DE19900119C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur Diagnose allergischer SymptomeInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose allergi
sche Symptome durch Nachweis von in vitro Immunreaktionen,
bei dem auf einem Träger ein Bindungsprotein aufgebracht
wird, auf dem Antikörper eines zu untersuchenden Patienten
durch Ankoppeln an das Bindungsprotein immobilisiert und
anschließend einer Antigen-Lösung ausgesetzt werden, die
allergieauslösende Antigene enthält.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Diag
nose allergischer Symptome durch Nachweis von in vitro Im
munreaktionen.
Aus der EP 0 629 857 A2 ist ein Verfahren zur immunchemi
schen Bestimmung von Antigenen bekannt. Bei diesem Verfah
ren wird auf die Oberfläche eines Trägers ein Bindungspro
tein aufgebracht, auf dem primäre Antikörper immobilisiert
sind. Zu bestimmende Antigene werden an die primären Anti
körper gebunden und so ebenfalls immobilisiert. Die Antige
ne werden über Bestimmung einer Immunreaktion mit markierten
sekundären Antikörpern bestimmt.
Nachteilig bei diesem Verfahren ist, daß neben den primären
Antikörpern markierte sekundäre Antikörper notwendig sind.
Die Antigene, welche im vorhergehenden Verfahrensschritt
mit den immobilisierten spezifischen Antikörpern einen Kom
plex eingegangen sind, können in den darauffolgenden Inku
bationsschritten in einer Rückreaktion sich zum Teil wieder
aus dem Komplex lösen und so der Nachweisreaktion entzie
hen, wodurch u. a. die Sensitivität stark eingeschränkt
wird.
Aus der WO 97/49989 A2 ist ein Verfahren zur Unterscheidung
komplexer biologischer Muster bekannt, bei dem auf einem
Träger unterschiedliche biologische Sensorelemente (Lectin,
DNA, RNA, PNA, Peptide) aufgebracht werden. Die Sensorele
mente werden hierzu durch ankoppeln an einem biologischen
Zwischenträger immobilisiert, der seinerseits über einen
chemischen Zwischenträger auf dem Träger angeordnet ist.
Der so entstandene Biosensor wird einer aus Serum gewonne
nen Lösung der zu unterscheidenden biologischen Muster aus
gesetzt, die sich an die biologischen Sensorelemente anbin
den. Ungebundene Muster werden entfernt und der Schichtdi
ckenzuwachs bzw. Massenzuwachs festgestellt. Der Schichtdi
ckenzuwachs läßt sich hierbei auch ellipsometrisch bestim
men. Nachteilig bei dem aus dieser Druckschrift bekannten
Verfahren ist, daß es einen relativ aufwendigen Schichtauf
bau aufweist, der auch mit Ungenauigkeiten verbunden ist.
So war es den Anmeldern auch nicht möglich, Antikörper für
ihr Verfahren zu benutzen, da sie keine monoklonalen Anti
körper mit geeigneter Kombination von Affinität und Spezi
fität gefunden haben. Zur Diagnose allergischer Symptome
ist dieses bekannte Verfahren daher wenig geeignet.
Weiterhin ist aus der EP 0 819 931 A2 ein Verfahren zur Di
agnose allergischer Symptome bzw. zur Bestimmung von Mole
külen (Antikörper, Antigene) bekannt, bei dem sogenannte
Fängermoleküle (Antigene, Antikörper), die in der Lage
sind, selektiv bestimmte Moleküle zu binden, auf einem flä
chigen Träger verankert werden. Anschließend wird der Trä
ger einer ersten ellipsometrischen Untersuchung unterzogen.
