Der Patentanspruch I des Hauptpatentes betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Lösung, wobei man ein Metall auf eine Platte aus lichtdurchlässi gem Material aufbringt, die beschichtete Platte durch Eintauchen in eine Lösung eines mit dem nachzuweisenden Protein spezifisch reagierenden Proteins mit einer monomolekularen Schicht dieses spezifisch reagierenden Proteins bedeckt, die so behandelte Platte in die zu untersuchende Lösung taucht und schliesslich prüft, ob an der Platte eine bimolekulare oder monomolekulare Proteinschicht haftet.
Der Patentanspruch II des Hauptpatentes betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des genannten Verfahrens, die ein Substrat aufweist mit einer Vielzahl von Metallkügelchen, die an einer Oberfläche des Substrates haften, und einer monomolekularen Schicht eines immunologisch reaktiven Proteins, die mindestens einen Teil des Substrates und der Metallkügelchen bedeckt.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbesserung dieses Verfahrens, die darin besteht, dass man ein die Platte aus lichtdurchlässigem Material schlecht benetzendes Metall aufbringt und dass man zur Prüfung, ob an der Platte eine bimolekulare oder monomolekulare Proteinschicht haftet, die Platte mit der Metall- und Proteinschicht nach unten auf die Oberfläche einer Flüssigkeit, vorzugsweise einer metallischen Flüssigkeit, insbesondere Quecksilber, aufbringt.
Immunologische Reaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen bezeichnetes erstes Protein sich mit einem zweiten Protein verbindet, das für dieses Antigen spezifisch ist und dessen Antikörper genannt wird, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems, wie einem tierischen Lebewesen, stattfinden, sind von grosser Bedeutung für das Tier bei der Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlasst der Eintritt eines fremden Proteins, das heisst des Antigens, das biologische System zur Erzeugung der für das entsprechende Antigen spezifischen Antikörper Proteine in einem Verfahren, das bisher noch nicht vollständig verstanden wird.
Die Antikörper-Proteinmoleküle weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die die am Antigenmolekül ergänzen, und so können das Antigen und der Antikörper sich chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden.
Da Antikörper durch biologische Systeme als Antwort auf das Eindringen von fremden Proteinen erzeugt werden, ist der Nachweis von in einem biologischen System vorhandenen Antikörpern von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat auch der Nachweis bestimmter Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnosti schen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin zur Feststellung der Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle im Blut von in Aussicht genommenen Blutspendern.
Um solche diagnostischen Untersuchungen durchführen zu können, muss das geeignete Protein mindestens eines immunologisch reagierenden Paares in konzentrierter gereinigter Form erhältlich sein. Die einzige bekannte Quelle für Antikörper-Proteine ist ein lebendes biologisches System. Dar über hinaus ist es bisher nur von Wirbeltieren bekannt, dass sie der Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen begegnen. Beispielsweise wurden viele Antikörper im Blutserum von tierischen Lebewesen gefunden, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden waren. Das Blutserum ist jedoch eine sehr komplexe Mischung, in der die erforderlichen Antikörper in sehr geringen Konzentrationen bei Anwesenheit einer Vielzahl anderer Bestandteile vorkommen. Viele Antigene können andererseits in kontrollierbarer Weise in Laboratoriumskulturen hergestellt werden.
Einige Antigene jedoch, wie zum Beispiel das mit der Hepatitis verbundene Antigen, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren lebenden biologischen Systemen erhältlich.
In der derzeit praktizierten Weise basieren sowohl die Ansammlung als auch die Reinigung und die diagnostische Verwendung immunologisch aktiver Proteine auf den Ausfällungs- oder Agglutinierungseigenschaften, die für die Proteine charakteristisch sind, die aus der immunologischen Komplexierungsreaktion herrühren. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Verwendungen ist das Verfahren zur Feststellung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Serum Antikörpern vom Typ a und Q vermischt werden und man bestimmt die Blutgruppe durch Feststellen irgendwelcher Agglutinationen in den Blutproben.
Die Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein, wie sie derzeit durchgeführt wird, ist ein Inhibitions Test, der ausgeführt wird, indem man eine Menge des HCG Antiserums in eine Urin-Probe einmischt. Eine Vielzahl von Polystyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet worden sind, bringt man in eine so vorbereitete Urinprobe ein.
Die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe kein HCG-Protein vorhanden ist. Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann bildet das HCG Protein auf den Polystyrolkugeln mit dem zuvor in die Urinprobe eingebrachten HCG-Antiserum Komplexe und die Kugeln agglutinieren. Wenn andererseits in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden ist, dann bildet dieses mit dem zuvor eingebrachten HCG-Antiserum einen Komplex, der aus der Probe ausfällt, so dass das vorher eingeführte Serum nicht länger für die Komplexbildung mit dem HCG-Protein auf den Kugeln verfügbar ist und so auch keine Agglutinierung der Kugeln verursachen kann.
Gemäss der Lehre der vorliegenden Erfindung kann die bekannte Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein vereinfacht werden, indem man das HCG-Antiserum auf den Polystyrolkugeln haften lässt, und eine Urinprobe direkt untersucht In diesem Falle würden die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe HCG-Protein vorhanden ist.
Es scheint, dass der Grund, weshalb dieses einfachere Verfahren bisher nicht angewendet worden ist, der ist, dass die verfügbaren HCG-Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen grossen Anteil an Bestandteilen anderer Art als HCG Antikörper enthalten. Die zusätzliche Bemühung, die nach dem bekannten Verfahren erforderlich ist, um die Antikörper aus den HCG-Antiseren zu extrahieren, führen dazu, dass die Seren für den Inhibitionstest bisher direkt verwendet worden sind. Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Prozedur geschaffen, mit der HCG-Antikörper wirksam von Seren getrennt werden und diese Prozedur erzeugt weiter eine diagnostische Vorrichtung, mit der der einfachere direkte Test ausführbar ist.
Jedes Antigenmolekül bildet typischerweise Komplexe mit einer Vielzahl von Antikörpermolekülen, die mit verschiedenen Teilchen verbunden sein können und bildet dabei sichtbare Klumpen von zum Beispiel beschichteten Polystyrolkügelchen oder roten Blutzellen. Eine Unzulänglichkeit von Agglutinierungs-Untersuchungen ist die, dass die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen agglomerieren können, die mit der immunologischen Agglutinierung nichts zu tun haben, und auf diese Weise die Zuverlässigkeit der Untersuchung vermindern. Üblicherweise werden Agglutinierungs-Untersuchungen mit grösster Sorgfalt von ausgebildeten Fachkräften durchgeführt, doch treten trotzdem gelegentlich diagnostische Fehler auf.
Beim derzeitigen Verfahren zur Gewinnung gereinigter Anreicherungen von Antikörpern wird zuerst durch Einführung des Antigens in das tierische System die Erzeugung von Antikörpern in einem tierischen Lebewesen angeregt, dann entnimmt man dem Tier Blutserum, welches die Antikörper in hochverdünnter Form enthält und vermischt eine bestimmte Menge des spezifischen Antigens mit dem Serum.
Die Mischung aus Antigen und Antikörper bildet Komplexe und fällt aus der Serumlösung aus. Die verbleibenden Bestandteile des Serums werden abgezogen und der Niederschlag aus Antikörper und Antigen wird in einer Säure gelöst, welche die Komplexbindungen trennt. Man erhält dadurch eine Lösung der Antigen- und Antikörpermoleküle in der Säure. Da die Antikörper- und Antigenmoleküle unterschiedliche physikalische Eigenschaften haben, zum Beispiel unterschiedliches Gewicht, können sie voneinander mechanisch, zum Beispiel durch Zentrifugieren, getrennt werden.
