JPH05503148A - 分析装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析装置および方法 本発明は、溶液における分析サンプルの測定方法およびその装置に関し、特に、 ハブテンの測定に関する。

多くの異なる測定技術が、溶液中の化学的および生物学的分析サンプルの測定用 として提案されている。これらの多くは、ガラスまたは金属の表面における分析 サンプル用の結合パートナ−の固定化工程と、分析サンプルを含有する溶液をそ の表面と接触させる工程とを含むものである。分析サンプルが固定化結合パート ナ−と結合するため、その表面における性質、たとえば屈折率がいくらか変化す るが、その変化が、消失波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ　ｗａｖｅ）または表面プラ ズモンレゾナンス技術（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ 　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）により、モニターされるものである。この変化の大き さにより、サンプルにおける分析サンプルの存在が、量的および／または法的に 分析される。

ハブテン（抗体により結合されることの可能な小さな分子であるが、それ自身、 免疫遺伝的である必要はない）は、小さな分子であり、その表面性質においては 小さな変化のみしかないので、上記方法による測定は困難である。

国際特許出願、ＷＯ３９１０８２６０は、表面プラズモンレゾナンスの使用を含 有する、サンプルにおけるハブテンの測定方法を開示している。このような方法 を実行するためには、ハブテン、または他の方法におけるハブテンに対する抗体 は、表面プラズモンレゾナンスのおこる金属薄層に結合しなければならない。

この方法を部分的に変更したものが、国際特許出願、ＷＯ９０／１１５２５に開 示されている。

我々は、国際特許出願、ＷＯ８９１０８２６０およびＷＯ９０／１１５２５に開 示された方法に類似した測定方法を発展させて、表面プラズモンレゾナンスによ ってではなく、漏れ全反射として知られている現象に基づいた装置を用いること によってモニター可能であることを見いだした。測定にこの形式を使用すると、 表面プラズモンレゾナンスの使用の場合よりも多くの優位点がある。本発明によ る装置を用いることにより行なわれる測定は、特に、ハブテンの測定に有用であ る。

漏れ全反射（ＦＴＲ）の原理は良く知られており、たとえば、文献（Ｂｏｓａｃ ｃｈｉ　ａｎｄ　０ｅｈｒｌｅ　［Ａｐｐｌｉｅｄ　０ｐｔｉｃｓ　（１９８２ ）、２１．２１６７−２１７３］）に記載されている。免疫測定に使用されるＦ ＴＲ装置は、米国特許第４８５７２７３号に開示されており、漕定中、サンプル により片側に結合され、もう片方に基体に順番に設けられたスペーサー層により 結合された、空洞層からなるものである。基体−スペーサー層インターフェース が、漏れ全反射が起こるような単色放射線をもちいて照射されると、その消失部 （ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ　ｆｉｅｌｄ　）はスペーサー層を通過して浸透するも のである。もし、スペーサー層のあつさが正しく、へ肘波ベクトルがレゾナント モード伝搬の１つと整合すると、全反射は漏れ、照射は、空洞層内に結合される 。空洞層は、スペーサー層よりも高い屈折率を有する材料からなり、この材料は 、入射の波長において透明である。可視波長において高吸収性であるため、空洞 層として金属が使用されることは避けられている。

本発明によれば、ハプテンまたはハプテンアナログが固定された透明誘電材料層 が提供される。

上述したように、本願の誘電層は、漏れ全反射の原理に基づいたバイオセンサの 一部を形成するものである。より詳細には、本発明においては、ａ）ハプテンま たはハプテンアナログが固定された、屈折率ｎ３を有する透明誘電材料の空洞層 と、 ｂ）屈折率ｎｌを有する誘電基体と、 Ｃ）前記空洞層と基体との間に介入された、屈折率ｎ２を有する誘電スペーサー 層とからなるバイオセンサであって、基体とスペーサー層との間のインターフェ ースが、全反射がおこるような光により照射されるとき、全反射は空洞層内でレ ゾナント誘導モード（ｒｅｓｏｎａ口ｔ　ｇｕｉｄｅｄ　ｍｏｄｅ）の伝搬によ り、漏れることの可能なバイオセンサを提供するものである。

