DE2824742C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Festphasen-Matrix zum Einsatz in ein Reaktionsgefäß oder in Form eines einseitig geschlossenen zylindrischen Rohres zur Bestimmung oder zum Nachweis einer mobilen Komponente in einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe, welche gleichmäßig mit einer Zusammensetzung überzogen ist, an der die zu bestimmende mobile Komponente, falls vorhanden, haften wird.

In den letzten Jahren sind zahlreiche Techniken auf dem Gebiet der Laboratoriumsdiagnostik angewandt worden, um die Durch­ führung bestehender Methoden zu vereinfachen und um neue Methoden mit verbesserter Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Genauigkeit zu schaffen. Insbesondere waren Festphasen-Reaktionen besonders wertvoll, um die Handhabung bisheriger Methoden zu vereinfachen und Methoden möglich zu machen, die mit üblichen Homogenphasen- Reaktionen nicht durchgeführt werden konnten.

Die Festphasen-Reaktion wird im allgemeinen zwischen einem Reaktionsteilnehmer, der stationären Komponente, der auf der Oberfläche einer unlöslichen Trägermatrix immobilisiert ist, und einem zweiten Reaktionsteilnehmer, der mobilen Komponente, in Lösung durchgeführt. Die Reaktion findet statt, wenn ein Molekül oder eine molekulare Anordnung des mobilen Reaktionsteilneh­ mers im Verlaufe der Diffusion mit einem Molekül des stationären auf der Oberfläche der festen Trägermatrix immobilisierten Reaktionsteilnehmers kollidiert. Die Reaktion kann eine übliche chemische Reaktion, eine Bindung der mobilen Komponente durch die stationäre Komponente wie in einer immunchemischen Reaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper oder sie kann eine Bindung der mobilen Komponente durch die stationäre Komponente sein, begleitet durch chemische Transformierung der einen der Komponenten, wie es in einer enzymkatalysierten Reaktion statt­ findet. Quantitative Ergebnisse werden erzielt, indem man die Bildung der Produkte oder das Verschwinden der Reaktionsteil­ nehmer mißt, wie im Falle von üblichen und enzymkatalysierten Reaktionen, und indem man die Menge der gebundenen mobilen Komponente oder die Menge der ungebundenen mobilen Komponente im Fall einer immunchemischen Reaktion mißt.

Jede übliche chemische Reaktion oder enzymkatalysierte Reaktion, die in einer direkt oder indirekt meßbaren Veränderung resultiert, kann im Prinzip durch Festphasen-Techniken durchgeführt werden. Zu den direkt meßbaren Veränderungen gehören Änderung des pH-Wertes, der Lichtabsorption im sichtbaren und Ultraviolett­ bereich oder der Fluoreszenzintensität. Indirekte Messungen können durchgeführt werden, wenn die primären Reaktionsteilnehmer oder Produkte selbst nicht ohne weiteres meßbar sind, indem man die Wirkung eines Reagens zwischenschaltet, um weitere Reaktions­ stufen durchzuführen, die in einer meßbaren Veränderung resultiert und indem man spezifische Trenntechniken einfügt. Derartige Strategien können alleine oder in Kombination, wie es in der Technik üblich ist, angewandt werden.

Wo die Reaktion alleine in der Bindung ohne chemische Veränderung besteht, können Techniken, die auf dem Gebiet der Immunchemie entwickelt wurden, angewandt werden, um das Ausmaß der Reaktion zu messen. Festphasen-Reaktionen eignen sich besonders für immunchemische Bestimmungen, weil die Reaktionsteilnehmer in gebundener Form leicht von der Lösung entfernt werden können auf Grund ihrer Bindung an die feste Phase. Häufig lassen sich jedoch gebundene Verbindungen in einer immunchemischen Reaktion nicht direkt messen wegen ihrer Nichtunterscheidbarkeit durch chemische Methoden von anderen Substanzen, die üblicherweise im gleichen Reaktionsgemisch vorliegen, so daß das einfache Ver­ schwinden einer reaktiven Komponente von der Lösung oder dessen Ansammlung in der festen Phase nicht direkt gemessen werden kann. Deshalb müssen zusätzliche Schritte unternommen werden, um eine meßbare Veränderung bezüglich des Ausmaßes an Bindung zu er­ zielen.

Die Vielzahl an Schritten, die durch bisherige Fachleute unter­ nommen wurden, lassen sich in zwei generelle Kategorien unter­ teilen. In der ersten Kategorie, die als konkurrierende oder indirekte immunologische Bestimmung bezeichnet wird, liegt die immobilisierte Komponente in einer gesteuerten Menge vor und die mobile Komponente in einer unbekannten Menge. Der unbekannten Menge der mobilen Komponente wird eine bekannte Menge der gleichen Komponente zugesetzt, die durch Zugabe eines meßbaren Substituenten markiert worden war, dessen immunchemische reaktive Eigen­ schaften nicht stören. Die Markierung kann aus einem Radioisotop, einem Chromophor, einem Fluorophor oder einem Enzym bestehen. Die Menge an markiertem Material, das immunchemisch an die feste Phase gebunden ist, hängt von der Menge der nicht markierten Komponente in der Lösung ab, die um die gleichen Bindungsstellen konkurriert. Je weniger unbekannter Stoff vorliegt, desto weniger wird die Menge an gebundener markierter Komponente sein.

In der zweiten generellen Methode, die als Sandwich-Methode oder direkte Methode bezeichnet wird, wird die feste Phase, die eine Menge an immunchemisch gebundener mobiler Komponente aus der ersten immunchemischen Reaktion enthält, der Wirkung eines Reagens unterworfen, das ebenfalls immunchemisch an die feste Phase gebunden werden kann, jedoch nur an Stellen, die bereits durch die immunchemisch gebundene mobile Komponente besetzt sind. Das Reagenz kann markiert sein, beispielsweise wie in der ersten Methode mit einem Radioisotop, einem Fluorophor, einem Chromophor oder einem Enzym. Die Menge an gebundenem markiertem Reagens ist ein direktes Maß der Menge an mobiler gebundener Komponente, die ihrerseits ein Maß für die Menge an mobiler Komponente, die ursprünglich im Reaktionsgemisch vorhanden war, ist.

In den Fällen, in denen die Markierung ein Radioisotop ist, bezeichnet man die Technik, entweder die konkurrierende oder die nicht konkurrierende, als radioimmunologische Bestimmung. Wenn die Markierung ein Enzym ist, bezeichnet man die Bestimmung als enzymgebundene immunologische Bestimmung. Die Menge an enzymmarkiertem Reagens wird durch irgendeine bequeme Methode zum Messen der Aktivität des bei der Markierung verwendeten Enzyms gemessen. Andere Arten von Festphasen-Reaktionen des vor­ stehend beschriebenen allgemeinen Typs werden durch Beispiele erläutert. Die immunradiometrische Bestimmung zur quantitativen Bestimmung eines Antigens wird durchgeführt, indem man zuerst einen bekannten Überschuß eines markierten Antikörpers mit der unbekannten Menge eines Antigens in einer Homogenphasen-Reaktion umsetzt. Anschließend wird immobilisiertes Antigen in überschüssiger Menge zugesetzt, um den nichtumgesetzten löslichen markierten Antikörper zu binden. Die Menge an unbekanntem Antigen wird da­ durch bestimmt, daß man den Unterschied zwischen den gesamten markierten Antikörpern und der an die Festphase gebundenen Menge bestimmt. Die Methode gibt direkte quantitative Ergebnisse nur mit einem einwertigen Antigen, d. h. einem Antigen, das nur ein Molekül Antikörper binden kann.

Enzymkatalysierte Reaktionen werden zweckmäßigerweise in Fest­ phasen-Systemen durchgeführt. Ein an einer Festphasen-Matrix immobilisiertes Enzym kann dazu verwendet werden, um das Substrat für das Enzym in einer Probe eines biologischen Materials quantitativ zu bestimmen oder dessen Gegenwart qualitativ fest­ zustellen. Beispielsweise kann Milchsäure in Serum durch Ver­ wendung einer Matrix gemessen werden, die mit Milchsäure-dehydro­ genase überzogen ist. Gleicherweise kann Harnstoff bestimmt werden unter Verwendung einer festen Zwischenphase, die immobilisierte Urease trägt. Außer für klinische Anwendungen können Enzymbe­ stimmungen zur Überwachung der Qualität bei industriellen Ver­ fahrensstufen und außerdem zur Durchführung von Verfahrensstufen angewandt werden. Als ein Beispiel für das erstgenannte könnte immobilisierte Penicillinase bei der Überwachung von Penicillin, das während des Herstellungsverfahrens dieses Arzneimittels hergestellt wird, verwendet werden. Als ein Beispiel für das letztere könnte immobilisierte Protease oder Nuclease brauchbar zur Entfernung oder Inaktivierung von verunreinigenden Proteinen oder Nucleinsäuren sein.

