Der Patentanspruch I des Hauptpatentes betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Lösung, wobei man ein Metall auf eine Platte aus lichtdurchlässi gem Material aufbringt, die beschichtete Platte durch Eintauchen in eine Lösung eines mit dem nachzuweisenden Protein spezifisch reagierenden Proteins mit einer monomolekularen Schicht dieses spezifisch reagierenden Proteins bedeckt, die so behandelte Platte in die zu untersuchende Lösung taucht und schliesslich prüft, ob an der Platte eine bimolekulare oder monomolekulare Proteinschicht haftet.
Der Patentanspruch II des Hauptpatentes betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des genannten Verfahrens, die ein Substrat aufweist mit einer Vielzahl von Metallkügelchen, die an einer Oberfläche des Substrates haften, und einer monomolekularen Schicht eines immunologisch reaktiven Proteins, die mindestens einen Teil des Substrates und der Metallkügelchen bedeckt.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbesserung dieses Verfahrens, die darin besteht, dass man ein die Platte aus lichtdurchlässigem Material schlecht benetzendes Metall aufbringt und dass man zur Prüfung, ob an der Platte eine bimolekulare oder monomolekulare Proteinschicht haftet, die Platte mit der Metall- und Proteinschicht nach unten auf die Oberfläche einer Flüssigkeit, vorzugsweise einer metallischen Flüssigkeit, insbesondere Quecksilber, aufbringt.
Immunologische Reaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen bezeichnetes erstes Protein sich mit einem zweiten Protein verbindet, das für dieses Antigen spezifisch ist und dessen Antikörper genannt wird, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems, wie einem tierischen Lebewesen, stattfinden, sind von grosser Bedeutung für das Tier bei der Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlasst der Eintritt eines fremden Proteins, das heisst des Antigens, das biologische System zur Erzeugung der für das entsprechende Antigen spezifischen Antikörper Proteine in einem Verfahren, das bisher noch nicht vollständig verstanden wird.
Die Antikörper-Proteinmoleküle weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die die am Antigenmolekül ergänzen, und so können das Antigen und der Antikörper sich chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden.
Da Antikörper durch biologische Systeme als Antwort auf das Eindringen von fremden Proteinen erzeugt werden, ist der Nachweis von in einem biologischen System vorhandenen Antikörpern von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat auch der Nachweis bestimmter Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnosti schen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin zur Feststellung der Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle im Blut von in Aussicht genommenen Blutspendern.
Um solche diagnostischen Untersuchungen durchführen zu können, muss das geeignete Protein mindestens eines immunologisch reagierenden Paares in konzentrierter gereinigter Form erhältlich sein. Die einzige bekannte Quelle für Antikörper-Proteine ist ein lebendes biologisches System. Dar über hinaus ist es bisher nur von Wirbeltieren bekannt, dass sie der Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen begegnen. Beispielsweise wurden viele Antikörper im Blutserum von tierischen Lebewesen gefunden, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden waren. Das Blutserum ist jedoch eine sehr komplexe Mischung, in der die erforderlichen Antikörper in sehr geringen Konzentrationen bei Anwesenheit einer Vielzahl anderer Bestandteile vorkommen. Viele Antigene können andererseits in kontrollierbarer Weise in Laboratoriumskulturen hergestellt werden.
Einige Antigene jedoch, wie zum Beispiel das mit der Hepatitis verbundene Antigen, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren lebenden biologischen Systemen erhältlich.
In der derzeit praktizierten Weise basieren sowohl die Ansammlung als auch die Reinigung und die diagnostische Verwendung immunologisch aktiver Proteine auf den Ausfällungs- oder Agglutinierungseigenschaften, die für die Proteine charakteristisch sind, die aus der immunologischen Komplexierungsreaktion herrühren. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Verwendungen ist das Verfahren zur Feststellung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Serum Antikörpern vom Typ a und Q vermischt werden und man bestimmt die Blutgruppe durch Feststellen irgendwelcher Agglutinationen in den Blutproben.
Die Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein, wie sie derzeit durchgeführt wird, ist ein Inhibitions Test, der ausgeführt wird, indem man eine Menge des HCG Antiserums in eine Urin-Probe einmischt. Eine Vielzahl von Polystyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet worden sind, bringt man in eine so vorbereitete Urinprobe ein.
Die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe kein HCG-Protein vorhanden ist. Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann bildet das HCG Protein auf den Polystyrolkugeln mit dem zuvor in die Urinprobe eingebrachten HCG-Antiserum Komplexe und die Kugeln agglutinieren. Wenn andererseits in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden ist, dann bildet dieses mit dem zuvor eingebrachten HCG-Antiserum einen Komplex, der aus der Probe ausfällt, so dass das vorher eingeführte Serum nicht länger für die Komplexbildung mit dem HCG-Protein auf den Kugeln verfügbar ist und so auch keine Agglutinierung der Kugeln verursachen kann.
Gemäss der Lehre der vorliegenden Erfindung kann die bekannte Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein vereinfacht werden, indem man das HCG-Antiserum auf den Polystyrolkugeln haften lässt, und eine Urinprobe direkt untersucht In diesem Falle würden die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe HCG-Protein vorhanden ist.
Es scheint, dass der Grund, weshalb dieses einfachere Verfahren bisher nicht angewendet worden ist, der ist, dass die verfügbaren HCG-Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen grossen Anteil an Bestandteilen anderer Art als HCG Antikörper enthalten. Die zusätzliche Bemühung, die nach dem bekannten Verfahren erforderlich ist, um die Antikörper aus den HCG-Antiseren zu extrahieren, führen dazu, dass die Seren für den Inhibitionstest bisher direkt verwendet worden sind. Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Prozedur geschaffen, mit der HCG-Antikörper wirksam von Seren getrennt werden und diese Prozedur erzeugt weiter eine diagnostische Vorrichtung, mit der der einfachere direkte Test ausführbar ist.
Jedes Antigenmolekül bildet typischerweise Komplexe mit einer Vielzahl von Antikörpermolekülen, die mit verschiedenen Teilchen verbunden sein können und bildet dabei sichtbare Klumpen von zum Beispiel beschichteten Polystyrolkügelchen oder roten Blutzellen. Eine Unzulänglichkeit von Agglutinierungs-Untersuchungen ist die, dass die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen agglomerieren können, die mit der immunologischen Agglutinierung nichts zu tun haben, und auf diese Weise die Zuverlässigkeit der Untersuchung vermindern. Üblicherweise werden Agglutinierungs-Untersuchungen mit grösster Sorgfalt von ausgebildeten Fachkräften durchgeführt, doch treten trotzdem gelegentlich diagnostische Fehler auf.
Beim derzeitigen Verfahren zur Gewinnung gereinigter Anreicherungen von Antikörpern wird zuerst durch Einführung des Antigens in das tierische System die Erzeugung von Antikörpern in einem tierischen Lebewesen angeregt, dann entnimmt man dem Tier Blutserum, welches die Antikörper in hochverdünnter Form enthält und vermischt eine bestimmte Menge des spezifischen Antigens mit dem Serum.
Die Mischung aus Antigen und Antikörper bildet Komplexe und fällt aus der Serumlösung aus. Die verbleibenden Bestandteile des Serums werden abgezogen und der Niederschlag aus Antikörper und Antigen wird in einer Säure gelöst, welche die Komplexbindungen trennt. Man erhält dadurch eine Lösung der Antigen- und Antikörpermoleküle in der Säure. Da die Antikörper- und Antigenmoleküle unterschiedliche physikalische Eigenschaften haben, zum Beispiel unterschiedliches Gewicht, können sie voneinander mechanisch, zum Beispiel durch Zentrifugieren, getrennt werden.
Es ist bekannt, dass die Antikörper-Antigen-Komplexierungsreaktion stattfindet, wenn ein Antigen an einer Oberfläche absorbiert ist. Die Komplexierungsreaktion an einer Oberfläche ist mittels eines Ellipsometers beobachtet worden. Ein Ellipsometer ist ein komplexes, speziell zur Bestimmung der Elliptizität polarisierten Lichtes brauchbares optisches Instrument, mit dessen Hilfe man Filmdicken in der Grössenordnung von 0,1 Ä messen kann. Ellipsometer sind teuer und erfordern ausgebildetes Bedienungspersonal. Bei Untersuchungen immunologischer Reaktionen unter Verwendung von Ellipsometern, soweit sie bisher durchgeführt wurden, verwendete man zwei Verfahren. Nach dem einen Verfahren liess man die zu untersuchende Reaktion ablaufen und ordnete dann den Objektträger, auf dem die Reaktion stattgefunden hatte, in einem Ellipsometer an, um die Filmdicke zu bestimmen.
Bei dem anderen Verfahren wurde der Objektträger von vornherein im Ellipsometer befestigt und man beobachtete mit dem Ellipsometer die sich mit dem Fortschreiten der immunologischen Reaktion ändernde Filmdicke. Die Bestimmung der absoluten Dicke erfordert eine ausserordentliche Sorgfalt. Ist andererseits die Konzentration der Antikörper in der Lösung gering, dann erfordert die Messung der realtiven Dickenänderung obwohl sie leichter durchzuführen ist als die Bestimmung der absoluten Dicke, eine lange Zeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist daher der Nachweis immunologischer Reaktionen auf einer Oberfläche unter Verwendung eines Ellipsometers nicht für diagnostische Zwecke verwendet worden.
Die vorliegende Erfindung schliesst die Feststellung ein, dass irgendein willkürlich ausgewähltes Protein sich an einem Substrat nur in einer monomolekularen Schicht absorbiert und dass ein spezifischer Antikörper (oder Antigen) für ein solches willkürlich ausgewähltes Protein sich mit diesem unter Bildung einer bimolekularen Proteinschicht auf dem Substrat verbinden wird. Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfassen daher die Anwendung dieser Feststellung für die Schaffung eines Verfahrens zur Ausnutzung in der me dizinischen Diagnostik und in pharmakologischen Anwendungen, sowie die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Es ist daher eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Apparat für den wirtschaftlichen Nachweis immunologischer Reaktionen zu schaffen, die auf einer Oberfläche stattfinden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines solchen Verfahrens und Apparates, in dem die immunologischen Reaktionen elektrisch nachweisbar sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines solchen Verfahrens und Apparates, mit dem immunologische Reaktionen durch direkte visuelle Beobachtung nachweisbar sind.
Eine zweite Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von Verfahren und Apparat für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern mittels gesteuerter immunologischer Reaktionen, die an einer Oberfläche stattfinden.
Kurz gesagt und in Übereinstimmung mit zwei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine Platte eines Substratmaterials zuerst in eine Lösung eines ersten Proteins eingetaucht, so dass eine monomolekulare Schicht des ersten Proteins an dem Substrat haftet. Das mit dem ersten Protein beschichtete Substrat wird dann in eine zweite Lösung eingetaucht, von der man nach einer ersten Ausführungsform der Erfindung weiss, dass sie ein spezifisch mit dem ersten Protein reagierendes Protein enthält und von der man in einer zweiten Ausführungsform vermutet, dass sie ein spezifisch mit dem ersten Protein reagierendes Protein enthält. Das spezifisch reagierende Protein und nur das spezifisch reagierende Protein bildet eine zweite monomolekulare Schicht, die die monomolekulare Schicht des ersten Proteins auf dem Substrat überlagert.
Dann wird nach einer ersten Ausführungsform der Erfindung das mit zwei monomo lekularen Schichten bedeckte Substrat in eine Lösung einer schwachen Säure eingetaucht, welche die immunologische Bindung zwischen den beiden Proteinschichten trennt und für die Ansammlung des spezifisch reagierenden Proteins in gereinigter Form in einer Lösung einer schwachen Säure sorgt. In einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das beschichtete Substrat, nachdem man es in die Lösung eingetaucht hat, in der man ein spezifisch reagierendes Protein vermutet, elektrisch oder optisch untersucht, um festzustellen, ob an dem Substrat eine bimolekulare oder eine monomolekulare Proteinschicht haftet Gleichzeitig bestimmt man damit, ob die zweite Lösung das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthalten hat oder nicht.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert, wobei weitere Aufgaben und Vorteile ersichtlich werden. Im einzelnen zeigen:
Fig. 1 einen Ablaufplan für die Verfahrensstufen der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung,
Fig. 2 eine Seitenansicht des diagnostischen Apparates gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche das Verfahren für dessen Herstellung und Verwendung darstellt,
Fig. 3 eine Seitenansicht eines für diagnostische Zwecke und für die Reinigung und Konzentrierung von Antikörpern gemäss einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung geeigneten Apparates,
Fig. 4 ein mechanisches schematisches Diagramm des Apparates gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern,
Fig.