本願による装置は、国際特許出願、ＷＯ３９１０８２６０に記載された、表面プ ラズモンレゾナンスを含有する方法などの、公知の技術を用いてできるものより もさらに、ハプテンの測定感度が良好であるという利点を有する。感度が向上す るのは、たとえば、空洞層内で結合された光の伝搬距離が、適当に材料および層 の厚さを選択することによって、効率的に利用されるという事実のためである。

さらに、適当な装置パラメータを選択することにより、相当する表面プラズモン レゾナンス装置（欧州特許第００７５３５３号に記載された原理にしたがった、 パラメーターの選択）を用いる場合に可能なものよりも、より厳密に、空洞層の 表面に、消失部を限定することができる。これらの優位点は、この方法およびそ れに類似の方法により定められることの可能な分析サンプルの他のクラスと比較 して、幾分率さい種のハプテンの測定にも特に有効である。

誘電空洞層におけるハプテンおよび抗体の）、’、１着はまた、金属層における 相当するスピーシーズの固着よりも簡単に行なわれる。また、本発明によれば、 誘電構造の製造も、金属の薄層を含有するセンサに基づいた、表面プラズモンレ ゾナンスの場合よりも、簡単に、しかも安く行なわれる。

′ハブテンアナログ′は、ハプテンの抗体に結合するハプテンと競争する物質の 意味である。このアナログは、ハプテン自体と、はぼ同一または全く同一である 。

′透明誘電材料層は、入射の波長において、はとんどまたは全く吸収性がない、 誘電材料の意味である。

ここで、′光°は、可視光のみならず、この範囲の上下の波長を有する光、すな わち紫外線および赤外線も含有される。

空洞層における誘導モードのレゾナント伝搬は、ある波長で、励起照射の特別な 入射角において起こるであろう。２つの基本的な測定アプローチが可能であり、 すなわち、ある定められた波長における入射角を走査するか、または、ある定め られた入射角における波長を走査するかである。前者のアプローチは、レーザー 源を使用することができるので、単色照射線を」いると好ましく、光学規準の問 題を簡略にするものであり、また、拡散効果を避けるため、結果の分析を簡略に することができる。

レゾナント効果の角度位置は、屈折率および種々の層の厚さなど、本願の多層装 置の種々のパラメータに依存するものである。一般に、空洞層の屈折率ｎ３およ び基体の屈折率ｎｌは、スペーサー層の屈折’Ｉ　ｎ　２を越えるべきである。

また、空洞には、少なくとも１つのモードが、レゾナンスをおこなうために存在 しなければならないので、空洞層は、ある最低厚ご以上でなければならない。

空洞層用の適当な透明誘電材料には、二酸化ジルコニウム、二酸化チタン、二酸 化シリコン、酸化アルミニウム、および酸化タンタルが含有されている。

空洞層は、公知の技術、たとえば真空蒸着により形成可能である。

誘電スペーサー層もまた、入射照射に対して、透明でなければならず、空洞層お よび基体よりも低い屈折率を有するものでなければならない。この層は、たとえ ば、フッ化マグネシウムの蒸着層またはスパッタ層からなってもよい。この場合 、赤外線入射レーザが、光源として使用可能である。源などからの光は、通常、 ８００　ｎｍの波長を有しており、低い波長の光としては、スペーサ層用として 異なる材料、たとえば、酸化アルミニウムを使用することが必要であり、他の適 当な材料としては、フッ化リチウムおよび二酸化シリコンが用いられる。上記の 蒸着およびスパッタ法以外では、スペーサー層は、ツルーゲル法（ｓｏｌ−ｇｅ ｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ）により、基体に蒸着可能である。後者の方法は、特に、ス ペーサー層が二酸化シリコンである場合に、好ましい。

