KR100524821B1 - 보체 １ｑ를 이용한 단백질 칩 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보체 1q(Complement 1q, C1q)를 이용한 단백질 칩 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항원이 결합된 항체에만 반응하는 C1q를 단백질 칩 검출방법에 적용함으로써 기존의 검출방법과는 달리 수많은 항원을 동시에 측정할 수 있으며, 수십 내지 수백개의 이차항체를 생산할 필요가 없어 비용에서나 시간적인 면에서 매우 경제적이며, 누구나 손쉽게 한번에 수백개의 면역반응 유무와 반응의 정도를 감지해 낼 수 있는 단백질 칩 검출방법에 관한 것이다.

Description

보체 １ｑ를 이용한 단백질 칩 검출방법{The development of the detection method using Complement 1 q for protein chips}

본 발명은 보체 1q(Complement 1q, C1q)를 이용한 단백질 칩 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항원이 결합된 항체에만 반응하는 C1q를 단백질 칩 검출방법에 적용함으로써 기존의 검출방법과는 달리 수많은 항원을 동시에 측정할 수 있으며, 수십 내지 수백개의 이차항체를 생산할 필요가 없어 비용에서나 시간적인 면에서 매우 경제적이며, 누구나 손쉽게 한번에 수백개의 면역반응 유무와 반응의 정도를 감지해 낼 수 있는 단백질 칩 검출방법에 관한 것이다.

1990년부터 시작된 게놈 프로젝트(genome project)의 진전에 힘입어 최근 인간유전자의 구조가 대부분 밝혀지면서 인체를 구성하는 유전자의 기능연구에 대한 관심이 급증하고 있다. 유전자는 단백질을 발현해 세포 내에서 그 기능을 수행하기 때문에 게놈의 기능연구는 단백질에 대한 연구로 귀결되며, 최근 프로테오믹스(proteomics, 단백질체학)라는 새로운 연구분야가 국내외적으로 많은 관심을 불러일으키고 있다. 프로테오믹스는 게놈(genome)에 의해 발현되는 모든 단백질들의 총합을 일컫는 프로테옴(proteome)을 다루는 학문으로, 어떤 단백질이 얼마의 양으로 어떤 환경에서 발현되는 가를 파악하는 것을 목적으로 한다. 생명체의 게놈이 생명체가 수행하는 기능의 이론적인 면만을 제시할 수 있음에 반해, 프로테옴은 세포가 처해있는 환경에 따라 세포의 실제적인 기능을 표현해 준다. 이러한 이유로 급속한 속도로 밝혀지고 있는 미지의 유전자들의 기능을 밝혀내고자 하는 기능유전체학(functional genomics)의 한 부분으로 새롭게 부각되고 있고, 세포 내에서 일어나는 실제적인 현상들을 전체 단백질 단계에서 통합적으로 파악하는 수단으로 제공된다. 이러한 프로테오믹스 연구에 필수적으로 이용될 수 있는 핵심기술이 단백질 칩이며, 이는 수십 내지 수백 개의 단백질을 작은 칩 상에 고정해 동시다발적으로 단백질의 결합을 분석하는 자동화 기기 시스템이다. 이는 질병의 진단, 단백질의 발현 및 기능연구, 단백질의 상호작용 연구, 신약개발 등 다양한 응용분야를 가지고 있어 의학, 약학, 생명과학분야에서 광범위하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

한편, 단백질 칩을 개발하는데 있어서 검출 기술은 가장 중요한 부분으로 자동진단기기의 가장 중요한 정확성과 신속성이 요구되어진다.

대표적으로 단백질 칩은 표면플라즈몬 공명장치(SPR, Surface plasmon resonance)와 SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization - Time of Flight)의 2가지 기술로 측정하는데, 이 방법들은 미지의 단백질을 직접 분석할 수 있는 장점이 있으나 수많은 항원을 동시에 측정하는 데는 어려움이 있다.

