DE3025022C2 - Verfahren zur Bestimmung biologischer Teilchen durch induzierte Signale - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung biologischer Teilchen durch induzierte SignaleInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung biologischer Teilchen einer bestimmten Spezies in einem
Fluid, bei dem ein mit geeigneten biologischen Teilchen überzogenes metallisches Substrat nacheinander
mit dem Fluid und weiteren geeigneten biologischen Teilchen in Kontakt gebracht wird und nicht gebundene
Teilchen jeweils abgewaschen werden, und anschließend das vorbereitete Substrat anregenden Teilchen
ausgesetzt und die Fluoreszenz der zu bestimmenden biologischen Teilchen mit einer Quantitätsmeßeinrichtung
gemessen wird.
Es wird in diesem Zusammenhang bezug genommen auf die US-Patente Nr. 40 11 308 »Method for Surface
Immunological Detection of Biological Particles by the use of Tagged Antibodies« und 39 26 564 »Substrate for
immunological Tests and Method Fabrication Thereof« v. 1. Giaever; »Blood Coagulation Studies with the Recording
Ellipsometer« von I. Vromau \National Bureau
of Standards Miscellaneous Publication 256 September 1964); »A Study of Antigens and Antibodies by the Monolayer
Film Technique of Langmuir« von M. F. Shaffer und ). H. Dingle (Proceeding of Society of Experimental
Biological Medicine 38. S. 528-530. 1938): »Immunological
Reactions Between Film of Antigen and Antibody Molecule« von A. Rothen (lournal of Biological Chemistry
Bd. 168 S. 75-97 (April/Mai 1949); »The Beginnings of Immunofluorescence« von A. H. Coons (J. Immunology
87 S. 499-503 (1961): »Fluorescent Protein Conjugates« von R. F. Steiner Ut11. N. Edelhoch (Chemistry
Review 62. S. 457-483 (1962): sowie »Radioimmunoassay«
von D. S. Skeller et al. (Clinical Chemistry 19 (2) S. 146-186(1973).
Immunologische und spezifische Bindungsreaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen. Die immunologische
Reaktion ist für die Bekämpfung von Krankheiten von höchster Bedeutung. Die Schlusselproteine
und Rezeptoren sind wichtig für den Transport und das Gleichgewicht spezifischer Hormone und Molekülc,
die die Hormonfunktion stören. Um diese Art spezifischer Bindungsreaktionen auf einer Metalloberfläche
ablaufen zu lassen, haben Shaffer et al., Rothen und viele andere Forscher Ellipsometer verwendet, um
die an das Antigen gebundene Antikörpcrnicnge und
h5 umgekehrt, /u bestimmen. In neuerer Zeit wurde von
Giaever ein visueller Detektor entwickelt, bei dem eine
speziell präparierte Metalloberfläche verwendet wird (US-PS 39 26 564). Da jedoch das Signal von dem unbe-
waffneten Auge empfangen wird, bleibt die quantitative Bestimmung sehr ungenau.
Durch die DE-PS 25 09 215 ist ein fluorometrisches System und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung
einer fluoreszenten Mustersubstanz bekannt, wobei biologische Teilchen der zu untersuchenden Spezies
in einem Antigenauftrag eingebettet und danach fluoreszenzbehaftete Antikörper zugesetzt und jeweils
nicht gebunden^ biologische Teilchen abgewaschen werden. Anschließend wird dieses Substrat beispielsweise
einer Lichtquelle ausgesetzt und die Intensität der von der Substanz emittierten Fluoreszenz gemessen.
Nachteilig bei diesem bekannten Verfahren ist, daß eine große Anzahl von Störsignclen auftritt, da das dort verwendete
Substrat eine große Streuung aufweist
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur Bestimmung biologischer Teilchen der eingangs genannten Art zu schaffen, bei welchem die Störung
gegenüber dem infolge der Fluoreszenz induzierten Signals vermindert ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Substrat mit einer stark reflektierenden Metalloberfläche
verwendet wird, daß die anregenden Teilchen durch Reflektion der Substratoberfläche von der
Quantitätsmeßeinrichtung fortgelenkt werden, und daß im wesentlichen nur das von den fluoreszierenden biologischen
Teilchen induzierte Signal auf die Quantitätsmeßeinrichtung gelenkt wird.