Die Gegenwart eines Enzyms von klinischer Bedeutung in einer Probe eines biologischen Materials kann außerdem dadurch bestimmt werden, daß man ein Substrat für das auf der Festphasen-Matrix immobilisierte Enzym schafft. Ein Beispiel einer Bestimmung, die für die Verwendung auf diese Weise angepaßt werden könnte, ist die in der DE-OS 27 47 853 beschriebene Methode. Eine Lysozym­ bestimmung, worin radioaktiv markierter Micrococcus lyso­ deikticus covalent an die Oberfläche einer Festphasen-Matrix ge­ bunden ist, veranschaulicht weiter die Verwendung eines immo­ bilisierten Substrats in einer Enzym-Bestimmungsreaktion.

Weitere Beispiele für brauchbare Festphasen-Reaktionen stellen die spezifischen Bindungsreaktionen gewisser Proteine dar. Zu diesen gehören beispielsweise β-Lactoglobulin, das Folsäure spezifisch bindet, spezifische Rezeptorproteine, die Hormone zu binden vermögen, wie die Rezeptorsubstanz, die aus Ratten­ brust-Tumorzellen rein gewonnen wird, die spezifisch Prolactin binden und die Vielzahl der Pflanzenproteine wie Concanavalin A, das gewisse Kohlehydrate spezifisch zu binden vermag.

Übliche chemische Reagentien können für die Verwendung in Fest­ phasen-Reaktionen geeignet sein. Festphasen-Reagentien, die in der Lage sind, gefärbte Komplexe zu bilden wie durch Bildung von Glycosylderivaten oder durch Diazo-Kupplung an das auf der Oberfläche einer Festphasen-Matrix immobilisierte Reagens, können für die Bestimmung entweder allein oder in Kombination mit einer enzymkatalysierten Reaktion geeignet sein, um eine Farbänderung auf der Oberfläche der Matrix zu erzeugen. Außer­ dem können Ionenaustauschreaktionen zweckmäßigerweise durchge­ führt werden unter Verwendung einer Fest­ phasen-Matrix. Außer den vorstehend genannten gibt es noch viele weitere Möglichkeiten der Anwendung.

In einer solchen Festphasen-Technologie ist das in dem Verfahren verwendete Reagens oder die Reagentien gewöhnlich dadurch immo­ bilisiert, daß sie überzogen oder gebunden sind, entweder co­ valent oder durch Adsorption an das Festphasen-Material, das dann in die zu testende Probe eingetaucht wird. Die Art der Kupplung solcher Reagentien an das Festphasen-Material ist be­ kannt, vgl. beispielsweise US-PS 36 52 761, 38 79 262 und 38 96 217.

Beispiele von üblicherweise verwendeten Festphasen-Materialien sind Glas- oder Polymerröhrchen, die mit dem Reagens oder den Reagentien an der inneren Oberfläche überzogen sind, polymere überzogene Stäbchen, Mikro- und Makrokügelchen, die aus Poly­ meren und Glas- und poröser Matrices hergestellt wurden.

Immunchemische Bestimmungen sind höchst wertvoll bei klinischer Forschung und Diagnose. Sie sind hoch spezifisch auf Grund der hoch selektiven Natur von Antigen-Antikörper-Reaktionen. Die Antigen-Antikörper-Bindung ist sehr eng, so daß, wenn die Bin­ dungsreaktion einmal Gelegenheit hatte zu erfolgen, die Grenze der Bestimmbarkeit durch die Meßbarkeit bestimmt wird, mit der die Markierung bestimmt werden kann. Immunchemische Bestimmungen sind außergewöhnlich vielseitig auf Grund der Tatsache, daß sie zur selektiven Messung von spezifischen Substanzen gegen einen Hintergrund von chemisch ähnlichen Substanzen verwendet werden können. Wegen dieser wünschenswerten Attribute besteht ein beachtliches Interesse, die Einfachheit der Handhabung, die Empfindlichkeit, die Genauigkeit, die Geschwindigkeit und die Anwendbarkeit von immunchemischen Bestimmungen zu verbessern.

Zu den Vorteilen der Festphasen-Systeme gehört, daß das Reaktionsprodukt oder die Produkte von der Reaktionslösung relativ leicht abgetrennt werden kann, d. h. durch physikalische Entfernung des Festphasen-Materials. Dies steht im Gegensatz zu einer Nicht­ festphasen- oder homogenen Reaktion, die typischerweise in einer homogenen Lösung resultiert, welche komplexere Trenntechniken erfordert.

Die Einführung der Festphasen-Technologie hat den Einsatz neuer Verfahren gestattet, die vorher bei der Anwendung der freien Lösungs-Technologie außergewöhnlich schwierig waren. Ein Beispiel dafür ist die Sandwich-Bestimmungstechnik, die vorstehend be­ schrieben wurde. Um in homogener Lösung durchgeführt zu werden, würde die Sandwich-Technik einen großen Überschuß einer der Reaktionsteilnehmer erfordern. Was noch wichtiger ist, die Ab­ trennung des ersten Antigen-Antikörper-Komplexes von einer Homogenphasen-Lösung erfordert die Anwendung von ausgefallenen physikalisch-chemischen Techniken, insbesondere wenn das Antigen im Vergleich zum Antikörper relativ klein ist und Molekularge­ wichtsunterschiede zwischen freiem Antikörper und komplexem Anti­ körper gering sind. Im Gegensatz dazu ist das Trennverfahren in einem Festphasen-System äußerst einfach. Wie nachstehend be­ schrieben wird, wird einer der Hauptvorteile der Festphasen- Technologie, nämlich die Leichtigkeit der Trennung von fester und flüssiger Phase, bei der Durchführung der Erfindung maximiert, wobei extrem einfache Maßnahmen zum Trennen der Phasen geschaffen werden.

Während theoretisch die Festphasen-Technologie zahlreiche Vorteile gegenüber den freien Lösungs- oder homogenen Systemen bietet, besitzt es gewisse Grenzen auf Grund der bisher verwendeten Festphasen-Konfigurationen. Beispielsweise ist mindestens eines der Reagentien in einem Festphasen-System wirksam immobilisiert, indem es an die Oberfläche gebunden ist, während die Reaktions­ geschwindigkeit von Festphasen-Systemen im allgemeinen langsamer ist als die von homogenen oder freien Lösungs-Systemen. Außerdem kann normalerweise eine maximale Menge an Reagens an die Fest­ phasen-Oberfläche gebunden werden, wobei diese maximale Menge generell von der Oberfläche, der Reinheit des Reagens und dem spezifischen Verfahren, das zur Bindung des Reagens an die Ober­ fläche angewandt wird, abhängig ist. Optimalerweise sollte so­ viel wie möglich von der Oberfläche des festen Materials überzogen sein, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen und die Reaktionszeit herabzusetzen.

Die frühesten Festphasen-Systeme waren Teströhrchen, die auf der Innenseite der Oberfläche überzogen waren. Zu den handelsüblichen Beispielen der Technologie der überzogenen Röhrchen gehören das Immunotub-System, vertrieben durch Smith Kline Instruments von Sunnyvale, California, und das Rianen-System von New England Nuclear, North Billerica, Massachusetts, die in der US-PS 38 67 517 und die in Angew. Chem., 88, Jahrg. 1976, Nr. 17, S. 565- 573 beschriebenen Rohre. Obgleich überzogene Rohrsysteme sich für immunologische Bestimmungszwecke als geeignet erwiesen, besitzen sie nicht den vollen Bereich von potentiellen Vorteilen, die durch Festphasensysteme geboten werden. Ein prinzipieller Nachteil besteht darin, daß das Oberflächen zu Volumen-Verhältnis relativ klein ist und Reaktionskinetiken weiterhin durch die Tatsache behindert werden, daß die reaktive Oberfläche an der Grenze des Lösungsvolumens sitzt, das relativ weit entfernt vom Hauptkörper der Lösung sein kann. Somit ist der Durchschnitts­ abstand zwischen mobilen Reaktionsteilnehmern und der reaktiven Oberfläche groß. Außerdem muß jedes Testrohr getrennt unter statischen Bedingungen überzogen sein, woraus Unterschiede in der Menge an aufgebrachtem Überzugsmaterial von Rohr zu Rohr und schließlich in den Bestimmungsergebnissen vorliegen können. Der so hergestellte Überzug kann ungleichmäßig oder sogar dis­ kontinuierlich sein, so daß einige Bereiche der potentiell reaktiven Oberfläche keinen Überzug aufweisen, während andere für eine optimale Reaktivität zu stark überzogen sein können. In jedem Falle ist die Menge an Oberfläche, die tatsächlich für die Reaktion mit der mobilen Komponente verfügbar ist, verringert, und zwar auf eine nicht gleichmäßige Weise, wodurch Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit verloren geht. Die absatzweise Methode des Überziehens der Rohre ist außerdem relativ teuer. Reaktionen, die in überzogenen Rohren durchgeführt werden, unterliegen Fehlern, die durch Konvektion in der Reaktionsflüssigkeit ver­ ursacht werden. Ergebnisse, die um das 10fache schwanken, können durch Konvektion in diesen Systemen verursacht werden.

