JPH06501555A - 固相結合アッセイの改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 同相結合アッセイの改良 本発明は、既に固相表面に結合された第一物質に第二物質を特異的に結合させる ことより成るア・ンセイ方法の改良に関する。

我々のｙｏ　９０１０５３０３には、選択的バイオ分子相互反応が可能でありか つバイオセンサー系、特に表面プラスモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏ ｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；　５ＰＲ）に基づく系に用いられるように設計された 感知表面が開示されている。

このタイプの光学的バイオセンサーにおいては、金属薄膜に近接した層における 屈折率変化が、結果的に変化する全体的に反射される光ビームの強度により検出 される。

かかるバイオセンサーのより詳細な説明については、光学的バイオセンサー系に 関する我々のＷｏ　９０１０５２９５、およびセンサー装置およびそのバイオセ ンサー系への使用に関する我々のＷｏ　９０１０５３０５を参照されたい。

前述の感知表面は、その片面が密に充填された単層の特異的有機分子で被覆され た自由電子金属、好ましくは銀または金の膜を含んでいる。この単層に、バイオ コンパチブルな多孔質マトリックス例えばノ１イドロゲルが結合されるが、この マトリックスは特定のバイオセンサーにより測定されるべき標的バイオ分子に適 したリガンドを固定するのに用いられる。

そのマトリックスに所望のりガントを結合させるために、それは適切な官能基の 導入により活性化され、またそれによってマトリックスは普通正または負のネッ ト電荷を獲得する。結合されるべきリガンド、典型的にはタンパク質が反対電荷 を有していれば、そのリガンドとマトリックス間の静電相互作用がそのリガンド を表面に集中させ、したがって該リガンドを表面に効率的に結合させることにな る。このような荷電表面に対する結合は、例えば酵素固定およびアフィニティー クロマトグラフィーなどの技術において古くからよ（知られている（例えばＵＳ −Ａ−４，８２９，００９、ＷＯ８３１０２９５４およびｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１１ｅｔｈｏｄＳ　１９８ｇ、ｖｏｌ、１１１（２）、ｐ１５７〜６６参照）。

このような静電効果はりガントの結合には有益であるが、リガンド結合後の固体 表面に残留電荷が存在する可能性があり、検体との望ましくないイオン相互作用 を生じるところ、以後の分析段階での問題源となり得ると従来より考えられてい る。

今般、本発明により驚くべきことに、固体表面にリガンドを結合した後に残る固 体表面の残留電荷は、同相表面で行われる特定アッセイの以後の段階における分 析物質種（ａｎａｌｙｔｉｃｅｌ　５ｐｅｃｉｅｓ）の結合を容易にしそして至 適化するのにうまく利用できることが見出された。この文脈において「分析物質 種」という用語は、最初に結合されるリガンドを除いてアッセイに用いられるあ らゆる反応性物質種を意味する。すなわち、例えば、サンドイッチ型アッセイで は、一方においてマトリックスがそれにリガンドを固定後残留電荷を残すのに十 分なもともとの電荷を何しており、そして他方において反応条件がイオン濃度（ ｉｏｎｉｃ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）およびｐＨについて適切に選択されるのであれ ば、いわゆる第二抗体（ＳＰＲ−アッセイにおいて「増強剤」として働く）は創 出された静電的相互作用によりマトリックスに効率的に集中し、その結果、リガ ンドに既に結合した第一被分析物質（ｐｒｉｍａｒｙａｎａｌ、ｙｔｅ）に実質 的に完全に結合する。

すなわち、従来技術においては生理学的条件、すなわち中等度のイオン濃度およ び略中性のｐＨが用いられるのに対し、本発明のための反応条件は低いイオン濃 度、および固相表面の電荷とは反対の第二抗体の負または正電荷を確保するのに 適切な反応媒質ｐＨを含む。例えばマトリックスの残留電荷が負のときは、抗体 が正に荷電するように、抗体の等電点よりも低いｐＦｌが選択されるべきであり 、そして逆の場合は逆にするべきである。これらの条件下では、マトリックスと 第二抗体のこのような反対電荷間の静電的相互作用は、さほど多くのスクリーニ ングイオンが存在することなく利用されることになる。さらにまた、かかる条件 下では、マトリックス自体が、ポリマー層における内部排斥の故によりオーブン となることから、結合被分析物質の利用可能性が高まると考えられる。

