JPS5944583B2 - 蛋白質の検出法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質や抗体の検出に関するものである。

更に詳しく言えば本発明は、抗原抗体反応を基体の表面
で行なわせることによる蛋白質や抗体５ の検出に関す
る。なお、本特許出願は１９７２年６月２６田こ受理さ
れかつ本発明と同じ受託者に委託されたギアエヴア（Ｇ
ｉａｅｖｅｒ）の米国特許出願第２６６２７８号に関連
している。

１０ところで、免疫反応は極めて特異的な生化学的反応
である。

それによれば、抗原と呼ばれる第１の蛋白質がそれに対
して特異的な抗体と呼ばれる第２の蛋白質と結合して免
疫学的に複合した蛋白質を生成する。動物のごとき生体
系の内部におい１５て起る免疫反応は、病気との闘争と
いう点でその動物にとつて重要である。異種蛋白質すな
わち抗原が侵入した場合、現在ではまだ十分に解明され
ていない過程により、生体系はその抗原に対して特異的
な抗体蛋白質を産生する。かかる抗体蛋白２０質の分子
は抗原分子の対応箇所と補足し合う化学結合部位を有し
ているため、抗原と抗体とは化学的に結合して免疫学的
に複合した蛋白質を生成する。このように抗体は異種蛋
白質の侵入に応答して２５生体系が産生するものである
から、生体系内に存在する抗体の検出はその生体系がい
かなる抗原に暴露されたかを判定するという点で医学診
断上の価値を有する。

逆に、生体系内における特定の抗原の検出もまた医学診
断上の価値を有する。その３０実例としては、妊娠試験
として尿中のＨＣＧ蛋白質分子を検出すること、並ひに
予定された供血者の血液中の肝炎関連抗原分子を検出す
ることが挙げられる。かかる診断試験を実施するために
は、免疫学的３５に反応する１対の蛋白質の少なくとも
一方を濃縮精製状態で入手しなければならない。

ところで、抗体蛋白質の唯一公知の源泉は生体系である
。更、＾＾に詳しく言えば、異種蛋白質の導入に対して
免疫反応を示すことが現在までに知られているのはを椎
動物だけである。

たとえば、多数の抗原に暴露された動物の血清中には対
応する多数の抗体が見出される。しかし、血清は極めて
複雑な混合物であり、しかも所要の抗体は多数の他種成
分中に極めて低い濃度で存在するに過ぎない。他方、多
数の抗原は実験室的な培養物中において制御可能に産生
させることができる。とは言え、現在のところ、ある種
の抗原（たとえば肝炎関連抗原）は抗体と同じく高等動
物の生体系からしか入手することができない。現状では
、免疫学的に活性な蛋白質の濃縮精製および診断学的利
用のいずれもが免疫学的複合反応に基づく蛋白質の沈降
または凝集特性に依存している。

このような診断学的利用の古典的な実例は血液型の判定
である。その場合には、血液試料がα型およびβ型血清
抗体と混合され、それから血液試料中における凝集の有
無を観察することによつて血液型が判定される。現在実
施されているようなＨＣＧ蛋白質による妊娠試験は阻害
試験である。

