DE3618100C2 - - Google Patents

Description

Bei herkömmlichen Immunoassayverfahren unter Verwendung von Mikrokapseln geht man so vor, daß man die Mikrokap­ seln, von denen jede entweder ein Antigen oder einen Antikörper an die Oberfläche gebunden enthält, mit einer Probe vermischt, die den zugehörigen Antikörper oder das zugehörige Antigen enthält, und ein Komplement durch die Antigen/Antikörper-Reaktion aktiviert. Das aktivierte Komplement zerstört die Membran jeder Mikrokapsel unter Freisetzung deren Inhalts, wobei die durch das freigesetz­ te Material hervorgerufene Reaktion photometrisch gemes­ sen wird. Auf diese Weise lassen sich die Konzentrationen der in der Probe enthaltenen zugehörigen Antikörper bzw. zugehörigen Antigene bestimmen.

In der US-PS 43 42 826 ist ein Immunoassayverfahren be­ schrieben, bei dem Mikrokapseln Verwendung finden, die jeweils ein Liposom mit einer Lipidmembran und außer­ dem ein Enzym enthalten und die immunspezifischen aufgebrochen werden in Gegenwart von Komplement. Bei einem Komplement handelt es sich um einen Proteinkomplex, der aus 11 Komponenten be­ steht. Handelsübliche Komplemente sind teuer, da sie aus Serum gewonnen werden. Darüber hinaus verursacht eine ungenügende Reinigung des Serums gewisse Verunreini­ gungen, die wiederum zu gewissen Qualitätsschwankungen der Komplemente führen, die für Immunoassays verwendet werden sollen. Schließlich handelt es sich bei einem Komplement um ein Protein, das nicht bei Raumtemperatur gelagert werden kann. Dies alles hat zur Folge, daß aus einem derartigen Komplement Reagentien stabiler Qualität ohne erhebliche Unterschiede zwischen den einzelnen Chargen kaum hergestellt werden können.

In der US-PS 44 83 929 ist ein Verfahren beschrieben, das die Empfindlichkeit eines Radioimmunoassays mit den Vorteilen des Spinmembran-Immunoassays kombiniert, ohne das Erfordernis der Verwendung radioaktiver Substanzen. Als lytisches Agenz wird entweder Komplement oder ein grenzflächenaktiver Stoff verwendet. Während aber bei der Verwendung von Komplement das Ausmaß der Lyse direkt proportional der Menge des in dem Analyt anwesenden Liganden ist, hängt die Einwirkung grenzflächenaktiver Stoffe auf die Lipidmembran nicht reproduzierbar vom Ausmaß der immunologischen Reaktion ab, so daß eine quantitative Bestimmung nicht in Frage kommt.

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, ein Immunoassayverfahren zur Verfügung zu stellen, das nicht auf ein Komplement instabiler Qualität angewiesen ist, und ein Immunoassayreagens mit stabiler Qualität zur Verfügung zu stellen, das längere Zeit lagerfähig ist.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Immunoassayverfah­ ren gemäß Patentanspruch 1 sowie ein Immunoassayreagens zur Durchführung dieses Verfahrens gemäß Patentan­ spruch 3.

Das Immunoassayverfahren der Erfindung besteht darin, daß man ein Material, das bei seiner Freisetzung in einer Probelösung eine optische Änderung hervorruft, Mikro­ kapseln einverleibt, die jeweils ein Anti­ gen oder einem Antikörper auf der Oberfläche tragen, diese Mikro­ kapseln und Magnesium- oder Calciumionen zusammen mit der Probelösung vermischt, die Mikrokapseln mit Fortschrei­ ten der Antigen/Antikörper-Reaktion aufbricht, und die Reaktionslösung einer photometrischen Messung unterwirft, wodurch die in der Probe enthaltenen zugehörigen Anti­ körper bzw. zugehörigen Antigene bestimmt werden können.

Die Magnesium- und Calciumionen besitzen die Fähig­ keit Membranen aufzubrechen, ähnlich derjenigen herkömm­ licher Komplemente, wobei eine Konzentration von 2 mMol oder darüber in der Reaktionslösung bevorzugt ist. Aus diesem Grund kann der Inhalt der Mikrokapseln erfindungsgemäß in Abwesenheit jeglichen Komplements freigesetzt werden.

Zum Immunoassayreagens der Erfindung gehören Mikro­ kapseln, die jeweils entweder ein Antigen oder einen Antikörper auf der Oberfläche tragen, und ein Calcium- oder Magnesiumionen freisetzendes Metallsalz.

