DE2433246A1

DE2433246A1 - Verbessertes verfahren fuer den nachweis und die reinigung von proteinen und antikoerpern und vorrichtung zu dessen durchfuehrung

Info

Publication number: DE2433246A1
Application number: DE2433246A
Authority: DE
Inventors: Ivar Giaever
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1973-07-30
Filing date: 1974-07-11
Publication date: 1975-02-13
Also published as: JPS59160763A; JPS5944583B2; CA1047918A; SE7409777L; SE464784B; DE2433246C2; NL7410231A; JPS5076226A; JPS6130215B2; NL177939B; IT1212274B; NL177939C; BR7406086D0; DE2463435C2

Description

Verbessertes Verfahren für den Nachweis und die Reinigung von Proteinen und Antikörpern und Vorrichtung zu dessen Durchführung Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtung für den Nachweis und die Reinigung von Proteinen und Antikörpern.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung den Nachweis und die Reinigung von Proteinen und Antikörperng wobei die Antigen-Antikdrper-Reakt40n an der Oberfläche eines Substrates stattfindet Immunologische Reaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen bezeichnetes erstes Protein sich mit einem zweiten Protein verbindet, das für dieses Antigen spezifisch ist und dessen Antikörper genannt wird, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems, wie einem tierischen Lebewesen, stattfinden, sind von großer Bedeutung für das Tier bei der Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlaßt der Eintritt eines fremden Proteins, d.h. des Antigens, das biologische System zur Erzeugung der für das entsprechende Antigen spezifischen Antikörper-Proteine in einem Verfahren, das bisher noch nicht vollständig verstanden wird.
Die Antikörper-ProSinmoleküle weisen verfügbare chemische 3indestellen auf, die die am Antigenmolekül ergänzen, und so können das Antigen und der Antikörper sich chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden.
Da Antikörper durch biologische Systeme als Antwort auf das Hindringen von fremden Proteinen erzeugt werden, ist der Nachweis von in einem biologischen System vorhandenen Antikörpern von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat auch der ;;acnweis bestimmter Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin zur Feststellung der Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle im Blut von in Aussicht genommenen Blutspendern.
Um solche diagnostischen Untersuchungen durchführen zu können, muß das geeignete Protein mindestens eines immunologisch reagierenden Paares in konzentrierter gereinigter Form erhältlich sein.
Die einzige bekannte Quelle für Antikörper-Proteine ist ein lebendes biologisches System. Darüber hinaus ist es bisher nur von Wirbeltieren bekannt, daß sie der Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen begegnen. Beispielsweise wurden viele Antikörper im Blutserum von tierischen Lebewesen gefunden, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden waren. Das Blutserum ist Jedoch eine sehr komplexe Mischung, in der die erforderlichen Antikörper in sehr geringen Konzentrationen bei Anwesenheit einer Vielzahl anderer Bestandteile vorkommen.
Viele Antigene können andererseits in kontrollierbarer Weise in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Einige Antigene Jedoch, wie z. B. das mit der Hepatitis verbundene Antigen, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren lebenden biologischen Systemen erhältlich.
In der derzeit praktizierten Weise basieren sowohl die Ansammlung als auch die Reinigung und die diagnostische Verwendung immunologisch aktiver Proteine auf den Ausfällungs- oder Agglutinierungseigenschaften, die für die Proteine charakeristisch sind, re die aus der immunologischen Komplexierungs)aktion herfahren. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Verwendungen ist das Verfahren zur Feststellung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Serum-Antikörpern vom Typ $ und ß vermischt werden und man bestimmt die Blutgruppe durch Feststellen irgendwelcher Agglutination in den Blutproben.
Die Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein, wie sie derzeit durchgeführt wird, ist ein Inhibitions-Test, der ausgeführt wird, indem man eine Menge des HCG-Antiserums in eine Urin-Probe einmischt. Eine Vielzahl von Polystyrolkügelchen, die mit HCG-Pro-- - - - . - - - so - - - - -tein beschichtet worden sind, bringt man in einelvörbereitete Urinprobe ein. Die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe kein HCG-Protein vorhanden ist. Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann bildet das HCG-Protein auf den Polystyrolugeln mit dem zuvor in die Urinprobe eingebracnten HCG-Antiserum Komplexe und die Kugeln agglutinieren.
Wenn andererseits in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden ist, dann bildet dieses mit dem zuvor eingebrachten HCG-Antiserum einen Komplex, der aus der Probe ausfällt, so daß das vorher eingeführte Serum nicht länger für die Komplexbildung mit dem HCG-Protein auf den Kugeln verfügbar ist und so auch keine Agglutinierung der Kugeln verursachen kann. Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung kann die bekannte Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein vereinfacht werden, indem man das HCG-Antiserum auf den Polystyrolkugeln haften läßt, und eine Urinprobe direkt untersucht. In diesem Falle werden die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe HCG-Protein vornanden ist.
Es scheint, daß der Grund, weshalb dieses einfachere Verfahren bisner nicht angewendet worden ist, der ist, daß die verfügbaren HCG-Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen fflroßen Anteil an Bestandteilen anderer Art als flCG-Antikörper enthalten. Die zusitzliche Bemühung, die nach dem bekannten Verfahren erforderlich ist, um die Antikörper aus den HCG-Antiseren zu extrahieren führen dazu, daß die Seren für den Inhibitionstest bisher direkt verwendet worden sind. Gemäß einer AusfÜhrungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Prozedur geschaffen, mit der HCG-Antikörper wirksam von Seren getrennt werden und diese Prozedur erzeugt weiter eine diagnostische Vorrichtung, mit der der einfachere direkte Test ausführbar ist. Jedes Antigenmolekül bildet typischerweise Komplexe mit einer Vielzahl von Antikörpermolekülen, die mit verschiedenen Teilchen verbunden seir. können und bildet dabei sichtbare Klumpen von z. B. beschichteten Polystyrolkügelchen oder roten Blutzellen. Eine Unzulänglichkeit von Agglutinierungs-Untersuchungen ist die, daß die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen agglomerieren können, die mit der immunologischen Agglutinierung nichts zu tun haben, und auf diese Weise die ZuverlässIgkeit der Untersuchung vermindern. Üblicherweise werden Agglutinierungs-Untersuchungen mit größter Sorgfalt von ausgebildeten Fachkräften durchgeführt, doch treten trotzdem gelegentlich diagnostische Fehler auf.
Beim derzeitigen Verfahren zur Gewinnung gereinigter Anreicherungen von Antikörpern wird zuerst durch Einführung des Antigens in das tierische System die Erzeugung von Antikörpern in einem tierischen Lebewesen angeregt, dann entnimmt man dem Tier Blutserum, welches die Antikörper in hochverdünnter Form enthält und vermischt eine bestimmte Menge des spezifischen Antigens mit dem Serum. Die Mischung aus Antigen und Antikörper bildet Komplexe und fällt aus der Serumlösung aus. Die verbleibenden Bestandteile des Serums werden abgezogen und der Niederschlag aus Antikörper und Antigen wird in einer Säure gelöst, welche die Komplexbindungen trennt. Man erhält dadurch eine Lösung der Antigen- und Antikörpermoleküle in der Säure. Da die Antikörper-und Antigenmoleküle unterschiedliche physikalische Eigenschaften haoen, z. B. unterschiedliches Gewicht, können sie voneinander mechanisch, z. B. durch Zentrifugieren, getrennt werden.
Es ist bekannt, daß die Antikörper-Antigen-Komplexierungsreaktion stattfindet, wenn ein Antigen an einer Oberfläche absorbiert ist. Die Komplexierungsreaktion an einer Oberfläche ist mittels eines Ellipsometers beobachtet worden. Ein Ellipsometer ist ein komplexes, speziell zur Bestimmung der Elliptizität polarisierten Lichtes brauchbares optisches Instrument, mit dessen Hilfe man Filmdicken in der Größenordnung von X,i R messen kann. Ellipsometer sind teuer und erfordern ausgebildetes Bedienungspersonal. Bei Untersuchungen immunologischer Reaktionen unter Verwendung von Ellipsometern, soweit sie bisher durchgeführt wurden verwendete man zwei Verfahren. Nach dem einen Ver-.
fahren ließ man die zu untersuchende Reaktion ablaufen und ordnete dann den Objektträger> auf dem die Reaktion stattgefunden hatten in einem Ellipsometer ans um die Filmdicke zu bestimmen.
Bei dem anderen Verfahren wurde der ObJekttrRger von vornherein im Ellipsometer befestigt und man beobachtete mit dem Ellipse meter die sich mit dem Fortschreiten der immunolõgischen Reaktion ändernde Filmdicke . Die Bestimmung der absoluten Dicke erfordert eine außerordentliche Sorgfalt Ist andererseits die Konzentration der Antikörper in der Lösung gering, dann erfordert die Messung der relativen Dickenänderung obwohl sie leichter durchzuführen ist als die Bestimmung der absoluten Dicke, eine lange Zeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist daher der Nachweis immunologischer Reaktionen auf einer Oberfläche unter Verwendung eines Ellipsometers nicht für diagnostische Zwecke verwendet worden.
Die vorliegende Erfindung schließt die Feststellung ein, daß irgendein willkürlich ausgewähltes Protein sich an einem Substrat nur in einer monomolekularen Schicht absorbiert und daß ein spezifischer Antikörper (oder Antigen) für ein solches willkürlich ausgewähltes Protein sich mit diesem unter Bildung einer bimolekularen Proteinschicht auf dem Substrat verbinden wird.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfassen daher die Anwendung dieser Feststellung für die Schaffung eines Verfahrens zur Ausnutzung in der medizinischen Diagnostik und in pnarmakologischen Anwendungen, sowie die Vorrichtung zur Durcnführung des Verfahrens.