かかる試験の実施に当つては、尿検体中に一定量のＨＣ
Ｇ抗血清が混合される。こうして前処理を受けた尿検体
中にＨＣＧ蛋白質で被覆された多数のポリスチレン球が
導入される。かかるポリスチレン球は、尿検体中にＨＣ
Ｇ蛋白質が存在しない場合、しかもその場合に限つて凝
集するはずである。すなわち、尿検体中にＨＣＧ蛋白質
が存在しない場合、ポリスチレン球上のＨＣＧ蛋白質は
尿検体中に予め導入されたＨＣＧ抗血清と複合し、その
ためポリスチレン球は凝集する。他方、尿検体中にＨＣ
Ｇ蛋白質が存在すれば、それは予め導入されたＨＣＧ抗
血清と複合し、こうして生成された複合体は尿検体から
沈殿してしまう。その結果、予め導入されたＨＣＧ抗血
清がポリスチレン球上のＨＣＧ蛋白質と複合することは
もはや起り得ないため、ポリスチレン球は凝集しないわ
けである。この着想に従えば、上記のＨＣＧ蛋白質によ
る妊娠試験は簡略化することも可能なはずである。すな
わち、ポリスチレンン球上にＨＣＧ抗血清を付着させ、
次いでそれを用いて尿検体を直接に試険することもでき
よう。そうすれば、尿検体中にＨＣＧ蛋白質が存在する
場合、しかもその場合に限つてポリスチレン球が凝集す
ることになろう。しかるに、かかる簡略な方法はこれま
で使用されなかつた。

その理由は、入手し得るＨＣＧ抗血清がＨＣＧ抗体以外
の成分を多量に含有する複雑な混合物である点にあつた
と思われる。その上、ＨＣＧ抗血清から抗体を抽出する
には余計な手間がかかるという事実もまた、ＨＣＧ抗血
清を直接に使用する阻害試験の方が従来好ましいとされ
てきた理由の１つである。ところが、本発明の一実施例
に従えば、ＨＣＧ抗体を血清から効率的に分離する方法
が提供される。その上、かかる方法は一層簡略な直接試
験の実施を可能にする診断装置をも生み出すのである。
典型的には、各抗原分子は複数の抗体分子と複合する。
それらの抗体分子は相異なる粒子に付随していることも
あり得るため、たとえば被覆ポリスチレン球や赤血球の
肉眼で見える凝集塊が生成される。しかし凝集試験は、
問題の粒子が免疫反応とは無関係な様々の理由によつて
凝集する傾向を示し、そのため試験の信頼性が低下する
という欠点を有している。それ故、典型的には熟練した
技術者が細心の注意を払いながら凝集試験を実施するが
、それでもなお診断上の過誤が起ることは避けられない
。抗体の精製濃縮物を調製するための現行の方法に従え
ば、動物の生体系内に抗原を導入することによつて抗体
の産生が励起され、高度に希釈された状態の抗体を含有
する血清がその動物から採取され、それから一定量の抗
原が血清中に混合される。

かかる抗原と抗体との混合物は複合し、そして血清から
沈殿する。血清の残留成分を吸引除去した後、抗原一抗
体沈殿物は酸に溶解され、それによつて複合結合が切断
される。この結果、酸中における抗原および抗体分子の
溶液が得られたことになる。抗原および抗体分子は相異
なる物理的特性（たとえば重量）を有するから、たとえ
ば遠心分離のごとき機械的手段によつて両者を分離する
ことが可能である。ところで、抗原抗体複合反応は抗原
が表面に吸着されている場合にも起ることが知られてい
る。

このような表面における複合反応は楕円偏光計によつて
観測されてきた。楕円偏光計は複雑な光学計器であつて
、それを用いれば０．１Ｘ程度の膜厚を測定することが
可能となる。しかし、楕円偏光計は高価である上に熟練
した操作者を必要とする。楕円偏光計を用いた従来の免
疫反応の研究に際しては、２つの方法が使用されてきた
。１つの方法によれば、研究すべき免疫反応をスライド
上で行なわせた後、そのスライドが楕円偏光計に取付け
られて膜厚が実測される。

もう１つの方法によれば、楕円偏光計に取付けられたス
ライド上で免疫反応が行なわされ、そして膜厚の変化が
観測される。その際、絶対膜厚の測定には極度の注意を
払う必要がある。他方、膜厚の相対変化の測定は絶対膜
厚の測定よりも容易であるが、溶液中の抗体濃度が低い
場合には長い時間がかかる。それ故、経済的理由から、
表面における免疫反応の楕円偏光計による検出は診断目
的用としては採用されなかつた。さて本発明は、任意の
蛋白質がもつぱら一分子層を成して基体上に吸着する一
方、かかる蛋白質に対する特異的な抗体（または抗原）
がそれに結合すると基体上に二分子層が形成されるとい
う発見に基づいている。