Bei dem in den Mikrokapseln enthaltenen Material handelt es sich um einen Stoff, der von sich aus besondere opti­ sche Eigenschaften besitzt, eine Vorstufe dieses Stoffes mit besonderen optischen Eigenschaften oder um einen Stoff, der einen anderen Stoff in einen weiteren Stoff mit besonderen optischen Eigenschaften umzusetzen vermag. Bei dem Immunoassayreagens kann es sich z. B. um ein festes Gemisch aus Mikrokapseln und einem Calcium- oder Magnesiumsalz oder um eine Lösung des Salzes handeln, in der die Mikrokapseln dispergiert sind.

Es wurde gefunden, daß bei der Reaktion von Mikrokapseln, von denen jede eine Membran mit entweder einem Antigen oder einem Antikörper enthält, die an deren Oberfläche gebunden sind, mit entweder einem Antikörper oder einem Antigen in einer Probe, d. h. beim Ablauf einer immuno­ logischen Reaktion, Calcium- oder Magnesiumionen einen spe­ zifischen Effekt auf die Antigen/Antikörper-Reaktion un­ ter Aufbrechen der Mikrokapseln ausüben. Das Metallion vermag somit ein herkömmliches Komplement zu ersetzen.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikrokapseln können z. B. Schaferythrozyten oder Liposomen sein. Die Lipo­ somen besitzen vorzugsweise eine Teilchengröße von 0,2 bis 1 mm. Zur Bestimmung eines Antigens wird an die Membran jeder Mikrokapsel der zugehörigen Antikörper gebunden. Umgekehrt erfolgt zur Bestimmung eines Antikörpers die Bindung des zugehörigen Antigens an die Kapseloberfläche.

Die Herstellung der Mikrokapseln kann z. B. nach einem Verfahren erfolgen, das in "Methods in Enzymology" 74, 152-161 (1981) beschrieben ist. Hierzu werden Sphinogomyelin, Cholesterin, Dicetylphosphat und Thyroxin (T4) in Methanol gelöst. Das Lösemittel der erhaltenen Lösung wird im Vakuum auf einer Glasplatte verdampft, wobei auf dieser eine trockene Lipidmembran entsteht. Dann wird die mit Thyroxin - einem Antigen - markierte Membran durch Rühren in einem Mixer mit einer Lösung vermischt, die ein in bestimmter Konzentration einzu­ verbleibendes Material enthält. Auf diese Weise wird das Lipid emulgiert und das Material jedem Teilchen einver­ leibt. Die Lipidmembran bildet dann ein Teilchen mit einer hydrophilen äußeren Oberfläche. Die so erhaltenen Liposomteilchen werden durch Waschen gereinigt.

Die so erhaltenen Mikrokapseln können getrocknet und als Immunoassayreagens in Form von Granulat oder Tabletten gelagert werden. Alternativ kann man zur Herstellung eines Immunoassayreagens die Liposomen auch in einer Pufferlösung mit entsprechend eingestelltem pH-Wert suspendieren, wobei eine lagerfähige Suspension erhalten wird.

Die Erfindung eignet sich zum Nachweis zahlreicher Anti­ gen/Antikörper-Reaktionen. Typische Beispiele für Antigene sind T4, T3, Globulin und IgG. Durch die Anti­ gen/Antikörper-Reaktion kommt es auf der Oberfläche jeder Mikrokapsel zur Bildung eines Antigen/Antikörper-Kom­ plexes. Mit fortschreitender immunologischer Reaktion bewirken die Magnesium- oder Calciumionen ein Aufbrechen der Membran jeder Mikrokapsel unter Freisetzung des hier­ in enthaltenen Materials. Die erhaltene Reaktionslösung, die auch noch nicht reagierte Mikrokapseln enthält, wird einer photometrischen Auswertung zur Bestimmung der in der Probe enthaltenen Antigene bzw. Antikörper unterwor­ fen.