目的とする特異的に活性な物質だけが表面に結合されることを確実とする（その 重要性はもちろん個々の適用例に依存する）ために、本発明により静電的に生じ る第二試薬の集中により促進される結合段階に引き続いて、その表面を中または 高イオン濃度条件に付して静電的に結合したにすぎない物質種を除く必要があり 得る。

通常の条件とは対照的に本発明により前述の如くアッセイを行うことにより得ら れる改良点は、（ｉ）アッセイの感度が上がり、動的範囲（ｄｙｎａ■ｉｃ　ｒ ａｎｇｅ）が広がること、（ｉｆ）第二抗体の消費が相当に低下すること、そし て（ｉｆｉ）分析が迅速化すること、にある。

前述の静電的相互作用に由来する集中化効果は、さらに後述されるようにサンド イッチアッセイ以外のタイプの５ＰＲ−アッセイに用いることができるばかりで な（、より一般的に分析法全般、例えば自体慣用されているＥＬＩＳＡ型分析に も、それらが適当なタイプの荷電マトリックスに変性されたまたは変性され得る 固相の使用を伴う限り、用いることができることは理解されよう。

すなわち、本発明は、その最も広い観点において、リガンドであるかまたはリガ ンドに直接または間接に結合した物質種例えば被分析物質または被分析物質に結 合した第二試薬である、固相表面に固定された第一物質に第二物質を結合させる 段階より成り、そして第−物質を固定した固相表面が電荷を示し、また第二物質 を第一物質に結合させるための反応が、１００■麗以下のイオン濃度で、かつ該 第二物質の電荷が固相表面のそれの反対となりそれによって第二物質が固相表面 に静電的に引き付けられるようなｐＩ（条件下に行われることを特徴とするアッ セイ方法に関する。

前述の如く、本方法は、第二物質の結合の後、非特異的結合を除くために、より 高いイオン濃度の条件に表面を付す段階を含んでいてもよい。

本発明は基本的に、リガンド固定に引き続きアッセイのすべての段階に適用可能 であると意図されているが、第二物質は、特に免疫アッセイにおいては、大抵の 場合、アッセイで測定されるべき被分析物質ではない点に留意すべきである。何 故ならば、試験される検体は通常イオン濃度および／またはｐＩ（に関する所要 条件を満たさず、また（例えば血清検体について）検体環境を乱すことは通常望 ましいことではないからである。しかしながら、場合によっては、本発明の静電 的集中効果は、個々の検体に応じて被分析物質の結合にも用いることができる。

すなわち、本発明の一聾様において、第二物質は既に前述の如く、サンドインチ 型アッセイにおける第二成分である。

他の態様において、第二ｔ’７７１ｆは、リガンドを表面に固定した後、ブロッ クしなければ特定の分析手順を混乱させることになる残留結合部位をブロックす るのに用いられる剤である。

さらなる池の態様において、第二物質は被分析物質であり、その本発明方法は例 えば、表面に固定された活性（リガンド）量の測定に用いられる。

しかしながら、基本的に第二物質は、前記の特定された反応条件を、何らマイナ スとなる実際的影響を伴うことなく都合欲適合できるいずれの分析物質であって もよい。

第二物質は典型的には、タンパク質またはポリペプチドまたはその活性断片であ るが、一般的に、所望の固相アッセイにおける結合になじむいずれの物質であっ てもよい。容易に理解されるように、前記の第二物質は主として比較的大きいタ イプの分子、例えば巨大分子であり、拡散速度は分子が小さい程高く、したがっ て本発明により達成される効果はさほど顕著でない。

当業者により容易に理解されるように、前述の第一物質は、特に被分析物質とし て、例えばタンパク質またはポリペプチド例えば抗原または抗体、プロティンＡ またはＧ、酵素、レクチン、アビジンなど、または／％ブテン、ホルモン、糖、 ビオチン、トキシン、ビタミンなどであってよい。

前述のタンパク質およびポリペプチド、およびそれらの断片はいうまでもなく天 然および合成または半合成物質、例えば化学的手段または、遺伝子工学法により 変性されたタンパク質およびポリペプチドなどを包含する。

−例は、キメラ分子すなわち二官能性または多官能性分子、例えば二官能性また は多官能性抗体である。かかる分子のバイオセンサー表面への適用については、 前述の我々のｔｏ　９０１０５３０５を参照することができる。さらに、例えば サンドイッチ型アッセイにおいては、第二試薬は、次の第三試薬との反応を可能 にする二官能性抗体または他の分子であってよい。