Sodann wird der Träger dem zu untersuchenden Material über
eine bestimmte Inkubationszeit ausgesetzt. Innerhalb dieser
Zeit binden die Fängermoleküle selektive Moleküle nach dem
Schlüssel-Schloß-Prinzip, die dann zu einer Veränderung der
auf dem Träger befindlichen Schicht führen. Durch erneute
ellipsometrische Messung wird die Veränderung gegenüber der
Vormessung erfaßt und anhand vorher von Referenzproben er
mittelten Referenzwerten verglichen. Nachteilig bei diesem
bekannten Verfahren ist, daß ein zweifaches ellipsometri
sches Meßverfahren notwendig ist oder bei Verzicht auf eine
erste Messung auf Werte einer Referenzprobe zurückgegriffen
werden muß, was zu einer damit verbundenen Meßungenauigkeit
führt und zu zwei Messungen an unterschiedlichen Proben
führt. Der Meßaufwand kann dadurch nicht wesentlich verein
facht werden. Die Verankerung der Moleküle auf dem Träger
ist zudem bei dem bekannten Verfahren mit einem relativ ho
hen Aufwand verbunden und kann zu einer schwankenden
Schickdicke führen.
Aus der US 4 508 832 ist ein Verfahren zum Nachweis von in
vitro Immunreaktionen bekannt, bei dem auf ein transparen
tes dielektrisches Substrat als Träger eine Antikörper
enthaltende Schicht aufgebracht wird. Der Träger wird in
eine Küvette mit einem Phosphat-Puffer eingetaucht, die in
dem Strahlengang eines Ellipsometers angeordnet ist. Nach
einer Justierung wird eine Antigene enthaltende zu testende
Lösung in die Küvette eingebracht und die Veränderung eines
Meßsignales über die Zeit mit bekannten Standarddaten ver
glichen. Nachteilig bei dem aus dieser Druckschrift bekann
ten Verfahren ist, daß es relativ aufwendig und kompliziert
durchzuführen und entsprechend fehlerhaft ist.
Weiterhin ist aus der DE 30 42 535 A1 eine Vorrichtung bzw
ein Verfahren bekannt, bei dem auf einem als Träger ausge
bildeten hochreflektierenden Substrat erste biologische
Teilchen als eine erste Proteinschicht aufgebracht bzw. ab
sorbiert werden. Dieses aktive Substrat wird dann in eine
zu untersuchende Lösung mit einer unbekannten Menge an
zweiten biologischen Teilchen (Antigene), die von dem ers
ten biologischen Teilchen der ersten Schicht gebunden wer
den, eingetaucht. An die zweiten biologischen Teilchen wer
den fluoreszierende Antikörper als dritte biologische Teil
chen angebunden. Über eine Lichtquelle, die dem Induzieren
einer Fluoreszenzemission von dem Substrat dient, wird das
induzierte Signal einem Photonenzählsystem zugeführt. Das
am Photonenzählsystem angezeigte Signal ist proportional
der Menge an fluoreszierenden Antikörpern an dem Substrat.
Durch die notwendige Markierung mit fluoreszierendem Farb
stoff ist dieses bekannte Verfahren ebenfalls relativ auf
wendig und kompliziert durchzuführen.
Aus der Datenbank: WPIDS auf STN, Derwent., AN 1990-048279,
AB, JP02001557 A ist ein in vitro Verfahren zur Untersu
chung von lebenden biologischen Komponenten wie Antigenen
und Antikörper-Proteinen bekannt. Dabei wird auf einen
lichtreflektierenden Träger eine Lichtinterferenzschicht
und eine Substanz- bzw. Stoffschicht als eine Detektor
schicht aufgebracht. Die Detektorschicht besteht aus einer
monomolekularen Schicht mit der eine Lösung mit der zu un
tersuchenden ersten biologischen Komponente kontaktiert
wird. Über die Farbveränderung von Interferenzlicht bzw. an
dem Träger reflektierten Licht oder der Dichteveränderung
des reflektierten Lichtes wird die zu untersuchende biolo
gische Kompnente gemessen. Eine zweite biologische Kompo
nente, die mit der ersten Komponente reagieren kann, wird
mit der ersten Komponente in Berührung gebracht, so daß es
beispielsweise zu einer Antigen-Antikörper-Reaktion kommen
kann. Anschließend wird über die Lichtreflektion die Reak
tion bestimmt.
