DE2650106C2

DE2650106C2 -

Info

Publication number: DE2650106C2
Application number: DE2650106A
Authority: DE
Inventors: Fred H. Northbridge Calif. Us Deindoerfer; Roland Saratoga Calif. Us Jang; H. Theodore Atherton Calif. Us Rudow
Original assignee: Whittaker Corp
Current assignee: Whittaker Corp
Priority date: 1975-11-03
Filing date: 1976-10-30
Publication date: 1989-06-29
Also published as: FR2329997A1; DE2650106A1; JPS5533686A; GB1565401A; FR2329997B1; US3999948A; JPS5524067B2; JPS5257317A; CA1083729A; JPS5914193B2

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Zur Ausführung quantitativer Mengenbestimmungen an Proben biologischer Herkunft (wie z. B. Serum oder Urin) sind bereits mehrere Verfahren bekannt. Bei diesen bekannten Verfahren muß eine bezeichnete Substanz, die mit der Probe zur Reaktion gebracht worden ist, von nicht zur Reaktion gebrachten, be zeichneten Substanzen getrennt werden, die aus freien und unspezifisch gebundenen Substanzen bestehen. Die in der Flüssigkeit erfolgende Trennung ist mangelhaft, unzuverlässig und zeitraubend. Zur Abhilfe ist daher bereits vorgeschlagen worden, diagnostische Reagenzien auf die Oberfläche eines festen Körpers in Form einer Beschichtung aufzubringen, wel che mit der bezeichneten Substanz kombinierbar ist.

Entsprechend einem bekannten Verfahren werden Kunststoff- Prüfröhrchen mit Reagenz beschichtet durch physikalische Adsorption von Antikörpern, welche für die zu untersuchende Probensubstanz spezifisch sind. Nähere Angaben darüber sind zu entnehmen z. B. den Aufsätzen von Catt u. a. in "Journal of Biochemistry", 1966,Bd. 100, Seiten 31c und 33c und in "Science", 1967, Bd. 158, Seite 70. Dieses bekannte Verfahren läßt sich auf Grund der Ungleichförmigkeit der Kunststoffoberfläche und der bei der Beschichtung unvermeid baren Ungenauigkeit nur schwierig beherrschen. Außerdem kann beim Waschen, durch welches nicht zur Reaktion gebrach te, bezeichnete Substanz entfernt werden soll, eine die Anti körper haltende, verhältnismäßig schwache physikalische Haft bindung der Beschichtung gestört werden, so daß die Antikör per zusammen mit zur Reaktion gebrachter, bezeichneter Sub stanz verlorengehen. Außerdem muß dabei die Beschichtung jedes einzelnen Prüfröhrchens getrennt für sich erfolgen. Das ist besonders zeitraubend, insbesondere im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit, wenn zur Vermeidung des Verlusts an dia gnostischem Reagenz eine kovalente Bindung angewendet wird. Außerdem gestattet die Prüfröhrchenbeschichtung keine genaue Ausrichtung in einem Fluorometer-Meßstrahlengang für Refle xionsmessungen. Bei Prüfröhrchen ist weiterhin die kovalente Bindung auf den Werkstoff beschränkt, aus dem Prüfröhr chen hergestellt sind.

Ein weiteres bekanntes Verfahren unter Verwendung einer Fest körperoberfläche ist in der US-PS 38 26 619 von Bratu Jr. u. a. beschrieben. Bei diesem System wird ein physikalisch adsorbiertes diagnostisches Reagenz verwendet, mit dem die Spitze eines Halters beschichtet wird. Die Spitze wird zu nächst in einen Behälter für die Probe, und dann in einen weiteren Behälter für die bezeichnete Substanz eingepaßt. Dabei ergeben sich große Ungenauigkeiten, da durch Abrieb an der ungeschützten Spitze beim paßgenauen Einführen in die Behälter Verluste auftreten. Da die in den Behälter ein gesetzte Spitze keine Rühr- oder Agitationsmöglichkeit bie tet, ergeben sich lange Inkubationszeiten. Außerdem eignet sich dieses Verfahren nicht zur Ausführung großer, repro duzierbarer Meßreihen, da jeder Halter einzeln für sich mit dem diagnostischen Reagenz beschichtet werden muß. Schließlich ist damit auch keine genaue Messung möglich.

Des weiteren ist aus der DE-OS 25 09 215 ein Halter für diagnostische Reagenzien bekannt, der aus einem Schaft, einem Griff und einer den Probenbelag tragenden Fläche besteht. Allerdings ist dieser Halter für durchstrahlende Meßverfahren vorgesehen, und es wird auch kein Hinweis zum Aufbringen des zu untersuchenden Materials in Form einer selbsttragenden Folie gegeben.

Die DE-OS 25 31 136 zeigt einen Halter für diagnostische Reagenzien, die in Form von Gelsäulen vorliegen und zur Messung ebenfalls durchstrahlt werden müssen. Dieser Halter soll in den entsprechend geformten Schaft einer nicht dargestellten Meßvorrichtung formschlüssig eingesetzt werden, wobei innerhalb des Halters der Träger für das zu untersuchende Material mittels einer Blattfeder gegen die das Meßfenster enthaltende Wand des Halters gedrückt wird. Um ein Fluchten des zu untersuchenden Materials mit dem Meßfenster zu erzielen, sitzt der Träger für das zu untersuchende Material auf dem Ende einer Justier schraube auf.

