JPH04501607A

JPH04501607A - 巨大分子の特性決定法

Info

Publication number: JPH04501607A
Application number: JP1511528A
Authority: JP
Inventors: マルムクヴイスト，マグヌス; カールソン，ロベルト; ラーソン，アニタ; シエーダール，イヨルゲン
Original assignee: フアーマシア・ビオセンソル・アクチエボラーグ
Priority date: 1988-11-10
Filing date: 1989-11-09
Publication date: 1992-03-19
Anticipated expiration: 2013-09-24
Also published as: DE68921635D1; WO1990005306A1; ATE119671T1; DE68921635T2; US5554541A; EP0442930A1; EP0442930B1; JP2803877B2; SE8902043L; SE8902043D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】巨大分子の特性決定法本発明は巨大分子特にタンパク質の特性決定に関し、より詳しくは種々なリガンドとの反応を調べることにより巨大分子に関する構造的情報を得る方法に関する。

現在タンパク質の特性決定は主として２群の方法によってなされ、すなわち１つは組成情報法（アミノ酸分析、配列分析、分光測光法、質量分析法）でこれは化学的存在物の含量を与えるが、これらが空間のどこに位置するかの情報はな（、一方、特別構造法（Ｘ線結晶学、ＮＩＩＲ。

低温電子鏡検法、走査型電子トンネル鏡検法）は特定の方法により種々な程度の構造的情報を提供する。Ｘ線結晶学により全空間構造は確かに得られるが、この方法はタンパク質を結晶形態に変換することを要し、これは一般に困難であり、又この方法は更に極めて時間がかかり、且つ面倒である。現在約４００のタンパク質のみがその構造が原子分解を伴うＸ線結晶学により決定されていることが特筆される。高分解の構造的情報はＮＩＲによっても得られるが、タンパク質を溶液にすることを要する。分解はこれまで装置の磁場により制限されたが、この磁場は無制限に強（することはできず、又タンパク質の大きさと溶解度により制限された。更にＮＩＲとＸ線結晶学の両者は高品質及び比較的多量の純粋なタンパク質を必要とする。低温電子鏡検法は目視分析により固体形態におけるタンパク質の表面構造情報を提供することができ、又走査型電子トンネル鏡検法は固体形態におけるタンパク質のいくらかの情報を提供することが可能である。要約するとタンパク質の構造情報を得るためのこれらの方法は複雑で長時間を要するか、又は限られた情報のみを提供するであろう。

タンパク質に関する構造的情報は問題のタンパク質の領域又は部分を特異的に指向する抗体による免疫学的な分析方法によっても得られた。例えば、Ｆｕｒｉｅ　Ｂ等はＭｅｔｈｏｄｓ　ｆｎ　Ｅｎｚｙ園ｏ１ｏｇｙ（１９８２年）８４巻、６０〜６３ページにタンパク質表面の特異的決定基に対する抗体によりプロトロンビンとＸ因子の配座変化の研究を記述している。

モノクローナル抗体とプロット法によるヒトαヨーマクログロブリンのエピトープマツピング（すなわち巨大分子表面のエピトープの決定）はＶａｎ　Ｌｅｕｖｅｎ等によりＩ。

Ｉｓｍｕｎｏｌ、　（１９８６年）９０巻、　１２５〜１３０ページに記述されており、一方璽ａｚｚａ　Ｍ、ＩとＲｅｔｅｇｕｉ　Ｌ、＾、は璽ｏ１ｅｃ、Ｉｍｍｕｎ。

（１９８９年）２６巻、２３１〜２４０ページにモノクローナル抗体と固相ＲＩＡ法によるヒト成長ホルモン（ｈＧＩＩ）のエピトープマツピングを記述している。

最近固体表面の表層における変化例えば種々な表面へのテンサイド（ｔｅｎｓｉｄｅｓ）とタンパク質の吸着を測定するための光学的方法が化学及び生化学関連で使用され始めた。これらの光学的方法の中に楕円偏光法及び表面プラスセン共鳴法（ＳＰＲ）がある。楕円偏光法は楕円偏光の成分が表面により反射される場合受ける振幅とフヱーズの相互関係における変化を測定することにより屈折物質の屈折率を測定することを可能にする古い光学的方法である。種々な物質を表面に吸着させ、吸着層の厚さ並びに表面に吸着された量を計算することができる。

表面プラスセン共鳴法はやや簡単な表現を用いると薄い自由電子金属膜に近接する層の屈折率の変化をこれらの屈折率変化により引き起こされる反射されたｐ− 偏光束の強さの変化により検出する方法であるといえる（例えばＲａｅｔｈｅｒ　Ｈ，、Ｉ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ｏｆ　Ｔｈ１ｎ　Ｆｉｌｍｓ、　ｔｌａｓｓ　Ｇ、。

Ｆｒａｎｃｏｍｂｅ　１．及びＨｏｆｆｍａｎ　Ｒ９編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７７年）、　１４５〜２６１ページが参照される）。以下にこれらの方法を化学又は生化学分野で利用したいくつかの刊行物を説明する。

Ｃｕ１ｌｅｎ等はＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（１９８７／　８８年）３巻、　２１１〜２２５ページにおいて２つのモデル生化学系における免疫複合体形成の検出のためにＳＰＲ法の使用を記述しており、この中でヒト免疫グロブリンＧ又はヒツジ抗血清の免疫グロブリン画分を金被覆回折格子に物理的に吸着させた。次いでそれぞれアフィニティー精製したヤギ抗ヒトＩｇＧ又はヒト血清アルブミンを免疫複合体形成により特異的に結合させ、結合反応を時間との関連で追跡することができた。

Ｄａｎｆｅｌｓ　Ｐ、　Ｂ、等は５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ（１９８８年）１５巻、　１１〜１８ページにおいて表面プラスモン共鳴における濃度依存性変化が２つの系、アビジン固定化ビオチンとアルファーフェトプロティン固定化抗体−抗原について得られる実験を記述しており、これは溶液の直接免疫化学的分析にＳＰＲを使用する可能性を示している。

