DE3025022A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung biologischer teilchen durch induzierte signale - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur bestimmung biologischer teilchen durch induzierte signale

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Description

  • Zusammenfassung:
  • An ein eine metallische Oberflächenschicht aufweisendes Substrat wird zunächst eine Schicht aus'bekannten biologischen Teilchen adsorbiert. Dieses aktive Substrat wird dann in eine Lösung eingetaucht, die eine unbekannte Menge an zweiten biologischen Teilchen, die die erste Art von Teilchen, die in ungeordneter Verteilung in der Schicht anwesend sind, binden, enthalten. Auf dieses Substrat wird dann eine dritte Art biologischer Teilchen, gebunden an ein anregbares Mittel, von dem ein induziertes Signal erzeugt werden kann, aufgebracht, und dieses Substrat wird dann in eine Vorrichtung eingebracht, die eine Quelle für induzierte Signale anregelnde Teilchen sowie ein Photonenzählsystem zum Messen der Menge an induziertem Signal aufweist. Das die Metallschicht aufweisende Substrat lenkt die anregenden Teilchen auf eine Falle, so daß weniger anregende Teilchen auf das Photonenzählsystem gelangen, während das induzierte Signal auf das Photonenzählsystem gelenkt wird und eine größere enge an induziertem Signal gemessen wird.
  • Die Erfindung bezieht sich auf eine immunologische und auf einer spezifischen Bindung beruhende Bestimmung biologischer Teilchen und insbesondere auf die Bestimmung biologischer Teilchen wie Antikörper, ilormone, spezifisch bindender Proteine, Rezeptoren und Antigene unter Verwendung von Fluoreszenz oder Metall.
  • Es wird in diesem Zusammenhang Bezug genommen auf die US-Patente Nr. 4 011 308 "Method for Surface Immunological Detection of Biological Particles by the use of Tagged Antibodies und 3 926 564 "Substrate for Immunological Tests and Method Fabrication hereof"v. I. Giaever; Blood Coagulation Studies with the Recording Ellipsometer11 von I. Vroman (National Bureau of Standards Miscellaneous Publication 256 September 1964); "A Utudy of Antigens and Antibodies by the onolayer Film Technique of Langmuir" von M. P. Shaffer und J.H. Dingle (Proceeding of Society of Experimental Biological Medicine 38, . 528-530, 1938); 11lmmunological Reactions Between Film of Antigen and Antibody Molecule" von A. Rothen (Journal of Biological Chemistry Ed. 168 . 75-97 (April/Iai 1949)); "The Beginnings of Immunofluorescence" von A.Ei. Coons (J. Immunology 87 S. 499-503 (1961)); "Fluroescent Protein Conjugates" von R.F. Steiner und H. Edel hoch (Chemistry Review 62, 5. 457-483 (1(362)); sowie "Radioimmunoassay" von D.S. Skeller et al. (Clinical Chemistry 19 (2) S. 146-186 (1973)).
  • Immunologische und spezifische Bindungsreaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen. Die immunologische Reaktion ist für die Bekämpfung von Krankheiten von höchster Bedeutung. Die Schlüsselproteine und Rezeptoren sind wichtig.
  • für den Transport und das Gleichgewicht spezifischer Hormone und Moleküle, die die liormonfunktion stören. Um diese Art spezifischer Bindungsreaktionen auf einer Fletalloberfläche ablaufen zu lassen, haben Shaffer et al., Rothen und viele andere Forscher Ellipsometer verwendet, um die an das Antigen gebundene Antikörpermenge und umgekehrt, zu bestimmen. In neuerer Zeit wurde von Giaever ein visueller Detektor entwickelt, bei dem eine speziell präparierte Metalloberfläche verwendet wird (US-PS 3 926 564). Da jedoch das Signal von dem unbewaffneten Auge empfangen wird, bleibt die quantitative Bestimmung sehr ungenau.
  • Auch gemäß der Erfindung wird eine liletalloberfläche benutzt; jedoch ist eine besondere Präparierung dieser Metalloberfläche nicht erforderlich. Die meisten metallischen Oberflächenschichten, die mit Hilfe handelsüblicher eiz- oder Sprühvorrichtungen hergestellt sind, entsprechen den Erfordernissen für eine Verwendung gemäß der Erfindung und weisen eine stark reflektierende Metalloberfläche auf. Das Metall wird verwendet, um eine monomolekulare Proteinschicht, beispielsweise ein Protein, das ein Antigen enthält, zu binden, während die enge an Antikörper (zweites biologisches Teilchen), die an dieses Antigen gebunden ist, sich aus der induzierten Emission eines anregbaren Mittels, das an einen Antikörper (drittes biologisches Teilchen) dieses Antikörpers gebunden ist, ergibt.