Die photometrische Auswertung kann z. B. mittels Absorp­ tions-, Fluoreszenz- oder Emissionsspektrophotometrie erfolgen. Es sind zahlreiche Möglichkeiten gegeben. Es ist z. B. ein Reagens möglich, das eine Vorstufe eines Materials mit besonderen optischen Eigenschaften außer­ halb der Mikrokapseln enthält, während ein anderes Ma­ terial, das die Vorstufe in das Material mit besonderen optischen Eigenschaften über verschiedene Reaktionsstu­ fen umzuwandeln vermag, den Mikrokapseln einverleibt wird. Es ist auch ein Reagens möglich, das ein Apoenzym innerhalb der Mikrokapseln und ein Coenzym außerhalb der Mikrokapseln enthält. Weiterhin lassen sich Mikrokapseln verwenden, die ein Enzym, ein fluoreszierendes Material, ein Coenzym oder einen Chelatbildner mit einer enzyma­ tischen Aktivität per se enthalten.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen beschrieben. Es zeigt

Fig. 1 das Ergebnis eines Experiments, das zum Nachweis der Auswirkung von Magnesiumionen auf das Auf­ brechen von Mikrokapseln durchgeführt wurde,

Fig. 2 eine Eichkurve des in Beispiel 1 verwendeten Antigens T4,

Fig. 3 eine Eichkurve des in Beispiel 2 verwendeten Anti-T4-Antikörpers,

Fig. 4 eine Eichkurve des in Beispiel 3 verwendeten Anti-T4-Antikörpers, und

Fig. 5 eine Eichkurve des in Beispiel 4 verwendeten Anti-T4-Antikörpers.

Anhand von Fig. 1 wird nun der Einfluß des Magnesiumions auf die Lyse von Mikrokapseln beschrie­ ben. Als Mikrokapseln dienen Schaferythrozyten, denen Eosin als fluoreszierender Stoff einverbleibt wird. Die Oberfläche der Mikrokapsel wird zuvor in üblicher Weise mit Anti-T4-Antikörper überzogen. Magnesiumchlorid dient als Magnesiumionen lieferndes Salz. Fig. 1 zeigt die Abhängigkeit der aufgebrochenen (lysierten) Mikrokapseln von der Konzentration des Magnesiumions. Die T4-Kon­ zentration bei diesem Versuch beträgt 20 µg/dl, wobei eine 50 mM KH₂PO₄-Pufferlösung (pH 7,4) als Ver­ dünnungsmittel dient. Die Fluoreszenzintensität wird 20 min nach Einleitung der Reaktion bestimmt.

Fig. 1 zeigt, daß die Mikrokapseln bei einer Magnesium­ ionenkonzentration in der Reaktionsflüssigkeit von 3 mMol oder darüber lysiert werden, und daß eine Magne­ siumkonzentration von 2 mMol oder darüber einen merkli­ chen Einfluß auf die Lyse der Mikrokapseln ausübt. Die Mikrokapseln zeigen eine signifikante Lyse selbst bei einer Magnesiumkonzentration von 20 mM oder darüber im Reaktionsmilieu. Calciumionen zeigen eine ähnliche Ten­ denz wie Magnesiumionen.

Beispiel 1

An die Oberfläche jeder Mikrokapsel, der fluoreszierendes Eosin einverleibt worden ist, wird Antithyroxin-Antikör­ per gebunden. Nachdem eine Magnesiumchloridlösung mit einer Endkonzentration von 500 mMol hergestellt worden ist, werden die so prägnierten Mikrokapseln in dieser Lösung unter Erhalt einer Immunoassay-Reagenslösung dispergiert.

10 µl einer Probe, die Thyroxin (T4) enthält, werden in eine Reaktionsküvette eines automatischen Klinik-Analyse­ gerätes eingebracht. Nachdem die Küvette in die Reagens- Abgabestellung transportiert worden ist, werden 20 µl des vorgenannten Reagens, gefolgt von 970 µl einer 50 mM KH₂PO₄-Pufferlösung (pH 7,4) zugesetzt. Eine ganze Reihe Küvetten wird dann während des Transports 20 min be­ brütet. Nach Erreichen eines Fluoreszenzbereiches jeder Küvette erfolgt Bestrahlung mit einer Anregungsstrahlung von 522 nm, worauf die Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 560 nm gemessen wird. Die Verarbeitung der Meßergebnisse erfolgt in einer Prozessoreinheit des automatischen Klinik-Analysegerätes auf der Grundlage der Eichkurve von T4, wie in Fig. 2 dargestellt, worauf Ausdruck der Konzentration an T4 in der Probe erfolgt.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird 2,5-Brom-2-pyridylazo-5-N-propyl- N-sulfopropylaminoanilin (nachfolgend als 5-Br-PAPS be­ zeichnet) Mikrokapseln einverleibt. Dieser Chelatbildner wird auf eine Konzentration von 10 mMol/l eingestellt. Ein Lipid wird in dieser Lösung dispergiert unter Bil­ dung einer Anzahl von Liposomen, die jeweils den Chelat­ bildner in sich enthalten. Nach Isolierung der Liposomen erfolgt Waschen der äußeren Oberflächen. Hierauf wird an die Oberfläche jedes Liposoms Thyroxin (T4)- Antigen gebunden.