Ein der JP02001557 A entsprechendes Verfahren bzw. Vorrich
tung ist auch aus der Datenbank: WPIDS auf STN, Derwent.,
AN 1989-089414, AB, JP01039555 A bekannt. Ein lichtreflek
tierender Körper besteht hierbei aus Gold, Silber etc. und
weist eine aufgebrachte Lichtinterferenzschicht auf. Eine
reaktive Zwischenschicht besteht aus einer Komponente die
selektiv mit der in Antikörpermolekülen oder -fragmenten
enthaltenen Karboxylgruppe oder Thiolgruppe reagiert. Eine
auf der Zwischenschicht angeordnete im wesentlichen monomo
lekulare Schicht besteht aus Antigenmaterial und/oder An
tikörper-Protein.
Einen der JP01039555 A entsprechenden Aufbau weist auch die
aus der Datenbank: WPIDS auf STN, Derwent., AN 1988-136448,
AB, JP63078051 A bekannte Vorrichtung auf. Nachteilig bei
den aus der JP02001557 A, JP01039555 A und JP63078051 A be
kannten Vorrichtungen ist, daß sie durch ihren vielschich
tigen Aufbau relativ kompliziert aufgebaut und wenig geeig
net für eine Untersuchung einer Vielzahl von unterschiedli
chen allergieauslösenden Antigenen sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Ver
fahren zu finden, bei dem auf markierte sekundäre Antikör
per verzichtet werden kann und das relativ einfach aufge
baut und durchgeführt werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß in Verbindung mit dem O
berbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, daß der Träger
als reflektierender fester Träger ausgebildet ist, auf dem
das Bindungsprotein in einer monomolekularen, oberflächen
aktiven Schicht aufgebracht wird, und daß nach einer Inku
bationszeit ein durch Immunreaktion zwischen dem Antikörper
und dem Antigen verursachter Schichtdickenzuwachs der Pro
tein-Antikörper-Schicht durch ein ellipsometrisches Meßver
fahren festgestellt wird.
Durch die Verwendung eines reflektierenden festen Trägers
ist es möglich, den durch die Immunreaktion verursachten
Schichtdickenzuwachs der Protein-Antikörper-Schicht el
lipsometrisch - also optisch und somit zerstörungsfrei -
festzustellen. Durch die ellipsometrische Messung kann
gänzlich auf sekundäre Antikörper verzichtet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
als Bindungsprotein Protein A vermittels der bekannten
Langmuir-Blodgett-Technik aufgebracht. Es ist aber auch
möglich, als Bindungsprotein beispielsweise Protein G oder
andere geeignete Proteine zu verwenden und vermittels glei
cher Technik aufzubringen.
Durch die Verwendung der Langmuir-Blodgett-Technik ist es
möglich, das Bindungsprotein in einer gewünschten monomole
kularen oberflächenaktiven Schicht aufzubringen. Die mono
molekulare Schicht gewährleistet, daß minimale Substanzen
eingesetzt und nachgewiesen werden können.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin
dung wird als Träger ein Siliziumplättchen verwendet.
Durch die Verwendung von Silizium als Trägermaterial kann
zur ellipsometrischen Bestimmung der Schichtdecke wegen des
hohen Brechungsindexes von Silizium eine entsprechend hohe
Auflösung erreicht werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin
dung wird vor Aufbringen des Bindungsproteins der Träger
mindestens teilweise mit einer gitterförmigen Abdeckung
versehen. Nach Aufbringen des Proteins in voneinander durch
das Abdeckgitter getrennten Inseln wird das Abdeckgitter
entfernt.
Durch die Verwendung des Abdeckgitters wird auf einfache
Weise eine definierte Struktur von Bindungsprotein-Inseln
erreicht. Auf den Bindungsprotein- bzw. Protein-A-Inseln
können dann die für die Examinierung bzw. Diagnose notwen
digen spezifischen Antikörper immobilisiert werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden
Immunglobulin-Antikörper verwendet. So wird beispielsweise
das im Immunsystem am häufigsten vorkommende Immunglobulin
G (IgG) verwendet. Es ist aber beispielsweise auch möglich,
Immunglobulin-E-Antikörper (IgE) zu verwenden. Der Antikör
per (IgG) besteht - ähnlich einem "Y" - aus drei Bereichen.
