JP2803877B2 - 巨大分子の特性決定法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は巨大分子特にタンパク質の特性決定に関し、
より詳しくは種々なリガンドとの反応を調べることによ
り巨大分子に関する構造的情報を得る方法に関する。
より詳しくは種々なリガンドとの反応を調べることによ
り巨大分子に関する構造的情報を得る方法に関する。
現在タンパク質の特性決定は主として２群の方法によ
ってなされ、すなわち１つは組成情報法（アミノ酸分
析、配列分析、分光測光法、質量分析法）でこれは化学
的存在物の含量を与えるが、これらが空間のどこに位置
するかの情報はなく、一方、特別構造法（Ｘ線結晶学、
NMR、低温電子鏡検法、走査型電子トンネル鏡検法）は
特定の方法により種々な程度の構造的情報を提供する。
Ｘ線結晶学により全空間構造は確かに得られるが、この
方法はタンパク質を結晶形態に変換することを要し、こ
れは一般に困難であり、又この方法は更に極めて時間が
かかり、且つ面倒である。現在約400のタンパク質のみ
がその構造が原子分解を伴うＸ線結晶学により決定され
ていることが特筆される。高分解の構造的情報はNMRに
よっても得られるが、タンパク質を溶液にすることを要
する。分解はこれまで装置の磁場により制限されたが、
この磁場は無制限に強くすることはできず、又タンパク
質の大きさと溶解度により制限された。更にNMRとＸ線
結晶学の両者は高品質及び比較的多量の純粋なタンパク
質を必要とする。低温電子鏡検法は目視分析により固体
形態におけるタンパク質の表面構造情報を提供すること
ができ、又走査型電子トンネル鏡検法は固体形態におけ
るタンパク質のいくらかの情報を提供することが可能で
ある。要約するとタンパク質の構造情報を得るためのこ
れらの方法は複雑で長時間を要するか、又は限られた情
報のみを提供するであろう。
ってなされ、すなわち１つは組成情報法（アミノ酸分
析、配列分析、分光測光法、質量分析法）でこれは化学
的存在物の含量を与えるが、これらが空間のどこに位置
するかの情報はなく、一方、特別構造法（Ｘ線結晶学、
NMR、低温電子鏡検法、走査型電子トンネル鏡検法）は
特定の方法により種々な程度の構造的情報を提供する。
Ｘ線結晶学により全空間構造は確かに得られるが、この
方法はタンパク質を結晶形態に変換することを要し、こ
れは一般に困難であり、又この方法は更に極めて時間が
かかり、且つ面倒である。現在約400のタンパク質のみ
がその構造が原子分解を伴うＸ線結晶学により決定され
ていることが特筆される。高分解の構造的情報はNMRに
よっても得られるが、タンパク質を溶液にすることを要
する。分解はこれまで装置の磁場により制限されたが、
この磁場は無制限に強くすることはできず、又タンパク
質の大きさと溶解度により制限された。更にNMRとＸ線
結晶学の両者は高品質及び比較的多量の純粋なタンパク
質を必要とする。低温電子鏡検法は目視分析により固体
形態におけるタンパク質の表面構造情報を提供すること
ができ、又走査型電子トンネル鏡検法は固体形態におけ
るタンパク質のいくらかの情報を提供することが可能で
ある。要約するとタンパク質の構造情報を得るためのこ
れらの方法は複雑で長時間を要するか、又は限られた情
報のみを提供するであろう。
タンパク質に関する構造的情報は問題のタンパク質の
領域又は部分を特異的に指向する抗体による免疫学的な
分析方法によっても得られた。例えば、Furie B等はMet
hods in Enzymology（1982年）84巻,60〜63ページにタ
ンパク質表面の特異的決定基に対する抗体によりプロト
ロンビンとＸ因子の配座変化の研究を記述している。モ
ノクローナル抗体とブロット法によるヒトα２−マクロ
グロブリンのエピトープマッピング（すなわち巨大分子
表面のエピトープの決定）はVan Leuven等によりJ.Immu
nol.（1986年）90巻,125〜130ページに記述されてお
り、一方Mazza M.MとRetegui L.A.はMolec.Immun.（198
9年）26巻、231〜240ページにモノクローナル抗体と固
相RIA法によるヒト成長ホルモン（hGH）のエピトープマ
ッピングを記述している。
領域又は部分を特異的に指向する抗体による免疫学的な
分析方法によっても得られた。例えば、Furie B等はMet
hods in Enzymology（1982年）84巻,60〜63ページにタ
ンパク質表面の特異的決定基に対する抗体によりプロト
ロンビンとＸ因子の配座変化の研究を記述している。モ
ノクローナル抗体とブロット法によるヒトα２−マクロ
グロブリンのエピトープマッピング（すなわち巨大分子
表面のエピトープの決定）はVan Leuven等によりJ.Immu
nol.（1986年）90巻,125〜130ページに記述されてお
り、一方Mazza M.MとRetegui L.A.はMolec.Immun.（198
9年）26巻、231〜240ページにモノクローナル抗体と固
相RIA法によるヒト成長ホルモン（hGH）のエピトープマ
ッピングを記述している。
最近固体表面の表層における変化例えば種々な表面へ
のテンサイド（tensides）とタンパク質の吸着を測定す
るための光学的方法が化学及び生化学関連で使用され始
めた。これらの光学的方法の中に楕円偏光法及び表面プ
ラスモン共鳴法（SPR）がある。楕円偏光法は楕円偏光
の成分が表面により反射される場合受ける振幅とフェー
ズの相互関係における変化を測定することにより屈折物
質の屈折率を測定することを可能にする古い光学的方法
である。種々な物質を表面に吸着させ、吸着層の厚さ並
びに表面に吸着された量を計算することができる。表面
プラスモン共鳴法はやや簡単な表現を用いると薄い自由
電子金属膜に近接する層の屈折率の変化をこれらの屈折
率変化により引き起こされる反射されたｐ−偏光束の強
さの変化により検出する方法であるといえる（例えばRa
ether H.,I Physics of Thin Films,Hass G.,Francombe
M.及びHoffman R.編集、Academic Press,New York（19
77年）,145〜261ページが参照される）。以下にこれら
の方法を化学又は生化学分野で利用したいくつかの刊行
物を説明する。
のテンサイド（tensides）とタンパク質の吸着を測定す
るための光学的方法が化学及び生化学関連で使用され始
めた。これらの光学的方法の中に楕円偏光法及び表面プ
ラスモン共鳴法（SPR）がある。楕円偏光法は楕円偏光
の成分が表面により反射される場合受ける振幅とフェー
ズの相互関係における変化を測定することにより屈折物
質の屈折率を測定することを可能にする古い光学的方法
である。種々な物質を表面に吸着させ、吸着層の厚さ並
びに表面に吸着された量を計算することができる。表面
プラスモン共鳴法はやや簡単な表現を用いると薄い自由
電子金属膜に近接する層の屈折率の変化をこれらの屈折
率変化により引き起こされる反射されたｐ−偏光束の強
さの変化により検出する方法であるといえる（例えばRa
ether H.,I Physics of Thin Films,Hass G.,Francombe
M.及びHoffman R.編集、Academic Press,New York（19
77年）,145〜261ページが参照される）。以下にこれら
の方法を化学又は生化学分野で利用したいくつかの刊行
物を説明する。
Cullen等はBiosensors（1987/88年）３巻,211〜225ペ
ージにおいて２つのモデル生化学系における免疫複合体
形成の検出のためにSPR法の使用を記述しており、この
中でヒト免疫グロブリンＧ又はヒンジ抗血清の免疫グロ
ブリン画分を金被覆回析格子に物理的に吸着させた。次
いでそれぞれアフィニティー精製したヤギ抗ヒトIgG又
はヒト血清アルブミンを免疫複合体形成により特異的に
結合させ、結合反応を時間との関連で追跡することがで
きた。
ージにおいて２つのモデル生化学系における免疫複合体
形成の検出のためにSPR法の使用を記述しており、この
中でヒト免疫グロブリンＧ又はヒンジ抗血清の免疫グロ
ブリン画分を金被覆回析格子に物理的に吸着させた。次
いでそれぞれアフィニティー精製したヤギ抗ヒトIgG又
はヒト血清アルブミンを免疫複合体形成により特異的に
結合させ、結合反応を時間との関連で追跡することがで
きた。
Daniels P.B.等はSensors and Actuators（1988年）1
5巻,11〜18ページにおいて表面プラスモン共鳴における
濃度依存性変化が２つの系、アビジン固定化ビオチンと
アルファーフェトプロテイン固定化抗体−抗原について
得られる実験を記述しており、これは溶液の直接免疫化
学的分析にSPRを使用する可能性を示している。
5巻,11〜18ページにおいて表面プラスモン共鳴における
濃度依存性変化が２つの系、アビジン固定化ビオチンと
アルファーフェトプロテイン固定化抗体−抗原について
得られる実験を記述しており、これは溶液の直接免疫化
学的分析にSPRを使用する可能性を示している。
Elwing H.等はJ.Colloid Interface Sci.（1988年）1
25巻、139〜145ページに天然分子中に隠されたエピトー
プ指向抗体により親水性及び疎水性表面に吸着された補
体因子の配座変化の楕円偏光法による測定を記述してい
る。
25巻、139〜145ページに天然分子中に隠されたエピトー
プ指向抗体により親水性及び疎水性表面に吸着された補
体因子の配座変化の楕円偏光法による測定を記述してい
る。
Jonsson U.等はJ.Colloid Interface Sci.（1982年）
90巻、148〜163ページに固体表面へのヒトフィブロネク
チン（HFN）の吸着を調べるため楕円偏光法の使用を記
述している。吸着時タンパク質の配座変化が吸着タンパ