5 eine Fotografie, die den Betrieb der erfindungsgemässen diagnostischen Vorrichtung illustriert,
Fig. 6 eine Seitenansicht einer anderen Ausführungsform eines erfindungsgemässen diagnostischen Apparates,
Fig. 7 eine Seitenansicht einer erfindungsgemässen diagnostischen Vorrichtung, welche eine Modifikation des Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung nach Fig. 2 illustriert,
Fig. 8 eine grafische Darstellung des Betriebsprinzips, der in in Fig. 9 dargestellten Ausführungsform eines erfindungsgemässen diagnostischen Apparates, und
Fig. 9 eine Seitenansicht einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemässen diagnostischen Apparatur.
Fig. 1 gibt einen Ablaufplan wieder, der die einzelnen Verfahrensstufen bei der Durchführung der vorliegenden Erfin dung zeigt. Beim Lesen des Ablaufplanes von oben nach unten gibt jede vertikale Stufe eine der Zeit nach folgende Stufe des Verfahrens wieder. Die einzelnen horizontal angeordneten Stufen auf einer gegebenen vertikalen Höhe im Ablaufplan zeigen die alternativen Möglichkeiten für eine der angegebenen Stufen gemäss den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung.
Gemäss einer ersten Ausführungsform der Erfindung beginnt das Verfahren mit dem Block 13 der Fig. 1, bei dem eine Platte eines Substratmaterials, das Metall, Glas, Glimmer, Kunststoff, gesintertes Siliciumdioxyd, Quarz oder ein ähnliches Material sein kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den grössten Unterschied im Brechungsindex gegenüber Protein hat, und vorzugsweise wird ein metallisierter Glas Objektträger in eine Lösung eingetaucht die ein erstes interessierendes Protein enthält, das biologisch ein Antigen oder ein Antikörper sein kann und das in relativ konzentrierter Lösung erhältlich ist und das verwendet werden soll, sein entsprechendes spezifisch reagierendes Protein nachzuweisen oder zu reinigen, wobei letzteres biologisch ein Antikörper bzw. ein Antigen ist. Das erste Protein wird an dem Substrat in einer monomolekularen Schicht adsorbiert.
Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, wobei eine weitere Adsorption nicht stattfindet. Das heisst das Protein haftet am Substrat, nicht jedoch an sich selbst.
Nachdem sich eine monomolekulare Schicht des Proteins auf der ganzen Oberfläche des Substrates gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des ersten Proteins herausgenommen. Die für die vollständige Beschichtung des Substrates erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proteins in der Lösung und des Masses, mit dem die Lösung gerührt wird. Beispielsweise beschichtet eine 1 /Oige Rinderserum-Albuminlösung einen Objektträger in ungefähr 30 Minuten mit einer monomolekularen Proteinschicht vollständig.
Bei der nächsten Stufe, die in Block 14 der Fig. 1 dargestellt ist, wird das Protein-beschichtete Substrat in eine Lösung eingetaucht, in der man das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein vermutet. Diese Lösung kann und tut es üblicherweise auch, viele Bestandteile ausser dem spezifisch reagierenden Protein enthalten, dessen Anwesenheit man nachweisen möchte. Es wird jedoch kein anderes als ein spezifisch reagierendes Protein an der ersten Proteinschicht auf dem Substrat haften. Ist demgemäss das spezifisch reagierende Protein nicht vorhanden, dann weist das Substrat nach dem Eintauchen in die zweite Lösung immer noch nur eine monomolekulare Proteinschicht auf.
Ist andererseits das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann findet ein immunologisches Komplexieren zwischen dem ersten Protein und seinem spezifisch reagieren den Protein statt und das Substrat trägt nach einer bestimmten Zeit eine bimolekulare Proteinschicht. Es ist zu erwähnen, dass die in den Blocks 13 und 14 der Fig. 1 dargestellten Schritte für alle Ausführungsformen der Erfindung die gleichen sind. Die für die Adhäsion einer vollständigen zweiten molekularen Schicht an dem beschichteten Substrat erfor derliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung. Für Antikörper in Blutserum kann diese Zeit bis zu 1 Tag betragen.
Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird bei der nächsten Stufe das beschichtete Substrat in eine Lösung einer schwachen Säure eingetaucht, wie dies in Block 15 der Fig. 1 dargestellt ist, während man gleichzeitig das beschichtete Substrat in einem Ellipsometer betrachtet, wie in Block 22 der Fig. 1 illustriert. Während die Bildung der Schicht des spezifisch reagierenden Proteins auf dem mit dem ersten Protein beschichteten Substrat eine längere Zeit erfordern kann, löst die schwache Säure die immunologische Bindung zwischen den beiden Proteinen sehr rasch.
Demgemäss kann die Beobachtung mit dem Ellipsometer auf die relativ einfache Beobachtung der Änderung der Filmdicke gerichtet werden anstelle der komplizierteren Messung der absoluten Filmdicke. Die Beobachtung des Ablösens der Schicht aus spezifisch reagierendem Protein durch die schwache Säure ist sehr viel rascher möglich als bei dem bekannten Verfahren die Beobachtung des Aufbaues der Schicht aus dem spezifisch reagierenden Protein.
Daher kann eine grosse Menge von Objektträgern gemäss Block 13 hergestellt werden, und man kann jeden von ihnen einer aus einer grossen Vielzahl von Serumproben, wie in Block 14 dargestellt, aussetzen, und dann kann in einer kurzen Zeit jeder Objektträger serienmässig gemäss den Stufen der Blöcke 15 und 22 untersucht werden, um festzustellen, welche der Serumproben das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthielt Da die Säure das erste Protein vom Substrat nicht ablöst, werden solche beschichteten Substrate, die in Lösungen ohne spezifisch reagierendes Protein eingetaucht waren, keine Anderung der Filmdicke zeigen, wenn sie in eine Säure eingetaucht und in einem Ellipsometer beobachtet werden.
Andererseits zeigen die Objektträger, die in eine Lösung mit dem spezifisch reagierenden Protein eingetaucht waren, ungefähr einen Faktor von 2 bis 5 bei der Änderung der Dicke, wenn sie in eine Säure eingetaucht und in einem Ellipsometer beobachtet werden. Jede Untersuchung mit dem Ellipsometer kann in wenigen Minuten durchgeführt werden, und dadurch ist eine wirksame und diagnostisch bedeutende Untersuchungsmethode geschaf- fen.
Eine zweite eng damit verwandte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen umfasst die in den Blöcken 13, 14, 15 und 23 der Fig. 1 dargestellten Stufen. Das Substrat wird erst in eine Lösung des erhältlichen Proteins des Antigen-Antikörper-Paares eingetaucht, wie in Block 13 dargestellt.
Üblicherweise wird dies das Antigen sein, doch hängt die vor liegende Erfindung nicht von der biologischen Identität des ersten Proteins ab. Das gemäss Block 13 der Fig. 1 hergestellte beschichtete Substrat wird dann in eine Lösung eingetaucht, die das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthält, wie in Block 14 dargestellt. Im üblichen Falle ist das spezifisch reagierende Protein ein Antikörper, und die in Block 14 verwendete Lösung ist das Blutserum eines tierischen Lebewesens, welches dem ersten Protein ausgesetzt worden ist. Das nun mit einer bimolekularen Proteinschicht bedeckte Substrat wird als nächstes, wie in Block 15 der Fig. 1 gezeigt, in eine schwache Säure eingetaucht, welche die Schicht des spezifisch reagierenden Proteins von der ersten Proteinschicht ablöst.
Danach ist das Substrat mit einer monomolekuaren Schicht des ersten Proteins beschichtet, und es liegt eine gereinigte Lösung des spezifisch reagierenden Proteins in der schwachen Säure vor.
Die nächste, in Block 23 der Fig. 1 gezeigte Stufe ist die Rückführung des mit der anhaftenden ersten Proteinschicht versehenen Substrates in die Lösung die das spezifisch reagierende Protein enthält um wieder eine zweite Schicht aufzunehmen, die dann wieder durch die Säure abgelöst wird, wobei die Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Säure erhöht wird. Dieses Verfahren wird fortgesetzt und führt zur Ansammlung einer Konzentration reinen spezifisch reagierenden Proteins in dem Bad aus schwacher Säure.
Obwohl die zuerst beschriebene Ausführungsform die Wirksamkeit des ellipsometrischen immunologischen Nach.
weises bis zur praktischen Durchführbarkeit verbessert hat, ist es trotzdem wirtschaftlich erwünscht, die Notwendigkeit für das Ellipsometer vollständig zu eliminieren. Demgemäss schafft eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Möglichkeit für die Bestimmung relativer Proteinfilmdicken durch elektrische Massnahmen. Bei dieser Ausführungsform wird entweder ein metallisches Substrat ausgewählt oder ein Substrat aus einem anderen Material wird erst, wie in Block 11 der Fig. 1 gezeigt, mit einem Metallfilm beschichtet. Das Metallsubstrat oder das metallbeschichtete Substrat wird dann gemäss den Blöcken 13 und 14, wie oben beschrieben, in Proteinlösungen eingetaucht. Die an dem Substrat haftenden Proteinschichten sind elektrisch isolierend.
Als nächstes wird eine Quecksilber- oder eine andere Elektrode auf der oberen an dem Substrat haftenden Proteinschicht angebracht, wie in Block 16 der Fig. 1 gezeigt. Die obere Proteinschicht ist entweder das erste Protein, wenn die zweite Lösung nicht das erwartete spezifisch reagierende Protein enthalten hatte, oder die oberste Schicht ist das spezifisch reagierende Protein, wenn die zweite Lösung ein solches enthielt. Der Metallfilm oder das Metallsubstrat und der Quecksilbertropfen bilden daher die beiden leitenden Platten eines elektrischen Kondensators, der durch eine isolierende Schicht getrennt ist, die entweder eine monomole- kulare oder eine bimolekulare Proteinschicht umfasst.
Die elektrische Kapazität dieses Kondensators wird dann, wie in Block 19 der Fig. 1 angegeben, unter Verwendung irgendeines geeigneten bekannten Instrumentes für die Kapazitätsmessung bestimmt, zum Beispiel mit einer Heathkit-lmpedanzbrücke, Modell IB-28. Die elektrische Kapazität solcher Kondensatoren mit einer bimolekularen Proteinschicht als Dielektrikum hatte einen Faktor von ungefähr 2 bis 5 gegen über der Kapazität solcher Kondensatoren mit einer monomolekularen Proteinschicht.
Eine andere eng verwandte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vereinfacht den Nachweis des spezifisch reagierenden Proteins weiter, indem sie die Möglichkeit schafft, seine Anwesenheit durch visuelle Beobachtung mit dem blossen Auge festzustellen. Diese Ausführungsform wendet ein Metallsubstrat an, das mit Quecksilber ein Amalgam bildet, oder es wird ein anderes Substratmaterial verwendet, wie Glas, das, wie in Block 11, mit einem dünnen Metallfilm beschichtet wird, welches ein Amalgam mit Quecksilber bildet, vorzugsweise Gold. Das Substrat wird dann nach den in
Block 13 und Block 14 beschriebenen Stufen behandelt, und es wird wieder ein Quecksilbertropfen auf der oberen Pro teinschicht angeordnet, wie in Block 16 angegeben. Bei dieser Ausführungsform wird jedoch keine elektrische Messung gemacht.
Bei dieser Ausführungsform ist die nächste Stufe, das beschichtete Substrat visuell zu betrachten und die Zeit zu bestimmen, die vergeht, bevor ein sichtbares Amalgam von dem Quecksilber mit dem auf dem Substrat befindlichen Metallfilm gebildet wird. Diese Ausführungsform der Erfindung beruht auf der erfindungsgemässen Feststellung, dass Quecksilber durch eine monomolekulare Proteinschicht in ungefähr 1 Minute diffundiert, dass das Quecksilber jedoch 10 Minuten oder mehr braucht, um durch eine bimolekulare Pro teinschicht zu diffundieren.
Da das Quecksilber durch die
Proteinschicht- oder -schichten diffundieren muss, um mit dem Metallfilm auf dem Substrat ein sichtbares Amalgam zu bilden, gibt die Zeit, die zwischen dem Anordnen des Quecksilbertropfens auf der oberen Proteinschicht und dem Erscheinen des sichtbaren Amalgams vergeht, an, ob eine monomolekulare oder eine bimolekulare Proteinschicht auf dem Substrat vorhanden ist und demgemäss ob die Lösung, die zu untersuchen war, tatsächlich das mit dem ersten Pro tein spezifisch reagierende Protein enthielt oder nicht. Es ist dem Fachmann klar, dass die Kapazitätsmessung bei der zuvor beschriebenen Ausführungsform innerhalb 1 Minute vom Anordnen des Quecksilbertropfens auf der oberen Pro teinschicht durchgeführt sein muss, da die Quecksilberelektrode durch die isolierende Proteinschicht diffundiert und den Kondensator kurzschliesst.