Es ist daher eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Apparat für den wirtschaftlichen Nachweis immunologischer Reaktionen zu schaffen, die auf einer Oberfläche stattfinden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines solchen Verfahrens und Apparates, in dem'die immunologischen Reaktionen elektrisch nachweisbar sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines solchen Verfahrens und Apparates, mit dem immunologische Reaktionen durch direkte visuelle Beobachtung nachweisbar sind.
Eine zweite Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von Verfahren und Apparat für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern mittels gesteuerter immunologischer Reaktionen, die an einer Oberfläche stattfinden.
Kurz gesagt und in Übereinstimmung mit zwei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine Platte eines Substratmaterials zuerst in eine Lösung eines ersten Proteins eingetaucht, so daß eine monomolekulare Schicht des ersten Proteins an dem Substrat haftet. Das mit dem ersten Protein beschichtete Substrat einer wird dann in eine zweite Lösung eingetaucht, von der man nach/ - - - ein ersten Ausrunrungsrorm aer trtlnuung weit, daß sie/spezltlsen mit dem ersten Protein reagierendes Protein enthält und von der man in einer zweiten Ausführungsform vermutet, daß sie ein spezifisch mit dem ersten Protein reagierendes Protein enthält. Das spezifisch reagierende Protein und nur das spezifisch reagierende Protein bildet eine zweite monomolekulare Schicht, die die monomolekulare Schicht des ersten Proteins auf dem Substrat überlagert.
Dann wird nach einer ersten Ausführungsform der Erfindung das mit zwei monomolekularen Schichten bedeckte Substrat in eine Lösung einer schwachen Säure eingetaucht, welche die immunologische Bindung zwischen den beiden Proteinschichten trennt und für die Ansammlung des spezifisch reagierenden Proteins in gereinigter Form in einer Lösung einer schwachen Säure sorgt. In einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das beschichtete Substrat, nachdem man es in die Lösung eingetaucht hat, in der man ein spezifisch reagierendes Protein vermutet, elektrisch oder optisch untersucht, um festzustellen, ob an dem Substrat eine bimolekulare oder eine monomolekulare Proteinschicht haftet. Gleichzeitig bestimmt man damit, ob die zweite Lösung das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthalten hat oder nicht.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert, wobei weitere Aufgaben und Vorteile ersichtlich werden. Im einzelnen zeigen: Fig. 1 einen ADlaufplan für die Verfahrensstufen der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung, Fig. 2 eine Seitenansicht des diagnostischen Apparates gemäß einer'Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche das Verfahren für dessen Herstellung und Verwendun-? darstellt, Fig. 3 eine Seitenansicht eines für diagnostische Zwecke und für die Reinigung und Konzentrierung von Antikörpern gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung geeigneten Apparates Fig. 4 ein mechanisches schematisches Diagramm des Apparates gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern, Fig. 5 eine Fotografie, die den Betrieb der erfindungsgemäßen diagnostischen Vorrichtung illustriert, Fig. 6 eine Seitenansicht einer anderen Ausführungsform eines erfindungsgemäßen diagnostischen Apparates, Fig. 7 eine Seitenansicht einer erfindungsgemäßen diagnostischen Vorrichtung, welche eine Modifikation des Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung nach Fig. 2 illustriert, Fig. 8 eine grafische Darstellung des Betriebsprinzips, der in in Fig. 9 dargestellten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen diagnostischen Apparates, und Fig. 9 eine Seitenansicht einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen diagnostischen Apparatur.
Fig. 1 gibt einen Ablaufplan wieder, der die einzelnen Verfahren rensstufen bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zeigt.
Beim Lesen des Ablaufplanes von oben nach unten gibt Jede vertikale Stufe eine der Zeit nach folgende Stufe des Verfahrens wieder. Die einzelnen horizontal angeordneten Stufen auf einer gegebenen vertikalen Höhe im Ablaufplan zeigen die alternativen Möglichkeiten für eine der angegebenen Stufen gemäß den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung beginnt das Verfahren mit dem Block 13 der Fig. 1, bei dem eine Platte eines Subsbatmaterials, das Metall, Glas, Glimmer, Kunststoff, gesintertes SiliciumdioXyd, Quarz oder ein ähnliches Material sein kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den größten Unterschied im Brechungsindex gegenüber Protein hat, und vorzugsweise wird ein metallisierter Glas-Objektträger in eine Lösung eingetaucht, die ein erstes interessierendes Protein enthält. das biologisch Konzentnerter Luq ein Antigen oder ein Antikörper sein kann und das ln-relattv/ erhältlich ist und das verwendet werden soll, sein entsprechendes spezifisch reagierendes Protein nachzuweisen oder zu reinigen, wobei letzteres biologisch ein Antikörper bzw. ein Antigen ist. Das erste Protein wird an dem Substrat in einer monomolekularen Schicht adsorbiert. Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, wobei eine weitere Adsorption nicht stattfindet. D.h. das Protein haftet am Substrat, nicht jedoch an sich selbst. Nachdem sich eine monomolekulare Schicht des Proteins auf der ganzen Oberfläche des Substrates gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des ersten Proteins herausgenommen. Die für die vollständige Beschichtung des Substrates erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proteins in der Lösung und des Maßes, mit dem die Lösung gerührt wird. Beispielsweise beschichte S ine 1 %-ige Rinderserum-Albuminlösung einen Objektträger in ungefähr 30 Minuten mit einer monomolekularen Proteinschicht vollständig.
Bei der nächsten Stufe, die in Block 14 der Fig. 1 dargestellt ist, wird das Protein-beschichtete Substrat in eine Lösung eingetaucht, in der man das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein vermutet. Diese Lösung kann und tut es üblicherweise auch, viele Bestandteile außer dem spezifisch reagierenden Protein enthalten, dessen Anwesenheit man nachweisen möchte. Es wird jedoch kein anderes als ein spezifisch reagierendes Protein an der ersten Proteinschicht auf dem Substrat haften. Ist demgemäß das spezifisch reagierende Protein nicht vorhanden, dann weist das Substrat nach dem Eintauchen in die zweite Lösung immer noch nur eine monomolekulare Proteinschicht auf. Ist andererseits das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann findet ein immunologisches Komplexieren zwischen dem ersten Protein und seinem spezifisch reagierenden Protein statt und das Substrat trägt nach einer bestimmten Zeit eine bimolekulare Proteinschicht. Es ist zu erwähnen, daß die in den Blocks 13 und 14 der Fig. 1 dargestellten Schritte für alle Ausführungsformen der Erfindung die gleichen sind. Die für die Adhäsion einer vollständigen zweiten molekularen Schicht an dem beschichteten Substrat erforderliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung. Für Antikörper in Blutserum kann diese Zeit bis zu 1 Tag betragen.
Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird bei der nächsten Stufe das beschichtete Substrat in eine Lösung einer schwachen Säure eingetaucht, wie dies in Block 15 der Fig. 1 dargestellt ist, während man gleichzeitig das beschichtete Substrat in einem Ellipsometer betrachtet, wie in Block 22 der Fig. 1 illustriert. Während die Bildung der Schicht des spezifisch reagierenden Proteins auf dem mit dem ersten Protein beschichteten Substrat eine längere Zeit erfordern kann, löst die schwache Säure die immunologische Bindung zwischen den beiden Proteinen sehr rasch. Demgemäß kann die Beobachtung mit dem Ellipsometer auf die relativ einfache Beobachtung der Änderung der Filmdicke gerichtet werden anstelle der komplizierteren Messung der absoluten Filmdicke. Die Beobachtung des Ablösens der Schicht aus spezifisch reagierendem Protein durch de schwache Säure ist sehr viel rascher möglich als bei dem bekannten Verfahren die Beobachtung des Aufbaues der Schicht aus dem spezifisch reagierenden Protein. Daher kann eine große Menge von Objektträgern gemäß Block 13 hergestellt werden, und man kann jeden von ihnen einer aus einer großen Vielzahl von Serumproben, wie in Block 14 dargestellt, aussetzen, und dann kann in einer kurzen Zeit jeder Objektträger serienmäßig gemaß den Stufen der Blöcke 15 und 22 untersucht werden, um festzustellen, welche der Serumproben das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein.enthielt.
Da die Säure das erste Protein vom Substrat nicht ablöst, werden solche beschichteten Substrate, die in Lösungen ohne spezifisch reagierendes Protein eingetaucht waren, keine Änderung der Filmdicke zeigen, wenn sie in eine Säure eingetaucht und in einem Ellipsometer beobachtet werden. Andererseits zeigen dievObjektträger, die in eine Lösung mit dem spezifisch reagierenden Protein eingetaucht waren, ungefähr einen Faktor von 2 bis 5 bei der Änderung der Dicke, wenn sie in eine Säure eingetaucht und in einem Ellipsometer beobachtet werden. Jede Untersuchung mit dem Ellipsometer kann in wenigen Minuten durchgeführt werden, und dadurch ist eine wirksame und diagnostisch bedeutende Unterschungsmethode geschaffen.