Ｅｌｖｉｎｇ　Ｈｏ等はＪ、　Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ、　（１９８８年）１２５巻、１３９〜１４５ページに天然分子中に隠されたエピトープ指向抗体により親水性及び疎水性表面に吸着された補体因子の配座変化の楕円偏光法による測定を記述している。

Ｊｏｎｓｓｏｎ　Ｕ、等はＪ、　Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｅｔ、　（１９８２年）９０巻、１４８〜１６３ページに固体表面へのヒトフィブロネクチン（ＨＦＮ）の吸着を調べるため楕円偏光法の使用を記述している。吸着時タンパク質の配座変化が吸着タンパク質と抗ＨＦＮ及びコンカナバリンとの相互作用をそれぞれ調べることにより明らかにされた。

Ｂｏｒｒｉｓｂｅｒｇｅｒ　Ｍ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ（１９８０年）６３２巻、２９８〜３０９ページにはレクチンとガラス表面に適用した多糖類、糖ペプチド及び糖タンパク質の膜との相互作用の研究に楕円偏光法の使用が記述されている。

璽ａｎｄｅｎｉｕｓ、　Ｃ，Ｆ、等はＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　（１９８４年）１３７巻、１０６〜１１４ページにタンパク質とシリコン表面に共有結合したアフィニティーリガンドを持つ細胞との相互作用を調べるため楕円偏光法の使用を記述している。調べた特異的系はコンカナバリンＡ−サツカロマイセス・セレビシェ−細胞、免疫グロブリンＧ−スタフィロコックス・オーレウス細胞及びＮＡＤアナログ−ラクテート・デハイドロジェネースであった。

欧州特許出願公告箱２６２１５号は液体試料中の抗原特異的抗体の量を測定するための抗原の吸着された層を持つ圧電石英結晶発振機の使用を開示している。

上述の刊行物のいくつかは極めて主要なバイオセンサー法の例であると言える。

バイオセンサーは試料中の生体分子又は粒子の存在の測定が可能なセンサーであり、分子認識のためのりセプターと変換器からなると定義することができる。バイオセンサーの群又は種類はりセプターと周囲媒質との相互作用により表面層の性質に起こる変化を例えば上述のＳＰＲ及び楕円偏光法により検出することに基づく。しかしながら今日に至るまで適当な意味におけるバイオセンサーは試料中の物質の検出又は濃度の測定にもっばら使用されてきた。

本発明は全く異なる目的のためのバイオセンサー法の使用、すなわち巨大分子と種々なリガンドとの相互作用及びそれらの互いの間の相互の影響を調べることにより露出した構造的要素に関連して巨大分子例えばタンノくり質の特性決定に関する。

本発明をより詳細に記述する前に本発明の定義に関連して使用する用語の一部について説明する。

用語「巨大分子」は含めようとする分子の実際の大きさの何等かの限定を意味するものではなく、一般に分子の構造的領域を確立することに関心があるすべての大型分子を表す。その例はタンパク質（糖タンパク質、リポタンパク質なども含む）、ポリペプチド、炭水化物、レクチン、ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであり、及びこの巨大分子は天然並びに合成的に作られたものであることができる。

「エピトープ」は巨大分子上の限定された表面に露出した構造要素を表す。ある種のエピトープ、抗原決定基はそれらの抗体分子と結合する能力により特徴付けられる。他のエピトープは他の種類の巨大分子に結合することができる。例えばある種のレクチンに結合するタンパク質のグリコジル化された部分、ある種の露出したアミノ酸残基の金属イオンとのキレートであり、他のエピトープは分子の生官能的構造を構成し例えばリセプターに結合するか、又はリセプター結合部位を構成する。この例は容易に多重化されることができる。

「リガンド」は巨大分子のエピトープと相互作用することができる化学化合物である。リガンドはそれ自身１つ又はそれより多いエピトープを示すことがあり、それにより相互作用が起こる。リガンドは巨大分子であることができるが、必要ではない。リガンドの例として天然リガンド例えば酵素に対する基質及びリセブターに対するシグナル物質、表面上のアミノ酸残基に対するキレート化構造、ポレート（糖と反応する）、アロメート（ａｒｏ■ａｔｅ）　（芳香族部分と結合する）、抗体（抗原性エピトープに対する）及びレクチン（グリコジル化工ビト −プとの反応）を挙げることができる。

「検出表面」はここでは表層の物理化学的性質の変化の検出に基づくバイオセンサー（上述の定義による）に存在することができる測定表面又は領域、又はその種類に類似のそれを表す。そのような表面は以下でより詳しく論議されるであろう。

従って本発明はリガンドとのその相互作用を調べることにより巨大分子の特性を決定する方法に関し、及びそれは巨大分子が少なくとも１つのリガンドと相互作用した後巨大分子を少なくとも１つの他のリガンドと接触させ、この場合巨大分子又は他のリガンド（１つ又は複数）は検出表面に結合しており、検出表面の物理化学的性質にその結果起こる変化を検出することにより相互作用を測定し、測定したリガンド相互作用の間の相互の依存に基づいて巨大分子のエピトープを識別し、それらの相対的な位置をマツピングすることによりリガンド相互作用の相互の影響を測定することからなることにより特徴付けられる。

バイオセンサー法の使用に基づくこの方法により巨大分子の表面構造的要素の驚くべき迅速且つ簡単な測定が達成される。更に、リガンド相互作用の「バイオセンサー」に基づく検出はりガント又は巨大分子を検出可能なマーカーで付標する必要がないことを意味し、何故なら分子自体が検出表面の物理化学的変化に寄与するからである。本発明の方法は例えばＸ線回折法と同じような構造的情報を与えないが、それは実質的により少ない物質量で又多（の場合同等精製を先行させることなく実行することができ、及び未知物質の構造的情報を蓄積する作業の中でそのような方法に対する優れた補足を形作る。