Durch die Verwendung einer stark reflektierenden Metalloberfläche als Substrat wird die Störung stark
vermindert. Das anregende Signal, das nicht zur Anregung der Fluoreszenz gebraucht wird und die Störung
der Fluoreszenzmessung bildet, wird von der Quantitätsmeßeinrichtung
abgeleitet und beispielsweise von einer Photonenfalle aufgenommen. Dadurch kann die
Störung um einen Faktor um mehr als 104 verringert
werden, während das Signal nur um etwa das zehnfache vermindert wird. Daraus ergibt sich eine Verbesserung
des Signal-StörungsVerhältnisses von mehr als 103 gegenüber
bekannten Verfahren. Das bedeutet, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf einfache Weise
spezifische Proteinteilchen in einer Konzentration zwischen
0.1 ng/cm' bis 1 ng/cm1 ermittelt werden können,
was mit dem bekannten Verfahren nicht möglich ist.
Bevorzugte Weiterbildungen und Ausführungen des erfindungsge.näßen Verfahrens sind .P den Unteransprüchen
angegeben.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden anhand der Zeichnungen erläutert. Es zeigt
F i g. 1 einen Schnitt dui>:h ein in dem Verfahren gemäß
der Erfindung verwendbaren Präparat mit einem Substrat mit einer in der rnonomoiekularen Proteinschicht
gebundenen zweiten Art biologischer Teilchen:
F i g. 2 einen Schnitt durch ein erfindungsgemäß ver
wendbares Präparat mit an die zweiten biologischen Teilchen gebundenen dritten biologischen Teilchen;
V ι g. 3A eine Ansicht einer Ausführungsform einer
Vorrichtung zur Überprüfung des fertigen Substrats. Das Photonenzählsystem befindet sich in einem Abstand
von dem Substrat, damit die anregenden Teilchen von der Metalloberfläche gegen das dunkle Gehäuse
reflektiert werden, so daß alle darauf auftreffenden Photonen absorbiert werden, während zufolge dieser Reflexion
ein verstärktes induziertes Signal vom Substrat zum Photonenzählsystem laufen kann,
F i g. 3B eine perspektivische Ansicht eines Teiles der Vorrichtung von F i g. 3A. K»ier ist eine Elektronenkanone
31 gezeiet. Das Substrat 30 wird mittels einer Metallbürste 33 positiv aufgeladen und auf konstanter Spannung
gehalten. In Fig. 3B sind nur die Kontaktteile von Bürste 33 und Oberfläche 30 im Detail gezeigt. Die
Rückwand des dunklen Aufnahmekastens 35 weist ein Loch 34 auf. durch das Licht auf die Metalloberfläche
30' gerichtet werden kann,
F i g. 4 ist ein Schnitt durch das Präparat von F i g. 2, der eine vierte Art biologischer Teilchen an die zweite
Art, die wiederum an die erste Art gebunden ist, gebunden zeigt,
Fig. 5 ist ein Schnitt durch das Präparat von Fig. 1.
das die dritte Art biologischer Teilchen an die erste Art gebunden zeigt.
Nachdem einige biologische Teilchen von Interesse
(2. biologisches Teilchen) an die erste Schicht aus Protein gebunden sind, hat das Substrat den in F i g. 1 gezeigten
Aufbau aus dem eigentlichen Substrat 10, der Metalloberflächenschicht
11, den ersten biologischen Teilchen 12 und den zweiten biologischen Teilchen 13. Ein
biologisches Teilchen, wahrscheinlich der Antikörper des zweiten biologischen Teilchens, wii* mit einem fluoreszierenden
Farbstoff verbunden. Em Ttopfen einer Lösung dieses fluoreszierenden Antikörpers (drittes
biologisches Teilchen) wird auf das Substrat, das be; ?its das zweite biologische Teilchen aufweist, wie in F i g. 1
gezeigt, aufgebracht. Dann wird das Substrat vorzugsweise so lange in einer Feuchtigkeitskammer gehalten,
daß der fluoreszierende Antikörper mit dem zweiten biologischen Teilchen reagiert. Nach der Reaktion hat
das Substrat den in Fig.2 gezeigten Aufbau. Die Menge
an gebundenem fluoreszierenden Antikörper 14 ist proportional der Menge an dem auf dem Substrat 30
anwesenden zweiten biologischen Teilchen. Das Präparat mit dem in F i g. 2 gezeigten Aufbau wird in ein
geschlossenes Gehäuse mit einer Lichtquelle 31, die dem Induzieren einer Fluoreszenzemission von dem
Substrat 30 dient, eingebracht. Das Photon von der Lichtquelle 31 wird nach Auftreffen auf das Substrat 30.