前述の固相表面層は使用すべき分析方法のタイプに依存することになる。バイオ センサーへの応用、例えばＳＰＲまたは電気化学的バイオセンサーに対しては、 この層はポリマー層、好ましくは金属面に結合したハイドロゲル例えばデキスト ラン層であってよい。そこにリガンドを結合させるために、ポリマー層に適当な 官能基を付与し、その結合表面層は本発明の目的に十分な残留圧または負電荷を 獲得できるが、かかる電荷は別個の表面層処理に導入してもよい。バイオセンサ ーへの応用のための表面の例は前述の我々の１０９０１０５３０５に示されてい るところ、その開示を引用により本明細書に含める。

前記より明らかなように、「低イオン濃度」は本発明の文脈上、１００ｍＭ以下 として定義され、典型的免疫学的方法における「通常」イオン濃度は約１５０１ １Ｍである。しかしながら、好ましくはイオン濃度は５０ｍ１ｌ以下であり、そ してより好ましくは２０１Ｍ以下である。理論上理懇状態のイオン濃度は少なく ともゼロ近傍であるべきだが、これはほとんどの実際のケースにおいて、例えば タンパク質に対する安定性を考慮するなどすると、可能なことではない。

第二物質の適切な電荷を確保するのに必要なｐＨ値はもちろん特定の物質の性質 によって異なることになる。例えば、タンパク質の場合には、選択されるべきｐ Ｈはそのタンパク質の等電点（Ｉｐ）に依存することになり、Ｉｐを超えるｐＨ 値では正電荷が得られ、Ｉｐを下回るｐＨ値では負電荷が得られる。特定のＩｐ を有する特定のタンパク質に対しては、選択されるべきｐＨはそのＩｐとは所望 の方向に少なくとも０．５だけ一般に異なるべきである。一部のタンパク質検体 、例えばポリクローナル抗体混合物は、そのＩｐに対し単一のｐＨ値というより はむしろｐＨ範囲を示す可能性があり、このような場合は、前述のｐＨ差はもち ろんそれにかえてｐＦＩ間隔の関連の範囲限界（すなわち、５〜８のｐＨ範囲を 有するポリクローナル混合物については４．５以下）に関係づけるべきである。

この文脈において特定のタンパク質のＩｐは自体慣用されている方法により例え ば特定の荷電マトリックスに適合させるために変えることができるという点にも 注目すべきである。

本発明方法は、免疫化学型のアッセイまたは分析方法、特にバイオセンサー関連 方法に特に適している。既に前述の如（、この発明思想はこのように、免疫学的 サンドイッチアッセイにおける第二抗体の結合に有利に適用でき、そして反応の 感度および動的範囲が相当に増大する。

同様に前述した本発明のもう一つの価値ある適用は、余剰結合部位を効率的にブ ロックするためのものである。

これは例えばバイオセンサー技術によるいわゆるエピトープマツピング（例えば バイオセンサー技術による巨大分子の特徴付けに関する我々のＷｏ　９０１０５ ３０６を参照されたい）に有用であるが、その場合には、モノクローナル抗体を 、（例えばウサギ抗−マウスＧｌまたはＦＣのタイプの）マウス抗体を一般的に 結合できる抗体を固定した感知表面にまず結合させる。次いで、被分析物質（抗 原）と第二特異的モノクローナルを表面上を順次通過させることによりマツピン グが行われるが、後者の結合は、それら二つのモノクローナルが抗原上の異なる 部位に結合することを示している。容易に理解されるように、表面に固定される 一般的結合性抗体の１は、例えば培地に存在する比較的低い濃度から十分な量の 第一モノクローナルを結合できるように、比較的多くしておく必要がある。

第二モノクローナルは最初に固定される一般的結合性抗体に結合してはならない ので（結合してしまうと偽陽性応答として解されることになろう）、第一モノク ローナルにより占有されなかった一般的結合性抗体の余剰結合部位は非特異的抗 体によりブロックする必要がある。本発明によれば、これはブロック用抗体を低 イオン濃度を有し、感知表面マトリックスのそれとは反対の電荷をブロック用抗 体に与えるｐ＋（の緩衝液中に添加することにより前述の静電的集中効果を利用 すれば、より効率的でかつ省試薬的に行うことができる。