基体は、たとえば高分子材料も使用可能であるが、通常、ガラスや石英などから なるものである。照射をシステムに人出したりするために、従来の結合手段、た とえばグレーティングカプラまたはプリズムカプラを使用することが必要である 。さらに、プリズムカプラおよび基体との間の、屈折率−整合フルイドなどの層 を設ける必要がある。

製造および取り扱いを簡単にするために、基体はたとえば約１ｍｍ厚さで１０平 方ｍｍのガラスチップでよい。また、使用を簡単にするために、このチップが使 い捨てであるか、またはその一部が使い捨てであってもよい。

基体の屈折率（ｎ　１）は、スペーサー層のそれ（ｎ２）よりも大きくなければ ならないが、基体の厚さは、一般的には本発明の実施には重要ではない。

これに対して、空洞層およびスペーサー層の厚さは、レゾナンスがカップリング 角の適当な範囲内において起こるように選択されなければならない。スペーサー 層は、通常、約２００ｎｍから２０００ｎｍ、より好ましくは５００から１５０ ０　ｎｍ、たとえば、ｌｏｏＯｎｍなどの、数百ナノメータの単位の厚さである 。空洞層は、１０から２００ｎｒｎ、より好ましくは３０から１５０ｎｍ、たと えば、ｌ　００　ｎｍなどの、２．３十ナノメータの単位の厚さである。

本発明の好ましい実施態様においては、空洞層は、３０から１５０ｎｍの厚さで あり、二酸化ジルコニウム、二酸化チタン、二酸化シリ・フン、酸化アルミニウ ム、および酸化タンタルから選択された材料からなり、スペーサー層は、５００ から１５００ｎｍの厚さで、フッ化マグネシウム、フン化リチウム、および二酸 化シリコンから選択された材料からなり、スペーサー層の屈折率が空洞層のそれ よりも小さくなるような材料が選択される。

空洞層およびスペーサー層として好ましい材料は、それぞれ、酸化タンタルおよ び二酸化シリコンである。

本発明によるバイオセンサ装置は、一般に光源および適当な検知手段からなる装 量の部分である。

従来知られている照射源が、入射光源として使用可能であるが、単色放射線を使 用することが好ましく、このような照射源はレーザーである。レーザーの選択は 、特に、種々の層に使用された材料に依存し、いくつかの例がすでにあげられて いる。

波長の走査は、光の細いビームの入射角を変えることにより、または欧州特許出 願第０３０５１０９Ａ号に（表面プラズモンレゾナンスに関して）記載されてい るような光のファン形ビームを使用して、角度の範囲を同時に照射することによ り、引き続いてまたは同時に行なうことができる。前者の場合には、角度の範囲 において機械的に走査する、シングル−チャンネル検知器を使用することが可能 であり、後者の場合には、角度の範囲が同時に照射される、マルチ−チャンネル 検知器を使用することが可能である。

レゾナンスにおいて、入射光は、ＦＴＨにより空洞層に結合し、空洞層に沿っで ある距離伝搬して、（またＦＴＨにより）戻る。伝搬距離は、種々の装置パラメ ーターに依存するが、一般的には、１または２ｍｍのオーダーである。

一般にレゾナンスにおいて、反射光は相変化をするが、この相変化が起こるとこ ろの角位置が検知されるものである。空洞層の表面における変化、たとえばハプ テンが固定化抗体へ結合すると、サンプルの屈折率に変化が起こり、レゾナンス の角位置が移動する。

また、たとえば固定化スピーシーズが入射の波長において吸収されると、反射光 の強度が減少する可能性もある。この場合、この強度減少は、レゾナンスをモニ ターするのに使用可能である。

