RU2741199C1 - Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов - Google Patents
Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2741199C1 RU2741199C1 RU2020131639A RU2020131639A RU2741199C1 RU 2741199 C1 RU2741199 C1 RU 2741199C1 RU 2020131639 A RU2020131639 A RU 2020131639A RU 2020131639 A RU2020131639 A RU 2020131639A RU 2741199 C1 RU2741199 C1 RU 2741199C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sample
- zone
- binding protein
- membrane
- immunochromatographic
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Abstract
Изобретение относится к иммунологии, медицинской и ветеринарной диагностике и представляет собой способ проведения иммунохроматографической серодиагностики. Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов для определения специфических антител посредством использования (1) мультимембранного композита, в котором на функциональном участке иммобилизуется антиген патогенного организма, (2) раствора, содержащего меченый иммуноглобулин-связывающий белок; (3) смывающего буфера характеризуется тем, что на разные участки начальной мембраны мультимембранного композита последовательно добавляются: проба, раствор, содержащий меченый иммуноглобулин-связывающий белок; и смывающий буфер; при этом зоны для нанесения реагентов располагаются следующим образом: зона для меченого иммуноглобулин-связывающего белка располагается между зоной для нанесения пробы и зоной для нанесения смывающего буфера; зона для нанесения пробы соприкасается с рабочей мембраной тест-полоски, на которой располагается аналитическая зона, и при этом отсутствует подложка для нанесения конъюгата. Изобретение обеспечивает повышение достоверности анализа. 1 пр., 2 ил.
Description
Изобретение относится к области иммунологии, медицинской и ветеринарной диагностике и представляет собой способ проведения иммунохроматографической серодиагностики. Одним из основных методов скрининговой диагностики бруцеллеза является серодиагностика - определение специфических антител против антигенов возбудителя бруцеллеза в крови зараженных животных (P. Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology-E-Book, 13th ed.; Elsevier Ltd.: St. Louis, MO, USA, 2013; p. 1056. ISBN 9780323083300.). Особенно перспективным представляется реализация серодиагностики в формате иммунохроматографии (ИХ), позволяющей проводить диагностику непосредственно на месте отбора проб неквалифицированным персоналом. Принцип работы ИХ основан на движении жидкой пробы вдоль мембран (формирующих тест-полоску) под действием капиллярных сил, которое приводит к последовательному взаимодействию реагентов на разных участках мембран и окрашиванию функциональных участков тест-полоски. Благодаря такой реализации анализа количество манипуляционных стадий сводится к минимуму, что делает ИХ идеальным решением для внелабораторной диагностики.
Традиционная схема иммунохроматографического анализа для серодиагностики основана на взаимодействии иммуноглобулинов в тестируемой сыворотке крови с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом (обычно в качестве такового реагента выбирают антивидовые антитела, белок А из Staphylococcus aureus или белок G из Streptococcus spp.). Традиционно меченый иммуноглобулин-связывающий реагент предварительно наносится и высушивается на специальной подложке, расположенной между мембраной для нанесения пробы и рабочей мембраной с аналитической зоной. После добавления жидкой пробы она протекает через подложку с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом. Вследствие этого проба смешивается с меченым иммуноглобулин-связывающим реагентом, который связывает все иммуноглобулины в пробе. Последующая детекция специфических антител, образовавших комплекс с меткой, осуществляется путем их взаимодействия в аналитической зоне тест-полоски с иммобилизованным антигеном, что приводит к концентрированию метки в аналитической зоне и формированию окрашенной полосы (Sajid, M., Kawde, A.N., & Daud, M. (2015). Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review. Journal of Saudi Chemical Society, 19(6), 689-705.). На данном принципе основано большинство используемых на сегодняшний день систем для ИХ-серодиагностики, в частности тест-система для серодиагностики лейкоза крупного рогатого скота, описанная Mukantayev и соавт. (Mukantayev, K., Tursunov, K., Raimbek, G., Shustov, A., Begaliyeva, A., Ingirbay, B., Mukanov, K. & Ramanculov, E. (2018). IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY FOR DIAGNOSIS OF BOVINE LEUKAEMIA VIRUS INFECTION IN COWS USING THE RECOMBINANT PROTEIN GP51. Veterinarija ir Zootechnika, 76(98). https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf), использованная в настоящей заявке в качестве наиболее близкого аналога.
Схематичное изображение тест-полоски, основанной на данном принципе, представлено на рис. 1А. Тест-полоска для ИХ-серодиагностики с традиционной схемой включает следующий набор компонентов:
• начальная мембрана, абсорбирующая образец, на которую наносится анализируемая проба;
• подложка под конъюгат, на которую наносится конъюгат маркера с рецепторными молекулами (антивидовыми антителами, белками A/G и пр.);
• рабочей мембраны с иммобилизованным антигеном патогена;
• конечной абсорбирующей мембраны, впитывающей жидкость, протекающую через рабочую мембрану.