Es ist bekannt, dass die Antikörper-Antigen-Komplexierungsreaktion stattfindet, wenn ein Antigen an einer Oberfläche absorbiert ist. Die Komplexierungsreaktion an einer Oberfläche ist mittels eines Ellipsometers beobachtet worden. Ein Ellipsometer ist ein komplexes, speziell zur Bestimmung der Elliptizität polarisierten Lichtes brauchbares optisches Instrument, mit dessen Hilfe man Filmdicken in der Grössenordnung von 0,1 Ä messen kann. Ellipsometer sind teuer und erfordern ausgebildetes Bedienungspersonal. Bei Untersuchungen immunologischer Reaktionen unter Verwendung von Ellipsometern, soweit sie bisher durchgeführt wurden, verwendete man zwei Verfahren. Nach dem einen Verfahren liess man die zu untersuchende Reaktion ablaufen und ordnete dann den Objektträger, auf dem die Reaktion stattgefunden hatte, in einem Ellipsometer an, um die Filmdicke zu bestimmen.
Bei dem anderen Verfahren wurde der Objektträger von vornherein im Ellipsometer befestigt und man beobachtete mit dem Ellipsometer die sich mit dem Fortschreiten der immunologischen Reaktion ändernde Filmdicke. Die Bestimmung der absoluten Dicke erfordert eine ausserordentliche Sorgfalt. Ist andererseits die Konzentration der Antikörper in der Lösung gering, dann erfordert die Messung der realtiven Dickenänderung obwohl sie leichter durchzuführen ist als die Bestimmung der absoluten Dicke, eine lange Zeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist daher der Nachweis immunologischer Reaktionen auf einer Oberfläche unter Verwendung eines Ellipsometers nicht für diagnostische Zwecke verwendet worden.
Die vorliegende Erfindung schliesst die Feststellung ein, dass irgendein willkürlich ausgewähltes Protein sich an einem Substrat nur in einer monomolekularen Schicht absorbiert und dass ein spezifischer Antikörper (oder Antigen) für ein solches willkürlich ausgewähltes Protein sich mit diesem unter Bildung einer bimolekularen Proteinschicht auf dem Substrat verbinden wird. Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung umfassen daher die Anwendung dieser Feststellung für die Schaffung eines Verfahrens zur Ausnutzung in der me dizinischen Diagnostik und in pharmakologischen Anwendungen, sowie die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Es ist daher eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Apparat für den wirtschaftlichen Nachweis immunologischer Reaktionen zu schaffen, die auf einer Oberfläche stattfinden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines solchen Verfahrens und Apparates, in dem die immunologischen Reaktionen elektrisch nachweisbar sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines solchen Verfahrens und Apparates, mit dem immunologische Reaktionen durch direkte visuelle Beobachtung nachweisbar sind.
Eine zweite Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von Verfahren und Apparat für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern mittels gesteuerter immunologischer Reaktionen, die an einer Oberfläche stattfinden.
Kurz gesagt und in Übereinstimmung mit zwei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine Platte eines Substratmaterials zuerst in eine Lösung eines ersten Proteins eingetaucht, so dass eine monomolekulare Schicht des ersten Proteins an dem Substrat haftet. Das mit dem ersten Protein beschichtete Substrat wird dann in eine zweite Lösung eingetaucht, von der man nach einer ersten Ausführungsform der Erfindung weiss, dass sie ein spezifisch mit dem ersten Protein reagierendes Protein enthält und von der man in einer zweiten Ausführungsform vermutet, dass sie ein spezifisch mit dem ersten Protein reagierendes Protein enthält. Das spezifisch reagierende Protein und nur das spezifisch reagierende Protein bildet eine zweite monomolekulare Schicht, die die monomolekulare Schicht des ersten Proteins auf dem Substrat überlagert.
Dann wird nach einer ersten Ausführungsform der Erfindung das mit zwei monomo lekularen Schichten bedeckte Substrat in eine Lösung einer schwachen Säure eingetaucht, welche die immunologische Bindung zwischen den beiden Proteinschichten trennt und für die Ansammlung des spezifisch reagierenden Proteins in gereinigter Form in einer Lösung einer schwachen Säure sorgt. In einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das beschichtete Substrat, nachdem man es in die Lösung eingetaucht hat, in der man ein spezifisch reagierendes Protein vermutet, elektrisch oder optisch untersucht, um festzustellen, ob an dem Substrat eine bimolekulare oder eine monomolekulare Proteinschicht haftet Gleichzeitig bestimmt man damit, ob die zweite Lösung das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthalten hat oder nicht.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert, wobei weitere Aufgaben und Vorteile ersichtlich werden. Im einzelnen zeigen:
Fig. 1 einen Ablaufplan für die Verfahrensstufen der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung,
Fig. 2 eine Seitenansicht des diagnostischen Apparates gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche das Verfahren für dessen Herstellung und Verwendung darstellt,
Fig. 3 eine Seitenansicht eines für diagnostische Zwecke und für die Reinigung und Konzentrierung von Antikörpern gemäss einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung geeigneten Apparates,
Fig. 4 ein mechanisches schematisches Diagramm des Apparates gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern,
Fig.
5 eine Fotografie, die den Betrieb der erfindungsgemässen diagnostischen Vorrichtung illustriert,
Fig. 6 eine Seitenansicht einer anderen Ausführungsform eines erfindungsgemässen diagnostischen Apparates,
Fig. 7 eine Seitenansicht einer erfindungsgemässen diagnostischen Vorrichtung, welche eine Modifikation des Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung nach Fig. 2 illustriert,
Fig. 8 eine grafische Darstellung des Betriebsprinzips, der in in Fig. 9 dargestellten Ausführungsform eines erfindungsgemässen diagnostischen Apparates, und
Fig. 9 eine Seitenansicht einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemässen diagnostischen Apparatur.
Fig. 1 gibt einen Ablaufplan wieder, der die einzelnen Verfahrensstufen bei der Durchführung der vorliegenden Erfin dung zeigt. Beim Lesen des Ablaufplanes von oben nach unten gibt jede vertikale Stufe eine der Zeit nach folgende Stufe des Verfahrens wieder. Die einzelnen horizontal angeordneten Stufen auf einer gegebenen vertikalen Höhe im Ablaufplan zeigen die alternativen Möglichkeiten für eine der angegebenen Stufen gemäss den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung.
Gemäss einer ersten Ausführungsform der Erfindung beginnt das Verfahren mit dem Block 13 der Fig. 1, bei dem eine Platte eines Substratmaterials, das Metall, Glas, Glimmer, Kunststoff, gesintertes Siliciumdioxyd, Quarz oder ein ähnliches Material sein kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den grössten Unterschied im Brechungsindex gegenüber Protein hat, und vorzugsweise wird ein metallisierter Glas Objektträger in eine Lösung eingetaucht die ein erstes interessierendes Protein enthält, das biologisch ein Antigen oder ein Antikörper sein kann und das in relativ konzentrierter Lösung erhältlich ist und das verwendet werden soll, sein entsprechendes spezifisch reagierendes Protein nachzuweisen oder zu reinigen, wobei letzteres biologisch ein Antikörper bzw. ein Antigen ist. Das erste Protein wird an dem Substrat in einer monomolekularen Schicht adsorbiert.
Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, wobei eine weitere Adsorption nicht stattfindet. Das heisst das Protein haftet am Substrat, nicht jedoch an sich selbst.
Nachdem sich eine monomolekulare Schicht des Proteins auf der ganzen Oberfläche des Substrates gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des ersten Proteins herausgenommen. Die für die vollständige Beschichtung des Substrates erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proteins in der Lösung und des Masses, mit dem die Lösung gerührt wird. Beispielsweise beschichtet eine 1 /Oige Rinderserum-Albuminlösung einen Objektträger in ungefähr 30 Minuten mit einer monomolekularen Proteinschicht vollständig.