上記したように、本発明によるバイオセンサー装置は、特に、ハプテンが存在す る生物学的サンプル測定の方法において有用である。

本発明によれば、この他、サンプルにおけるハプテンの検知方法が提供され、こ の方法は、 ａｌ）ハプテンの特異的結合パートナ−と、ハプテンを含有するサンプルとを、 引き続いてまたは同時に、ハプテンまたはそのアナログを固定化させる透明誘電 材料層であり、漏れ全反射バイオセンサのレゾナント空洞からなる、透明誘電材 料層に接触させ、または、 ａ２）ハプテンまたはそのアナログの共役体と、ハプテンを含有するサンプルと を、引き続いてまたは同時に、ハプテンまたはそのアナログの特異的結合パート ナ−を固定化させる透明誘電材料層であり、漏れ全反射バイオセンサのレゾナン ト空洞からなる、透明誘電材料層に接触させ、およびｂ）特異的結合パートナ− の固定化ハプテンまたはそのアナログに対する結合性、または、ハプテン共役体 の固定化特異的結合パートナ−に対する結合性を、漏れ全反射によって、モニタ ーすることからなる。

双方の方法においても、固定化スピーシーズ（ハプテン、ハブテンアナログ、ま たは特異的結合パートナ−）は、当業者には良く知られている方法により、透明 誘電層に、共有的に結合可能である。一般的にはしかしながら、固定化を容易に するために、誘電層は、誘導化または活性化されるであろう。表面の誘導化また は活性化は、固定化スピーシーズの反応性または親和性がその特異的結合パート ナ−に大きく影響を与えないで、固定化されるべきスピーシーズに結合位置を与 えるなどして行なわれるものである。

たとえば誘電層は、公知の方法で、ケイ素ベースの結合化合物と反応可能である 。このような試薬の適当な例としては、たとえば、末端アミノ−アルキルトリメ トキシシラン、たとえば、３−アミノプロピル化合物が挙げられ、アセトン中、 約２％ｗ／ｖの濃度で使用される。この試薬を使用する固定化技術の詳細は、ラ イ−トール（たとえば、米国特許３６５２７６１号、および“Ｉｍｍｏｂｉｌｉ ｚｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａｐｈｙｌｌＳＲＢ　Ｄｕｎｌｏｐ　（Ｅｄ）、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅ ｓｓ％Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７４）、ｐｐ１９１−２１２）に記載されてお り、他にも、他のシリル化合物および、抗体または抗原（またはそれらのフラグ メント）のカルボキシル基、アミノ基、他の反応基が、種々の無機材料に共有結 合可能であることが開示されている。

アミノ−シラン試薬と反応させたあと、誘電層に固定化したアミノ末端は、順に 、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）　（たとえばｐＨ７の ２％溶液）と反応可能であり、過剰な試薬が除去されて、固定化アルデヒド基を 用いて活性化された表面が、次いで、固定化されるべきスピーシーズの溶液、た とえば約１％ｗ／ｖの濃度の抗体免疫グロブリンで処理される。固定化されたス ピーシーズの連続またはほぼ連続した層は、約０．５−２．０μｇ／ａｍ２の表 面密度で得られる。過剰な試薬は、たとえば、強バッファー溶液（０，１Ｍアセ テート、０．５Ｍ食塩、ｐＨ４−５）で洗浄し、中性バッファー洗浄（ｐＨ７− ７，４）で洗浄し、次いで、ｐＨ９−１０洗浄して、中性トリスバッファーなど を用いて中性化する。

タンパク質を誘電表面に結合させる他の方法は、エポキシ−シラン試薬、特にグ リシジルオキシプロピルトリメトキシシランを、ヘルマンらの文献（Ｈｅｒｍａ ｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｓｃｉ　（１９８１）、１９（９ ）　、４７０−４７６））にしたがって、たとえばトルエン中、約２％ｖ／ｖノ 濃度テ、７０℃において、約２時間使用するものである。この方法においては、 エポキシシリル化された誘電層が直接タンパク質と反応可能であるため、アルデ ヒド試薬の使用は不必要である。