Darüber hinaus zeigt die US-PS 27 49 797 einen Halter für durchstrahlende Messungen an Ölproben, bei dem der Halter einen Durchbruch als Meßfenster aufweist, der teilweise von einem vorspringenden Rand umgeben ist. Allerdings dient dieser vorspringende Rand zum Zentrieren und Fixieren eines entsprechend gestalteten, ringförmigen Trägers aus transparenter Folie, auf den die Ölprobe aufgebracht wird.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, eine Probenkammer mit herausnehmbarem Halter für diagnostische Reagenzien, insbes. biologischer Herkunft, zu schaffen, bei der ein schnelles und einfaches Einführen des Halters in die Probenkammer sowie eine exakte Justierung der Probe gegenüber der Meßeinrichtung und damit ein genau reproduzierbares Einstellen der Proben möglich ist, so daß der Halter auch für Massenanalysen geeignet ist.

Die Lösung dieser Aufgabe ist im ersten Anspruch gekennzeichnet. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Dabei läßt sich die Probenkammer in einen Fluorometer oder ein anderes Gerät einsetzen und ist vermittels einer Gleit führung in seitlicher Richtung verschiebbar. Es können mehrere Meßfenster vorgesehen sein, von denen eines zur Auf nahme einer Flüssigkeitsküvette dient. Ein weiteres Meß fenster kann zur Aufnahme einer Null- oder Bezugsprobe dienen.

Die Probenkammer in Verbindung mit dem Reagenzhalter ist besonders gut geeignet zur Ausführung fluorometrischer Mes sungen an einer Oberfläche, indem die mit einem Reagenz versehene Oberfläche des Halters in jedem Falle in gleichem Abstand und unter gleichen Winkeln von bzw. zu Anregungs lichtquelle und Detektor gehalten ist.

Der zur Mengenbestimmung an einer Probe biologischer Herkunft verwendete Halter weist einen langgestreckten Schaft, an den sich an einem Ende eine Tragvorrichtung anschließt, auf, und die Tragvorrichtung ist mit einer ein diag nostisches Reagenz tragenden, selbsttragenden Folie versehen. Bei einer Ausführungsform besteht die Halterung aus einer Auflagefläche, mit welcher die Folie haftend verbunden wird. Vorzugsweise wird das diagnostische Reagenz in kovalenter Bindung gleichzeitig auf eine große Anzahl scheibenförmiger Folien aufgebracht, wonach die Folien einzeln an der Tragvorrichtung befestigt werden. Um die Folie herum ist ein Schutz wie z. B. ein Abstandshalter angeordnet, durch den Abriebver luste am diagnostischem Reagenz, an der bezeichneten Probe oder der mit der Folie reagierten Substanz verhindert werden. Der Halter ist innerhalb der Probenkammer in einer genau vorgebbaren und reproduzierbaren Lage gehalten. Eine am Hal ter ausgebildete Spitze dient im Zusammenwirken mit einem entsprechenden Teil der Probenkammer als Drehlager und er möglicht das Ausführen von Rührbewegungen vermittels des Halters.

Die Erfindung ist im nachfolgenden an Hand der in der Zeich nung dargestellten Ausführungsbeispiele näher erläutert. In der Zeichnung ist

Fig. 1 eine Explosionsdarstellung der Probenkammer, wobei der Halter und eine Küvette oberhalb der Schächte dargestellt sind, in welche sie einführbar sind;

Fig. 2 eine Aufsicht auf die Kammer der Fig. 1, wobei die Decke teilweise weggebrochen ist;

Fig. 3 ein Aufrißquerschnitt des unteren Teils des Halters der Fig. 1 entlang der Linie 3-3;

Fig. 4 eine Vorderansicht einer anderen Aus führungsform des Halters,

Fig. 5 ein Querschnitt entlang der Linie 5-5 durch den Halter der Fig. 4.

Es sei zunächst die in den Fig. 1 und 3 dargestellte Aus führungsform des Halters 10 betrachtet. Dieser Halter 10 weist an seinem oberen Ende einen leicht zu fassen den Griff 11, und an seinem unteren Ende eine Tragvorrichtung 12 auf, wobei Handgriff und Halterung über einen langgestreck ten Schaft 13 miteinander verbunden sind. Die Tragvorrichtung 12 besteht hier aus einer an der Vorderseite des Halters ausge bildeten Anlagefläche, welche zugleich die Meßseite bildet. Der Griff 11 weist eine rechteckige Formgebung von aus reichender Größe auf, verläuft quer zum Schaft 13 und läßt sich somit bequem von Hand oder vermittels einer mechanischen Vorrichtung erfassen. Der Halter 10 kann somit zugleich zum Rühren einer Flüssigkeit verwendet werden und ermöglicht an seinem Griff 11 das Anbringen eines Etiketts zur Iden tifizierung der Probe. Selbstverständlich kann der Griff auch eine andere Formgebung aufweisen. Der langgestreckte Schaft 13 hat den Zweck, einen Abstand zwischen Griff 11 und Tragvorrichtung 12 vorzugeben, so daß der z. B. von Hand am Griff 11 ergriffene Halter 10 zum Rühren einer Flüssigkeit benutzt werden kann, wobei sich der Griff oberhalb der Flüssigkeit befindet und die Tragvorrichtung 12 in diese eintaucht.