そこで本発明の目的は、かかる発見の応用により、医学
診断上および薬学土の用途にとつて有用な方法を提供す
ることにある。従つて本発明の第１の主たる目的は、表
面において起る免疫反応を経済的に検出するための方法
を提供することにある。更にまた、かかる免疫反応を視
覚的な直接観察によつて検出するような上記の方法を提
供することも本発明の目的の１つである。

本発明の実施例に従つて簡潔に言えば、先ず基体材料製
の薄板が第１の蛋白質の溶液中に浸漬される結果、第１
の蛋白質の一分子層が基体に付着する。

こうして第１の蛋白質で被覆された基体が、次いで、第
２の溶液中に浸漬される。かかる第２の溶液は、第１の
蛋白質と特異的に反応する蛋白質を含有するかどうか疑
われているものである。かかる特異的に反応する蛋白質
、しかもそれのみが、基体上の第１の蛋白質の一分子層
に重なり合つた第２の一分子層を形成する。次に、特異
的に反応する蛋白質を含有するかどうか疑われている溶
液中に浸漬された後の基体が光学的に検査され、それに
よつて基体に付着している蛋白質層が二分子層および一
分子層のいずれであるかが判定される。その結果、第２
の溶液が第１の蛋白質と特異的に反応する蛋白質を含有
するかどうかが決定されることになる。フ 特許の対象とすべき本発明の新規な特徴は前記特許請求
の範囲に明確に示されている。

なお本発明は、その目的および利点と共に、添付の図面
に関連してなされる以下の記載を読めば理解され得るは
ずである。先ず、第１図は本発明の実施に関連した諸工
程を図解する工程系統図である。

かかる工程系統図を上から下へ読んで行く際、垂直方向
の各レベルは時間的に継続した作業工程の１つを表わす
。本発明の最初の実施例に従えば、作業は第１図中のプ
ロツク１３から開始する。先ず、金属、ガラス、雲母、
プラスチツク、溶融シリカ、石英などのごとき基体材料
製の薄板が用意される。かかる基体は、蛋白質に対する
屈折率の差が最大である点で金属から成ることが好まし
く、とりわけ金属で被覆されたスライドガラスから成る
ことが好ましい。次いで、問題となる第１の蛋白質を含
有する溶液中に上記の基体が浸漬される。かかる第１の
蛋白質は生物学的に見れば抗原または抗体であつて、相
当に濃縮された溶液として入手可能である上、それと特
異的に反応する蛋白質（生物学的に見ればそれぞれ抗体
または抗原）を検出または精製するために使用すべきも
のである。かかる第１の蛋白質は一分子層を成して基体
上に吸着する。なお、いかなる蛋白質も一分子層を成し
て吸着するが、それ以上の吸着は決して起らない。換言
すれば、蛋白質は基体に付着するけれど、それ自体には
付着しないのである。基体の表面全域に蛋白質の一分子
層が形成された後、被覆基体が第１の蛋白質の溶液から
取り出される。なお、基体を完全に被覆するのに要する
時間は溶液中の蛋白質の濃度および溶液の攪拌の程度に
依存する。たとえば、１％のウシ血清アルブミン溶液を
使用した場合、蛋白質の一分子層でスライドガラスを完
全に被覆するには約３０分を要する。第１図中のプロツ
ク１４に示された次の工程は、第１の蛋白質と特異的に
反応する蛋白質を含有するかどうか疑われる溶液中に上
記の被覆基体を浸漬することである。この溶液は検出す
べき特異的に反応する蛋白質以外に多数の成分を含有す
る場合があるばかりか、そのような場合の方がむしろ典
型的と言える。しかしながら、特異的に反応する蛋白質
以外の蛋白質は基体上の第１の蛋白質層に決して付着し
ない。従つて、特異的に反応する蛋白質が問題の溶液中
に存在しなければ、浸漬後の基体はやはり蛋白質の一分
子層しか有しない。他方、特異的に反応する蛋白質が問
題の溶液中に存在すれば、第１の蛋白質およびそれと特
異的に反応する蛋白質の間で免疫学的複合が起り、従つ
て一定時間後の基体は蛋白質の二分子層を有することに
なる。被覆基体上に第２の蛋白質層が完全に付着するの
に要する時間は、やはり溶液中の特異的に反応する蛋白
質の濃度に依存する。血清中の抗体の場合、この時間は
１日にわたることもある。第１図中に示された本発明の
実施例は、第１図中のプロツク１２，１３，１４および
１８に示された諸工程から成るものである。