Andererseits kann das Kurzschliessen dadurch verhindert werden, dass man das Metall mit einer isolierenden Metalloxydschicht bedeckt und das Protein an dem Metalloxyd haften lässt. Durch Herstellen einer Vielzahl von Substraten nach der in Block 13 beschriebenen Stufe und deren gleichzeitiges Eintauchen in die Lösung, in der ein spezifisch reagierendes Protein erwartet wird, wie in Block 14 angegeben, wobei man die einzelnen Substrate jedoch während einer gewissen Dauer nacheinander aus der Lösung herauszieht, kann man eine rohe quantitative Bestimmung der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins durchführen.
Da die Geschwindigkeit, mit der sich die Schicht aus spezifisch reagierendem Protein bildet, eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung ist, kann ein Vergleich der Diffusionszeiten für den Quecksilbertropfen durch die Proteinschichten auf einer Reihe von Substraten, die der Lösung, in der man das spezifisch reagierende Protein vermutet, verschiedene Zeiten ausgesetzt worden sind, eine rohe quantitative Angabe der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der entsprechenden Lösung ergeben.
In einer anderen verwandten Ausführungsform wird ein Substrat mit einem Metallfilm beschichtet, wie in Block 11 der Fig. 1 abgebildet und wie bei der letzten Ausführungsform beschrieben. Dann taucht man das Substrat in Lösungen ein, wie in den Blöcken 13 und 14 dargestellt und oben beschrieben. Die nächste Stufe nach dieser Ausführungsform besteht im Beschichten der oberen Proteinschicht mit einer zweiten Metallschicht, wie in Block 17 der Fig. 1 dargestellt, und dann wird die so erhaltene Struktur mit reflektiertem Licht betrachtet, wie in Block 21 der Fig. 1 dargestellt.
Das zweite Metall wird vorzugsweise durch Elektroplattieren aufgebracht. Im wesentlichen führt diese Ausführungsform zu einer Struktur, die als Diffraktionsraster arbeitet und der Unterschied zwischen einer monomolekularen und einer bimolekularen Protein-lsolationsschicht ist bestimmbar aus den Spektralanteilen, die im reflektierten Licht festgestellt werden können.
Figur 6 illustriert die Ausführungsform der erfindungsgemässen Apparatur für diese optische Bestimmungsmethode.
Eine metallische Oberfläche 81 eines Substrates, welches entweder ein metallisches Substrat oder ein mit einem Metallfilm beschichtetes nicht-metallisches Substrat sein kann, weist eine erste Proteinschicht 82 auf, die gemäss Block 13 der Fig. 1 aufgebracht worden ist. Das mit der Proteinschicht 82 bedeckte Substrat wird dann in die zu untersuchende Lösung eingetaucht und es bildet sich eine zweite Schicht 83 aus, mit dem Protein der Schicht 82 spezifisch rea- gierenden Protein darauf, wenn ein solches in der Lösung vorhanden ist. Es wird dann auf die freie Oberfläche des Proteinfilms eine zweite Metallisierung aufgebracht. Es wird eine sehr geringe Menge Metall aufgetragen, so dass die zweite Metallisierung in Form einer Vielzahl diskontinuierlicher metallisierter Bereiche erscheint, wie zum Beispiel den Bereichen 84 und 85 in Fig. 6.
Ein durch die Strahlen 86 repräsentierter Lichtstrahl wird dann auf den so vorbereiteten Objektträger gerichtet. Das Licht wird an den Metallgrenzen reflektiert. Der Abstand zwischen den reflektierenden Oberflächen der Metallsubstratoberfläche 81 und zum Beispiel den Teilchen der Metallisierung 84 ist eine Funktion der Dicke des Proteinfilms zwischen den Teilen 81 und 84.
Demgemäss variiert das beobachtete reflektierte Licht, das durch die Strahlen 87 illustriert ist, in der spektralen Zusammensetzung je nachdem ob die Proteinschicht eine monomolekulare oder eine bimolekulare Schicht ist.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die in der Fig. 1 in den Blöcken 12, 13, 14 und 18 beschriebenen Stufen. bei dieser Ausführungsform muss das Substrat ein lichtdurchlässiges Substrat sein, wie Glas, Kunststoff, gesintertes Siliziumdioxyd, Glimmer, Quarz und ähnliches und vorzugsweise wird Glas verwendet, wobei Objektträger ein bequem erhältliches Substrat darstellen, das zuerst mit einer Vielzahl von Metallkügelchen beschichtet wird, indem man ein Metall, zum Beispiel Indium, wie in Block 12 der Fig. 1 angegeben, durch Verdampfen auf das Substrat aufbringt. Das Indium zum Beispiel wird langsam aus einem Tantaltiegel in einem Vakuum von etwa 5x10-5 mm Hg auf das Glassubstrat aufgebracht.
Da die Indiumatome auf der Oberfläche des Substrates eine hohe Beweglichkeit haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Substrat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Jedes Metall, das ähnliche Eigenschaften hat und Kügelchen auf dem Substrat bildet, wenn es durch Aufdampfen dort aufgebracht wird, kann hier verwendet werden. Ausser Indium sind Gold, Silber, Zinn und Blei erfolgreich verwendet worden. Das Verdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat eine leicht bräunliche Farbe hat. Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallkügelchen Durchmesser in der Grössenordnung von 1000 . Die genaue Grösse der Kügelchen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben, die einem grossen Anteil der Wellenlänge des sichtbaren Lichtes entsprechen.
Beim nächsten Schritt wird das mit den Kügelchen bedeckte Substrat in eine Lösung eines ersten Proteins eingetaucht, wie in Block 13 der Fig. 1 dargestellt. Das erste Protein haftet wieder in einer monomolekularen Schicht an dem Substrat und den darauf befindlichen Metallkügelchen. Nachdem sich eine monomolekulare Proteinschicht gebildet hat, kann das beschichtete Substrat dazu verwendet werden, Lösungen auf die Anwesenheit eines mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden Proteins zu untersuchen, indem man das beschichtete Substrat in eine solche Lösung eintaucht, in der ein solches spezifisch reagierendes Protein erwartet wird, wie in Block 14 der Fig. 1 angegeben.
War das erwartete spezifisch reagierende Protein vorhanden, dann weisen das Substrat und die Metallkügelchen eine bimolekulare Proteinschicht auf; war das spezifisch reagierende Protein dagegen nicht vorhanden, dann werden das Substrat und die Metallkügelchen nur von einer monomolekularen Proteinschicht bedeckt. Das beschichtete Substrat wird dann entweder im reflektierten oder durchfallenden Licht betrachtet, wie in Block 18 der Fig. 1 angegeben und vom Aussehen des beschichteten Substrates hinsichtlich der Dicke der anhaftenden Proteinschicht und demgemäss der Anwesenheit oder Abwesenheit des erwarteten spezifisch reagierenden Proteins wird letzteres bestimmt. Der Nachweis der Proteinschichten beruht auf Änderungen des Farbtones des leicht braunen Substrates, die in dem beschichteten Substrat beobachtbar sind.
Diese Änderungen sind sehr ausgeprägt, und der Nachweis der Proteinschichten ist in diesem Falle ein sehr einfaches Verfahren. Die Teilchen allein auf dem Substrat erscheinen als ein erster Farbton von Braun, die mit einer monomolekularen Proteinschicht belegten Teilchen erscheinen als ein dunkleres Braun und die mit einer bimolekularen Proteinschicht belegten Teilchen erscheinen als ein noch dunklerer Braunton.
Dieses Nachweisverfahren beruht auf der Tatsache, dass elek- tromagnetische Strahlung in einem starken Masse durch leitende Kügelchen mit Durchmessern gleich einem grossen An teil einer Wellenlänge der einfallenden Energie zerstreut wird und dass im Falle des Zerstreuens durch solche Kügelchen das Zerstreuen stark durch eine dünne auf den Kügelchen befindliche dielektrische Schicht beeinflusst wird.
Fig. 5 zeigt eine Fotografie einer diagnostischen Apparatur gemäss der vorbeschriebenen Ausführungsform. Bei jeder Ansicht der Fig. 5 wird der Testobjektträger im durchfallenden Licht betrachtet. Ansicht 5a gibt einen Glasobjektträger mit Indiumkügelchen auf einer Oberfläche 100 des Objektträgers wieder. Die Ansicht 5b zeigt einen Objektträger der wie der Objektträger der Ansicht 5a zubereitet ist, dessen linke Kante jedoch in eine Lösung von Rinderserum-Albumin eingetaucht worden ist und dabei eine monomolekulare Schicht 101 des Rinderserum-Albumins adsorbierte. Die Ansicht 5c zeigt einen ähnlichen Objektträger dessen linke Kante in Rinderserum-Albumin eingetaucht wurde und die dabei eine monomolekulare Schicht 101 des Rinderserum-Albumins trägt.
Die untere Kante des Objektträgers in Ansicht 5c ist in eine Lösung von Eialbumin eingetaucht worden und weist demgemäss eine adsorbierte monomolekulare Schicht 102 aus Eialbumin auf. Es ist wichtig zu bemerken, dass das Aussehen der beschichteten Teile des Objektträgers der Ansicht 5b ähnlich ist und anzeigt, das nur eine monomolekulare Proteinschicht auf dem Objektträger vorhanden ist.
Dies demonstriert, dass das Rinderserum-Albumin und das Eialbumin zwar an dem Objektträger anhaften, dass das Eialbumin jedoch nicht an dem Teil des Objektträgers haftet, der zuvor mit dem Rinderserum-Albumin beschichtet worden ist. In anderen Worten illustriert die Ansicht 5c die oben genannte Feststellung, dass irgendein willkürlich ausgewähltes Protein zwar an einem Substrat haften wird, das jedoch ein Protein nicht an einem solchen Film aus einem willkürlich ausgewählten Protein haftet. Der Objektträger der Ansicht 5d wurde hergestellt, indem man die linke Kante in eine Rinderserum-Albuminlösung eintauchte, um darauf eine monomolekulare Schicht 101 davon aufzubringen.
Dann wurde die rechte Kante in eine Eialbuminlösung eingetaucht, um dort eine monomolekulare Schicht 102 aufzubringen und schliesslich wurde die untere Kante in eine Lösung eines gegenüber dem Rinderserum als Antiserum wirkenden Kaninchenserums eingetaucht. Demgemäss ist 103 eine monomolekulare Schicht von Kaninchen-Antiserum zum Rinderserum-Albumin.
Das Aussehen der unteren rechten Ecke zeigt an, dass das Kaninchen-Antiserum zum Rinderserum-Albumin nicht an der Eialbuminschicht 102 haftet, und demgemäss ist die untere rechte Ecke des Objektträgers der Ansicht 4d nur mit einer monomolekularen Schicht aus Eialbumin bedeckt Die untere linke Ecke der Ansicht 5d ist deutlich dunkler, was die Anwesenheit einer bimonolaren Proteinschicht an dieser Stelle anzeigt, die eine erste monomolekulare Schicht aus Rinderserum-Albumin, das zuerst daran absorbiert worden ist, umfasst, sowie eine zweite monomolekulare Schicht aus Kaninchen-Antiserum gegenüber dem Rinderserum-Albumin, das immunologisch mit dem darunterliegenden Rinderserum-Albumin komplexiert ist.
Es ist demgemäss zu sehen, dass nur das spezifisch reagierende Proteinpaar eine bimolekulare Schicht auf dem Objektträger bildete, während alle anderen Beschichtungen monomolekular waren.
Bei einer Modifikation dieser Ausführungsform, die ein medizinisches diagnostisches System schafft, wird das die Mc- tallkügelchen aufweisende Substrat teilweise bis zu einer er sten Tiefe in eine Lösung eines ersten Antigens eingetaucht.
Das Substrat wird in einer monomolekularen Schicht durch das erste Antigen in dem Bereich beschichtet, der in die Lö sung eingetaucht war. Dann trocknet man das Substrat und taucht bis zu einer zweiten Tiefe tiefer in eine Lösung eines zweiten Antigens ein. Das zweite Antigen haftet nicht an dem ersten Antigen, wohl aber an dem durch das erste Anti gen nicht bedeckten Teil des Substrates, der in die Lösung des zweiten Antigens eingetaucht wird. Danach trocknet man das Substrat wieder und taucht bis zu einer dritten und grösseren Tiefe in eine Lösung eines dritten Antigens ein.
Das dritte Antigen haftet an dem Teil und nur an dem Teil des Substrates, der noch nicht mit dem ersten oder zweiten Antigen bedeckt ist. Das Verfahren kann für irgendeine Zahl intressierender Antigene wiederholt werden. Man erhält ein Substrat, das mit einer Vielzahl von monomolekularen streifenförmigen Schichten verschiedener Antigene bedeckt ist.