  • llauptaufgabe der Erfindung ist ein leicht durchführbares Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis immunologischer oder spezifischer Bindungsreaktionen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist eine Vorrichtung und ein leicht durchführbares Verfahren zum Nachweis biologischer Teilchen in einer Lösung, die Serum, Körpersekret, Körperfluid, Urin, Gewebeextrakt usw. sein kann. Das biologische Teilchen kann ein kleines Teilchen, wie ein Hormon, Antikörper, Plasmaprotein, oder ein großes Teilchen, wie ein Virus, Bakterium, eine Zelle, die eine Antikörperproduktion stimmulieren können, sein. Eine weitere Aufgabe der Bindung ist eine Vorrichtung und ein einfaches Verfahren zur Durchführung diagnostischer Tests. Um einen solchen Test durchzuführen, müssen zwei geeignete biologische Teilchen mit hoher gegenseitiger Bindungsaffinität gefunden werden, von denen das eine Protein oder Protein an beispielsweise Steroidhormon oder Polypeptid, gebunden an Rinderserumalbumin, sein muß und das andere ein drittes biologisches Teilchen, gewöhnlich der Antikörper des zweiten biologischen Teilchens ist. Weil die Vorrichtung gemäß der Erfindung zum quantitativen Nachweis über ein Signal verwendet wird, muß die Metalloberfläche nicht aus einer bestimmten Art einer Legierung hergestellt sein oder eine bestimmte Dicke haben, und das erste, das zweite und das dritte biologische teilchen müssen keine Schicht bilden, um nachgewiesen zu werden. Die ausgewählte Proteinschicht wird an der Oberfläche des Substrats in einer monomolekularen Schicht (die das erste biologische Teilchen enthält) an der Oberfläche des Substrats adsorbiert. enn eine suspekte Lösung auf die An-oder Abwesenheit des biologischen Teilchens von Interesse (zweites biologisches Teilchen) getestet wird, wird die monomolekulare Proteinschicht ausreichend lange in Kontakt mit der zu untersuchenden Lösung gebracht, daß eine spezifische Bindungsreaktion erfolgen kann.
  • enn das biologische Teilchen von Interesse anwesend ist, erfolgt zwischen der anfangs anwesenden Proteinschicht und dem biologischen Teilchen von Interesse eine spezifische Umsetzung, bei der es zu einer Art Bindung zwischen ihnen kommt. Gemäß der Erfindung wird ein Fluoreszenz oder ein Metall zum Nachweis der Menge an dem zweiten biologischen Teilchen, das an das Substrat gebunden ist, verwendet. Zum Nachweis der Anwesenheit von Antigen wird in der Histochemie seit langem eine Immunofluoreszenzeinfärbung verwendet. Bei einem herkömmlichen Verfahren wird der Antikörper des speziellen Antigens präpariert und mit fluoreszierendem Farbstoff gekuppelt. Dieser fluoreszierende Antikörper wird zum Einfärben eines Gewebeschnitts verwendet, und ein Fluoreszenzmikroskop wird verwendet, um die Anwesenheit des speziellen Antigens in dem Gewebe sichtbar zu machen. Gemäß der Erfindung wird der fluoreszierende Antikörper oder das bindende Protein verwendet, um das zweite biologische Teilchen, das an das erste biologische Teilchen, das seinerseits an die Netalloberfläche gebunden ist, gebunden ist, zu erkennen.
  • In den Zeichnungen ist: Figur 1) Ein Schnitt durch ein in der Vorrichtung gemäß der Erfindung verwendetes Präparat mit einem Substrat mit einer in der monomolekularen Proteinschicht gebundenen zweiten Art biologischer Teilchen; Figur 2) Ein Schnitt durch ein Präparat gemäß der Erfindung mit an die zweiten biologischen Teilchen gebundenen dritten biologischen Teilchen; Figur DA) Eine Ansicht einer Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung zur Überprüfung des fertigen Substrats. Das Photonenzählsystem befindet sich in einem Abstand von dem Substrat, damit die anregenden Teilchen von der luletalloberfläche gegen das dunkle Gehäuse reflektiert werden, so daß alle darauf auftreffenden Photonen absorbiert werden, während zufolge dieser Reflektion ein verstärktes induziertes Signal vom Substrat zum Photonenzählsystem laufen kann; Figur 3B) Eine perspektivische Ansicht eines Teiles der Vorrichtung von Figur 3A. Hier ist eine Elektronenkanone 31 gezeigt. Das Substrat 30 wird mittels einer Metallbürste 33 positiv aufgeladen und auf konstanter Spannung gehalten. In Figur 3B sind nur die Kontaktteile von Bürste 33 und Oberfläche Q im Detail gezeigt. Die Rückwand des dunklen Aufnahmekastens 35 weist ein Loch 34 auf, durch das Licht auf die Metalloberfläche 30' gerichtet werden kann.
  • Figur 4) ist ein Schnitt durch das Präparat von Figur 2, der eine vierte Art biologischer Teilchen an die zweite Art, die wiederum an die erste Art gebunden ist, gebunden zeigt.
  • Figur 5) ist ein Schnitt durch das Präparat von Figur 1, das die dritte Art biologischer Teilchen an die erste Art gebunden zeigt.