高分子表面への抗原または抗体の固定化方法は、また良く知られているものであ り、当業者にとって、透明誘電層が高分子であるとき、これらの方法が適用でき ることは明らかであろう。たとえば、結合は、高分子の官能基における水素が、 適当な置換基により置換された形態で行なわれる。

特に方法ａ１）　（ここでは、固定化されたスピーシーズは比較的小さいハプテ ンまたはハプテンアナログである）においては、結合位置が中間結合基に合体可 能である。このような結合基の使用により、特異的結合過程の立体障害が最小に なるように、固定化された特異的結合パートナ−により結合したスピーシーズと 表面とが、十分に離れるものである。

本発明によれば、したがって、ハプテンまたはハプテンアナログが結合する結合 基を固定化させる、透明誘電材料層が提供される。

また、本発明によれば、ハプテンまたはハプテンアナログを透明誘電材料層上に 固定化させる方法が提供され、この方法は、ハプテンを中間結合基に結合させて 共役体を形成し、次いで、透明誘電材料層の表面に共役させて固定化させること からなる。

使用可能な結合基の例としては、たとえば、■、６−ジアミツヘキサンまたは６ −アミノヘキサン酸がペプチド結合により誘電表面に結合して、タンパク質のカ ルボニルまたはアミノ末端に共有結合できる、フリーな１級アミノ基およびフリ ーなカルボキシル基を提供する場合には、ポリエチレン鎖が挙げられる。これら の結合材料は、末端間に６−炭素鎖を提供するので、相当する距離だけ、表面か ら固定化スピーシーズを離れるものである。類似の適当な結合および中間結合基 は、免疫測定およびアフィニティークロマトグラフィーの分野において、良く知 られている。

結合基は、好ましくは、分析に使用される透明誘電材料層の表面の部分を実質的 に完全にカバーするユニットなどの高分子コーティングの一部である。結合基は 、好ましくは、化学的に、たとえば共有的に、ハプテンに適当な架橋構造により 結合するタンパク質である。この結合が達成される技術は、当業者にとってあき らかであろう。たとえば、１つの例として混合無水技術（ｍ　ｉ　ｘ　ｅ　ｄ　 ａ　ｎｈｙｄｒｉｄｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）がある。適当なハプテン−架橋− タンパク質共役体としては、フェニトイン−グルクロナイド−ガンマ　グロブリ ンおよびフェニトイン−グルクロニル−リボゾームが挙げられる。

方法ａｌ）において、固定化されたハプテンまたはハプテンアナログに可逆的に 結合する、特異的結合パートナ−は、ハプテンまたはそのフラグメントの抗体で ある。

また、特異的結合パートナ−は、抗体またはそのフラグメントなどの共役体に成 りうるものである。この場合、抗体の共役体は、好ましくは、分析サンプルの結 合指示薬として、装置の漏れ全反射特性において大きな変化をもたらすように、 十分に高い分子量を有する基体との共役体である。この共役体は、抗体が結合剤 により共有結合可能な、適当な材料との共役体であるが、典型的には、コロイド 金属またはポリスチレン球などの高屈折率粒子、またはタンパク質などの高分子 との、抗体の共役体である。使用可能な高分子としては、ボビン血清アルブミン 、ヒト血清アルブミン、卵アルブミン、およびポリリジンや、免疫グロブリン、 脂質ＡＳ：７ラーゲンなどのスピーシーズが挙げられる。結合試薬は通常、抗体 および高分子との間の共有結合を効果的にするために使用されるものである。

上記の結合基に加えて、結合試薬として、ヒドラジド、アジド、臭化シアン、Ｎ １Ｎ−ｏ−フェニルジマレイミド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ スジニックイミド　エステル等が使用される。結合試薬の選択は、特別な抗体お よび係わる高分子に依存するであろう。

抗体および高分子間の共有結合に関する結合において、結合試薬は通常、抗体お よび／または高分子の溶液または混合物に添加され、結合試薬の濃度は、特別な システムによって異なる。培養後、典型的には数時間、抗体が加えられ、混合物 はさらに培養される。共役体は、公知の方法によって、単離される。