Dieser beschichtete Objektträger ist das für diagnostische Zwecke einsetzbare Werkzeug. Bei dem medizinisch diagnostischen Verfahren wird dieser Objektträger in eine Probe von zum Beispiel Blut üblicherweise mehrere Stunden lang eingetaucht. Danach nimmt man den Objektträger aus der Probe heraus und betrachtet ihn nach dem Waschen in Wasser mittels reflektiertem oder durchfallendem Licht. Der Objektträger zeigt ein Muster hellerer und dunklerer Streifen, welche die in der Probe vorhandenen Antikörper anzeigen und gestattet so eine entsprechende medizinische Diagnose.
Fig. 2 gibt eine stark vergrösserte Seitenansicht eines Teiles des in der vorgenannten Ausführungsform dieser Erfindung beschriebenen diagnostischen Apparates wieder. Fig. 2 zeigt einen Teil des Substratmaterials 31 mit einer Vielzahl von darauf durch Verdampfen aufgebrachten Metallkügelchen 32. Die Teilchen 32 sind vorzugsweise durch Aufdamp fen von Indium auf das Substrat 31 hergestellt, wie oben be schrieben, doch können sie auch durch Verdampfen von Gold, Silber, Zinn, Blei oder eines anderen Metalles hergestellt sein, das ähnliche nicht benetzende und eine atomare
Beweglichkeit aufweisende Eigenschaften hat. Irgendeines einer grossen Zahl von Metallen zeigt solche Eigenschaften, wenn die Temperatur des Substrates verändert wird.
Nach dem Eintauchen in eine Lösung eines ersten Proteins wird das Segment des Objektträgers, der das Substrat 31 und die
Metallkügelchen 32 umfasst, mit einer monomolekularen
Schicht von Molekülen 34 des ersten Proteins bedeckt, wie in Fig. 2 allgemein bei 33 angegeben. Der mit 33 bezeich nete Apparat ist das diagnostische Instrument, das zum Un tersuchen von Lösungen auf die Anwesenheit des mit den
Proteinmolekülen 34 spezifisch reagierenden Proteins ver wendet wird.
Wird der allgemein mit 33 bezeichnete Appa rat dem mit dem Protein der Moleküle 34 spezifisch reagie renden Protein ausgesetzt, dann nimmt der Apparat ein Aus sehen an, wie es allgemein bei 35 gezeigt ist, bei dem das
Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 mit einer bimolekula ren Proteinschicht bedeckt sind, welche die Moleküle 34 des ersten Proteins, die die erste monomolekulare Schicht auf dem Substrat 31 und den Kügelchen 32 bilden und eine zweite monomolekulare Schicht eines Proteins aus den Mole külen 36 des mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden
Proteins umfasst, wobei die Moleküle 36 immunologisch mit den Molekülen 34 des ersten Proteins verbunden sind und diese erste Proteinschicht, die Metallkügelchen und das Sub strat überlagern.
Fig. 7 illustriert eine Modifikation dieser Ausführungs form, die einen vergrösserten Kontrast in dem beschichte ten diagnostischen Objektträger schafft. In Fig. 7 wird der
Objektträger 31, der Metallkügelchen 32 darauf trägt und mit Proteinmolekülen 34 beschichtet ist, wie in Fig. 2 einge taucht in eine Menge 71 einer lichtreflektierenden Flüssig keit, wobei die beschichtete Seite nach unten gerichtet ist.
Der Objektträger 31 wird dann von seiner oberen Oberflä che mit reflektiertem Licht betrachtet. Um eine totale Reflek tion des auf den diagnostischen Apparat der Fig. 7 einfallen den Lichtes zu schaffen, ist die reflektierende Flüssigkeit 71 vorzugsweise eine metallische Flüssigkeit und besonders be vorzugt Quecksilber. Wird eine nicht-metallische Flüssigkeit verwendet, dann werden die optischen Einfalls- und Betrach tungswinkel bei Verwendung der Ausführungsform der
Fig. 7 kritisch, wenn Totalreflektion beobachtet werden soll.
Das Aussehen eines Testobjektträgers, der gemäss dieser
Lehre betrachtet wird, ist ähnlich dem in Fig. 5 gezeigten, je doch mit einem verbesserten Kontrast.
Fig. 3 ist eine stark vergrösserte Seitenansicht des Apparates, der für diagnostische Zwecke und für die Reinigung und Konzentrierung von Proteinen und Antikörpern gemäss einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung brauchbar ist. Mit 40 ist allgemein ein Substrat 41 bezeichnet, das mit einer monomolekularen Schicht von Proteinmole külen 42 bedeckt ist, wobei die Einheit 40 in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurde. Mit 43 ist allgemein das Substrat 41 und die Proteinschicht 42 bezeichnet, mit der immunologisch eine zweite monomolekulare Schicht von Proteinmolekülen 44 des mit den Molekülen 42 spezifisch reagierenden Proteins verbunden ist, wobei diese Einheit 43 gemäss den oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Ein zweites Substrat 45 weist einen Tropfen 46 einer Lösung einer schwachen Säure auf.
Die sich gegenüberstehenden Oberflächen der Substrate 41 und 45 mit einer bimolekularen Proteinschicht bzw. einem Tropfen schwacher Säure darauf, der zum Beispiel eine 0,1 normale Zitronensäurelösung sein kann, werden dann physikalisch miteinander in Kontakt gebracht. Gemäss einer erfindungsgemässen Feststellung der vorliegenden Erfindung trennt der Tropfen 46 der schwachen Säure die immunologischen Bindungen zwischen den Molekülen 42 und den Molekülen 44, ohne die biochemischen Eigenschaften der Proteine zu beeinflussen und ohne die Adhäsionsbindung zwischen den Molekülen 42 des ersten Proteins und dem Substrat 41 zu trennen.
Wenn die Substrate 41 und 45, wie bei 47 gezeigt, getrennt sind, dann haftet an dem Substrat 41 eine monomolekulare Schicht der Moleküle 42 des ersten Proteins und an dem Substrat 45 haftet eine monomolekulare Schicht der Moleküle 44 des spezifisch reagierenden Proteins. Das Substrat 41 mit den Molekülen 42 darauf kann dann erneut für das genannte Verfahren verwendet werden, wobei wieder ein Substrat erhalten wird, das mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Proteins bedeckt ist oder man kann das Substrat 41 mit den Molekülen 42 darauf als Testobjektträger gemäss einer der anderen Ausführungsformen der Erfindung verwenden.
Das Substrat 45 mit den daran haftenden Molekülen 44 des spezifisch reagierenden Proteins kann dann gemäss den oben beschriebenen weiteren Ausführungsformen der Erfindung als Objektträger für die Untersuchung von Lösungen auf die Anwesenheit von Molekülen seines entsprechenden ersten Proteins verwendet werden. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als besonders bedeutend angesehen, da, wie bereits ausgeführt wurde, im Falle der üblichen Proteine von biologischem Interesse, Antigene ziemlich leicht in gereinigter Form erhältlich sind und so auf einem Substrat adsorbiert werden können und einen Testobjektträger für den Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern in Lösungen bilden, Antikörper jedoch nicht so erhältlich sind.
Demgemäss war es vor dieser Erfindung im allgemeinen nicht möglich, Testobjektträger für die Untersuchung von Lösungen auf die Anwesenheit von Antigenen her- zustellen. Das Verfahren und der Apparat, wie in Fig. 3 darge stellt, schaffen jedoch Testobjektträger, die ein Substrat 45 umfassen, das mit einer monomolekularen Schicht von zum Beispiel Antikörpermolekülen 44 bedeckt ist und das zur Untersuchung von Lösungen auf die Anwesenheit von Antigen verwendet werden kann.
Eine andere Ausführungsform eines diagnostischen Apparates nach der vorliegenden Erfindung ist strukturell in Fig. 9 gezeigt, und sein Betriebsprinzip ist grafisch in Fig. 8 illustriert. Die Apparatur nach Fig. 9 umfasst ein Goldsubstrat 91, das aus wirtschaftlichen Gründen vorzugsweise aus einem mit einer dünnen Goldschicht versehenen anderen Metall besteht und auf dem eine monomolekulare Schicht 92 eines ersten Proteins adsorbiert ist. Gold hat ein Absorptions.
band innerhalb des sichtbaren Spektrums. Diese Tatsache ist für die charakteristische Goldfarbe verantwortlich und ermöglicht diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Fig. 8 illustriert den Betrieb dieser Ausführungsform und gibt eine Reihe von Reflektivitätskurven wieder, bei denen die relative Reflektivität als Funktion der Wellenlänge aufgetragen ist. Die Kurve 93 repräsentiert die Reflektivität von Goldmetall. Die Kurve 94 gibt die Reflektivität von Goldmetall wieder, das eine monomolekulare Proteinschicht aufweist. Kurve 95 zeigt die Reflektivität von Goldmetall mit einer bimolekularen Proteinschicht darauf. Ein Goldsubstrat, wie 91, hat in Übereinstimmung mit Kurve 93, die leuchtend gelbe Farbe des Goldmetalles. Wird die Testproteinschicht 92 auf das Substrat 91 aufgebracht, dann hat die Testplatte gemäss Kurve 94 ein dunkelgelbes Aussehen.
Nachdem die Testplatte einer Lösung ausgesetzt worden ist, in der man das mit dem Protein der Schicht 92 immunologisch reagierende Protein vermutet, dann weist die Testplatte, wenn ein solches spezifisch reagierendes Protein in der Lösung vorhanden war und die Platte demzufolge eine bimolekulare Protein schicht trägt, eine Reflektivitätscharakteristik, wie sie in Kurve 95 gezeigt ist, auf, und die Platte hat ein deutlich grünes Aussehen.
Nach bisher durchgeführten Versuchen scheinen die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die ein Substrat mit Metallkügelchen und ein Goldsubstrat verwenden, die im allgemeinen brauchbarsten zu sein. Weiter wurde festgestellt, dass diese beiden Ausführungsformen unterschiedliche Empfindlichkeiten haben in Abhängigkeit von den Dicken der interessierenden Proteinfilme. Im einzelnen weist die Ausführungsform mit einem Substrat und Metallkügelchen die grösste Empfindlichkeit auf, wenn die Filmdicken unterhalb von etwa 200 Ä liegen. Das Goldsubstrat hat die grösste Empfindlichkeit für Filme, die eine Dicke von 30 übersteigen.
In einem diagnostischen Verfahren, das gemäss der vorliegenden Erfindung ausgeführt worden ist, wurden Glasobjektträger mit einer dünnen Indiumsschicht bedeckt und mit einer Goldschicht überschichtet. Die Verwendung einer Indiumunterschicht war erforderlich, um die Adhäsion zwischen Glas und Gold zu verbessern. Es wurde weiter festgestellt, dass die Diffusion des Indiums in die darüberliegende Goldschicht die optischen Charakteristiken der Testobjektträger verbesserte. Die so vorbereiteten Objektträger wurden mit einer monomolekularen Schicht des mit der Hepatitis verbundenen Antigens bedeckt.
Proben menschlichen Blutes, die auf die Anwesenheit von Hepatitis zu untersuchen waren, wurden durch Einmischen einer Menge Antikörper ge genüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen zubereitet, wobei eine ausreichende Menge der Antikörper verwendet wurde, um immunologisch aus der Mischung entfernt zu werden, wenn das mit der Hepatitis verbundene Antigen in der Probe vorhanden ist. Dann wurden die Testobjektträger in die so vorbereiteten Blutproben eingetaucht. Nach dem
Herausnehmen wiesen die in die Hepatitis-negativen Proben eingetauchten Objektträger eine bimonokulare Protein schicht auf, die das zuerst aufgebrachte mit der Hepatitis ver bundene Antigen umfassten und eine zweite Schicht von An tikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen An tigen, die immunologisch damit verbunden waren, wie ein grüngefärbter Streifen auf dem Objektträger zeigt.
Die Ob jektträger, die in Hepatitis-positive Proben eingetaucht waren, hielten ihre ursprüngliche dunkelgelbe Färbung bei, und dies zeigt an, dass nur die monomolekulare Schicht aus mit der Hepatitis verbundenem Antigen auf dem Objektträ ger vorhanden war, während die in die Probe eingebrachten
Antikörper durch Komplexbildung mit dem darin enthalte nen Antigen aus der Probe ausgefallen waren und nicht mehr mit dem Antigen auf dem Testobjektträger reagieren konnte.
Es zeigt sich, dass der oben beschriebene Test ein Inhibitionstest ist In einem anderen diagnostischen Verfahren wurde ein direkter Test gemäss der vorliegenden.Erfindung durchgeführt. Bei dem direkten Test wurden Objektträger aus Glas-Indium-Gold und wie oben beschrieben vorbereitet, und dann mit einer monomolekularen Schicht aus Antikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen beschichtet. Einige der Objektträger wurden dann in Serum eingetaucht, dass von Hepatitispatienten entnommen war und von dem man daher wusste, dass es das mit der Hepatitis verbundene Antigen enthält. Andere Objektträger wurden in Serumproben eingetaucht, von denen man wusste, dass sie frei sind von dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen.