Eine zweite eng damit verwandte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen umfaßt die in den Blöcken 13, 14, 15 und 29 der Fig. 1 dargestellt ten Stufen. Das Substrat wird erst in eine Lösung des erhältlichen Proteins des Antigen-Antikörper-Paares eingetaucht, wir in Block 13 dargestellt. Üblicherweise wird dies das Antigen sein, doch hängt die vorliegende Erfindung nicht von der biologischen Identität des ersten Proteins ab. Das gemäß Block 13 der Fig. 1 hergestellte beschichtete Substrat wird dann in eine Lösung eingetaucht, die das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthält, wie in Block 14 dargestellt. Im üblichen Falle ist das spezifisch reagierende Protein eln Antikörper, und die in Block 14 verwendete Lösung ist das Blutserum eines tierischen Lebewesens, welches dem ersten Protein ausgesetzt worden ist.
Das nun mit einer bimolekularen Proteinschicht bedeckte Substrat wird als nächstes, wie in Block 15 der Fig. 1 gezeigt, in eine schwache Säure eingetaucht, welche die Schicht des spezifisch reagierenden Proteins von der ersten Proteinschicht ablöst. Danach ist das Substrat mit einer monomolekularen Schicht des ersten Proteins beschichtet, und es liegt eine gereinigte Lösung des spezifisch reagierenden Proteins in der schwachen Säure vor.
Die nächste, in Block 23 der Fig. 1 gezeigte Stufe ist die Rückführung des mit der anhaftenden ersten Proteinschicht versehenen Substrates in die Lösung, die das spezifisch reagierende Protein enthält, um wieder eine zweite Schicht aufzunehmen, die dann wieder durch die Säure abgelöst wird, wobei die Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Säure erhöht wird.
Dieses Verfahren wird fortgesetzt und führt zur Ansammlung einer Konzentration reinen spezifisch reagierenden Proteins in dem Bad aus schwacher Säure.
Obwohl die zuerst beschriebene Ausführungsform die Wirksamkeit des ellipsometrischen immunologischen Nachweises bis zur praktischen Durchführbarkeit verbessert hat, ist es trotzdem wirtschaftlich erwünscht, die Notwendigkeit für das Ellipsometer vollständig zu eliminieren. Demgemäß schafft eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Möglichkeit für die Bestimmung relativer Proteinfilmdicken durch elektrische Maßnahmen. Bei dieser Ausführungsform wird entweder ein metallisches Substrat ausgewählt oder ein Substrat aus einem anderen Material wird erst, wie in Block 11 der Fig. 1 gezeigt, mit einem Metallfilm beschichtet. Das Metallsubstrat oder das Metall-beschichtete Substrat wird dann gemäß den Blöcken 13 und 14, wie oben beschrieben, in Proteinlösungen eingetaucht. Die an dem Substrat haftenden Proteinschichten sind elektrisch isolierend. Als nach stes wird eine Quecksilber- oder eine andere Elektrode auf der oberen an dem Substrat haftenden Proteinschicht angebracht, wie in Block 16 der Fig. l gezeigt. Die obere Proteinschicht ist entweder das erste Protein, wenn die zweite Lösung nicht das erwartete spezifisch reagierende Protein enthalten hatte, oder die oberste Schicht ist das spezifisch reagierende Protein, wenn die zweite Lösung ein solches enthielt. Der Metallfilm oder das Metallsubstrat und der Quecksilbertropfen bilden daher die beiden leitenden Platten eines elektrischen Kondensators, der durch eine isolierende -Schicht getrennt ist, die entweder eine monomolekulare oder eine bimolekulare Proteinschicht umfaßt. Die elektrische Kapazität dieses Kondensators wird dann, wie in Block 19 der Fig. 1 angegeben, unter Verwendung irgendeines geeigneten bekannten Instrumentes für die Kapazitätsmessung bestimmt,- z.B. mit einer Heathkit-Impedanzbrücke, Modell IB-28.
Die elektrische Kapazität solcher Kondensatoren mit einer bimolekularen Proteinschicht als Dielektrikum hatte einen Faktor von ungefähr 2 bis 5 gegenüber der Kapazität solcher Kondensatoren mit einer monomolekularen Proteinschicht.
Eine andere eng verwandte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vereinfacht den Nachweis des spezifisch reagierenden Proteins weiter, indem sie die i glichkeit schafft, seine Anwesenheit durch visuelle Beobachtung mit dem bloßen Auge festzustellen.
Diese Ausführungsform wendet ein Metallsubstrat an, das mit Quecksilber ein Amalgam bildet, oder es wird ein anderes Substrat material verwendet, wie Glas, das, wie in Block 11, mit einem dünnen Metallfilm beschichtet wird, welches ein Amalgam mit Quecksilber bildet, vorzugsweise Gold. Das Substrat wird dann nach den in Block 13 und Block 14 beschriebenen Stufen gehandelt, und es wird wieder ein Quecksilbertropfen auf der oberen Proteinschicht angeordnet, wie in Block 16 angegeben. Bei dieser Ausführungsform wird jedoch keine elektrische Messung gem.acht. Bei dieser Ausführungsform ist die nächste Stufe, das beschichtete Substrat visuell zu betrachten und die Zeit zu bestimmen, die vergeht, bevor ein sichtbares Amalgam von dem Quecksilber mit dem auf dem Substrat~befindlichen Metallfilm gebildet wird. Diese Ausführungsform der Erfindung beruht auf der erfindungsgemäßen Feststellung, daß Quecksilber durch eine monomolekulare Proteinschicht in ungefähr 1 Minute diffundiert, daß das Quecksilber jedoch 10 Minuten oder mehr braucht, um durch eine bimolekulare Proteinschicht zu diffundieren. Da das Quecksilber durch die Proteinschicht oder -schichten diffundieren muß, um mit dem Metallfilm auf dem Substrat ein sichtbares Amalgam zu bilden, gibt die Zeit, die zwischen dem Anordnen des Quecksilbertropfens auf der oberen Proteinschicht und dem Erscheinen des sichtbaren Amalgams vergeht, an, ob eine monomolekulare oder eine bimolekulare Proteinschicht auf dem Substrat vorhanden ist und demgemäß ob die Lösung, die zu untersuchen war, tatsächlich das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende, Protein enthielt oder'nicht. Es ist dem Fachmann klar, daß die Kapazitätsmessung bei der zuvor beschriebenen Ausführungsform innerhalb 1 Minute vom Anordnen des Quecksilbertropfens auf der oberen Proteinschicht durchgeführt sein muß, da die Quecksilberelektrode durch die isolierende Proteinschicht diffundiert und den Kondensator kurzschließt. Andererseits kann das Kurzschließen dadurch verhindert werden, daß man das Metall mit einer isolierenden lletalloxydschicht bedeckt und das Protein an dem Metalloxyd haften läßt. Durch Herstellen einer Vielzahl von Substraten nach der in Block 13 beschriebenen Stufe und deren gleichzeitiges Eintauchen in die Lösung, in der ein spezifisch reagierendes Protein erwartet wird, wie in Block 14 angegeben, wobei man die einzelnen Substrate jedoch während einer gewissen Dauer nacheinander aus der Lösung herauszieht, kann man eine rohe quantitative Bestimmung der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins durchführen. Da die Geschwindigkeit, mit der sich die Schicht aus spezifisch reagierendem Protein bildet, eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung ist, kann ein Vergleich der Diffusionszeiten für den Quecksilbertropfen durch die Proteinschichten auf einer Reihe von Substraten, die der Lösung, in der man das spezifisch reagierende Protein vermutet, verschiedene Zeiten ausgesetzt worden sind, eine rohe quantitative Angabe der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der entsprechenden Lösung ergeben.
In einer anderen verwandten Ausführungsform wird ein Substrat mit einem Metallfilm beschicht, wie in Block 11 der Fig. 1 abgebildet und wie bei der letzten Ausführungsform beschrieben. Dann taucht man das Substrat in Lösungen ein, wie in den Blöcken 13, und 14 dargestellt und oben bescT-rieben. Die nächste Stufe nach dieser Ausführungsform besteht im Beschichten der oberen Proteinschicht mit ener zweiten Metallschicht, wie in Block 17 der Fig. 1 dargestellt, und dann wird die so erhaltene Struktur mit reflektiertem Licht betrachtet, wie in Block 21 der Fig. 1 dargestellt.
Das zweite Metall wird vorzugsweise durch Elektroplattieren aufgebracht. Im wesentlichen führt diese Ausführungsform zu einer Struktur, die als Diffraktionsraster arbeitet und der Unterschied zwischen einer monomolekularen und einer bimolekularen Protein-Isolationsschicht ist bestimmbar aus den Spektralanteilen, die im reflektierten Licht festgestellt werden können.
Figur 6 illustriert die Ausführungsform der erfindungsgemäßen Apparatur für diese optische Bestimmungsmethode. Eine metallische Oberfläche 81 eines Substrates, welches entweder ein metallisches Substrat oder ein mit einem Metallfilm beschichtetes nicht-metallisches Substrat sein kann, weist eine erste Proteinschicht 82 auf, die gemäß Block 13 der Fig. 1 aufgebracht worden ist. Das mit der Proteinschicht 82 bedeckte Substrat wird dann in die zu untersuchende Lösung eingetaucht und es bildet sich eine zweite Schicht 83 aus, mit dem Protein der Schicht 82 spezifisch reagierenden Protein darauf, wenn ein solchen in der Lösung vorhanden ist. Es wird dann auf die freie Oberfläche des Proteinfilms eine zweite Metallisierung aufgebracht. Es wird eine sehr geringe Menge Metall aufgetragen, so daß die zweite Metall sierung in Form einer Vielzahl diskontinuierlicher metallisierter Bereiche erscheint, wie z. B. den Bereichen 84 ttnd 85 in Fig. 6.
Ein durch die Strahlen 86 repräsentierter Lichtstrahl wird darli,e auf den so vorbereiteten ObJektträger gerichtet. Das Licht wird an den Metallgrenzen reflektiert. Der Abstand zwischen den reflektierenden Oberflächen der Metallsubstratoberfläche 81 und z. B.