Bei der nächsten Stufe, die in Block 14 der Fig. 1 dargestellt ist, wird das Protein-beschichtete Substrat in eine Lösung eingetaucht, in der man das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein vermutet. Diese Lösung kann und tut es üblicherweise auch, viele Bestandteile ausser dem spezifisch reagierenden Protein enthalten, dessen Anwesenheit man nachweisen möchte. Es wird jedoch kein anderes als ein spezifisch reagierendes Protein an der ersten Proteinschicht auf dem Substrat haften. Ist demgemäss das spezifisch reagierende Protein nicht vorhanden, dann weist das Substrat nach dem Eintauchen in die zweite Lösung immer noch nur eine monomolekulare Proteinschicht auf.
Ist andererseits das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann findet ein immunologisches Komplexieren zwischen dem ersten Protein und seinem spezifisch reagieren den Protein statt und das Substrat trägt nach einer bestimmten Zeit eine bimolekulare Proteinschicht. Es ist zu erwähnen, dass die in den Blocks 13 und 14 der Fig. 1 dargestellten Schritte für alle Ausführungsformen der Erfindung die gleichen sind. Die für die Adhäsion einer vollständigen zweiten molekularen Schicht an dem beschichteten Substrat erfor derliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung. Für Antikörper in Blutserum kann diese Zeit bis zu 1 Tag betragen.
Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird bei der nächsten Stufe das beschichtete Substrat in eine Lösung einer schwachen Säure eingetaucht, wie dies in Block 15 der Fig. 1 dargestellt ist, während man gleichzeitig das beschichtete Substrat in einem Ellipsometer betrachtet, wie in Block 22 der Fig. 1 illustriert. Während die Bildung der Schicht des spezifisch reagierenden Proteins auf dem mit dem ersten Protein beschichteten Substrat eine längere Zeit erfordern kann, löst die schwache Säure die immunologische Bindung zwischen den beiden Proteinen sehr rasch.
Demgemäss kann die Beobachtung mit dem Ellipsometer auf die relativ einfache Beobachtung der Änderung der Filmdicke gerichtet werden anstelle der komplizierteren Messung der absoluten Filmdicke. Die Beobachtung des Ablösens der Schicht aus spezifisch reagierendem Protein durch die schwache Säure ist sehr viel rascher möglich als bei dem bekannten Verfahren die Beobachtung des Aufbaues der Schicht aus dem spezifisch reagierenden Protein.
Daher kann eine grosse Menge von Objektträgern gemäss Block 13 hergestellt werden, und man kann jeden von ihnen einer aus einer grossen Vielzahl von Serumproben, wie in Block 14 dargestellt, aussetzen, und dann kann in einer kurzen Zeit jeder Objektträger serienmässig gemäss den Stufen der Blöcke 15 und 22 untersucht werden, um festzustellen, welche der Serumproben das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthielt Da die Säure das erste Protein vom Substrat nicht ablöst, werden solche beschichteten Substrate, die in Lösungen ohne spezifisch reagierendes Protein eingetaucht waren, keine Anderung der Filmdicke zeigen, wenn sie in eine Säure eingetaucht und in einem Ellipsometer beobachtet werden.
Andererseits zeigen die Objektträger, die in eine Lösung mit dem spezifisch reagierenden Protein eingetaucht waren, ungefähr einen Faktor von 2 bis 5 bei der Änderung der Dicke, wenn sie in eine Säure eingetaucht und in einem Ellipsometer beobachtet werden. Jede Untersuchung mit dem Ellipsometer kann in wenigen Minuten durchgeführt werden, und dadurch ist eine wirksame und diagnostisch bedeutende Untersuchungsmethode geschaf- fen.
Eine zweite eng damit verwandte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen umfasst die in den Blöcken 13, 14, 15 und 23 der Fig. 1 dargestellten Stufen. Das Substrat wird erst in eine Lösung des erhältlichen Proteins des Antigen-Antikörper-Paares eingetaucht, wie in Block 13 dargestellt.
Üblicherweise wird dies das Antigen sein, doch hängt die vor liegende Erfindung nicht von der biologischen Identität des ersten Proteins ab. Das gemäss Block 13 der Fig. 1 hergestellte beschichtete Substrat wird dann in eine Lösung eingetaucht, die das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein enthält, wie in Block 14 dargestellt. Im üblichen Falle ist das spezifisch reagierende Protein ein Antikörper, und die in Block 14 verwendete Lösung ist das Blutserum eines tierischen Lebewesens, welches dem ersten Protein ausgesetzt worden ist. Das nun mit einer bimolekularen Proteinschicht bedeckte Substrat wird als nächstes, wie in Block 15 der Fig. 1 gezeigt, in eine schwache Säure eingetaucht, welche die Schicht des spezifisch reagierenden Proteins von der ersten Proteinschicht ablöst.
Danach ist das Substrat mit einer monomolekuaren Schicht des ersten Proteins beschichtet, und es liegt eine gereinigte Lösung des spezifisch reagierenden Proteins in der schwachen Säure vor.
Die nächste, in Block 23 der Fig. 1 gezeigte Stufe ist die Rückführung des mit der anhaftenden ersten Proteinschicht versehenen Substrates in die Lösung die das spezifisch reagierende Protein enthält um wieder eine zweite Schicht aufzunehmen, die dann wieder durch die Säure abgelöst wird, wobei die Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Säure erhöht wird. Dieses Verfahren wird fortgesetzt und führt zur Ansammlung einer Konzentration reinen spezifisch reagierenden Proteins in dem Bad aus schwacher Säure.
Obwohl die zuerst beschriebene Ausführungsform die Wirksamkeit des ellipsometrischen immunologischen Nach.
weises bis zur praktischen Durchführbarkeit verbessert hat, ist es trotzdem wirtschaftlich erwünscht, die Notwendigkeit für das Ellipsometer vollständig zu eliminieren. Demgemäss schafft eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Möglichkeit für die Bestimmung relativer Proteinfilmdicken durch elektrische Massnahmen. Bei dieser Ausführungsform wird entweder ein metallisches Substrat ausgewählt oder ein Substrat aus einem anderen Material wird erst, wie in Block 11 der Fig. 1 gezeigt, mit einem Metallfilm beschichtet. Das Metallsubstrat oder das metallbeschichtete Substrat wird dann gemäss den Blöcken 13 und 14, wie oben beschrieben, in Proteinlösungen eingetaucht. Die an dem Substrat haftenden Proteinschichten sind elektrisch isolierend.
Als nächstes wird eine Quecksilber- oder eine andere Elektrode auf der oberen an dem Substrat haftenden Proteinschicht angebracht, wie in Block 16 der Fig. 1 gezeigt. Die obere Proteinschicht ist entweder das erste Protein, wenn die zweite Lösung nicht das erwartete spezifisch reagierende Protein enthalten hatte, oder die oberste Schicht ist das spezifisch reagierende Protein, wenn die zweite Lösung ein solches enthielt. Der Metallfilm oder das Metallsubstrat und der Quecksilbertropfen bilden daher die beiden leitenden Platten eines elektrischen Kondensators, der durch eine isolierende Schicht getrennt ist, die entweder eine monomole- kulare oder eine bimolekulare Proteinschicht umfasst.
Die elektrische Kapazität dieses Kondensators wird dann, wie in Block 19 der Fig. 1 angegeben, unter Verwendung irgendeines geeigneten bekannten Instrumentes für die Kapazitätsmessung bestimmt, zum Beispiel mit einer Heathkit-lmpedanzbrücke, Modell IB-28. Die elektrische Kapazität solcher Kondensatoren mit einer bimolekularen Proteinschicht als Dielektrikum hatte einen Faktor von ungefähr 2 bis 5 gegen über der Kapazität solcher Kondensatoren mit einer monomolekularen Proteinschicht.