das eine reflektierende metallische Oberfläche hat. gegen die Wand des Gehäuses reflektiert und von ihr eingefan~en.
während das induzierte Signal von dem Photonenzählsystem 32. das der Messung der Quantität dieser
Fluoreszenzemission dient, angezeigt wird. Da eine konstante Lichtquelle verwendet wird, ist das an, Photonenzählsystem
32 angezeigte Signal pro- Kortiona! der
Menge an fluoreszierendem Antikörper 14 an dem Substrat. Daher ist es nicht notwendig, daß die biologischen
Teilchen, damit sie bestimmt werden können, eine Schicht bilden. Die zweiten biologischen Teilchen werden
an die erste oder Proteinschicht gebunden. Da die zweiten biologischen Veilchen keine Schicht bilden müssen,
müssen diese ersten biologischen Teilchen nicht die ganze Schicht einnehmen. Daher braucht die erste
Schicht aus Protein nicht von hoher Reinheit zu sein.
Alles dies sind beträchtliche Vorteile gegenüber den
US-PS 39 26 564 und 40 11 308.
Ein weiterer Vorteil bestehi dann, daß das bei Durchführung
des Verfahrens gemäß der Erfindung aufgefangene Signal nicht vo . der Größe aes biologischen Teil·
chens abhäng·.
Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung können sowohl große biologische Teilchen (vergleichbar den in
der US-PS 38 53 467 genannten) als auch kleine biologische Teilchen (vergleichbar den in der US-PS 39 26 564
genannten) bestimmt v?rden.
Auch kleinere Teilchen, wie Steroidhormon und Polypeptide, können bestimmt werden. Der gebundene fluoreszierende
Farbstoff kann
(A) ein Fluorescein-derivat. üblicherweise Fluoresceinisocyanat
(FIC) oder -isothiocyanat (FITC),
(B) ein Rhodamin-derivat, üblicherweise Rhodaminisocyanat oder -isothiocyanat, Lissamin-rhodamin-B200-sulfonylchlorid
(RB200XC), oder
(C) 1 - Dimethylaminonaphtalin-S-sulfonylchlorid
(DANSC),
sein.
Diese Farbstoffe sind im Handel erhältlich, und auch
einige Antikörper mit daran gebundenem fluoreszierendem Farbstoff sind im Handel erhältlich. Für verschiedene
Farbstoffe werden zweckmäßig verschiedene Lichtquellen und verschiedene Photonenbestimmungsvorrichtungen
verwendet. Die am stärksten intensivierte Lichtquelle ist der Laser. Es können aber auch Bogenlampen
mit einer Wellenlängenselektiereinrichtung oder Wolframlampen mit einer Wellenlängenselektiereinrichtung
zum Auswählen einer günstigen Wellenlänge verwendet werden. Die stark reflektierende Oberfläche
des Substrats lenkt die anregenden Photonen von dem Photonenzählsystem 32 ab. so daß das induzierte
Signal nicht von anregenden Photonen gestört wird. Je stärker die Vermischung von induziertem Signal und
anregenden Photonen ist. desto größer ist die Störung. Je höher das Verhältnis Signal zu Störung ist, desto
zuverlässiger sind die Testergebnisse. Unabhängig davon, was für eine Lichtquelle verwendet wird, ist für die
Photonenbestimniu,ngsvorrichtung eine Ellenlängenselektiereinrichtung
erforderlich, um die Fluoreszenzemissionen weiter zu selektieren, da sie mit einer geringen
Menge an anregenden Photonen gemischt sein kann, obwohl wegen der Verwendung der Reflektiereinrichtung
das Verhältnis Signal zu Störung sehr groß ist. Die Wellenlängenselektiereinrichtung kann ein Monochromator
oder ein Filter sein.
Das anregende Signal muß kein Photon sein. Es kann ein Neuironensignal sein und das induzierte Signal kann
^«■Strahlung (bekannt als Neutronenaktivierungsanalyse) oder andere Strahlung sein.
