함할 수 있다. 이는, 비제한적인 예시로서 본 발명을 한정하지 않는다. 도 4a 및 도 4b에서 좌측의 도면들은 일 실시예에 따른 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)의 형광 이미지이고, 우측의 도면들은 일 실시예에 따른 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')의 형광 이미지이다.
도 4a를 참조하면, 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)의 형광에 비하여 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')의 형광이 강한 세기로 발생하는 것을 볼 수 있다. 이는, 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)에 비하여 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')가 그람 양성균(GP)과 더 강하게 결합함을 나타낸다.
도 4b를 참조하면, 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')의 형광에 비하여 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)의 형광이 강한 세기로 발생하는 것을 볼 수 있다. 이는, 그람 양성균(GP)에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')에 비하여 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)가 그람 음성균과 더 강하게 결합함을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(BCT) 오염 진단 방법의 순서도이다.
도 5를 참조하면, 먼저, 피분석물을 준비한다(S1000~S1200). 도 5는 피분석물로부터 박테리아(BCT)를 분리하여 획득하여 준비하는 것을 도시하고 있으나, 이는 예시에 불과하며, 박테리아(BCT)를 분리하는 단계가 생략되고, 상기 피분석물에 직접적으로 후술되는 제 1 항체(TAB) 또는 제 2 항체(TAB')를 제공(S1300)할 수도 있다. 일 실시예에서, 상기 피분석물은 수혈용 혈액, 수혈용 혈청(SR), 적혈구 용액, 혈소판(PL) 용액, 의약품, 약물이 용해된 용액, 식염수 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이는 비제한적인 예시로서, 박테리아(BCT)의 오염 여부가 문제되는 모든 것들이 해당될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 피분석물의 박테리아(BCT) 오염 여부를 검출하여 박테리아(BCT)에 오염된 피분석물이 환자의 체내로 유입되어 상기 환자의 건강을 악화시키는 것을 방지하 수 있는 이점이 있다. 또한, 타겟 항체(TAB)를 이용한 간단한 방법으로 단시간 내에 박테리아(BCT) 오염 여부를 진단할 수 있어 신속한 치료가 가능한 이점이 있다.
일 실시예에서, 박테리아(BCT)는 상기 피분석물과의 비중 차이에 의하여 상기 피분석물로부터 분리하여 획득될 수 있다. 먼저, 박테리아(BCT)를 포함하는 피분석물을 준비하고(S1000), 이후, 상기 비중 차이를 이용하여 상기 박테리아(BCT)를 상기 피분석물로부터 분리할 수 있다(S1100). 박테리아(BCT)의 비중은 약 1.10 이상이고, 상기 피분석물의 비중은 박테리아(BCT)의 비중보다 낮을 수 있다. 예를 들면, 상기 피분석물이 혈소판(PL)인 경우, 혈소판(PL)의 비중은 1.05 내지 1.07일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 피분석물을 원심 분리하여 상기 피분석물로부터 상기 박테리아(BCT)를 분리할 수 있다. 또는, 상기 피분석물을 소정 기간 방치하여 상기 박테리아(BCT)를 하부에 가라앉힐 수도 있다. 이는 비제한적인 예시로서, 비중 차이를 이용한 분리에 관한 다양한 공지 기술들이 참작될 수 있다.
일 실시예에서, 피분석물에서 박테리아(BCT)를 제외한 나머지 구성들의 비중 값과 박테리아(BCT)의 비중 값 사이의 비중 값을 갖는 표준 물질을 상기 피분석물에 제공할 수 있다. 예를 들면, 박테리아(BCT)를 제외한 나머지 구성이 혈소판(PL)인 경우, 혈소판(PL)의 비중은 1.05 내지 1.07의 범위 내일 수 있고, 박테리아(BCT)의 비중이 1.10 이상인 경우, 약 1.083의 비중을 갖는 표준 물질이 제공될 수 있다. 상기 표준 물질은 예시적으로, 히스토팍1083일 수 있다.