Versuche, die Eigenschaften von überzogenen Rohren zu verbessern, haben zu einer Vielzahl von Systemen geführt, die dazu ge­ schaffen wurden, um das Oberflächen zu Volumen-Verhältnis des Festphasen-Systems zu erhöhen. Zu diesen Methoden gehören die Schaffung von hochspiralförmigen Oberflächen, wodurch das Volumen der erforderlichen Flüssigkeit reduziert wird, und die Schaffung von Oberflächen aus feinteiligem Material.

Das SPAC-System der Mallinkrodt Chemical Company ist grundsätzlich ein überzogenes Rohr-System, das die Strategie der Schaffung einer spiralförmigen Oberfläche veranschaulicht, um den Ober­ flächenbereich im überzogenen Rohr zu erhöhen. Außerdem sind die Rohre mit einem abnehmbaren niederen Abschnitt ausgestattet, der absatzweise überzogen werden kann, um von Rohr zu Rohr größere Gleichmäßigkeit zu erzielen.

Eine Folge der absatzweisen Immobilisierung auf überzogenen Röhrchenböden besteht darin, daß sowohl die Außenseite als auch die Innenseite der Röhrchen überzogen werden. Dies erschwert dem Labortechniker, mit den Röhrchen zu arbeiten, ohne mit dem an seiner Oberfläche überzogenen Material in Berührung zu kommen, wobei wertvolle immunologische Reaktionsteilnehmer verloren gehen. Die spiralförmige Oberfläche kann die Menge an verfügbarer reaktiver Oberfläche drei- bis viermal vergrößern. Jedoch bleibt die reaktive Oberfläche an der Peripherie der Lösung. Dies kann eine suboptimale Geometrie sein vom Standpunkt des Durchschnittsdiffusionsabstandes von der Lösung zur reaktiven Oberfläche. Auf Grund der Komplexizität der Oberfläche können Schwierigkeiten beim Freiwaschen der Oberfläche von verunreinigenden Substanzen auftreten. Wie die überzogenen Röhrchensysteme im allgemeinen kann das SPAC-System ziemlich empfindlich gegenüber Konvektionsströmen sein, was große Fehler zur Folge hat, wie vorstehend beschrieben. Konvektion kann vermindert werden, wenn man die Reaktion in einem konstanten Temperaturbad durchführt. Jedoch fordert dieses Verfahren zusätzliche Vorrichtungen für das klinische Laboratorium. Zum Messen von Haptenantigenen ist das System außerdem nicht optimal, wenn die Reaktion gemäß den Empfehlungen des Herstellers bei 37°C durchge­ führt wird. Es erwies sich, daß die Erhöhung der Temperatur gewisser Antikörper-Hapten-Reaktionen die Dissoziationsgeschwin­ digkeit des Antikörper-Hapten-Komplexes, bezogen auf seine Bildungsgeschwindigkeit, erhöhen kann, vgl. Smith, T. W. und Skubitz, K. M., Biochemistry 14, 1496 (1975) und Keave, P. M., Walker, W. H. C., Gauldie, J. and Abraham, G. E., Clin. Chem. 22, 70 (1976).

Es wurden verschiedene Typen von Festphasen-Matrices beschrieben, die sich zur Einführung in die Reaktionsflüssigkeit eignen.

Ein Beispiel einer spiralförmigen oder schwammartigen Matrix, die sich dafür eignet, in die Testlösung eingeführt zu werden, ist die in der US-PS 39 51 748 beschriebene. Dieses Material bietet relativ große Oberflächen, jedoch kann es schwierig sein, dasselbe sorgfältig zu waschen oder abtropfen zu lassen bei Beendigung der Reaktion. Außerdem können derartige Systeme in der Praxis auf die Verwendung von Reaktionsteilnehmern und Reagentien be­ schränkt sein, die leicht von der schwammartigen Matrix zu elu­ ieren sind. Was noch bedeutender ist, die schwammartigen Matrices können extensiv mit nur einem Teil der Reaktionsflüssigkeit reagieren, d. h. dem Teil, der tatsächlich die Poren der Matrix durchdringt.

Ein zweiter Typ eines Einsatzes, der sich die Strategie zunutze­ macht, die Reaktionsflüssigkeit zu zwingen, sich in einer Dünn­ schicht über der überzogenen Matrixoberfläche auszubreiten, wird in der US-PS 38 26 619 (DE-OS 22 62 479) und 34 64 798 beschrieben. Beide Fälle beschreiben eine Kombination aus einem Behälter und einer festsitzenden Einsatzmatrix, die so geformt ist, daß die Reaktionsflüssigkeit in eine Dünn­ schicht zwischen den Behälterwänden und der Matrix­ oberfläche zusammengequetscht wird. Die Einsatz­ matrix muß im Behälter mit einer festen Toleranz sitzen, und das Volumen der Reaktionsflüssigkeit muß sorgfältig kontrolliert werden, da Abweichungen die Reproduzierbarkeit der Bestimmung nachteilig beeinträchtigen können. Die Apparatur der US-PS 38 26 619 eignet sich für die Verwendung in einem direkten immunchemischen Test, der nur quanlitativ ist. Da die Reaktions­ lösung zu einem Dünnfilm durch den Einsatz gedrückt wird, muß das Reaktionsvolumen zwangsläufig gering sein, und die US-PS 38 26 619 beschreibt tatsächlich, daß diese Art der Bestimmung für geringe Mengen an unverdünntem Serum geeignet ist. Einer der Nachteile dieser Art von Bestimmung besteht darin, daß Fehler in der Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktionen durch Veränderungen des pH-Wertes, der in klinischen Proben zwischen pH 6 und pH 9 liegen kann, des unverdünnten Serums verursacht werden können. Der pH-Wert kann durch Zugabe eines Puffers gesteuert werden, jedoch Puffersalzkonzentrationen von über 0,1 Mol können die Antigen-Antikörper-Komplexe trennen. Deshalb muß ein überschüssiges Volumen an einem Puffer mit einer geringen Ionenstärke verwendet werden, um den pH-Wert genau zu steuern, und dies kann das Reaktionsvolumen auf eine unannehmbare Menge vergrößern. Fehler auf Grund des pH-Wertes können in qualitativen Bestimmungen wie sie durch die US-PS 38 26 619 beschrieben werden, insbesondere in Proben, die relativ reich an unbekannten Konzentrationen sind, toleriert werden, jedoch nicht in quantitativen Bestimmungen. Wo Verdünnung durch Puffer erforderlich ist, kann eine niedrige Konzentration der unbekannten Komponente unter den Bestimmungsspiegel verdünnt sein und zu falsch-negativen Ergebnissen mit der in der US-PS 38 26 619 oder US-PS 334 64 798 beschriebenen Vorrichtung führen. Eine Ausführungsform des in der US-PS 38 26 619 beschriebenen Einsatzes ist ein Flügeleinsatz ohne Aussparungen mit einem Querschnitt in der Form eines X. Diese Testvorrichtung arbeitet, wie vorstehend bereits ausgeführt, nach dem Prinzip des innigen Kontaktes zwischen verdünnter Probe und überzogener Matrixoberfläche. Mit einer solchen Probemenge läßt sich jedoch nicht die gesamte überzogene Matrix bedecken, d. h., die Matrix ist nicht vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht. Eine über die Flüssigkeit hinausragende Matrixlänge schließt jedoch eine quantitative Bestimmung aus.

Eine dritte Art von Festphasen-Einsatzmatrix ist die StiQ- Bestimmung der International Diagnostic Technology Corporation, Santa Clara, California, die dazu bestimmt ist, eine in der US- PS 40 20 151 beschriebene Festphasen-Bestimmung durchzuführen. In diesem System ist eine scheibenförmige nichtüberzogene Einsatz­ matrix aus einem Material vorgesehen, das Proteine von Serum zu adsorbieren vermag. Dieses System ist nicht nur auf Grund des Oberflächen : Volumen-Verhältnisses oder geometrischer Überlegungen begrenzt, sondern in der Hauptsache auf Grund von Problemen, die mit der anfänglichen Adsorptionsstufe verbunden sind, wie die Gegenwart von störenden Substanzen und die Schwierigkeit, in der niedrigen Konzentration meßbare Adsorptionskomponenten zu er­ zielen.

Ein anderes Beispiel eines Versuchs, das Verhältnis von Ober­ fläche zu Volumen durch die Reduzierung des Reaktionsvolumens zu verbessern, wird von Friedel, R. und Dwenger, A., Clin. Chem. 21, 967 (1975) beschrieben. In diesem System sind kapillar­ förmige Röhrchen auf der Innenseite mit einem spezifischen Adsorbans überzogen, und das Reaktionsgemisch wird in den Hohlraum des kapillarförmigen Röhrchens eingeführt.