Es können Elektronen oder andere geladene Teilchen sein und das induzierte Signal kann die charakteristische
Röntgenstrahlung sein, wenn das dritte biologische Teilchen
mit spezifischen Elemenien etikettiert ist. Beispielsweise
kann eine Metalletikettierung durch Ferritin,
das im Handel erhäStlich ist. erfolgen, und das wirtschaftlichste
geladene Teilchen kann ein Elektron sein. In diesem Fall wird die Metalloberfläche positiv aufgeladen
und mit einer konstanten Spannung verbunden, wie m Fig. 3B gezeigt. Diese Metalloberfläche dient
dann als die Elektronenfalle. Em entsprechendes Photonenzählsystem
kann verwendet werden, um das induzierte Signal von dem Eisenelement zu bestimmen.
Die zu messende Menge an induziertem Signal kann durch Ändern der Menge an erregendem Signal manipuliert
werden. Gemäß der Erfindung werden die anregenden Teilchen von dem Signalbestimmungssystem
fortgelenkt, so daß das Signal verstärkt wird, ohne daß
die Störung beträchtlich erhöht wird In der Vorrichtung ergibt ein mit einer Metallschicht überzogenes
Substrat ohne biologische Teilchen sehr wenige Sr.örungsgeräuscbzählungen.
Das ist eine Verbesserung gegenüber
den bekannten Vorrichtungen.die eine Emanation eines Signais von einer Quelle von konstantem
Wert, der von der spezifischen Aktivität abhängt, verwenden.
Auch wird die Emanation mit der Zeit geringer,
manchmal bei sehr kurzer Halbwertszeit, und es ist daher schwieriger, damit zu arbeiten. Die Verwendung
eines induzierten Signals ist ein beträchtlicher Vorteil gegenüber der US-PS 40 11 308.
Bei Verwendung eines induzierten Signals kann der natürliche Hintergrund gemessen werden, indem man
das anregende Signal dafür abschaltet; d. h. die Abscheidung eines biologischen Teilchens zur Bildung eines
speziellen Musters, wie es gemüß US-PS 40 11 308 erforderlich
ist, ist nicht notwendig. Die Zählung außerhalb des Musters ist das. was unter dem natürlichen
Hintergrund zu verstehen ist.
Durch die Verwendung der Vorrichtung wird es möglich,
eine Spurenmenge an dem dritten biologischen Teilchen auf der Metalloberfläche zu bestimmen. Das
heißt, es hat sich gezeigt, daß das dritte biologische Teilchen,
um bestimmt zu werden, keine Schicht bilden muß. Auch das zweite biologische Teilchen oder das erste
biologische Teilchen müssen keine Schicht bilden. Als die erste Schicht wurden teilweise gereinigte erste biologische
Teilchen (beispielsweise nach Fällung mit Ammoniumsulfat) verwendet. Die geringe Menge an zweiten
biologischen Teilchen ragen ebenso wie die dritten biologischen Teilchen aus der Metalloberfläche heraus.
Das ist gegenüber der Verwendung von Schichten ein Vorteil, weil die Teilchen von Interesse in die Lösung
hineinragen und dadurch die spezifische Reaktion erleichtern und die nicht spezifische Bindung verringern.
Sowohr die Zeit zur Durchführung eines solchen Tests als auch die Menge an nicht spezifischer Bindung wird
stark verringert. Weitere Vorteile des Verfahrens gemäß der Erfindung gegenüber den Verfahren der US-PS
40 11 308 und 39 26 564, bei denen die ersten, die zweiten oder die dritten biologischen Teilchen Schichten
bilden, damit sie bestimmt werden können (Giaevcr Südes), sind:
Es ist nur eine sehr geringe Menge an ersten biologischen
und zweiten biologischen Teilchen (etwa Viooo der von Giaever verwendeten) erforderlich,
um einen Test durchzuführen. Die ersten biologischen Teilchen müssen nur teilweise gereinigt sein
und können daher leichter erhalten werden und sind billiger.
Einfluß der Gleichgewichtskonstante: Wenn die ersten biologischen Teilchen eine Schicht bilden, ist
eine Bindung mit dem Metall erforderlich, damit diese Teilchen nicht in Lösung gehen, und um dies
zu erreichen, ist eine große Menge an ersten biologischen Teilchen erforderlich.