다음으로, 피분석물에서 박테리아(BCT)를 제외한 나머지 구성들을 제거하여 박테리아(BCT)를 획득할 수 있다(S1200). 예를 들면, 박테리아(BCT)는 상기 피분석물로부터 분리되어 상기 피분석물의 하부에 침전되거나 밀집될 수 있고, 박테리아(BCT)를 제외한 나머지 구성들을 스포이드와 같은 기구로 분리할 수 있다. 또는, 상기 파분석물의 하부에 침전되거나 밀집된 박테리아(BCT)를 분리하여 획득할 수도 있다.
다른 실시예에서, 상기 피분석물을 마이크로 필터로 필터링하여 박테리아(BCT)를 분리하여 획득할 수도 있다. 상기 마이크로 필터의 구멍은 박테리아(BCT)보다는 작고, 박테리아(BCT)를 제외한 나머지 구성들보다는 클 수 있다. 상기 구멍의 크기는 제한되지 않으며, 상기 피분석물의 종류에 따라 달라질 수 있다.
다음으로, 피분석물 또는 상기 피분석물로부터 획득된 박테리아(BCT)에 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질과 결합되고, LPS(lipopolysaccharide)를 포함하지 않는 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 제 1 항체(TAB) 또는 박테리아(BCT)에 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질과 결합되고, LTA(lipoteichoic acid)을 포함하는 그람 양성균(GP)의 상기 LTA에 선택적으로 결합하는 제 2 항체(TAB')를 제공할 수 있다(S1300). 일 실시예에서, 제 1 타겟 항체가 먼저 제공될 수 있고, 제 2 타겟 항체가 먼저 제공될 수도 있고, 제 1 타겟 항체(AB1) 및 제 2 타겟 항체(AB2)가 함께 제공될 수도 있다. 일 실시예에서, 박테리아(BCT)는 그람 음성균 또는 그람 양성균(GP)일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제 1 타겟 항체가 상기 그람 음성균의 LPS가 아닌 상기 그람 음성균의 외막에 결합함으로써, 다양한 종류의 LPS를 갖는 그람 음성균들에 의하여 전기적, 화학적 또는 광학적 반응을 발생시킬 수 있는 이점이 있다. 제 1 타겟 항체(AB1)에는 그람 음성균의 외막에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB)에 관하여 전술한 개시 사항들이 참조될 수 있고, 제 2 타겟 항체(AB2)에는 그람 양성균에 선택적으로 결합하는 타겟 항체(TAB')에 관하여 전술한 개시 사항들이 참조될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 표지 물질은 발색 물질, 발광 물질, 형광 물질 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 표지 물질들은 발색, 발광 또는 형광과 같은 광학적 반응을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 물질은 비제한적인 예시로서, FAM 형광 물질 또는 TAMRA 형광 물질일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 표지 물질은 산화-환원 반응을 일으키는 촉매일 수 있다. 상기 촉매에 의한 산화 반응 또는 환원 반응에 의한 전기적 신호가 발생될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 표지 물질은 홀스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase; AP) 또는 퍼옥시다아제 화합물 중 적어도 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 표지 물질은 제 1 타겟 항체(AB1) 또는 제 2 타겟 항체(AB2)와 결합되어 상기 피분석물에 제공될 수 있다. 다른 실시예에서는, 상기 피분석물에 제 1 타겟 항체(AB1) 또는 제 2 타겟 항체(AB2)를 먼저 제공하고, 이후, 상기 표지 물질을 제공할 수도 있다. 이는 예시적으로서, 본 발명을 한정하지 않는다.