Eine andere eng verwandte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vereinfacht den Nachweis des spezifisch reagierenden Proteins weiter, indem sie die Möglichkeit schafft, seine Anwesenheit durch visuelle Beobachtung mit dem blossen Auge festzustellen. Diese Ausführungsform wendet ein Metallsubstrat an, das mit Quecksilber ein Amalgam bildet, oder es wird ein anderes Substratmaterial verwendet, wie Glas, das, wie in Block 11, mit einem dünnen Metallfilm beschichtet wird, welches ein Amalgam mit Quecksilber bildet, vorzugsweise Gold. Das Substrat wird dann nach den in
Block 13 und Block 14 beschriebenen Stufen behandelt, und es wird wieder ein Quecksilbertropfen auf der oberen Pro teinschicht angeordnet, wie in Block 16 angegeben. Bei dieser Ausführungsform wird jedoch keine elektrische Messung gemacht.
Bei dieser Ausführungsform ist die nächste Stufe, das beschichtete Substrat visuell zu betrachten und die Zeit zu bestimmen, die vergeht, bevor ein sichtbares Amalgam von dem Quecksilber mit dem auf dem Substrat befindlichen Metallfilm gebildet wird. Diese Ausführungsform der Erfindung beruht auf der erfindungsgemässen Feststellung, dass Quecksilber durch eine monomolekulare Proteinschicht in ungefähr 1 Minute diffundiert, dass das Quecksilber jedoch 10 Minuten oder mehr braucht, um durch eine bimolekulare Pro teinschicht zu diffundieren.
Da das Quecksilber durch die
Proteinschicht- oder -schichten diffundieren muss, um mit dem Metallfilm auf dem Substrat ein sichtbares Amalgam zu bilden, gibt die Zeit, die zwischen dem Anordnen des Quecksilbertropfens auf der oberen Proteinschicht und dem Erscheinen des sichtbaren Amalgams vergeht, an, ob eine monomolekulare oder eine bimolekulare Proteinschicht auf dem Substrat vorhanden ist und demgemäss ob die Lösung, die zu untersuchen war, tatsächlich das mit dem ersten Pro tein spezifisch reagierende Protein enthielt oder nicht. Es ist dem Fachmann klar, dass die Kapazitätsmessung bei der zuvor beschriebenen Ausführungsform innerhalb 1 Minute vom Anordnen des Quecksilbertropfens auf der oberen Pro teinschicht durchgeführt sein muss, da die Quecksilberelektrode durch die isolierende Proteinschicht diffundiert und den Kondensator kurzschliesst.
Andererseits kann das Kurzschliessen dadurch verhindert werden, dass man das Metall mit einer isolierenden Metalloxydschicht bedeckt und das Protein an dem Metalloxyd haften lässt. Durch Herstellen einer Vielzahl von Substraten nach der in Block 13 beschriebenen Stufe und deren gleichzeitiges Eintauchen in die Lösung, in der ein spezifisch reagierendes Protein erwartet wird, wie in Block 14 angegeben, wobei man die einzelnen Substrate jedoch während einer gewissen Dauer nacheinander aus der Lösung herauszieht, kann man eine rohe quantitative Bestimmung der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins durchführen.
Da die Geschwindigkeit, mit der sich die Schicht aus spezifisch reagierendem Protein bildet, eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung ist, kann ein Vergleich der Diffusionszeiten für den Quecksilbertropfen durch die Proteinschichten auf einer Reihe von Substraten, die der Lösung, in der man das spezifisch reagierende Protein vermutet, verschiedene Zeiten ausgesetzt worden sind, eine rohe quantitative Angabe der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der entsprechenden Lösung ergeben.
In einer anderen verwandten Ausführungsform wird ein Substrat mit einem Metallfilm beschichtet, wie in Block 11 der Fig. 1 abgebildet und wie bei der letzten Ausführungsform beschrieben. Dann taucht man das Substrat in Lösungen ein, wie in den Blöcken 13 und 14 dargestellt und oben beschrieben. Die nächste Stufe nach dieser Ausführungsform besteht im Beschichten der oberen Proteinschicht mit einer zweiten Metallschicht, wie in Block 17 der Fig. 1 dargestellt, und dann wird die so erhaltene Struktur mit reflektiertem Licht betrachtet, wie in Block 21 der Fig. 1 dargestellt.
Das zweite Metall wird vorzugsweise durch Elektroplattieren aufgebracht. Im wesentlichen führt diese Ausführungsform zu einer Struktur, die als Diffraktionsraster arbeitet und der Unterschied zwischen einer monomolekularen und einer bimolekularen Protein-lsolationsschicht ist bestimmbar aus den Spektralanteilen, die im reflektierten Licht festgestellt werden können.
Figur 6 illustriert die Ausführungsform der erfindungsgemässen Apparatur für diese optische Bestimmungsmethode.
Eine metallische Oberfläche 81 eines Substrates, welches entweder ein metallisches Substrat oder ein mit einem Metallfilm beschichtetes nicht-metallisches Substrat sein kann, weist eine erste Proteinschicht 82 auf, die gemäss Block 13 der Fig. 1 aufgebracht worden ist. Das mit der Proteinschicht 82 bedeckte Substrat wird dann in die zu untersuchende Lösung eingetaucht und es bildet sich eine zweite Schicht 83 aus, mit dem Protein der Schicht 82 spezifisch rea- gierenden Protein darauf, wenn ein solches in der Lösung vorhanden ist. Es wird dann auf die freie Oberfläche des Proteinfilms eine zweite Metallisierung aufgebracht. Es wird eine sehr geringe Menge Metall aufgetragen, so dass die zweite Metallisierung in Form einer Vielzahl diskontinuierlicher metallisierter Bereiche erscheint, wie zum Beispiel den Bereichen 84 und 85 in Fig. 6.
Ein durch die Strahlen 86 repräsentierter Lichtstrahl wird dann auf den so vorbereiteten Objektträger gerichtet. Das Licht wird an den Metallgrenzen reflektiert. Der Abstand zwischen den reflektierenden Oberflächen der Metallsubstratoberfläche 81 und zum Beispiel den Teilchen der Metallisierung 84 ist eine Funktion der Dicke des Proteinfilms zwischen den Teilen 81 und 84.
Demgemäss variiert das beobachtete reflektierte Licht, das durch die Strahlen 87 illustriert ist, in der spektralen Zusammensetzung je nachdem ob die Proteinschicht eine monomolekulare oder eine bimolekulare Schicht ist.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die in der Fig. 1 in den Blöcken 12, 13, 14 und 18 beschriebenen Stufen. bei dieser Ausführungsform muss das Substrat ein lichtdurchlässiges Substrat sein, wie Glas, Kunststoff, gesintertes Siliziumdioxyd, Glimmer, Quarz und ähnliches und vorzugsweise wird Glas verwendet, wobei Objektträger ein bequem erhältliches Substrat darstellen, das zuerst mit einer Vielzahl von Metallkügelchen beschichtet wird, indem man ein Metall, zum Beispiel Indium, wie in Block 12 der Fig. 1 angegeben, durch Verdampfen auf das Substrat aufbringt. Das Indium zum Beispiel wird langsam aus einem Tantaltiegel in einem Vakuum von etwa 5x10-5 mm Hg auf das Glassubstrat aufgebracht.
Da die Indiumatome auf der Oberfläche des Substrates eine hohe Beweglichkeit haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Substrat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Jedes Metall, das ähnliche Eigenschaften hat und Kügelchen auf dem Substrat bildet, wenn es durch Aufdampfen dort aufgebracht wird, kann hier verwendet werden. Ausser Indium sind Gold, Silber, Zinn und Blei erfolgreich verwendet worden. Das Verdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat eine leicht bräunliche Farbe hat. Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallkügelchen Durchmesser in der Grössenordnung von 1000 . Die genaue Grösse der Kügelchen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben, die einem grossen Anteil der Wellenlänge des sichtbaren Lichtes entsprechen.