ク質と抗HFN及びコンカナバリンとの相互作用をそれぞ
れ調べることにより明らかにされた。
90巻、148〜163ページに固体表面へのヒトフィブロネク
チン（HFN）の吸着を調べるため楕円偏光法の使用を記
述している。吸着時タンパク質の配座変化が吸着タンパ
ク質と抗HFN及びコンカナバリンとの相互作用をそれぞ
れ調べることにより明らかにされた。
Horrisberger M.,Biochim.Biophys.Acta（1980年）63
2巻,298〜309ページにはレクチンとガラス表面に適用し
た多糖類、糖ペプチド及び糖タンパク質の膜との相互作
用の研究に楕円偏光法の使用が記述されている。
2巻,298〜309ページにはレクチンとガラス表面に適用し
た多糖類、糖ペプチド及び糖タンパク質の膜との相互作
用の研究に楕円偏光法の使用が記述されている。
Mandenius,C.F.等はAnal.Biochem.（1984年）137巻、
106〜114ページにタンパク質とシリコン表面に共有結合
したアフィニティーリガンドを持つ細胞との相互作用を
調べるため楕円偏光法の使用を記述している。調べた特
異的系はコンカナバリンＡ−サッカロマイセス・セレビ
シエー細胞、免疫グロブリンＧ−スタフィロコックス・
オーレウス細胞及びNADアナログ−ラクテート・デハイ
ドロジェネースであった。
106〜114ページにタンパク質とシリコン表面に共有結合
したアフィニティーリガンドを持つ細胞との相互作用を
調べるため楕円偏光法の使用を記述している。調べた特
異的系はコンカナバリンＡ−サッカロマイセス・セレビ
シエー細胞、免疫グロブリンＧ−スタフィロコックス・
オーレウス細胞及びNADアナログ−ラクテート・デハイ
ドロジェネースであった。
欧州特許出願公告第26 215号は液体試料中の抗原特異
的抗体の量を測定するための抗原の吸着された層を持つ
圧電石英結晶発振機の使用を開示している。
的抗体の量を測定するための抗原の吸着された層を持つ
圧電石英結晶発振機の使用を開示している。
上述の刊行物のいくつかは極めて主要なバイオセンサ
ー法の例であると言える。バイオセンサーは試料中の生
体分子又は粒子の存在の測定が可能なセンサーであり、
分子認識のためのリセプターと変換器からなると定義す
ることができる。バイオセンサーの群又は種類はリセプ
ターと周囲媒質との相互作用により表面層の性質に起こ
る変化を例えば上述のSPR及び楕円偏光法により検出す
ることに基づく。しかしながら今日に至るまで適当な意
味におけるバイオセンサーは試料中の物質の検出又は濃
度の測定にもっぱら使用されてきた。
ー法の例であると言える。バイオセンサーは試料中の生
体分子又は粒子の存在の測定が可能なセンサーであり、
分子認識のためのリセプターと変換器からなると定義す
ることができる。バイオセンサーの群又は種類はリセプ
ターと周囲媒質との相互作用により表面層の性質に起こ
る変化を例えば上述のSPR及び楕円偏光法により検出す
ることに基づく。しかしながら今日に至るまで適当な意
味におけるバイオセンサーは試料中の物質の検出又は濃
度の測定にもっぱら使用されてきた。
本発明は全く異なる目的のためのバイオセンサー法の
使用、すなわち巨大分子と種々なリガンドとの相互作用
及びそれらの互いの間の相互の影響を調べることにより
露出した構造的要素に関連して巨大分子例えばタンパク
質の特性決定に関する。
使用、すなわち巨大分子と種々なリガンドとの相互作用
及びそれらの互いの間の相互の影響を調べることにより
露出した構造的要素に関連して巨大分子例えばタンパク
質の特性決定に関する。
本発明をより詳細に記述する前に本発明の定義に関連
して使用する用語の一部について説明する。
して使用する用語の一部について説明する。
用語「巨大分子」は含めようとする分子の実際の大き
さの何等かの限定を意味するものではなく、一般に分子
の構造的領域を確立することに関心があるすべての大型
分子を表す。その例はタンパク質（糖タンパク質、リポ
タンパク質なども含む）、ポリペプチド、炭水化物、レ
クチン、ポリマー、DNA、RNAなどであり、及びこの巨大
分子は天然並びに合成的に作られたものであることがで
きる。
さの何等かの限定を意味するものではなく、一般に分子
の構造的領域を確立することに関心があるすべての大型
分子を表す。その例はタンパク質（糖タンパク質、リポ
タンパク質なども含む）、ポリペプチド、炭水化物、レ
クチン、ポリマー、DNA、RNAなどであり、及びこの巨大
分子は天然並びに合成的に作られたものであることがで
きる。
「エピトープ」は巨大分子上の限定された表面に露出
した構造要素を表す。ある種のエピトープ、抗原決定基
はそれらの抗体分子と結合する能力により特徴付けられ
る。他のエピトープは他の種類の巨大分子に結合するこ
とができる。例えばある種のレクチンに結合するタンパ
ク質のグリコシル化された部分、ある種の露出したアミ
ノ酸残基の金属イオンとのキレートであり、他のエピト
ープは分子の生官能的構造を構成し例えばリセプターに
結合するか、又はリセプター結合部位を構成する。この
例は容易に多重化されることができる。
した構造要素を表す。ある種のエピトープ、抗原決定基
はそれらの抗体分子と結合する能力により特徴付けられ
る。他のエピトープは他の種類の巨大分子に結合するこ
とができる。例えばある種のレクチンに結合するタンパ
ク質のグリコシル化された部分、ある種の露出したアミ
ノ酸残基の金属イオンとのキレートであり、他のエピト
ープは分子の生官能的構造を構成し例えばリセプターに
結合するか、又はリセプター結合部位を構成する。この
例は容易に多重化されることができる。
「リガンド」は巨大分子のエピトープと相互作用する
ことができる化学化合物である。リガンドはそれ自身１
つ又はそれより多いエピトープを示すことがあり、それ
により相互作用が起こる。リガンドは巨大分子であるこ
とができるが、必要ではない。リガンドの例として天然
リガンド例えば酵素に対する基質及びリセプターに対す
るシグナル物質、表面上のアミノ酸残基に対するキレー
ト化構造、ボレート（糖と反応する）、アロメート（ar
omate）（芳香族部分と結合する）、抗体（抗原性エピ
トープに対する）及びレクチン（グリコシル化エピトー
プとの反応）を挙げることができる。
ことができる化学化合物である。リガンドはそれ自身１
つ又はそれより多いエピトープを示すことがあり、それ
により相互作用が起こる。リガンドは巨大分子であるこ
とができるが、必要ではない。リガンドの例として天然
リガンド例えば酵素に対する基質及びリセプターに対す
るシグナル物質、表面上のアミノ酸残基に対するキレー
ト化構造、ボレート（糖と反応する）、アロメート（ar
omate）（芳香族部分と結合する）、抗体（抗原性エピ
トープに対する）及びレクチン（グリコシル化エピトー
プとの反応）を挙げることができる。
「検出表面」はここでは表層の物理化学的性質の変化
の検出に基づくバイオセンサー（上述の定義による）に
存在することができる測定表面又は領域、又はその種類
に類似のそれを表す。そのような表面は以下でより詳し
く論議されるであろう。
の検出に基づくバイオセンサー（上述の定義による）に
存在することができる測定表面又は領域、又はその種類
に類似のそれを表す。そのような表面は以下でより詳し
く論議されるであろう。
従って本発明はリガンドとのその相互作用を調べるこ
とにより巨大分子の特性を決定する方法に関し、及びそ
れは巨大分子が少なくとも１つのリガンドと相互作用し
た後巨大分子を少なくとも１つの他のリガンドと接触さ
せ、この場合巨大分子又は他のリガンド（１つ又は複
数）は検出表面に結合しており、検出表面の物理化学的
性質にその結果起こる変化を検出することにより相互作
用を測定し、測定したリガンド相互作用の間の相互の依
存に基づいて巨大分子のエピトープを識別し、それらの
相対的な位置をマッピングすることによりリガンド相互
作用の相互の影響を測定することからなることにより特
徴付けられる。
とにより巨大分子の特性を決定する方法に関し、及びそ
れは巨大分子が少なくとも１つのリガンドと相互作用し
た後巨大分子を少なくとも１つの他のリガンドと接触さ
せ、この場合巨大分子又は他のリガンド（１つ又は複
数）は検出表面に結合しており、検出表面の物理化学的
性質にその結果起こる変化を検出することにより相互作
用を測定し、測定したリガンド相互作用の間の相互の依
存に基づいて巨大分子のエピトープを識別し、それらの
相対的な位置をマッピングすることによりリガンド相互
作用の相互の影響を測定することからなることにより特
徴付けられる。
バイオセンサー法の使用に基づくこの方法により巨大
分子の表面構造的要素の驚くべき迅速且つ簡単な測定が
達成される。更に、リガンド相互作用の「バイオセンサ
ー」に基づく検出はリガンド又は巨大分子を検出可能な
マーカーで付標する必要がないことを意味し、何故なら
分子自体が検出表面の物理化学的変化に寄与するからで
ある。本発明の方法は例えばＸ線回折法と同じような構
造的情報を与えないが、それは実質的により少ない物質
量で又多くの場合何等精製を先行させることなく実行す
ることができ、及び未知物質の構造的情報を蓄積する作
業の中でそのような方法に対する優れた補足を形作る。
この方法はエピトープ構造の変化の確認例えば化学的変
性の構造的影響の研究におけるマーカーとして使用する
こともできる。
分子の表面構造的要素の驚くべき迅速且つ簡単な測定が
達成される。更に、リガンド相互作用の「バイオセンサ
ー」に基づく検出はリガンド又は巨大分子を検出可能な
マーカーで付標する必要がないことを意味し、何故なら
分子自体が検出表面の物理化学的変化に寄与するからで
ある。本発明の方法は例えばＸ線回折法と同じような構
造的情報を与えないが、それは実質的により少ない物質
量で又多くの場合何等精製を先行させることなく実行す