1 ml der so präparierten Liposomen werden in einer NaCl-Lösung (0,15 Mol/l) dispergiert. Dann wird der erhaltenen Lösung MgCl₂ bis zum Erreichen einer Konzentration von 3 mMol/l in der immunologischen Reaktion zugesetzt. Nachdem man ZnCl₂, zur Umsetzung mit dem Chelatbildner, bis zu einer Konzentration von 0,1 mMol/l in der immunologischen Reaktion zugesetzt hat, wird bis zum Erreichen eines Gesamtvolumens von 100 ml aufgefüllt. Die so erhaltene Immunoassayreagenslösung wird in einem Behälter aufbewahrt.

Die Probegefäße eines automatischen Klinik-Analysengerä­ tes werden mit Serumproben beschickt. Eine Serie Reak­ tionsbehälter des Analysengerätes wird bei 37°C ge­ halten und intermittierend geladen. Entlang des Ladeweges befinden sich ein Proben-Pipetttiersystem, ein Reagens- Zugabesystem, ein Multiwellenlängenphotometer und ein Waschsystem.

5 µl des Serums in jedem Probengefäß werden jedem Reak­ tionsbehälter mittels des Proben-Pipettiersystems zuge­ gegeben. Hierauf erfolgt Zugabe von 800 µl der Immuno­ assay-Reagenslösung, wie vorstehend beschrieben, zu dem Reaktionsbehälter bei der Reagens-Zugabeposition. Dann wird eine Serie Reaktionsbehälter unter Bebrütung gela­ den. Nach 30 min erreicht jeder die Reaktionsflüssigkeit enthaltende Reaktionsbehälter den photometrischen Meß­ bereich, in dem die Reaktionsflüssigkeit mit weißem Licht bestrahlt wird, worauf das Licht mit einer Wellenlänge von 552 nm im durchgehenden Licht zur Bestimmung der Ab­ sorption gemessen wird. Der erhaltene Absorptionswert wird mit der Eichkurve von Fig. 3 in einer Prozessorein­ heit verglichen, worauf Ausdruck der Konzentration an in der Serumprobe enthaltenen Anti-T4-Antikörper erfolgt. Die in Fig. 3 gezeigte Eichkurve wird durch Herstellung einer Standardprobe erhalten, wobei Anti-T4-Antikörper in bestimmter Konzentration antikörperfreiem Serum zugesetzt und diese Standardprobe mit der obengenannten Reagens­ lösung umgesetzt wird.

Beispiel 3

Zunächst erfolgt die Herstellung einer Glukoselösung mit einer Konzentration von 50 mMol/l. Dann werden Mikro­ kapseln, die die vorgenannte Lösung einverleibt enthal­ ten, in gleicher Weise, wie vorstehend für Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Hierbei erhält man mit T4 präparier­ te Liposomen. Nachdem man 1 ml dieser Liposomen einer 0,15 Mol/l enthaltenden isotonischen Kochsalzlösung zu­ gesetzt hat, erfolgt Zugabe von Glukoseoxidase und -per­ oxidase, jeweils in einer Konzentration von 1 mg/l. Nach Zugabe von Calciumionen zu der Lösung bis zu einer Kon­ zentration von 3 mMol/l im immunologischen Reaktions­ milieu, wird bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml auf­ gefüllt. Die so erhaltene Lösung wird als Reagens 1 be­ zeichnet.

Phenol und 4-Aminoantipyrin werden getrennt einer Phosphatpufferlösung in Konzentrationen von 1 mMol/l bzw. 0,1 mMol/l zugesetzt. Die erhaltene Lösung wird als Reagens 2 bezeichnet.