Wenn auch die zweiten biologischen Teilchen eine Schicht bilden, ist ss die Bindung zwischen dem ersten
und dem zweiten biologischen Teilchen, die verhindert, daß das zweite biologische Teilchen in Lösung geht. Für
die Bildung einer Schicht aus dem zweiten biologischen Teilchen gibt es jedoch eine Mindestkonzentration an
dem zweiten biologischen Teilchen in der Lösung, unter der dieses zweite biologische Teilchen keine Schicht
bilden kann. Dadurch wird die Genauigkeit des Testergebnisses stark vermindert Bei dem Verfahren gemäß
der Erfindung gibt es keine Schicht aus den zweiten biologischen Teilchen. Auch die Menge an ersten biologischen
Teilchen in der Proteinschiciit kann mit dem
Grad der Reinigung oder des Zusatzes verschiedener Mengen an inertem Protein wie BSA variieren. Die beste
Auflösung ist sehr viel empfindlicher, und ihre Grenzen hängen von der Menge an dritten biologischen Teilchen,
die noch genau gemessen werden kann. ab.
Das wesentlichste Merkmal der in F i g. 3A gezeigten Vorrichtung ist das metallische Substrat. Im Weg des
anregenden Photons, das von der Lichtquelle 32 ausgeht und an der Wand des dunklen Gehäuses endet, darf sich
nichts befinden als die stark reflektierende metallische
Oberfläche und die biologischen Teilchen darauf. Wenn der Einfallswinkel gleich dem Reflektionswinkel ist und
das Sigr.albestimmungssystem senkrecht zu dem Substrat und in einigem Abstand davon angeordnet ist, wird
das anregende Teilchen nicht auf das Bestimmungssystem zu gestreut. Auch kann die Form des Oehäuses so
gewählt werden, daÜ sein Einfangvermögen erhöht wird, so daß fast alle anregenden Teilchen, die gegen die
entsprechend ausgebildete Falle reflektiert werden, dort abgebremst werden und nicht zu dem Signalzählsystem
gelangen. Das induzierte Signal, das von dem dritten biologischen Teilchen ausgeht, nachdem das anregende
Teilchen absorbiert ist. kann in jeder Richtung ausstrahlen, und ein Teii davon, der vun der SarniiiciOffnung
des Photonenzählsystems abhängt, gelangt zu dem Photonenzählsystem. Wegen der stark reflektierenden
metallischen Oberfläche werden auch diejenigen induzierten Photonen, die direkt in eine Richtung entgegengesetzt
von dem Photonenzählsystem abgestrahlt werden, zurückreflektiert und treten in das Photonenzählsystem
ein.
Die Vorrichtung ist speziell für ein stark reflektierendes Substrat ausgebildet, und es ist nicht wesentlich, daß
es ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat ist. Jedoch ist ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat
eines der zweckmäßigsten. Aber auch beispielsweise ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat,
das noch eine dünne Schicht aus einem Gel aufweist, ist ein gutes Substrat. Auch ist es nicht von entscheidender
Bedeutung, daß die daran gebundenen Moleküle Proteinmoleküle sind. Vielmehr kann die Vorrichtung auch
für andere Moleküle oder dünne Gewebeschnitte und andere Dinge, die durch Trocknen, chemische Umsetzung,
Adhäsion, Bindung oder andere Maßnahmen zur Bindung an ein solches stark reflektierendes Substrat
gebracht sind, verwendet werden.
in der Vorrichtung kann auch für eine trockene Probe, wie im vorliegenden Fall, eine Lichtquelle sehr hoher
Intensität verwendet werden. Die stark reflektierende Metalloberfläche bewirkt, daß es zu einer nur sehr geringfügigen
Photonenabsorption (die in Wärme umgewandelt wird) kommt, so daß auch die Wahrscheinlichkeit
eines Ausbleichens oder einer Beschädigung der Probe sehr gering ist. Daher kann sogar ein Laser als
Lichtquelle verwendet werden. Dies sind beträchtliche Vorteile gegenüber den US-PS 40 56 724 und 40 36 946.