ることができ、及び未知物質の構造的情報を蓄積する作
業の中でそのような方法に対する優れた補足を形作る。
この方法はエピトープ構造の変化の確認例えば化学的変
性の構造的影響の研究におけるマーカーとして使用する
こともできる。
巨大分子又はリガンドは検出表面に生特異的リガンド
を介し又は化学的に結合し、この場合すべての種類の化
学的結合例えば共有結合、イオン結合、双極子結合、水
素結合及びファンデルワール力を含むものである。従っ
て巨大分子は例えば調べる巨大分子と使用する検出表面
によりいずれかの適当なカップリング基を介して表面に
共有結合させることができる。巨大分子をリガンドを介
して結合させる場合後者は調べるリガンドの１つである
ことができ、以下により詳しく説明されるであろう。カ
ップリング基又はリガンドを介して巨大分子を表面へそ
のように生特異的結合させることにより、後者はハンド
ル又はスペーサーとして機能し、巨大分子を表面からあ
る距離におき、それにより巨大分子を表面に固定化させ
るために使用されるエピトープの近傍のエピトープも露
出され、追加の１つ又は複数のリガンドとの相互作用の
ために近づくことができる。これにより巨大分子の溶液
条件がシミュレートされ、同時に巨大分子が結合した固
相の利点を利用することができる。
を介し又は化学的に結合し、この場合すべての種類の化
学的結合例えば共有結合、イオン結合、双極子結合、水
素結合及びファンデルワール力を含むものである。従っ
て巨大分子は例えば調べる巨大分子と使用する検出表面
によりいずれかの適当なカップリング基を介して表面に
共有結合させることができる。巨大分子をリガンドを介
して結合させる場合後者は調べるリガンドの１つである
ことができ、以下により詳しく説明されるであろう。カ
ップリング基又はリガンドを介して巨大分子を表面へそ
のように生特異的結合させることにより、後者はハンド
ル又はスペーサーとして機能し、巨大分子を表面からあ
る距離におき、それにより巨大分子を表面に固定化させ
るために使用されるエピトープの近傍のエピトープも露
出され、追加の１つ又は複数のリガンドとの相互作用の
ために近づくことができる。これにより巨大分子の溶液
条件がシミュレートされ、同時に巨大分子が結合した固
相の利点を利用することができる。
本発明による上で定義した一般的方法の１つの具体例
は ａ） リガンドを検出表面に結合させ、 ｂ） 巨大分子を検出表面に結合させるため巨大分子が
検出表面に結合したリガンドと相互作用することを許容
し、 ｃ） １つ又はそれより多い追加のリガンドを検出表面
に結合させた巨大分子と連続的に接触させ、及び ｄ） 各々の追加のリガンドを巨大分子を持つ検出表面
と接触させた後それぞれのリガンドの巨大分子との相互
作用を検出表面の物理化学的性質にその結果現れる変化
を検出することにより測定する段階からなる。
は ａ） リガンドを検出表面に結合させ、 ｂ） 巨大分子を検出表面に結合させるため巨大分子が
検出表面に結合したリガンドと相互作用することを許容
し、 ｃ） １つ又はそれより多い追加のリガンドを検出表面
に結合させた巨大分子と連続的に接触させ、及び ｄ） 各々の追加のリガンドを巨大分子を持つ検出表面
と接触させた後それぞれのリガンドの巨大分子との相互
作用を検出表面の物理化学的性質にその結果現れる変化
を検出することにより測定する段階からなる。
巨大分子の追加の機能的／構造的情報を得るため、段
階ｃ）とｄ）は変更した相対的順序で添加した種々なリ
ガンドを用いて１回又はそれより多い回数繰り返すこと
ができ、これについては以下により詳しく記述する。所
望により結合させるリガンドは変化させることができ
る。変更したリガンドの順序で上の段階ｃ）とｄ）を反
復し、次いで結合させるリガンドを変更し、再び段階
ｃ）とｄ）の順序を変更することなども可能である。
階ｃ）とｄ）は変更した相対的順序で添加した種々なリ
ガンドを用いて１回又はそれより多い回数繰り返すこと
ができ、これについては以下により詳しく記述する。所
望により結合させるリガンドは変化させることができ
る。変更したリガンドの順序で上の段階ｃ）とｄ）を反
復し、次いで結合させるリガンドを変更し、再び段階
ｃ）とｄ）の順序を変更することなども可能である。
本発明による方法の他の具体例は、 ａ） 巨大分子を検出表面に結合させ、 ｂ） 少なくとも２つのリガンドを検出表面に結合させ
た巨大分子に連続的に接触させ、及び ｃ） 各々のリガンドを巨大分子を持つ検出表面と接触
させた後それぞれのリガンドの巨大分子との相互作用を
検出表面の物理化学的性質にその結果現れる変化を検出
することにより測定する段階からなる。
た巨大分子に連続的に接触させ、及び ｃ） 各々のリガンドを巨大分子を持つ検出表面と接触
させた後それぞれのリガンドの巨大分子との相互作用を
検出表面の物理化学的性質にその結果現れる変化を検出
することにより測定する段階からなる。
先行の具体例におけるように巨大分子の追加の機能的
／構造的情報はもちろん段階ｂ）とｃ）を変更した順序
で添加した種々なリガンドと共に１回又はそれより多い
回数繰り返すことにより得ることができる。
／構造的情報はもちろん段階ｂ）とｃ）を変更した順序
で添加した種々なリガンドと共に１回又はそれより多い
回数繰り返すことにより得ることができる。
本発明の方法の更に別の具体例は、 ａ） リガンドを検出表面に結合させ、 ｂ） 巨大分子を少なくとも１つの他のリガンドと相互
作用することを許容し、 ｃ） 前記少なくとも１つの他のリガンドと相互作用し
た巨大分子をリガンドを持つ検出表面と接触させ、及び ｄ） 巨大分子の検出表面に結合させたリガンドとの相
互作用を検出表面の物理化学的性質にその結果現れる変
化を検出することにより測定する段階からなる。
作用することを許容し、 ｃ） 前記少なくとも１つの他のリガンドと相互作用し
た巨大分子をリガンドを持つ検出表面と接触させ、及び ｄ） 巨大分子の検出表面に結合させたリガンドとの相
互作用を検出表面の物理化学的性質にその結果現れる変
化を検出することにより測定する段階からなる。
先行の具体例におけるように巨大分子の追加の機能的
／構造的情報はもちろん段階ｂ）とｃ）を変更した順序
で添加した種々なリガンドと共に１回又はそれより多い
回数繰り返すことにより得ることができる。
／構造的情報はもちろん段階ｂ）とｃ）を変更した順序
で添加した種々なリガンドと共に１回又はそれより多い
回数繰り返すことにより得ることができる。
最後に述べた具体例の変法においては、多数の検出表
面又は領域を持つ例えば「センサーユニットとそのバイ
オセンサーシステムにおける使用（Sensor unit and it
s use in biosensor systems）」（スエーデン特許願第
8804074−６号に基づく）という我々の係属中のPCT出願
に記述された種類の検出表面が使用され、前記特許の開
示は参考例としてここに組み入れるものであり、調べる
種種なリガンドの各々はそれぞれの検出表面に結合させ
る。そこに結合させた種々なリガンドの少なくとも１つ
を持つ巨大分子を得られる多官能性検出表面に順次接触
させ、巨大分子とセンサー表面の全ての検出領域との相
互作用を各々の巨大分子／リガンド組合せにつき測定す
る。測定はこの場合検出表面に適合した多チャンネル装
置、例えば「光学的バイオセンサーシステム（Optical
biosensor system）」（スエーデン特許願8804075−３
号に基づく）という我々の係属中のPCT出願に記述され
た種類のそれで実行することができ、その開示は参考例
としてここに組み入れる。
面又は領域を持つ例えば「センサーユニットとそのバイ
オセンサーシステムにおける使用（Sensor unit and it
s use in biosensor systems）」（スエーデン特許願第
8804074−６号に基づく）という我々の係属中のPCT出願
に記述された種類の検出表面が使用され、前記特許の開
示は参考例としてここに組み入れるものであり、調べる
種種なリガンドの各々はそれぞれの検出表面に結合させ
る。そこに結合させた種々なリガンドの少なくとも１つ
を持つ巨大分子を得られる多官能性検出表面に順次接触
させ、巨大分子とセンサー表面の全ての検出領域との相
互作用を各々の巨大分子／リガンド組合せにつき測定す
る。測定はこの場合検出表面に適合した多チャンネル装
置、例えば「光学的バイオセンサーシステム（Optical
biosensor system）」（スエーデン特許願8804075−３
号に基づく）という我々の係属中のPCT出願に記述され
た種類のそれで実行することができ、その開示は参考例
としてここに組み入れる。
より多数のリガンドを調べる場合、上述の具体例のリ
ガンド反応段階はより小さい群のリガンドを用いて連続
的に便利に実行することができる。
ガンド反応段階はより小さい群のリガンドを用いて連続
的に便利に実行することができる。
上の記述から明らかなように本発明の方法は巨大分子
の機能的領域（機能は生機能に限定されない）の研究に
基づく。リガンドの特異性に基づいて巨大分子に関する
定性的並びに定量的情報を得ることができる。リガンド
の巨大分子との相互作用の連続的な実施により、この方
法は１つのリガンドの機能領域との相互作用が他の機能
領域の他のリガンドとの相互作用にいかに影響するかを
研究することをも伴う。影響が現れる場合相互作用に対
する阻害及び増強効果の両者が問題となることがある。
バイオセンサー法により相互作用における親和力変化を
調べることによりより大きな解答の得られることがあ
る。これらの研究に基づいて機能情報が得られ、それよ
り巨大分子の構造要素の結論を導き出すことができる。
従って本発明の方法を用いて（ｉ）巨大分子の１つまた
はそれより多い機能的／構造的要素を確認すること及び
（ii）１つ又はそれより多い他の確認された構造要素に
関連して後者の位置を確認することが可能である。