同じ思想を、ポリクローナル抗体を一般的に結合できるようにするためにプロテ ィンＡまたはＧを固定した表面の余剰結合部位をブロックするのに用いることが できる。この場合には、ｐｔ＋に応じて、静電的効果を用いて、プロティンＡま たはＧへのリガンドの結合およびその後の残留結合部位のブロッキングを改良す ることができる。

以下、本発明をいくつかの特定の実施例により説明するが、それらは例示のため にのみ示したものであって、いささかも本発明を限定するものと解されてはなら ない。

これに関連して添付図面も参酌する。

Ｆｉｇ、　ｌは、それぞれ高（◆）および低（ロ）イオン濃度でのβ２−マイク ログロブリンサンドイッチアッセイにおいて第二抗体をバイオセンサー表面に結 合した際の表面変化応答を示すグラフであり： Ｆｉｇ、　２は、（ｉ）高（０）および低い（◆）イオン濃度でのｌ　ｗｇ／　 ｗｅの第二抗体濃度、（ｎ）低（■）イオン濃度での２５０１＋　９　／　Ｒｌ の第二抗体濃度および（ｔｉｉ）低（◆）イオン濃度での５０μｑ／ｍｌの第二 抗体濃度での黄体形成ホルモンサンドイッチアッセイにおいて第二抗体をバイオ センサー表面に結合した際の表面変化応答を示すＦｉｇ、　ｌと同様のグラフで あり。

Ｆｉｇ、　３　オヨヒＦｉｇ、　４　ＬＬ、それソｔ１．１．　Ｏｍｑ／　ｍｌ 　（Ｆｉｇ、　３　）および５０ｕｇ／肩１　（Ｆｉｇ、　４　）の第二抗体濃 度でのＬＨサンドイッチアッセイにおける第二抗体のバイオセンサー表面への結 合に対する表面変化応答のｐＨ依存性を示すステーブルダイアグラムであり： Ｆｉｇ、　５〜７は、それぞれ各種濃度のブロック用抗体および高および低イオ ン濃度における培地中の三種類の異なるモノクローナルについての、モノクロー ナル（■）ニブロック用抗体（ａ）　、ＬＨ（ロ）の逐次的結合および可能性と してのその後のもとのモノクローナル（ロ）の結合にに対するバイオセンサー表 面の表面変化応答を示すステーブルダイアグラムであり：Ｆｉｇ、　３は、Ｆｉ ｇ、　５〜７と同様のステーブルダイアグラムであるが精製されたモノクローナ ルを用いたほかモノクローナル添加濃度を第一回目の添加よりも第二回目の添加 における方が高くなるようにしたものであり：Ｆｉｇ、　９は、Ｆｉｇ、　８と 同様のステーブルダイアグラムであり、精製されたモノクローナルを用いている が、モノクローナル使用濃度はその第一回目および第二回目の添加の両者につい て同一としており：またＦｉｇ、　１０は、四種類の異なるブロック用抗体濃度 に対する低イオン濃度での応答についてのＦｉｇ、　５〜９と同様のステーブル ダイアグラムである。

実施例中のアッセイはすべて、我々のＷＯ９０１０５２９５（その開示を引用に より本明細書に含める）に開示されそして現在Ｐｈａｒ＋＊ａｃｉａ　Ｂｉｏｓ ｅｎｓｏｒ　ＡＢ　（スウェーデン国、ウプサラ市）からＢＩ＾Ｃｏｒｅの商品 名で市販されているタイプの表面プラスモン共鳴バイオセンサー系を用いて行っ た。このバイオセンサー系は、センサー装置、試薬と検体溶液をセンサー装置の 感知表面上に輸送するための導管系を有する液体操作のためのブロック装置、入 射光線を感知表面に連結しそして反射光を検出する光学装置、およびキャリブレ ーション後に検出器信号を感知表面における物質量に比例したパラメーターに変 える評価装置より成っている。測定を行うに際しては、規定された検体液量を規 定された導管セクションに注入するが、その液量は次いで溶出液または駆動緩衝 液（ｄｒｉｎｅ　ｂｕｔｌｅｒ）により光学的分析のために感知表面を強制的に 通過する。