Ein System, das eine große Oberfläche für das Gesamtvolumen bietet, ist das überzogene Mikroglaskügelchen-System, wie bei­ spielsweise das Immo-Phasen-System von Corning Glass Works. Dieses System verkörpert die Verwendung von feinteiligen Teil­ chen. Es liefert eine große überzogene Oberfläche mit einer entsprechend hohen Reaktionsgeschwindigkeit. Auf Grund des Ab­ setzens der Teilchen während der Reaktion erfordert die Opti­ mierung dieser Art Testsystem, daß die Teströhrchen, in die sie getan werden, während der Reaktion verschlossen sind und während der Reaktion vertikal gemischt werden, um sicherzustellen, daß die gesamte Oberfläche in Kontakt mit den Reaktionsteilnehmern kommt. Außerdem macht die Verwendung von Teilchen eine mehrfache Zentrifugierung und das Waschen erforderlich, um das immobili­ sierte Produkt von den Reaktionsteilnehmern in der Lösung voll­ ständig zu trennen. Glasteilchenoberflächen besitzen den weiteren Nachteil, daß gegenüber Glas eine größere nicht spezifische Proteinbindung besteht als gegenüber Plastik.

Frühere Versuche, überzogene Röhrchen als eine Feststoff- Reaktionsmatrix zu verbessern, resultierten allgemein in einer gewissen Verbesserung der Reaktionsgeschwindigkeit oder der Zeit, die zum Durchführen einer meßbaren Reaktion erforderlich ist. Derartige Verbesserungen wurden im allgemeinen erzielt durch ein gleichzeitiges Anwachsen der Handhabungsschwierigkeiten oder durch den Verlust an Flexibilität. Die vorliegende Erfindung liefert beides, und zwar sowohl ein verbessertes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen und verbesserte Reaktionskinetiken sowie verbesserte Vielseitigkeit und Leichtigkeit der Handhabung.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Festphasen- Matrix zur Bestimmung oder zum Nachweis einer mobilen Kom­ ponente in einer Flüssigkeitsprobe bereitzustellen, mit deren Hilfe folgende Vorteile erzielt werden: Wegfall von Zeitnahmefehlern beim Starten und beim Stoppen der Reak­ tionen, hohe Reaktionsgeschwindigkeiten, Verringerung von volumentrischen Übergangsfehlern, verringerte Fehler beim Messen bei einem gegebenen Empfindlichkeitsspiegel und Leichtigkeit der Handhabung.

Diese Aufgabe wird bei einer gattungsgemäßen Einrichtung durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Festphasen-Matrix läßt sich ein Verfahren einer chemischen, enzymatischen oder immunchemischen Reaktion durchführen, worin einer oder mehrere der Reaktionsteilnehmer, jeder als fixierte Komponente bezeichnet, an eine Festphasen-Oberfläche gebunden sind und ein oder mehrere andere Reaktionsteilnehmer, jeder als mobile Komponente bezeichnet, frei diffusionsfähig in einem flüssigen Medium sind, worin die feste Phase eingetaucht ist. Insbesondere ist ein fixierter Reaktionsteilnehmer an eine einheitliche Matrix gebunden, die in die Flüssigkeit eingetaucht werden kann. Die Form der Matrix ist so konstruiert, daß für die Reaktion ein großes Oberflächen zu Volumen-Verhältnis sowie ein kürzerer Übergangsabstand für die mobilen Reaktions­ teilnehmer aus der Lösung zur Oberfläche der festen Phase ge­ schaffen werden und sie frei bei der Entfernung aus der Reaktionsflüssigkeit abtropfen kann.

Die hohe Reaktionsgeschwindigkeit mit den Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Festphasen-Matrix gestattet, immunchemische Bestimmungen bei Raumtemperatur oder darunter durchzuführen, was gegenüber höheren Reaktionstemperaturen vorteilhaft sein kann, die ein Gleichge­ wicht schaffen. Von der Vorrichtung ist zu erwarten, daß sie leicht zu handhaben ist mit ständiger Wirtschaftlichkeit und Gleichmäßigkeit des Produktes. Eine große Vielzahl von Matrices kann gemäß den vorliegenden Prinzipien und Lehren verwendet werden. Das wesentliche Merkmal der Matrix ist ein Griffteil und eine Vielzahl von daran befestigten im wesentlichen glatten planen oder kurvigen Oberflächen, die bezüglich der Reaktionsflüssigkeit so angeordnet und geformt sind und derartige Abmessungen besitzen, daß das Einsetzen der Matrix darin den durchschnitt­ lichen Diffusionsabstand der Moleküle der mobilen Komponente zur Matrixoberfläche im Vergleich zu ihrem Durchschnitts­ diffusionsabstand zu den inneren Oberflächen des Reaktionsgefäßes, wenn keine Matrix vorhanden ist, reduziert. Die tatsächliche Form einer gegebenen Matrix der Erfindung kann, jedoch muß nicht, gemäß der Größe und der Form des Reaktionsgefäßes gestaltet sein, in das sie hinein getan wird. Außerdem ist keine enge Toleranz oder enger Sitz innerhalb des Reaktionsgefäßes erforderlich. Außerdem muß die Matrix sich im wesentlichen durch die Tiefe der Flüssigkeitsprobe erstrecken. In einigen Systemen erstrecken sich die Matrixoberflächen vorzugsweise über die Oberfläche der Reaktionsflüssigkeit hinaus, wobei sie eine im wesentlichen konstante geometrische Beziehung durch die Tiefe der Reaktionsflüssigkeit erzeugen und außerdem dafür sorgen, daß die gleiche geometrische Beziehung erfolgt, unabhängig von irgendwelchen Veränderungen im Flüssigkeitsvolumen. Vorrichtungen der bevorzugten Ausführungs­ form einer gegebenen Größe sind beispielsweise ebenfalls für Bestimmungen geeignet, worin das Reaktionsvolumen um das Dreifache differiert.

Eine alternative Ausführungsform betrifft eine Festphasen-Matrix zur Verwendung in chemischen, enzymatischen und immunchemischen Bestimmungsmethoden, die eine spezielle Verwendung im Zusammen­ hang mit automatischen Pipettierungseinrichtungen findet. Die Matrix kann außerdem für übliche mit Hand durchgeführte Einzel­ analysen Anwendung finden. Die Matrix ist durch ein zylindrisches Rohr gebildet, die eine Trägeroberfläche mit einer Vielzahl an radial nach innen ragenden Flügeln aufweist, deren äußeres Ende mit der Innenfläche der Trägerfläche verbunden ist und deren inneres Ende ein zentral angeordnetes zylindrisches Volumen bildet, in das eine Pipette eingesetzt werden kann, um Flüssigkeitsproben anzu­ saugen und abzugeben.

Die Verwendung der Flügelstabgeometrie hat in einigen Fällen eine unerwartete und zur Zeit unerklärte Erhöhung der Reaktions­ geschwindigkeit über diejenige zur Folge, die auf der Basis der Oberfläche bestimmt wurde. Auf Grund der Entdeckung, daß geo­ metrische Faktoren die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen, war es wichtig, eine gleichmäßige Festphasen-Geometrie von einer Probe zur anderen zu schaffen, um gleichmäßige Ergebnisse zu erzielen. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen schaffen eine solche Gleichmäßigkeit und tragen ferner dazu bei, menschliche und mechanische Fehler wie Veränderung der Rührgeschwindigkeit, Zeitfehler oder Konvektion auszuschalten.

Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Matrix wird eine Festphasen-Reaktion ausgeführt, indem man eine oder mehrere Reaktionskomponenten verwendet, die fest an die Oberfläche der in die Reaktionsflüssig­ keit eingetauchten Matrix gebunden sind. Zur Erläuterung werden Reaktionen, die in Teströhrchen durchgeführt werden, beschrieben, und Matrices, die so beschaffen sind, daß sie in die Teströhrchen hineingegeben werden können, werden abgehandelt. Die Reaktion wird leicht eingeleitet, indem man die Matrix in das Röhrchen tut, das die mobile Komponente enthält, und kann durch Entfernung des Einsatzes beendet werden. Gegebenenfalls kann die Reaktion wieder eingeleitet werden, indem man die Matrix einfach wieder hineingibt, oder eine zweite Reaktion kann eingeleitet werden, indem man eine neue Matrix, die eine zweite fixierte Komponente trägt, hineingibt. Die Matrix kann gegebenenfalls in ein zweites, das Reagens enthaltende Röhrchen hineingegeben werden oder direkt in eine radioaktive Zählkammer oder andere Meßvorrichtungen je nach Art der Bestimmungsmethode übergeführt werden.

Die Festphasen-Reaktionskinetiken sind komplexer als für Homogenphasen-Reaktionen. Eine ins einzelne gehende theoretische Basis zum Optimieren von Einsatzformen ist nicht verfügbar. Jedoch können gewisse allgemeine Grunderwägungen berücksichtigt werden. Die Gesamtoberfläche in Kontakt mit der Lösung ist ein wichtiger Faktor. Je größer die Oberfläche ist, desto größer ist die Menge an fixierter Komponente, die in der Reaktion vorliegen kann. Die Erhöhung der effektiven Konzentration jeder der Kompo­ nenten erhöht im allgemeinen die Gesamtreaktionsgeschwindigkeit.