  • Nachdem einige biologische Teilchen von Interesse (2. biologisches Teilchen) an die erste Schicht aus Protein gebunden sind, hat das Substrat den in Figur 1 gezeigten Aufbau aus dem eigentlichen Substrat 10, der Netalloberflächenschicht 11, den ersten biologischen Teilchen 12 und den zweiten biologischen Teilchen 13. min biologisches Teilchen, wahrscheinlich der Antikörper des zweiten biologischen Teilchens, wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff verbunden. Lin Tropfen einer Lösung dieses fluoreszierenden Antikörpers (drittes Diolostisches "teilchen) wird auf das Substrat, das bereits das zweite biolonische Teilchen aufweist, wie in Figur 1 gezeigt, aufgebracht. Dann wird das Substrat vorzugsweise so lane in einer ;'euchtigkeitskammer gehalten, daß der fluoreszierende Antikörper mit dem zweiten biologischen Teilchen reagiert. Nach der Reaktion hat das Substrat den in Figur 2 gezeigten Aufbau. Die Menge an gebundene fluoreszierenden Antikörper 14 ist proportional der Menge an dem auf dem Substrat 30 anwesenden zweiten biologischen Teilchen. Das Präparat mit dem in Figur 7 gezeigten Aufbau wird in ein geschlossenes Gehäuse mit einer Lichtquelle 31, die dem Induzieren einer Fluoreszenzemission von dem Substrat 50 dient, eingebracht. Das Photon von der Lichtquelle 71 wird nach Auftreffen auf das Substrat 30, das eine reflektierende metallische Oberfläche hat, gelen die Wand des Gehäuses reflektiert und von ihr eingefangen, während das induzierte Signal von dem Photonenzählsystem 32, das der Messung der Quantität dieser Fluoreszenzemisson dient, angezeigt wird. Da eine konstante Lichtquelle verwendet wird, ist das am Photonenzählsystem 72 angezeigte Signal proportional der Menge an fluoreszierendem Antikörper 14 an dem Substrat. Daher ist es bei Anwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung nicht notwendig, daß die biologischen Teilchen, damit sie bestimmt werden können, eine Schicht bilden. Die zweiten biologischen Teilchen werden an die erste oder Proteinschicht gebunden. Da die zweiten biologische Teilchen keine Schicht bilden müssen, müssen diese ersten biologischen Teilchen nicht die ganze Schicht einnehmen. Daher braucht die erste Schicht aus Protein nicht von hoher Reinheit zu sein. Alles dies sind beträchtliche Vorteile gegenüber den US-PS 3 926 564 und 4 011 308.
  • Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß das bei Durchführung.
  • des Verfahrens gemäß der Erfindung aufgefangene Signal nicht von der Größe des biologischen Teilchens abhängt.
  • Mit der Vorrichtung und nach dem Verfahren gemäß der Erfindung können sowohl roBe biologische Teilchen (vergleichbar den in der US-PS 3 53 467 genannten) als auch lein biologische Teilchen (vergleichbar den in der US-PS # 926 564 genannten) bestimmt werden.
  • Auch kleinere Teilchen, wie Steroidhormon und Polypeptide, können bestimmt werden. Der gebundene fluoreszierende Sarbstoff kann (A)ein Fluorescein-derivat, üblicherweise Fluorescein-isocyanat (FIC) oder -isothiocyanat (FITC), () ein Rhodamin-derivat,üblicherweise Rhodamin-isocyanat oder -isothiocyanat, Lissamin-rhodamin-B200-sufonylchlorid (RB200XC), oder (C) 1 -Dimethylaminonaphtalin-5-sulfonylchlorid (DANSC) sein. Diese Farbstoffe sind im Handel erhältlich (beispielsweise von der Baltimore Biological Lab), und auch einige Antikörper mit daran gebundenem fluoreszierendem farbstoff sind im Handel erhältlich. Für verschiedene Farbstoffe werden zweckmäßig verschiedene Lichtquellen und verschiedene Photonenbestimmungsvorrichtungen verwendet. Die am stärksten intensivierte Lichtquelle ist der Laser. Es können aber auch Bogenlampen mit einer Wellenlängenselektiereinrichtung oder Wolframlampen mit einer Wellenlängenselektierteinrichtung zum Auswählen einer günstigen Wellenlänge verwendet werden. Die stark reflektierende Oberfläche des Substrats lenkt die anregenden Photonen von dem Photonenzählsystem 32 ab, so daß das induzierte Signal nicht von anregenden Photonen gestört wird. Je stärker die Vermischung von induziertem Signal und anregenden Photonen ist, desto größer ist die Störung. Je höher das Verhältnis Signal zu Störung ist, desto zuverlässiger sind die Testergebnisse. Unabhängig davon, was für eine Lichtquelle verwendet wird, ist für die Photonenbestimmungsvorrichtung eine Wellenlängenselektiereinrichtung erforderlich, um die Fluoreszenzemissionen weiter zu selektieren, da sie mit einer geringen X,enge an anregenden Photonen gemischt sein kann, obwohl wegen der Verwendung der heflektiereinrichtung das Verhältnis i;'n?d zu Störung sehr groß ist. Die Wellenlängenselektierenrichtung kann ein îlonochromator oder ein filter sein.
  • Das anregende Signal muß kein Photon sein. Es kann ein Neutronensignal sein und das induzierte Signal kann γ-Strahlung (bekannt als Neutronenaktivierungsanalyse) oder andere Strahlung sein.
  • Es können Elektronen oder andere @eladene Teilchen sein und das induzierte Signal kann die charakteristische köntgenstrahlung sein, wenn das dritte biologische Teilchen mit spezifischen Elementen etikettiert ist. Beispielsweise kann eine Metalletikettierung durch Ferritin, das im Handel erhältlich ist, erfolgen, und das wirtschaftlichste geladene Teilchen kann ein Elektron sein. In diesem Fall wird die etalloberfläche positiv aufgeladen und mit einer konstanten Spannung verbunden, wie in Figur 3B gezeigt. Diese Metalloberfläche dient dann als die alektronenfalle. Ein entsprechendes Photonenzählsystem kann verwendet werden, um das induzierte Signal von dem Eisenelement zu bestimmen.