この方法はエピトープ構造の変化の確認例えば化学的変性の構造的影響の研究におけるマーカーとして使用することもできる。

巨大分子又はリガンドは検出表面に生物異的リガンドを介し又は化学的に結合し、この場合すべての種類の化学的結合例えば共有結合、イオン結合、双極子結合、水素結合及びファンデルワール力を含むものである。従って巨大分子は例えば調べる巨大分子と使用する検出表面によりいずれかの適当なカップリング基を介して表面に共有結合させることができる。巨大分子をリガンドを介して結合させる場合後者は調べるリガンドの１つであることができ、以下により詳しく説明されるであろう。カップリング基又はリガンドを介して巨大分子を表面へそのように生物異的結合させることにより、後者はハンドル又はスペーサーとして機能し、巨大分子を表面からある距離におき、それにより巨大分子を表面に固定化させるために使用されるエピトープの近傍のエピトープも露出され、追加の１つ又は複数のリガンドとの相互作用のために近づくことができる。これにより巨大分子の溶液条件がシミュレートされ、同時に巨大分子が結合した固相の利点を利用することができる。

本発明による上で定義した一般的方法の１つの具体例はａ）　リガンドを検出表面に結合させ、ｂ）巨大分子を検出表面に結合させるため巨大分子が検出表面に結合したリガンドと相互作用することを許容し、Ｃ）１つ又はそれより多い追加のリガンドを検出表面に結合させた巨大分子と連続的に接触させ、及びｄ）各々の追加のリガンドを巨大分子を持つ検出表面と接触させた後それぞれのリガンドの巨大分子との相互作用を検出表面の物理化学的性質にその結実現れる変化を検出することにより測定する段階からなる。

巨大分子の追加の機能的／構造的情報を得るため、段階Ｃ）とｄ）は変更した相対的順序で添加した種々なリガンドを用いて１回又はそれより多い回数繰り返すことができ、これについては以下により詳しく記述する。所望により結合させるリガンドは変化させることができる。変更したリガンドの順序で上の段階Ｃ）とｄ）を反復し、次いで結合させるリガンドを変更し、再び段階Ｃ）とｄ）の順序を変更することなども可能である。

本発明による方法の他の具体例はａ）巨大分子を検出表面に結合させ、ｂ）少なくとも２つのリガンドを検出表面に結合させた巨大分子に連続的に接触させ、及びＣ）各々のリガンドを巨大分子を持つ検出表面と接触させた後それぞれのリガンドの巨大分子との相互作用を検出表面の物理化学的性質にその結実現れる変化を検出することにより測定する段階からなる。

先行の具体例におけるように巨大分子の追加の機能的／構造的情報はもちろん段階ｂ）とＣ）を変更した順序で添加した種々なリガンドと共に１回又はそれより多い回数繰り返すことにより得ることができる。

本発明の方法の更に別の具体例は、ａ）　リガンドを検出表面に結合させ、ｂ）巨大分子を少なくとも１つの他のリガンドと相互作用することを許容し、Ｃ）前記少なくとも１つの他のリガンドと相互作用した巨大分子をリガンドを持つ検出表面と接触させ、及びｄ）巨大分子の検出表面に結合させたりガントとの相互作用を検出表面の物理化学的性質にその結実現れる変化を検出することにより測定する段階からなる。

最後に述べた具体例の変法においては、多数の検出表面又は領域を持つ例えば「センサーユニットとそのバイオセンサーシステムにおける使用（Ｓｅｎｓｏｒ　ｕｎｉｔ　ａｎｄｉｔｓ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ｓｙｓｔｅｍｓ）Ｊ　（スエーデン特許願第８８０４０７４−６号に基づ（）という我々の係属中のＰＣＴ出願に記述された種類の検出表面が使用され、前記特許の開示は参考例としてここに組み入れるものであり、調べる種種なりガントの各々はそれぞれの検出表面に結合させる。

そこに結合させた種々なリガンドの少なくとも１つを持つ巨大分子を得られる多官能性検出表面に順次接触させ、巨大分子とセンサー表面の全ての検出領域との相互作用を各々の巨大分子／リガンド組合せにつき測定する。測定はこの場合検出表面に適合した多チヤンネル装置、例えば「光学的バイオセンサーシステム（Ｏｐｔｉｃａｌｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ月　（スエーデン特許願８８０４０７５−３号に基づ（）という我々の係属中のＰＣＴ出願に記述された種類のそれで実行することができ、その開示は参考例としてここに組み入れる。

より多数のリガンドを調べる場合、上述の具体例のリガンド反応段階はより小さい群のリガンドを用いて連続的に便利に実行することができる。

上の記述から明らかなように本発明の方法は巨大分子の機能的領域（機能は生機能に限定されない）の研究に基づく。リガンドの特異性に基づいて巨大分子に関する定性的並びに定量的情報を得ることができる。リガンドの巨大分子との相互作用の連続的な実施により、この方法は１つのりガントの機能領域との相互作用が他の機能領域の他のリガンドとの相互作用にいかに影響するかを研究することをも伴う。影響が現れる場合相互作用に対する阻害及び増強効果の両者が問題となることがある。

バイオセンサー法により相互作用における親和力変化を調べることによりより大きな解答の得られることがある。

これらの研究に基づいて機能情報が得られ、それより巨大分子の構造要素の結論を導き出すことができる。従って本発明の方法を用いて（１）巨大分子の１つまたはそれより多い機能的／構造的要素を確認すること及び（ｉｆ）１つ又はそれより多い他の確認された構造要素に関連して後者の位置を確認することが可能である。

この方法で同時に使用するリガンドは同じ種類例えばモノクローナル抗体であるばかりでな（，２つ又はそれより多い異なる種類例えば２つの抗体、レクチンと天然りガントであることもできる。最初に述べた場合の例は一組の、好ましくはモノクローナルの抗体によるタンパク質の抗原性エピトープのマツピングであり、一方第二の場合はタンパク質の機能領域の異なる種類、例えば抗原性エピトープ、特異的なグリコジル化構造と活性部位の検出と位置の確認を例として示すことができる。機能的／構造的領域の相対的位置を得るため巨大分子に対する天然リガンド（生物異的パートナ−）もリガンドとして使用することができる。