다음으로, 박테리아(BCT)와 상기 표지 물질의 전기적, 화학적 또는 광학적 반응을 이용하여 박테리아(BCT)의 식별 또는 농도를 분석할 수 있다. 예를 들면, 상기 전기적, 화학적 또는 광학적 반응이 발생하는 경우에는 피분석물이 박테리아(BCT)에 오염되었다고 진단할 수 있고, 상기 전기적, 화학적 또는 광학적 반응이 발생하지 않는 경우에는 상기 피분석물이 박테리아(BCT)에 의해 오염되지 않았다고 진단할 수 있다. 일 실시예에서는 상기 전기적, 화학적 또는 광학적 반응의 크기를 정량하여 상기 피분석물 내에 박테리아(BCT)의 농도를 분석하거나, 상기 피분석물의 오염도를 측정할 수 있다. 예를 들면, 상기 전기적, 화학적 또는 광학적 반응을 광학 현미경, 광계측기, 전류계, 전압계, 크로노암페로메트리(chronoamperometry), 크로노볼타메트리(chronovoltametry), pH 측정기 또는 이들의 조합을 이용하여 분석할 수 있다. 이는 비제한적인 예시이며, 다양한 종류의 측정 장비가 적용될 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(BCT) 오염 진단 키트를 나타낸 도면이다.
도 6을 참조하면, 일 실시예에서, 박테리아(BCT) 오염 진단 키트는 LPS(lipopolysaccharide)를 포함하지 않는 비정상 그람 음성균(CC)의 외막에 선택적으로 결합하는 제 1 타겟 항체(AB1) 및 LTA(lipoteichoic acid)을 포함하는 그람 양성균(GP)의 상기 LTA에 선택적으로 결합하는 제 2 타겟 항체(AB2)를 포함할 수 있다. 또한, 일 실시예에서, 박테리아(BCT) 진단 키트는 혈소판(PL) 오염 진단 키트일 수 있다. 박테리아(BCT) 진단 키트에 관한 상세한 설명은 모순되지 않는 범위 내에서 전술한 개시 사항들이 참조될 수 있다.
일 실시예에서, 박테리아(BCT) 오염 진단 키트는 마이크로 어레이, 마이크로 칩(microchip) 또는 스트립(strip)형 키트일 수 있다. 다른 실시예에서, 박테리아(BCT) 오염 진단 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 엘리사(ELISA) 키트를 더 포함할 수도 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 제 1 타겟 항체(AB1) 및 제 2 타겟 항체(AB2)로 구성된 박테리아(BCT) 오염 진단 키트를 제공함으로써, 간단한 구성으로 사용이 용이하며, 키트의 소형화가 가능하여 휴대성 또는 편의성이 향상될 수 있으며, 생산 비용이 감소된 박테리아(BCT) 오염 진단 키트를 제공할 수 있다.
일 실시예에서, 박테리아(BCT) 진단 키트는 제 1 타겟 항체(AB1) 및 제 2 타겟 항체(AB2)에 결합된 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 제 1 타겟 항체(AB1) 또는 제 2 타겟 항체(AB2)에 결합되어 제공되거나, 상기 표지 물질이 용해 또는 분산된 용액으로 제공될 수도 있다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 항체(TAB)를 이용한 그람 양성균(GP)의 농도에 따른 형광 세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 표준 곡선이고, 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 항체(TAB)를 이용한 그람 음성균의 농도에 따른 형광 세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS) 표준 곡선이다.
도 7a를 참조하면, 일 실시예에서, x축은 그람 양성균(GP)의 집락형성단위(colony-forming unit; CFU)를 나타내며, y축은 FACS를 이용하여 측정된 그람 양성균(GP)의 수를 나타낼 수 있다. 도 7a의 곡선은 그람 양성균(GP)의 집락형성단위의 증가에 따른 측정된 그람 양성균(GP)의 수의 표준 곡선을 나타낸 그래프이다. 일 실시예에서, 상기 그람 양성균(GP)은 B. subtilis일 수 있다. 상기 집락형성단위의 증가에 따라 상기 측정된 그람 양성균(GP)의 수도 증가하는 것을 볼 수 있으며, 최대 측정 한계는 1.2ⅹ104 cfu까지 측정 가능한 것을 볼 수 있다.