Wie erwartet, wiesen die in das Hepatitisserum eingetauchten Objektträger eine bimolekulare Proteinschicht auf, während die in das Hepatitisfreie Blut eingetauchten Objektträger nur eine monomolekulare Schicht aufwiesen.
Theoretisch ist der eben beschriebene direkte Test das bevorzugte diagnostische Verfahren sowohl wegen seiner relativen Einfachheit, als auch weil in diesem Falle der direkte Test eine höhere Empfindlichkeit hat als der Inhibitionstest.
Die höhere Empfindlichkeit des direkten Tests resultiert aus der Tatsache, dass die mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle sehr viel grösser sind als die Moleküle des Antikörpers gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen. Daher bewirkt der direkte Test, eine sehr viel grössere prozentuale Änderung der Filmdicke und demgemäss ist ein grösserer Kontrast beobachtbar.
Die Konzentration des mit der Hepatitis verbundenen Antigens im Blut einer Person, die der Krankheit ausgesetzt ist, ist eine Funktion der Zeit. Die Konzentration des Hepatitisantigens ist sehr hoch, während der klinischen und unmittelbar vor klinischen Phasen der Hepatitis. In den weit nachklinischen Phasen ist die Konzentration des Hepatitisantigens im Blut einer Person jedoch sehr gering. Beide Zustände sind medizinisch von Interesse. Der Nachweis des Antigens während der klinischen und unmittelbar vorklinischen Phasen ist für Diagnosezwecke wertvoll. Der Nachweis des Antigens in der weit nachklinischen Phase ist für die Untersuchung des Blutes von in Aussicht genommenen Blutspendern wertvoll.
Der einfacherere empfindliche direkte Test ist daher für diagnostische Zwecke bevorzugt, da er leicht durchgeführt werden kann, wegen der relativ hohen Konzen tration des Hepatitisantigens in der Blutprobe.
Der für Überprüfungszwecke beschriebene Inhibitionstest ist experimentell ausgewertet worden, um seinen Wert relativ zu anderen bekannten Überprüfungstests zu bestimmen. In diesen Tests wurde das Hepatitis-positive Serum mit bekanntem Hepatitis-negativem Serum verdünnt. Unter Anwendung der oben beschriebenen Inhibitionsprozedur führte eine Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Serums mit 32 Teilen bekannten Hepatitis-negativem Serum zu einem zuverlässigen Nachweis während einer Stunde. Die Anwen dung einer Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Se rums mit 3000 Teilen bekannt negativem Serums, ergab einen zuverlässigen Nachweis während 24 Stunden. Diese Er gebnisse erweisen sich als sehr ähnlich in der Empfindlich keit bzw. der erforderlichen Zeit wie das bekannte Verfah ren der Gegenelektrophorese bzw. der Radioimmunisierung.
Ein Überprüfungsverfahren gemäss der vorliegenden Erfin dung ergibt also Resultate, die vergleichbar sind mit den be sten nach bekannten Verfahren erhältlichen, wobei ein zu sätzlicher Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens der eines beträchtlich billigeren Verfahrens ist
Die bevorzugte Verwendung eines goldbeschichteten Sub strates gegenüber einem mit Metallkügelchen beschichteten
Substrat bei dem vorbeschriebenen diagnostischen Hepatitis Verfahren ist durch den Durchmesser der Hepatitis-Antigenmoleküle bedingt, der bei etwa 210 Ä liegt. Solche Filmdikken liegen gut im Bereich der Möglichkeiten goldbeschichteter Substrate, um eine empfindliche Anzeige zu geben, doch sind sie zu dick für eine hochempfindliche Anzeige unter Verwendung mit Metallkügelchen beschichteten Substrats.
In Fig. 4 ist ein Apparat gemäss einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern in einem mechanischen schematischen Diagramm dargestellt.
Zur Erleichterung des Verständnisses der Ausführungsform der Fig. 4 sei darauf hingewiesen, dass der im Betrieb befindliche Anfang der Ausführungsform der Fig. 4 eine Modifikation der Ausführungsform der gerade besprochenen Fig. 3 ist. In Fig. 4 wird ein kontinuierlicher flexibler Gurt aus Substratmaterial 51, welches mit einer monomolekularen Proteinschicht bedeckt ist, das spezifisch mit dem zu konzentrierenden und reinigenden Protein reagiert, zuerst in einen Behälter 52 eingeführt, der eine gewisse Menge Flüssigkeit 53 enthält, in der sich das zu reinigende Protein befindet.
Das immunologische Komplexieren zwischen den beiden spezifisch miteinander reagierenden Proteinen findet im Behälter 52 statt, und dann gelangt der Substratgurt 51, der nun eine bimolekulare Proteinschicht aufweist, in den Behälter 58, in dem sich eine Lösung 59 einer schwachen Säure befindet, welche die immunologische Bindung zwischen den beiden spezifisch miteinander reagierenden Proteinen trennt und dabei die Moleküle der zweiten Proteinschicht in der Lösung 59 sammelt. Nach dem Verlassen des Behälters 58 befindet sich daher auf dem Substrat 51 wieder nur die ursprüngliche monomolekulare Proteinschicht. Das Substrat 51 wird dann in den Behälter 52 zurückgeführt, um wieder eine monomolekulare Schicht des zu sammelnden Proteins aufzunehmen, welche wieder im Behälter 58 abgelöst wird.
Der Gurt 51 wird mittels der Gurtantriebsachsen 60 und 63, die mit den entsprechenden Klemmrollen 61 und 62 zusammenarbeiten, durch die Lösungen 53 und 59 geführt. Die Gurtantriebsachsen 60 und 63 können mit jeder geeigneten Einrichtung angetrieben werden, die zweckmässigerweise kleine elektrische Motoren umfassen kann, die mit den Gurtantriebsachsen 60 und 63 durch die Geschwindigkeit verringernde Getriebe verbunden sein können. Da die immunologische Komplexierungsreaktion sehr viel langsamer vor sich geht als die die Bindungen trennende Säureeinwirkung, ist es zweckmässig, dass der beschichtete Substratgurt 51 für eine sehr viel längere Zeit in Kontakt mit der das zu sammelnde Protein enthaltenden Lösung 53 ist als mit der die schwache Säure enthaltenden Lösung 59.
Es ist demgemäss zweckmässig, dass der Behälter 52 beträchtlich grösser ist als der Behälter 58 und dass eine Vielzahl von oberen und unteren Leitrollen 54 bzw. 55 verwendet werden, um den Gurt 51 vielfach durch die Lösung 53 zu führen. Auf diese Weise befindet sich der Gurt 51 zu irgendeiner Zeit mit einer grösseren Länge in Kontakt mit der Lösung 53, und auf diese Weise ist irgendein Segment des Gurtes 51 eine längere Zeit der Lösung 53 ausgesetzt. Andererseits ist ein einziger Durchgang des Gurtes 51 durch die Säurelösung 59 völlig ausreichend, um die zweite Proteinschicht davon abzulösen. Daher ist lediglich ein Paar oberer Leitrollen 56 und eine einzige Leitrolle 57 für die Führung des Gurtes 51 durch die Säurelösung vorgesehen.
Eine Vielzahl von Leitrollen 64 ist vorgesehen, um dem Gurt 51 während seines Ueberganges zwischen den Behältern 52 und 58 die erforderliche mechanische Abstützung zu geben. Die Behälter 52 und 58 sind vorzugsweise mit Rühreinrichtungen 85 bzw. 66 versehen, die flüssigkeitsdicht durch die Wände der entsprechenden Behälter hindurchgeführt-sind, um die Lösungen 53 bzw. 59 zu rühren und so eine Erneuerung der Lösungen zu bewirken, die sich in Kontakt mit dem Gurt 51 befinden. Der Behälter 52 ist mit einem Abzugsrohr 67 versehen, das durch das Ventil 68 gesteuert wird und durch das die Lösung 53 abgelassen werden kann, wenn man die Konzentration des erwünschten Proteins bis zu einem Punkt verringert hat, bei dem eine weitere wirksame Aufnahme nicht mehr möglich ist.
Eine frische Probe der Lösung 53 kann dann durch den oberen offenen Teil in den Behälter 52 eingefüllt werden. Auch der Behälter 58 ist mit einem Abzugsrohr 69 versehen, das durch das Ventil 70 gesteuert wird und durch das die Lösung des gereinigten Proteins in der schwachen Säure abgezogen werden kann, wenn die gewünschte Konzentration erreicht ist.
Eine frische Säurelösung kann dann ähnlich durch das obere offene Ende in den Behälter 58 eingefüllt werden. Wie oben im Zusammenhang mit Fig. 3 beschrieben, kann der Substratgurt 51 mit jedem gewünschten Protein, sei es ein Antigen oder ein Antikörper, beschichtet werden. Verfahren und Apparat der Fig. 4 sind daher für das Sammeln einer gereinigten Konzentration irgendeines erwünschten Proteins geeignet, solange eine immunologische Reaktion mit dem gewünschten Protein vorhanden ist. Durch leichtes Modifizieren seiner Wirkungsweise kann der Apparat der Fig. 4 auch dazu verwendet werden, selektiv ein spezifisch unerwünschtes Protein aus einer Mischung, wie einem Serum, zu entfernen.
Um dies zu bewirken, lässt man den Apparat der Fig. 4 einfach für eine längere Zeit ohne Erneuerung der Lösung 53 und mit periodischen Erneuerungen, soweit sie erforderlich sind, der Lösung 59 laufen. In diesem Falle wird beim Ab zugsrohr 67 das Serum 53 erhalten, aus dem das unerwünschte Protein bis zu jedem erforderlichen Grad, abhängig nur von der Betriebszeit des Systems, entfernt worden ist.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Lösung gemäss dem Patentanspruch I des Hauptpatentes, dadurch gekennzeichnet, dass man ein die Platte aus lichtdurchlässigem Material schlecht benetzendes Metall aufbringt und dass man zur Prüfung, ob an der Platte eine bimolekulare oder monomolekulare Proteinschicht haftet, die Platte mit der Metall- und Proteinschicht nach unten auf die Oberfläche einer Flüssigkeit aufbringt.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man auf die Platte Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei aufdampft.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit eine metallische Flüssigkeit, vorzugsweise Quecksilber, ist und die Platte visuell mit reflektiertem Licht geprüft wird, während sie sich in Kontakt mit der metallischen Flüssigkeit befindet.
PATENTANSPRUCH 11
Vorrichtung nach Patentanspruch 11 des Hauptpatentes zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch I hiervor, gekennzeichnet durch ein Substrat mit einer Vielzahl von an der Oberfläche des Substrats haftenden Kügelchen aus einem Metall, das das Substrat schlecht benetzt, und einer monomolekularen Schicht eines immunologisch reaktiven Proteins, die mindestens einen Teil des Substrats und der Metallkügelchen bedeckt.
UNTERANSPRÜCHE
3. Vorrichtung gemäss Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Vielzahl monomolekularer Schich
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
Claim I of the main patent relates to a method for the detection of a specific protein in a solution, whereby a metal is applied to a plate made of light-permeable material, the coated plate by immersion in a solution of a protein with a monomolecular layer that reacts specifically with the protein to be detected This specifically reacting protein is covered, the plate treated in this way is immersed in the solution to be examined and finally it is checked whether a bimolecular or monomolecular protein layer adheres to the plate.
Claim II of the main patent relates to a device for carrying out said method, which has a substrate with a plurality of metal spheres adhering to a surface of the substrate, and a monomolecular layer of an immunologically reactive protein, which comprises at least part of the substrate and the metal spheres covered.
The present invention relates to an improvement of this method, which consists in applying a metal which poorly wets the plate made of translucent material and in checking whether a bimolecular or monomolecular protein layer is adhered to the plate with the metal and protein layer down onto the surface of a liquid, preferably a metallic liquid, in particular mercury.
Immunological reactions are highly specific biochemical reactions in which a first protein called an antigen combines with a second protein which is specific for this antigen and whose antibody is called, with an immunologically complexed protein being formed. Immunological reactions that take place within a biological system, such as an animal living being, are of great importance for the animal in combating disease. In a biological system, the entry of a foreign protein, that is to say the antigen, causes the biological system to generate the antibody proteins specific for the corresponding antigen in a process which is not yet fully understood.
The antibody protein molecules have available chemical binding sites that complement those on the antigen molecule, and so the antigen and antibody can chemically combine to form an immunologically complexed protein.
Since antibodies are generated by biological systems in response to invasion of foreign proteins, the detection of antibodies present in a biological system is of medical diagnostic value in determining the antigens to which the system has been exposed. Conversely, the detection of certain antigens in a biological system also has medical diagnostic value. Examples of the diagnostic detection of antigens are the detection of HCG protein molecules in the urine to determine the pregnancy and the detection of the hepatitis-related antigen molecules in the blood of prospective blood donors.