Die Fab-Regionen, den Armen entsprechend, sind für die im
munspezifische Reaktionsfähigkeit verantwortlich, während
das Fc-Fragment, das Fußende, unspezifisch reagiert. Über
das Fc-Fragment ist das IgG an das Bindungsprotein, bei
spielsweise Protein A, gekoppelt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin
dung, werden aus Patientenserum separierte isotypische An
tikörper verwendet. Grundsätzlich können isotypische Anti
körper jedoch auch aus Blut, Urin oder anderen Körperflüs
sigkeiten separiert werden.
Die separierten Antikörper werden durch eine Mikropipettie
rung auf das in separaten Inseln angeordnete Bindungspro
tein aufgebracht. So können die Inseln des Bindungsproteins
einfach durch eine serielle Mikropipettierung oder auch
durch eine der Inselmatrix entsprechende rastersynchrone
komplette Mikropipettierung bestückt werden.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin
dung wird zur Bestimmung des Schichtdickenzuwachses der
Protein-Antikörper-Schicht der einzelnen Inseln der Träger
auf einem Zwei-Koordinaten-Meßtisch eines Ellipsometers
softwaregesteuert durch den Laserstrahl des Ellipsometers
gescannt. Das Ergebnis des Scannvorganges wird dann mit
Hilfe einer Auswertungssoftware ausgewertet.
Durch die softwaregesteuerte ellipsometrische Messung des
Schichtdickenzuwachses kann die ellipsometrische Schicht
dickenbestimmung zeitsparend weitgehend automatisch und
fehlerfrei durchgeführt werden.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin
dung wird zu einer quantitativen Diagnose ein Massensepara
tor eingesetzt, der die Substanz der Inseln, auf denen eine
Immunreaktion stattgefunden hat, in ihre atomaren Bestand
teile zerlegt. Die erzielten separierten elementaren Frak
tionen werden um die bekannten Protein- und Antikörperan
teile reduziert, so daß die Restsubstanz einen gesuchten,
allergieauslösenden Faktor ergibt. Der allergieauslösende
Faktor wird mit in einer Allergen-Datenbank gespeicherten
Daten verglichen und ausgewertet.
Mit Hilfe eines in das Verfahren integrierten Bearbeitungs
programmes kann das Separatorergebnis mit Hilfe der Aller
gen-Datenbank - einer Softwarebibliothek - rekonstruiert
und durch Vergleiche und Einschränkungen identifiziert wer
den. Damit ist das erfindungsgemäße Verfahren quantitativ
wesentlich exakter als das vorbekannte Verfahren.
Darüber hinaus läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren zu
einem allgemein einsetzbaren Verfahren erweitern.
Die aus der EP 629 857 A2 bekannte Vorrichtung weist die
beschriebenen Nachteile auf und ist nicht für eine optische
Messung in einem Ellipsometer geeignet.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher,
eine Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome durch
Nachweis von in vitro Immunreaktionen zu schaffen, die ohne
markierte sekundäre Antikörper auskommt und für eine zer
störungsfreie optische Messung geeignet ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem Oberbegriff des
Anspruches 23 dadurch gelöst, daß eine Sensorbasis aus ei
nem reflektierenden festen Träger ausgebildet ist, auf dem
matrixförmig in Inseln eine monomolekulare Schicht aus ei
nem oberflächenaktiven Bindungsprotein aufgebracht ist, an
das patientenspezifische Antikörper anbindbar sind, die mit
in einer Lösung enthaltenen Antigenen reagieren können, und
daß die Immunreaktionen in einem Ellipsometer meßbar sind.
Dadurch, daß die Sensorbasis aus einem reflektierenden Trä
ger ausgebildet ist, auf den Inseln eines oberflächenakti
ven Bindungsproteins, an das patientenspezifische Antikör
per, die mit in einer Lösung enthaltenen Antigenen reagie
ren können, anbindbar sind, ist es möglich, die Vorrichtung
bzw. den Träger in einem Ellipsometer auszuwerten, so daß
die Immunreaktionen in einem Ellipsometer meßbar sind.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist
der reflektierende Träger aus Silizium ausgebildet.