この実施例の場合、ガラス、プラスチツク、溶融シリカ
、雲母、石英などのごとき光透過性の基体材料を使用し
なければならない。とりわけガラスが好適であるが、簡
便に入手し得る基体は顕微鏡用のスライドガラスである
。先ず、第１図中のプロツク１２に示されるごとく金属
（たとえばインジウム）を蒸着することにより、基体が
多数の金属球体で被覆される０たとえば、水銀柱約５×
１０−５ｍｍの常用真空中において、インジウムがタン
タル製ボートからガラス基体上にゆつくりと蒸着される
。インジウム原子は基体の表面上における移動特性が大
きく、従つてガラス基体を顕著に濡らすことがないため
、基体上に蒸着されたインジウムは集合して小さな粒子
となる。基体上に蒸着された場合に球体を形成するよう
な類似の特性を有するものであれば、任意の金属が使用
できる。実際、インジウム以外にも、金、銀、スズおよ
び鉛が有用であつた。かかる金属の蒸着は基体の色が淡
褐色になるまで継続される。この時点において、金属球
体は１０００Ｘ程度の直径を有している。球体の正確な
寸法は重要でないが、その直径は可視光の主要部分の波
長と等しくなければならない。次の工程は、第１図中の
プロツク１３に示されるごとく、球体で被覆された基体
を第１の蛋白質の溶液中に浸漬することである。第１の
蛋白質はやはり一分子層を成して基体および金属球体上
に付着する。蛋白質の一分子層が形成されれば、かかる
被覆基体は第１の蛋白質と特異的に反応する蛋白質の存
在が疑われる溶液を試験するために使用できる。すなわ
ち、第１図中のプロツク１４に示されるごとく被覆基体
が問題の溶液中に浸漬される。その結果、特異ノ的に反
応する蛋白質が存在すれば、基体および金属球体には蛋
白質の二分子層が付着することになる。