の機能的領域（機能は生機能に限定されない）の研究に
基づく。リガンドの特異性に基づいて巨大分子に関する
定性的並びに定量的情報を得ることができる。リガンド
の巨大分子との相互作用の連続的な実施により、この方
法は１つのリガンドの機能領域との相互作用が他の機能
領域の他のリガンドとの相互作用にいかに影響するかを
研究することをも伴う。影響が現れる場合相互作用に対
する阻害及び増強効果の両者が問題となることがある。
バイオセンサー法により相互作用における親和力変化を
調べることによりより大きな解答の得られることがあ
る。これらの研究に基づいて機能情報が得られ、それよ
り巨大分子の構造要素の結論を導き出すことができる。
従って本発明の方法を用いて（ｉ）巨大分子の１つまた
はそれより多い機能的／構造的要素を確認すること及び
（ii）１つ又はそれより多い他の確認された構造要素に
関連して後者の位置を確認することが可能である。
この方法で同時に使用するリガンドは同じ種類例えば
モノクローナル抗体であるばかりでなく、２つ又はそれ
より多い異なる種類例えば２つの抗体、レクチンと天然
リガンドであることもできる。最初に述べた場合の例は
一組の、好ましくはモノクローナルの抗体によるタンパ
ク質の抗原性エピトープのマッピングであり、一方第二
の場合はタンパク質の機能領域の異なる種類、例えば抗
原性エピトープ、特異的なグリコシル化構造と活性部位
の検出と位置の確認を例として示すことができる。機能
的／構造的領域の相対的位置を得るため巨大分子に対す
る天然リガンド（生特異的パートナー）もリガンドとし
て使用することができる。
モノクローナル抗体であるばかりでなく、２つ又はそれ
より多い異なる種類例えば２つの抗体、レクチンと天然
リガンドであることもできる。最初に述べた場合の例は
一組の、好ましくはモノクローナルの抗体によるタンパ
ク質の抗原性エピトープのマッピングであり、一方第二
の場合はタンパク質の機能領域の異なる種類、例えば抗
原性エピトープ、特異的なグリコシル化構造と活性部位
の検出と位置の確認を例として示すことができる。機能
的／構造的領域の相対的位置を得るため巨大分子に対す
る天然リガンド（生特異的パートナー）もリガンドとし
て使用することができる。
本発明の方法を実行する最も簡単な場合は、巨大分子
を２つのリガンドのみとの関連で調べる。上述の種々な
具体例により１つのリガンドを検出表面に結合させよう
とする場合、検出表面における相互作用測定は巨大分子
を最初に前記第１のリガンドを介して検出表面に結合さ
せた後他のリガンドを添加するか、又は第２のリガンド
を最初に巨大分子に結合させた後巨大分子を添加するこ
とにより実行することができる。もちろん相互作用でな
い情報も検出された相互作用と同様に有用である。巨大
分子の検出表面への他の結合が調べるリガンドの１つと
のそれの代わりに利用される場合、後者の相互作用は順
次測定されるであろう。すなわち最初に述べた場合のよ
うに第２のリガンドは第１のリガンドが巨大分子に結合
したとき巨大分子と相互作用することができる。２つの
リガンドは巨大分子と相互作用できることが既に知られ
ている場合、巨大分子との連続的相互作用はリガンド相
互作用がいかに相互に影響するかについて情報を提供す
るであろう。これからそれぞれのエピトープの相互関係
について結論を引き出すことができる。場合により問題
の方法の段階をリガンド相互作用の順序を変えてくり返
すことができる。１つのリガンドが最初に巨大分子を検
出表面に結合させるために使用された場合、そのような
逆の順序はもちろん他のリガンドが代わりに巨大分子を
検出表面に結合させるために使用されることを意味す
る。
を２つのリガンドのみとの関連で調べる。上述の種々な
具体例により１つのリガンドを検出表面に結合させよう
とする場合、検出表面における相互作用測定は巨大分子
を最初に前記第１のリガンドを介して検出表面に結合さ
せた後他のリガンドを添加するか、又は第２のリガンド
を最初に巨大分子に結合させた後巨大分子を添加するこ
とにより実行することができる。もちろん相互作用でな
い情報も検出された相互作用と同様に有用である。巨大
分子の検出表面への他の結合が調べるリガンドの１つと
のそれの代わりに利用される場合、後者の相互作用は順
次測定されるであろう。すなわち最初に述べた場合のよ
うに第２のリガンドは第１のリガンドが巨大分子に結合
したとき巨大分子と相互作用することができる。２つの
リガンドは巨大分子と相互作用できることが既に知られ
ている場合、巨大分子との連続的相互作用はリガンド相
互作用がいかに相互に影響するかについて情報を提供す
るであろう。これからそれぞれのエピトープの相互関係
について結論を引き出すことができる。場合により問題
の方法の段階をリガンド相互作用の順序を変えてくり返
すことができる。１つのリガンドが最初に巨大分子を検
出表面に結合させるために使用された場合、そのような
逆の順序はもちろん他のリガンドが代わりに巨大分子を
検出表面に結合させるために使用されることを意味す
る。
上述の２つのリガンドのみの関連で巨大分子を調べる
具体例は本来例えばプロット法、ELISA又はRIAで実行す
ることができるが（しかしながら、相当に複雑且つ時間
を要する方法である）、これはより多くのリガンドを使
用する場合実際には不可能であろう。そのような場合本
発明の方法の迅速性と単純性はなおより大きな程度に有
利であると評価されるであろう。
具体例は本来例えばプロット法、ELISA又はRIAで実行す
ることができるが（しかしながら、相当に複雑且つ時間
を要する方法である）、これはより多くのリガンドを使
用する場合実際には不可能であろう。そのような場合本
発明の方法の迅速性と単純性はなおより大きな程度に有
利であると評価されるであろう。
本発明の方法において多数のリガンドを使用する例は
タンパク質に対して生産される多数のモノクローナルに
より独立の抗原決定部位を決定する上述の場合を挙げる
ことができ、これは例えば問題のタンパク質のためのモ
ノクローナルにに基づく試験の組立てに有用であること
ができる。そのような場合１つのモノクローナルをタン
パク質を検出表面に結合させるために使用し、その後他
のモノクローナルの各々の１つを最初にモノクローナル
の１つにより固定化させたタンパク質に関して個別に試
験することができる。この段階は２つのリガンドのみに
関する上述の測定の場合の反復する実施であるというこ
とができる。次いで正に相互作用するモノクローナルは
更に種々な相互組合せ例えば５つの群で分析され、これ
は元の結合リガンドを介して既に固定化させたタンパク
質と順々に相互作用させることができる。
タンパク質に対して生産される多数のモノクローナルに
より独立の抗原決定部位を決定する上述の場合を挙げる
ことができ、これは例えば問題のタンパク質のためのモ
ノクローナルにに基づく試験の組立てに有用であること
ができる。そのような場合１つのモノクローナルをタン
パク質を検出表面に結合させるために使用し、その後他
のモノクローナルの各々の１つを最初にモノクローナル
の１つにより固定化させたタンパク質に関して個別に試
験することができる。この段階は２つのリガンドのみに
関する上述の測定の場合の反復する実施であるというこ
とができる。次いで正に相互作用するモノクローナルは
更に種々な相互組合せ例えば５つの群で分析され、これ
は元の結合リガンドを介して既に固定化させたタンパク
質と順々に相互作用させることができる。
この方法により前に結合した抗体が後続のそれの結合
部位を妨げるか否かが直接明らかになるであろう。先行
する相互作用により、抗体は問題のエピトープすなわち
タンパク質表面の抗原決定部位との相互作用を変化させ
るであろう。理想的な場合この方法はもちろん、すべて
の抗体が互いに交差試験されるように実施すべきであ
る。しかしながらリガンドの数が多い場合測定の量は比
較的多大となり、適当な情報は実際には試験するリガン
ドの組合せを適当に選択することにより得られる。リガ
ンドの１つにより固定化されたタンパク質と負に相互作
用したモノクローナルは、次いで同様な方法で但し他の
モノクローナルを使用して表面に結合させて連続的に分
析される。場合により、結合モノクローナルは正に相互
作用するモノクローナルの分析において１回又はそれよ
り多い回数変化させることもできる。
部位を妨げるか否かが直接明らかになるであろう。先行
する相互作用により、抗体は問題のエピトープすなわち
タンパク質表面の抗原決定部位との相互作用を変化させ
るであろう。理想的な場合この方法はもちろん、すべて
の抗体が互いに交差試験されるように実施すべきであ
る。しかしながらリガンドの数が多い場合測定の量は比
較的多大となり、適当な情報は実際には試験するリガン
ドの組合せを適当に選択することにより得られる。リガ
ンドの１つにより固定化されたタンパク質と負に相互作
用したモノクローナルは、次いで同様な方法で但し他の
モノクローナルを使用して表面に結合させて連続的に分
析される。場合により、結合モノクローナルは正に相互
作用するモノクローナルの分析において１回又はそれよ
り多い回数変化させることもできる。
いくつかのモノクローナル組合せをそのような組織的
な方法で実行した後、簡単な論理と結果の有効な提示に
よりタンパク質の抗体結合表面が確認され、相互に関連
することが許容される。抗体相互作用との関連でタンパ
ク質の特性決定のために記述された方法は、もちろん一
般にそれらのエピトープ相互作用に高い特異性を示すす
べての種類のリガンドと巨大分子に適用することができ
る。
な方法で実行した後、簡単な論理と結果の有効な提示に
よりタンパク質の抗体結合表面が確認され、相互に関連
することが許容される。抗体相互作用との関連でタンパ
ク質の特性決定のために記述された方法は、もちろん一
般にそれらのエピトープ相互作用に高い特異性を示すす