F_s gibt verschiedene Wege zur Bindung der ersten biologischen Teilchen an das Substrat. Für ein mit einem
Metallüberzug versehenes Substrat kann die erste Stufe in einem Eintauchen bestehen, und auch für die Bindung
der zweiten biologischen Teilchen an die ersten biologischen Teilchen und für die Bindung der dritten biologischen
Teilchen an die zweiten biologischen Teilchen (die ersten biologischen Teilchen in Fig.5) kann in gleicher
Weise vorgegangen werden. Um den Test zu beschleunigen, kann die Probe auf dem Substrat getrocknet werden.
Um die nicht-spezifische Bindung zu senken, kann ein Eintrocknen der Lösung dadurch verhindert werden,
daß man das Substrat in einer Feuchtigkeitskammer hält. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann jedoch
in vielfacher Weise modifiziert werden. Beispielsweise kann die Probe in ein kleines Rohr eingebracht werden,
um den Kontakt mit dem Substrat auf ein kleines Gebiet zu begrenzen; oder das Volumen der Lösung der Probe
kann dadurch vergrößert werden, daß ein Becher verwendet wird. In jedem Fall ist es wesentlich, daß das
fertige Substrat gewaschen wird. Da die Metallobcrfläehe die ersten biologischen Teilchen bindet, die ersten
biologischen Teilchen die zweiten biologischen Teilchen binden usw., wird durch Waschen die nicht-spezifische
Bindung, nicht jedoch die durch die spezifische Reaktion erfolgte Bindung gelöst. Bei Substraten aus Glas, Plastik
oder vielen anderen Materialien, erfolgt dagegen keine Bindung zwischen ersten biologischen Teilchen und
Substrat, und durch Waschen kann daher die durch die spezifische Reaktion eriolgte Bindung gelöst werden,
während andererseits bei Unterlassung des Waschens die durch nicht-spezifische Reaktion erfolgte Bindung
an das Substrat erhalten bleibt und daher eine quantitative Messung unmöglich wird.
Außerdem sind solche Substrate nicht stark reflektie-
Außerdem sind solche Substrate nicht stark reflektie-
Fcfiu üfiu crgCi/Cn uahc
I III Ut-I
£Ute Auflösung.
Um die quantitative Bestimmung bei einem Test zu verbessern und die Umsetzung klar erkennbar zu machen,
werden zweckmäßig in einer Serie von Tests Substrate mit gleicher Fläche und gleicher Menge an Losung
der Probe verwendet.
Die Absorptions- und Emissionsspektren der meisten fluoreszierenden Verbindungen, die zur Einfärbung von
Protein verwendet werden, sind von Hansen PA (1964) (Publikation der University of Maryland College Park,
Maryland) zusammengestellt.
Die Peakwellenlänge des zu verwendenden Filters oder Monochromator wird zweckmäßig unter Verwendung
dieser Angaben ausgewählt. Es wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung eines im Handel erhältlichen
(Oriel Corporation) Engbandinterferenzfilters mit einer Transmission außerhalb eines Durchlässigkeitsbereiches
von 0,01% nicht genügt, um eine Spurenmenge an dritten biologischen Teilchen auf dem Substrat zu
bestimmen, weil das Störgeräusch des Instruments (zur Ablesung einer blanken Metalloberfläche) noch hoch
ist.
Bei Verwendung von zwei solchen Engbandfiltern als Gruppe als Filter sowohl für das anregende als auch für
das induzierte Signal wird die Auflösung sehr gut und das Störgeräusch des Instruments nicht wahrnehmbar.
Nach Hansen sind sowohl die Absorptions- als auch die Emissionsbande sehr breit und werden noch breiter,
wenn eine Bindung an eine stark reflektierende Metalloberfläche erfolgt ist. Die genaue Paekwellenlänge dieser
Engbandinterferenzfilter ist nicht wesentlich. Es wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung von zwei
Filtern als Gruppe besser geeignet ist, um die gleiche Paekwellenlänge und Bandbreite zu haben.
Wenn als Lichtquelle ein Laser verwendet wird, muß kein Filter für das anregende Signal verwendet werden.
Monochromatoren eignen sich ausgezeichnet zur Wahl des anregenden Signals, insbesondere wenn Lichtquellen
hoher Intensität verwendet werden.
Es ist einfach, andere Spezies Antikörper zu Aiitikörper
zu erzeugen. Beispielsweise kann Ziegenantikörper für Kaninchen-z-globulin erzeugt werden, indem man
Ziegen Kaninchen-^-globulin injiziert und umgekehrt.