den Teilchen der Metallisierung 84 ist eine Funktion der Dicke des Proteinfilms zwischen den Teilen 81 und 84. Demgemäß variiert das beobachtete reflektierte Licht, das durch die Strahlen 87 illustriert ist, in der spektralen Zusammensetzung Jetachdem ob die Proteinschicht eine monomulekulare oder eine bimolekulare Schicht ist.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die in der Fig. 1 in den Blöcken 12, 13, 14 und 18 beschriebenen Stufen. Bei dieser Ausführungsform muß das Substrat ein lichtdurchlässiges Substrat sein, wie Glas, Kunststoff, gesintertes Siliziumdioxyd, Glimmer, Quarz-und ähnliches und vorzugsweise wird Glas verwendet, wobei Objektträger ein bequem erhältliches Substrat darstellen, das zuerst mit einer Vielzahl von Metallkügelchen beschichtet wird, indem man'ein Metall, z. B. Indium, wie in Block 12 der Fig. 1 angegeben, durch Verdampfen auf das Substrat aufbringt. Das Indium z. B. wird langsam aus einem Tantaltiegel in einem Vakuum von etwa 5 x 10 5 mm Hg auf das Glassubstrat aufgebracht. Da die Indiumatome auf der Oberfläche des Substrates eine hohe Beweglichkeit haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Substrat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Jedes Metall, das ähnliche Eigenschaften hat und Kügelchen auf dem Substrat bildet, wenn es durch Aufdampfen dort aufgebracht wird, kann hier verwendet werden. Außer Indium sind Gold, Silber, Zinn und Blei erfolgreich verwendet worden. Das Verdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat eine leicht bräunliche Farbe hat. Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallkügelchen Durchmesser in der Größenordnung von 1000 i. Die genaue Größe der Kügelchen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben, die einem großen Anteil der Wellenlänge des sichtbaren Lichtes entsprechen. Beim nächsten Schritt wird das mit den Kügelchen bedeckte Substrat in eine Lösung eines ersten Proteins eingetaucht, wie in Block 13 der Fig. 1 dargestellt. Das erste Protein haftet wieder in einer monomolekularen Schicht an dem Substrat und den darauf befindlichen Meta7lkügelchen. Nachdem sich eine monomolekulare Proteinschicht gebildet hat, kann das beschichtete Substrat dazu verwendet werden, Lösungen auf die Anwesenheit eines mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden Proteins zu untersuchen, indem man das beschichtete Substrat in eine solche Lösung eintaucht, in der ein solches spezifisch reagierendes Protein erwartet wird, wie in Block 14 der Fig. 1 angegeben. War das erwartete spezifisch reagierende Protein vorhanden, dann weisen das Substrat und die Metallkügelchen eine bimolekulare Proteinschicht auf; war das spezifisch reagierende Protein dagegen nicht vorhanden, dann werden das Substrat und die Metallkügelchen nur von einer monomolekularen Proteinschicht bedeckt. Das beschichtete Substrat wird dann entweder im reflektierten oder durchfallenden Licht betrachtet, wie in Block 18 der Fig. 1 angegeben und vom Aussehen des beschichteten Substrates hinsichtlich der Dicke der anhaftenden Proteinschicht und demgemäß der Anwesenheit oder Abwesenheit des erwarteten spezifisch reagierenden Proteins wird letzteres bestimmt. Der Nachweis der Proteinschichten beruht auf Änderungen des Farbtones des leicht braunen Substrates, die in dem beschichteten Substrat beobachtbar sind. Diese Änderungen sind sehr ausgeprägt, und der Nachweis der Proteinschichten ist in diesem Falle ein sehr einfaches Verfahren. Die Teilchen allein auf dem Substrat erscheinen als ein erster Farbton von Braun, die mit einer monomolekularen Proteinschicht belegten Teilchen erscheinen als ein dunkleres Braun und die mit einer bimolekularen Proteinschicht belegten Teilchen erscheinen als ein noch dunkierer Braunton. Dieses Nachweisverfahren beruht auf der Tatsache, daß elektromagnetische Strahlung in einem starken Maße durch leitende Kügelchen mit Durchmessern gleich einem großen Anteil einer Wellenlänge der einfallenden Energie zerstreut wird und daß im Falle des Zerstreuens durch solche Kügelchen das Zerstreuen stark durch eine dünne auf den Kügelchen befindliche dielektrische Schicht beeinflußt wird.
Figur 5 zeigt eine Fotografie einer diagnostischen Apparatur gemäß der vorbeschriebenen Aus führungs form. Bei jeder Ansicht der Fig. 5 wird der Testobjektträger im durchfallenden Licht betrachtet. Ansicht 5a gibt einenGlasobjektträger mit Indiumkügelchen auf einer Oberfläche 100 des ObJektträgers wieder. Die Ansicht 5b zeigt einen Objektträger der wie der Objektträger der Ansicht 5a zubereitet ist, dessen linke Kante jedoch in eine Lösung von Rinderserum-Albumin eingetaucht worden ist und dabei eine monomolekulare Schicht 101 des Rinderserum-Albumins adsorbierte. Die Ansicht 5c zeigt einen ähnlichen Objektträger dessen linke Kante in Rinderserum-Albumin eingetaucht wurde und die dabei eine monomolekulare Schicht 101 des Rinderserum-Albumins trägt. Die untere Kante des Objektträgers in Ansicht 5c ist eine Lösung von nialbumin eingetaucht worden und weist demgemäß eine adsorbierte monomolekulare Schicht 102 aus Eialbumin auf. Es ist wichtig zu bemerken, daß das Aussehen der beschichteten Teile des Objektträgers der Ansicht 5b ähnlich ist und anzeigt, das nur eine monomolekulare Proteinschicht auf dem Objektträger vorhanden ist.
Dies demonstriert, daß das Rinderserum-Albumin und das Eialbumin zwar an dem Objektträger anhaften, daß das Eialbumin Jedoch nicht an dem Teil des Objektträgers haftet, der zuvor mit dem Rinderserum-Albumin beschichtet worden ist. In anderen Worten illustriert die Ansicht 5c die oben genannte Feststellung, daß irgendein willkürlich ausgewähltes Protein zwar an einem Substrat haften wird, das jedoch ein Protein nicht an einem solchen Film aus einem willkürlich ausgewählten Protein haftet. Der ObJektträger der Ansicht 5d wurde hergestellt, indem man die linke Kante in eine Rinderserum-Albuminlösung eintauchte,um darauf eine monomolekulare Schicht 101 davon aufzubringen. Dann wurde die rechte Kante in eine Eialbuminlösung eingetaucht, um dort eine monomolekulare Schicht 102 aufzubringen und schließlich wurde die untere Kante in eine Lösung eines gegenüber dem Rinderserum als Antiserum wirkenden Kaninchenserums eingetaucht. Demgemäß ist 103 eine monomolekulare Schicht von Kaninchen-Antiserum zum Rinderserum-Albumin. Das Aussehen der untere rechten Ecke zeigt an, daß das Kaninchen-Antiserum zum Rinderserum-Albumin nicht an der Eialbuminschicht 102 haftet, und demgemäß ist die untere rechte Ecke desObjektträgers der Ansicht 4d nur mit einer-monomolekularen Schicht aus Eialbumin bedeckt. Die untere linke Ecke der Ansicht 5d ist deutlicn dunkler, was die Anwesenheit einer bimonolaren Proteinschicht an dieser Stelle anzeigt, die eine erste monomolukulare Schicht aus Rinderserum-Albumin, das zuerst daran absorbiert worden ist umfaßt, sowie eine zweite monomolekulare Schicht aus Kaninchen-Antiserum gegenüber dem Rinderserum-Albumin, das immunologisdi mit dem darunterliegenden Rinderserum-Albumin komplexiert ist. Es ist demgemäß zu sehen, daß nur das spezifisch reagierende Proteinpaar eine bimolekulare Schicht auf dem Objektträger bildete , während alle anderen Beschichtungen monomolekular waren.
Bei einer Modifikation dieser Ausführungsform, die ein mediziniscnes diagnostisches System schafft, wird das die Metallkügelchen aufweisende Substrat teilweise bis zu einer ersten Tiefe in eine Lösung eines ersten Antigens eingetaucht. Das Substrat wird in einer monomolekularen Schicht durch das erste Antigen in dem Bereich beschichtet, der in die Lösung eingetaucht war. Dann trocknet man das Substrat und taucht bis zu einer zweiten Tiefe tiefer in eine Lösung eines zweiten Antigens ein. Das zweite Antigen haftet nicht an dem ersten Antigen, wohl aber an dem durch das erste Antigen nicht bedeckten Teil des Substrates, de in die Lösung des zweiten Antigens eingetaucht wird. Danach trocknet man das Substrat wieder und taucht bis zu einer dritten und größeren Tiefe in eine Lösung eines dritten Antigens ein. Das dritte Antigen haftet an dem Teil und nur an dem Teil des Substrates, der noch nicht mit dem ersten oder zweiten Antigen bedeckt ist. Das Verfahren kann für irgendeine Zahl intressierender Antigene wiederholt werden. Man erhält ein Substrat, das mit einer Vielzahl von-monomolekularen streifenförmigen Schichten verschiedener Antigene bedeckt ist. Dieser beschichtete Objektträger ist das für diagnostische Zwecke einsetzbare Werkzeug.
Bei dem medizinisch diagnostischen Verfahren wird dieser Objektträger in eine Probe von z. B. Blut üblicherweise mehrere Stunden lang eingetaucht. Danach nimmt man den Objektträger aus der Probe heraus und betrachtet ihn nach dem Waschen in Wasser mittels reflektiertem oder durchfallendem Licht. Der Objektträger zeigt ein Muster hellerer und dunklerer Streifen, welche die in der Probe vorhandenen Antikörper anzeigen und gestattet so eine entsprechende medizinische Diagnose.
Fig. 2 gibt eine stark vergrößerte Seitenansicht eines Teiles des in der vorgenannten Ausführungsform dieser Erfindung beschriebenen diagnostischen Apparates wieder. Fig. 2 zeigt einen Teil des Substratmaterials 31 mit einer Vielzahl von darauf durch Verdampfen aufgebrachten etallkügelchen 32. Die Teilchen 32 sind vorzusweise durch Aufdampfen von Indium auf das Substrat 31 hergestellt, wie oben beschrieben, doch können sie auch durch Verdampfen von Gold, Silber, Zinn, Blei oder eines anderen Metalles nergestellt sein, das ähnliche nicht benetzende und eine atomare Beweglichkeit aufweisende Eigenschaften hat. Irgendeines einer großen Zanl von Metallen zeigt solche Eigenschaften,-wenn die Temperatur des Substrates verändert wird. ;4ach dem Eintauchen in eine Lösung eines ersten Proteins wird das Segment des Objektträgers, der das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 umfaßt, mit einer monomolekularen Schicht von Molekülen 34 des ersten Proteins bedeckt, wie in Fig. 2 allgemein bei 33 angegeben. Der mit 33 bezeichnete Apparat ist das diagnostische Instrument, das zum Untersuchen von Lösungen auf die Anwesenheit des mit den Proteinmolekülen 34 spezifisch reagierenden Proteins verwendet wird.
Wird der allgemein mit 33 bezeichnete Apparat dem mit dem Protein der Moleküle 34 spezifisch reagierenden Protein ausgesetzt, dann nimmt der Apparat ein Aussehen an, wie es allgemein bei 35 gezeigt ist, bei dem das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 mit einer bimolekularen Proteinschicht bedeckt sind, welche die Moleküle 34 des ersten Proteins, die die erste monomolekulare Schicht auf dem Substrat 31 und den Kügelchen 32 bilden und eine zweite monomolekulare Schicht eines Proteins aus den Molekülen 36 des mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden Proteins umfaßt, wobei die Moleküle 36 immunologisch mit den Molekülen 34 des. ersten Proteins verbunden sind und diese erste Proteinschicht, die Metallkügelchen und das Substrat überlagern.