Damit ist eine rasche Trennung von festen und flüssigen Phasen, sowie außerdem eine genaue Ausrichtung der Tragvorrichtung 12 in der Probenkammer entsprechend der Darstellung von Fig. 1 möglich, wobei sich die Tragvorrichtung tief innerhalb der Kammer befindet und gegen Umgebungslicht geschützt ist. Der Halter ist aus einem gegenüber den Reagenzien verhältnismäßig inerten Werkstoff wie z. B. einem Spritzkunststoff hergestellt.

Die selbsttragende Folie 16 ist scheibenförmig ausgebildet und vermittels eines Haftmittels oder durch Kunststoff- Schweißung mit der Vorderseite der Tragvorrichtung, d. h. der Anlage fläche verbunden, so daß sie fest an dieser haftet. Die Folie 16 trägt ein diagnostisches Reagenz, das wie nach stehend beschrieben vorzugsweise durch kovalente Bindung auf gebracht ist. Die hier mit Anlagefläche ausgebildete Tragvorrichtung 12 und die Folie 16 weisen vorzugsweise beide kreis förmige Formgebung auf, was das Anbringen der Folie an der Anlagefläche erleichtert, indem keine Winkelausrichtung er forderlich ist.

Ein vorstehender Abschnitt in Form eines überstehenden Abstandhalters 14 ist um den ganzen Umfang oder den größten Teil des Umfangs der Anlagefläche herum ausgebildet und umgibt somit gleich falls die Folie 16. Bei dem hier dargestellten Ausführungs beispiel ist der Abstandhalter 14 um den ganzen Umfang der Folie herumgeführt, steht von der freiliegenden Oberfläche der Folie 16 nach außen zur Vorderseite des Halters vor und schützt daher die Folie vor Abrieb und damit Verlust des auf diese aufgebrachten Materials. Der vorstehende Abstandhalter kann auch mit Unterbrechungen versehen oder aus einer Vielzahl um den Umfang herum in gegenseitigen Abständen ausgebildeten Höckern gebildet sein. Auch kann die Tragvorrichtung eine ebene Vorderfläche aufweisen und die Anlagefläche gegenüber dieser zurückgesetzt sein, so daß sich ebenfalls wieder ein vor stehender Abstandhalter ergibt. Die Oberfläche des Abstandhalters liegt in jedem Falle in einer zur Oberfläche der Folie 16 parallelen Ebene und ist zur Anlage bringbar gegen eine entsprechende Anlagefläche in der Probenkammer oder in einem optischen Gerät, wobei die Folie 16 eine genau defi nierte Lage in einem optischen Strahlengang einnimmt.

Der Halter weist an seinem unteren Ende an der Rückseite eine Abschrägung 17 auf, welche das Vorbeiführen des Halters an einem federnd elastisch beaufschlagten Vorsprung erleich tert, der zu Ausrichtungszwecken in einem Schlitz der Proben kammer angeordnet ist.

Außerdem weist der Halter 10 an seiner Rückseite gegenüber der Mitte der Tragvorrichtung einen Vorsprung 18 auf, welcher in eine entsprechende Ausnehmung in der Probenkammer einsetzbar ist. Stattdessen kann der Halter 10 auch parallel zum Schaft 13 gefast und dementsprechend zusammenwirkbar mit einem entsprechenden Vorsprung im Meßschlitz der Probenkammer ausgebildet sein.

Vom unteren Ende des Halters steht eine Spitze 15 vor, welche als Stützlager oder Drehlager dient. Zum Rühren wird der Hal ter mit seiner Spitze 15 gegen eine Fläche eines Flüssig keitsbehälters wie z. B. eines Prüfrohrs angesetzt und er möglicht damit eine Verwirbelung der Flüssigkeit im Proben bereich.

Die Folie 16 trägt ein diagnostisches Reagenz, welches mit einer Probensubstanz zur Reaktion bringbar ist. Wenn die Probensubstanz beispielsweise aus einem Antigen besteht, kann das diagnostische Reagenz aus einem in spezifischer Weise mit dem Antigen zur Reaktion bringbaren Antikörper be stehen. Das diagnostische Reagenz stellt somit einen von zwei oder mehreren Reaktantensubstanzen dar. Ein typischer Anwendungszweck für den Reagenzhalter ist die Prüfung von Körperflüssigkeiten wie z. B. Seren, Urin oder anderen Flüssigkeiten auf das Vorhandensein von pathogenen Stoffen oder deren Toxinen, oder auf die Konzentration anderer Sub stanzen in der Flüssigkeit. Das diagnostische Reagenz ist eine Substanz, die selektiv oder sterisch auf die dazu passende Probensubstanz abgestimmt ist. Beispiele für Pro bensubstanzen sind: Suchterregende Drogen wie z. B. Morphium, Methadon, Cocain und Barbiturate, Arzneimittel zur Behand lung bestimmter chronischer Krankheiten und Leiden wie z. B. Digoxin (Herzunregelmäßigkeiten), Insulin (Digitalis) und Diphenylhydantoin (Epilepsie), Hormone wie z. B. Thyroxin und Trÿodthyroxin, Stereoidhormone wie z. B. Aldosteron, Corti sol, Testosteron, Estriol und Progesteron, Peptid- und Proteinhormone wie z. B. Adrenocorticotropin, Angiotensin, Gastrin, chorionisches Gonadotropin, follikelstimulierendes Hormon, Wachstumshormon, Luteinisierungshormon, Neurophysin, Placental-Lactogen und thyroidstimulierende Hormone, Vita mine wie z. B. Cyanocobalamin und Folinsäure, Enzyme wie z. B. Chymotrypsin, Kreatinphosphokinase, alkalische Phosphatase und laktische Dehydrogenase, Antigene wie z. B. carcinoembio nisches Antigen, Leberentzündungen begleitendes Antigen und Alphafetoprotein, Antikörper wie z. B. Anti-Toxoplasmose- Anti körper, Anti-Thyroid-Antikörper und Anti-Kern-Antikörper, aus Zellen gebildete Stoffe wie z. B. Bakterien, Pilze, Pro tozoen, Erthyozyten und Leukozyten, Serenproteine wie z. B. Fibrogene, antihämophile Faktoren, Lipoproteine, Immuno globuline und Thyroxin bindendes Globulin, Zellen zersetzende Produkte wie z. B. Myoglobine, bakterielle Toxine und lyzo zymale Digestionsmittel usw. Es lassen sich auch andere Substanzen verwenden, vorausgesetzt, diese lassen sich durch direkte Bezeichnung oder durch Bindung mit bezeichneten spe ziellen Bindeproteinen, Inhibitoren, Enzymen, Antigenen oder Antikörpern messen und entweder vor oder nach direkter oder indirekter Bezeichnung auf eine Oberfläche aufbringen.