他方、特異的に反応する蛋白質が存在しなければ、基体
および金属球体には蛋白質の一分子層が付着しているに
過ぎない。次いで、第１図中のプロツク１８に示される
ごとく、被覆基体が反射光によつて観察される。その結
果、被覆基体の外観から、それに付着している蛋白質層
の膜厚に関する判定、従つて特異的に反応する蛋白質の
存在に関する判定が下される。蛋白質層の膜厚は被覆基
体において観察される褐色の色調の変化に対応している
。これらの変化は極めて顕著なものであるため、蛋白質
層の検出は非常に簡単な作業である。基体上に粒子のみ
が存在する場合の褐色の色調に比べ、蛋白質の一分子層
で被覆された粒子は暗い色調の褐色を示し、また蛋白質
の二分子層で被覆された粒子は一層暗い色調の褐色を示
す。このような検出方法は、電磁輻射線が入射エネルギ
ーの主要部分の波長に等しい直径を持つた導電性球体に
よつて著しく散乱され、しかもかかる散乱は球体上に設
置された薄い絶縁性被膜によつて大きく影響されるとい
う事実に基づいている。この実施例に基づく診断装置の
実際の写真が第３図に示されている。第３図中の各写真
においては、試験用スライドが透過光によつて観察され
ている。写真３ａは一方の表面１００上にインジウム球
体を有するスライドを示している。写真３ｂも写真３ａ
のスライドと同様にして作製されたスライドであるが、
その左端はウシ血清アルブミンの溶液中に浸漬され、そ
れによつてウシ血清アルブミンの一分子層１０１が吸着
されている。写真３ｃも同様なスライドであつて、その
左端はウシ血清アルブミンの溶液中に浸漬され、それに
よつてウシ血清アルブミンの一分子層１０１が付着して
いる。更にその下端は卵白アルブミンの溶液中に浸漬さ
れ、それによつて卵白アルブミンの一分子層１０２が吸
着されている。ところで、写真３ｃのスライドの被覆部
分の外観は全て同様であることが留意されるべきである
。これは、スライド上に蛋白質の一分子層しか存在して
いないことを表わす。従つて、ウシ血清アルブミンおよ
び卵白アルブミンはスライド上に吸着するけれど、予め
ウシ血清アルブミンで被覆された部分のスライド上には
卵白アルブミンが付着しないことがわかる。換言すれば
、任意の蛋白質が基体に付着するけれど任意の蛋白質層
に蛋白質が付着するわけではないという前述の発見を写
真３ｃは例証している。写真３ｄのスライドの作製に当
つては、その左端をウシ血清アルブミンの溶液中に浸漬
することによつて一分子層１０１が付着させられ、その
右端を卵白アルブミンの溶液中に浸漬することによつて
一分子層１０２が付着させられ、そして最後にその下端
がウシ血清アルブミンに対するウサギ抗血清の溶液中に
浸漬された。従つて、１０３はウシ血清アルブミンに対
するウサギ抗血清の一分子層である。右側下方の隅の外
観から見れば、ウシ血清アルブミンに対するウサギ抗血
清は卵白アルブミン層１０２に付着せず、従つて写真３
ｄのスライドの右側下方の隅は卵白アルブミンの一分子
層のみで被覆されていることがわかる。写真３ｄの左側
下方の遇は顕著に暗くなつているが、これは予め吸着さ
れたウシ血清アルブミンの第１の一分子層およびそれと
免疫学的に複合したウシ血清アルブミンに対するウサギ
抗血清の第２の一分子層から成る蛋白質の二分子層が存
在することを表わす。このように、特異的に反応する蛋
白質のみがスライド上に二分子層を与えるのであつて、
その他の蛋白質層は全て一分子層であることがわかるは
ずである。医学診断用の道具を与えるような上記実施例
の変形実施例に従えぱ、表面上に金属球体を有する基体
が第１の抗原の溶液中に部分的に（第１の深さまで）浸
漬される。

その結果、溶液中に浸漬された領域に関し、基体は第１
の抗原の一分子層で被覆される。乾燥後、かかる基体が
第２の抗原の溶液中に一層深く（第２の深さまで）浸漬
される。第２の抗原は第１の抗原には付着しないが、溶
液中に浸漬された基体の未被覆部分には付着する。再び
乾燥後、かかる基体が第３の抗原の溶液中になお一層深
く（第３の深さまで）浸漬される。第３の抗原は第１ま
たは第２の抗原で被覆されていない基体部分にのみ付着
する。このような操作が任意の数の抗原に関して繰返さ
れる。その結果、多数の縞状を成す各種抗原の一分子層
で被覆された基体が得られる。こうして被覆されたスラ
イドが診断用の道具となる。医学診断の実施に当つては
、かかるスライドをたとえば血液の検体中に一定時間（
典型的には数時間）だけ浸漬すればよい。次いで、検体
からスライドを取出して水洗した後、反射光による観察
が行なわれる。かかるスライドは検体中に存在する抗体
を表わす濃淡の縞模様を示すから、それらの情報に基づ
いて医学診断が可能となる。第２図は、本発明の前述の
実施例に基づく診断装置の一部の拡大立面図である。