Figur 7 illustriert eine Modifikation dieser Ausführungsform, die einen vergrößerten Kontrast in dem beschichteten diagnostischen ObJektträger schafft. In Fig. 7 wird der Objektträger 31, der l-letallkAgelchen 32 darauf trägt und mit Proteinmolekülen 34 beschichtet ist, wie in Fig. 2 eingetaucht in eine Menge 71 einer lichtreflektierenden Flüssigkeit, wobei die beschichtete Seite nach unten gerichtet ist. Der Objektträger 31 wird dann von seiner oberen Oberfläche mit reflektiertem Licht betrachtet. Um eine totale Reflektion des auf den diagnostischen Apparat der Fig. 7 einfallenden Licntes zu schaffen, ist die reflektierende Flüssigkeit 71 vorzugsweise eine metallische Flüssigkeit und besonders bevorzugt Quecksilber. Wird eine nicht-metallische Flüssigkeit verwendet, dann werden die optiscnen Einfalls- und Betrachtungswinkel bei Verwendung der Ausführungsform der Fig. 7 kritiscn, wenn Totalreflektion beobachtet werden soll. Das Aussehen eines Testobjektträgers, der gemäß dieser Lehre betrachtet wird, ist ähnlich dem in Fig. 5 gezeigten, Jedoch mit einem verbesserten Kontrast.
Fig. 3 ist eine stark vergrößerte Seitenansicht des Apparates, der für diagnostische Zwecke und für die Reinigung und Konzen-und trierung von Proteinen / Antikörpern gemaß einer anderen AUS-führungsform der vorliegenden Erfindung brauchbar ist. Mit 40 ist allgemein ein Substrat 41 bezeichnet, das mit einer monomolekularen Schicht von Proteinmolekülen 42 bedeckt ist, wobei die Einheit 40 in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurde.
Mit 43 ist allgemein das Substrat 41 und die Proteinschicht 42 bezeichnet, mit der immunologisch eine zweite monomolekulare Schicht von Proteinmolekülen 44 des mit den Molekülen 42 spezifisch reagierenden Proteins verbunden ist, wobei diese Einheit 43 gemäß den oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Ein zweites Substrat 45 weist einen Tropfen 46 einer Lösung einer schwachen Säure auf. Die sich gegenüberstehenden Oberflächen der Substrate 41 und 45 mit eine bimolekularen Proteinschicht bzw.
einem Tropfen schwacher Säure darauf, der z.B. eine o,i normale Zitronensäurelösung sein kann,bwerden dann physikalisch miteinander in Kontakt gebracht. Gemäß einer erfindungsgemäßen Feststellung der vorliegenden Erfindung trennt der Tropfen 46 der schwachen Säure die immunologischen Bindungen zwischen den Molekülen 42 und den Molekülen 44, ohne die biochemischen Eigenschaften der Proteine zu beeinflussen und ohne die Adhäsionsbindung zwischen den Molekülen 42 des ersten Proteins und dem Substrat 41 zu trennen. Wenn die Substrate 41 und 45, wie bei 47 gezeigt, getrennt sind, dann haftet an dem Substrat 41 eine monomolekulare Schicht der Moleküle 42 des ersten Proteins und an dem Substrat 45 haftet eine monomolekulare Schicht der Moleküle 44 des spezifisch reagierenden Proteins. Das Substrat 41 mit den Molekülen 42 darauf kann dann erneut für das genannte Verfahren verwendet werden, wobei wieder ein Substrat erhalten wird, das mit einer mohomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Proteins bedeckt ist oder man kann das Substrat 41 mit den Molekülen 42 darauf als Testobjektträger gemäß einer der anderen 8usführungsformen der Erfindung verwenden. Das Substrat 45 mit den daran haftenden Molekülen 44 des spezifisch reagierenden Proteins kann dann gemäß den oben beschriebenen weiteren Ausführungsformen der Erfindung als Objektträger für die Untersuchung von Lösungen auf die Anwesenheit von Molekülen seines entsprechenden ersten Proteins verwendet werden. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als besonders bedeutend angesehen, da, wie bereits ausgeführt wurde, im Falle der üblichen Proteine von biologischem Interesse, AntigelE ziemlich leicht in gereinigter Form erhältlich sind und so auf einem Substrat adsorbiert werden können und einen Testobjektträger für den Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern in Lösungen bilden, Antikörper jedoch nicht so erhältlich sind. Demgemäß war es vor dieser Erfindung im allgemeinen nicht möglich, Testobjektträger für die Untersuchung von Lösungen auf die Anwesenheit von Antigenen herzustellen. Das Verfahren und der Apparat, wie in Fig. 3 dargestellt, schaffen Jedoch Testobjektträger, die ein Substrat 45 umfassen, das mit einer monomolekularen Schicht von z. 13. Antikarpermolekülen 44 bedeckt ist und das zur Untersuchung von Lssungen auf die Anwesenheit von Antigen verwendet werden kann.
Eine andere Ausführungsform eines diagnostischen Apparates nach der vorliegenden Erfindung ist strukturell in Fig. 9 gezeigt, und sein Betriebsprlnzip ist grafisch in Fig. 8 illustriert. Die Apparatur nach Fig. 9 umfaßt ein Goldsubstrat 91, das aus wirtschaftlicnen Gründen vorzugsweise aus einem mit einer dünnen Goldschicht versehenen anderen Metall besteht und auf dem eine monomolekulare Schicht 92 eines ersten Proteins adsorbiert ist. Gold hat ein Absorptionsband innerhalb des sichtbaren Spektrums. Diese Tatsache ist für die charakteristische Goldfarbe verantwortlich und ermöglicht diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Fig. 8 illustriert den Betrieb dieser Ausführungsform und gibt eine Reihe von Reflektivitätskurven wieder, bei denen die relative Reflektivität als Funktion der Wellenlänge aufgetragen ist.
Die Kurve 93 repujsentiert die Reflektivität von Goldmetall.
Die Kurve 94 gibt die Reflektivität von Goldmetall wieder, das eine monomolekulare Proteinschicht aufweist. Kurve 95 zeigt die Reflektivität von Goldmetall mit einer bimolekularen Protein-111 schicht darauf. Ein Goldsubstratowie 91) hat Subereinstimmung mit Kurve 93, die leuchtendhelbe Farbe des Goldmetalles. Wird die Testproteinschicht 92 auf das Substrat 91 aufgebracht, dann hat die Testplatte gemäß Kurve 94 ein dunkelgelbes Aussehen. Nach dem die Testplatte einer Lösung ausgesetzt worden ist, in der man das mit dem Protein der Schicht 92 immunologisch reagierende Protein vermutet, dann weist die Testplatte, wenn ein solches spezifisch reagierendes Protein in der Lösung vorhanden war und die Platte demzufolge eine bimolekulare Proteinschicht trägt, eine Reflektivitätschaf>akteristik' wie sie in Kurve 95 gezeigt ist auf und die Platte hat ein deutlich grünes Aussehen.
Nach bisher durchgeführten Versuchen scheinen die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die ein Substrat mit Metallkügelchen und ein Goldsubstrat verwenden, die im allgemeinen brauchbarsten zu sein. Weiter wurde festgestellt, daß diese beiden Ausführungsformen unterschiedliche Empfindlichkeiten haben in Abhängigkeit von den Dicken der interessierenden Proteinfilme. Im einzelnen weist die Ausführungsform mit einem Substrat und Metallkügelchen die größte Empfindlichkeit auf, wenn die Filmdicken unterhalb von etwa 200 R liegen. Das Goldsubstrat hat die größte Empfindlichkeit für Filme, die eine Dicke von 30 2 übersteigen.
In einem diagnostischen Verfahren, das gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt worden ist, wurden Glasobjektträger mit einer dünnen Indiumschicht bedeckt und mit einer Goldschicht überschichtet. Die Verwendung einer Indiumunterschicht war erfordersich, um die Adhäsion zwischen Glas und Gold zu verbessern. Es wurde weiter festgestellt, daß die Diffusion des Indiums in die darüberliegende Goldschicht- die optischen Charakteristiken der restobjektträger verbesserte. Die so vorbereiteten Objektträger wurden mit einer monomolekularen Schicht des mit der Hepatitis verbundenen Antigens bedeckt. Proben menschlichen Blutes, die auf die Anwesenheit von Hepatitis zu untersuchen waren, wurden durch ionischen einer Menge Antikörper gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen zubereitet, wobei eine ausreichende Menge der Antikörper verwendet wurde, um immunologisch aus der Mischung entfernt zu werden, wenn daß mit der Hepatitis verbundene Antigen in der Probe vorhanden ist. Dann wurden die Testobjektträger in die so vorbereiteten Blutproben eingetaucht.
Nach dem Herausnehmen wiesen die in die Hepatitis-negativen Proben eingetauchten Objektträger eine bimonokulare Proteinschicht auf', die das zuerst aufgebrachte mit der Hepatitis, verbundene Antigen umfaßten und eine zweite Schicht von Antikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen) die immunologisch damit verbunden waren, wie ein grüngefärbter Streifen auf dem Objektträger zeigt. Die Objektträger, die in Hepatitis-positive Proben eingetaucht waren, hielten ihre ursprüngliche dunkelgelbe Färbung bei, und dies zeigt an, daß nur die monomolekulare Schicht aus mit de Hepatits verbundenem Antigen auf dem ObJektträger vorhanden war, während die in die Probe eingebrachten Antikörper durch Komplexbildung mit dem darin enthaltenen Antigen aus der Probe ausgefallen waren und nicht mehr mit dem Antigen auf dem Testobjektträger reagieren konnte.
Es zeigt sich, daß der oben beschriebene Test ein Inhibitionstest ist. In einem anderen diagnostischen Verfahren wurde ein direkter Test gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt.
Bei dem direkten Test-wurden ObJektträger aus Glas-Indium-Gold und wie oben beschrieben vorbereitet, und dann mit einer monomolekularen Schicnt aus Antikorpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen beschichtet. Einige der ObJektträger wurden dann in Serum eingetaucht, daß von Hepatitspatienten entnommen war und von dem man daher wußte, daß es das mit der Hepatitis verbundene Antigen enthielt. Andere Objektträger wurden in Serumproben eingetaucht/von denen man wußte, daß sie frei sind von dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen. Wie erwartet, wiesen die in das Hepatitisserum eingetauchten Objektträger eine bimolekulare Proteinschicht auf, während die in das Hepatitisfreie Blut eingetauchten Objektträger nur eine monomolekulare Schicht aufwiesen.