Da die Menge an fixierter Komponente unter anderem durch die Oberfläche der Festphase bestimmt wird, sollte die Reaktionsge­ schwindigkeit sich direkt mit dem Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ändern. Ein vergrößertes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen wird erfindungsgemäß dadurch erzielt, daß man einen Einsatz schafft, der eine vergrößerte Oberfläche im Verhältnis zu der­ jenigen, die auf der inneren Oberfläche des Teströhrchens ver­ fügbar ist, aufweist. Ein zweiter, wahrscheinlich die Reaktions­ geschwindigkeit beeinflussender Faktor ist der durchschnittliche Diffusionsabstand zwischen den mobilen und den stationären bzw. fixierten Reaktionsteilnehmern. Unter dem Ausdruck "durch­ schnittlicher Diffusionsabstand" versteht man die Summe der Abstände, die jedes der Moleküle der mobilen Komponente diffun­ dieren muß, durch den kürzestmöglichen Weg, um eine fixierte Komponente zu erreichen, geteilt durch die Gesamtanzahl der­ artiger Moleküle. Die erfindungsgemäßen Matrices sind so be­ schaffen, daß sie weitestgehend den Durchschnittsdiffusions­ abstand der Mobilphasen-Moleküle zu der an den Oberflächenelementen der Matrix haftenden Komponente gegenüber dem Durchschnitts­ diffusionsabstand derartiger Moleküle zu einer fixierten Kompo­ nente, die auf den inneren Oberflächen des Reaktionsgefäßes festgehalten werden, wenn keine Matrix vorhanden ist, reduziert. Der Übergang der mobilen Reaktionsteilnehmer zur reaktiven Oberfläche wird durch Verringerung des Durchschnittsabstands zwischen den mobilen Reaktionsteilnehmern und den reaktiven Oberflächen erleichtert. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices wurden erhöhte Reaktionsgeschwindigkeiten beobachtet, wie im einzelnen in den Beispielen beschrieben wird.

Unerwarteterweise wurde in einer Anzahl von Fällen beobachtet, daß die beobachtete Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit größer war als auf der Basis des erhöhten Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen erwartet worden war. Gleichermaßen scheinen Reaktionen das Gleichgewicht bei Verwendung der Flügelstab-Matrices schneller zu erreichen als bei der Verwendung eines überzogenen Röhrchens. Obgleich diese Erscheinungen nicht quantitativ bestimmt worden sind, scheinen sie häufiger und leichter beobachtet zu werden bei der Verwendung von Flügelstäben mit einer größeren Anzahl an Flügeln.

Obgleich nicht ständig beobachtet, tritt das Phänomen der erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit und schnelleren Erzielung des Gleichge­ wichtes mit ausreichender Häufigkeit auf, um die Vermutung zu stützen, daß geometrische Faktoren der Matrixkonfiguration, bei denen es sich nicht um die Oberfläche als solche handelt, die Festphasen-Reaktionsgeschwindigkeit bedeutend beeinflussen können. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices schafft somit vorteilhafte Reaktionsgeschwindigkeit für Festphasen- Reaktionen im allgemeinen. Praktische Erwägungen diktieren eine Obergrenze der einzelnen Elemente wie beispielsweise Flügel, die an dem Griff des Stabes befestigt werden können. Beispielsweise sollten die Elemente nicht zu eng beieinander sein, oder irgend­ welche anderen Kapillarkräfte verursachen die Retention des Reaktionsgemischs zwischen den Elementen, die das Waschen oder selbst einfaches Abtropfen schwierig machen. Außerdem kann, wenn ein Flügelstab durch Gießen herzustellen ist, die Anzahl an Flügeln durch die Möglichkeit, eine Form mit der ge­ wünschten Anzahl an Flügeln herzustellen, begrenzt sein. Die obere Grenze, die durch derartige Überlegungen gegeben ist, hängt von der Größe des Stabes und dem Zweck ab, für den er verwendet werden soll. Für Stäbe, die für Reaktionsvolumen in der Größenordnung von etwa 1 ml verwendet werden sollen, ist die bevorzugte Anzahl an Flügeln mindestens 8. In einer besonders be­ vorzugten Ausführungsform werden 18 Flügel, die radial um einen zentralen Griff angeordnet sind, verwendet.

Zusätzliche Vorteile werden durch die vorliegende Erfindung ge­ geben. Eine vergrößerte Gesamtoberfläche macht es möglich, quantitative Bestimmungen über einen weiteren Bereich von mobilen Reaktionskonzentrationen durchzuführen auf Grund der erhöhten Feststellbarkeit am niedrigen Ende des Konzentrationsbereichs und erhöhter Bindungskapazität dahin gehend, daß die proportional aufgeteilte Reaktion bei höheren Konzentrationen des mobilen Reaktionsteilnehmers möglich ist. Außerdem können die erfindungs­ gemäßen Matrices zur Durchführung von quantitativen Direkt- oder Sandwich-Bestimmungen verwendet werden. Für diese Anmeldung ist die erhöhte Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Matrices erforderlich, um die Materialien über den gesamten Bereich der potentiellen Konzentrationen zu immobilisieren und nicht nur einen einfachen "Ja-Nein"-Test zu erzielen, vgl. US-PS 38 26 619 (DE-OS 22 62 479). Für immunologische Bestimmungen vom Sandwich-Typ ist der Bereich an Antigen-Konzentrationen, der unter Verwendung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung quantitativ gemessen werden kann, sehr groß, wie in Beispiel 7 veranschaulicht wird. Für konkurrierende immunologische Bestimmungen wird der anwend­ bare Bereich der Bestimmung durch eine komplexe Wirkung bestimmt, wozu die Geometrie der Matrix, die Menge und die Verteilung von auf der Matrixoberfläche immobilisiertem Antikörper und die Methode der Immobilisierung gehören. Die Anzahl, der Sitz, die Größe und die Form der Matrixoberflächenelemente beeinflussen die Kinetiken der immunchemischen Reaktion, die ihrerseits die Menge an immobilisierter Komponente beeinflußt, die erforderlich ist, um eine unterschiedliche Reaktion mit der zu messenden Menge an mobiler Komponente zu schaffen. Außerdem sind die Stabilität der gebundenen Komponente und die Gleichmäßigkeit ihrer Verteilung Parameter, die die Beschaffenheit der überzogenen Matrix beein­ flussen. Vorteilhafte Ergebnisse werden bei der Verwendung der erfindungsgemäßen überzogenen Matrices in einer konkurrierenden immunologischen Bestimmung erzielt, indem man die Steuerung aller bedeutenden, die Empfindlichkeit, die Geschwindigkeit und die Reproduzierbarkeit beeinflussenden Faktoren gestattet. Außerdem erlaubt die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices ein Reaktions­ volumen, das groß genug ist, um zu gestatten, daß eine Serum­ probe mit einem Puffer verdünnt wird, um den pH-Wert zu steuern und um Fehler zu reduzieren, die auf Grumd der Veränderung des pH-Wertes in der Probe auftreten, oder andere Faktoren wie Proteinkonzentration und, falls erforderlich, von Probe zu Probe ein konstantes Volumen zu schaffen. Erfindungsgemäße Matrices sind nicht für die Verwendung mit einem einzigen definierten Reaktionsvolumen begrenzt, da sie in das Reaktionsgefäß nicht innerhalb einer engen Toleranz hineinpassen müssen. Es ist keine besondere Größe oder Form des Reaktionsgefäßes erforderlich. Die erfindungsgemäße Matrix muß nicht eng in das Reaktionsgefäß hineinpassen oder sogar dessen Wände berühren. Die Matrixelemente mit glatten planen oder kurvigen Oberflächen sollten gleichmäßig innerhalb der Tiefe der Reaktionsflüssigkeit verteilt sein und in einigen Systemen vorzugsweise sich über diese Oberfläche erstrecken, um eine im wesentlichen gleichmäßige geometrische Beziehung zwischen Mobilkomponentenmolekülen und der Matrix­ oberflächen über einen weiten Bereich der Reaktionsflüssigkeits­ volumen zu schaffen.

Sowohl in immunchemischen konkurrierenden als auch Sandwich- Bestimmungen hängt die zur Durchführung dieser Bestimmung er­ forderliche Zeit von der Geschwindigkeit ab, mit der die Reaktion ihr Gleichgewicht erreicht. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Matrices durchgeführte Reaktionen erreichen das Gleichgewicht schneller als übliche Bestimmungsmethoden mit überzogenen Röhrchen und können deshalb in kürzerer Zeit durchgeführt werden. Außerdem schafft die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrix sehr wirksame und genaue Mittel zum Starten und Stoppen der Reaktionen. Dieser Vorteil wird bedeutend, wenn es erforderlich ist, eine Vielzahl an Bestimmungen gleichzeitig durchzuführen. In diesen Fällen wird die für die Handhabung des Startens und Stoppens der Reaktion erforderliche Zeit auf ein Minimum reduziert und kann für alle Proben in der Reihe präziser gesteuert werden. Dieses Merkmal ist besonders vorteilhaft im Vergleich mit überzogenen Röhrchen, die dekantiert werden müssen, Schwämme, die ausgedrückt oder massiert werden müssen, um die letzten Spuren des Reaktionsgemischs zu entfernen, und insbesondere zu Materialien, die zentrifugiert und dekantiert werden müssen.