  • Die zu messende Menge an induziertem Signal kann durch Ändern der Menge an erregendem Signal manipuliert werden. Gemäß der Erfindung werden die anregenden Teilchen von dem Signalbestimmungssystem fortgelenkt, so daß das Signal verstärkt wird, ohne daß die Störung beträchtlich erhöht wird. In der Vorrichtung, gemäß der Erfindung ergibt ein mit einer Metall schicht überzogenes Substrat ohne biologische Teilchen sehr wenige Störungsgeräuschzählungen. Das ist eine Verbesserung gegenüber den bekannten Vorrichtungen, die eine Emanation eines Signals von einer Quelle von konstantem Wert,der von der spezifischen Aktivität abhängt, verwenden. Auch wird die Emanation mit der Zeit geringer, manchmal bei sehr kurzer Halbwertszeit, und es ist daher schwieriger, damit zu arbeiten. Die Verwendung eines induzierten Signals ist ein beträchtlicher Vorteil gegenüber der US-PS 4 011 508.
  • Bei Verwendung eines induzierten Signals kann der natürliche tiintergrund gemessen werden, indem man das anregende Signal dafür abschaltet; d.h. die Abscheidung eines biologischen Teilchens zur Bildung eines speziellen Musters, wie es gemäß US-PS 4 011 308 erforderlich ist, ist nicht notwendig. Die Zählung außerhalb des Musters ist das, was unter dem natürlichen Hintergrund zu verstehen ist.
  • Durch die Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung wird es möglich, eine Spurenmenge an dem dritten biologischen Teilchen auf der Metalloberfläche zu bestimmen. Das heißt, es hat sich gezeigt, daß das dritte biologische Teilchen, um bestimmt zu werden, keine Schicht bilden muß. Auch das zweite biologische Teilchen oder das erste biologische Teilchen müssen keine Schicht bilden. Als die erste Schicht wurden teilweise gereinigte erste biologische Teilchen ( beispielsweise nach Fällung mit Ammoniumsulfat) verwendet. Die geringe Menge an zweiten biologischen Teilchen ragen ebenso wie die dritten biologischen Teilchen aus der Metalloberfläche heraus. Das ist gegenüber der Verwendung von Schichten ein Vorteil, weil die Teilchen von Interesse in die Lösung hineinragen und dadurch die spezifische Reaktion erleichtern und die nicht spezifische Bindung verringern. Sowohl die Zeit zur Durchführung eines solchen Tests als auch die Menge an nicht spezifischer Bindung wird stark verringert. Weitere Vorteile des Verfahrens gemäß der Erfindung gegenüber den Verfahren der US-PSs 4 011 308 und 3 926 564, bei denen die ersten, die zweiten oder die dritten biologischen Teilchen Schichten bilden, damit sie bestimmt werden können (Giaever Slides),sind: 1) Es ist nur eine sehr geringe Menge an ersten biologischen und zweiten biologischen Teilchen (etwa 1/1000 der von Giaever verwendeten) erforderlich, um einen Test durchzuführen. Die ersten biologischen Teilchen müssen nur teilweise gereinigt sein und können daher leichter erhalten werden und sind billiger. 2) Einfluß der Gleichgewichtskonstante: enn die ersten biologischen Teilchen eine Schicht bilden, ist eine Bindung mit dem Metall erforderlich, damit diese Teilchen nicht in Lösung gehen, und um dies zu erreichen, ist eine große Menge an ersten biologischen Teilchen erforderlich.
  • Wenn auch die zweiten biologischen Teilchen eine Schicht bilden, ist es die Bindung zwischen dem ersten und dem zweiten biologischen Teilchen, die verhindert, daß das zweite biolorasche Teilchen in Lösung geht. Für die Bildung einer Schicht aus dem zweiten biolor-;iscnen Teilchen gibt es jedoch eine Kindestkonzentration an dem zweiten bilogischen Teilchen in der Lösung, unter der dieses zweite biologische Teilchen keine Schicht bilden kann. Dadurch wird die Genauigkeit des Testergebnisses stark vermindert. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung gibt es keine Schicht aus den zweiten biologischen Teilchen. Auch die Menge an ersten biologischen Teilchen in der Proteinschicht kann mit dem Grad der Reinigung oder des Zusatzes verschiedener Mengen an inertem Protein wie BUA variieren.
  • Die beste Auflösung ist sehr viel empfindlicher, und ihre Grenzen hängen von der Menge an dritten biologischen Teilchen, die noch genau gemessen werden kann, ab.
  • Die in Figur 3A gezeigte Vorrichtung, die im folgenden besprochen wird, ist der Schlüsel für die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung. Das wesentlichste Merkmal der in Figur 3A gezeigten Vorrichtung ist das metallische Substrat.