Theoretisch ist der eben beschriebene direkte Test das bevorzugte diagnostische Verfahren sowohl wegen seiner relativen Einfachnein/ als auch weil in diesem Falle der direkte Test eine höhere Empfindlichkeit hat als der Inhibitionstest. Die höhere Empfindlichkeit des direkten Tests resultiert aus der Tatsache, daß die mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle sehr viel größer sind als die Moleküle des Antikörpers gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen . Daher bewirkt der direkte Test, eine sehr viel größere prozentualle änderung der Filmdicke und demgemäß ist ein größerer Kontrast bexobachtbar.
Die Konzentration des mit der Hepatitis verbundenen Antigens im Blut einer Person, die der Krankheit ausgesetzt ist, ist eine Funktion der Zeit. Die Konzentration des Hepatitisantigens ist sehr hoch, während der klinischen und unmittelbar vor klinischen Phasen der Hepatitis. In den weit nachRlinischen Phasen ist die Konzentration des Hepatitisantigens im Blut einer Person jedoch sehr gering. Beide Zustände sind medizinisch von Interesse. Der Nachweis des Antigens während der klinischen und unmittelbar vorklinischen Phasen ist für Diagnosezwecke wertvoll. Der Nachweis des Antigens in der weit nach,klinischen Phase ist für die Untersuchung des Blutes von in Aussicht genommenen Blutspendern wertvoll. Der einfacherere empfindliche direkte Test ist daher für diagnostische Zwecke bevorzugt, da er leicht durchgeführt werden kann, wegen der relativ hohen Konzentration des Hepatitisantigens in der Blutprobe.
Der für Überprüfungszwecke beschriebene Inhibitionstest ist experimentell ausgewertet worden, um seinen Wert relativ zu anderen bekannten Überprüfungstests zu bestimmen. In diesen Tests wurde das Hepatitis-positive Serum mit bekanntem Hepatitis-negativem Serum verdünnt. Unter Anwendung der oben: beschriebenen Inhibitionsprozedur führte eine Verdünnung eines Teiles Hepatitispositiven Serums mit 32 Teilen bekannten Hepatitis-negativem Serum zu einem zuverlässigen Nachweis während einer Stunde. Die Anwendung einer Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Serums mit 3000 Teilen bekannt negativem Serums,ergab einen zuverlässigen Nachweis während 24 Stunden. Diese Ergebnisse erweisen sich als sehr ähnlich in der Empfindlichkeit bzw. der erforderlichen Zeit wie das bekannte Verfahren der Gegenelektrophorese bzw. der Radioimmunisierung. Ein Überprüfungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt also Resultate, die vergleichbar sind mit den besten nach bekannten Verfahren erhältlichen, wobei ein zusätzlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der eines beträchtlich billigeren Verfahrens ist.
Die bevorzugte Verwendung eines goldbeschichteten Substrates gegenüber einem mit Metallkügelchen beschichteten Substrat bei dem vorbeschriebenen diagnostischen Hepatitis-Verfahren ist durch den Durchmesser der Hepatitis-Antigenmoleküle bedingt, der bei etwa 210 R liegt. Solche Filmdicken liegen gut im Bereich der Möglich keiten goldbeschichteter Substrate, um eine empfindliche Anzeige zu geben, doch sind sie zu dick für eine hochempfindliche Anzeige unter Verwendung mit Metallkügelchen beschichteten Substrats.
In Fig. 4 ist ein Apparat gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern in einem mechanischen schematischen Diagramm dargestellt. Zur Erleichterung des Verständnisses der Ausführungsform der Fig 4 sei darauf hingewiesen, daß der im Betrieb befindliche Anfang der Ausführungsform der Fig. 4 eine i4odifikation der Ausführungsform der gerade besprochenen Fig. 3 ist.
In Fig. 4 wird ein kontinuierlicher flexibler Gurt aus Substratmaterial 51, welches mit einer monomolekularen Proteinschicht bedeckt ist, das spezifisch mit dem zu konzentrierenden und reinigenden Protein reagiert, zuerst in einen Behälter 52 eingeführt, der eine gewisse Menge Flüssigkeit 53 enthält, in der sich das zu reinigende Protein befindet. Das immunologische Komplexieren zwischen den beiden spezifisch miteinander reagierenden Proteinen findet im Behälter 52 statt, und dann gelangt der Substratgurt 51, der nun ine bimolekulare Proteinschicht aufweist, in den Behälter ::, in dem sich eine Lösung 59 einer schwachen Säure befindet, welche die immunologische Bindung zwischen den beiden spezifisch miteinander reagierenden Proteinen trennt und dabei die Moleküle der zwei-Lls ten eroteSnschtcht in der Lösungrsammelt. Nach dem Verlassen des Behälters 58 befindet sich daher auf dem Substrat 51 wieder nur die ursprüngliche monomolekulare Proteinschicht. Das Substrat 51 wird dann in den Behälter 52 zurückgeführt, um wieder eine monomolekulare Schicht des zu sammelnden Proteins aufzunehmen, welche wieder im Behälter 58 abgelöst wird. Der Gurt 51 wird mittels der Gurt an triebsachsen 60 und 63, die mit den entsprechenden Klemmrollen o1 und 62 zusammenarbeiten, durch die Lösungen 53 und 59 geführt. Die Gurtantriebsachsen 60 und 63 können mit Jeder geeigneten Einrichtung angetrieben werden, die zweckmäßigerweise kleine elektrische Motoren umfassen kann, die mit den Gurtantriebsachsen 60 und 63 durch die Geschwinigkeit verringernde Getriebe verbunden sein können. Da die immunologische Koinplexierungsreaktion sehr viel langsamer vor sich geht als die die Bindungen trennende Säureeinwirkung, ist es zweckmäßig, daß der beschichtete Substratgurt 51 für eine sehr viel Engere Zeit in Kontakt mit der das zu sammelnde Protein enthaltenden Lösung 53 ist als mit der die schwache Säure enthaltenden Lösung 59. Es ist demgemäß zweckmäßig, daß der Behälter 52 beträchtlich größer ist als der Behälter 58 und daß eine Vielzahl von oberen und unteren Leitrollen 54 bzw. 55 verwendet werden, um den Gurt 51 vielfach durch die Lösung 53 zu führen. Auf diese Weise befindet sich der Gurt 51 zu irgendeiner Zeit mit einer größeren Länge in Kontakt mit der Lösung 53, und auf diese Weise ist irgendein Segment des Gurtes 51 eine längere Zeit der Lösung 53 ausgesetzt. Andererseits ist ein einziger Durchgang des Gurtes 51 durch die Säurelösung 59 völlig ausreichend, um die zweite Proteinschicht davon abzulösen. Daher ist lediglich ein'Paar oberer Leitrollen 56 und eine einzige Leitrolle 57 für die Führung des Gurtes 51 durch die Säurelösung rorgesehen. Eine Vielzahl von Leitrollen 64 ist vorgesehen, um dem ---- --------- - ----- - - (in' Gurt 51 während seines Überganges zwischen/BehEltern 52 und 58 die erforderliche mechanische Abstützung zu geben. Die Behälter 52 und 58 sind vorzugsweise mit Rühreinrichtungen 85 bzw. 66 versehen, die flüssigkeitsdicht durch die Wände der entsprechenden Behälter hindurchgeführt sind, um die Lösungen 53 bzw. 59 zu rühren und so eine Erneuerung der Lösungen zu bewirken, die sich in Kontakt mit dem Gurt 51 befinden. Der Behälter 52 ist mit einem Abzugsrohr 67 versehen, das durch das Ventil 68 gesteuert wird und durch das die Lösung 53 abgelassen werden kann, wenn man die Konzentration des erwünschten Proteins bis zu einem Punkt verringert hat, bei dem eine weitere wirksame Aufnahme nicht mehr möglich ist. Eine frische Probe der Lösung 53 kann dann durch den oberen offenen Teil in den Behälter 52 eingefüllt werden.
Auch der Behälter 58 ist mit einem Abzugs rohr 69 versehen, das durch das Ventil 70 gesteuert wird und durch das die Lösung des gereinigten Proteins in der schwachen Säure abgezogen werden kann, wenn die gewünschte Konzentration erreicht ist. Eine frische Säurelösung kann dann ähnlich durch das obere offene Ende in den Behälter 58 eingefüllt werden. Wie oben im Zusammenhang mit Fig. 3 beschrieben, kann der Substratgurt 51 mit jedem gewünschten Protein, sei es ein Antigen oder ein Antikörper, beschichtet werden. Verfahren und Apparat der Fig. 4 sind daher für das Sammeln einer gereinigten Konzentration irgendeines erwünschten Proteins geeignet, solange eine immunologische Reaktion mit dem gewünschten Protein vorhanden ist. Durch leichtes Modifizieren seiner Wirkungsweise kann der Apparat der Fig. 4 auch dazu verwendet werden, selektiv ein spezifisch unerwünschtes Protein aus einer Mischung, wie einem Serum, zu entfernen. Um dies zu bewirken, läßt man den Apparat der Fig. 4 einfach für eine längere Zeit ohne Erneuerung der Lösung 53 und mit periodischen Erneuerungen, soweit sie erforderlich sind, der Lösung 59 laufen. In diesem Falle wird beim Abzugsrohr 67 das Serum 53 erhalten, aus dem das unerwünschte Protein bis zu jedem erforderlichen Grad, abhängig nur von der Betriebszeit des Systems, entfernt worden ist.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Untersuchen einer Lösung auf die Anwesenheit eines spezifischen Proteins, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h die folgenden Stufen: Aufbringen eines Metalles auf eine Platte lichtdurchlässigen Substratmaterials, Eintauchen der Platte in eine Lösung eines mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, um die Platte mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Proteins zu bedecken, Eintauchen der Platte in eine Lösung, in der man das spezifische Protein vermutet und Untersuchen der Platte, um zu bestimmen, ob an der Platte eine bimolekulare oder eine monomolekulare Protein schicht haftet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Aufbringen eines Metalles das Beschichten der Platte mit einem Metallfilm umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t ,daß das Untersuchen der Platte weiter die folgenden Stufen umfaßt: Anordnen eines Quecksilbertropfens auf der oberen Oberfläche der Proteinschicht auf der Platte und Messen der elektrischen Kapazität zwischen dem Quecksilbertropfen und der Metallschicht.

4. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t - , daß das Metall ein sichtbares Amalgam mit dem Quecksilber bildet und daß das Untersuchen der Platte die folgenden weiteren Stufen umfaßt: Anordnen eines Quecksilbertropfens auf der oberen Oberfläche der Proteinschicht auf der Platte und Messen der Zeit, die zwischen dem Aufbringen des Quecksilbertropfens und dem Erscheinen eines sichtbaren Amalgams vergeht.

5. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Untersuchen der Platte die folgenden weiteren Stufen umfaßt: Aufbringen einer zweiten Metallschicht auf der oberen Oberfläche der Proteinschicht auf der Platte und Betrachten der Platte im reflektierten Licht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Beschichten mit einer zweiten Metallschicht das Aufbringen der zweiten Metallschicht auf die Platte durch Elektroplattieren umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Aufbringen eines Metalles das Verdampfen eines Metalles mit hoher atomarer Beweglichkeit und schlechten Oberflächenbenetzungs-Eigenschaften auf diese Platte umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Untersuchen der Platte das visuelle Betrachten der Platte umfaßt und daß das Bestimmen durch Unterscheiden zwischen verschiedenen Brauntönen erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Metall Indium ist und daß das Indium aus einem Tantaltiegel bei einem Vakuum von etwa 5 x 10 5 mm Hg auf die Platte aufgedampft' wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Untersuchen der Platte das visuelle Untersuchen der Platte umfaßt und daß das Bestimmen durch Unterscheiden zwischen drei Braunfarbtönen erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß es weiter die Stufe des Anordnens der Platte auf einer Oberfläche einer lichtreflektierenden Flüssigkeit umfaßt, wobei das Metall und die Proteinschicht nach unten gerichtet sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die lichtreflektierende Flüssigkeit Quecksilber ist und die Untersuchungsstufe das visuelle Untersuchen der Platte mit reflektiertem Licht umfaßt, während sich die Platte in Kontakt mit dem Quecksilber befindet.