도 7b를 참조하면, x축은 그람 음성균의 집락형성단위(colony-forming unit; CFU)를 나타내며, y축은 FACS를 이용하여 측정된 그람 음성균의 수를 나타낼 수 있다. 도 7a의 곡선은 그람 음성균의 집락형성단위의 증가에 따른 측정된 그람 음성균의 수의 표준 곡선을 나타낸 그래프이다. 일 실시예에서, 상기 그람 음성균은 BL21일 수 있다. 상기 집락형성단위의 증가에 따라 상기 측정된 그람 음성균의 수도 증가하는 것을 볼 수 있으며, 최대 측정 한계는 3.7ⅹ104 cfu까지 측정 가능한 것을 볼 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 피분석물 내의 그람 양성균(GP) 또는 그람 음성균을 상기 표지 물질의 전기적, 화학적 또는 광학적 반응을 분석하여 정량할 수 있어, 상기 피분석물의 오염의 정도를 측정할 수 있는 이점이 있다. 또한, 상기 오염의 정도를 수치화하여 오염 여부 분석의 정확도를 향상시킬 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명이 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
TAB: 타겟 항체
SR: 혈청
NTAB: 비타겟 항체
BND1: 제 1 결합체
MX1: 제 1 혼합물
CC: 비정상 그람 음성균
MX2: 제 2 혼합물
MX3: 제 3 혼합물
GP: 그람 양성균
BND2: 제 2 결합체
RDAB: 리던던트 비타겟 항체
PL: 혈소판

Claims (14)

  1. 대상 체의 혈청에 LPS(lipopolysaccharide)를 포함하는 정상 그람 음성균 대비 외막에 ⅰ) 상기 LPS를 포함하지 않거나, ⅱ) 상기 LPS의 변형물을 포함하거나, ⅲ) 지질의 지방산 사슬 중 하나 이상이 제거되거나 다른 지방산 사슬로 치환되거나, ⅳ) IVA(4-A) 지질 이외의 지질이 적용된 비정상 그람 음성균을 제공하여, 상기 비정상 그람 음성균의 외막에 선택적으로 결합하는 제 1 타겟 항체와 상기 비정상 그람 음성균의 제 1 결합체와 비타겟 항체를 포함하는 제 1 혼합물을 얻는 단계;
    상기 제 1 혼합물로부터 상기 제 1 결합체와 상기 비타겟 항체를 분리하여 상기 제 1 결합체를 선택적으로 획득하는 단계;
    상기 제 1 결합체를 상기 비정상 그람 음성균과 상기 제 1 타겟 항체로 해리시키는 단계; 및
    상기 제 1 타겟 항체를 획득하는 단계를 포함하는 항체 선별 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 타겟 항체에 상기 정상 그람 음성균을 처리하여, 상기 제 1 타겟 항체로부터 상기 정상 그람 음성균의 상기 LPS에 선택적으로 결합하는 제 2 타겟 항체를 획득하는 단계를 포함하는 항체 선별 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 타겟 항체를 획득하는 단계는,
    상기 비정상 그람 음성균을 제거하여 상기 타겟 항체와 상기 제 1 결합체로부터 분리된 리던던트 비타겟 항체의 제 2 혼합물을 획득하는 단계;
    상기 제 2 혼합물에 상기 리던던트 비타겟 항체와 특이적으로 결합하는 그람 양성균을 제공하여, 상기 리던던트 비타겟 항체와 상기 그람 양성균의 제 2 결합체를 형성하여, 상기 제 1 타겟 항체와 상기 제 2 결합체를 포함하는 제 3 혼합물을 획득하는 단계; 및
    상기 제 3 혼합물에서 상기 제 2 결합체와 상기 제 1 타겟 항체를 분리하여 상기 제 1 타겟 항체를 선택적으로 획득하는 단계를 포함하는 항체 선별 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 타겟 항체는 정상 그람 음성균의 외막에도 선택적으로 결합하는 항체 선별 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 제 1 타겟 항체는 상기 정상 그람 음성균의 외막의 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 선별 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 정상 그람 음성균은 폐렴막대균(Klebsiella penumoniae), 아시네토박터(Acinetobacter baumannii), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박터(Enterobacter spp.), 살모넬라균(salmonella), 이질균(shigella), 리케차(R. rickettsii), 대장균(E. coli), 콜레라균(V. cholerae), 페스트균(Y. pestis), 임질구균(N. gonorrhoeae), 수막염균(N. meningitidis) 또는 나선상균(spirochaeta) 중 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 항체 선별 방법.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 그람 양성균은 포도상구균(staphylococcus), 연쇄상구균(streptococcus), 폐렴균(pneumococcus), 나병균(M. leprae), 디프테리아균(C. diphtheriae), 파상풍균(C. tetani), 탄저균(B. anthracis), 방선균(actinobacteria) 또는 고초균(B. subtilis) 중 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 항체 선별 방법.