In order to be able to carry out such diagnostic examinations, the suitable protein of at least one immunologically reacting couple must be available in concentrated, purified form. The only known source of antibody proteins is a living biological system. Furthermore, only vertebrates are known to date that they encounter the introduction of a foreign protein with immunological reactions. For example, many antibodies have been found in the blood serum of animals that have been exposed to the corresponding antigens. However, the blood serum is a very complex mixture in which the required antibodies occur in very low concentrations in the presence of a large number of other components. Many antigens, on the other hand, can be produced in a controllable manner in laboratory cultures.
However, some antigens, such as the hepatitis-related antigen, are currently, like antibodies, only available from higher living biological systems.
As presently practiced, both the collection, purification and diagnostic use of immunologically active proteins are based on the precipitation or agglutination properties characteristic of the proteins resulting from the immunological complexation reaction. The classic example of these diagnostic uses is the blood group determination method in which blood samples are mixed with serum antibodies of type a and Q and the blood group is determined by detecting any agglutination in the blood samples.
The HCG protein pregnancy determination as it is currently carried out is an inhibition test that is carried out by mixing a quantity of the HCG antiserum into a urine sample. A large number of polystyrene beads that have been coated with HCG protein are introduced into a urine sample prepared in this way.
The polystyrene balls agglutinate if, but only if no HCG protein is present in the sample. If no HCG protein is present in a urine sample, the HCG protein forms complexes on the polystyrene balls with the HCG antiserum previously introduced into the urine sample and the balls agglutinate. On the other hand, if HCG protein is present in the urine sample, then this forms a complex with the previously introduced HCG antiserum which precipitates out of the sample, so that the previously introduced serum is no longer available for complex formation with the HCG protein on the spheres and so cannot cause agglutination of the balls.
According to the teaching of the present invention, the known pregnancy determination via the HCG protein can be simplified by allowing the HCG antiserum to adhere to the polystyrene beads and examining a urine sample directly. In this case, the polystyrene beads would agglutinate if, but only if in the Sample HCG protein is present.
It appears that the reason this simpler method has not been used is that the available HCG antisera are complex mixtures containing a large proportion of ingredients other than HCG antibodies. The additional effort that is required according to the known method to extract the antibodies from the HCG antisera means that the sera have so far been used directly for the inhibition test. In accordance with one embodiment of the present invention, a procedure is provided by which HCG antibodies are effectively separated from sera and this procedure further creates a diagnostic device with which the simpler direct test can be carried out.
Each antigen molecule typically forms complexes with a large number of antibody molecules that may be linked to different particles, thereby forming visible clumps of, for example, coated polystyrene beads or red blood cells. One shortcoming of agglutination studies is that the particles involved can agglomerate for any of a variety of reasons unrelated to immunological agglutination, thereby reducing the reliability of the study. Agglutination examinations are usually carried out with the greatest care by trained specialists, but nevertheless diagnostic errors occasionally occur.
In the current process for obtaining purified concentrations of antibodies, the introduction of the antigen into the animal system first stimulates the production of antibodies in an animal living being, then blood serum, which contains the antibodies in highly diluted form, is taken from the animal and a certain amount of the specific is mixed Antigen with the serum.
The mixture of antigen and antibody forms complexes and precipitates out of the serum solution. The remaining components of the serum are drawn off and the precipitate of antibody and antigen is dissolved in an acid which separates the complex bonds. This gives a solution of the antigen and antibody molecules in the acid. Since the antibody and antigen molecules have different physical properties, for example different weights, they can be separated from one another mechanically, for example by centrifugation.
It is known that the antibody-antigen complexation reaction occurs when an antigen is absorbed on a surface. The complexation reaction on a surface was observed using an ellipsometer. An ellipsometer is a complex optical instrument that is especially useful for determining the ellipticity of polarized light, with the aid of which one can measure film thicknesses in the order of 0.1 Å. Ellipsometers are expensive and require trained operators. In investigations of immunological reactions using ellipsometers, as far as they have been carried out so far, two methods have been used. In one method, the reaction to be investigated was allowed to proceed and then the slide on which the reaction had taken place was placed in an ellipsometer to determine the film thickness.
In the other method, the slide was fixed in the ellipsometer from the start and the film thickness was observed with the ellipsometer, which changed with the progress of the immunological reaction. The determination of the absolute thickness requires extreme care. On the other hand, if the concentration of the antibodies in the solution is low, the measurement of the actual change in thickness, although easier to perform than the determination of the absolute thickness, takes a long time. Therefore, for economic reasons, the detection of immunological reactions on a surface using an ellipsometer has not been used for diagnostic purposes.
The present invention includes the determination that any arbitrarily selected protein will only be absorbed on a substrate in a monomolecular layer and that a specific antibody (or antigen) for such an arbitrarily selected protein will combine with it to form a bimolecular protein layer on the substrate becomes. The objects of the present invention therefore include the application of this finding for creating a method for use in medical diagnostics and in pharmacological applications, as well as the device for carrying out the method.
It is therefore a primary object of the present invention to provide methods and apparatus for the economical detection of immunological reactions which take place on a surface.
Another object of the present invention is to provide such a method and apparatus in which the immunological reactions are electrically detectable.
Another object of the present invention is to provide such a method and apparatus by which immunological reactions can be detected by direct visual observation.
A second primary object of the present invention is to provide methods and apparatus for the concentration and purification of proteins and antibodies by means of controlled immunological reactions that take place on a surface.
Briefly, and in accordance with two embodiments of the present invention, a plate of substrate material is first immersed in a solution of a first protein so that a monomolecular layer of the first protein is adhered to the substrate. The substrate coated with the first protein is then immersed in a second solution which, according to a first embodiment of the invention, is known to contain a protein which reacts specifically with the first protein and which, in a second embodiment, is suspected to be a contains protein reacting specifically with the first protein. The specifically reacting protein and only the specifically reacting protein forms a second monomolecular layer which overlays the monomolecular layer of the first protein on the substrate.
Then, according to a first embodiment of the invention, the substrate covered with two monomolecular layers is immersed in a solution of a weak acid which separates the immunological bond between the two protein layers and for the collection of the specifically reacting protein in a purified form in a solution of a weak acid cares. In a second embodiment of the present invention, after it has been immersed in the solution in which one suspects a specifically reacting protein, the coated substrate is examined electrically or optically in order to determine whether a bimolecular or a monomolecular protein layer is adhering to the substrate this is used to determine whether or not the second solution contained the protein that specifically reacts with the first protein.
The invention is explained in more detail below with reference to the drawing, with further objects and advantages becoming apparent. Show in detail:
1 shows a flow chart for the method stages of the various embodiments of the invention,
2 is a side view of the diagnostic apparatus according to an embodiment of the present invention, illustrating the method for its manufacture and use,
3 shows a side view of an apparatus suitable for diagnostic purposes and for the purification and concentration of antibodies according to another embodiment of the present invention,
4 shows a mechanical schematic diagram of the apparatus according to an embodiment of the present invention for the concentration and purification of proteins and antibodies,
Fig.
5 is a photograph illustrating the operation of the diagnostic device according to the invention;
6 shows a side view of another embodiment of a diagnostic apparatus according to the invention,
7 shows a side view of a diagnostic device according to the invention, which illustrates a modification of the method using the device according to FIG. 2,
8 shows a graphical representation of the operating principle of the embodiment of a diagnostic apparatus according to the invention shown in FIG. 9, and FIG
9 shows a side view of a further embodiment of the diagnostic apparatus according to the invention.
Fig. 1 is a flow chart again showing the individual process stages in the implementation of the present invention. When reading the flow chart from top to bottom, each vertical step represents a step in the process that follows in time. The individual horizontally arranged steps at a given vertical height in the flow chart show the alternative possibilities for one of the specified steps according to the various embodiments of the invention.
According to a first embodiment of the invention, the method begins with block 13 of FIG. 1, in which a plate of a substrate material, which can be metal, glass, mica, plastic, sintered silicon dioxide, quartz or a similar material, metal being preferred, since it has the greatest difference in refractive index versus protein, and preferably a metallized glass slide is immersed in a solution containing a first protein of interest which can biologically be an antigen or antibody and which is available in relatively concentrated solution and which can be used is intended to detect or purify its corresponding specifically reacting protein, the latter being biologically an antibody or an antigen. The first protein is adsorbed on the substrate in a monomolecular layer.
Each protein is adsorbed in such a monomolecular layer, with no further adsorption taking place. This means that the protein adheres to the substrate, but not to itself.
After a monomolecular layer of the protein has formed on the entire surface of the substrate, the coated substrate is removed from the solution of the first protein. The time required for the substrate to be fully coated is a function of the concentration of the protein in the solution and the degree to which the solution is agitated. For example, a 1 / O solution of bovine serum albumin completely coats a slide with a monomolecular protein layer in about 30 minutes.
In the next step, which is shown in block 14 of FIG. 1, the protein-coated substrate is immersed in a solution in which one suspects the protein specifically reacting with the first protein. This solution can, and usually does, contain many components apart from the specifically reacting protein, the presence of which one wishes to prove. However, no protein other than a specifically reacting protein will adhere to the first protein layer on the substrate. Accordingly, if the specifically reacting protein is not present, the substrate still only has a monomolecular protein layer after immersion in the second solution.
If, on the other hand, the specifically reacting protein is present in the solution, an immunological complexing takes place between the first protein and its specifically reacting protein and the substrate bears a bimolecular protein layer after a certain time. It should be noted that the steps shown in blocks 13 and 14 of FIG. 1 are the same for all embodiments of the invention. The time required for the adhesion of a complete second molecular layer to the coated substrate is again a function of the concentration of the specifically reacting protein in the solution. For antibodies in blood serum, this time can be up to 1 day.
According to one embodiment of the present invention, in the next step, the coated substrate is immersed in a solution of a weak acid, as shown in block 15 of FIG. 1, while at the same time viewing the coated substrate in an ellipsometer, as in block 22 of FIG Fig. 1 illustrates. While the formation of the layer of the specifically reacting protein on the substrate coated with the first protein can take a long time, the weak acid dissolves the immunological bond between the two proteins very quickly.
Accordingly, the observation with the ellipsometer can be directed to the relatively simple observation of the change in film thickness instead of the more complicated measurement of the absolute film thickness. The observation of the detachment of the layer of specifically reacting protein by the weak acid is possible very much more quickly than in the known method the observation of the structure of the layer of the specifically reacting protein.
Therefore, a large amount of slides can be made according to block 13, and each of them can be exposed to one of a large variety of serum samples as shown in block 14, and then in a short time each slide can be mass-produced according to the steps of the blocks 15 and 22 to determine which of the serum samples contained the protein specifically reacting with the first protein. Since the acid does not detach the first protein from the substrate, those coated substrates that were immersed in solutions without a specifically reacting protein will not change the Show film thickness when immersed in an acid and observed in an ellipsometer.
On the other hand, the slides immersed in a solution containing the specific reacting protein show about a factor of 2 to 5 in change in thickness when immersed in an acid and observed in an ellipsometer. Every examination with the ellipsometer can be carried out in a few minutes, and this creates an effective and diagnostically important examination method.
A second closely related embodiment of the present invention for the concentration and purification of proteins comprises the steps shown in blocks 13, 14, 15 and 23 of FIG. The substrate is first immersed in a solution of the available protein from the antigen-antibody pair, as shown in block 13.
Usually this will be the antigen, but the present invention does not depend on the biological identity of the first protein. The coated substrate produced according to block 13 of FIG. 1 is then immersed in a solution which contains the protein which reacts specifically with the first protein, as shown in block 14. In the usual case, the specifically reacting protein is an antibody and the solution used in block 14 is the blood serum of an animal which has been exposed to the first protein. The substrate, which is now covered with a bimolecular protein layer, is next, as shown in block 15 of FIG. 1, immersed in a weak acid which separates the layer of the specifically reacting protein from the first protein layer.
The substrate is then coated with a monomolecular layer of the first protein, and there is a purified solution of the specifically reacting protein in the weak acid.
The next stage, shown in block 23 of FIG. 1, is the return of the substrate provided with the adhering first protein layer into the solution which contains the specifically reacting protein in order to take up a second layer which is then detached again by the acid The concentration of the specifically reacting protein in the acid is increased. This process continues and results in the accumulation of a concentration of pure specific reactive protein in the weak acid bath.
Although the embodiment described first demonstrates the effectiveness of the ellipsometric immunological after.
has improved wisely to practicality, it is nevertheless economically desirable to completely eliminate the need for the ellipsometer. Accordingly, another embodiment of the present invention provides a way of determining relative protein film thicknesses by electrical means. In this embodiment, either a metallic substrate is selected or a substrate made of a different material is first coated with a metal film, as shown in block 11 of FIG. 1. The metal substrate or the metal-coated substrate is then immersed in protein solutions according to blocks 13 and 14 as described above. The protein layers adhering to the substrate are electrically insulating.