또 다른 방법으로는 형광물질이 붙어있는 이차항체를 이용하여 항체-항원의 반응여부를 판단하는 방법이 있으며, 이와 같은 방법으로 목적물질의 유무를 판단하기 위해서는 각 항원에 맞는 이차항체가 필요하다. 이는 칩 상에 고정된 항체와 동일한 항체에 형광물질이 부착된 형태로 측정대상에 있는 항원이 자신에 맞는 특정 항체에 반응하여 부착하면 여기에 형광물질이 부착된 이차항체가 붙어 그 위치에 항체가 반응했다는 것을 보여주어 이를 검출한다. 그러나, 이 방법은 칩 상에 부착된 항체와 동일한 수의 이차항체가 필요하여 비용 상승 및 생산과 측정 방법에서 복잡한 작업이 필요한 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 제시된 문제점들을 해결하기 위하여 면역반응의 유무를 좀더 간단하고 단 하나의 물질로 검출할 수 있는 방법을 연구한 결과, C1q를 이용한 단백질 칩 검출방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 C1q를 이용한 단백질 칩 검출방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 항원ㆍ항체 반응물에 표적한 보체1q(Complement 1q, C1q)를 반응시켜 면역반응 유무와 반응 정도를 감지하는 단백질 칩 검출방법에 그 특징이 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 항원이 결합된 항체에만 반응하는 C1q를 단백질 칩 검출방법에 적용함으로써 기존의 검출방법과는 달리 수많은 항원을 동시에 측정할 수 있으며, 수십 내지 수백개의 이차항체를 생산할 필요가 없어 비용에서나 시간적인 면에서 매우 경제적이며, 누구나 손쉽게 한번에 수백개의 면역반응 유무와 반응의 정도를 감지해 낼 수 있는 단백질 칩 검출방법에 관한 것이다.

보체는 척추동물의 신선한 혈청 속에서 각종 면역 반응이나 감염 방어 등에 관여하는 약 20여종의 단백질의 총칭으로, 열에 불안정하며, 항원과 항체의 결합물에 특이하게 결합하는 성질이 있다. 항원과 항체의 복합체에 반응하여 활성화되어 혈구를 파괴시키는 용혈 작용이나 세균을 파괴시키는 용균 작용 등을 촉진시킴으로써 여러 가지 효과를 가져오는 단백질이다. 상기 보체성분 중에 C1은 항원의 용균작용을 개시하는 역할을 하며, C1q, C1r, C1s로 이루어져 있으며 C1r과 C1s는 다음 기작이 일어날 수 있도록 유도하는 효소이며 이중 C1q는 430 kDa 정도의 단백질로 6개의 튤립다발처럼 줄기에 서로 붙어있는 구조를 하고 있으며 보체 활성화의 첫 구성성분 중 항체에 결합하는 물질로 항원이 붙지 않은 항체( IgG(Immunoglobulin G), IgM(Immunoglobulin M))에는 붙지 않으며, IgM과는 1:1로 IgG의 경우에는 두 개 이상의 항원에 결합한 IgG가 30 ∼ 40 nm 이내의 거리에 있을 때 항체의 Fc(Fragment crystaline) 사이트에 결합한다.

따라서, 상기에 설명한 바와 같이 여러 보체성분 중에서 C1q가 항원이 결합된 항체에만 반응하는 성분이고 다른 효소의 도움 없이 항원에 반응한 항체만으로 항체와의 결합에너지가 활성화되기 때문에 단백질 칩의 검출에 적용되는 것이 바람직하다.

단백질 칩은 한 가지 혹은 몇 가지의 항원만을 검사하는 기존의 면역반응검출장치와는 달리 한 기판 위에 수백에서 수천 종류의 항체가 고정화되어 그 수만큼의 항원을 검출하고 샘플의 항원을 고정화 후 이차항체로 검출하는 것과는 달리 항체를 고정화 시켜놓은 기판으로 샘플의 항원 유무를 확인하는 것이므로 항원의 유무의 관계없이 항체가 기판에 붙어 있으므로 고정된 모든 항체에 특이한 한 종류의 이차항체를 사용하면 유무를 확인할 수 없으므로 각각의 항원에 특이한 표적된 항체를 사용해야 하는데 이는 너무 많은 종류의 표적된 항체를 사용해야하므로 생산단가가 비싸며 검사과정이 복잡하다는 단점이 있어 사용의 어려움이 있다. C1q의 사용은 이러한 단점을 다 보완해 준다. 단 한 종류의 표적된 C1q로 모든 항원, 항체 반응의 유무를 확인할 수 있기 때문이다.

특히, 상기 C1q는 기존의 면역반응검출방법에서 상용적으로 사용되지 않았으나 TBS(Tris Buffer Saline) 나 PBS(Sodium Phosphate Buffer)등의 완충용액 내에서 in vitro의 조건에서도 in vivo에서와 마찬가지로 면역반응이 일어난다. 이는 단백질 칩에 적용할 수 있음을 나타내어 준다. 단백질 칩에 적용하기 위해서는 FITC 등의 물질로 표적하여 사용하기만 하면 된다.