Ein weiterer Vorteil, der sich aus der erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit und erhöhten Kapazität der erfindungsgemäßen Matrices ergibt, besteht darin, daß die gleiche Matrix sowohl für Sandwich- als auch konkurrierende Bestimmungen verwendet werden kann. Bei der Verwendung in einer quantitativen konkurrierenden Bestimmung schafft die Matrix einen weiten Bereich an Proportional aufgeteilten Reaktionen wie vorstehend beschrieben und in den Beispielen veranschaulicht wird.

Weitere Vorteile resultieren aus der geometrischen Konfiguration der erfindungsgemäßen Matrices. Wie vorstehend ausgeführt, resultiert die Verwendung der Matrices in einer sichtbaren Erhöhung der Reaktionsgeschwindig­ keit, für die nicht die vergrößerte Oberfläche als solche verant­ wortlich ist. Zwar gibt es für diese Erscheinung im Augenblick keine Erklärung, jedoch wird vermutet, daß die Schaffung einer Reihe von planen oder kurvigen Oberflächen, die sich durch die Tiefe der flüssigen Probe erstrecken, den Durchschnittsabstand zwischen mobilen Reaktionsteilnehmern und der auf jeder Ober­ fläche verteilten fixierten Komponente reduziert und daß eine solche Reduktion in einer schnelleren Gesamtreaktionsgeschwindig­ keit resultiert. Außer den schnelleren Reaktionsgeschwindigkeiten und den sich daraus ergebenden Vorteilen liefern die beschriebenen Vorrichtungen gleichmäßigere Ergebnisse. Die geometrische Be­ ziehung zwischen den mobilen und den fixierten Reaktionsteil­ nehmern ist konstant und von Versuch zu Versuch reproduzierbar im Gegensatz zu bestimmten Festphasen-Systemen, worin die Teilchen die Tendenz besitzen, sich mit einer Geschwindigkeit abzusetzen, die von der Teilchengröße und der Teilchengrößenver­ teilung abhängt. Die erfindungsgemäßen Matrices sind weniger empfindlich gegenüber Fehlern auf Grund von Konvektion, was eine wesentliche Schwierigkeit ist, die mit der Verwendung von über­ zogenen Röhrchen verbunden ist. Die erfindungsgemäßen Matrices sind mit im wesentlichen glatten Oberflächen ausge­ stattet, um ein schnelles Abtropfen des Reaktionsgemischs zu ge­ statten, wenn die Matrix aus der Lösung entfernt wird. Durch dieses Merkmal können die Reaktionen schnell beendigt werden, die Waschstufen vereinfacht oder weggelassen werden, und es werden potentielle Verunreinigungsverfahren bei der Verwendung von Radioisotopen reduziert. Viele Quellen von potentiellen mensch­ lichen Fehlern fallen hierbei weg. Vorzugsweise verwendet man Stäbchen mit maximaler Oberflächenglätte, die durch ein Ver­ formungsverfahren hergestellt wurden, worin die Formoberflächen zu Spiegelglätte poliert worden sind. Maximale Oberflächenglätte kann durch Herstellung der Matrix aus gegossenem Kunststoff unter Verwendung einer Form mit zu Spiegelglätte polierten Ober­ flächen erzielt werden. Dieser aus der Verwendung von maximal glatten Oberflächen sich ergebende Vorteil mag im Gegensatz zu den Erwartungen stehen, da die rauheren Oberflächen einen größeren Oberflächenbereich liefern. Jedoch werden solche maximal glatten Oberflächen in einer bevorzugten Ausführungsform der Matrix verwendet, um die Entfernung der Reaktionsflüssigkeits­ komponenten von den Matrixoberflächen zu maximieren und nicht­ spezifische Hintergrundsstörungen auf ein Minimum herabzu­ setzen.

Aus Vorstehendem ist ersichtlich, daß die Gestaltung einer richtig funktionierenden Matrix in jeder Richtung Aufmerksamkeit er­ fordert und daß Abweichungen die durchzuführende Reaktion be­ einflussen. Außer der Schaffung einer strukturellen Basis für erhöhte Reaktionsgeschwindigkeiten, einfache Handhabung, auf ein Mindestmaß herabgesetzte Hintergrundsstörung und aller anderen erfindungsgemäßen Vorteile ist es wichtig, eine überzogene Oberfläche zu schaffen, auf der die immobilisierten Reaktions­ teilnehmer so verteilt sind, daß deren Reaktivität maximal ist. Die immobilisierte Komponente sollte so gleichmäßig wie möglich auf der Oberfläche verteilt sein. Hohlräume im Überzug, die beispielsweise durch eine Luftblase auf der Matrixoberfläche während der Überzugsstufe verursacht werden könnten, müssen ver­ mieden werden. Die Moleküle des immobilisierten Reaktionsteil­ nehmers müssen auf der Matrixoberfläche frei liegen und dürfen nicht durch überschüssige Reaktionsteilnehmer oder anderes Trägermaterial begraben sein. Vorzugsweise sollte der immobili­ sierte Reaktionsteilnehmer so fest an die Matrix gebunden sein, daß keine wesentliche Menge an Reaktionsteilnemher desorbiert oder auf andere Weise während der Inkubations- und Waschstufe der Reaktion entfernt wird.

Ausführungsformen mit einer Vielzahl an einzelnen herausragenden Oberflächen wie Flügel oder Stäbe sind brauchbare Methoden zur Durchführung verschiedener Tests auf einmal, indem man einzelne Flügel oder Stäbe schafft mit unterschiedlichen, darauf immo­ bilisierten Materialien. Die in Fig. 3 gezeigte Konfiguration aus einem Bündel von Stäben ist besonders für derartige Techniken geeignet. Die Stäbe können so gefertigt sein, daß sie einzeln anzubringen und abzunehmen sind, so daß jede Kombination an für diesen Zweck geeigneten Bestimmungen in einer einzelnen Reaktions­ stufe durchgeführt werden kann und die Ergebnisse nicht einzeln gemessen werden müssen.

Außer den vorstehend genannten Vorteilen des Einsatz-Matrix­ systems in quantitativen Analysen besteht ein Produktionsvorteil von wirtschaftlicher Bedeutung. Insbesondere können die Techniken zum Immobilisieren der fixierten Komponente so gestaltet sein, daß sie auf eine große Vielzahl an Matrices zur gleichen Zeit angewandt werden können, entweder in einem diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Herstellungsverfahren. Die sich daraus ergebende Wirtschaftlichkeit des im Großen herzustellenden Produktes mit erhöhter Gleichmäßigkeit bedeuten einen klaren Vorteil.

Eine alternative Ausführungsform der Festphasen-Matrix, die sich für die Ver­ wendung mit einer automatischen Pipettierungsapparatur eignet, kann nach den Prinzipien der vorliegenden Erfindung konstruiert werden. Diese ist bereits oben beschrieben worden. Sie kann vorzugsweise durch Gießen oder Extrudieren als eine einheitliche Struktur oder alternativerweise als einzelne Stücke hergestellt, die durch geeignete Verbindungstechniken wie Nut und Feder oder einen Klebstoff miteinander verbunden werden. Die inneren Enden der sich erstreckenden Teile bilden ein zentral angeordnetes zylindrisches Volumen, das einen schnellen Zutritt und Austritt einer Sonde einer automatischen Pipettierungsapparatur in den Boden des die Matrix enthaltenden Testrohres gestatten. Die radial sich erstreckenden Oberflächen sind in Ebenen angeordnet, die die zentrale Achse des zentral angeordneten zylindrischen Volumens schneiden. Je größer die Anzahl der sich erstreckenden Teile ist, desto größer ist die reaktive Oberfläche und desto schneller die Reaktionszeit innerhalb der praktischen Grenzen, wie vorstehend diskutiert für die Flügel-Stab-Ausführungsform.

Die erfindungsgemäßen Matrices können außerdem Anwendung finden in industriellen Labors für Qualitätskontrolle für chemische oder enzymkatalysierte Routinereaktionen, die in einem Festphasen- System durchgeführt werden können. Außerdem können die Vor­ richtungen für kontinuierliche oder nichtkontinuierliche Pro­ duktionsverfahren verwendet werden, worin es erwünscht ist, eine bestimmte Substanz vom Reaktionsgemisch zu entfernen. Beispielsweise können Matrices, die mit Ionenaustauschharz über­ zogen sind, zur Entfernung bestimmter Ionen von der Lösung verwendet werden. Bestimmte auf den erfindungsgemäßen Matrices immobilisierte spezifisch adsorbierende Proteine können zur Entfernung von Verunreinigungen wie Spurenmetalle aus dem Pro­ duktionsstrom verwendet werden. Übliche Katalysatoren können zum Überziehen der Oberflächen der beschriebenen Einsatz- Matrices verwendet werden für kontinuierliche Umwandlung von Reaktionsteilnehmern, Behandlung von ausfließenden Stoffen u. ä. Die erfindungsgemäßen Matrices können, wenn sie so angepaßt sind, daß sie in die entsprechende Größe des Reaktionsgefäßes passen, für großindustrielle als auch Laboratoriumsverfahren verwendet werden. Festphasen-Reaktionen mit gasförmigen Reak­ tionsteilnehmern, Dämpfen, Aerosols, Teilchensuspensionen und ähnlichem sind ebenfalls vorgesehen. Die erfindungsgemäßen Matrices finden besonders Anwendung in fließenden Systemen, worin es erwünscht ist, Reaktionssysteme ohne Reduzierung der Fließgeschwindigkeit oder der Schaffung eines Rückstaus in das System durchzuführen.