  • Im Weg des anregenden Photons, das von der Lichtquelle 32 ausgeht und an der Wand des dunklen Gehäuses endet, darf sich nichts befinden als die stark reflektierende metallische Oberfläche und die biologischen Teilchen darauf. Wenn der Einfallswinkel gleich dem Reflektionswinkel ist und das zeigt nalbestimmungssystem senkrecht zu dem Substrat und in einigem Abstand davon angeordnet ist, wird das anregende Teilchen nicht auf das Bestimmungssystem zu gestreut. Auch kann die Form des Gehäuses 90 gewählt werden, daß sein },infangverrnögen erhöht wird, so daß fast alle anregenden Teilchen, die gegen die entsprechend ausgebildete Falle reflektiert werden, dort abgebremst werden und nicht zu dem Signalzählsystem gelangen.
  • Das induzierte Signal, das von dem dritten biologischen Teilchen ausgeht, nachdem das anregende Teilchen absorbiert ist, kann in jeder Richtung ausstrahlen, und ein Teil davon, der von der Sammelöffnung des Photonenzählsystems abhängt, gelangt zu dem Photonenzählsystem. Wegen der stark reflektierenden metallischen Oberfläche werden auch diejenigen induzierten Photonen, die direkt in eine Richtung entgegengesetzt von dem Photonenzählsystem abgestrahlt werden, zurückreflektiert und treten in das Photonenzählsystem ein.
  • Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist speziell für ein stark reflektierendes Substrat ausgebildet, und es ist nicht wesentlich, daß es ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat ist. Jedoch ist ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat eines der zweckmäßigsten. Aber auch beispielsweise ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat, das noch eine dünne Schicht aus einem Gel aufweist, ist ein gutes Substrat. Auch ist es nicht von entscheidender Bedeutung, daß die daran gebundenen oleküle Proteinmoleküle sind. Vielmehr kann die Vorrichtung auch für andere Moleküle oder dünne Gewebeschnitte und andere Dinge, die durch Trocknen, chemische Umsetzung, Adhäsion, Bindung oder andere Maßnahmen zur Bindung an ein solches stark reflektierendes Substrat gebracht sind, verwendet werden.
  • In der Vorrichtung gemäß der Erfindung kann auch für eine trockene Probe, wie im vorliegenden Fall, eine Lichtquelle sehr hoher Intensität verwendet werden. Die stark reflektierende l'letalloberfläche bewirkt, daß es zu einer nur sehr geringfügigen Photonenabsorbtion (die in Wärme urugewandelt wird) kommt, so daß auch die Wahrscheinlichkeit eines Ausbleichens oder einer Beschädigung der Probe sehr gering ist.
  • Daher kann sogar ein Laser als Lichtquelle verwendet werden.
  • Dies sind beträchtliche Vorteile gegenüber den US-PSsen 4 056 724 und 4 036 946.
  • Es gibt verschiedene Wege zur Bindung der ersten biologischen Teilchen an das Substrat. Pür ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat kann die erste Stufe in einem Eintauchen bestehen, und auch für die Bindung der zweiten biologischen Teilchen an die ersten biologischen Teilchen und für die Bindung der dritten biologischen Teilchen an die zweiten biologischen Teilchen (die ersten biologischen Teilchen in Figur 5) kann in gleicher 'eise vorgegangen werden. Um den Test zu beschleunigen, kann die Probe auf der Substrat -etrceknet werden. m die nicht-svezifische Bindung zu senken, kann ein Eintrocknen der Lösung dadurch verhindert werden, daß man das Substrat in einer Feuchtigkeitskammer hält. Die Vorrichtung und das Verfahren gemäß der Erfindung können jedoch in vielfacher Weise modifiziert werden. Beispielsweise kann die Probe in ein kleines Rohr einsrebracht werden, um den Kontakt mit dem Substrat auf ein kleines Gebiet zu begrenzen; oder das Volumen der Lösung der Probe kann dadurch vergrößert werden, daß ein Becher verwendet wird. In jedem Fall ist es wesentlich, daß das fertige Substrat gewaschen wird. Da die iXetalloberfläche die ersten bioloischen Teilchen bindet, die ersten biologischen Teilchen die zweiten biologischen Teilchen binden usw., wird durch Waschen die nicht-spezifische Bindung, nicht jedoch die durch die spezifische Reaktion erfolgte Bindung gelöst. Bei Substraten aus Glas, Plastik oder vielen anderen Materialien, erfolgt dagegen keine Bindung zwischen ersten biologischen Teilchen und Substrat, und durch Waschen kann daher die durch die spezifische Reaktion erfolgte Bindung gelöst werden, während andererseits bei Unterlassung des Waschens die durch nicht-spezifische Reaktion erfolgte Bindung an das Substrat erhalten bleibt und daher eine quantitative Messung unmöglich wird.
  • Außerdem sind solche Substrate nicht stark reflektierend und ergeben daher in der Vorrichtung gemäß der Erfindung keine gute Auflösung.
  • Um die quantitative Bestimmung bei einem Test zu verbessern und die Umsetzung klar erkennbar zu machen, werden zweckmäßig in einer Serie von Tests Substrate mit gleicher Fläche und gleicher enge an Lösung der Probe verwendet.
  • Die Absorptions- und Emissionsspektren der meisten fluoreszierenden Verbindungen, die zur einfärbung von Protein verwendet werden, sind von Hansen PA (1964) (Publikation der University of Maryland, College Park, Maryland) zusammengestellt.