べての種類のリガンドと巨大分子に適用することができ
る。
上に示した情報から明らかなように本発明の方法の重
要な態様は巨大分子の改良された機能的／構造的情報を
得るためにリガンド相互作用の連続的分析を（ｉ）検出
表面に供給されるリガンドの変更された順序、並びに
（ii）巨大分子上の変更された結合部位を伴い、できれ
ば組み合わせて反復する可能性である。添加するリガン
ドの相対的順序を変更することは機能的及び構造的な点
で相当するエピトープの相互関係のよりよい情報を得る
ことを可能にするが、分析の間巨大分子の検出表面への
固定化のための結合部位を変更することにより多少検出
表面上の巨大分子を回転させることができる。このよう
にして巨大分子のすべての部分はリガンド相互作用に有
効に露出され、それによりエピトープの検出表面への近
接がエピトープの機能に及ぼすことができる影響を除去
することができる。
要な態様は巨大分子の改良された機能的／構造的情報を
得るためにリガンド相互作用の連続的分析を（ｉ）検出
表面に供給されるリガンドの変更された順序、並びに
（ii）巨大分子上の変更された結合部位を伴い、できれ
ば組み合わせて反復する可能性である。添加するリガン
ドの相対的順序を変更することは機能的及び構造的な点
で相当するエピトープの相互関係のよりよい情報を得る
ことを可能にするが、分析の間巨大分子の検出表面への
固定化のための結合部位を変更することにより多少検出
表面上の巨大分子を回転させることができる。このよう
にして巨大分子のすべての部分はリガンド相互作用に有
効に露出され、それによりエピトープの検出表面への近
接がエピトープの機能に及ぼすことができる影響を除去
することができる。
本発明の方法は完全に又は部分的に知られていない巨
大分子に関する定性的機能的／構造的情報を得るために
使用できると理解されるであろう。しかしながらこの方
法の測定原理から、例えば巨大分子の１つ又はそれより
多いエピトープがあらかじめ知られている場合定量的情
報を得ることも可能である。
大分子に関する定性的機能的／構造的情報を得るために
使用できると理解されるであろう。しかしながらこの方
法の測定原理から、例えば巨大分子の１つ又はそれより
多いエピトープがあらかじめ知られている場合定量的情
報を得ることも可能である。
本発明の方法の考えられる重要な用途は巨大分子の一
次構造の変更の影響を調べることである。これにより例
えばペプチド配列の点変異又は欠失が完成され、又本発
明によるエピトープマッピングをどちらのエピトープが
それらの結合特性が変化するように構造的に影響を受け
ているかを実証するために使用することができる。その
ような巨大分子構造の変更は分子の性質を１つの方向又
は他に変化させるため所謂タンパク質工学のためのみな
らず、部分的に知られている巨大分子の改良された構造
情報を得るために実行することができる。
次構造の変更の影響を調べることである。これにより例
えばペプチド配列の点変異又は欠失が完成され、又本発
明によるエピトープマッピングをどちらのエピトープが
それらの結合特性が変化するように構造的に影響を受け
ているかを実証するために使用することができる。その
ような巨大分子構造の変更は分子の性質を１つの方向又
は他に変化させるため所謂タンパク質工学のためのみな
らず、部分的に知られている巨大分子の改良された構造
情報を得るために実行することができる。
他の用途は巨大分子の断片を調べることによりエピト
ープを既知のユニットに位置付けすることである。更に
考えられる用途としてはエピトープが消失し又は新しい
エピトープ（ネオエピトープ）が形成される過程により
巨大分子が受けるかも知れない影響の制御を挙げること
ができる。
ープを既知のユニットに位置付けすることである。更に
考えられる用途としてはエピトープが消失し又は新しい
エピトープ（ネオエピトープ）が形成される過程により
巨大分子が受けるかも知れない影響の制御を挙げること
ができる。
本発明による構造分析は患者の血清／血漿／血液、
尿、脳脊髄液、唾液又は組織内の巨大分子の研究に使用
することもできる。従って本発明によるリガンドのサブ
セットを用いて患者からの巨大分子の特性決定により種
々なエピトープパターン又はエピトープ密度を重篤度又
は病理的条件に関連して開示することができる。患者の
抗原構造におけるそのような差異は翻訳後修飾例えばグ
リコシル化又はタンパク分解的分裂の結果であり、異な
る抗原用細胞起原を反映することがある。この例は古典
的モノクローナル抗体例えばCA 50、CA 19−９又はCA 2
42により定義される腫瘍付随抗原である。この抗原は約
90％の炭水化物と分子量が約100キロダルトンのコアタ
ンパク質を持つ糖タンパク質である。本発明の方法によ
り腫瘍付随抗原が一連のリガンドにより特徴付けられ、
又これらの異なるリガンドの結合がエピトープ密度と構
造的関係について比較される場合よりよい臨床的相関を
得ることができる。
尿、脳脊髄液、唾液又は組織内の巨大分子の研究に使用
することもできる。従って本発明によるリガンドのサブ
セットを用いて患者からの巨大分子の特性決定により種
々なエピトープパターン又はエピトープ密度を重篤度又
は病理的条件に関連して開示することができる。患者の
抗原構造におけるそのような差異は翻訳後修飾例えばグ
リコシル化又はタンパク分解的分裂の結果であり、異な
る抗原用細胞起原を反映することがある。この例は古典
的モノクローナル抗体例えばCA 50、CA 19−９又はCA 2
42により定義される腫瘍付随抗原である。この抗原は約
90％の炭水化物と分子量が約100キロダルトンのコアタ
ンパク質を持つ糖タンパク質である。本発明の方法によ
り腫瘍付随抗原が一連のリガンドにより特徴付けられ、
又これらの異なるリガンドの結合がエピトープ密度と構
造的関係について比較される場合よりよい臨床的相関を
得ることができる。
エピトープマッピングは又、所与の抗原に対する免疫
応答を分析する場合診断的興味がある。記述した方法と
モノクローナル抗体のサブセット又は抗原上の限定され
たエピトープに対する他のリガンドにより、患者におけ
る免疫応答は患者のポリクローナル抗血清を抗原に結合
させた後、リガンドによりエピトープを特性決定するこ
とにより分析することができる。患者の免疫応答の定量
後限定されたエピトープに対するリガンドの連続注入を
伴う方法により患者のためのエピトープレパートリーが
容易に特徴付けられ、この情報は病理的条件と相関を持
つことがあり、及び予知的価値を持つ、この方法による
エピトープ特性決定が診断的又は予知的価値を持つ他の
場合は予防接種に関連する患者におけるエピトープ免疫
応答の分析である。自己抗原並びに外来抗原のためのエ
ピトープレパートリーは臨床的興味がある。
応答を分析する場合診断的興味がある。記述した方法と
モノクローナル抗体のサブセット又は抗原上の限定され
たエピトープに対する他のリガンドにより、患者におけ
る免疫応答は患者のポリクローナル抗血清を抗原に結合
させた後、リガンドによりエピトープを特性決定するこ
とにより分析することができる。患者の免疫応答の定量
後限定されたエピトープに対するリガンドの連続注入を
伴う方法により患者のためのエピトープレパートリーが
容易に特徴付けられ、この情報は病理的条件と相関を持
つことがあり、及び予知的価値を持つ、この方法による
エピトープ特性決定が診断的又は予知的価値を持つ他の
場合は予防接種に関連する患者におけるエピトープ免疫
応答の分析である。自己抗原並びに外来抗原のためのエ
ピトープレパートリーは臨床的興味がある。
前に述べたように本発明の方法は少なくともある程度
まで不純な巨大分子標品に適用することもできる。以下
に不純な抗原で免疫する場合に得られるモノクローナル
抗体により不純な抗原に関する構造情報を得るための本
発明の方法の使用を記述する。
まで不純な巨大分子標品に適用することもできる。以下
に不純な抗原で免疫する場合に得られるモノクローナル
抗体により不純な抗原に関する構造情報を得るための本
発明の方法の使用を記述する。
簡単のため、不純抗原はタンパク質Ａ、Ｂ及びＣの混
合物であり、その種々なエピトープに対するモノクロー
ナル抗体は免疫化で得られると仮定する。本発明により
抗体の１つを検出表面に結合させ、次いでタンパク質混
合物を検出表面に生特異的に固定化させるために添加す
る。タンパク質Ａは検出表面に結合した抗体により指向
される。次いで得られる検出表面をＡに結合するそれに
関連して他の抗体を調査するために使用する。結合しな
い抗体は検出表面に結合させた抗体のようにＡ上の同一
エピトープを指向するか又はタンパク質Ｂ若しくはＣを
指向することができる。
合物であり、その種々なエピトープに対するモノクロー
ナル抗体は免疫化で得られると仮定する。本発明により
抗体の１つを検出表面に結合させ、次いでタンパク質混
合物を検出表面に生特異的に固定化させるために添加す
る。タンパク質Ａは検出表面に結合した抗体により指向
される。次いで得られる検出表面をＡに結合するそれに
関連して他の抗体を調査するために使用する。結合しな
い抗体は検出表面に結合させた抗体のようにＡ上の同一
エピトープを指向するか又はタンパク質Ｂ若しくはＣを
指向することができる。
Ａに結合する抗体を見出した場合、タンパク質Ａを代
わりにこの他の抗体を介して検出表面に固定化させ、前
に得られたタンパク質Ａに対して負の抗体のすべてを抗
体固定化タンパク質Ａに対して選別し、タンパク質Ａ上
の同一エピトープに結合する抗体を前記第一の抗体とし
て見出す。見出された非結合抗体はタンパク質Ｂ又はＣ
を指向するに違いなく、上述の方法を同様に繰り返して
これらのタンパク質を確認する。種々なタンパク質に対
するすべての抗体が一旦確認されると、各タンパク質に
つき前に述べた様に本発明によるエピトープマッピング
を行うことができる。どちらの成分が生物学的効果に応