Der Ziegenantikörper für Kaninchen-v-globulin bindet
Kaninchenantikörper und der Kaninchenantikörper für Ziegen-v-globulin bindet den Ziegenantikörper. Daher
muß der fluoreszierende Antikörper nicht direkt an das zweite biologische Teilchen binden, sondern kann nach
dem vierten biologischen Teilchen kommen, wie durch
Beispiel 2 veranschaulicht. Der komplementierende fluoreszierende Antikörper kann auch als das dritte biologische
Teilchen verwendet werden, wenn das zweite biologische Teilchen der Antikörper des ersten biologischen
Teilchens ist. Die Menge an gebundenem Komplement ist proportional der Menge an gebundenem
zweiten biologischen Teilchen.
Die erste Schicht aus Protein enthält HCG (menschliches chorionisches Gonadotropin). Das zweite biologische
Teilchen ist Kaninchenantikörper zu HCG. Das dritte biologische Teilchen ist mit einem fluoreszierenden
Farbstoff eingefärbter Ziegenantikörper zu Kaninchen-/-globulin.
Das fertige Substrat wird durch F i g. 2 veranschaulicht: HCG 12 Kaninchenantikörper zu
HCG 13. mit fluoresziertem Farbstoff eingefärbter Zieorpcr
zu iv
CiiCn-/™giG
iGuünn i~r.
oder für Beispiel 3 angewandt werden, um die Menge an HCG in einem Fluid zu bestimmen.
Um HCG zu bestimmen, kann als erstes biologisches Teilchen Kaninchenantikörper zu HCG, als zweites biologisches
Teilchen HCG und als drittes biologisches Teilchen mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbter
Kaninchenantikörper zu HCG verwendet werden. Das fertige Substrat wird durch F i g. 2 veranschaulicht: Kaninchenantikörper
zu HCG 12, HCG 13, mit fluoreszierendem Farbstoff verbundener Kaninchenantikörper zu
HCG 14. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung großer biologischer Teilchen, wie Viren,
Bakterien und Zellen.
20
Die Bestimmung von HCG Antikörper kann auch mit mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbtem Kaninchenantikörper
zu Ziegen-;"-globu!in erfolgen. Die erste
Schicht aus Protein enthält HCG. Das zweite biologische Teilchen ist Kaninchenantikörper zu HCG. Bevor
das dritte biologische Teilchen (mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbter Kaninchenantikörper zu Ziegen-
«-globuün) wird auf das Substrat aufgebracht. Dann
wird das vierte biologische Teilchen (Ziegenantikörper zu Kaninchen-/-globulin) aufgebracht. Das fertige Substrat
wird durch Fig.4 veranschaulicht: HCG 12, Kaninchenantikörper
zu HCG 13, Ziegenantikörper zu Kaninchen-/-globulin 15, mit fluoreszierendem Farbstoff
eingefärbter Kaninchenantikörper zu Ziegen-/-globulin
16.
40
Ein anderer Weg der Bestimmung von HCG-Antikörper ist die Verwendung 7on mit fluoreszierendem Farbstoff
eingefärbtem Kaninchenantikörper zu HCG als drittem biologischem Teilchen. Das fertige Substrat
wird durch F i g. 5 veranschaulicht: HCG 12, Kaninchenantikörper zu HCG 13, mit fluoreszierendem Farbstoff
eingefärbter Kaninchenantikörper zu HCG 23. Durch Erhöhung der Menge an 13 wird die Menge an 23 gesenkt.