共役体は次いで、典型的には、適当なバッファー、たとえば炭酸塩−炭酸水素塩 などで希釈され、一般的には１０から２００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度に、たとえ ば約１１００ｎ／ｍ＋の濃度に希釈される。他のバッファーも無論、使用可能で あり、たとえば、グリシンバッファーｐＨ９，５、およびその他の希釈、たとえ ば５０ｎｇ／ｍ＋が使用可能である。溶液は次いで、ハプテンまたはそのアナロ グを固定化させる透明誘電層と接触される。この接触は、共役体が固定化スピー シーズに結合するまで、十分な時間、行なわれるものである。結合が終了したの ち、誘電表面は結合しなかった共役体がなくなるまで洗浄される。この洗浄は、 適当な溶液、たとえばリン酸−緩衝の食塩水または蒸留水を用いると効果的であ る。結合しなかった共役体が確実になくなるまで、表面を何度か洗浄しなければ ならないが、その表面は、エアードライまたはフリーズドライして乾燥され、後 の使泪のために保存することができる。

方法ａ２）においては、ハプテン共役体は、上記したのと類似の方法により調製 可能である。たとえば、ゲンタマイシンがボビン直情ア、ルプミンにグルタルア ルデヒドにより結合する場合、結合試薬は、まず、高分子と混合されて結合試薬 と高分子の比率が重量で約２：ｌとなるような濃度とする。ここで、３時間、室 温で培養したのち、その溶液をクロスリンクデキストラン（ｃｒｏｓｓ−１ｉｎ ｋｅｄ　ｄｅｘｔｒａｎ）　（２５００の最大限とする分子量）のカラムク０７ トグラフイーにふし、有効なものの最初の２０ｍ１を取って、濃縮する。この濃 縮された混合物に、２００ｍｇのハプテンを加え、約２０時間、室温で攪拌しな がら培養し、５００ｍｇのグリシンを添加する。最終混合物は、さらに室温で２ 時間培養され、この後、この共役体溶液は、室温で約３日間、蒸留水で透析され 、次いで凍結乾燥されると、最終の高分子−ハブテン共役体が得られる。

方法ａ２）における、固定化された特異的結合パートナ−は、フラグメントまた は、ハプテンまたはハプテンアナログの抗体となりうる。固定化は、上記と類似 の手段により効果的である。

両方の方法において、試薬の添加オーダーは重大ではない。方法ａｌ）において は、しかしながら特異的結合パートナ−がまず固定化ハプテンまたはアナログに 添加され、次いで結合していない材料を除去すべく、洗浄される。次いでサンプ ルを、透明誘電材料層に接触させる。ただし、透明誘電材料層には、あらかじめ 特異的結合パートナ−が固定化ハプテンまたはアナログに可逆的に結合されてい るものである。方法ａ２）においては、共役体がまず、特異的結合パートナ−に 可逆的に結合し、サンプルが固定化スピーシーズを支持する表面と接触される。

方法ａ２）のモディフィケーションにおいては、ハプテンまたはハプテンアナロ グが、ハプテンまたはハプテンアナログと、またはハプテンまたはハプテンアナ ログの固定化特異的結合パートナ−と、反応しない、さらなる試薬の特異的結合 パートナ−である、スピーシーズと共役する。この場合、この方法は、さらなる 工程、すなわち、前記したさらなる試薬を添加するという工程を含有する。

このさらなる試薬は、ハプテンが共役するスピーシーズの特異的結合パートナ− であっても、また、特異的結合パートナ−などの、たとえば高分子との共役体で あってもよい。

さらなる試薬とハブテン共役体とを結合させる際に含有・可能な特異的結合シス テムの例は、バイオチン−アビジン（ｂｉｏｔｉｎ−ａｖｉｄｉｎ）およびバイ ｔチンーストレプトアビジン（ｂｉｏｔｉｎ−ｓｔｒｅｐｔａ、ｖｉｄｉｎ）で ある。