Die Folie 16 besteht aus einem praktisch nicht schwellfähi gen, durchgehenden, durchlässigen Werkstoff. Eine undurch lässige Folie wie sie hier verwendet wird, gestattet keinen Flüssigkeitsdurchgang von der einen zur anderen Seite wäh rend der Behandlung. Wenngleich etwas Flüssigkeit in die Folie eindringen kann, sollte diese vorzugsweise nicht porös ausgebildet sein, um ein nennenswertes Imprägnieren mit Flüssigkeit zu verhindern. Eine in dieser Weise ausgebildete Folie gestattet ein schnelles Abwaschen der Oberfläche nach Reaktion mit einer bezeichneten Substanz, um den Störpegel auf Grund nicht reagierender Bezeichnungssubstanz zu besei tigen. Im Gegensatz dazu benötigen durchlässige oder poröse Flächen eine sehr aufwendige Waschbehandlung. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform wird das diagnostische Reagenz in kovalenter Bindung auf die Oberfläche der Folie 16 aufgebracht. Die Folie 16 besteht dabei aus einer Unter lage aus einem Polyacrylsäurepolyamid, einem Zellstoff- oder Polymerisat-Film, je nachdem, welches diagnostische Reagenz verwendet wird.

Der Halter 10 muß zu seiner Handhabung, insbesondere als Rührer, eine bestimmte mechanische Festigkeit oder Steifigkeit auf weisen, jedoch ist das für die Folie 16 andererseits nicht erforderlich. In entsprechender Weise treffen die chemi schen Anforderungen an die Folie 16, wie z. B. ihre Reaktivi tät zur Bildung kovalenter Bindungen mit diagnostischen Reagenzien, nicht auf den Halter 10 zu. Daher kann es vorteilhaft sein, Folie 16 und Halter 10 aus unterschiedlichen Werkstoffen her zustellen.

Wenn die Folie 16 aus einem Polymerisatwerkstoff hergestellt ist, der in seiner Matrix keine Gruppen enthält, die mit dem diagnostischen Reagenz reagieren, lassen sich entsprechende, reagierende Gruppen durch bekannte chemische Reaktionen an lagern. Derartige Gruppen sind Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen, Amidogruppen und Carboxylgruppen. Die Bindung diagnostischer Reagenzien an Polymerisaten, die mit derartigen Gruppen gekoppelt sind, ist in der US-PS 37 20 760 von Bennich u. a. beschrieben.

Die kovalente Bindung wäre sehr zeitraubend und schwer re produzierbar, wenn diese bei in der Tragvorrichtung 12 angebrach ter Folie 16 ausgebildet wird. Daher hat es sich als wün schenswert gezeigt, zunächst das diagnostische Reagenz durch kovalente Bindung an einer großen Anzahl von Folien anzubringen, indem diese in einem Behälter der entsprechenden Reaktionsbehandlung unterworfen werden, wonach die Folien in der Tragvorrichtung 12 der Halter 10 haftend befestigt werden. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß die Hand habung der Folien in diesem Zeitpunkt, in welchem sie noch nicht durch einen vorstehenden Abstandhalter 14 geschützt und auch noch nicht vermittels des Halters frei bewegbar sind, noch mühelos zu bewerkstelligen ist. Die Folien werden in der nachstehend beschrie benen Weise vor Reaktion mit der bezeichneten Substanz (labelled substance) und der Probensubstanz in die Tragvorrichtung eingesetzt und sind dann gegen Abrieb geschützt, der sich bei der Handhabung der Proben ergeben könnte und zu Signal verlust und Meßfehlern führen würde.

Der Einfachheit halber sei hier ein typisches fluorometrisches Verfahren, das Sandwich-Verfahren, beschrieben. In einem ersten Verfahrensschritt wird das diagnostische Reagenz (wie z. B. ein Antikörper) in kovalenter Bindung auf die Folie aufge bracht. Zur Massenherstellung können die scheibenförmigen Folien aus einem entsprechenden Folienmaterial wie z. B. Poly acrylsäurefolie ausgestanzt werden. Die Scheiben werden dann mit einem Abstandsarm versehen, oder es wird diesen ein Kopplungsreagenz aufgepfropft. Diese Reaktionen werden an einer großen Anzahl von Folien wie z. B. 100 Stück oder mehr in einem Reaktionsgefäß unter Agitation durchgeführt. Die Kopplungsreagenz enthaltenden Folien werden anschließend in entsprechender Weise mit einem geeigneten Antikörper be handelt, gewaschen und getrocknet. Dann werden die Folien z. B. vermittels eines auf Druck ansprechenden Haftmittels an der Tragvorrichtung 12 befestigt.