50
Um HCG zu bestimmen, kann als erstes biologisches Teilchen HCG, als zweites biologisches Teilchen Kaninchenantikörper
zu HCG und a!s drittes biologisches Teilchen mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbter
Ziegenantikörper zu Kaninchen-/-globulin verwendet werden. Wenn das Substrat mit der ersten Schicht aus
Protein in das Fluid von Interesse getaucht wird, um die Menge an HCG darin zu bestimmen, kann dem Fluid
eine bekannte Menge an Kaninchenantikörper zugesetzt werden, und dieser zugesetzte Antikörper kann
entweder das HCG auf dem Substrat oder das HCG in Lösung binden. Die Menge an HCG auf dem Substrat
ist eine Konstante. Je mehr HCG in der Lösung ist, desto ^1
geringer ist die Menge an Antikörper, die ?n das Substrat
bindet Das fertige Substrat ist das gleiche wie in
Beispiel·!. Eine ähnliche Methode kann für Beispiel2
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (14)
1. Verfahren zur Bestimmung biologischer Teilchen einer bestimmten Spezies in einem Fluid, bei
dem ein mit geeigneten biologischen Teilchen überzogenes metallisches Substrat nacheinander mit
dem Fluid und weiteren geeigneten biologischen Teilchen in Kontakt gebracht wird und nicht gebundene
Teilchen jeweils abgewaschen werden, und nicht gebundene Teilchen jeweils abgewaschen werden,
und anschließend das vorbereitete Substrat anregenden Teilchen ausgesetzt und die Fluoreszenz
der zu bestimmenden biologischen Teilchen mit einer Quantitätsmeßeinrichmng gemessen wird, d a durch
gekennzeichnet, daß ein Substrat mit einer stark reflektierenden Metalloberfläche verwendet
wird, daß die anregenden Teilchen durch Reflektion der Substratoberfläche von der Quantitätsmeßeinnehtung
fortgelenkt werden, und daß im wesentlichen nur das von den fluoreszierenden biologischen
Teilchen induzierte Signal auf die Quantitätsmeßeinrichtung gelenkt wird.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet,
daß die anregenden Teilchen einer Falle zugeführt werden und daß das induzierte Signal von
dem Substrat aufgenommen und integriert und die integrale Menge des induzierten Signals als Maß der
Konzentration an dem biologischen Teilchen in dem Fluid angezeigt oder aufgezeichnet wird.
3. Verfehlen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß auf die i^etallisr^e Oberfläche ein immunologischer
Belag aus wenigstens einer Schicht aufgebracht wird, welche Fror :n oder proteingebundene
Teilchen enthält, die auf der metallischen Oberfläche adsorbiert sind, wobei erste biologische
Teilchen ungeordnet darin verteilt sind, und daß die Einrichtung zum Aufbringen dritter biologischer
Teilchen auf das Substrat in der Lage ist, einige dritte biologische Teilchen daran zu binden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —3, dadurch gekennzeichnet, daß die anregenden Teilchen
Photonen sind und daß sie reflektierten Teilchen zu einer Photonenfalle gerichtet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4. dadurch gekennzeichnet,
daß die Photonen von einem Laser ausgesendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 4. dadurch gekennzeichnet, daß die Photonen von einer Lampe durch
eine Wellenlängenselektiereinrichtung ausgesendet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —6. dadurch gekennzeichnet, daß der fluoreszierende
Farbstoff ein Fluorescein-Derivat ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7. dadurch gekennzeichnet,
daß das FUiorescein-Denvat Fluoresceinisothiocyanat
ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —6. dadurch gekennzeichnet, daß der fluoreszierende
Farbstoff cm Rhodamin-DcriYat ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Rhodamin-Derivat Tetramethyl-Rhodamin-isothiocyanat
ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß der Rhodamin-Farbstoff Lissamin-Rhodiimin-B-200-Siilfonylchloridist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —6, dadurch
gekennzeichnet, daß der fluoreszierende
Farbstoff 1 -DimethyIaminonaphthalin-5-Sulfonylchlorid
ist.
13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das dritte biologische Teilchen ein an
ein biologisches Teilchen gebundenes Metall enthält, daß das anregende Teilchen ein Elektron ist. daß die
Mittel zum Richten des anregenden Teilchens ein elektrisches und ein Magnetfeld sind, daß d'° Mitte!
zum Messen des induzierten Signals Mittel zum Messen der Quantität des induzierten Photons sind,
und daß die Mittel zum Ablenken des anregenden Elektrons von der Quantitätsmeßeinrichtung aus der
metallischen Oberfläche bestehen und positiv aufgelegen und mit einer Elektronenfalle verbunden sind.
14. Verfahren nach Anspruch Ί3. dadurch gekennzeichnet,
daß die dritten biologischen Teilchen mit Ferretin verbundene biologische Teilschen sind.
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- 1980-07-02 DE DE3025022A patent/DE3025022C2/de not_active Expired
- 1980-07-02 DE DE3042535A patent/DE3042535C2/de not_active Expired
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