図中には、蒸着金属の球体３２が多数付着した基体３１
の一部が示されている。金属球体３２は前述のごとく基
体３１上にインジウムを蒸着することによつて形成する
のが好ましいけれど、同様な原子移動特性および非湿潤
特性を持つたその他の金属たとえば金、銀、スズ、鉛な
どを蒸着することによつて形成してもよい。基体の温度
が変化するのに伴ない、多数の金属がかかる特性を示す
はずである。第１の蛋白質の溶液中に浸漬すれば、基体
３１および金属球体３２から成る装置は第２図中の３３
として示されるごとく蛋白質分子３４の一分子層で被覆
される。３３として示された装置は、蛋白質分子３４と
特異的に反応する蛋白質の存在が疑われる溶液を試験す
るために使用すべき診断用の道具となる。

すなわち、３３として示された装置が蛋白質分子３４と
特異的に反応する蛋白質に暴露された場合、かかる装置
は３５として示されるような外観を有することになる。
その場合、基体３１および金属球体３２は蛋白質の二分
子層で被覆されるわけで、かかる二分子層は基体３１お
よび金属球体３２に重なり合つた第１の一分子層を形成
している第１の蛋白質の分子３４並びに第１の一分子層
、基体３１および金属球体３２に重なり合いかつ第１の
一分子層と免疫学的に結合した第２の一分子層を形成し
ている第１の蛋白質と特異的に反応する蛋白質の分子３
６とから成つている。かかる診断用の被覆スライドにお
けるコントラストを増大させる本発明の実施例が第４図
に示されている。この場合には、第２図に見られるごと
く表面上に金属球体３２を有しかつ蛋白質分子３４で被
覆されたスライド３１が被覆側を下向きにして光反射性
液体７１中に浸漬される。次いで、スライド３１がその
上面から反射光によつて観察される。第４図の診断装置
に入射した光を全反射させるためには、光反射性液体７
１は金属性液体とりわけ水銀であることが好ましい。非
金属性液体が使用される場合には、全反射を行なわせよ
うとすれば、第４図の診断装置の使用に際して採用すべ
き光学的な入射角および観察角が重要となる。この実施
例に従つて観察される診断装置の外観は第３図の場合と
同様であるが、コントラストの増大が見られる。以上、
特定の実施例に関連して本発明が記載されたが、上記の
教示に従えばその他の変形や変更も可能であることは当
業者にとつて自明であろう。

それ故、前記特許請求の範囲内であれば、上記の実施例
とは異なるやり方でも本発明を実施し得ることが了解さ
れるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例における作業工程を図解する工
程系統図、第２図は本発明の実施例に基づく診断装置の
作製および使用方法を示す立面図、第３図は本発明に基
づく診断装置の動作を示す写真、そして、第４図は第２
図の装置の使用方法として本発明の実施例を示す立面図
、である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 原子移動特性が大きくかつ表面湿潤特性が小さい金
   属を光透過性基体材料製の薄板上に金属球体として蒸着
   し、存在するか否か疑われている特定の蛋白質と特異的
   な抗原抗体反応をする蛋白質の溶液中に前記薄板を浸漬
   して前記の特異的な抗原抗体反応をする蛋白質の一分子
   層で前記薄板を被覆し、前記特定の蛋白質の存在が疑わ
   れる溶液中に前記薄板を浸漬し、前記薄板を前記溶液か
   ら取り出し、前記の金属および蛋白質層を下向きにして
   前記薄板を光反射性液体の表面上に設置し、次いで前記
   薄板を上面から反射光によつて観察して前記薄板に付着
   している蛋白質層が二分子層および一分子層のいずれで
   あるかを判定することの諸工程から成る、前記特定の蛋
   白質の存在が疑われる溶液中の前記特定の蛋白質の存否
   を試験する方法。