Durch die Verwendung von Silizium wird zur ellipsometri
schen Bestimmung der Schichtdicke wegen des hohen Bre
chungsindexes von Silizium eine hohe Auflösung erreicht.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin
dung wird Protein A (PrA) als Bindungsprotein verwendet.
Als Antikörper werden Immunglobulin-G-Antikörper (IgG) des
zu untersuchenden Patienten verwendet. Durch den Fc-
Rezeptor des Proteins A wird das IgG mit seiner Fc-Region
an das Protein A gebunden.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der
nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefüg
ten Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der
Erfindung beispielsweise veranschaulicht sind.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1: Eine schematische Draufsicht auf einen Träger in
vergrößerter Darstellung,
Fig. 2: eine Draufsicht auf den Träger von Fig. 1 mit
einer schematischen Darstellung einer in einer
Reihe angeordneten Mikropipetten,
Fig. 3: eine nichtmaßstäbliche prinzipielle Darstellung
einer Seitenansicht eines Trägers,
Fig. 4: eine schematische Seitenansicht eines in eine
Wanne eingelegten Trägers und
Fig. 5: ein vereinfachtes Fließbild eines Verfahrens zum
Nachweis von Antigen.
Eine Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome besteht
im wesentlichen aus einer Sensorbasis 1, an die patienten
spezifische Allergene 2 anbindbar sind.
Die Sensorbasis 1 besteht im wesentlichen aus einem Träger
3, einem Bindungsprotein 4 und aus patientenspezifischen
Antikörpern 5.
Der Träger 3 ist als ein rechteckiges Siliziumplättchen
ausgebildet, auf dem mit Hilfe der Langmuir-Blodgett-
Technik (Beschichtung von monomolekularen Filmen oberflä
chenaktiver Stoffe durch ein spezielles Tauchverfahren) ei
ne monomolekulare Schicht eines Bindungsproteins 4 angeord
net ist. Als Bindungsprotein 4 wird Protein A (PrA) verwen
det. Es ist beispielsweise aber auch möglich, Protein G als
Bindungsprotein zu verwenden. Das Bindungsprotein 4 ist ma
trixförmig in Inseln 8 auf dem Si-Plättchen angeordnet. Da
bei weist der Träger 3 einen freigelassenen Rand 6 auf. Der
freigelassene Rand 6 dient einerseits als Angriffsfläche
für Halterungen und andererseits gegebenenfalls als Refe
renzfläche für die Brechungsindexermittlung des Trägers 3.
Die Inseln 8 sind mit patientenspezifischen Antikörpern 5
bestückt. Unterschiedliche Inseln 8 weisen dabei Antikörper
5 von jeweils unterschiedlicher Spezifität auf. Als Anti
körper 5 werden aus Patientenserum separierte, isotypische
Immunglobulin-G-Antikörper (IgG) verwendet. Es ist aber
beispielsweise auch möglich, Immunglobulin-E-Antikörper
(IgE) zu verwenden.
Auf den Träger 3 bzw. das Si-Plättchen wird ein Abdeckgit
ter 9 aus einem wachsartigen Material aufgebracht. Mit Hil
fe der Langmuir-Blodgett-Technik werden durch Tauchen die
von dem Abdeckgitter 9 freigelassenen Zwischenräume monomo
lekular mit Protein A beschichtet, so daß durch das Abdeck
gitter 9 voneinander getrennte Inseln 8 aus PrA entstehen.
Die aus Patientenserum separierten Antikörper (IgG) 5 wer
den mit Hilfe von in einer Reihe angeordneten Mikropipetten
10 auf die Inseln 8 aufgebracht. Die Sensorbasis 1 wird je
weils mit der Anzahl einer Rastersequenz (entspricht einer
Reihe im Trägerraster, beispielsweise vier Inseln 8)an Mi
kropipetten 10 bestückt, wobei die Mikropipetten 10 sequen
tiell über die Sensorbasis 1 bzw. den Träger 3 gezogen wer
den, während der Träger 3 jeweils eine Matrixbreite 7 wei
tergeschoben wird. Bei beispielsweise vier in einer Reihe
angeordneten Inseln 8 entspricht die Matrixbreite 7 der
vierfachen Inselbreite 11.