本発明の方法を実行する最も簡単な場合は、巨大分子を２つのリガンドのみとの関連で調べる。上述の種々な具体例により１つのリガンドを検出表面に結合させようとする場合、検出表面における相互作用測定は巨大分子を最初に前記第１のリガンドを介して検出表面に結合させた後他のリガンドを添加するか、又は第２のリガンドを最初に巨大分子に結合させた後巨大分子を添加することにより実行することができる。もちろん相互作用でない情報も検出された相互作用と同様に有用である。巨大分子の検出表面への他の結合が調べるリガンドの１つとのそれの代わりに利用される場合、後者の相互作用は順次測定されるであろう。すなわち最初に述べた場合のように第２のリガンドは第１のリガンドが巨大分子に結合したとき巨大分子と相互作用することができる。２つのりガントは巨大分子と相互作用できることが既に知られている場合、巨大分子との連続的相互作用はりガント相互作用がいかに相互に影響するかについて情報を提供するであろう。これからそれぞれのエピトープの相互関係について結論を引き出すことができる。場合により問題の方法の段階をリガンド相互作用の順序を変えてくり返すことができる。１つのリガンドが最初に巨大分子を検出表面に結合させるために使用された場合、そのような逆の順序はもちろん他のリガンドが代わりに巨大分子を検出表面に結合させるために使用されることを意味する。

上述の２つのリガンドのみの関連で巨大分子を調べる具体例は本来例えばプロット法、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡで実行することができるが（しかしながら、相当に複雑且つ時間を要する方法である）、これはより多くのリガンドを使用する場合実際には不可能であろう。そのような場合本発明の方法の迅速性と単純性はなおより大きな程度に有利であると評価されるであろう。

本発明の方法において多数のリガンドを使用する例はタンパク質に対して生産される多数のモノクローナルにより独立の抗原決定部位を決定する上述の場合を挙げることができ、これは例えば問題のタンパク質のためのモノクローナルにに基づく試験の組立てに有用であることができる。そのような場合１つのモノクローナルをタンパク質を検出表面に結合させるために使用し、その後他のモノクローナルの各々の１つを最初にモノクローナルの１つにより固定化させたタンパク質に関して個別に試験することができる。この段階は２つのリガンドのみに関する上述の測定の場合の反復する実施であるということができる。次いで正に相互作用するモノクローナルは更に種々な相互組合せ例えば５つの群で分析され、これは元の結合リガンドを介して既に固定化させたタンパク質と順々に相互作用させることができる。

この方法により前に結合した抗体が後続のそれの結合部位を妨げるか否かが直接明らかになるであろう。先行する相互作用により、抗体は問題のエピトープすなわちタンパク質表面の抗原決定部位との相互作用を変化させるであろう。理想的な場合この方法はもちろん、すべての抗体が互いに交差試験されるように実施すべきである。

しかしながらリガンドの数が多い場合測定の量は比較的多大となり、適当な情報は実際には試験するりガントの組合せを適当に選択することにより得られる。リガンドの１つにより固定化されたタンパク質と負に相互作用したモノクローナルは、次いで同様な方法で但し他のモノクローナルを使用して表面に結合させて連続的に分析される。場合により、結合モスクローナルは正に相互作用するモノクローナルの分析において１回又はそれより多い回数変化させることもできる。

いくつかのモノクローナル組合せをそのような組織的な方法で実行した後、簡単な論理と結果の有効な提示によりタンパク質の抗体結合表面が確認され、相互に関連することが許容される。抗体相互作用との関連でタンパク質の特性決定のために記述された方法は、もちろん一般にそれらのエピトープ相互作用に高い特異性を示すすべての種類のリガンドと巨大分子に適用することができる。

上に示した情報から明らかなように本発明の方法の重要な態様は巨大分子の改良された機能的／構造的情報を得るためにリガンド相互作用の連続的分析を（１）検出表面に供給されるリガンドの変更された順序、並びに（ｉｔ）巨大分子上の変更された結合部位を伴い、できれば組み合わせて反復する可能性である。添加するリガンドの相対的順序を変更することは機能的及び構造的な点で相当するエピトープの相互関係のよりよい情報を得ることを可能にするが、分析の間巨大分子の検出表面への固定化のための結合部位を変更することにより多少検出表面上の巨大分子を回転させることができる。このようにして巨大分子のすべての部分はリガンド相互作用に有効に露出され、それによりエピトープの検出表面への近接がエピトープの機能に及ぼすことができる影響を除去することができる。

本発明の方法は完全に又は部分的に知られていない巨大分子に関する定性的機能的／構造的情報を得るために使用できると理解されるであろう。しかしながらこの方法の測定原理から、例えば巨大分子の１つ又はそれより多いエピトープがあらかじめ知られている場合定量的情報を得ることも可能である。

本発明の方法の考えられる重要な用途は巨大分子の一次構造の変更の影響を調べることである。これにより例えばペプチド配列の点変異又は欠失が完成され、又本発明によるエピトープマツピングをどちらのエピトープがそれらの結合特性が変化するように構造的に影響を受けているかを実証するために使用することができる。そのような巨大分子構造の変更は分子の性質を１つの方向又は他に変化させるため所謂タンパク質工学のためのみならず、部分的に知られている巨大分子の改良された構造情報を得るために実行することができる。

他の用途は巨大分子の断片を調べることによりエピトープを既知のユニットに位置付けすることである。更に考えられる用途としてはエピトープが消失し又は新しいエピトープ（ネオエピトープ）が形成される過程により巨大分子が受けるかも知れない影響の制御を挙げることができる。

本発明による構造分析は患者の血清／血漿／血液、尿、脳を髄液、唾液又は組織内の巨大分子の研究に使用することもできる。従って本発明によるリガンドのサブセットを用いて患者からの巨大分子の特性決定により種々なエピトープパターン又はエピトープ密度を重篤度又は病理的条件に関連して開示することができる。患者の抗原構造におけるそのような差異は翻訳後修飾例えばグリコジル化又はタンパク分解的分裂の結果であり、異なる抗原用細胞起源を反映することがある。この例は古典的モノクローナル抗体例えばＣＡ　５０、ＣＡ　１９−９又はＣＡ　２４２により定義される腫瘍付随抗原である。この抗原は約９０％の炭水化物と分子量が約１００キロダルトンのコアタンパク質を持つ糖タンパク質である。本発明の方法により腫瘍付随抗原が一連のリガンドにより特徴付けられ、又これらの異なるリガンドの結合がエピトープ密度と構造的関係について比較される場合よりよい臨床的相関を得ることができる。