따라서, C1q를 이용한 단백질 칩 검출방법은 단백질 칩의 항원ㆍ항체 반응을 감지하는데 있어 감지정도가 뛰어나며, 이체항체를 사용할 필요가 없어, 수십 내지 수백개의 이차항체를 생산할 필요가 없으며, 이에 따른 비용절감효과 및 시간 절감 효과, 프로세스의 간소화를 가져올 수 있다. 또한, 전문인력과 고가의 실험장비가 필요한 기본의 검출방법과는 달리 누구나 손쉽게 한번에 수백개의 면역반응의 유무와 반응의 정도를 감지해 낼 수 있게 되어 단백질 칩의 범용화에 크게 기여할 것으로 사료된다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

C1q가 in vitro 상태에서도 작용을 하는 지를 알아보기 위하여 효소면역반응(ELISA)과 웨스턴 블랏(Western blot)을 실시하였다. 항원은 장내 세균인 예르시니아 엔터콜리티카(Yersinia entercolitica)를 사용하고 항체는 예르시니아 엔터콜리티카에 대한 단일클론 항체를 사용하였다. 보체는 정제된 C1q를 사용하였다. 이차항체는 HRP가 부착된 항-마우스 IgG(Anti-mouse IgG labeled HRP)와 HRP가 부착된 항-C1q(Anti- C1q labeled HRP)를 사용하였다. 효소면역반응(ELISA)은 첫 번째 기판에는 항체를 코팅 후 차단용액(3% bovine serum albumin)으로 4 ℃에서 12시간 차단하였다. 두 번째 기판에는 항원 코팅 후 차단용액(3% bovine serum albumin)으로 4℃에서 12시간 차단하였다. 세 번째 기판에는 항원 코팅 후 차단용액(3% bovine serum albumin)으로 4 ℃에서 12시간 차단 후 0.1 ㎍/㎖의 항체로 상온에서 면역 반응시켰다. 이 세 기판에 상온에서 C1q를 반응시킨 후 HRP가 부착된 항-C1q를 반응시킨 후 발색시켰다. 결과 항원만 존재하는 경우, 항체만 존재하는 경우에는 C1q가 결합하지 않고 항원이 반응한 항체에는 C1q가 결합한다는 것을 확인하였다[도 1(a)]. 또한, 웨스턴 블랏팅은 15% SDS-Page 후 나이트로 셀룰로우즈로 전기 이동 후 차단용액으로 4 ℃에서 24시간 차단 후 0.1 ㎍/㎖의 항체로 상온에서 면역 반응시켰다. 왼쪽 것은 HRP가 부착된 항-마우스 IgG로 반응시키고 오른쪽 것은 C1q를 반응시킨 후 HRP가 부착된 항-C1q를 반응시켜 발색시켰다. 결과 항체가 반응한 영역과 동일하게 항원이 결합된 항체에만 C1q가 반응하여 결합하는 것을 확인하였다[도 1(b)].

실시예 2

실제 단백질 칩과 같은 환경을 만들기 위해 고체 기판 위에 항체를 고정화시켰다. 금 기판(gold plate) 위에 MUA(11-mercaptoundecanoic Acid)를 자기조립 방식을 이용하여 24시간 동안 코팅하고 EDAC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)로 상온에서 3시간동안 활성시켜 단백질과 화학결합을 이룰 수 있게 한 후, 7.5 ㎍/㎖의 항체용액에 담가 반응시켜 항체를 고정화시켰다. 고정화 후 각각 다른 농도(10³, 10⁵, 10⁷ CFU/㎖)로 항원(yersinia entercolitica)을 포함하고 있는 반응액에 이를 2시간 반응시켰다. 이 기판을 완충용액(TBS, pH 7.4 )을 이용하여 세척 후 일정농도(17.2 ㎍/㎖)의 C1q를 포함한 완충용액(TBS)에 담가 다시 반응시켰다. 이 결과를 표면플라즈몬 공명장치(SPR, Optrel GdBR, Germany)를 이용하여 분석하였다. 표면플라즈몬 공명현상은 금속박막 위에 빛이 어떤 특정한 각도에서는 반사되지 않고 사라지는 현상을 말하는데, 표면플라즈몬 공명 각도는 칩에 단백질이 결합하면 커지는 특성을 가지고 있으며 그 질량에 따라 각의 변화는 더 커진다. 분석결과, 도 2에서 보듯이 항체가 고정된 기판을 담근 용액의 항원 농도에 따라 항체에 반응하는 항원 양이 증가함을 알 수 있었고, 항체와 반응한 항원의 양이 증가함에 따라 C1q의 반응이 선형적으로 증가함을 확인하였다. 상기 실험결과로 기판에 고정된 항체가 항원과 반응함을 알 수 있었으며, 항원이 반응한 항체에는 C1q가 반응하며 항원이 반응하지 않은 항체에는 C1q가 반응하지 않음을 알 수 있었다.