Beim nächsten Schritt wird das mit den Kügelchen bedeckte Substrat in eine Lösung eines ersten Proteins eingetaucht, wie in Block 13 der Fig. 1 dargestellt. Das erste Protein haftet wieder in einer monomolekularen Schicht an dem Substrat und den darauf befindlichen Metallkügelchen. Nachdem sich eine monomolekulare Proteinschicht gebildet hat, kann das beschichtete Substrat dazu verwendet werden, Lösungen auf die Anwesenheit eines mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden Proteins zu untersuchen, indem man das beschichtete Substrat in eine solche Lösung eintaucht, in der ein solches spezifisch reagierendes Protein erwartet wird, wie in Block 14 der Fig. 1 angegeben.
War das erwartete spezifisch reagierende Protein vorhanden, dann weisen das Substrat und die Metallkügelchen eine bimolekulare Proteinschicht auf; war das spezifisch reagierende Protein dagegen nicht vorhanden, dann werden das Substrat und die Metallkügelchen nur von einer monomolekularen Proteinschicht bedeckt. Das beschichtete Substrat wird dann entweder im reflektierten oder durchfallenden Licht betrachtet, wie in Block 18 der Fig. 1 angegeben und vom Aussehen des beschichteten Substrates hinsichtlich der Dicke der anhaftenden Proteinschicht und demgemäss der Anwesenheit oder Abwesenheit des erwarteten spezifisch reagierenden Proteins wird letzteres bestimmt. Der Nachweis der Proteinschichten beruht auf Änderungen des Farbtones des leicht braunen Substrates, die in dem beschichteten Substrat beobachtbar sind.
Diese Änderungen sind sehr ausgeprägt, und der Nachweis der Proteinschichten ist in diesem Falle ein sehr einfaches Verfahren. Die Teilchen allein auf dem Substrat erscheinen als ein erster Farbton von Braun, die mit einer monomolekularen Proteinschicht belegten Teilchen erscheinen als ein dunkleres Braun und die mit einer bimolekularen Proteinschicht belegten Teilchen erscheinen als ein noch dunklerer Braunton.
Dieses Nachweisverfahren beruht auf der Tatsache, dass elek- tromagnetische Strahlung in einem starken Masse durch leitende Kügelchen mit Durchmessern gleich einem grossen An teil einer Wellenlänge der einfallenden Energie zerstreut wird und dass im Falle des Zerstreuens durch solche Kügelchen das Zerstreuen stark durch eine dünne auf den Kügelchen befindliche dielektrische Schicht beeinflusst wird.
Fig. 5 zeigt eine Fotografie einer diagnostischen Apparatur gemäss der vorbeschriebenen Ausführungsform. Bei jeder Ansicht der Fig. 5 wird der Testobjektträger im durchfallenden Licht betrachtet. Ansicht 5a gibt einen Glasobjektträger mit Indiumkügelchen auf einer Oberfläche 100 des Objektträgers wieder. Die Ansicht 5b zeigt einen Objektträger der wie der Objektträger der Ansicht 5a zubereitet ist, dessen linke Kante jedoch in eine Lösung von Rinderserum-Albumin eingetaucht worden ist und dabei eine monomolekulare Schicht 101 des Rinderserum-Albumins adsorbierte. Die Ansicht 5c zeigt einen ähnlichen Objektträger dessen linke Kante in Rinderserum-Albumin eingetaucht wurde und die dabei eine monomolekulare Schicht 101 des Rinderserum-Albumins trägt.
Die untere Kante des Objektträgers in Ansicht 5c ist in eine Lösung von Eialbumin eingetaucht worden und weist demgemäss eine adsorbierte monomolekulare Schicht 102 aus Eialbumin auf. Es ist wichtig zu bemerken, dass das Aussehen der beschichteten Teile des Objektträgers der Ansicht 5b ähnlich ist und anzeigt, das nur eine monomolekulare Proteinschicht auf dem Objektträger vorhanden ist.
Dies demonstriert, dass das Rinderserum-Albumin und das Eialbumin zwar an dem Objektträger anhaften, dass das Eialbumin jedoch nicht an dem Teil des Objektträgers haftet, der zuvor mit dem Rinderserum-Albumin beschichtet worden ist. In anderen Worten illustriert die Ansicht 5c die oben genannte Feststellung, dass irgendein willkürlich ausgewähltes Protein zwar an einem Substrat haften wird, das jedoch ein Protein nicht an einem solchen Film aus einem willkürlich ausgewählten Protein haftet. Der Objektträger der Ansicht 5d wurde hergestellt, indem man die linke Kante in eine Rinderserum-Albuminlösung eintauchte, um darauf eine monomolekulare Schicht 101 davon aufzubringen.
Dann wurde die rechte Kante in eine Eialbuminlösung eingetaucht, um dort eine monomolekulare Schicht 102 aufzubringen und schliesslich wurde die untere Kante in eine Lösung eines gegenüber dem Rinderserum als Antiserum wirkenden Kaninchenserums eingetaucht. Demgemäss ist 103 eine monomolekulare Schicht von Kaninchen-Antiserum zum Rinderserum-Albumin.
Das Aussehen der unteren rechten Ecke zeigt an, dass das Kaninchen-Antiserum zum Rinderserum-Albumin nicht an der Eialbuminschicht 102 haftet, und demgemäss ist die untere rechte Ecke des Objektträgers der Ansicht 4d nur mit einer monomolekularen Schicht aus Eialbumin bedeckt Die untere linke Ecke der Ansicht 5d ist deutlich dunkler, was die Anwesenheit einer bimonolaren Proteinschicht an dieser Stelle anzeigt, die eine erste monomolekulare Schicht aus Rinderserum-Albumin, das zuerst daran absorbiert worden ist, umfasst, sowie eine zweite monomolekulare Schicht aus Kaninchen-Antiserum gegenüber dem Rinderserum-Albumin, das immunologisch mit dem darunterliegenden Rinderserum-Albumin komplexiert ist.
Es ist demgemäss zu sehen, dass nur das spezifisch reagierende Proteinpaar eine bimolekulare Schicht auf dem Objektträger bildete, während alle anderen Beschichtungen monomolekular waren.
Bei einer Modifikation dieser Ausführungsform, die ein medizinisches diagnostisches System schafft, wird das die Mc- tallkügelchen aufweisende Substrat teilweise bis zu einer er sten Tiefe in eine Lösung eines ersten Antigens eingetaucht.
Das Substrat wird in einer monomolekularen Schicht durch das erste Antigen in dem Bereich beschichtet, der in die Lö sung eingetaucht war. Dann trocknet man das Substrat und taucht bis zu einer zweiten Tiefe tiefer in eine Lösung eines zweiten Antigens ein. Das zweite Antigen haftet nicht an dem ersten Antigen, wohl aber an dem durch das erste Anti gen nicht bedeckten Teil des Substrates, der in die Lösung des zweiten Antigens eingetaucht wird. Danach trocknet man das Substrat wieder und taucht bis zu einer dritten und grösseren Tiefe in eine Lösung eines dritten Antigens ein.
Das dritte Antigen haftet an dem Teil und nur an dem Teil des Substrates, der noch nicht mit dem ersten oder zweiten Antigen bedeckt ist. Das Verfahren kann für irgendeine Zahl intressierender Antigene wiederholt werden. Man erhält ein Substrat, das mit einer Vielzahl von monomolekularen streifenförmigen Schichten verschiedener Antigene bedeckt ist.
Dieser beschichtete Objektträger ist das für diagnostische Zwecke einsetzbare Werkzeug. Bei dem medizinisch diagnostischen Verfahren wird dieser Objektträger in eine Probe von zum Beispiel Blut üblicherweise mehrere Stunden lang eingetaucht. Danach nimmt man den Objektträger aus der Probe heraus und betrachtet ihn nach dem Waschen in Wasser mittels reflektiertem oder durchfallendem Licht. Der Objektträger zeigt ein Muster hellerer und dunklerer Streifen, welche die in der Probe vorhandenen Antikörper anzeigen und gestattet so eine entsprechende medizinische Diagnose.