エピトープマツピングは又、所与の抗原に対する免疫応答を分析する場合診断的興味がある。記述した方法とモノクローナル抗体のサブセット又は抗原上の限定されたエピトープに対する他のリガンドにより、患者における免疫応答は患者のポリクローナル抗血清を抗原に結合させた後、リガンドによりエピトープを特性決定することにより分析することができる。患者の免疫応答の定量後限定されたエピトープに対するリガンドの連続注入を伴う方法により患者のためのエピトープレフ＜−トリーが容易に特徴付けられ、この情報は病理的条件と相関を持つことがあり、及び予知的価値を持つ、この方法によるエピトープ特性決定が診断的又は予知的価値を持つ他の場合は予防接種に関連する患者におけるエピトープ免疫応答の分析である。自己抗原並びに外来抗原のためのエピトープレパートリ− は臨床的興味がある。

前に述べたように本発明の方法は少な（ともある程度まで不純な巨大分子標品に適用することもできる。以下に不純な抗原で免疫する場合に得られるモノクローナル抗体により不純な抗原に関する構造情報を得るための本発明の方法の使用を記述する。

簡単のため、不純抗原はタンパク質Ａ、Ｂ及びＣの混合物であり、その種々なエピトープに対するモノクローナル抗体は免疫化で得られると仮定する。本発明により抗体の１つを検出表面に結合させ、次いでタンノ（り質混合物を検出表面に生物異的に固定化させるために添加する。タンパク１ｔＡは検出表面に結合した抗体により指向される。次いで得られる検出表面をＡに結合するそれに関連して他の抗体を調査するために使用する。結合しない抗体は検出表面に結合させた抗体のようにＡ上の同一エビトープを指向するか又はタンパク質Ｂ若しくはＣを指向することができる。

Ａに結合する抗体を見出した場合、タンパク質Ａを代わりにこの他の抗体を介して検出表面に固定化させ、前に得られたタンパク質Ａに対して負の抗体のすべてを抗体固定化タンパク質Ａに対して選別し、タンパク質入上の同一エビトープに結合する抗体を前記第一の抗体として見出す。見出された非結合抗体はタンパク質Ｂ又はＣを指向するに違いなく、上述の方法を同様に繰り返してこれらのタンパク質を確認する。種々なタンパク質に対するすべての抗体が一旦確認されると、各タンパク質につき前に述べた様に本発明によるエピトープマツピングを行うことができる。どちらの成分が生物学的効果に応答し得るかは抗体による阻害により容易に確認することができる。

本発明の方法に使用するセンサー表面はその物理的又は化学的性質が問題のリガンド相互作用により測定可能な様式で変化するような表面であることができる。

例えばそれらは光学的性質例えば光の放射量又はその波長における変化、屈折率などを測定することができる表層又は表面近くに位置する層を持つことができる。屈折率における変化は例えば前に述べたＳＰＲ又は楕円偏光法により測定することができる。検出表面はリガンド相互作用がその光音響的性質に測定可能な変化として現れるようなそれであることができる。他の例ではバイオセンサー表面は圧電結晶又は電場効果トランジスターの一部である。

本発明の方法に使用するセンサー表面が含まれる全センサーシステムはもちろん調べるセンサー表面と表面パラメーターの種類による。ＳＰＲ法に基づ（適当なセンサーシステムは「光学的バイオセンサーシステム」という我々の前述の係属中のＰＣＴ出願に記述されている。そのより詳しい設計は以下の実施例に示されるであろう。

場合により本発明の方法により得られる情報は問題の巨大分子の表面特性の解釈を単純化するためコンピューター処理することができ、その結果をグラフ形態で便利に提供することができる。

本発明は次の実施例で更に詳しく例証する。これに関連して付随する図面を参考として示すが、その中で第１ａ図と第１ｂ図は本発明の方法の１つの具体例の異なる段階を実行する場合に得られる表面変化応答を示すグラフであり、第２ａ図と第２ｂ図は本発明の方法の他の具体例により得られる表面変化応答を示す第１ａ図及び第１ｂ図と同様なグラフであり、及び第３図は本発明の方法により得られる情報の模式的グラフ図の例である。

実施例この実施例においては本発明の方法によるＨＩＶタンパク質Ｐ２４のエピトープマツピングを記述する。このタンパク質はそれ自身又はそれに対する抗体の存在がＢＩＶ感染の初期の兆候であると考えられることより現在極めて大きな関心を持たれている。試験システムの組立てのためもちろんタンパク質のい（つかの独立した結合部位を知ることが重要である。

エピトープマツピングのため「光学的バイオセンサーシステムｊという我々の前述のＰＣＴ出願に記述された光学的バイオセンサーシステムを使用する。このバイオセンサーシステムは、その１つの具体例においては本来公知のＳＰＲ法に基づいており、交換可能なセンサーユニット：センサーユニットの検出表面に試薬と試料溶液を輸送する導管又はチャンネルシステムを持つ液体取扱い用ブロックユニット；増感させた表面への入射光線と結合し、反射した放射線を検出する光学ユニット：及び検量後検出器シグナルを検出表面における物質の量に比例するパラメーターに変換する評価ユニットとを持つ。測定を実行する場合、定められた試料液量を定められたチャンネル部分に注入して導入し、次いでこの液量を溶離液体により光学的分析のため検出表面を強制的に通過させる。

ここで使用した装置は０．５Ｘ０．Ｏ５Ｘ４ｍｍの測定用チャンネルを持つていた。ポンプはＰｈａｔｖａｃｉａ　ＡＨ，Ｓｗｅｄｅｎから商品番号Ｐ５００として発売されているポンプの変更機種を用いた。５０ｘｌの外部ループを持つ自動注入装置Ｇｉｌｓｏｎｍｏｄｅｌ　２３１を装置に取り付けた。