Nach einer anderen Ausführungsform wird ein dem Trägerra
ster entsprechendes Mikropipettierraster hergestellt, was
beispielsweise durch Mikroätzung von Si-Plättchen entspre
chender Dicke unter Ausnutzung seiner Kristallstruktur mög
lich ist. Mit Hilfe des Mikropipettierrasters wird eine ra
stersynchrone Komplettbestückung ermöglicht.
Nach einer gewissen Einwirkzeit, die den Antikörpern 5 die
Anbindung an die (PrA-)Inseln 8 ermöglicht, werden die In
seln 8 durch eine Spülung von überschüssigen Antikörpern
befreit. Anschließend wird das Abdeckgitter 9 von dem Trä
ger entfernt.
Zur Diagnose allergischer Symptome wird die nunmehr als
Biosensor wirkende Sensorbasis 1 in einer Wanne 12 einer
Antigen- bzw. Allergen-Lösung 13 mit patientenspezifischen
Antigenen bzw. Allergenen 2 ausgesetzt. Der bei Anbindung
(Immunreaktion) der Antigene bzw. Allergene 2 an die Anti
körper 5 zu erwartende Schichtdickenzuwachs wird dann mit
einem nicht dargestellten Ellipsometer nachgewiesen. Hierzu
wird zur Bestimmung des Schichtdickenzuwachses der Protein-
Antikörper-Schicht der einzelnen Inseln 8 der Träger 3 auf
einem Zwei-Koordinaten-Meßtisch des Ellipsometers software
gesteuert durch den Laserstrahl des Ellipsometers gescannt.
Das Ergebnis des Scannvorganges wird dann mit Hilfe einer
Auswertungssoftware ausgewertet.
Mit Hilfe eines nicht dargestellten Massenseparators wird
die Substanz der Inseln 8, auf denen eine Immunreaktion
stattgefunden hat, in ihre atomaren Bestandteile zerlegt.
Die erzielten, separierten elementaren Fraktionen werden um
die bekannten Bindungsprotein- und Antikörperanteile redu
ziert. Die Restsubstanz ist der gesuchte allergieauslösende
Faktor, der in einer Allergen-Datenbank bzw. Software-
Bibliothek ausgewertet wird. Diese Allergen-Datenbank ist
eine Sammlung aller bekannten Allergene mit der Verteilung
ihrer elementaren Bestandteile, ihrer biochemischen Struk
tur sowie molekularen Strukturelementen und aller für die
Auswertung notwendigen Bedingungen. Weiterhin wird mit ei
nem integrierten Bearbeitungsprogramm das Separatorergebnis
mit Hilfe der Allergen-Datenbank rekonstruiert und durch
Vergleiche und Einschränkungen identifiziert.