Fig. 2 gibt eine stark vergrösserte Seitenansicht eines Teiles des in der vorgenannten Ausführungsform dieser Erfindung beschriebenen diagnostischen Apparates wieder. Fig. 2 zeigt einen Teil des Substratmaterials 31 mit einer Vielzahl von darauf durch Verdampfen aufgebrachten Metallkügelchen 32. Die Teilchen 32 sind vorzugsweise durch Aufdamp fen von Indium auf das Substrat 31 hergestellt, wie oben be schrieben, doch können sie auch durch Verdampfen von Gold, Silber, Zinn, Blei oder eines anderen Metalles hergestellt sein, das ähnliche nicht benetzende und eine atomare
Beweglichkeit aufweisende Eigenschaften hat. Irgendeines einer grossen Zahl von Metallen zeigt solche Eigenschaften, wenn die Temperatur des Substrates verändert wird.
Nach dem Eintauchen in eine Lösung eines ersten Proteins wird das Segment des Objektträgers, der das Substrat 31 und die
Metallkügelchen 32 umfasst, mit einer monomolekularen
Schicht von Molekülen 34 des ersten Proteins bedeckt, wie in Fig. 2 allgemein bei 33 angegeben. Der mit 33 bezeich nete Apparat ist das diagnostische Instrument, das zum Un tersuchen von Lösungen auf die Anwesenheit des mit den
Proteinmolekülen 34 spezifisch reagierenden Proteins ver wendet wird.
Wird der allgemein mit 33 bezeichnete Appa rat dem mit dem Protein der Moleküle 34 spezifisch reagie renden Protein ausgesetzt, dann nimmt der Apparat ein Aus sehen an, wie es allgemein bei 35 gezeigt ist, bei dem das
Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 mit einer bimolekula ren Proteinschicht bedeckt sind, welche die Moleküle 34 des ersten Proteins, die die erste monomolekulare Schicht auf dem Substrat 31 und den Kügelchen 32 bilden und eine zweite monomolekulare Schicht eines Proteins aus den Mole külen 36 des mit dem ersten Protein spezifisch reagierenden
Proteins umfasst, wobei die Moleküle 36 immunologisch mit den Molekülen 34 des ersten Proteins verbunden sind und diese erste Proteinschicht, die Metallkügelchen und das Sub strat überlagern.
Fig. 7 illustriert eine Modifikation dieser Ausführungs form, die einen vergrösserten Kontrast in dem beschichte ten diagnostischen Objektträger schafft. In Fig. 7 wird der
Objektträger 31, der Metallkügelchen 32 darauf trägt und mit Proteinmolekülen 34 beschichtet ist, wie in Fig. 2 einge taucht in eine Menge 71 einer lichtreflektierenden Flüssig keit, wobei die beschichtete Seite nach unten gerichtet ist.
Der Objektträger 31 wird dann von seiner oberen Oberflä che mit reflektiertem Licht betrachtet. Um eine totale Reflek tion des auf den diagnostischen Apparat der Fig. 7 einfallen den Lichtes zu schaffen, ist die reflektierende Flüssigkeit 71 vorzugsweise eine metallische Flüssigkeit und besonders be vorzugt Quecksilber. Wird eine nicht-metallische Flüssigkeit verwendet, dann werden die optischen Einfalls- und Betrach tungswinkel bei Verwendung der Ausführungsform der
Fig. 7 kritisch, wenn Totalreflektion beobachtet werden soll.
Das Aussehen eines Testobjektträgers, der gemäss dieser
Lehre betrachtet wird, ist ähnlich dem in Fig. 5 gezeigten, je doch mit einem verbesserten Kontrast.
Fig. 3 ist eine stark vergrösserte Seitenansicht des Apparates, der für diagnostische Zwecke und für die Reinigung und Konzentrierung von Proteinen und Antikörpern gemäss einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung brauchbar ist. Mit 40 ist allgemein ein Substrat 41 bezeichnet, das mit einer monomolekularen Schicht von Proteinmole külen 42 bedeckt ist, wobei die Einheit 40 in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurde. Mit 43 ist allgemein das Substrat 41 und die Proteinschicht 42 bezeichnet, mit der immunologisch eine zweite monomolekulare Schicht von Proteinmolekülen 44 des mit den Molekülen 42 spezifisch reagierenden Proteins verbunden ist, wobei diese Einheit 43 gemäss den oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Ein zweites Substrat 45 weist einen Tropfen 46 einer Lösung einer schwachen Säure auf.
Die sich gegenüberstehenden Oberflächen der Substrate 41 und 45 mit einer bimolekularen Proteinschicht bzw. einem Tropfen schwacher Säure darauf, der zum Beispiel eine 0,1 normale Zitronensäurelösung sein kann, werden dann physikalisch miteinander in Kontakt gebracht. Gemäss einer erfindungsgemässen Feststellung der vorliegenden Erfindung trennt der Tropfen 46 der schwachen Säure die immunologischen Bindungen zwischen den Molekülen 42 und den Molekülen 44, ohne die biochemischen Eigenschaften der Proteine zu beeinflussen und ohne die Adhäsionsbindung zwischen den Molekülen 42 des ersten Proteins und dem Substrat 41 zu trennen.
Wenn die Substrate 41 und 45, wie bei 47 gezeigt, getrennt sind, dann haftet an dem Substrat 41 eine monomolekulare Schicht der Moleküle 42 des ersten Proteins und an dem Substrat 45 haftet eine monomolekulare Schicht der Moleküle 44 des spezifisch reagierenden Proteins. Das Substrat 41 mit den Molekülen 42 darauf kann dann erneut für das genannte Verfahren verwendet werden, wobei wieder ein Substrat erhalten wird, das mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Proteins bedeckt ist oder man kann das Substrat 41 mit den Molekülen 42 darauf als Testobjektträger gemäss einer der anderen Ausführungsformen der Erfindung verwenden.
Das Substrat 45 mit den daran haftenden Molekülen 44 des spezifisch reagierenden Proteins kann dann gemäss den oben beschriebenen weiteren Ausführungsformen der Erfindung als Objektträger für die Untersuchung von Lösungen auf die Anwesenheit von Molekülen seines entsprechenden ersten Proteins verwendet werden. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als besonders bedeutend angesehen, da, wie bereits ausgeführt wurde, im Falle der üblichen Proteine von biologischem Interesse, Antigene ziemlich leicht in gereinigter Form erhältlich sind und so auf einem Substrat adsorbiert werden können und einen Testobjektträger für den Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern in Lösungen bilden, Antikörper jedoch nicht so erhältlich sind.
Demgemäss war es vor dieser Erfindung im allgemeinen nicht möglich, Testobjektträger für die Untersuchung von Lösungen auf die Anwesenheit von Antigenen her- zustellen. Das Verfahren und der Apparat, wie in Fig. 3 darge stellt, schaffen jedoch Testobjektträger, die ein Substrat 45 umfassen, das mit einer monomolekularen Schicht von zum Beispiel Antikörpermolekülen 44 bedeckt ist und das zur Untersuchung von Lösungen auf die Anwesenheit von Antigen verwendet werden kann.
Eine andere Ausführungsform eines diagnostischen Apparates nach der vorliegenden Erfindung ist strukturell in Fig. 9 gezeigt, und sein Betriebsprinzip ist grafisch in Fig. 8 illustriert. Die Apparatur nach Fig. 9 umfasst ein Goldsubstrat 91, das aus wirtschaftlichen Gründen vorzugsweise aus einem mit einer dünnen Goldschicht versehenen anderen Metall besteht und auf dem eine monomolekulare Schicht 92 eines ersten Proteins adsorbiert ist. Gold hat ein Absorptions.
band innerhalb des sichtbaren Spektrums. Diese Tatsache ist für die charakteristische Goldfarbe verantwortlich und ermöglicht diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Fig. 8 illustriert den Betrieb dieser Ausführungsform und gibt eine Reihe von Reflektivitätskurven wieder, bei denen die relative Reflektivität als Funktion der Wellenlänge aufgetragen ist. Die Kurve 93 repräsentiert die Reflektivität von Goldmetall. Die Kurve 94 gibt die Reflektivität von Goldmetall wieder, das eine monomolekulare Proteinschicht aufweist. Kurve 95 zeigt die Reflektivität von Goldmetall mit einer bimolekularen Proteinschicht darauf. Ein Goldsubstrat, wie 91, hat in Übereinstimmung mit Kurve 93, die leuchtend gelbe Farbe des Goldmetalles. Wird die Testproteinschicht 92 auf das Substrat 91 aufgebracht, dann hat die Testplatte gemäss Kurve 94 ein dunkelgelbes Aussehen.