感知表面を有するセンサー装置は５ｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ　Ｃ１０（ＰＣｌ５（ Ｐｈａｒ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ＡＢ　（スウェーデン国、ウプサラ市））とし たが、これはガラス基板に支持された金膜に、金属−保護層（長鎖１．ω−ヒド ロキシアルキルチオールの吸着された単層）と共有結合的に結合した負荷電を有 する可撓性カルボキシメチル変性デキストランハイドロゲルとの複合体より構築 されたマトリックスが結合したものである。かかる感知表面の調製については、 前述の我々の１０９０１０５３０３を参照されたい。

測定は実質的に前述の我々の１０９０１０５３０５に記載された如くに行われた ところ、その開示を引用により本明細書に含める。実施例全体にわたり用いる駆 動緩衝液は、以下において特定されるように、ＨＢＳ　（Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆ ｅｒｓａｌｉｎｅ）、ｐｌＴ７．４とした。これら測定における表面変化応答は 「共鳴単位Ｊ　（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｕｎｉｔ；　Ｒυ）で表される。１００ ０ＲＵの応答は共鳴角（表面プラスモン共鳴が生じるセンサー表面に対する入射 光の角度）の０．１°シフト、または表面濃度の１ｎｇ／　ｌｚ変化に相当する 。

実　施　例　１ β２−マイクログロブリンのサンドイッチアッセイβ２−マイクログロブリンサ ンドイッチアッセイを、まずβツーマ・イク［１グロブリンに対して特異的なポ リクローナル抗体を感知表面に固定することにより行った。

これは、その表面を蒸留水中の０．２Ｍ　Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルア ミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０５Ｍ　Ｎ−ヒドロキシス クシンイミド（ＮＨ３）で活性化し７、カンプリング緩衝液（１０ａＭ酢酸ナト リウム、ｐＨ５，０）中の抗体をその表面に適用し、そして過剰のＥＤＣおよび Ｎ　ＩＩ　ＳをすべてＩＭ　エタノールアミン、ｐＨ８，５で失活させることに より行った。試験サイクルにおいて、感知表面は次いでそれぞれβ２−マイクロ グロブリン（被分析物質）を含有する検体およびポリクローナルＩｇ−画分（２ ，５１１９／　ｍｌ　：　１０％比活性）の形態の第二試薬を含有するサンプル の通過を順次受け、そして第二試薬に対する応答を測定した。各試験サイクルは 表面を１０ｍＭ　ＨＣＡ’５ｐＩ（２，２で再生することにより終了させた。ア ッセイは、様々な被分析物質濃度を用い、そしてそれぞれ低イオン濃度（ＩＯｌ ｌｌｌ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．００５％Ｔｖｅｅｎ■２０、ｐＨ７，５）およ び高イオン濃度（０，１５Ｍ　ＮａＣ！含有１１ｅｐｅｓｉｌ　ＷＲ液、ｐＨ７ ，５）の第一試薬を用いて行った。結果は下記表１および図面のＦｉｇ、　１に 示す。

表　１ ＊　ｉ、　ｓ、　＝イオン濃度 この表およびＦｉｇ、　ｌから明らかなように、低イオン濃度に対して３倍以上 の応答がｌ　００　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌの被分析物質濃度について得られる。約 ８００ｎｇ／ｇ／の被分析物質濃度では第二応答は高イオン濃度では水平化する のに対し、低イオン濃度では２０００ｎｙ／　ｍｌでもなお増加する。これらの 実験はｐＦＩ７．５で行われ、そして第二抗体のＩｐは約８．５であるので、後 者はこのｐＨでは正に荷電していた。

実　施　例　２ 黄体形成ホルモンのサンドイッチアッセイ黄体形成ホルモンサンドイッチアッセ イを実施例１と同様にして、まず黄体形成ホルモン（Ｌｌｌ）に対し特異的なモ ノクローナル抗体を感知表面に固定し、次いでそれぞれＬｌ’ｌ含有検体（被分 析物質）および第二試薬としてのモノクローナル抗−ＬＨ抗体を表面上に順次に 通すことにより行う。様々な濃度のＬＨ−被分析物質を含む検体を、第二試薬の 応答をそれぞれ各種濃度および高および低イオン濃度で観察することにより分析 した（０．１５Ｍ　ＮａＣ／を含むまたは含まないＨｅｐｅｓ緩衝液使用）。結 果を次の表２および図面のＦｉｇ、　２に示す。