さらなるモディフィケーションにおいては、前記さらなる試薬は、誘電表面にお いてまたは誘電表面の付近における、検知可能な反応生成物の製造に触媒作用を 施すことの可能な酵素を用いて、ハプテンが共役するスピーシーズの特異的結合 パートナ−の共役体であってもよい。適当な酵素の例は、ｌ）基体としてのジア ミノ−ベンジジンおよび過酸化水素とともに、パーオキシダーゼ。

ｉｉ）基体としてのテトラゾリウム塩およびＮＡＤ　（Ｐ）Ｈとともに、あるオ キシドレダクターゼ。

ｉ　ｉ　ｉ）ガスを発生するとして知られている、あるカタラーゼ酵素であり、 そのバブルは誘電表面に接近していることの可能なものである。

酵素基体は一般に、前記さらなる試薬（酵素を含有している）が、表面に複合し て固定化され、過剰な試薬がたとえば洗浄により除去されたのち、表面と接触す る。

本発明において使用可能な免疫測定の他の方法は、サンプルに国定化ハプテンを 接触させて、抗体と固定化ハプテンとの結合をモニターすることによって、特別 なハプテン抗体のサンプルの存在を測定するものである。この方法はしかしなが ら、実際はほとんど重要ではない。

本発明による方法および装置を用いて測定されたハプテンは、たとえば、薬物、 動植物ホルモン、抗生物質、殺虫剤などの１以」二の種々の基体である。測定可 能なホルモンの例としては、甲状刺激ホルモン、黄体ホルモン、ヒト卵膜ゴナト ドロフィン、卵胞刺激ホルモン、インシュリン、プロラクチン、ステロイドホま ず７図１を参照すると、漏れ全反射の原理を用いたバイオセンサー装置は、約ｌ Ｏ平方ｍｍの大きさで、約１ｍｍの厚さを有するガラスチップ（１）からなる。

このガラスチップ（１）は、半球プリズム（２）の平坦表面に置かれている。

また、屈折率−整合流体（３）の層が、チップ（１）およびプリズム（２）との 間に介入されている。

酸化アルミニウムのスペーサー層（４）が、ガラスチップ（１）の上表面に形成 され、その厚さは約７００ｎｍである。このスペーサー層（４）上には、二酸化 ジルコニウムの第２層（５）が形成゛される（約４０ｎｍの厚さ）。薄層構造は 、固定化バイオケミカルスピーシーズの層（６）により完成され、その性質は、 行なわれる測定技術に依存するが、より詳細には以下に記される。

使用に際しては、ガラスチップ（１）およびスペーサー層（４）の間のインター フェースが、（図示していないが）レーザーからの単色放射線のビームを用いて 照射される。（図示して・いないが）適当な光が供給されて、照射が角度範囲に おいて同時に起きるように、入射ビームが扇型に形成される。

入射ビームの全反射が起きるが、入射の特にある角度において、第２層（５）へ の照射のレゾナントカップリングにより、反射が漏れる。第２層（５）は、上下 の層（４，６）のいずれよりも高い屈折率を有しており、したがって、レゾナン ト空洞として機能するものである。この角度において、反射された照射は、相変 化する。

反射照射の相は、（図示していないが）適当な検知装置により、角度のファンク ションとして、モニターされて、レゾナンスが起きる角度が測定される。テスト 中、分析サンプルを含有するサンプルが固定化バイオケミカルスピーシーズ層（ ６）と接触されると、この層の屈折率が変わり、レゾナンスの角度位置が変化す ることになる。この変化がモニターされ、その頻度および大きさで、サンプルに おける分析サンプルの存在が、量的および質的に分析される。