センサーユニットは薄い金膜で被覆したガラス板からなり、前記金膜には「バイオセンサーシステムに使用する選択的生体分子相互作用可能な検出表面（Ｓｅｎｓｉｎｇｓｕｒｆａｃｅｓ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　１ｎｔｅｒ−ａｃｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　５ｙｓｔｅｓｓ）　Ｊ　（スエーデン特許願第８８０４０７３−８号に基づく）という我々の係属中のＰＣＴ出願に記述されているようにデキストランヒドロゲルの層が結合されており、前記開示は参考例としてここに組み入れるものであり、又これは「センサーユニットとそのバイオセンサーシステムにおける使用」という我々の係属中のＰＣＴ出願に記述されているように変更されており、以下に明確に述べる。

検出器デバイスは幅８０μで２０μの間隔で置かれるフォトダイオードの形態の一組の検出器要素からなる。下で測定表面における質量吸着（応答）に使用するユニット「ダイオード（１つ又は複数）」とこの特定のフォトダイオード配置に関連しており、検出表面の屈折率変化により引き起こされる角度における共鳴変化に包含される連続的フォトダイオードの数を示す。

測定用として組換えＤＮＡ法により得られるタンパク質Ｐ２４並びにこのタンパク質に対して反応性を持つ抗Ｐ２４モノクローナルを含む５４の培養培地を使用した。

実際のエピトープ測定に先立ち、これらの５４の培養培地のサブクラス及び濃度測定を以下に記述するように実施した。

溶離剤として１０ｓｌｌ　Ｈｅｐｅｓｌｏ、１５　ＮａＣ４，３，４ａｌｌ　ＥＤＴ＾、０．１％ＦＴ　２２９、ｐｌ＝　７．４を使用した。試薬と試料は２０１１の量ヲ注入シ、再生ハ０．１Ｍり！Ｊ　シン−ＨＣＩ、　ｐＨ＝２．５．０．１％ＦＴ　２２９Ｃ２０１１＞で実行した。

Ａ、　サブクラスの測定この測定のためデキストランで処理した検出表面をカルボキシメチル化により修飾し、次いで反応性エステル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びＮ−（３− ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）と共にインキュベートすることにより導入した。

このように誘導体化した検出表面に免疫吸着精製した標品からウサギ抗マウス軽鎖を結合させた。

次の抗マウスＩｇＧサブクラス試薬を使用した。

ラットモノクローナル抗Ｇｌ、ラットモノクローナル抗Ｇ　２　ａ　ｓラットモノクローナル抗Ｇ２ｂ及びラットモノクローナル抗Ｇ３は菖■＾Ｂ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎから入手した。この試薬を１０ｍ１ｌ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐ１１＝７．４）に１００ＩＩＩＦ／ＩＩ７に希釈した。

抗サブクラス試薬は抗Ｇ３、抗Ｇ２ａ、抗Ｇ２ｂ及び抗Ｇｌの順に連続的に実施し、５４の培養培地を連続的に分析した。

流速は２０ｔｒｌ／ｍｌ、注入の間の時間は２分間であった。

培養培地は抗Ｇ１に対する応答が少な（とも０．１ダイオードに達した場合６１と定義した。Ｎｏ、ｇ、５１．２７．３５．３８．３９．４０．４１４３及び４６を除（すべての培養培地は０．１を越える応答値を示した。抗Ｇ３、抗Ｇ２ａ、及び抗Ｇ２ｂに対する応答はいずれの培養培地も０．０２ダイオードを越えなかった。精製したＩｇｌ　（１１０Ｏｘ／　ｍｌ）の注入によりすべての抗サブクラス試薬について０．０３より少ない応答を示す結果となった。

Ｂ、　濃度測定すべての培養培地は培養培地（５％ＦＣ３）中でそれぞれ２．５．１０．２０．３０．４０．５０．６０．８０及び１００μｇ／窮ｌの濃度に希釈したＧ１モノクローナル（抗ベーター２−ミクログロブリン）の混合物で得られる応答値に基づいて確立した０１基準標準曲線と相関を持っていた。

標準点は繰返し２で実施し、各点の平均値に基づく標準曲線を２〜３０１ｑ／ｍｌの間で確立した。上のサブクラス測定におけると同じ検出表面を使用した。流速は２０ｓｌ１分であり、注入の間の時間は３分であった。培養培地の測定は単一試料につき実行した。培養培地８．２７．３５．３８．４０及び４１は極めて低い濃度を示した。

Ｃ９エピトープ調査上で実行したサブクラス及び濃度測定に基づいて次の培養培地、８．１６．２７．３５．３８．３９及び４０はエピトープ調査から除いた。他の培養培地は下で記述する相互エピトープ反応性の点で特性決定した。これらの測定のためデキストランで処理した検出表面を次のように修飾した。

Ｃ１，ヒドラジド機能の導入３．５ｇのブロモ酢酸を２７９の２Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解した。混合物をデキストラン処理しカルボキシメチル化したセンサー表面に注ぎ、振盪インキュベーターし、次いで上述の方法を一度繰り返した。洗浄後表面を２０謂ｌの水中０．８９のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）で５分間処理し、次いで２０翼ｌの水中４．　Ｏｗｌのヒドラジン塩酸を添加した。

表面を２５℃の振盪インキュベーター中で１６時間インキュベートし、次いで水で洗浄した。

Ｃ２，誘導体化した測定表面へのウサギ抗マウス−Ｆｃγの結合１０■蓋酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）中免疫吸着精製したウサギ抗マウス−Ｆｃγ を上で得られたヒドラジド表面に２０分間結合させ、次いで未結合抗体を表面をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ１，４）及び０．１Ｍグリシン（ｐＨ２，５）中で洗浄することにより除いた。得られた結合は約２．５ダイオードの測定装置中応答に相当した。

流速は２ｈＡ’／分であり、注入の間は３分を実験に使用した。

Ｇ３．　エピトープマツピング第一段階として培養培地Ｎｏ、　１２　（１：　４に希釈）を検出表面上に相当するモノクローナルを固定化させるため注入した。次に検出表面上の残りの結合部位をすべて封鎖するためこの状況に不適当なＧ１モノクローナルすなわち抗ベーター２−ミクログロブリン（４０ｇｇ／ｍｌ）を注入し、次いでＨＩＶタンパク質Ｐ２４　（１０ｐｇ／舅りを注入した。