Next, a mercury or other electrode is placed on the top protein layer adhered to the substrate, as shown in block 16 of FIG. The top protein layer is either the first protein if the second solution did not contain the expected specifically reacting protein, or the top layer is the specifically reacting protein if the second solution did contain one. The metal film or the metal substrate and the mercury drop therefore form the two conductive plates of an electrical capacitor which is separated by an insulating layer which comprises either a monomolecular or a bimolecular protein layer.
The electrical capacitance of this capacitor is then determined, as indicated in block 19 of Figure 1, using any suitable known instrument for capacitance measurement, for example a Heathkit impedance bridge, model IB-28. The electrical capacitance of such capacitors with a bimolecular protein layer as a dielectric had a factor of approximately 2 to 5 compared to the capacitance of such capacitors with a monomolecular protein layer.
Another closely related embodiment of the present invention further simplifies the detection of the specifically reacting protein by making it possible to determine its presence by visual observation with the naked eye. This embodiment employs a metal substrate that forms an amalgam with mercury, or another substrate material is used, such as glass, which, as in block 11, is coated with a thin metal film that forms an amalgam with mercury, preferably gold. The substrate is then placed according to the in
Block 13 and Block 14 treated stages described, and it is again a drop of mercury on the upper protein layer, as indicated in Block 16. In this embodiment, however, no electrical measurement is made.
In this embodiment, the next step is to visually inspect the coated substrate and determine the time that passes before a visible amalgam is formed from the mercury with the metal film on the substrate. This embodiment of the invention is based on the discovery according to the invention that mercury diffuses through a monomolecular protein layer in approximately 1 minute, but that the mercury takes 10 minutes or more to diffuse through a bimolecular protein layer.
Since the mercury passes through the
Protein layer or layers must diffuse in order to form a visible amalgam with the metal film on the substrate, indicates the time that elapses between the placement of the mercury drop on the upper protein layer and the appearance of the visible amalgam, whether a monomolecular or a bimolecular protein layer is present on the substrate and accordingly whether or not the solution that was to be examined actually contained the protein that specifically reacts with the first protein. It is clear to the person skilled in the art that the capacitance measurement in the embodiment described above must be carried out within 1 minute of placing the mercury drop on the upper protein layer, since the mercury electrode diffuses through the insulating protein layer and short-circuits the capacitor.
On the other hand, the short circuit can be prevented by covering the metal with an insulating metal oxide layer and letting the protein adhere to the metal oxide. By producing a plurality of substrates after the step described in block 13 and their simultaneous immersion in the solution in which a specifically reacting protein is expected, as indicated in block 14, but the individual substrates are successively removed from the solution for a certain period of time pulls out, one can make a crude quantitative determination of the concentration of the specifically reacting protein.
Since the rate at which the layer of specifically reacting protein forms is a function of the concentration of the specifically reacting protein in the solution, a comparison of the diffusion times for the mercury droplet through the protein layers on a number of substrates that the solution contains which one suspects the specifically reacting protein, have been exposed to different times, give a raw quantitative indication of the concentration of the specifically reacting protein in the corresponding solution.
In another related embodiment, a substrate is coated with a metal film, as depicted in block 11 of FIG. 1 and as described in the last embodiment. The substrate is then immersed in solutions as shown in blocks 13 and 14 and described above. The next step according to this embodiment consists in coating the upper protein layer with a second metal layer, as shown in block 17 of FIG. 1, and then the structure thus obtained is observed with reflected light, as shown in block 21 of FIG.
The second metal is preferably applied by electroplating. Essentially, this embodiment leads to a structure that works as a diffraction grid and the difference between a monomolecular and a bimolecular protein insulation layer can be determined from the spectral components that can be determined in the reflected light.
FIG. 6 illustrates the embodiment of the apparatus according to the invention for this optical determination method.
A metallic surface 81 of a substrate, which can either be a metallic substrate or a non-metallic substrate coated with a metal film, has a first protein layer 82 which has been applied in accordance with block 13 of FIG. The substrate covered with the protein layer 82 is then immersed in the solution to be examined and a second layer 83 is formed, with the protein of the layer 82 specifically reacting protein on it, if such is present in the solution. A second metallization is then applied to the free surface of the protein film. A very small amount of metal is applied so that the second metallization appears in the form of a plurality of discontinuous metallized areas, such as areas 84 and 85 in FIG. 6.
A light beam represented by rays 86 is then directed onto the slide thus prepared. The light is reflected at the metal boundaries. The distance between the reflective surfaces of the metal substrate surface 81 and, for example, the particles of the metallization 84 is a function of the thickness of the protein film between the parts 81 and 84.
Accordingly, the observed reflected light illustrated by the rays 87 varies in spectral composition depending on whether the protein layer is a monomolecular or a bimolecular layer.
Another embodiment of the present invention comprises the stages described in FIG. 1 in blocks 12, 13, 14 and 18. in this embodiment, the substrate must be a translucent substrate such as glass, plastic, sintered silica, mica, quartz and the like, and preferably glass is used, with microscope slides being a conveniently available substrate which is first coated with a plurality of metal beads by a metal, for example indium, as indicated in block 12 of FIG. 1, is deposited on the substrate by evaporation. The indium, for example, is slowly applied to the glass substrate from a tantalum crucible in a vacuum of about 5x10-5 mm Hg.
Since the indium atoms on the surface of the substrate have a high mobility and do not noticeably wet the glass substrate, the indium vapor deposited on the substrate agglomerates into small particles. Any metal that has similar properties and that forms beads on the substrate when deposited there by vapor deposition can be used herein. In addition to indium, gold, silver, tin and lead have been used successfully. The evaporation of the metal continues until the substrate is slightly brown in color. At this point in time, the metal spheres have a diameter of the order of 1000. The exact size of the spheres is not critical, but they must have diameters which correspond to a large proportion of the wavelength of visible light.
In the next step, the substrate covered with the beads is immersed in a solution of a first protein, as shown in block 13 of FIG. The first protein again adheres in a monomolecular layer to the substrate and the metal spheres on it. After a monomolecular protein layer has formed, the coated substrate can be used to test solutions for the presence of a protein that reacts specifically with the first protein by immersing the coated substrate in a solution in which such a specifically reacting protein is expected as indicated in block 14 of FIG.
If the expected specifically reacting protein was present, the substrate and the metal beads have a bimolecular protein layer; if, on the other hand, the specifically reacting protein was not present, the substrate and the metal beads are only covered by a monomolecular protein layer. The coated substrate is then viewed in either reflected or transmitted light, as indicated in block 18 of FIG. 1, and the appearance of the coated substrate in terms of the thickness of the adhering protein layer and, accordingly, the presence or absence of the expected specifically reacting protein, the latter is determined. The detection of the protein layers is based on changes in the hue of the light brown substrate, which can be observed in the coated substrate.
These changes are very pronounced and the detection of the protein layers is a very simple procedure in this case. The particles alone on the substrate appear as a first shade of brown, the particles coated with a monomolecular protein layer appear as a darker brown, and the particles coated with a bimolecular protein layer appear as an even darker shade of brown.
This detection method is based on the fact that electromagnetic radiation is scattered to a large extent by conductive beads with diameters equal to a large proportion of a wavelength of the incident energy and that in the case of scattering by such beads, the scattering is greatly increased by a thin one Bead-located dielectric layer is affected.
5 shows a photograph of a diagnostic apparatus according to the embodiment described above. In each view of FIG. 5, the test slide is viewed in transmitted light. View 5a shows a glass slide with indium beads on a surface 100 of the slide. The view 5b shows a slide which is prepared like the slide of view 5a, but the left edge of which has been immersed in a solution of bovine serum albumin and a monomolecular layer 101 of the bovine serum albumin has been adsorbed. The view 5c shows a similar slide, the left edge of which was immersed in bovine serum albumin and which carries a monomolecular layer 101 of the bovine serum albumin.
The lower edge of the slide in view 5c has been immersed in a solution of egg albumin and accordingly has an adsorbed monomolecular layer 102 of egg albumin. It is important to note that the appearance of the coated portions of the slide is similar to view 5b, indicating that there is only one monomolecular protein layer on the slide.
This demonstrates that while the bovine serum albumin and egg albumin adhere to the slide, the egg albumin does not adhere to the portion of the slide that has previously been coated with the bovine serum albumin. In other words, view 5c illustrates the above finding that while any arbitrarily selected protein will adhere to a substrate, that protein will not adhere to such a film of an arbitrarily selected protein. The slide of view 5d was prepared by dipping the left edge in a bovine serum albumin solution to apply a monomolecular layer 101 thereof thereon.
The right edge was then immersed in an egg albumin solution in order to apply a monomolecular layer 102 there, and finally the lower edge was immersed in a solution of a rabbit serum acting as an antiserum to the bovine serum. Accordingly, 103 is a monomolecular layer of rabbit antiserum to bovine serum albumin.
The appearance of the lower right corner indicates that the rabbit antiserum to bovine serum albumin does not adhere to the egg albumin layer 102, and accordingly the lower right corner of the slide of view 4d is only covered with a monomolecular layer of egg albumin View 5d is significantly darker, indicating the presence of a bimonolar protein layer at this point, comprising a first monomolecular layer of bovine serum albumin that was first absorbed thereon and a second monomolecular layer of rabbit antiserum to the bovine serum albumin which is immunologically complexed with the underlying bovine serum albumin.
It can accordingly be seen that only the specifically reacting protein pair formed a bimolecular layer on the slide, while all other coatings were monomolecular.
In a modification of this embodiment, which creates a medical diagnostic system, the substrate comprising the metal beads is partially immersed to a first depth in a solution of a first antigen.
The substrate is coated in a monomolecular layer by the first antigen in the area that was immersed in the solution. Then the substrate is dried and immersed to a second depth in a solution of a second antigen. The second antigen does not adhere to the first antigen, but does adhere to that part of the substrate which is not covered by the first antigen and which is immersed in the solution of the second antigen. Then the substrate is dried again and immersed in a solution of a third antigen to a third and greater depth.
The third antigen adheres to that part and only to that part of the substrate which is not yet covered with the first or second antigen. The procedure can be repeated for any number of antigens of interest. A substrate is obtained which is covered with a multiplicity of monomolecular strip-shaped layers of different antigens.
This coated slide is the tool that can be used for diagnostic purposes. In the medical diagnostic method, this slide is immersed in a sample of, for example, blood, usually for several hours. The slide is then taken out of the sample and, after washing in water, viewed using reflected or transmitted light. The slide shows a pattern of lighter and darker stripes, which indicate the antibodies present in the sample and thus allows a corresponding medical diagnosis.
Fig. 2 shows a greatly enlarged side view of part of the diagnostic apparatus described in the aforementioned embodiment of this invention. Fig. 2 shows a portion of the substrate material 31 with a plurality of metal spheres 32 deposited thereon by evaporation. The particles 32 are preferably produced by evaporation of indium onto the substrate 31, as described above, but they can also be produced by evaporation of gold, Silver, tin, lead, or any other metal that is similar non-wetting and an atomic one
Has mobility exhibiting properties. Any of a large number of metals exhibit such properties when the temperature of the substrate is changed.
After immersion in a solution of a first protein, the segment of the slide containing the substrate 31 and the
Metal bead 32 includes, with a monomolecular
Layer covered by molecules 34 of the first protein, as indicated generally at 33 in FIG. The designated apparatus with 33 is the diagnostic instrument that is used to examine solutions for the presence of the
Protein molecules 34 specifically reacting protein is used.
If the apparatus, generally designated 33, is exposed to the protein that specifically reacts with the protein of molecules 34, then the apparatus assumes an appearance as shown generally at 35, in which the
Substrate 31 and the metal beads 32 are covered with a bimolecular protein layer, which contains the molecules 34 of the first protein, which form the first monomolecular layer on the substrate 31 and the beads 32, and a second monomolecular layer of a protein from the molecules 36 of the with specifically reacting to the first protein
Protein comprises, wherein the molecules 36 are immunologically linked to the molecules 34 of the first protein and this first protein layer, the metal beads and the substrate overlay.
Fig. 7 illustrates a modification of this embodiment form which creates an increased contrast in the coated diagnostic slide. In Fig. 7 the
Slide 31, which carries metal balls 32 thereon and is coated with protein molecules 34, as shown in FIG. 2, is immersed in a quantity 71 of a light-reflecting liquid, with the coated side facing downwards.
The slide 31 is then viewed from its upper surface with reflected light. In order to create a total reflection of the incident light on the diagnostic apparatus of FIG. 7, the reflective liquid 71 is preferably a metallic liquid and particularly preferably mercury. If a non-metallic liquid is used, the optical angles of incidence and viewing angles using the embodiment of FIG
Fig. 7 is critical if total reflection is to be observed.