答し得るかは抗体による阻害により容易に確認すること
ができる。
わりにこの他の抗体を介して検出表面に固定化させ、前
に得られたタンパク質Ａに対して負の抗体のすべてを抗
体固定化タンパク質Ａに対して選別し、タンパク質Ａ上
の同一エピトープに結合する抗体を前記第一の抗体とし
て見出す。見出された非結合抗体はタンパク質Ｂ又はＣ
を指向するに違いなく、上述の方法を同様に繰り返して
これらのタンパク質を確認する。種々なタンパク質に対
するすべての抗体が一旦確認されると、各タンパク質に
つき前に述べた様に本発明によるエピトープマッピング
を行うことができる。どちらの成分が生物学的効果に応
答し得るかは抗体による阻害により容易に確認すること
ができる。
本発明の方法に使用するセンサー表面はその物理的又
は化学的性質が問題のリガンド相互作用により測定可能
な様式で変化するような表面であることができる。例え
ばそれらは光学的性質例えば光の放射量又はその波長に
おける変化、屈折率などを測定することができる表層又
は表面近くに位置する層を持つことができる。屈折率に
おける変化は例えば前に述べたSPR又は楕円偏光法によ
り測定することができる。検出表面はリガンド相互作用
がその光音響的性質に測定可能な変化として現れるよう
なそれであることができる。他の例ではバイオセンサー
表面は圧電結晶又は電場効果トランジスターの一部であ
る。
は化学的性質が問題のリガンド相互作用により測定可能
な様式で変化するような表面であることができる。例え
ばそれらは光学的性質例えば光の放射量又はその波長に
おける変化、屈折率などを測定することができる表層又
は表面近くに位置する層を持つことができる。屈折率に
おける変化は例えば前に述べたSPR又は楕円偏光法によ
り測定することができる。検出表面はリガンド相互作用
がその光音響的性質に測定可能な変化として現れるよう
なそれであることができる。他の例ではバイオセンサー
表面は圧電結晶又は電場効果トランジスターの一部であ
る。
本発明の方法に使用するセンサー表面が含まれる全セ
ンサーシステムはもちろん調べるセンサー表面と表面パ
ラメーターの種類による。SPR法に基づく適当なセンサ
ーシステムは「光学的バイオセンサーシステム」という
我々の前述の係属中のPCT出願に記述されている。その
より詳しい設計は以下の実施例に示されるであろう。
ンサーシステムはもちろん調べるセンサー表面と表面パ
ラメーターの種類による。SPR法に基づく適当なセンサ
ーシステムは「光学的バイオセンサーシステム」という
我々の前述の係属中のPCT出願に記述されている。その
より詳しい設計は以下の実施例に示されるであろう。
場合により本発明の方法により得られる情報は問題の
巨大分子の表面特性の解釈を単純化するためコンピュー
ター処理することができ、その結果をグラフ形態で便利
に提供することができる。
巨大分子の表面特性の解釈を単純化するためコンピュー
ター処理することができ、その結果をグラフ形態で便利
に提供することができる。
本発明は次の実施例で更に詳しく例証する。これに関
連して付随する図面を参考として示すが、その中で 第1a図と第1b図は本発明の方法の１つの具体例の異な
る段階を実行する場合に得られる表面変化応答を示すグ
ラフであり、 第2a図と第2b図は本発明の方法の他の具体例により得
られる表面変化応答を示す第1a図及び第1b図と同様なグ
ラフであり、及び 第３図は本発明の方法により得られる情報の模式的グ
ラフ図の例である。
連して付随する図面を参考として示すが、その中で 第1a図と第1b図は本発明の方法の１つの具体例の異な
る段階を実行する場合に得られる表面変化応答を示すグ
ラフであり、 第2a図と第2b図は本発明の方法の他の具体例により得
られる表面変化応答を示す第1a図及び第1b図と同様なグ
ラフであり、及び 第３図は本発明の方法により得られる情報の模式的グ
ラフ図の例である。
実施例 この実施例においては本発明の方法によるHIVタンパ
ク質P24のエピトープマッピングを記述する。このタン
パク質はそれ自身又はそれに対する抗体の存在がHIV感
染の初期の兆候であると考えられることより現在極めて
大きな関心を持たれている。試験システムの組立てのた
めもちろんタンパク質のいくつかの独立した結合部位を
知ることが重要である。
ク質P24のエピトープマッピングを記述する。このタン
パク質はそれ自身又はそれに対する抗体の存在がHIV感
染の初期の兆候であると考えられることより現在極めて
大きな関心を持たれている。試験システムの組立てのた
めもちろんタンパク質のいくつかの独立した結合部位を
知ることが重要である。
エピトープマッピングのため「光学的バイオセンサー
システム」という我々の前述のPCT出願に記述された光
学的バイオセンサーシステムを使用する。このバイオセ
ンサーシステムは、その１つの具体例においては本来公
知のSPR法に基づいており、交換可能なセンサーユニッ
ト：センサーユニットの検出表面に試薬と試料溶液を輸
送する導管又はチャンネルシステムを持つ液体取扱い用
ブロックユニット；増感させた表面への入射光線と結合
し、反射した放射線を検出する光学ユニット；及び検量
後検出器シグナルを検出表面における物質の量に比例す
るパラメーターに変換する評価ユニットとを持つ。測定
を実行する場合、定められた試料液量を定められたチャ
ンネル部分に注入して導入し、次いでこの液量を溶離液
体により光学的分析のため検出表面を強制的に通過させ
る。ここで使用した装置は0.5×0.05×4mmの測定用チャ
ンネルを持っていた。ポンプはPharmacia AB,Swedenか
ら商品番号P500として発売されているポンプの変更機種
を用いた。50μの外部ループを持つ自動注入装置Gils
on Model 231を装置に取り付けた。
システム」という我々の前述のPCT出願に記述された光
学的バイオセンサーシステムを使用する。このバイオセ
ンサーシステムは、その１つの具体例においては本来公
知のSPR法に基づいており、交換可能なセンサーユニッ
ト：センサーユニットの検出表面に試薬と試料溶液を輸
送する導管又はチャンネルシステムを持つ液体取扱い用
ブロックユニット；増感させた表面への入射光線と結合
し、反射した放射線を検出する光学ユニット；及び検量
後検出器シグナルを検出表面における物質の量に比例す
るパラメーターに変換する評価ユニットとを持つ。測定
を実行する場合、定められた試料液量を定められたチャ
ンネル部分に注入して導入し、次いでこの液量を溶離液
体により光学的分析のため検出表面を強制的に通過させ
る。ここで使用した装置は0.5×0.05×4mmの測定用チャ
ンネルを持っていた。ポンプはPharmacia AB,Swedenか
ら商品番号P500として発売されているポンプの変更機種
を用いた。50μの外部ループを持つ自動注入装置Gils
on Model 231を装置に取り付けた。
センサーユニットは薄い金膜で被覆したガラス板から
なり、前記金膜には「バイオセンサーシステムに使用す
る選択的生体分子相互作用可能な検出表面（Sensing su
rfaces capable of selective biomolecular interacti
ons to be used in biosensor systems）」（スエーデ
ン特許願第8804073−８号に基づく）という我々の係属
中のPCT出願に記述されているようにデキストランヒド
ロゲルの層が結合されており、前記開示は参考例として
ここに組み入れるものであり、又これは「センサーユニ
ットとそのバイオセンサーシステムにおける使用」とい
う我々の係属中のPCT出願に記述されているように変更
されており、以下に明確に述べる。
なり、前記金膜には「バイオセンサーシステムに使用す
る選択的生体分子相互作用可能な検出表面（Sensing su
rfaces capable of selective biomolecular interacti
ons to be used in biosensor systems）」（スエーデ
ン特許願第8804073−８号に基づく）という我々の係属
中のPCT出願に記述されているようにデキストランヒド
ロゲルの層が結合されており、前記開示は参考例として
ここに組み入れるものであり、又これは「センサーユニ
ットとそのバイオセンサーシステムにおける使用」とい
う我々の係属中のPCT出願に記述されているように変更
されており、以下に明確に述べる。
検出器デバイスは幅80μで20μの間隔で置かれるフォ
トダイオードの形態の一組の検出器要素からなる。下で
測定表面における質量吸着（応答）に使用するユニット
「ダイオード（１つ又は複数）」とこの特定のフォトダ
イオード配置に関連しており、検出表面の屈折率変化に
より引き起こされる角度における共鳴変化に包含される
連続的フォトダイオードの数を示す。
トダイオードの形態の一組の検出器要素からなる。下で
測定表面における質量吸着（応答）に使用するユニット
「ダイオード（１つ又は複数）」とこの特定のフォトダ
イオード配置に関連しており、検出表面の屈折率変化に
より引き起こされる角度における共鳴変化に包含される
連続的フォトダイオードの数を示す。
測定用として組換えDNA法により得られるタンパク質P
24並びにこのタンパク質に対して反応性を持つ抗P24モ
ノクローナルを含む54の培養培地を使用した。
24並びにこのタンパク質に対して反応性を持つ抗P24モ
ノクローナルを含む54の培養培地を使用した。
実際のエピトープ測定に先立ち、これらの54の培養培
地のサブクラス及び濃度測定を以下に記述するように実
施した。
地のサブクラス及び濃度測定を以下に記述するように実
施した。
溶離剤として10mM Hepes、0.15 NaCl、3.4mM EDTA、
0.1％FT 229、pH＝7.4を使用した。試薬と試料は20μ
の量を注入し、再生は0.1Mグリシン−HCl、pH＝2.5、0.