  • Die Peakwellenlänge des zu VerWendenden Filters oder Monochromators wird zweckmäßig unter Verwendung dieser Angaben ausgewählt. Es wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung eines im Handel erhältlichen (Oriel Corporation) Engbandinterferenzfilters mit einer Transmission außerhalb eines Durchlässigkeitsbereiches von 0,01 % nicht genügt, um eine Spurenmenge an dritten biologischen Teilchen auf dem Substrat zu bestimmen, weil das Störgeräusch des Instruments (zur Ablesung einer blanken Metalloberfläche) noch hoch ist.
  • Bei Verwendung von zwei solchen Engbandfiltern als Gruppe als Filter sowohl für das anregende als auch für das induzierte Signal wird die Auflösung sehr gut und das Störgeräusch des Instruments nicht wahrnehmbar.
  • Nach Hansen sind sowohl die Absorptions- als auch die Emissionsbande sehr breit und werden noch breiter, wenn eine Bindung an eine Metalloberfläche gemäß der Erfindung erfolgt ist. Die genaue Paekwellenlänge dieser Engbandinterferenzfilter ist nicht wesentlich. Es wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung von zwei Filtern als Gruppe besser geeignet ist, um die gleiche Paekwellenlänge und Bandbreite zu haben.
  • Wenn als Lichtquelle ein Laser verwendet wird, muß kein Fall ter für das anregende Signal verwendet werden. tonochromatoren eignen sich ausgezeichnet zur Wahl des anregenden Signals, insbesondere wenn lichtquellen hoher Intensität verwendet werden.
  • Es ist einfach, andere Spezies Antikörper zu Antikörper zu erzeugen. Beispielsweise kann Ziegenantikörper für Kaninchen-γ-globulin erzeugt werden, indem man Ziegen KaninchenT-globulin injeziert und umgekehrt. Der Ziegenantikörper für Kaninchen γ-globulin bindet Kaninchenantikörper und der Kaninchenantikörper für Ziegen γ-globulin bindet den Ziegenantikörper.
  • Daher nrn(3 der fluoreszierende Antikörper nicht direkt an das zweite biologische Teilchen binden, sondern kann nanch dem vierten biologischen Teilchen kommen, wie durch Beispiel 2 veranschaulicht. Der komplementierende fluoreszierende Antikörper kann auch als das dritte biologische Teilchen verwendet werden, wenn das zweite biologische Teilchen der Antikörper des ersten biologischen Teilchens ist. Die enge an gebundenem Komplement ist proportional der enge an gebundenem zweiten biologischen Teilchen.
  • Beispiel 1 Die erste Schicht aus Protein enthält lICG (menschliches chorionisches Gonadotropin). Das zweite biologische Teilchen ist Kanichenantikörper zu HCG. as dritte biologische Teilchen ist mit einem fluoreszierenden Farbstoff eingefärbter Ziegenantikörper zu Kaninchen γ-globulin. Das fertige Substrat wird durch Figur 2 veranschaulicht: ECG 12 Kaninchenantikörper zu HCG 13, mit fluoresziertem Farbstoff eingefärbter Ziegenantikörper zu Kaninchen γ-globulin 14.
  • Beispiel 2 Die Bestimmung von llCC Antikörper kann auch mit mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbtem Kaninchenantikörper zu Ziegen γ-globulin erfolgen. Die erste Schicht aus Protein enthält HCG. Das zweite biologische Teilchen ist Kaninchenantikörper zu HCG. Bevor das dritte biologische Teilchen (mit fluoreszierendem Farbstoff eingefarbter Kaninchenantikörper zu Ziegen γ-globulin) wird auf das Substrat aufgebracht. Dann wird das vierte biologische Teilchen (Ziegenantikörper zu Kaninchen γ-globulin) aufgebracht. Das fertige Substrat wird durch Figur 4 veranschaulicht: ijCG 12, Kaninchenantikörper zu HCG 13, Ziegenantikörper zu Kaninchen-globulin 15, mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbter Kaninchenantikörper zu Ziegen r-globulin 16.
  • Beispiel 3 Ein anderer Weg der Bestimmung von HCG-Antikörper ist die Verwenden; von mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbtem Kaninchenantikörper zu IICG als drittem biologischem Teilchen.
  • Das fertige Substrat wird durch Figur 5 veranschaulicht: HCG 12, Kaninchenantikörper zu HCG 13, mit fluoreszierendem Parbstoff eingefärbter Kaninchenantikörper zu HCG 27.Durch Erhöhung der Menge an 13 wird die enge an 23 gesenkt.
  • Beispiel 4 Um E,CS zu bestimmen, kann als erstes biologisches Teilchen HCG, als zweites biologisches Teilchen Kaninchenantikörper zu HCG und als drittes biologisches Teilchen mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbter Ziegenantikörper zu Kaninchen γ-globulin verwendet werden. Wenn das Substrat mit der ersten Schicht aus protein in das Fluid von Interesse getaucht wird, um die Menge an HCG darin zu bestimmen, kann dem Fluid eine bekannte enge an Kaninchenantikörper zugesetzt werden, und dieser zugesetzte Antikörper kann entweder das HCG auf dem Substrat oder das HCG in Lösung binden. Die Menge an HCG auf dem Substrat ist eine Konstante. Je mehr HCG in der Lösung ist, desto geringer ist die Menge an Antikörper, die an das Substrat bindet. Das fertige Substrat ist das gleiche wie in Beispiel 1. Eine ähnliche Methode kann für Beispiel 2 oder für Beispiel 3 angewandt werden, um die Menge an i;CG in einen Fluid zu bestimmen.