  8. 대상 체로부터 수득하고 박테리아를 포함하는 피분석물을 준비하는 단계;
    상기 피분석물 또는 상기 피분석물로부터 분리하여 획득된 박테리아에 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질과 결합되고, LPS(lipopolysaccharide)를 포함하는 정상 그람 음성균 대비 외막에 ⅰ) 상기 LPS를 포함하지 않거나, ⅱ) 상기 LPS의 변형물을 포함하거나, ⅲ) 지질의 지방산 사슬 중 하나 이상이 제거되거나 다른 지방산 사슬로 치환되거나, ⅳ) IVA(4-A) 지질 이외의 지질이 적용된 비정상 그람 음성균의 외막에 특이적으로 결합하는 제 1 타겟 항체를 제공하는 표지 단계; 및
    상기 박테리아와 상기 표지 물질의 전기적, 화학적 또는 광학적 반응을 이용하여 상기 박테리아의 식별 또는 농도를 분석하는 단계를 포함하고,
    상기 박테리아는 그람 양성균 또는 그람 음성균인 박테리아 오염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 표지 단계는 상기 박테리아에 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질과 결합되고, LTA(lipoteichoicacid)을 포함하는 그람 양성균의 상기 LTA에 선택적으로 결합하는 제 2 타겟 항체를 더 제공하는 박테리아 오염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 피분석물을 준비하는 단계는,
    상기 피분석물로부터 비중 차이를 이용하여 상기 박테리아를 분리하여 획득하는 박테리아 오염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 표지 단계는,
    상기 제 1 타겟 항체 또는 상기 제 2 타겟 항체를 준비하는 단계; 및
    상기 제 1 타겟 항체 또는 상기 제 2 타겟 항체에 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질을 제공하는 단계를 포함하는 박테리아 오염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  12. LPS(lipopolysaccharide)를 포함하는 정상 그람 음성균 대비 외막에 ⅰ) 상기 LPS를 포함하지 않거나, ⅱ) 상기 LPS의 변형물을 포함하거나, ⅲ) 지질의 지방산 사슬 중 하나 이상이 제거되거나 다른 지방산 사슬로 치환되거나, ⅳ) IVA(4-A) 지질 이외의 지질이 적용된 비정상 그람 음성균의 외막에 선택적으로 결합하는 제 1 타겟 항체 및
    LTA(lipoteichoic acid)을 포함하는 그람 양성균의 상기 LTA에 선택적으로 결합하는 제 2 타겟 항체를 포함하는 박테리아 오염 진단 키트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 박테리아 오염 진단 키트는 상기 제 1 타겟 항체 및 상기 제 2 타겟 항체에 결합된 전기적, 화학적 또는 광학적 표지 물질을 더 포함하는 박테리아 오염 진단 키트.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 박테리아 오염 진단 키트는 혈소판 오염 진단 키트인 박테리아 오염 진단 키트.
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