２５　２６　１２１　９１　＊ ＊アツセイ中に基線レベルがやや低下するために負の値が生じる。

この表から明らかなように、第二試薬の濃度は、低イオン濃度の緩衝液を用いれ ば、高イオン濃度での相当する手順に比べ２，０倍低減できる。それでもより高 い感度およびより大きな動的範囲が得られる。例えば、１０＋＋Ｕ／ｍｌという ＬＩＴ−被分析物質濃度においては、低イオン濃度および５０ｘｑ／ｍｌの第二 試薬濃度に対する第二応答が５０ＲＩＩであり高い感度が見られるのに対し、同 じ被分析物質濃度は高イオン濃度およびｌ　＠９／　ｗｌの第二試薬濃度におい ては全く有意な応答を与えない。

第二応答のｐ■依存性を検討するために相当するアッセイ実験を行ったところ、 その結果をＦｉｇ、　３およびＦｉｇ、　４に示す。Ｌｆｌは１０００ｎａ／　 ｍｌ濃度で用い、そして第二抗体は二つの異なる濃度、すなわち１゜０す／■／ （Ｆｉｇ、　３　）および５０ｘｑ／　ｙａｌ　（Ｆｉｇ、　４　）で用いた。

Ｆｉｇ、　２と同様に、第二抗体Ｉｐ（５，３）よりも高いｐｌＴ値では低イオ ン濃度は高イオン濃度での応答よりも低い応答を与える。これは抗体がその場合 にマトリックスの負荷により排斥されるためであり、その効果はより高い濃度に よっである捏度補償されるのかもしれない。しかしながら、抗体のＩｐより低い ｐｆｌ値では、結果は逆転し、低イオン濃度が５０Ｍｇ／ｍｙの抗体濃度で倍量 上の応答を与える。

実　施　例　３ 余剰結合部位のブロック １０ｍ１ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０に３０Ｍｇ　／　寵／となるよう溶解し たウサギ抗−マウスＧ１抗体（ＲＡＭＧ　ｌ　）　（ＰｈａｒｍａｃｉａＤｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＲ，（スウェーデン国、ウプサラ市））を、前記実施例１ および２と同様に感知表面に固定した。次にＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆｅｒ 　５ａｌｉｎｅ　：　１０ａｌｌ　Ｈｅｐｅｓ、　０．１５Ｍ　ＮａＣｆ３．４ ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０５％Ｔｖｅｅｎ　＠　）に溶解した黄体化ホルモン（ ＬＨ）特異的モノクローナルをその表面に適用した後、それぞれＮａＣ１（０， １５Ｍ）を含むおよび含まないＨｅｐｅｓ緩衝液（１ｈＭ　［Ｉｅｐｅｓ、　３ ．４ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ＴｖｅｅｎＯ）に溶解したアルファフヱトプロ テイン（八ＦＰ）に対するブロック用モノクローナル抗体をその表面を通過させ てＬ）ｌ−モノクローナルにより占められていないすべての残留結合部位をブロ ックした。次に、Ｐｈａｒｓａｃｉａ　Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＰｈａｒＩＩａｃｉａ 　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＡＢ、　（スウェーデン国、ウプサラ市））にｌｏ ｊｇ／＋ｓｊ’となるよう溶解したＬＦＩ−被分析物質（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｉｎｃ、、米国）をその表面と反応させた。残留する 非特異的ＲＡＩＩＧ　１部位の有無を試験するために、最初に結合させたモノク ローナルをもう一度、その表面上を通過させた（そのモノクローナルが結合され るということはブロックが非効率であったことを示す）。

２．５および１０で記される三種類の異なるモノクローナルを用いた。モノクロ ーナル２および５は培地中で用いたのに対し、モノクローナルＩＯは培地中で試 験されたほかＦＩＢＳ緩衝液緩衝液中興なる濃度（７および７０４ｇ／＋＋／） で精製状態でも試験された。

ブロック用抗体は、高イオン濃度（ＮａＣ１含有）で、二つの濃度（１０００お よび２５ｈｇ／　ｍ１ｌ）で用い、また低イオン濃度（ＮａＣ１不含）で四つの 濃度（０，５０，１０および２５０＋１９／ｍ／）で用いた。