Der Halter wird dann an dem Handgriff ergriffen und mit der das diagnostische Reagenz tragenden Folie in eine Flüssig keitslösung eingetaucht, die eine mit dem diagnostischen Rea genz reagierende Probensubstanz wie z. B. ein Antigen enthält. Ein vorhandenes Antigen reagiert mit dem Antikörper auf der Folienoberfläche während einer Inkubationszeit. Vorzugsweise wird die Reaktionssubstanz während der Inkubationszeit be wegt, wodurch diese wesentlich verkürzt wird. Außerdem wird dadurch die Reproduzierbarkeit von Versuchsergebnissen, ins besondere bei kurzen Inkubationszeiten, gesteigert. Der Griff 11 ist dabei sehr gut zum manuellen oder mechanischen Rühren der Lösung geeignet.

Nach Inkubation mit dem Antigen enthaltenden Probenserum wird der Halter 10 aus der Lösung herausgenommen und mit einem geeigneten Lösungsmittel wie z. B. einem wäßrigen Pufferphosphat oder destilliertem Wasser gewaschen.

Im nächsten Verfahrensschritt wird die gezeichnete Substanz, zweckmäßigerweise ein Antikörper, der mit einer fluorochro men radioaktiven Substanz, einem Enzym oder einer phosphores zierenden Substanz bezeichnet ist, während einer ausreichend langen Inkubationszeit in Berührung mit der Folie 16 ge bracht, wobei die Reaktion zwischen dem bezeichneten Anti körper und dem Antigen erfolgt. Auch dabei wird die Lösung während der Inkubationszeit vorzugsweise bewegt, um die Reak tionszeit zu verkürzen und die Reproduzierbarkeit beim späteren Meßvorgang zu steigern.

Im nächsten Verfahrensschritt wird die ungebundenen, be zeichneten Antikörper enthaltende Lösung von der gebundenen, bezeichneten Antikörper enthaltenden Festkörperoberfläche getrennt. Dann wird die der Reaktion ausgesetzte Festkörper oberfläche gründlich gewaschen, um ggf. auf der Folie noch zurückbleibende Rückstände von nicht spezifisch gebundenen Antikörpern zu entfernen. Der Wirkungsgrad dieses Wasch vorgangs ist ausschlaggebend, um genaue Ergebnisse zu er halten. Das gründliche Waschen der Oberfläche erfolgt mit einer Reinigungslösung wie z. B. einem wäßrigen Pufferphosphat oder destilliertem Wasser. Dabei muß natürlich eine feste kovalente Bindung zwischen diagnostischem Reagenz und Folie gegeben sein, damit der mit dieser verbundene, bezeichnete Antikörper während des Waschvorgangs nicht verlorengeht.

Im Anschluß an den Waschvorgang wird der Halter 10 zur Ausführung quantitativer Messungen in den Detektor ein gesetzt. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Bezeich nung aus einem Fluorochrom besteht und der Detektor ein Fluorometer ist, wie in einer weiteren US-Patentanmeldung der Anmelderin (Ser. No. 553 582, Titel: "Fluoro metric System, Method and Test Article", Erfinder Richard A. Harte, AT 27. 2. 1975) beschrieben ist.

Der Halter 10 läßt sich in ein optisches Meßsystem wie z. B. einen Fluorometer einsetzen, wobei die Messung jedoch vorzugsweise unter Verwendung der gleichfalls vorgeschlage nen Probenkammer ausgeführt wird.

Die in den Fig. 1 und 2 dargestellte Probenkammer 20 dient zur Aufnahme des vorstehend beschriebenen Halters 10 zur Ausführung von Messungen in z. B. einem Fluorometer. Die Probenkammer 20 weist eine vordere Begrenzungswand 21, eine Decke 22 und die beiden Seitenwände 23 und 24 auf und ist gleitend verschiebbar auf einem L-förmigen Fußstück 26 gelagert, das seinerseits fest mit dem Meßgerät verbindbar ist. Bei der hier dargestellten Ausführungsform weist die Probenkammer 20 einen parallel zur vorderen Begrenzungswand 21 über die ganze Länge der Probenkammer verlaufenden Längsschlitz 27 auf. Ein ander parallele Führungen 28 entlang dem Längsschlitz 27 wirken mit entsprechenden, einander parallelen Nuten 29 im Fußstück 26 zusammen und bilden eine Gleitführung, vermittels welcher die Probenkammer in waagerechter Richtung hin und her verschiebbar geführt ist.

Für die seitliche Verschiebung der Kammer entlang der Gleit führung ergeben sich wenigstens zwei genau vorbestimmte Ein stellungen. Zu diesem Zweck sind federbelastete und Kugeln aufweisende Stellschrauben 35 an der Rückseite der Kammer befestigt und stehen in den Längsschlitz 27 hinein vor. Diese Stellschrauben 35 münden an den Führungen 28. Die seitliche Verschiebung der Kammer entlang der Gleitführung ist auf beiden Seiten, rechts und links, durch hier nicht im einzel nen dargestellte Anschlagschrauben begrenzt, welche im Be reich des Längsschlitzes 27 angeordnet sind. Ein Schiebe griff 25 gestattet, Probenkammer 20 in ihrer Gleitführung zwischen mehreren, nebeneinander angeordneten Meßstationen hin und her zu verschieben.