Claims (29)
1. Verfahren zur Diagnose allergischer Symptome durch Nach
weis von in vitro Immunreaktionen, bei dem auf einem Träger ein
Bindungsprotein aufgebracht wird, auf dem Antikörper eines zu
untersuchenden Patienten durch Ankoppeln an das Bindungsprotein
immobilisiert und anschließend einer Antigen-Lösung ausgesetzt
werden, die allergieauslösende Antigene enthält, dadurch ge
kennzeichnet, daß der Träger (3) als reflektierender, fester
Träger ausgebildet ist, auf dem das Bindungsprotein (4) in ei
ner monomolekularen, oberflächenaktiven Schicht aufgebracht
wird, und daß nach einer Inkubationszeit ein durch Immunreakti
on zwischen dem Antikörper (5) und dem Antigen (2) verursachter
Schichtdickenzuwachs der Protein-Antikörper-Schicht durch ein
ellipsometrisches Meßverfahren festgestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Protein A als Bindungsprotein (4) aufgebracht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Protein G als Bindungsprotein (4) aufgebracht wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Bindungsprotein (4) vermittels der Lang
muir-Blodgett-Technik aufgebracht wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge
kennzeichnet, daß als Träger (3) ein Silizium-Plättchen verwen
det wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge
kennzeichnet, daß vor Aufbringen des Bindungsproteins (4) der
Träger (3) mindestens teilweise mit einem Abdeckgitter (9) ver
sehen wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
nach Aufbringen des Bindungsproteins (4) in voneinander durch
das Abdeckgitter (9) getrennten Inseln (8), das Abdeckgitter
(9) entfernt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das Abdeckgitter (9) aus einem wachsartigen Material herge
stellt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge
kennzeichnet, daß als patientenspezifische Antikörper (5) Im
munglobulin-Antikörper verwendet werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Im
munglobulin-G-Antikörper (IgG) verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Im
munglobulin-E-Antikörper (IgE) verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch ge
kennzeichnet, daß als patientenspezifische Antikörper (5) aus
Patientenserum separierte, isotypische Antikörper verwendet
werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die separierten Antikörper durch Mikropipettierung auf das in
separaten Inseln (8) angeordnete oberflächenaktive Bindungspro
tein (4) aufgebracht werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
nach erfolgter Anbindung der Antikörper (5) an das Bindungspro
tein (4) die Inseln (8) durch Spülung von überschüssigen Anti
körpern befreit werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Bestimmung des Schichtdickenzuwachses der Protein-
Antikörper-Schicht der einzelnen Inseln (8) der Träger (3)
auf einem Zwei-Koordinaten-Meßtisch eines Ellipsometers
softwaregesteuert durch einen Laserstrahl des Ellipsometers
gescannt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
daß das Ergebnis des Scannvorganges mit Hilfe einer Auswer
tungssoftware ausgewertet wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch
gekennzeichnet, daß zu einer quantitativen Diagnose ein
Massenseparator eingesetzt wird, der die Substanz der In
seln (8), auf denen eine Immunreaktion stattgefunden hat,
in ihre atomaren Bestandteile zerlegt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß die erzielten separierten elementaren Fraktionen um die
bekannten Protein- und Antikörperanteile reduziert werden,
so daß die Restsubstanz einen gesuchten allergieauslösenden
Faktor ergibt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß der allergieauslösende Faktor mit in einer Allergen-
Datenbank gespeicherten Daten verglichen und ausgewertet
wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,
daß die Allergen-Datenbank eine Sammlung bekannter Allerge
ne mit der Verteilung ihrer elementaren Bestandteile ent
hält.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,
daß die Allergen-Datenbank die biochemische Struktur sowie
molekulare Strukturelemente der Allergene enthält.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die Restsubstanz mit Hilfe der Aller
gen-Datenbank rekonstruiert und durch Vergleiche und Ein
schränkungen identifiziert wird.
23. Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome durch
Nachweis von in vitro Immunreaktionen, dadurch gekennzeich
net, daß eine Sensorbasis (1) aus einem reflektierenden,
festen Träger (3) ausgebildet ist, auf dem matrixförmig in
Inseln (8) eine monomolekulare Schicht aus einem oberflä
chenaktiven Bindungsprotein (4) aufgebracht ist, an das pa
tientenspezifische Antikörper (5) anbindbar sind, die mit
in einer Antigen-Lösung (13) enthaltenen Antigenen (2) rea
gieren können.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß der reflektierende Träger (3) aus Silizium ausgebildet
ist.
25. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Bindungsprotein (4) aus Protein A (PrA)
besteht.
26. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Bindungsprotein aus Protein G (PrG) be
steht.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 26, da
durch gekennzeichnet, daß die Antikörper (5) Immunglobulin-
Antikörper sind.
28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet,
daß die Antikörper (5) Immunglobulin-G-Antikörper (IgG) des
zu untersuchenden Patienten sind.
29. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet,
daß die Antikörper (5) Immunglobulin-E-Antikörper (IgE) des
zu untersuchenden Patienten sind.
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