실시예 3

실제 단백질 칩을 위한 단백질 어래이(array)를 만들어 검출을 위한 방법으로 C1q를 사용할 수 있음을 증명하였다.

항체를 마이크로어래이어(microarrayer)를 이용하여 금 기판 위에 배열시킨 후 18시간동안 고정화시켰다. 이후 차단용액(3% bovine serum albumin)으로 24시간동안 차단 후 10⁵ CFU/㎖ 농도의 항원을 1시간 반응시켰으며, 이를 17.2 ㎍/㎖농도의 형광물질(FITC)이 부착된 C1q와 2시간 반응시켜 형광 현미경(Leica)을 이용하여 이미지를 촬영한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 C1q가 항원이 반응한 항체에 결합하는 것을 확인하였다.

실시예 4

단백질 칩상에서 항체-항원 복합체와 항원과 반응하지 않은 항체사이에서 C1q의 반응성을 비교 분석하기 위해서 고체기판 위에 두 가지 항체를 격자 모양으로 배열하였으며 그 모식도를 도 4에 나타내었다.

두 가지 항원을 모두 반응시킨 다음 형광물질이 부착된 C1q를 반응시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다. 도 5에 보는 바와 같이 두 항원이 반응된 각각의 항체에 C1q가 붙음을 확인하였다.

다음으로 상기와 동일한 두 가지 항체가 배열된 기판으로 하나의 항원을 사용하여 실험을 수행하였다. 하나의 항원만을 반응시킨 후 C1q를 반응시킨 후 현미경으로 관찰하였다. 하나의 항체에만 C1q가 붙은 것을 알 수 있었다[도 6].

따라서, 상기 실험을 통하여 단백질 칩을 위한 검출 방법으로 적합함을 알 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 보체(C1q)를 이용한 단백질 칩 검출방법은 단백질 칩의 항원·항체 반응을 감지하는데 있어 감지정도가 뛰어나며, 이체항체를 사용할 필요가 없어, 수십 내지 수백개의 이차항체를 생산할 필요가 없으며, 이에 따른 비용절감효과 및 시간 절감 효과, 프로세스의 간소화를 가져올 수 있다. 또한, 전문인력과 고가의 실험장비가 필요한 SPR이나 SELDI-TOF와는 달리 누구나 손쉽게 한번에 수백개의 면역반응의 유무와 반응의 정도를 감지해 낼 수 있게 되어 단백질 칩의 범용화에 크게 기여할 것으로 사료된다.

도 1의 (a)는 항원과 항체에 대한 각각의 C1q의 반응성과 반응이 일어난 항원항체에 대한 C1q의 반응성을 검토한 효소면역분석법(ELISA) 그래프이며, (b)는 항원에 대한 항체와 그 위에 반응시킨 C1q의 반응성을 검토한 웨스턴블랏팅(Western blotting) 도면이다.

도 2는 항원의 농도에 따른 항원의 반응정도와 그에 따른 C1q의 반응정도를 표면플라즈몬 공명장치(SPR)로 측정한 도면이다.

도 3은 기판에 고정화된 항체에 항원을 반응시킨 후 형광물질을 라벨한 C1q를 반응시킨 것을 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 4는 한 기판 위에 두 가지 항체를 고정화한 개념도이다.

도 5는 두 가지 항체가 고정화된 기판 위에 두 가지 항원을 반응시킨 후 형광물질이 라벨된 C1q를 반응시킨 것을 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 6은 두 가지 항체가 고정화된 기판 위에 한 가지 항원을 반응시킨 후 형광물질이 라벨된 C1q를 반응시킨 것을 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

Claims (1)

1. 단백질 칩 고체 기판 위에 고정화된 항체를 항원과 반응시켜 항원ㆍ항체 반응물을 얻고, 상기 항원ㆍ항체 반응물에 표적된 보체1q(Complement 1q, C1q)를 반응시켜 항원ㆍ항체 반응물과 보체1q의 결합여부를 확인하여 면역반응 유무를 감지하는 것을 특징으로 하는 단백질 칩 검출방법.