1％FT 229（20μ）で実行した。
0.1％FT 229、pH＝7.4を使用した。試薬と試料は20μ
の量を注入し、再生は0.1Mグリシン−HCl、pH＝2.5、0.
1％FT 229（20μ）で実行した。
A. サブクラスの測定 この測定のためデキストランで処理した検出表面をカ
ルボキシメチル化により修飾し、次いで反応性エステル
基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びＮ−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩
酸（EDC）と共にインキュベートすることにより導入し
た。このように誘導体化した検出表面に免疫吸着精製し
た標品からウサギ抗マウス軽鎖を結合させた。
ルボキシメチル化により修飾し、次いで反応性エステル
基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びＮ−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩
酸（EDC）と共にインキュベートすることにより導入し
た。このように誘導体化した検出表面に免疫吸着精製し
た標品からウサギ抗マウス軽鎖を結合させた。
次の抗マウスIgGサブクラス試薬を使用した。
ラットモノクローナル抗G1、ラットモノクローナル抗
G2a、ラットモノクローナル抗G2b及びラットモノクロー
ナル抗G3はMIAB、Uppsala、Swedenから入手した。この
試薬を10mM Hepes（pH＝7.4）に100μg/mlに希釈した。
G2a、ラットモノクローナル抗G2b及びラットモノクロー
ナル抗G3はMIAB、Uppsala、Swedenから入手した。この
試薬を10mM Hepes（pH＝7.4）に100μg/mlに希釈した。
抗サブクラス試薬は抗G3、抗G2a、抗G2b及び抗G1の順
に連続的に実施し、54の培養培地を連続的に分析した。
流速は20μ/ml、注入の間の時間は２分間であった。
に連続的に実施し、54の培養培地を連続的に分析した。
流速は20μ/ml、注入の間の時間は２分間であった。
培養培地は抗G1に対する応答が少なくとも0.1ダイオ
ードに達した場合G1と定義した。No.8、51、27、35、3
8、39、40、41、43及び46を除くすべての培養培地は0.1
を越える応答値を示した。抗G3、抗G2a、及び抗G2bに対
する応答はいずれの培養培地も0.02ダイオードを越えな
かった。精製したIgM（100μg/ml）の注入によりすべて
の抗サブクラス試薬について0.03より少ない応答を示す
結果となった。
ードに達した場合G1と定義した。No.8、51、27、35、3
8、39、40、41、43及び46を除くすべての培養培地は0.1
を越える応答値を示した。抗G3、抗G2a、及び抗G2bに対
する応答はいずれの培養培地も0.02ダイオードを越えな
かった。精製したIgM（100μg/ml）の注入によりすべて
の抗サブクラス試薬について0.03より少ない応答を示す
結果となった。
B. 濃度測定 すべての培養培地は培養培地（５％FCS）中でそれぞ
れ２、５、10、20、30、40、50、60、80及び100μg/ml
の濃度に希釈したG1モノクローナル（抗ベータ−２−ミ
クログロブリン）の混合物で得られる応答値に基づいて
確立したG1基準標準曲線と相関を持っていた。
れ２、５、10、20、30、40、50、60、80及び100μg/ml
の濃度に希釈したG1モノクローナル（抗ベータ−２−ミ
クログロブリン）の混合物で得られる応答値に基づいて
確立したG1基準標準曲線と相関を持っていた。
標準点は繰返し２で実施し、各点の平均値に基づく標
準曲線を２〜30μg/mlの間で確立した。上のサブクラス
測定におけると同じ検出表面を使用した。流速は20μ
／分であり、注入の間の時間は３分であった。培養培地
の測定は単一試料につき実行した。培養培地８、27、3
5、38、40及び41は極めて低い濃度を示した。
準曲線を２〜30μg/mlの間で確立した。上のサブクラス
測定におけると同じ検出表面を使用した。流速は20μ
／分であり、注入の間の時間は３分であった。培養培地
の測定は単一試料につき実行した。培養培地８、27、3
5、38、40及び41は極めて低い濃度を示した。
c. エピトープ調査 上で実行したサブクラス及び濃度測定に基づいて次の
培養培地、８、16、27、35、38、39及び40はエピトープ
調査から除いた。他の培養培地は下で配述する相互エピ
トープ反応性の点で特性決定した。これらの測定のため
デキストランで処理した検出表面を次のように修飾し
た。
培養培地、８、16、27、35、38、39及び40はエピトープ
調査から除いた。他の培養培地は下で配述する相互エピ
トープ反応性の点で特性決定した。これらの測定のため
デキストランで処理した検出表面を次のように修飾し
た。
C1. ヒドラジド機能の導入 3.5gのブロモ酢酸を27gの2M水酸化ナトリウム溶液に
溶解した。混合物をデキストラン処理しカルボキシメチ
ル化したセンサー表面に注ぎ、振盪インキュベーター中
で25℃で16時間インキュベートした。表面を水で洗浄
し、次いで上述の方法を一度繰り返した。洗浄後表面を
20mlの水中0.8gのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）
−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸（EDC）で５分間処
理し、次いで20mlの水中4.0mlのヒドラジン塩酸を添加
した。表面を25℃の振盪インキュベーター中で16時間イ
ンキュベートし、次いで水で洗浄した。
溶解した。混合物をデキストラン処理しカルボキシメチ
ル化したセンサー表面に注ぎ、振盪インキュベーター中
で25℃で16時間インキュベートした。表面を水で洗浄
し、次いで上述の方法を一度繰り返した。洗浄後表面を
20mlの水中0.8gのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）
−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸（EDC）で５分間処
理し、次いで20mlの水中4.0mlのヒドラジン塩酸を添加
した。表面を25℃の振盪インキュベーター中で16時間イ
ンキュベートし、次いで水で洗浄した。
C2. 誘導体化した測定表面へのウサギ抗マウス−Fcγ
の結合 10mM酢酸緩衝液（pH5.5）中免疫吸着精製したウサギ
抗マウス−Fcγを上で得られたヒドラジド表面に20分間
結合させ、次いで未結合抗体を表面をPBS緩衝液（pH7.
4）及び0.1Mグリシン（pH2.5）中で洗浄することにより
除いた。得られた結合は約2.5ダイオードの測定装置中
応答に相当した。
の結合 10mM酢酸緩衝液（pH5.5）中免疫吸着精製したウサギ
抗マウス−Fcγを上で得られたヒドラジド表面に20分間
結合させ、次いで未結合抗体を表面をPBS緩衝液（pH7.