Процедура анализа в данной системе сводится к добавлению на один и тот же участок начальной абсорбирующей мембраны пробы и разбавляющего буфера и, через 10-15 мин, регистрацию результатов анализа.
Данная схема ИХ-серодиагностики предполагает взаимодействие всех иммуноглобулинов, содержащихся в пробе, с реагентом для связывания иммуноглобулинов. С антигеном же взаимодействует только небольшая доля специфичных к нему иммуноглобулинов, которая обычно не превышает 1% от общей концентрации иммуноглобулинов в крови. Таким образом, сигнал ИХ-анализа (интенсивность окраски аналитической зоны) в традиционной схеме зависит не только от концентрации специфических антител, но и от общего содержания иммуноглобулинов в пробе, что не является диагностически значимым параметром. Конкуренция между специфическими и общими иммуноглобулинами за связывание с иммуноглобулин-связывающим белком негативно сказывается на достоверности диагностики. Поэтому иммунохроматография зачастую уступает по чувствительности альтернативным методам серодиагностики (Sotnikov, D.V., Zherdev, A.V., & Dzantiev, B.B. (2017). Theoretical and experimental comparison of different formats of immunochromatographic serodiagnostics. Sensors, 18(1), 36.).
Предлагаемый альтернативный способ ИХ-серодиагностики заключается в разделении стадий связывания специфических иммуноглобулинов с иммобилизованным антигеном и меченым иммуноглобулин-связывающим белком. Для последовательного связывания иммуноглобулинов и меченого реагента в аналитической зоне проба, раствор, содержащий меченый иммуноглобулин-связывающий белок и смывающий буфер последовательно наносятся на начальную мембрану тест-полоски как показано на рис. 1Б. На первой стадии специфические иммуноглобулины в пробе сначала взаимодействуют с антигеном в аналитической зоне, при этом не связавшиеся иммуноглобулины увлекаются потоком жидкости и вымываются из реакционной зоны. На второй стадии иммуноглобулины, связавшиеся в аналитической зоне, проявляются посредством взаимодействия с меченым иммуноглобулин-связывающим белком. Смывающий буфер необходим для поддержания постоянного потока жидкости через мембраны теста. Состав тест-полоски отличается от традиционного только отсутствием подложки под конъюгат. Продолжительность анализа составляет 10-15 мин.
Преимущество предлагаемого подхода продемонстрировано на примере ИХ-системы для определения специфических антител против рекомбинантного антигена P24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Пример
Для формирования тест-систем использовали набор мембран компании Advanced Microdevices (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC15, подложку под конъюгат PT-R5 (только в тест-системе с традиционным форматом), мембрану для нанесения образца GFB-R4 и конечную адсорбирующую мембрану CFSP 223000 Millipore (США).
Для формирования аналитической зоны использовали антиген P24 производства РГП «Национальный центр биотехнологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора антигена (1 мг/мл в 100 мМ Na - цитратном буфере, рН 6). Конъюгат коллоидного золота (средний диаметр частиц 25 нм) со стрептококковым белком G синтезировали при концентрации белка 10 мкг/мл и оптической плотности золота D520=1. Конъюгат очищали от не связавшегося белка посредством центрифугирования при 10000 g и концентрировали до D520=20. Для тест-системы в традиционном формате (рис. 1А) конъюгат наносили на подложку в объеме 15 мкл на 1 см полосы. В тест-системе в предложенном альтернативном формате (рис. 1Б) конъюгат использовали в жидком виде, нанося 5 мкл конъюгата D520=20 на начальную адсорбирующую мембрану непосредственно после добавления анализируемой пробы. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 3,5 мм.
Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. В тест-системе с традиционным форматом анализа (рис. 1А) на начальную адсорбирующую мембрану наносили 10 мкл сыворотки крови коровы зараженной вирусом лейкоза КРС. Затем в то же место наносили 50 мкл разбавляющего раствора (50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl и 1% Tween-20). Фиксацию результата тестирования осуществляли через 10 мин.
В тест-системе с предложенным альтернативным форматом анализа (рис. 1Б) на начальную адсорбирующую мембрану наносили 5 мкл сыворотки крови коровы зараженной вирусом лейкоза КРС. Далее примерно на 1 см ниже места нанесения сыворотки наносили 5 мкл конъюгата белка G с коллоидным золотом D520=20. Затем примерно на 1 см ниже места нанесения конъюгата наносили 50 мкл смывающего раствора (50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl и 1% Tween-20). Фиксацию результата тестирования осуществляли через 10 мин.
Пример результата тестирования сыворотки крови коровы с диагнозом «лейкоз» в двух форматах анализа представлен на рис. 2. Представленные результаты демонстрируют повышение интенсивности сигнала в аналитической зоне в предложенном способе серодиагностики и, таким образом, повышение достоверности анализа.