Nachdem die Testplatte einer Lösung ausgesetzt worden ist, in der man das mit dem Protein der Schicht 92 immunologisch reagierende Protein vermutet, dann weist die Testplatte, wenn ein solches spezifisch reagierendes Protein in der Lösung vorhanden war und die Platte demzufolge eine bimolekulare Protein schicht trägt, eine Reflektivitätscharakteristik, wie sie in Kurve 95 gezeigt ist, auf, und die Platte hat ein deutlich grünes Aussehen.
Nach bisher durchgeführten Versuchen scheinen die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die ein Substrat mit Metallkügelchen und ein Goldsubstrat verwenden, die im allgemeinen brauchbarsten zu sein. Weiter wurde festgestellt, dass diese beiden Ausführungsformen unterschiedliche Empfindlichkeiten haben in Abhängigkeit von den Dicken der interessierenden Proteinfilme. Im einzelnen weist die Ausführungsform mit einem Substrat und Metallkügelchen die grösste Empfindlichkeit auf, wenn die Filmdicken unterhalb von etwa 200 Ä liegen. Das Goldsubstrat hat die grösste Empfindlichkeit für Filme, die eine Dicke von 30 übersteigen.
In einem diagnostischen Verfahren, das gemäss der vorliegenden Erfindung ausgeführt worden ist, wurden Glasobjektträger mit einer dünnen Indiumsschicht bedeckt und mit einer Goldschicht überschichtet. Die Verwendung einer Indiumunterschicht war erforderlich, um die Adhäsion zwischen Glas und Gold zu verbessern. Es wurde weiter festgestellt, dass die Diffusion des Indiums in die darüberliegende Goldschicht die optischen Charakteristiken der Testobjektträger verbesserte. Die so vorbereiteten Objektträger wurden mit einer monomolekularen Schicht des mit der Hepatitis verbundenen Antigens bedeckt.
Proben menschlichen Blutes, die auf die Anwesenheit von Hepatitis zu untersuchen waren, wurden durch Einmischen einer Menge Antikörper ge genüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen zubereitet, wobei eine ausreichende Menge der Antikörper verwendet wurde, um immunologisch aus der Mischung entfernt zu werden, wenn das mit der Hepatitis verbundene Antigen in der Probe vorhanden ist. Dann wurden die Testobjektträger in die so vorbereiteten Blutproben eingetaucht. Nach dem
Herausnehmen wiesen die in die Hepatitis-negativen Proben eingetauchten Objektträger eine bimonokulare Protein schicht auf, die das zuerst aufgebrachte mit der Hepatitis ver bundene Antigen umfassten und eine zweite Schicht von An tikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen An tigen, die immunologisch damit verbunden waren, wie ein grüngefärbter Streifen auf dem Objektträger zeigt.
Die Ob jektträger, die in Hepatitis-positive Proben eingetaucht waren, hielten ihre ursprüngliche dunkelgelbe Färbung bei, und dies zeigt an, dass nur die monomolekulare Schicht aus mit der Hepatitis verbundenem Antigen auf dem Objektträ ger vorhanden war, während die in die Probe eingebrachten
Antikörper durch Komplexbildung mit dem darin enthalte nen Antigen aus der Probe ausgefallen waren und nicht mehr mit dem Antigen auf dem Testobjektträger reagieren konnte.
Es zeigt sich, dass der oben beschriebene Test ein Inhibitionstest ist In einem anderen diagnostischen Verfahren wurde ein direkter Test gemäss der vorliegenden.Erfindung durchgeführt. Bei dem direkten Test wurden Objektträger aus Glas-Indium-Gold und wie oben beschrieben vorbereitet, und dann mit einer monomolekularen Schicht aus Antikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen beschichtet. Einige der Objektträger wurden dann in Serum eingetaucht, dass von Hepatitispatienten entnommen war und von dem man daher wusste, dass es das mit der Hepatitis verbundene Antigen enthält. Andere Objektträger wurden in Serumproben eingetaucht, von denen man wusste, dass sie frei sind von dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen.
Wie erwartet, wiesen die in das Hepatitisserum eingetauchten Objektträger eine bimolekulare Proteinschicht auf, während die in das Hepatitisfreie Blut eingetauchten Objektträger nur eine monomolekulare Schicht aufwiesen.
Theoretisch ist der eben beschriebene direkte Test das bevorzugte diagnostische Verfahren sowohl wegen seiner relativen Einfachheit, als auch weil in diesem Falle der direkte Test eine höhere Empfindlichkeit hat als der Inhibitionstest.
Die höhere Empfindlichkeit des direkten Tests resultiert aus der Tatsache, dass die mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle sehr viel grösser sind als die Moleküle des Antikörpers gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen. Daher bewirkt der direkte Test, eine sehr viel grössere prozentuale Änderung der Filmdicke und demgemäss ist ein grösserer Kontrast beobachtbar.
Die Konzentration des mit der Hepatitis verbundenen Antigens im Blut einer Person, die der Krankheit ausgesetzt ist, ist eine Funktion der Zeit. Die Konzentration des Hepatitisantigens ist sehr hoch, während der klinischen und unmittelbar vor klinischen Phasen der Hepatitis. In den weit nachklinischen Phasen ist die Konzentration des Hepatitisantigens im Blut einer Person jedoch sehr gering. Beide Zustände sind medizinisch von Interesse. Der Nachweis des Antigens während der klinischen und unmittelbar vorklinischen Phasen ist für Diagnosezwecke wertvoll. Der Nachweis des Antigens in der weit nachklinischen Phase ist für die Untersuchung des Blutes von in Aussicht genommenen Blutspendern wertvoll.
Der einfacherere empfindliche direkte Test ist daher für diagnostische Zwecke bevorzugt, da er leicht durchgeführt werden kann, wegen der relativ hohen Konzen tration des Hepatitisantigens in der Blutprobe.
Der für Überprüfungszwecke beschriebene Inhibitionstest ist experimentell ausgewertet worden, um seinen Wert relativ zu anderen bekannten Überprüfungstests zu bestimmen. In diesen Tests wurde das Hepatitis-positive Serum mit bekanntem Hepatitis-negativem Serum verdünnt. Unter Anwendung der oben beschriebenen Inhibitionsprozedur führte eine Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Serums mit 32 Teilen bekannten Hepatitis-negativem Serum zu einem zuverlässigen Nachweis während einer Stunde. Die Anwen dung einer Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Se rums mit 3000 Teilen bekannt negativem Serums, ergab einen zuverlässigen Nachweis während 24 Stunden. Diese Er gebnisse erweisen sich als sehr ähnlich in der Empfindlich keit bzw. der erforderlichen Zeit wie das bekannte Verfah ren der Gegenelektrophorese bzw. der Radioimmunisierung.