図２は、第１の、上記の装置を用いて行なわれることの可能なノ＼ブテンの測定 方法を示す。図２（ａ）図に示された第１実施例においては、第２層（５）の表 面が、テスト中、ハプテンの分子が共有結合する、固定化結合基により、被覆さ れる。第１ステツプにおいて、ハプテンの抗体が、複合が実質的に全表面に起き るような表面に適用される。固定化バイオケミカルの層（６）は、結合基を介し て、ハプテン−抗体固定化複合体の層からなる。

テスト中、ハプテンを含有するサンプル（分析サンプル）が活性表面（６）に接 触されると、分析サンプル分子は、抗体分子との結合において、固定化ハプテン と競争する。この結果、いくらかの抗体が、装置の表面−から離れる。これによ って（たとえば、ハプテンおよび抗体の分子の大きさの違いのために）、表面の 付近における屈折率が変化し、レゾナンスの角度位置が変化するものである。

図２（ｂ）に示された第２実施例においては、分析サンプルの添加効果は、固定 化ハプテンとあらかじめ複合された抗体が、大きな高分子と共役するため、増幅 される。これにより、分析サンプルハプテンが、抗体との結合において固定化ハ プテンと競争するとき、局所屈折率が大きく変化する。

第２の、図１の装置を用いた測定方法が、図３に示される。分析サンプルハプテ ンの抗体は、装置の表面において固定化され、ハプテン共役体とあらかじめ複合 する。図３（ａ）に示された第１実施例においては、ハプテン分子は、大きなタ ンパク質分子と、共有結合する。固定化ケミカル層（６）は、固定化抗体−ハプ テン共役複合体の層からなる。分析サンプルハプテンを含有するサンプルを添加 すると、表面からハプテン共役体のいくらかが置換され、さらに、屈折率が変化 して、レゾナンスのシフトも変化する。

図３　（ｂ）に示された実施例においては、複合ハプテンは、異なった特異的結 合ペアー、この場合はバイオチンと共役する。引き続いて、または同時に、表面 をサンプル（分析サンプルを含有している）で処理し、さらなる試薬が添加され る。このさらなる試薬は、 ｌ）ストレプトアビジン、この場合、最終複合体は、固定化抗体−（ハプテン− バイオチン）−ストレプトアビジンである、またはｉｉ）ストレプトアビジン− 高分子共役体、または１ｉｉ）ストレプトアビジン−酵素共役体である。

最終の場合においては、酵素基体を用いて引き続き処理すると、誘電表面付近に おいて反応生成物が生成する。酵素−基体表面は、反応生成物がその付近におけ る屈折率に実質的な変化を生じさせるようなものが、選択される。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ハプテンまたはハプテンアナログを固定化する、透明誘電材料層。 ２、ａ）ハプテンまたはハプテンアナログを固定化する、透明誘電材料の空洞層 、 ｂ）誘電基体、および ｃ）空洞層および誘電基体との間に介入された、誘電スペーサー層からなるバイ オセンサーであり、 基体とスペーサー層との間のインターフェースが、全反射するような光を用いて 照射される時、全反射が、空洞層内でレゾナント誘導モードの伝搬により、漏れ ることが可能であるように形成されたバイオセンサー。 ３、ａ１）ハプテンの特異的結合パートナーと、ハプテンを含有するサンプルと を、引き続いてまたは同時に、ハプテンまたはそのアナログを固定化させる透明 誘電材料層であり、漏れ全反射バイオセンサのレゾナント空洞からなる、透明誘 電材料層に接触させ、または、 ａ２）ハプテンまたはそのアナログの共役体と、ハプテンを含有するサンプルと を、引き続いてまたは同時に、ハプテンまたはそのアナログの特異的結合パート ナーを固定化させる透明誘電材料層であり、漏れ全反射バイオセンサのレゾナン ト空洞からなる、透明誘電材料層に接触させ、およびｂ）特異的結合パートナー の、固定化ハプテンまたはそのアナログに対する結合性、または、ハプテン共役 体の、固定化特異的結合パートナーに対する結合性を、漏れ全反射によって、モ ニターすることからなる、サンプルにおけるハプテンの測定方法。