  • Beispiel 5 Um HCG zu bestimmten, kann als erstes biologisches Teilchen Kaninchenantikörper zu HCG, als zweites biologisches Teilchen HCG und als drittes biologisches Teilchen mit fluoreszierendem Farbstoff eingefärbter Kaninchenantikörper zu HCG verwendet werden. Das fertige Substrat wird durch Figur 2 veranschaulicht: Kaninchenantikörper zu HCG 12, HCG 13, mit fluoreszierenden Farbstoff verbundener Kaninchenantikörper zu HCG 14. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung großer biologischer Teilchen, wie Viren, Bakterien und Zellen. (Alle in diesen Beispielen verwendeten biologischen Teilchen stammen vom Baltimore Biological Laboratory).

Claims (34)

  1. Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung biologischer Teilchen durch induzierte Signale Patentansprüche Y;/I? Vorrichtung zur Bestimmung biologischer Teilchen bestimmter Art in einem Fluid bestehend aus: einem Träger mit einem metallischen Oberflächenfilm, auf dem ein immunologischer Überzug aus wenigstens einer Schicht, der eine Schicht aus einem Protein oder an ein Protein gebundenen Teilchen, die an den metallischen Oberflächenfilm gebunden ist und erste biologische Teilchen ungeordnet darin verteilt enthält, abgeschieden ist, Mitteln, um dritte biologische Teilchen darauf aufzubringen und daran zu binden, Mitteln zur Erzeugung anregender Teilchen und Mitteln, um die anregenden Teilchen gegen die erwähnten dritten biologischen Teilchen zu richten, Mitteln zum Messen der von den dritten biologischen Teilchen ausgehenden Quantität an induziertem Signal sowie Mitteln, um die anregenden Teilchen, die die Anregung bewirkt haben, aus dem Weg zu der Quantitätsmeßeinrichtung zu führen, wobei die dritten biologischen Teilchen ein anregbares Mittel aufweisen, von dem durch die anregenden Teilchen das induzierte Signal erzeugt werden kann.
  2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das dritte biologische Teilchen einen an ein biologisches Teilchen gebundenen fluoreszierenden Farbstoff aufweist, die anregenden Teilchen Photonen sind, die Mittel zum Richten der anregenden Teilchen gegen die erwähnten dritten biologischen Teilchen Mittel zum Richten von Photonen sind, die Mittel zum Messen der Quantität an dem induzierten Signal Mittel zum Messen der Quantität einer Fluoreszenzemission sind und die Mittel, um die anregenden Photonen aus dem Weg zu der Quantitätsmeßeinrichtung zu führen, aus der metallischen Oberflächenschicht und einer Photonenfalle bestehen.
  3. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie noch Mittel zum Richten von Photonen auf die metallische Oberflächenschicht des Substrats aufweist.
  4. 4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Richten der Photonen auf die metallische Oberflächenschicht des Substrats aus einem Gehäuse mit einem ersten und einem zweiten Endteil bestehen, wobei in dem Gehäuse: eine Photonenquelle an dem ersten Endteil angeordnet ist, das zweite Teil an einer Oberfläche des Substrats befestigte Mittel, die zulassen, daß die Photonen darauf gerichtet werden, aufweist und das Gehäuse außerdem eine Photonenfalle darstellt.
  5. 5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es in dem Gehäuse noch Mittel zur Aufnahme der Fluoreszenzemission aufweist.
  6. 6. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Photonenquelle ein Laser ist.
  7. 7. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Photonenquelle eine Lampe und eine Wellenlängenselektiereinrichtung ist.
  8. 8. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel ein Photonenzählsystem und eine Wellenlängenselektiereinrichtung aufweisen.
  9. 9. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die We llenlängenselektiereinrichtung ein Monochromator ist.
  10. 10. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängenselektiereinrichtung ein Filter ist.
  11. 11. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der fluoreszierende Farbstoff ein Fluorescein-Derivat ist.
  12. 12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluorescein-Derivat Fluorescein-isothiocyanat ist.
  13. 13. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der fluoreszierende Farbstoff ein Rhodamin-derivat ist.
  14. 14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Rhodamin-derivat Tetramethylrhodamin-isothiocyanat ist.
  15. 15. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Rhodamin-Farbstoff Lissamin-Rhodamin-B-200-Sulfonylchlorid ist.
  16. 16. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der fluoreszierende Farbstoff 1-Dimethylaminonaphtalin-5-sulfonylchlorid ist.
  17. 17. Verfahren zur Bestimmung biologischer Teilchen einer bestimmten Species in einem Fluid, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substrat mit einer metallischen Oberfläche ausreichend lange in eine Lösung erster biologischer Teilchen aus einem Salz oder einer anderen Art Protein taucht, daß sie eine monomolekulare Proteinschicht adsorbiert, nicht gebundenes Protein entfernt, indem man das Substrat mit Wasser wäscht, das Substrat mit der monomolekularen Proteinschicht darauf in das erwähnte Fluid taucht, so daß zweite biologische Teilchen, falls in dem Fluid anwesend, an die ersten biologischen Teilchen gebunden werden, Mittel zur Aufbringung dritter biologischer Teilchen über das Substrat mit den ersten und den zweiten biologischen Teilchen ausbreitet, nicht gebundene Teilchen durch Waschen des Substrats mit Wasser entfernt, zur Prüfung des Substrats anregende Teilchen dagegen richtet, die anregenden Teilchen dann von der Quantitätsmeßeinrichtung fortlenkt und das entstandene induzierte Signal auf die Quantitätsmeßeinrichtung lenkt, um die Quantität des von dem Substrat kommenden induzierten Signals zu bestimmen.