Nachdem man 100 ml Reagens 1 mit 10 µl Serum vermischt hat, läßt man das Gemisch bei 30°C 10 min reagieren. Unmittelbar nach Zugabe von 500 µl Reagens 2 wird die Absorption des Gemisches bei 547 nm bestimmt, die als Blindwert bezeichnet wird. Nachdem man das Gemisch bei 30°C 20 min reagieren gelassen hat, wird erneut die Absorption bei 547 nm unter Erhalt eines Reaktionswertes bestimmt. Die Konzentration des Anti-T4-Antikörpers im Serum wird durch Subtraktion des Blindwertes vom Reaktionswert berechnet.

Fig. 4 zeigt eine Eichkurve, die durch Zugabe der Rea­ gentien 1 und 2, eines Anti-T4-Antikörper-freien Serums und des Anti-T4-Antikörper in bestimmter Konzentration enthaltenden Serums erhalten wurde.

Beispiel 4

Es wird eine 1 mMol/l Biotin - ein Coemzym - enthaltende Lösung hergestellt. Diese Lösung wird Mikrokapseln, in gleicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, einverleibt. 1 ml der Mikrokapseln, die jeweils mit T4-Antigen präpa­ riert sind, werden in einer isotonischen Kochsalzlösung dispergiert. Hierauf erfolgt Zugabe von HCO₃ ^-, ATP und Propionyl-CoA-carboxylase - ein Apoenzym - in Konzentra­ tionen von 2 mMol/l, 80 nMol/l bzw. 1 mg/l. Nach Zugabe von MgCl₂ wird bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml auf­ gefüllt. Die Zugabe von MgCl₂ erfolgt bis zu einer Kon­ zentration von 3 mMol/l im immunologischen Reaktions­ milieu. Die so erhaltene Lösung wird als Reagens 1 be­ zeichnet.

Eine Lösung zur Bestimmung von anorganischem Phosphor, die Molybdänsäure und p-Methylaminophenolsulfat enthält, wird als Reagens 2 bezeichnet.

100 µl Reagens 1 werden mit 10 µl einer Serumprobe in einer Reaktionsküvette vermischt, die 5 min bei 30°C bebrütet wird. Unmittelbar nach Zugabe von 500 µl Reagens 2 wird die Absorption der Reaktionsflüssigkeit bei 700 nm bestimmt, wobei man einen Blindwert erhält. Nach­ dem man die Reaktionsflüssigkeit 5 min bei 30°C reagie­ ren gelasssen hat, wird die Absorption erneut bei 700 nm bestimmt. Der Reaktionswert wird durch Subtraktion des Blindwertes vom gemessenen Wert berechnet. Die Konzen­ tration an Anti-T4-Antikörper im Serum wird durch Ver­ gleich des Reaktionswertes mit der Eichkurve bestimmt.

Fig. 5 zeigt eine Eichkurve, die durch Auftragung der Ab­ sorptionen, gemessen nach Zugabe der Reagentien 1 und 2 zu Standardproben, erhalten wurde. Die Standardproben wurden hergestellt durch Zugabe von Anti-T4-Antikörper in be­ stimmten Konzentrationen zu Anti-T4-Antikörper-freiem Serum unter Auslösung einer immunologischen Reaktion.

Claims (4)

1. Immunoassayverfahren unter Verwendung von Mikrokapseln, die jeweils ein Antigen oder einen Antikörper auf der Oberfläche tragen und ein Material enthalten, das bei seiner Freisetzung in einer Reaktionsflüssigkeit eine optische Veränderung zu erzeugen vermag, wobei eine den zugehörigen Antikörper bzw. das zugehörige Antigen enthaltende Probenlösung mit den Mikrokapseln unter Auslösung einer immunologischen Reaktion in Berührung gebracht wird und der Nachweis des Antikörpers bzw. Antigens in der Probe durch photometrische Analyse der Reaktionslösung erfolgt, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die immunologische Reaktion in Gegenwart von Magnesium- oder Calciumionen und in Abwesenheit eines Komplements durchführt.

2. Immunoassayverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man das Magnesium- oder Calciumion in der Reaktionsflüssigkeit in einer Konzentration von 2 mM oder darüber verwendet.

3. Immunoassayreagens mit Mikrokapseln, die jeweils ein Antigen oder einen Antikörper auf der Oberfläche tragen und ein Material enthalten, das bei seiner Freisetzung in einer Reaktionslösung eine optische Veränderung herbeizuführen vermag, gekennzeichnet durch den Gehalt an einem Magnesium- oder Calciumionen freisetzenden Metallsalz.

4. Immunoassayreagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich­ net, daß es in Form eines festen Gemisches oder einer Lösung vorliegt.