The appearance of a test slide, which according to this
Teaching considered is similar to that shown in Fig. 5, but with improved contrast.
3 is a greatly enlarged side view of the apparatus useful for diagnostic purposes and for the purification and concentration of proteins and antibodies in accordance with another embodiment of the present invention. 40 generally designates a substrate 41 which is covered with a monomolecular layer of protein molecules 42, the unit 40 having been produced in the manner described above. 43 generally denotes the substrate 41 and the protein layer 42, with which a second monomolecular layer of protein molecules 44 of the protein reacting specifically with the molecules 42 is immunologically linked, this unit 43 being obtained according to the method described above. A second substrate 45 has a drop 46 of a weak acid solution.
The opposing surfaces of the substrates 41 and 45 with a bimolecular protein layer or a drop of weak acid thereon, which can be, for example, a 0.1 normal citric acid solution, are then physically brought into contact with one another. According to a finding of the present invention, the drop 46 of the weak acid separates the immunological bonds between the molecules 42 and the molecules 44 without affecting the biochemical properties of the proteins and without the adhesive bond between the molecules 42 of the first protein and the substrate 41 separate.
When the substrates 41 and 45 are separated as shown at 47, a monomolecular layer of the molecules 42 of the first protein adheres to the substrate 41 and a monomolecular layer of the molecules 44 of the specifically reacting protein adheres to the substrate 45. The substrate 41 with the molecules 42 on it can then be used again for the aforementioned method, again obtaining a substrate which is covered with a monomolecular layer of the specifically reacting protein or the substrate 41 with the molecules 42 on it can be used as a test slide according to use any of the other embodiments of the invention.
The substrate 45 with the molecules 44 of the specifically reacting protein adhering to it can then, according to the further embodiments of the invention described above, be used as a slide for examining solutions for the presence of molecules of its corresponding first protein. This embodiment of the present invention is considered to be particularly important because, as already stated, in the case of common proteins of biological interest, antigens are fairly readily available in purified form and so can be adsorbed onto a substrate and a test slide for the detection of the Form the presence of antibodies in solutions, but antibodies are not so available.
Accordingly, prior to this invention, it was generally not possible to produce test slides for testing solutions for the presence of antigens. The method and apparatus as shown in Fig. 3, however, provide test slides which comprise a substrate 45 which is covered with a monomolecular layer of, for example, antibody molecules 44 and which can be used to test solutions for the presence of antigen .
Another embodiment of a diagnostic apparatus according to the present invention is shown structurally in FIG. 9 and its principle of operation is graphically illustrated in FIG. The apparatus according to FIG. 9 comprises a gold substrate 91 which, for economic reasons, preferably consists of another metal provided with a thin gold layer and on which a monomolecular layer 92 of a first protein is adsorbed. Gold has an absorption.
band within the visible spectrum. This fact is responsible for the characteristic gold color and enables this embodiment of the present invention.
Figure 8 illustrates the operation of this embodiment and provides a series of reflectivity curves in which the relative reflectivity is plotted as a function of wavelength. Curve 93 represents the reflectivity of gold metal. Curve 94 represents the reflectivity of gold metal which has a monomolecular protein layer. Curve 95 shows the reflectivity of gold metal with a bimolecular protein layer on top. A gold substrate such as 91, in accordance with curve 93, has the bright yellow color of gold metal. If the test protein layer 92 is applied to the substrate 91, the test plate according to curve 94 has a dark yellow appearance.
After the test plate has been exposed to a solution in which one suspects the protein which reacts immunologically with the protein of layer 92, the test plate indicates, if such a specifically reacting protein was present in the solution and the plate consequently carries a bimolecular protein layer, has a reflectivity characteristic as shown in curve 95 and the panel has a distinctly green appearance.
From attempts to date, embodiments of the present invention employing a metallic bead substrate and a gold substrate appear to be generally the most useful. It was further found that these two embodiments have different sensitivities depending on the thicknesses of the protein films of interest. In particular, the embodiment with a substrate and metal balls has the greatest sensitivity when the film thicknesses are below approximately 200 Å. The gold substrate has the greatest sensitivity for films that are thicker than 30.
In a diagnostic method carried out according to the present invention, glass slides were covered with a thin layer of indium and overlaid with a layer of gold. The use of an indium underlayer was necessary to improve the adhesion between glass and gold. It was further found that the diffusion of the indium into the overlying gold layer improved the optical characteristics of the test slides. The slides thus prepared were covered with a monomolecular layer of the antigen associated with hepatitis.
Samples of human blood to be examined for the presence of hepatitis were prepared by admixing an amount of antibody to the hepatitis-related antigen, using a sufficient amount of the antibody to be immunologically removed from the mixture, if hepatitis-related antigen is present in the sample. Then the test slides were immersed in the blood samples thus prepared. After this
Removal, the slides immersed in the hepatitis-negative samples had a bimonocular protein layer that comprised the hepatitis-related antigen applied first and a second layer of antibodies to the hepatitis-related antigen that was immunologically associated with it, as shown by a green colored stripe on the slide.
The slides immersed in hepatitis positive specimens retained their original dark yellow color, indicating that only the monomolecular layer of hepatitis-related antigen was present on the slide while they were being placed in the specimen
Antibodies had precipitated out of the sample through complex formation with the antigen contained therein and could no longer react with the antigen on the test slide.
It turns out that the test described above is an inhibition test. In another diagnostic method, a direct test according to the present invention was carried out. In the direct test, glass-indium-gold slides were prepared as described above and then coated with a monomolecular layer of antibodies to the hepatitis-related antigen. Some of the slides were then immersed in serum that was obtained from hepatitis patients and was therefore known to contain the antigen associated with hepatitis. Other slides were immersed in serum samples that were known to be free of the hepatitis-related antigen.
As expected, the slides immersed in the hepatitis serum had a bimolecular protein layer, while the slides immersed in the hepatitis-free blood had only a monomolecular layer.
In theory, the direct test just described is the preferred diagnostic method both because of its relative simplicity and because in this case the direct test is more sensitive than the inhibition test.
The higher sensitivity of the direct test results from the fact that the antigen molecules associated with the hepatitis are very much larger than the molecules of the antibody to the antigen associated with the hepatitis. Therefore, the direct test causes a much larger percentage change in the film thickness and, accordingly, a greater contrast can be observed.
The concentration of the hepatitis-related antigen in the blood of a person exposed to the disease is a function of time. The concentration of the hepatitis antigen is very high during the clinical and immediately before clinical phases of hepatitis. In the post-clinical phases, however, the concentration of the hepatitis antigen in a person's blood is very low. Both conditions are of medical interest. Detection of the antigen during the clinical and immediately preclinical phases is valuable for diagnostic purposes. The detection of the antigen in the post-clinical phase is valuable for the examination of the blood of potential blood donors.
The simpler sensitive direct test is therefore preferred for diagnostic purposes because it can be easily performed because of the relatively high concentration of the hepatitis antigen in the blood sample.
The inhibition test described for verification purposes has been evaluated experimentally to determine its value relative to other known verification tests. In these tests, the hepatitis positive serum was diluted with known hepatitis negative serum. Using the inhibition procedure described above, dilution of one part of hepatitis-positive serum with 32 parts of known hepatitis-negative serum resulted in reliable detection within one hour. The use of a dilution of one part of hepatitis-positive serum with 3000 parts of known negative serum resulted in reliable detection over 24 hours. These results turn out to be very similar in terms of sensitivity and the time required to the well-known counterelectrophoresis or radioimmunization methods.
A checking method according to the present invention thus gives results which are comparable with the best available according to known methods, an additional advantage of the method according to the invention being that of a considerably cheaper method
The preferred use of a gold-coated substrate over one coated with metal beads
The substrate in the above-described diagnostic hepatitis method is determined by the diameter of the hepatitis antigen molecules, which is approximately 210 Å. Such film thicknesses are well within the capabilities of gold-coated substrates to give a sensitive display, but are too thick for a highly sensitive display using bead-coated substrates.
In Fig. 4 an apparatus according to another embodiment of the present invention for the concentration and purification of proteins and antibodies is shown in a mechanical schematic diagram.
To facilitate understanding of the embodiment of FIG. 4, it should be pointed out that the beginning of the embodiment of FIG. 4 which is in operation is a modification of the embodiment of FIG. 3 just discussed. In FIG. 4, a continuous, flexible belt made of substrate material 51, which is covered with a monomolecular protein layer which specifically reacts with the protein to be concentrated and purified, is first introduced into a container 52 which contains a certain amount of liquid 53 in which the protein to be purified is located.
The immunological complexing between the two specifically reacting proteins takes place in the container 52, and then the substrate belt 51, which now has a bimolecular protein layer, gets into the container 58, in which there is a solution 59 of a weak acid which is responsible for the immunological bond separates between the two specifically reacting proteins and thereby collects the molecules of the second protein layer in the solution 59. After leaving the container 58, only the original monomolecular protein layer is therefore again located on the substrate 51. The substrate 51 is then returned to the container 52 in order to again receive a monomolecular layer of the protein to be collected, which is detached again in the container 58.
The belt 51 is guided through the solutions 53 and 59 by means of the belt drive axles 60 and 63, which work together with the corresponding pinch rollers 61 and 62. The belt drive axles 60 and 63 can be driven by any suitable device, which may conveniently comprise small electric motors which can be connected to the belt drive axles 60 and 63 through speed reducing gears. Since the immunological complexing reaction proceeds much more slowly than the action of acid separating the bonds, it is advisable that the coated substrate belt 51 is in contact with the solution 53 containing the protein to be collected for a much longer time than with the weak acid containing solution 59.
It is accordingly expedient that the container 52 is considerably larger than the container 58 and that a large number of upper and lower guide rollers 54 and 55 are used in order to guide the belt 51 through the solution 53 many times. In this way, at any one time, the belt 51 will be in contact with the solution 53 for a greater length, and thus any segment of the belt 51 will be exposed to the solution 53 for a longer period of time. On the other hand, a single pass of the belt 51 through the acid solution 59 is completely sufficient to detach the second protein layer therefrom. Therefore, only a pair of upper guide rollers 56 and a single guide roller 57 are provided for guiding the belt 51 through the acid solution.
A plurality of guide rollers 64 are provided in order to give the belt 51 the necessary mechanical support during its transition between the containers 52 and 58. The containers 52 and 58 are preferably provided with stirring devices 85 and 66, respectively, which are passed through the walls of the corresponding containers in a liquid-tight manner in order to stir the solutions 53 and 59 and thus to renew the solutions which are in contact with the belt 51 are located. The container 52 is provided with a vent 67 which is controlled by the valve 68 and through which the solution 53 can be drained when the concentration of the desired protein has been reduced to a point at which further effective uptake is no longer possible is.
A fresh sample of the solution 53 can then be filled into the container 52 through the upper open part. The container 58 is also provided with a discharge pipe 69 which is controlled by the valve 70 and through which the solution of the purified protein in the weak acid can be drawn off when the desired concentration is reached.
A fresh acid solution can then similarly be added to the container 58 through the top open end. As described above in connection with FIG. 3, the substrate belt 51 can be coated with any desired protein, be it an antigen or an antibody. The method and apparatus of Figure 4 are therefore suitable for collecting a purified concentration of any desired protein so long as there is an immunological reaction with the desired protein. By slightly modifying its mode of operation, the apparatus of Figure 4 can also be used to selectively remove a specifically undesirable protein from a mixture, such as a serum.
To accomplish this, the apparatus of FIG. 4 is simply allowed to run for an extended period of time with no renewal of solution 53 and with periodic renewals of solution 59 as necessary. In this case, the serum 53 is obtained from the exhaust pipe 67 from which the undesired protein has been removed to any required degree, depending only on the operating time of the system.
PATENT CLAIM 1
A method for the detection of a specific protein in a solution according to claim I of the main patent, characterized in that a metal which poorly wets the plate made of translucent material is applied and that the plate is used to check whether a bimolecular or monomolecular protein layer is adhering to the plate with the metal and protein layer facing down on the surface of a liquid.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim 1, characterized in that indium, gold, silver, tin or lead is vapor deposited on the plate.
2. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that the liquid is a metallic liquid, preferably mercury, and the plate is checked visually with reflected light while it is in contact with the metallic liquid.
PATENT CLAIM 11
Device according to patent claim 11 of the main patent for carrying out the method according to patent claim I above, characterized by a substrate with a multiplicity of spheres adhering to the surface of the substrate made of a metal which poorly wets the substrate, and a monomolecular layer of an immunologically reactive protein which covers at least a portion of the substrate and the metal beads.
SUBCLAIMS
3. Device according to claim II, characterized in that it has a large number of monomolecular layers
** WARNING ** End of DESC field could overlap beginning of CLMS **.