  18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Aufbringung der dritten biologischen Teilchen das Substrat mit den daran gebundenen ersten biologischen Teilchen und den gegebenenfalls daran gebundenen zweiten biologischen Teilchen in eine Lösung der dritten biologischen Teilchen taucht, so daß diese dritten biologischen Teilchen an das Substrat gebunden werden, und nicht gebundene Teilchen entfernt, indem man das Substrat mit Wasser wäscht.
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Aufbringung der dritten biologischen Teilchen das Substrat mit den ersten biologischen Teilchen und den erwähnten biologischen Teilchen, falls anwesend, in eine Lösung vierter biologischer Teilchen eintaucht, um diese an die erwähnten biologischen Teilchen zu binden, das Substrat mit den ersten biologischen Teilchen, den erwähnten biologischen Teilchen und den vierten biologischen Teilchen dann in eine Lösung dritter biologischer Teilchen taucht, so daß diese dritten biologischen Teilchen an die vierten biologischen Teilchen gebunden werden, und nicht gebundene Teilchen durch Waschen des Substrats mit Wasser entfernt.
  20. 20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die biologischen Teilchen Antikörper der ersten biologischen Teilchen sind und die dritten biologischen Teilchen mit einem fluoreszierenden Farbstoff verbundene Antikörper der erwähnten biologischen Teilchen sind.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten biologischen Teilchen Antikörper der erwähnten biologischen Teilchen sind und die dritten biologischen Teilchen mit einem fluoreszierenden Farbstoff verbundene Antikörper der erwähnten biologischen Teilchen sind.
  22. 22.Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das erwähnte biologische Teilchen ein Antikörper des ersten biologischen Teilchens ist und das dritte biologische Teilchen ein mit einem fluoreszierenden Farbstoff verbundener Antikörper des Komplements des Komplexes aus dem ersten und dem erwähnten biologischen Teilchen ist.
  23. 23.Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das vierte biologische Teilchen ein Antikörper des erwähnten biologischen Teilchens ist und das dritte biologische Teilchen ein Antikörper des vierten biologischen Teilchens ist.
  24. 24.Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, daß das erwähnte biologische Teilchen ein spezifisch an das erste biologische Teilchen bindendes Molekül und das dritte biologische Teilchen ein mit einem fluoreszierenden Farbstoff verbundener Antikörper des erwähnten biologischen Teilchens ist.
  25. 25. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß entweder das erste biologische Teilchen oder das erwähnte biologische Teilchen der Antikörper des anderen Teilchen ist und das dritte biologische Teilchen, das mit dem fluoreszierenden Farbstoff verbundene biologische Teilchen ist.
  26. 26. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß entweder das erste biologische Teilchen oder das erwähnte biologische Teilchen das spezifisch bindende Molekül des anderen Teilchens ist und das dritte biologische Teilchen das mit dem fluoreszierenden Farbstoff verbundene biologische Teilchen ist.
  27. 27. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Prüfung des Substrats die Quelle der anregenden Teilchen einschaltet, die Quelle der anregenden Teilchen ausrichtet, die anregenden Teilchen von der Quelle auf das Gebiet auf dem Substrat, wo das dritte biologische Teilchen, falls anwesend, gebunden ist, richtet.
  28. 28. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Prüfung des Substrats die anregenden Teilchen auf das Substrat richtet, das Substrat so anordnet, daß die anregenden Teilchen der Falle zugeführt werden, das induzierte Signal von dem Substrat aufnimmt und integriert und die integrale Menge des induzierten Signals als Maß der Konzentration an dem erwähnten biologischen Teilchen in dem Fluid anzeigt oder aufzeichnet.
  29. 29. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängenselektiereinrichtung ein Monochromator ist.
  30. 30. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängenselektiereinrichtung ein Filter ist.
  31. 31. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die anregenden Teilchen Photonen sind und das induzierte Signal eine Fluoreszenzemission ist.
  32. 32. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß erstes und zweites Endteil so angeordnet sind, daß die anregenden Photonen, die in das Gehäuse eintreten auf die Metalloberfläche auftreffen und gegen die Photonen reflektiert werden.
  33. 33. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das dritte biologische Teilchen ein an ein biologisches Teilchen gebundenes Metall enthält, das anregende Teilchen ein Elektron ist, die Mittel zum Richten des anregenden Teilchens ein elektrisches und ein Magnetfeld sind, die Mittel zum Messen des induzierten Signals Mittel zum Messen der Quantität des induzierten Photons sind, die Mittel zum Ablenken des anregenden Elektrons von der Quantitätsmeßeinrichtung aus der metallischen Oberfläche bestehen und positiv aufgeladen und mit einer Elektronenfalle verbunden sind.
  34. 34. Vorrichtung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die dritten biologischen Teilchen mit Ferritin verbundene biologische Teilchen sind.
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