このタンパク質をモノクローナル１２を介して表面に生物異的に結合させ、システムの他のモノクローナルとの相互作用の分析をする準備が整った。最初の分析系列で各モノクローナルの結合を個別に各測定の間にシステムの再生をしながら調べた。

結果として培養培地は下記のように２群に分布した。

ａ）培地Ｎｏ、１２から独立してＰ２４と反応する培養培地：１．１７．１９．２０．２１．２２．２３．２４．２５．２６．２８．２９．３０．３１．３２．３３．３４．３６．３７．４１．４３．４４．４５．４７．４８．４９．５０．５１．５２．５３及び５４ｂ）培地Ｎｏ、１２が結合した場合Ｐ２４と反応しない培養培地；２．３．４．５．６．７．９．１Ｏ１１１，１２，１３，１４，１５，１８及び４２上のケースａ）は添付の第１ａ図及びケースｂ）は第１ｂ図に示すが、この場合Ｙ軸は相対的応答及びＸ軸は時間（秒）を示す。両図において数字１は培養培地Ｎｏ、　１２の注入を示しく技術的理由から注入は各サイクルの最後に行った。

次いで再生は行わず、従ってモノクローナルＮｏ、２注入を実行した時既に表面に結合されていた）；２は抗ベーター２−ミクログロブリンの注入を示し、３はＰ２４の注入を示し、４は培地Ｎｏ、　１２から独立してＰ２４に結合するか（第１ａ図）、又は培地Ｎｏ、１２と競合する（第１ｂ図）１２４反応性培養培地の注入を示し、及び５は再生を示す。この測定において正の応答は０．１３ダイオ−・ドより大きいダイオードの読みと定義し、負のシグナル０．０２ダイオードを越えてはならない。

次いで更に正の培地を種々な相互組合せ、連続的に注入するい（つかの培地につき分析した。種々な組合せと得られたその結果を下の第１表に示す。表には０．１３ダイオードを越える応答を「＋」で、０．０２ダイオードより少ない応答を「−」で示す。ある場合応答は２つの限界の間を示す（半生）。

１）１　＋　２）ｌ　＋　３）２２　＋１７　＋　１　−　２３　＋１９　＋　２１　−　２４　− ４）２３　＋　５）２５　＋　６）２３　＋２４　＋　２６　＋　２６　− ２５−　２３−　２５　＋７）２８　＋　８）２９　＋　９）３３　＋２９　＋３０　−　３４　＋３０　−　３１　−　３６　７京３２　−　２８　＋　４１　− 第１表（続き）１０）３６　＋　１１）３７　＋　１２）４１　＋３３　＋　４１　＋　３６　 − ３４　＋　３６　−　３３　＋１３）４３　＋　１４）４４　＋　１５）４９　＋４４　＋　４５　−　５０　＋４５　−　４８　＋　５１　＋４７　＋　４７　−　５２　− １６）５１　＋　１７）５３　＋　１８）５４　＋５２　＋　５１　＋　５３　＋１９）１　＋　２０）２２　＋　２１）２９　＋２２　＋　４３　＋　２２　− ２８　＋　１７　＋　４３　− ３３　＋　２９　− ４３　＋　３４　＋第１表（続き）２２）１７　＋　２３）２２　＋　２４）１９　＋２９　＋　４３　＋　３６　 − ４９　＋　４９　＋２５）２２　＋　２６）４３　＋　２７）２９　＋１９　半＋　１９　半＋　１９− ２８）４９　＋　２９）２０　＋　３０）２３　＋４３　＋　４３　＋　４３　＋３４　＋　３４　＋　３４　＋１７　＋　１７　＋　１７　＋２２　＋　２２　＋　２２　＋３１）４４　＋　３２）４７　＋　３３）２０　＋４３　＋　４３　＋　２３　＋３４　＋　３４　＋　４４　＋１７　＋　１７　−　５０　− ２２　−　２２　＋３４）５０　＋　３５）１　＋　３６）２８　＋２３　＋　４３　＋　４３　＋４４　−　３４　＋　３４　＋２０　＋　１７　＋　１７　＋２２　＋　２２　＋第１表（続き）３７）３３　＋　３８）５１　＋　３９）４９　＋４３　＋　４３　＋　１　− ３４　＋３４　＋　２８　＋４０）１　＋　４１）２０　＋　４２）２３　十４９　−　４９　−　１　＋３３　＋　２８　＋　３３　＋４３）２０　＋　４４）５１　＋第２ａ図及び第２ｂ図はそれぞれ、そのような実験における検出器応答を示し、ここでは５つのモノクローナルを連続的に注入し、それらのすべては先行するモノクローナルを結合させた事実と無関係に結合させた。第２ｂ図においては第１と第２モノクローナルは結合（＋）しており、−万能の３つのモノクローナルの他の結合部位は封鎖（−）されている。

負の培地は正の培地と類似の方法で、但し第一段階において培地Ｎｏ、　ｆ２の代わりに固定化させた培地Ｎｏ、　３０を用いて分析した。当初の実験において正の応答で反応した個別培地、培地Ｎｏ、　１２と培地Ｎｏ、　４２は設定限度を外れる応答で反応することが確認された。これらの２つの培地は第一段階で固定化させた培地Ｎｏ、　３４を用いる系列で分析して同じ結果が得られた。次いで培地を組み合わせて分析し、下の第２表に示す結果が得られた。上の第１表と同じ判断基準を適用する。

第２表クローン３０に対して試験したｒ１２−Ｊクローン培地Ｎｏ　応答　培地Ｎｏ　応答　培地Ｎｏ　応答１）１４　＋　２）２　＋　３）１５　＋４）１８　＋　５）４２　半＋　６）１８＋クローン３４に対して試験したｒ１２−Ｊクローン培地Ｎｏ　応答　培地Ｎｏ　応答７）４２　半＋　８）３＋すべての結果をまとめると、実行した特性決定は第３図のように図形的に示すことができる。図の培地番号に下線が付しである場合、その培地がすべての他の下線を付した培地に対して試験されたことを示す。第３図に見られるように独立した結合部位を含む６つの主要な領域が確認された。特性決定はすべての個々の培地がすべての他の培地に対して試験されていないことから不完全であることに注意しなければならない。これはある培地においては極めて近接しているが同一でないエピトープに対してその反応性を持つ結果となることがある。