Fig. 1 veranschaulicht die bevorzugte Ausführungsform einer Festphasen-Matrix, die erfindungsgemäß konstruiert ist.

Fig. 2 veranschaulicht eine Modifikation der in Fig. 1 veran­ schaulichten Ausführungsform, worin eine Vielzahl von Aussparungen angebracht ist, um die reaktive Oberfläche zu vergrößern.

Fig. 3 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Erfindung mit einer Vielzahl von nach unten sich erstreckenden Zinken.

Fig. 4 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Erfindung mit konzentrischen zylindrischen Oberflächen.

Fig. 5 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Erfindung mit einer sich kontinuierlich erstreckenden Oberfläche in Form einer Spiralrampe.

Fig. 6 veranschaulicht eine andere Ausführungsform in Form von gestapelten Scheiben.

Fig. 7 veranschaulicht die Ergebnisse der in Beispiel 12 beschriebenen, bei 37°C mit unterschiedlichen Matrices durchgeführten Vergleichsversuche.

Fig. 8 veranschaulicht die Ergebnisse der in Beispiel 3 beschriebenen, mit 8- und 16-flügeligen Matrices durch­ geführten Versuche.

Fig. 9 veranschaulicht die Ergebnisse des in Beispiel 3 beschriebenen, mit einer 8-flügeligen Matrix in einer 45minütigen Reaktion bei 22°C durchgeführten Versuche.

Fig. 10 veranschaulicht die Ergebnisse der in Beispiel 2 beschriebenen, bei Raumtemperatur mit unterschiedlichen Matrices durchgeführten Vergleichsversuche.

Fig. 11 veranschaulicht die Ergebnisse der in Beispiel 3 beschriebenen, bei 37°C mit unterschiedlichen Matrices und einem überzogenen Rohr durchgeführten Vergleichsversuche.

Fig. 12 veranschaulicht die Ergebnisse der in Beispiel 6 beschriebenen, bei 37°C mit unterschiedlichen Matrices und einem überzogenen Rohr durchgeführten Vergleichsversuche.

Fig. 13 veranschaulicht die Ergebnisse der in Beispiel 5 beschriebenen, mit einer 8-flügeligen Matrix und einem überzogenen Rohr durchgeführten Vergleichsversuche.

Fig. 14a und 14b sind Abtastelektronenmikrographs von Matrix­ oberflächen.

Fig. 1 veranschaulicht die bevorzugte geometrische Form eines Festphasen-Einsatzes 10, der erfindungsgemäß konstruiert ist. Der Einsatz hat eine Vielzahl von im gleichen Abstand ange­ ordneten Flügeln 12 mit äußeren Enden 14, die ein im allgemeinen zylindrisches Volumen bilden, das in das Testrohr 16 hineinpaßt, in enger Nachbarschaft mit der Innenwand 18. Das Testdrohr 16 funktioniert als Flüssigkeitsbehälter für die zu bestimmende Probe zur Bestimmung der Konzentration oder des Vorhandenseins von Komponenten wie Antikörpern und Antigenen gemäß dem er­ findungsgemäßen Verfahren. Der Einsatz hat ein vertikal sich erstreckendes Griffteil 22, an das eine Vielzahl von im gleichen Abstand angeordneten radial sich erstreckenden Flügeln ange­ bracht sind, die einen Radius aufweisen, der gleich oder etwas geringer ist als der Radius des Testrohres. Der Stab funktioniert als ein Griff. Der untere Teil 26 jedes Flügels ist vorzugsweise so geformt, daß der Einsatz dem Boden des Testrohres angepaßt ist. Die Flügel sind vorzugsweise als Teil einer einheitlichen Struktur gebildet, die einen mittleren Stab enthält. Jedoch können die Flügel an den Stab mit Hilfe physikalischer Verbindungen wie Nut und Feder oder eines geeigneten Klebstoffs befestigt sein.

Während die Ausführungsform der Fig. 1 8 sich radial erstreckende im gleichmäßigen Abstand abgebrachte Flügel veranschaulicht, kann eine andere Anzahl und andere Konfiguration von Flügeln bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Es wurde gefunden, daß eine Vergrößerung der Oberfläche des Einsatzes durch Anbringen einer erhöhten Anzahl an Flügeln die Reaktions­ geschwindigkeit der mobilen und der fixierten Komponente erhöht. Außerdem wurde unerwarteterweise gefunden, daß in vielen Fällen ein 8-flügeliger Einsatz eine proportional größere Reaktionsge­ schwindigkeit gegenüber einem bekannten überzogenen Rohr hat als durch den Unterschied ihrer relativen Oberflächen erklärt werden kann, vgl. Fig. 7 und 10. Ähnliche Vorteile wurden beobachtet mit einer größeren Anzahl an Flügeln wie 12, 16 und 18. Im Hinblick auf diese Beobachtungen ist eine bevorzugte Aus­ führungsform der Erfindung eine Flügelmatrix ähnlich der in Fig. 1 gezeigten mit einer Vielzahl an Flügeln von 8 bis 18. Eine 18-flügelige Matrix, die die am meisten bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt, wurde hergestellt. Bei den Flügelvorrichtungen des in Fig. 1 gezeigten Typs wird die Anzahl an Flügeln, die praktisch verwendbar ist, durch die er­ höhte Schwierigkeit begrenzt, ein freies Ablaufen zu erzielen auf Grund der kapillaren Haftung der Reaktionsflüssigkeit, insbe­ sondere im Bereich des Griffteils, wo die Flügel sich gegenseitig näher kommen bei spitzer werdendem Winkel, wenn die Anzahl an Flügeln erhöht wird.

Ein Vergleich der Daten der Fig. 7 zwischen dem 8-flügeligen Einsatz mit dem des bekannten überzogenen Rohres zeigt an, daß andere Erwägungen die Reaktionsgeschwindigkeit der mobilen und der fixierten Komponenten außer dem Bereich der freiliegenden Oberfläche, die mit der fixierten Komponente überzogen ist, beeinflussen. Obgleich diese Gesichtspunkte zur Zeit nicht be­ kannt sind, wird angenommen, daß die Verringerung des durch­ schnittlichen Diffusionsabstandes in dem 8-flügeligen Einsatz gegenüber demjenigen im überzogenen Rohr mindestens einer dieser Gesichtspunkte ist.

Fig. 2 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Erfindung, die mit der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform in allen Punkten identisch ist, außer daß eine Vielzahl an Aussparungen 28 in den Flügeln angebracht ist, um die Oberfläche der fixierten Komponente zu erhöhen, die durch die zu bestimmende Probe be­ netzt wird. Die Aussparungen 28 können sich vollständig durch die Flügel erstrecken. Wie veranschaulicht ist, können die Aus­ sparungen kreisförmig oder länglich sein oder können irgendeine andere Form haben. Um die Oberfläche des Einsatzes durch An­ bringung von kreisrunden Aussparungen zu vergrößern, muß der Radius der Aussparungen weniger als das 2fache der Wandstärke 30 betragen.

In Fig. 3 wird eine weitere Ausführungsform der Erfindung ge­ zeigt mit einem Griff 50, an dem flache Scheiben 52 angebracht sind, die so geschnitten sind, daß ihr Durchmesser etwas geringer ist als ein Testrohr, in das die Vorrichtung hineinpassen soll. Eine Vielzahl an sich nach unten erstreckenden Zinken 54 ist mit der Scheibe 52 verbunden. Die unteren Enden der Zinken 56 können von gleichmäßiger Länge oder von abgestufter Länge sein in Anpassung an den Rundboden eines Testrohres. Die Zinken 54 sind mit zylindrischem Querschnitt gezeigt, jedoch können sie in anderen Ausführungsformen andere Querschnittsformen aufweisen. Die Zinken 54 können einzeln von der Scheibe 52 abnehmbar und ansetzbar sein. Die Ausführungsform der Fig. 3 eignet sich besonders für komplexe Analysen, die verschiedene unterschiedliche Testreaktionen in der gleichen Probe umfassen, zusätzlich zu ihrer allgemeinen Brauchbarkeit in Festphasen-Reaktionen.

Fig. 4 zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung mit einem als Mittelstab ausgebildeten Griffteil 22, mit dem eine Vielzahl von konzentrischen zylindrischen Oberflächen mit Hilfe von radial sich erstreckenden Streben 64 verbunden sind. Fig. 4 zeigt ein Paar solcher zylindrischer Oberflächen 60 und 62. Zur Anpassung an den Rundboden des Testrohres erstreckt sich der innere konzentrische Zylinder 60 unter den äußeren Zylinder 62, und der Mittelstab 22 erstreckt sich etwas über den inneren Zylinder 60 hinaus. Ein Satz von unteren Streben 66 verleiht dem unteren Ende der Struktur Starrheit und erleichtert außerdem das freie Abtropfen der Flüssigkeit.