結果はＦｉｇ、　５〜１０に示す。

それらの図から明らかなように、本発明の静電的集中効果が、ブロック用抗体を 低イオン濃度を有し該抗体のＩｐより低いｐＨのｌｌ衛液中に添加する（すなわ ちこの場合抗体は正に荷電される）ことにより利用されるならば、ブロッキング ははるかに効率的かつ省試薬的に行うことができる。これは、例えばそれぞれ高 および低イオン濃度での２５０ｇｇ／ｌｌの非特異的ブロック用抗体が比較され ているＦｉｇ、　５〜９のステーブル２および３の比較から理解し得る。

Ｆｉｇ、　８は、精製モノクローナルＩＯを第一モノクローナルとしては７μｇ ／ｍｌで、そして第二モノクローナルとしては’１Ｏａｑ／ｍｌで用いた場合の 応答を示しているのに対し、Ｆｉｇ、　９は精製モノクロ−ナル１０濃度がいず れの場合も７０ｘｑ／ｍｌである場合の応答を示している。

Ｆｉｇ、　ＩＱには、２５１９／ｌ／もの低いブロック用抗体濃度が低いイオン 濃度で効率的に作用していることが示されており、１０Ｍｇ／ｍｌでは第二モノ クローナル注入時に小さな応答が得られた。

本発明はもちろん以上において詳述された態様に限定されるものではなく、多く の改変が以下の請求の範囲に記述されるような一般的発明思想の範囲に包含され る。

β２μｍグロブリン（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、Ｉ Ｌ　Ｈ（ｍｕ／ｍｌ） 二ｌ＋−＋つ Ｈ ４ｔ　４ｉＩ：　６１　盲　７ｔ　７ジ　ｐＨ／イオン濃度ＦＩＧ、３ Ｌ）Ｉ ブロック濃度（μｑ／ｍｌＶイオン濃度ＦＩＧ、’５ 痙　（ゴ　づ　ポ　ぎ ブロック濃度（Ｉ１ｇ／！ＤＩり／イオン濃度ブロック濃度（ｕ／＋ｉ’）／イ オン濃度ＦＩＧ、７ 炬　煉　ぎ　ゴ　ぎ　＝ ブロック濃度（μｑ／ｍｌ）／イオン濃度ＦＩＧ、８ 達矩劇ゴー則 ブロック濃度（μ９／ＩＩ／）／イオン濃度ＦＩＧ、９ ブロック濃度（μ９／■ｌり ＦＩＧ、１０ 国際調査報告 １＋ｌｔｒＭｌｌｅｓ＠ｌ工ｔｌｌｅｓ１．い、。ＰＣＴ／ＳＥ　９１１００６ ４９国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．リガンドであるかまたはリガンドに直接または間接に結合した物質類である 、固相表面に固定された第一物質に第二物質を結合させる段階より成り、そして 第一物質を固定した固相表面が電荷を示し、また第二物質を第一物質に結合させ るための反応が、１００ｍＭ以下のイオン濃度で、かつ該第二物質の電荷が固相 表面のそれと反対となりそれによって第二物質が固相表面に静電的に引き付けら れてそこに集中するようなｐＨ条件下に行われることを特徴とするアッセイ方法 。
2. ２．前記第二物質の結合段階の後に前記表面を中または高イオン濃度条件に付す 段階がくることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．前記第二物質が場合により変性されたタンパク質およびポリペプチドおよび それらの断片および誘導体より選択されることを特徴とする請求項１または２記 載の方法。
4. ４．前記第二物質が抗体またはその断片または機能的等価物であることを特徴と する請求項３記載の方法。
5. ５．前記第二物質を前記第一物質に結合させるための反応が免疫化学反応である ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ６．前記イオン濃度が２０ｍＭ以下であることを特徴とする請求項１〜５のいず れかに記載の方法。
7. ７．前記第二物質が前記表面に固定されたリガンドに最初に結合した被分析物質 に結合するための、サンドイッチ型アッセイにおける第二試薬であることを特徴 とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. ８．前記第二物質が固相表面層にリガンドを固定した後該層上の残留結合部位を ブロックするためのブロック用試薬であることを特徴とする請求項１〜７のいず れかに記載の方法。
9. ９．前記固相表面が荷電ハイドロゲル表面層より成ることを特徴とする請求項１ 〜８いずれかに記載の方法。
10. １０．前記固相表面が表面プラズモン共嗚に基づく測定のための感知表面である ことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。