Die hier dargestellte Ausführungsform der Probenkammer weist wenigstens zwei Meßschlitze auf, von denen der eine zur Auf nahme des Halters 10, und der andere zur Aufnahme einer Küvette dient. Wenn die Probenkammer 20 in einen Fluoro meter eingebaut ist, läßt sie sich natürlich in seitlicher Richtung verstellen, um die Meßschlitze in entsprechende Ausrichtung zu den fest angeordneten Teilen des Fluorometers, nämlich der Anregungsquelle und dem Detektor, zu bringen.

Ein dritter, hier nicht dargestellter Meßschlitz kann zur Aufnahme eines weiteren Halters, der zur Ausführung einer Null- oder Bezugsmessung dient, vorgesehen sein.

Ein erster Meßschlitz 31 ist durch eine Öffnung in der Decke 22 zugänglich. Das untere Ende des Meßschlitzes 31 steht in Verbindung mit einer Ausnehmung in der Vorder wand 21, die als Meßfenster 32 ausgebildet ist. Ein An schlag innerhalb des Meßschlitzes 31 gibt die Höhe vor, bis zu welcher der Halter 10 in den Meßschlitz 31 einführbar ist. Bei der hier dargestellten Ausführungsform besteht dieser Anschlag aus dem abgerundeten unteren Ende 31 a des Meßschlitzes 31. Ein Ablaufkanal 33 steht mit dem Innenraum des Meßschlitzes 31 in Verbindung, ist aus der Probenkammer herausgeführt und dient dazu, Rückstände aus der Kammer ab zuführen, die sich nach längerem Gebrauch ansammeln könnten. Bei der in Fig. 2 schematisch dargestellten fluorometrischen Meßanordnung wird die in der Halterung befindliche Folie durch das Meßfenster 32 hindurch in Pfeilrichtung A beleuch tet, während das von dieser emittierte Licht in Pfeilrich tung B von einem Fluoreszenzdetektor aufgefangen wird.

Der Halter 10 ist gegen eine Oberfläche des Meßschlit zes 31 beaufschlagt, damit sich die Tragvorrichtung 12 innerhalb der Probenkammer in einer stets gleichbleibenden, genau vorgegebenen Lage befindet, wenn der Halter gegen seinen Anschlag anliegt. Bei der hier dar gestellten Ausführungsform ist eine federbelastete Stell schraube 34 vorgesehen, die zur Begrenzungswand 21 der Probenkammer weist. Die Stellschraube 34 beaufschlagt bei in den Meß schlitz 31 eingesetztem Halter 10 den auf dessen Rückseite befind lichen Vorsprung 18 und drückt damit die Tragvorrichtung 12 gegen das Meßfenster 32 an.

In der Vorderwand 21 der Probenkammer ist außerdem ein Küvettenschlitz 36 seitlich versetzt zum Meßschlitz 31 aus gebildet. Der Küvettenschlitz 36 weist ein gegenüber dem übrigen Teil des Schlitzes verbreitertes Küvettenfenster 36 a auf, ist von quadratischem Querschnitt und verläuft unter einem Winkel von 45° zur Begrenzungswand 21. Wie aus der schemati schen Darstellung von Fig. 2 ersichtlich, wird das in Pfeil richtung A einfallende Anregungslicht unter einem Winkel von 90° in Pfeilrichtung B reflektiert. Das wird durch die vor stehend beschriebene Winkelausrichtung ermöglicht. Ein An schlagstift 37 innerhalb des Küvettenschlitzes 36 gibt die genaue Höhenlage einer Küvette vor. Selbstverständlich sind auch Fluoreszenzmessungen an Oberflächen unter anderen Win keln als 90° möglich, wenn das in der vorgenannten weiteren US-Patentanmeldung von Harte beschriebene System verwendet wird.

Eine Küvette 38 von quadratischem Querschnitt und mit transparenten Seitenwänden ist paßgenau in den Küvettenschlitz 36 einführbar. Ein Deckel 39 der Küvette ist mit einem Einlaßrohr 40 und einem Auslaßrohr 41 versehen, so daß unterschiedliche diagnostische Proben bei eingesetz ter Küvette durch diese durchgeleitet werden können.

Die Decke 22 ist mit einer Ausnehmung versehen, an der auf zwei Seiten zueinander parallel verlaufende Schwalben schwanznuten 45 ausgebildet sind. Eine Platte 42 zum Abdecken ist in den Schwalbenschwanznuten 45 innerhalb der Ausnehmung gleitend verschiebbar geführt. Ein Stift 42 a dient zum Verstellen der Platte 42, wobei deren Verstellweg durch zwei Anschlagstifte 43 begrenzt ist.

Zur Ausführung einer Messung wird der diagnostische Halter 10 so weit in den Meßschlitz 31 eingeführt, daß sich die Folie 16 genau gegenüber dem Meßfenster 32 befindet, wo bei die Stellschraube 34 gegen den Vorsprung 18 an der Rück seite der Tragvorrichtung 12 anliegt. Bei fluorometrischer Messung fällt das Licht in Pfeilrichtung A ein und ruft Fluoreszenz an der mit einem fluoreszierenden Medium ver sehenen Folie hervor. Das emittierte fluoreszierende Licht wird in Pfeilrichtung B von einem Fluoreszenzdetektor auf gefangen, wobei die Emissionsintensität gemessen wird. Selbstverständlich läßt sich die Probenkammer auch in Ver bindung mit anderen Meßsystemen wie z. B. Radioimmunmessungen unter Verwendung eines Geigerzählers oder in einem Spektro photometer verwenden. Wenn die in einer Küvette 38 enthal tene Flüssigkeit analysiert werden soll, wird die Proben kammer 20 entlang ihrer Gleitführung in seitlicher Richtung so weit verschoben, daß die Küvette zu Lichtquelle und De tektor ausgerichtet ist.