Claims (1)
- Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов для определения специфических антител посредством использования (1) мультимембранного композита, в котором на функциональном участке иммобилизуется антиген патогенного организма, (2) раствора, содержащего меченый иммуноглобулин-связывающий белок; (3) смывающего буфера, характеризующийся тем, что на разные участки начальной мембраны мультимембранного композита последовательно добавляются: проба, раствор, содержащий меченый иммуноглобулин-связывающий белок; и смывающий буфер; при этом зоны для нанесения реагентов располагаются следующим образом: зона для меченого иммуноглобулин-связывающего белка располагается между зоной для нанесения пробы и зоной для нанесения смывающего буфера; зона для нанесения пробы соприкасается с рабочей мембраной тест-полоски, на которой располагается аналитическая зона, и при этом отсутствует подложка для нанесения конъюгата.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020131639A RU2741199C1 (ru) | 2020-09-25 | 2020-09-25 | Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020131639A RU2741199C1 (ru) | 2020-09-25 | 2020-09-25 | Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2741199C1 true RU2741199C1 (ru) | 2021-01-22 |
Family
ID=74213044
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020131639A RU2741199C1 (ru) | 2020-09-25 | 2020-09-25 | Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2741199C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2532352C2 (ru) * | 2012-06-28 | 2014-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) | Способ проведения иммунохроматографического анализа для серодиагностики |
RU2545909C2 (ru) * | 2013-03-19 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) | Способ иммунохроматографического определения специфических антител |
-
2020
- 2020-09-25 RU RU2020131639A patent/RU2741199C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2532352C2 (ru) * | 2012-06-28 | 2014-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) | Способ проведения иммунохроматографического анализа для серодиагностики |
RU2545909C2 (ru) * | 2013-03-19 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) | Способ иммунохроматографического определения специфических антител |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
BARSHEVSKAYA L.V. et al. Triple Immunochromatographic System for Simultaneous Serodiagnosis of Bovine Brucellosis, Tuberculosis, and Leukemia / Biosensors 2019, 9, 115; 10 pages. * |
SOTNIKOV D.V. et al. Theoretical and Experimental Comparison of Different Formats of Immunochromatographic Serodiagnostics / Sensors 2018, 18, 36, 15 pages. * |
СОТНИКОВ Д.В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ: КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ / Диссерт. на соис. уч. степ. к.х.н., Москва, 2016. * |
СОТНИКОВ Д.В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ: КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ / Диссерт. на соис. уч. степ. к.х.н., Москва, 2016. SOTNIKOV D.V. et al. Theoretical and Experimental Comparison of Different Formats of Immunochromatographic Serodiagnostics / Sensors 2018, 18, 36, 15 pages. BARSHEVSKAYA L.V. et al. Triple Immunochromatographic System for Simultaneous Serodiagnosis of Bovine Brucellosis, Tuberculosis, and Leukemia / Biosensors 2019, 9, 115; 10 pages. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6742978B2 (ja) | ラテラルフローおよび関連する免疫アッセイにおけるシグナル増幅 | |
US20050272106A1 (en) | Methods and kits for detection of multiple pathogens | |
US11714084B2 (en) | Method and associated device for rapid detection of target biomolecules with enhanced sensitivity | |
US8916389B2 (en) | Sensor element for SPR measurement | |
JP2019507890A5 (ru) | ||
US20210072235A1 (en) | Method for diagnosing tuberculosis | |
KR20160120675A (ko) | 래피드 정량 진단 키트 | |
JP4653574B2 (ja) | ヘモグロビンA1cの測定方法 | |
RU2741199C1 (ru) | Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов | |
JP6858784B2 (ja) | サブトラクティブイムノアッセイ方法およびその方法を実施するためのラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイストリップ | |
RU2532352C2 (ru) | Способ проведения иммунохроматографического анализа для серодиагностики | |
WO2005069002A1 (en) | Rapid test for antibodies against hiv in urine | |
RU2530560C2 (ru) | Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител | |
RU2545909C2 (ru) | Способ иммунохроматографического определения специфических антител | |
JP7417231B2 (ja) | 抗インターフェロンγ抗体を検出するための免疫クロマトグラフィーによる方法及びキット | |
RU2753237C1 (ru) | Способ иммунохроматографического анализа для серодиагностики с комбинированной схемой связывания антител | |
KR102314073B1 (ko) | 피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법 | |
Byzova et al. | Manufacturing lateral flow tests for tuberculosis diagnosis: choosing a reactants completion and sensing regime | |
JP2022153079A (ja) | 尿検体から血中及び尿中の細菌を検出する方法及びキット | |
EP4320438A1 (en) | Multiplex immunoassay for the detection of mycoplasma bovis infection | |
KR100524821B1 (ko) | 보체 1q를 이용한 단백질 칩 검출방법 | |
TR2022011905A2 (tr) | Yeni̇ bi̇r kontrol çi̇zgi̇si̇ yaklaşimina sahi̇p yanal akiş (lateral flow assay) hizli tani ki̇ti̇ | |
WO2004016804A2 (en) | Assay for detection of antigen in bodily fluid |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210520 Effective date: 20210520 |