13. Verfahren zum Untersuchen einer Lösung auf die Anwesenheit eines erwarteten spezifischen Proteins, g e k e n n -z e i c h n e t d u r c h die folgenden Stufen: Eintauchen einer Platte eines Sübstratmaterials in eine Lösung eines mit dem spezifischen Protein spezifisch reagieren den Proteins, um die Platte mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Proteins zu beschichten, Eintauchen der Platte in die Lösung, in der man das spezifische Protein erwartet und Eintauchen der Platte in eine Lösung einer schwachen Säure, während man die Platte in einem Ellipsometer beobachtet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Substrat eine Oberfläche aus einem Material aufweist, dessen Brechungsindex vom Brechungsindex des Proteins wesentlich verschieden ist.

15. Verfahren zum Herstellen einer gereinigten Anreicherung eines immunologisch reaktiven Proteins, g e k e n n -z e i c h n e t d u r c h folgende Stufen: Eintauchen eines Gurtes aus Substratmaterial in eine Lösung eines mit dem immunologisch reaktiven Protein spezifisch reagierenden Proteins, um den Gurt mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Proteins zu bedecken, Eintauchen eines Teiles des Gurtes in eine Lösung, die das immunologisch reaktive Protein enthält, um das immunologisch reaktive Protein mit dem spezifisch reagierenden Protein zu komplexieren, Überführen dieses Teiles des Gurtes aus der das immunologisch reaktive Protein enthaltenden Lösung in eine Lösung einer schwachen Säure und Eintauchen dieses Teiles in die schwache Säure, während ein zweiter Teil des Gurtes in die das immunologisch reaktive Protein enthaltende Lösung eingetaucht wird und Zurückführen des ersten Teiles des Gurtes aus der Lösung der schwachen Säure in die das immunologisch reaktive Protein enthaltende Lösung.

16. Verfahren zum Untersuchen einer Lösung auf die Anwesenheit eines spezifischen Proteins, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h die folgenden Stufen: Eintauchen einer Platte eines Substratmaterials mit einer metallischen Oberfläche in eine Lösung eines mit dem spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, Eintauchen der Platte in eine Lösung, in der man das spezifische Protein vermutet und elektrisches Untersuchen der Platte, um festzustellen, ob an der Platte eine bimolekulare oder eine monomolekulare Proteinschicht haftet.

17. Verfahren nach Anspruch 16, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die metallische Oberfläche eine erste Elektrode umfaßt, an der eine erste Oberfläche der Proteinschicht haftet und wobei das Untersuchen die folgenden weiteren Schritte umfaßt: Anordnen einer zweiten Elektrode auf einer zweiten Oberfläche der Proteinschicht und Messen der elektrischen Kapazität zwischen der ersten und zweiten Elektrode.

18. Verfahren nach Anspruch 17, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Anordnen einer zweiten Elektrode das Aufbringen eines Quecksilbertropfens auf die obere Oberfläche der Proteinschicht umfaßt.

19. Verfahren zum Untersuchen einer Lösung auf die Anwesenheit eines spezifischen Proteins,, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h die folgenden Stufen: Eintauchen einer Platte aus Substratmaterial mit einer metallischen Oberfläche in eine Lösung eines mit dem spezifischen Protein spezifisch reagierenden Proteins, Eintauchen der Platte in eine Lösung, in der man das spezifische Protein vermutet und chemisches Untersuchen der Platte, um festzustellen, ob die Platte eine bimolekulare oder eine monomolekulare Proteinschicht aufweist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die metallische Oberfläche ein Metall umfaßt, das mit Quecksilber ein sichtbares Amalgam bildet und daß die Untersuckungsstufe. die folgenden weiteren Stufen umfaßt: Aufbringen eines Quecksilbertropfens auf die obere Oberfläche der Proteinschicht und Messen der Zeit, die zwischen dem Aufbringen eines Quecksilbertropfens und dem Erscheinen eines sichtbaren Amalgams vergeht.

21. Verfahren nach Anspruch 19, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Untersuchungsstufe das Eintauchen der Platte in eine Lösung schwacher Säure umfaßt, um die immunologischen Bindungen in der Proteinschicht zu lösen, während die Platte in einem Ellipsometer beobachtet wird.

22. Verfahren zum Reinigen eines immunologisch reaktiven Proteins, g e k e n n z e i c h n e t . d u r c h folgende Stufen: Eintauchen eines Substrates in eine Lösung eines mit dem immunologisch reaktiven Protein spezifisch reagierenden Proteins, um das Substrat mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Proteins zu bedecken, Eintauchen des Substrates in eine das immunologisch reaktive Protein enthaltende Lösung, um das immunologisch reaktive Protein mit dem spezifisch reagierenden Protein zu komplexieren und Eintauchen des Substrates in eine Lösung einer schwachen Säure, um die immunologischen Bindungen zwischen dem immunologisch reaktiven Protein und dem spezifisch reagierenden Protein zu lösen.

23. Verfahren nach Anspruch 22, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Lösung einer schwachen Säure auf einer Oberfläche eines zweiten Substrates aufgebracht wird und daß die Stufe des Eintauchens in eine schwache Säure das Inkontaktbringen einer die Proteine aufweisenden Oberfläche des ersten Substrates mit der die schwache Säure tragenden Oberfläche des zweiten Substrates umfaßt.

24. Medizinisch diagnostischer Apparat, g e k e n n z e i c h -n e t d u r c h folgende Bestandteile: ein Substrat, eine Vielzahl von Metallkügelchen> die an einer Oberfläche des Substrates haften und einegonomolekulare Schicht eines immunologisch reaktiven Proteins, das mindestens auf einem Teil des Substrates und der Metallkügelchen liegt.

25. Apparat nach Anspruch 24, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß er eine Vielzahl monomolekularer Schichten aufweist, wobei jede monomolekulare Schicht einen Teil des Substrates und der Metallkügelchen überlagert.

26. Apparat nach Anspruch 24, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das Substrat eine lichtdurchlässige Platte umfaßt und daß die Metallkügelchen Indiumteilchen mit Hauptdimensionen im Bereich von 10 R bis 2000 i sind.

27. Apparat zum Nachweis der Anwesenheit eines interessierenden Proteins in einer Flüssigkeit, g e k e n n z e i c h n e t durch ein Substrat mit einer Metalloberfläche und eine monomolekulare Schicht aus einem mit dem interessierenden Proteins spezifisch reagierenden Protein auf der genannten Oberfläche.

28. Apparat nach Anspruch 27, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Oberfläche Gold umfaßt.

29. Apparat nach Anspruch 27, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Oberfläche Gold und ein anderes Metall zur Verbesserung der Adhäsion zwischen dem Gold und dem Substrat umfaßt.

30. Apparat nach Anspruch 29, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß das andere Metall in das Gold difundiert ist. unter Bildung einer Legierung, wodurch die Empfindlichkeit des Apparates erhöht ist.

31. Apparat nach Anspruch 27, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Oberfläche eine Vielzahl von an dem Substrat haftenden Metallkügelchen umfaßt.

32. Apparat nach Anspruch 31, d a d u r c h gek e n n -z e i c h n e t , daß die Metallkügelchen aus einem Metall mit einer hohen atomaren Beweglichkeit und schlechten Oberflächen-Benetzungseigenschaften auf dem genannten Substrat bestehen.

33. Apparat nach Anspruch 27 für den Schwangerschaftnachweis, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das interessierende Protein HCG-Protein ist, daß die Flüssigkeit Urin ist und daß das spezifisch reagierende Protein das für das HCG-Protein spezifisch reagierende Protein ist.

34. Apparat nach Anspruch 27, für die Diagnose der Hepatitis, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das interessierende Protein Hepatitis-Antikörper ist, daß die Flüssigkeit eine Mischung aus Blut und Hepatitis-Antikörper ist und daß das spezifisch reagierende Protein das mit der Hepatitis verbundene Antigen ist.

35. Apparat nach Anspruch 27 für die Diagnose der Hepatitis, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß daß interessierende Protein das Hepatitis-Antigen ist, daß die Flüssigkeit Blut ist und daß das spezifisch reagierende Protein Hepatitis-Antikörper ist.

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