In den Fig. 4 und 5 ist der untere Teil einer weiteren Aus führungsform des Halters 46 dargestellt. Der Halter 46 weist auch hier einen Schaft 47 auf, der seiner seits eine Tragvorrichtung trägt. Die Tragvorrichtung besteht bei die ser Ausführungsform aus einem ringförmigen Abstandhalter 48 mit einer inneren Haltenut 49, welche um die ganze Innenwand 50 des Ringrandes herumgeführt ist. Eine selbsttragende Folie 51, welche ein diagnostisches Reagenz trägt, ist in die Haltenut 49 einge setzt. Da die Folie 51 biegsam ist, läßt sie sich durch biegen und in die Haltenut 49 einpassen. Der Abstandhalter 48 dient dabei dazu, die Folie 51 vor Abrieb zu schützen. Eine an der Rückseite des Schafts 47 ausgebildete Aussparung 52 dient zum Paßeingriff mit einer entsprechenden Stellschraube 34 im Meßschlitz 31. Weiter können in Nähe der Folie auch noch parallel zum Schaft verlaufende Nuten vorgesehen sein, die zu entsprechenden Vorsprüngen von z. B. keilförmiger Formgebung an der Seite des Meßschlitzes ausgerichtet sind. Ansonsten entspricht der Reagenzhalter 46 nach den Fig. 4 und 5 der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform, wobei auch Anwendung und Einsatz unverändert sind.

Die Erfindung wird im nachfolgenden an Hand von Ausführungs beispielen veranschaulicht.

Beispiel 1 (1) Ausbildung kovalenter Brücken

Acrylscheiben von 6,3 mm Durchmesser werden aus einer Poly acrylsäurefolie von 152,4 µm Dicke ausgestanzt. Den Schei ben wird gleichförmig eine Aminbrücke unter Verwendung einer mit Carbodiimid katalysierten nukleophilen Substitutions reaktion aufgepropft. Die Reaktion erfolgt unter Umrühren bei Zimmertemperatur und über 2 Stunden, wobei die folgenden Anteile an Reaktanzen eingesetzt werden:

100 Scheiben
10 ml 0,1-M Natriumphosphat-Puffer von pH=6,0
0,1 g 3,3-Iminobispropylamin
0,05 g 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbo diimid-metho-p-toluolsulfonat.

Nach Waschen der Scheiben wird die auf diese Weise gebildete Aminbrücke durch Reaktion mit Succinanhydrid weiter ver längert, wobei das eine Ende derselben eine Amidbindung mit dem Amin eingeht, und das andere Ende zu einer Carboxylsäure gruppe hydrolysiert wird, an welcher Protein immobilisiert werden kann. Eine typische Reaktion erfolgt unter Umrühren bei Zimmertemperatur während 30 Minuten, wobei die folgen den Porportionen von Reaktanten verwendet werden:

100 Scheiben
10 ml destilliertes Wasser mit pH=6,0 bis 7,0 durch tropfenweise Zugabe von 10n-Natrium hydroxid
0,1 g Succinanhydrid, das während 20 Minuten lang sam zugesetzt wird.

(2) Kovalente Bindung von diagnostischem Reagenz

Nach dem Waschen werden die gepfropften Scheiben wiederum in einer mit Carbodiimid katalysierten Reaktion zur Reak tion gebracht, und zwar dieses Mal mit einem Antiserum. Zur Ausführung einer typischen Reaktion unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen werden die folgenden Proportionen an Reaktanten eingesetzt:

100 Scheiben
10 ml 0,1-M Natriumphospahtpuffer mit pH=6,0
0,05 ml Anti-human-Immunoglobulin-G-Ziegenserum
0,05 g 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbo diimid-metho-p-toluolsulfonat.

(3) Befestigung am Halter

Nach dem Waschen werden die den Antikörper enthaltenden Scheiben an der Luft bei Zimmertemperatur getrocknet. Die Anlageflächen der Halter werden mit einem Tropfen einer Acrylsäureemulsion beschichtet, und diese wird trocknen gelassen, so daß sie eine druckempfindliche Klebefläche bildet. Die Scheiben werden dann gegen die An lageflächen gelegt und durch Druck auf ihre Oberseite leicht gegen diese angedrückt, so daß sie für die nachfolgenden Versuche fest im Halter befestigt sind.

(4) Reaktion mit der Probensubstanz

Ein Halter, der eine scheibenförmige Folie enthält, wird in ein Rohr eingeführt, das 0,5 ml einer 0,01-M Natriumphosphat-Pufferlösung von pH=7,4 mit 1,0 µl mensch liches Serum enthält, und 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur langsam bewegt. Der Halter wird dann herausgenom men und mit Pufferlösung gewaschen.

(5) Reaktion mit der Bezeichnungssubstanz

Nach dem Waschen wird der Halter in ein anderes Rohr eingesetzt, das 0,5 ml einer 0,01-M Natriumphosphat-Puffer lösung von pH=7,4 und 5,0 µl einer handelsüblichen Fluo resceinisocyanatlösung enthält, die mit Ziegenimmunoglobu lin-G konjugiert ist, welches aus antihumanem Immunoglobu lin-G-Ziegenserum abgeleitet ist, und das ganze wird durch mechanisches Rühren bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang bewegt. Das Reagenz wird dann herausgenommen und mit Puffer lösung gewaschen.