Ein Überprüfungsverfahren gemäss der vorliegenden Erfin dung ergibt also Resultate, die vergleichbar sind mit den be sten nach bekannten Verfahren erhältlichen, wobei ein zu sätzlicher Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens der eines beträchtlich billigeren Verfahrens ist
Die bevorzugte Verwendung eines goldbeschichteten Sub strates gegenüber einem mit Metallkügelchen beschichteten
Substrat bei dem vorbeschriebenen diagnostischen Hepatitis Verfahren ist durch den Durchmesser der Hepatitis-Antigenmoleküle bedingt, der bei etwa 210 Ä liegt. Solche Filmdikken liegen gut im Bereich der Möglichkeiten goldbeschichteter Substrate, um eine empfindliche Anzeige zu geben, doch sind sie zu dick für eine hochempfindliche Anzeige unter Verwendung mit Metallkügelchen beschichteten Substrats.
In Fig. 4 ist ein Apparat gemäss einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Konzentrierung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern in einem mechanischen schematischen Diagramm dargestellt.
Zur Erleichterung des Verständnisses der Ausführungsform der Fig. 4 sei darauf hingewiesen, dass der im Betrieb befindliche Anfang der Ausführungsform der Fig. 4 eine Modifikation der Ausführungsform der gerade besprochenen Fig. 3 ist. In Fig. 4 wird ein kontinuierlicher flexibler Gurt aus Substratmaterial 51, welches mit einer monomolekularen Proteinschicht bedeckt ist, das spezifisch mit dem zu konzentrierenden und reinigenden Protein reagiert, zuerst in einen Behälter 52 eingeführt, der eine gewisse Menge Flüssigkeit 53 enthält, in der sich das zu reinigende Protein befindet.
Das immunologische Komplexieren zwischen den beiden spezifisch miteinander reagierenden Proteinen findet im Behälter 52 statt, und dann gelangt der Substratgurt 51, der nun eine bimolekulare Proteinschicht aufweist, in den Behälter 58, in dem sich eine Lösung 59 einer schwachen Säure befindet, welche die immunologische Bindung zwischen den beiden spezifisch miteinander reagierenden Proteinen trennt und dabei die Moleküle der zweiten Proteinschicht in der Lösung 59 sammelt. Nach dem Verlassen des Behälters 58 befindet sich daher auf dem Substrat 51 wieder nur die ursprüngliche monomolekulare Proteinschicht. Das Substrat 51 wird dann in den Behälter 52 zurückgeführt, um wieder eine monomolekulare Schicht des zu sammelnden Proteins aufzunehmen, welche wieder im Behälter 58 abgelöst wird.
Der Gurt 51 wird mittels der Gurtantriebsachsen 60 und 63, die mit den entsprechenden Klemmrollen 61 und 62 zusammenarbeiten, durch die Lösungen 53 und 59 geführt. Die Gurtantriebsachsen 60 und 63 können mit jeder geeigneten Einrichtung angetrieben werden, die zweckmässigerweise kleine elektrische Motoren umfassen kann, die mit den Gurtantriebsachsen 60 und 63 durch die Geschwindigkeit verringernde Getriebe verbunden sein können. Da die immunologische Komplexierungsreaktion sehr viel langsamer vor sich geht als die die Bindungen trennende Säureeinwirkung, ist es zweckmässig, dass der beschichtete Substratgurt 51 für eine sehr viel längere Zeit in Kontakt mit der das zu sammelnde Protein enthaltenden Lösung 53 ist als mit der die schwache Säure enthaltenden Lösung 59.
Es ist demgemäss zweckmässig, dass der Behälter 52 beträchtlich grösser ist als der Behälter 58 und dass eine Vielzahl von oberen und unteren Leitrollen 54 bzw. 55 verwendet werden, um den Gurt 51 vielfach durch die Lösung 53 zu führen. Auf diese Weise befindet sich der Gurt 51 zu irgendeiner Zeit mit einer grösseren Länge in Kontakt mit der Lösung 53, und auf diese Weise ist irgendein Segment des Gurtes 51 eine längere Zeit der Lösung 53 ausgesetzt. Andererseits ist ein einziger Durchgang des Gurtes 51 durch die Säurelösung 59 völlig ausreichend, um die zweite Proteinschicht davon abzulösen. Daher ist lediglich ein Paar oberer Leitrollen 56 und eine einzige Leitrolle 57 für die Führung des Gurtes 51 durch die Säurelösung vorgesehen.
Eine Vielzahl von Leitrollen 64 ist vorgesehen, um dem Gurt 51 während seines Ueberganges zwischen den Behältern 52 und 58 die erforderliche mechanische Abstützung zu geben. Die Behälter 52 und 58 sind vorzugsweise mit Rühreinrichtungen 85 bzw. 66 versehen, die flüssigkeitsdicht durch die Wände der entsprechenden Behälter hindurchgeführt-sind, um die Lösungen 53 bzw. 59 zu rühren und so eine Erneuerung der Lösungen zu bewirken, die sich in Kontakt mit dem Gurt 51 befinden. Der Behälter 52 ist mit einem Abzugsrohr 67 versehen, das durch das Ventil 68 gesteuert wird und durch das die Lösung 53 abgelassen werden kann, wenn man die Konzentration des erwünschten Proteins bis zu einem Punkt verringert hat, bei dem eine weitere wirksame Aufnahme nicht mehr möglich ist.
Eine frische Probe der Lösung 53 kann dann durch den oberen offenen Teil in den Behälter 52 eingefüllt werden. Auch der Behälter 58 ist mit einem Abzugsrohr 69 versehen, das durch das Ventil 70 gesteuert wird und durch das die Lösung des gereinigten Proteins in der schwachen Säure abgezogen werden kann, wenn die gewünschte Konzentration erreicht ist.
Eine frische Säurelösung kann dann ähnlich durch das obere offene Ende in den Behälter 58 eingefüllt werden. Wie oben im Zusammenhang mit Fig. 3 beschrieben, kann der Substratgurt 51 mit jedem gewünschten Protein, sei es ein Antigen oder ein Antikörper, beschichtet werden. Verfahren und Apparat der Fig. 4 sind daher für das Sammeln einer gereinigten Konzentration irgendeines erwünschten Proteins geeignet, solange eine immunologische Reaktion mit dem gewünschten Protein vorhanden ist. Durch leichtes Modifizieren seiner Wirkungsweise kann der Apparat der Fig. 4 auch dazu verwendet werden, selektiv ein spezifisch unerwünschtes Protein aus einer Mischung, wie einem Serum, zu entfernen.
Um dies zu bewirken, lässt man den Apparat der Fig. 4 einfach für eine längere Zeit ohne Erneuerung der Lösung 53 und mit periodischen Erneuerungen, soweit sie erforderlich sind, der Lösung 59 laufen. In diesem Falle wird beim Ab zugsrohr 67 das Serum 53 erhalten, aus dem das unerwünschte Protein bis zu jedem erforderlichen Grad, abhängig nur von der Betriebszeit des Systems, entfernt worden ist.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Lösung gemäss dem Patentanspruch I des Hauptpatentes, dadurch gekennzeichnet, dass man ein die Platte aus lichtdurchlässigem Material schlecht benetzendes Metall aufbringt und dass man zur Prüfung, ob an der Platte eine bimolekulare oder monomolekulare Proteinschicht haftet, die Platte mit der Metall- und Proteinschicht nach unten auf die Oberfläche einer Flüssigkeit aufbringt.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man auf die Platte Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei aufdampft.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit eine metallische Flüssigkeit, vorzugsweise Quecksilber, ist und die Platte visuell mit reflektiertem Licht geprüft wird, während sie sich in Kontakt mit der metallischen Flüssigkeit befindet.
PATENTANSPRUCH 11
Vorrichtung nach Patentanspruch 11 des Hauptpatentes zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch I hiervor, gekennzeichnet durch ein Substrat mit einer Vielzahl von an der Oberfläche des Substrats haftenden Kügelchen aus einem Metall, das das Substrat schlecht benetzt, und einer monomolekularen Schicht eines immunologisch reaktiven Proteins, die mindestens einen Teil des Substrats und der Metallkügelchen bedeckt.
UNTERANSPRÜCHE
3. Vorrichtung gemäss Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Vielzahl monomolekularer Schich
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