4）及び0.1Mグリシン（pH2.5）中で洗浄することにより
除いた。得られた結合は約2.5ダイオードの測定装置中
応答に相当した。
流速は20μ／分であり、注入の間は３分を実験に使
用した。
用した。
C3. エピトープマッピング 第一段階として培養培地No.12（1:4に希釈）を検出表
面上に相当するモノクローナルを固定化させるため注入
した。次に検出表面上の残りの結合部位をすべて封鎖す
るためこの状況に不適当なG1モノクローナルすなわち抗
ベータ−２−ミクログロブリン（40μg/ml）を注入し、
次いでHIVタンパク質P24（10μg/ml）を注入した。この
タンパク質をモノクローナル12を介して表面に生特異的
に結合させ、システムの他のモノクローナルとの相互作
用の分析をする準備が整った。最初の分析系列で各モノ
クローナルの結合を個別に各測定の間にシステムの再生
をしながら調べた。
面上に相当するモノクローナルを固定化させるため注入
した。次に検出表面上の残りの結合部位をすべて封鎖す
るためこの状況に不適当なG1モノクローナルすなわち抗
ベータ−２−ミクログロブリン（40μg/ml）を注入し、
次いでHIVタンパク質P24（10μg/ml）を注入した。この
タンパク質をモノクローナル12を介して表面に生特異的
に結合させ、システムの他のモノクローナルとの相互作
用の分析をする準備が整った。最初の分析系列で各モノ
クローナルの結合を個別に各測定の間にシステムの再生
をしながら調べた。
結果として培養培地は下記のように２群に分布した。
ａ） 培地No.12から独立してP24と反応する培養培地;
1、17、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、3
0、31、32、33、34、36、37、41、43、44、45、47、4
8、49、50、51、52、53及び54 ｂ） 培地No.12が結合した場合P24と反応しない培養培
地;2、３、４、５、６、７、９、10、11、12、13、14、
15、18及び42 上のケースａ）は添付の第1a図及びケースｂ）は第1b
図に示すが、この場合Ｙ軸は相対的応答及びＸ軸は時間
（秒）を示す。両図において数字１は培養培地No.12の
注入を示し（技術的理由から注入は各サイクルの最後に
行った。次いで再生は行わず、従ってモノクローナルN
o.2注入を実行した時既に表面に結合されていた）;2は
抗ベータ−２−ミクログロブリンの注入を示し、３はP2
4の注入を示し、４は培地No.12から独立してP24に結合
するか（第1a図）、又は培地No.12と競合する（第1b
図）P24反応性培養培地の注入を示し、及び５は再生を
示す。この測定において正の応答は0.13ダイオードより
大きいダイオードの読みと定義し、負のシグナル0.02ダ
イオードを越えてはならない。
1、17、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、3
0、31、32、33、34、36、37、41、43、44、45、47、4
8、49、50、51、52、53及び54 ｂ） 培地No.12が結合した場合P24と反応しない培養培
地;2、３、４、５、６、７、９、10、11、12、13、14、
15、18及び42 上のケースａ）は添付の第1a図及びケースｂ）は第1b
図に示すが、この場合Ｙ軸は相対的応答及びＸ軸は時間
（秒）を示す。両図において数字１は培養培地No.12の
注入を示し（技術的理由から注入は各サイクルの最後に
行った。次いで再生は行わず、従ってモノクローナルN
o.2注入を実行した時既に表面に結合されていた）;2は
抗ベータ−２−ミクログロブリンの注入を示し、３はP2
4の注入を示し、４は培地No.12から独立してP24に結合
するか（第1a図）、又は培地No.12と競合する（第1b
図）P24反応性培養培地の注入を示し、及び５は再生を
示す。この測定において正の応答は0.13ダイオードより
大きいダイオードの読みと定義し、負のシグナル0.02ダ
イオードを越えてはならない。
次いで更に正の培地を種々な相互組合せ、連続的に注
入するいくつかの培地につき分析した。種々な組合せと
得られたその結果を下の第１表に示す。表には0.13ダイ
オードを越える応答を「＋」で、0.02ダイオードより少
ない応答を「−」で示す。ある場合応答は２つの限界の
間を示す（半＋）。
入するいくつかの培地につき分析した。種々な組合せと
得られたその結果を下の第１表に示す。表には0.13ダイ
オードを越える応答を「＋」で、0.02ダイオードより少
ない応答を「−」で示す。ある場合応答は２つの限界の
間を示す（半＋）。
第2a図及び第2b図はそれぞれ、そのような実験におけ
る検出器応答を示し、ここでは５つのモノクローナルを
連続的に注入し、それらのすべては先行するモノクロー
ナルを結合させた事実と無関係に結合させた。第2b図に
おいては第１と第２モノクローナルは結合（＋）してお
り、一方他の３つのモノクローナルの他の結合部位は封
鎖（−）されている。
る検出器応答を示し、ここでは５つのモノクローナルを
連続的に注入し、それらのすべては先行するモノクロー
ナルを結合させた事実と無関係に結合させた。第2b図に
おいては第１と第２モノクローナルは結合（＋）してお
り、一方他の３つのモノクローナルの他の結合部位は封
鎖（−）されている。
負の培地は正の培地と類似の方法で、但し第一段階に
おいて培地No.12の代わりに固定化させた培地No.30を用
いて分析した。当初の実験において正の応答で反応した
個別培地、培地No.12と培地No.42は設定限度を外れる応
答で反応することが確認された。これらの２つの培地は
第一段階で固定化させた培地No.34を用いる系列で分析
して同じ結果が得られた。次いで培地を組み合わせて分
析し、下の第２表に示す結果が得られた。上の第１表と
同じ判断基準を適用する。
おいて培地No.12の代わりに固定化させた培地No.30を用
いて分析した。当初の実験において正の応答で反応した
個別培地、培地No.12と培地No.42は設定限度を外れる応
答で反応することが確認された。これらの２つの培地は
第一段階で固定化させた培地No.34を用いる系列で分析
して同じ結果が得られた。次いで培地を組み合わせて分
析し、下の第２表に示す結果が得られた。上の第１表と
同じ判断基準を適用する。
すべての結果をまとめると、実行した特性決定は第３
図のように図形的に示すことができる。図の培地番号に
下線が付してある場合、その培地がすべての他の下線を
付した培地に対して試験されたことを示す。第３図に見
られるように独立した結合部位を含む６つの主要な領域
に確認された。特性決定はすべての個々の培地がすべて
の他の培地に対して試験されていないことから不完全で
あることに注意しなければならない。これはある培地に
おいては極めて近接しているが同一でないエピトープに
対してその反応性を持つ結果となることがある。
図のように図形的に示すことができる。図の培地番号に
下線が付してある場合、その培地がすべての他の下線を
付した培地に対して試験されたことを示す。第３図に見
られるように独立した結合部位を含む６つの主要な領域
に確認された。特性決定はすべての個々の培地がすべて
の他の培地に対して試験されていないことから不完全で
あることに注意しなければならない。これはある培地に
おいては極めて近接しているが同一でないエピトープに
対してその反応性を持つ結果となることがある。
上述のエピトープ調査は驚くほど多数のエピトープが
P24分子上にあり、同時に少なくとも６つの抗体のため
の部屋があるこらとを明らかにしている。この調査の結
果は例えば診断試験用の適当なモノクローナル組合せの
開発に使用することができる。
P24分子上にあり、同時に少なくとも６つの抗体のため
の部屋があるこらとを明らかにしている。この調査の結
果は例えば診断試験用の適当なモノクローナル組合せの
開発に使用することができる。
本発明はもちろん上述の特定の具体例に限定されるも
のではなく、多くの修正と変更が添付の請求の範囲に定
義した一般的な発明の思想の範囲の中にある。
のではなく、多くの修正と変更が添付の請求の範囲に定
義した一般的な発明の思想の範囲の中にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シエーダール，イヨルゲン スウエーデン国エス―741 00 クニー ヴスタ．ペルシコヴエイエン１ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/543
Claims (14)
- 【請求項１】リガンドとの反応性を調べることによる巨
大分子の特性決定の方法であって、 前記方法は該巨大分子を少なくとも１つのリガンドと反
応させた後、該巨大分子を少なくとも１つの追加のリガ
ンドと接触させ、巨大分子又は追加の１つ又は複数の該
リガンドはセンサー表面に結合しており、センサー表面
の物理化学的性質に結果として起こる変化を検出するこ
とによりリガンドの反応性を測定し、測定したリガンド
反応性の間の相互依存性に基づいて該巨大分子のエピト
ープを識別し、そしてそれらの相対的位置をマッピング
することによってリガンド反応性の相互の影響を測定す
ることからなる巨大分子の特性決定の方法。 - 【請求項２】ａ） 巨大分子をセンサー表面に結合させ
る段階、 ｂ） 少なくとも２つのリガンドをセンサー表面に結合
させた該巨大分子に連続的に接触させる段階、及び ｃ） 各リガンドを該巨大分子を持つセンサー表面と接
触させた後それぞれのリガンドの巨大分子との反応性を
センサー表面の物理化学的性質に結果として起こる変化
を検出することにより測定する段階からなることを特徴
とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】ａ） リガンドをセンサー表面に結合させ
る段階、 ｂ） 巨大分子をセンサー表面に結合させるために該巨
大分子がセンサー表面に結合させたリガンドと反応する
ことを許容する段階、 ｃ） １つ又はそれより多い追加のリガンドをセンサー
表面に結合させた該巨大分子と連続的に接触させる段
階、及び ｄ） 各々の追加のリガンドを該巨大分子を持つセンサ
ー表面と接触させた後、それぞれのリガンドの該巨大分
子との反応性をセンサー表面の物理化学的性質に結果と
して起こる変化を検出することにより測定する段階から
なることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】ａ） リガンドをセンサー表面に結合させ
る段階、 ｂ） 巨大分子が少なくとも１つの他のリガンドと反応
することを許容する段階、 ｃ） 前記少なくとも１つの他のリガンドと反応させた
該巨大分子をリガンドを持つセンサー表面と接触させる
段階、及び ｄ） 該巨大分子とセンサー表面に結合させたリガンド
との反応性をセンサー表面の物理化学的性質に結果とし
て起こる変化を検出することにより測定する段階からな
ることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項５】変更した順序で少なくとも２つのリガンド
との複数の反応を繰り返すことからなることを特徴とす
る請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項６】段階ｂ）と段階ｃ）を変更した順序で複数
のリガンドとの反応を１回又はそれより多い回数繰り返
すことを特徴とする請求項２または５記載の方法。 - 【請求項７】段階ｃ）と段階ｄ）、及び場合によりａ）
を変更した順序で複数のリガンドとの反応を１回又はそ
れより多い回数繰り返すことを特徴とする請求項３また
は５記載の方法。 - 【請求項８】段階ａ）〜段階ｄ）を変更した順序で複数
のリガンドとの反応を１回又はそれより多い回数繰り返
すことを特徴とする請求項４または５記載の方法。 - 【請求項９】方法をリガンドのより小さい群で繰り返し
て実行することを特徴とする多数のリガンドを使用する
請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項１０】多数のリガンドの各々の１つをセンサー
表面のそれぞれのサブ領域に結合させる段階、及びそれ
に結合した少なくとも１つのリガンドを持つ巨大分子を
得られる多機能性センサー表面に連続して結合させる段
階、巨大分子の前記センサー表面のサブ領域のすべてと
の反応性を各巨大分子／リガンド組合せにつき測定する
段階からなることを特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項１１】センサー表面の物理化学的性質の変化は
センサー表面の屈折率の変化であることを特徴とする請
求項１〜10のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項１２】巨大分子がタンパク質であることを特徴
とする請求項１〜11のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項１３】リガンドは抗体からなることを特徴とす
る請求項１〜12のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項１４】リガンドの数は少なくとも３つであるこ
とを特徴とする請求項１〜13のいずれか一項記載の方
法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8804074-6 | 1988-11-10 | ||
| SE19888804074A SE8804074D0 (sv) | 1988-11-10 | 1988-11-10 | Sensorenhet och dess anvaendning i biosensorsystem |
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