(6) Messung im Fluorometer

Nach dem Waschen wird das Reagenz in den Halter ein gesetzt und das Fluoreszenzsignal bestimmt. Durch Vergleich mit in gleicher Weise erhaltenen Fluoreszenzsignalen be kannter Standardkonzentrationen wird die Probenkonzentration bestimmt. Im nachstehenden Beispiel wird durch Interpolation ein Wert von 23 µg/ml ermittelt. Unter Berücksichtigung der Verdünnung (1 : 500) enthält die ursprüngliche Probe somit 11,5 mg/ml Immunoglobulin G.

Immunoglobulin G
Fluoreszenzsignal
Konzentration in
in
Verfahrensschritt 4	Verfahrensschritt 6 @	(µg/ml)	(willkürl. Einheit)	Nullprobe	50
1,1	72
28,5	357
56,9	763
Probe	321

Beispiel 2

Dieses Beispiel dient zur Veranschaulichung der genau re produzierbaren Einstellung des Halters in bezug auf ein Fluorometer.

Scheibenförmige Folien von 152,4 µm Dicke werden an der Anlagefläche eines Halters entsprechend Beispiel 1 befestigt. Die Höhe der Folien wurde dabei an Hand unter schiedlicher Dicken der Haftschicht zwischen Folienunterseite und Anlagefläche unterschiedlich gemacht. Die Reagenzhalter wurden dann in eine Probenkammer der vorstehend beschriebenen Ausführung eingesetzt. Das optische System des Fluoro meters war dabei in der Weise eingestellt, daß sich die maximale Ansprechempfindlichkeit für einen Abstand von 76,2 µm ergab. Mit größerem Abstand nahm das Fluoreszenzsignal wie in der nachstehenden Tabelle angegeben ab.

Claims

1. Vorrichtung zur quantitativen fluorometrischen Bestimmung von Proben, insbesondere Proben biologischer Herkunft, mit einer Probenkammer, in die ein Halter für diagnostische Reagenzien einsetzbar ist, wobei die Probenkammer einen Schacht von schmalem rechteckigen Querschnitt aufweist, in dessen vorderer Begrenzungswand ein Meßfenster vorgesehen ist, und wobei der Halter eine lichtundurchlässige Tragvorrichtung für das Reagenz sowie einen langgestreckten Schaft und einen Griff aufweist, mit der er in den Meßschlitz einsenkbar ist, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Merkmale

a) der Halter (10, 46) in seinem unteren Bereich eine Abschrägung (17) in Einführrichtung des Halters sowie einen Vorsprung (18) aufweist, der mit dem unteren Bereich des Schachtes (31) in etwa formschlüssig ist,
b) der Halter (10, 46) an seinem unteren Ende eine axial zu dessen Schaft (13) ausgerichtete, als Dreh- und Stützlager geeignete Spitze (15) aufweist,
c) die Tragvorrichtung (12) des Halters (10, 46) für die Reagenzträgerfolie (16) vertieft hinter dem ringförmigen Abstandhalter (14) zurücksteht,
d) der ringförmige Abstandshalter (14) des Halters (10, 46), der um die Tragvorrichtung (12, 49) herum an geordnet ist, mittels eines Stellgliedes (34, 35) von hinten gegen die vordere Begrenzungswand (21) der Probenkammer (20), in der sich das Meßfenster (32) befindet, gepreßt werden kann,
e) die Reagenzträgerfolie (16) für ein auf der Oberfläche aufgebrachtes Reagenz licht- und flüssigkeitsundurch lässig ist und
f) das Reagenz auf der Reagenzträgerfolie (16) durch kovalente Bindung haftet.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie (16) haftend mit der Vorderseite der Tragvorrichtung (12) des Halters (10, 46) verbunden ist.

3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Stellglied (34, 35) aus einer federnd elastisch beauf schlagten Stellschraube (34) besteht.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der vorderen Begrenzungswand (21) an einer gegenüber dem Meßschlitz (31) für den Halter (10) seitlich versetzten Stelle ein Küvettenschlitz (36) mit einem Küvettenfenster (36 A) ausgebildet ist.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie (16) in Form einer Kreisscheibe ausgebildet ist.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lichtquelle und ein Empfänger zu dem Meßfenster (32) ausgerichtet angeordnet sind.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Tragvorrichtung (12) des Halters (10) bei in den Meßschlitz (31) eingeführten und gegen die vordere Begrenzungs wand (21) anliegendem Halter (10) durch das Meßfenster (32) hindurch exponiert ist.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenkammer (20) über eine Gleitführung mit einem zur Befestigung der Probenkammer (20) an einem Gerät dienenden Fußstück (26) verbunden ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gleitführung wenigstens zwei genau vorbestimmte Einrast stellen aufweist.

10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das diagnostische Reagenz aus einem Antigen oder Antikörper besteht.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen oder der Antikörper mit einer fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Substanz versetzt ist.

12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Griff (11) des Reagenzhalters (10) an dem der Trag vorrichtung (12) abgewandten Ende des Schaftes (13) befindet und sich quer zu diesem erstreckt, um der Aufnahme eines Etiketts oder dem Ergreifen des Halters (10) zu dienen.