上述のエピトープ調査は驚くほど多数のエピトープがＰ２４分子上にあり、同時に少なくとも６つの抗体のための部屋があるこらとを明らかにしている。この調査の結果は例えば診断試験用の適当なモノクローナル組合せの開発に使用することができる。

本発明はもちろん上述の特定の具体例に限定されるものではな（、多（の修正と変更が添付の請求の範囲に定義した一般的な発明の思想の範囲の中にある。

ＦＩＣ；−１ａＦＩ（，１ｂ３００　６００　９００　１２００　、、　（８１゜ＦＩＧ＋　２ａ相対的応答ＦＩ（，２ｂＦＩＣ，３国際調査報告Ｉｓ會−圓−１ｉ１１１１１１内−１−＾−―ト一一に一１１１内−―・ＰＣＴ／Ｓε８９１００６４４Ｔ１ｍ　ａｅ＋ｗｔ　ｍ　＋１ｗ　ｐ呻簀Ｉ−晰一−ｍｍ＋ｅｌ　１６１１ｗ　ｐｍｍ　ｍ（ｍ＋４１１Ｉ　＋１ｗ　ｍＭ？−Ｗｍ　ｉｍｅ香|ｍ　０ｍ　＋＋

Claims

【特許請求の範囲】

１．リガンドとの相互作用を調べることによる巨大分子の特性決定の方法であって、前記方法は巨大分子を少なくとも１つのリガンドと相互作用させた後、巨大分子を少なくとも１つの追加のリガンドと接触させ、巨大分子又は追加のリガンド（１つ又は複数）はセンサー表面に結合しており、センサー表面の物理化学的性質に結果として起こる変化を検出することにより相互作用を測定し、及び測定したリガンド相互作用の間の相互依存に基づいて巨大分子のエピトープを識別し及びそれらの相対的位置をマッピングすることによりリガンド相互作用の相互の影響を測定することを特徴とする巨大分子の特性決定の方法。
２．ａ）巨大分子をセンサー表面に結合させ、ｂ）少なくとも２つのリガンドをセンサー表面に結合させた巨大分子に連続的に接触させ、及びｃ）各リガンドを巨大分子を持つセンサー表面と接触させた後それぞれのリガンドの巨大分子との相互作用をセンサー表面の物理化学的性質に結果として起こる変化を検出することにより測定する段階からなることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
３．ａ）リガンドをセンサー表面に結合させ、ｂ）巨大分子をセンサー表面に結合させる巨大分子がセンサー表面に結合させたリガンドと相互作用することを許容し、ｃ）１つ又はそれより多い追加のリガンドをセンサー表面に結合させた巨大分子と連続的に接触させ、及びｄ）各々の追加のリガンドを巨大分子を持つセンサー表面と接触させた後、それぞれのリガンドの巨大分子との相互作用をセンサー表面の物理化学的性質に結果として起こる変化を検出することにより測定する段階からなることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
４．ａ）リガンドをセンサー表面に結合させ、ｂ）巨大分子が少なくとも１つの他のリガンドと相互作用することを許容し、ｃ）前記少なくとも１つの他のリガンドと相互作用させた巨大分子をリガンドを持つセンサー表面と接触させ、及びｄ）巨大分子のセンサー表面に結合させたリガンドとの相互作用をセンサー表面の物理化学的性質に結果として起こる変化を検出することにより測定する段階からなることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
５．変更した順序で少なくとも２つのリガンドの複数のリガンドとの相互作用を繰り返すことからなることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一項記載の方法。
６．段階ｂ）と段階ｃ）を変更した順序で複数のリガンドと１回又はそれより多い回数繰り返すことを特徴とする請求の範囲第２項及び第５項のいずれか一項記載の方法。
７．段階ｃ）と段階ｄ）、及び場合によりａ）を変更した順序で複数のリガンドと１回又はそれより多い回数繰り返すことを特徴とする請求の範囲第３項及び第５項のいずれか一項に記載の方法。
８．段階ａ）〜段階ｄ）を変更した順序で複数のリガンドと１回又はそれより多い回数繰り返すことを特徴とする請求の範囲第４項及び第５項のいずれか一項記載の方法。
９．方法をリガンドのより小さい群で繰り返して実行することを特徴とする多数のリガンドを使用する請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項記載の方法。
１０．多数のリガンドの各々の１つをセンサー表面のそれぞれのサブ領域に結合させ、及びそれに結合した少なくとも１つのリガンドを持つ巨大分子を得られる多機能性センサー表面に結合させ、巨大分子の前記センサー表面のサブ領域のすべてとの相互作用を各巨大分子／リガンド組合せにつき測定することを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
１１．センサー表面の物理化学的性質の変化はセンサー表面の屈折率の変化であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか一項記載の方法。
１２．巨大分子ハタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか一項記載の方法。
１３．リガンドは抗体からなることを特徴とする請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか一項記載の方法。
１４．リガンドの数は少なくとも３つであることを特徴とする請求の範囲第１項〜第１３項のいずれか一項記載の方法。
１５．巨大分子の構造修飾のそれへのリガンド結合性質に与える影響を調べるための請求の範囲第１項〜第１４項のいずれか一項記載の方法の使用。
１６．診断的又は予知的臨床目的のための請求の範囲第１項〜第１４項のいずれか一項記載の方法の使用。
１７．巨大分子上の異なる可能性のあるエピトープを限定するリガンドのサブセットを用いて巨大分子又はその複合体、病理学的条件の指標である巨大分子上の１つ又はそれより多い数の前記エピトープのそれぞれ存在又は不存在を特性決定することからなることを特徴とする請求の範囲第１６項記載の使用。
１８．患者の試料で限定されたエピトープを持つ巨大分子を最初に接触させ、次いで巨大分子を前記エピトープに結合させてリガンドのサブセットに接触させることにより試料中に存在する巨大分子による１つ又はそれより多い数のエピトープの可能な封鎖を測定することによる免疫応答を文するための請求の範囲第１６項記載の使用。