Fig. 5 zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung mit einer im allgemeinen radial sich erstreckenden Oberfläche in Form einer Spiralrampe 36, die sich um einen Zentralkern 32 windet, der mit dem Griffteil 22 verbunden ist. Die Vorrichtung schafft eine kontinuierliche im wesentlichen horizontale Oberfläche 36 und eine vertikale Oberfläche 34, die durch die Rampe bzw. ihre Außenfläche gebildet wird. Die Schräge der Rampe sorgt für das freie Ablaufen der Reaktionsflüssigkeit durch Gravität wenn die Vorrichtung aus der Reaktionsflüssigkeit entfernt wird. Die Ausführungsform der Fig. 5 ist besonders geeignet für Reak­ tionen, in denen Rühren erwünscht ist. Die Vorrichtung verjüngt sich am unteren Ende 38, um einen guten Paßsitz mit dem Boden eines Testrohrbehälters, wie er in Fig. 1 gezeigt ist, zu schaffen.

Fig. 6 ist eine andere Ausführungsform der Erfindung mit einer Vielzahl von horizontal angeordneten Scheiben 42, die an einem zentralen Griff 22 befestigt sind und die im wesentlichen parallel laufende obere und untere Oberflächen 44 und vertikale Kanten 46 aufweisen. Die Scheiben verjüngen sich am unteren Ende des Stabes 48 in Anpassung an den Rundboden des Testrohres. Während die geometrische Konfiguration der Fig. 6 zur Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, erfordert dieselbe und ähnliche Ausführungsformen, die keine frei abfließen lassende Oberflächen aufweisen, im Verhältnis mehr Arbeitszeit wegen der Wascher­ fordernisse, die bei den frei abfließen lassenden geometrischen Konfigurationen der Fig. 1 und 5 nicht vorhanden sind.

Andere geometrische Konfigurationen des Einsatzes als diejenigen die in den Fig. 1 bis 6 veranschaulicht sind können bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Diese geometrischen Konfigurationen sollten vorzugsweise vertikal ausgerichtete glatte Oberflächen in Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe haben, um das Ablaufen durch Gravität nach ihrer Entfernung aus dem Testrohr zu erleichtern. Jede geometrische Konfiguration, die eine frei abfließen lassende relativ große Oberfläche aufweist, kann zur Durchführung der Erfindung verwendet werden. Je größer die benetzbare Oberfläche ist, desto schneller ist die Reak­ tionsgeschwindigkeit zwischen den mobilen und den fixierten Kompo­ nenten.

Vor der Verwendung eines erfindungsgemäßen Einsatzes durch Hineingeben desselben in eine Flüssigkeitsprobe, die eine quan­ titativ oder qualitativ zu bestimmende mobile Komponente enthält, waren alle Oberflächen mit der fixierten Komponente, wie vor­ stehend bereits diskutiert, überzogen. Eine Vielzahl von Einsätzen kann gleichzeitig überzogen werden, um die Herstellungskosten bis auf einen Punkt zu senken, an dem das Wegwerfen des ver­ wendeten Einsatzes wirtschaftlich ist.

Der Einsatz kann aus so ziemlich jedem stabilen wasserunlöslichen Material hergestellt werden, wie beispielsweise Polymethacrylat, Polypropylen und Polystyrol.

Fig. 14a ist ein Abtastelektronenmikrograph der Oberfläche einer bevorzugten Ausführungsform, einer 18-flügeligen Matrix, die in einer polierten Form gegossen worden ist. Vergrößerung: 300fach; Abtastwinkel 45°.

Fig. 14b ist ein Abtastelektronenmikrograph der Oberfläche eines Matrixprototyps, der aus dem gleichen Plastikmaterial wie in Fig. 14a verwendet wurde gegossen wurde, jedoch mit einer nicht polierten Form. Vergrößerung: 300fach; Abtast­ winkel 45°.

Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und dem Vergleich der Erfindung mit dem St.d.T.

Beispiel 1

Matrices in Form von 2-flügeligen, 4-flügeligen und 8-flügeligen Stäben aus Polymethacrylat wurden hergestellt für die Verwendung in der Festphasen-Reaktion im Vergleich mit einem bekannten überzogenen Polystyrol-Rohr. Die Stäbe waren im wesentlichen wie in Fig. 1 gezeigt konstruiert, mit der Aus­ nahme, daß die Flügel am unteren Ende nicht abgerundet waren und somit sich nicht in den Rundbodenteil des Reaktionsrohres erstreckten. Die gemessenen Oberflächen für jede Konfiguration der Festphase war wie folgt:

Festphasen-Konfiguration
Oberfläche
Überzogenes Rohr
899 mm²
2-flügeliger Einsatz	452 mm² @	4-flügeliger Einsatz	660 mm² @	8-flügeliger Einsatz	1075 mm²

Die Reaktion war eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen I¹²⁵-Thyroxin (T4) und Kaninchen-Anti-Thyroxin-Antikörper. Der Antikörper wurde als fixierte Komponente verwendet und das radioaktive Antigen als mobile Komponente.

Um den Antikörper auf den vorstehenden Festphasen-Oberflächen zu immobilisieren, wurde eine 2,5%ige Lösung von Glutaraldehyd mit einem gleichen Volumen eines 0,5M Natriumcarbonatpuffers mit einem pH von 9,5 verdünnt. Die Festphasen-Oberflächen wurden in die Glutaraldehydlösung mindestens 3 Stunden lang bei Raum­ temperatur eingetaucht und dann mit Wasser gewaschen. Die mit Glutaraldehyd behandelten Oberflächen wurden dann sofort mit einer 1 : 1000 verdünnten Lösung von Kaninchen-Anti-T4-Serum in 0,5M Natriumcarbonat mit einem pH von 9,5 12 Stunden lang bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht.

Die Oberflächen wurden dann mit Wasser gewaschen und aufbewahrt in einer phosphatgepufferten Salzlösung aus 0,006M NaH₂PO₄, 0,024M K₂HPO₄ und 0,15M Natriumchlorid mit einem pH-Wert von 7,4, der 0,1% Bovinserumalbumin und soviel Merthiolat zugesetzt werden waren, um jegliches an das Serumprotein gebundene T4 freizusetzen, wobei das komplette Gemisch im nachstehenden als T-4-Puffer bezeichnet wird.

Die Reaktionen wurden durchgeführt, indem man die überzogene Oberfläche, die den immobilisierten Anti-Thyroxin-Antikörper trug, mit einer geringen Menge an I¹²⁵-Thyroxin in einem Gesamt­ reaktionsvolumen von 1,6 ml inkubierte. Die Poren wurden unter­ schiedlich lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle gezeigt:

Die Reaktionscharakteristika der Flügeleinsätze gegenüber dem überzogenen Rohr werden durch vorstehenden Versuch veranschaulicht. Zunächst darf bemerkt werden, daß das I¹²⁵-Thyroxin etwa 85 bis 90% rein war, so daß die maximale Bindung, die erzielt werden konnte, etwa 85 bis 90% betrug. Es ist somit ersichtlich, daß der 8-flügelige Einsatz nach 16 Stunden in etwa ein Gleichgewicht erreicht hatte. Noch bedeutender ist, daß der 4-flügelige Ein­ satz, obgleich er nur etwa ¾ der Oberfläche des überzogenen Rohres besaß, das Antigen mit einer etwas größeren Geschwindigkeit immobilisierte als das überzogene Rohr. Außerdem hatte der 2-flügelige Einsatz mehr Antigen je Oberflächeneinheit immobilisiert als das überzogene Rohr.

Beispiel 2

Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß die Reaktionen unterschiedlich lang bei Raumtemperatur und bei 37°C durchgeführt wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 bei 37°C und in Fig. 10 bei Raumtemperatur abgetragen. Daraus ist die Überlegenheit des 8-flügeligen gegenüber dem 4-flügeligen Einsatz ersichtlich. Der 4-flügelige Einsatz, trotzdem er weniger Oberfläche hatte als das überzogene Rohr, war zwar in der Lage, einen höheren Prozentsatz Antigen während des größten Teils des Reaktionsablaufs bei Raumtemperatur zu binden. Bei 37°C aber band der 4-flügelige Einsatz nicht mehr Antigen als das überzogene Rohr. Jedoch hatte der 8-flügelige Einsatz, trotzdem er nur das 1,2fache der Oberfläche des überzogenen Rohres aufwies, fast das 1,6fache an Antigen am Ende einer 60minütigen Inkubationszeit.

Beispiel 3

Die Reaktion von Flügeleinsätzen auf wachsende Konzentration von Antigen wurde mit derjenigen von überzogenen Rohren verglichen. Man verfuhr im wesentlichen nach Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß die Antigen-Konzentration durch Zugabe von nicht markiertem Standard auf der Basis von Thyroxin-Protein verändert wurde, während die Konzentration von I¹²⁵-Thyroxin konstant blieb. Die Antigen-Konzentration wurde von 25 auf 400 Nanogramm Thyroxin je ml Serum auf der Basis eines Probenvolumens von 0,025 ml verändert. In Fig. 11 wurden 2-, 4- und 8-flügelige Matrices mit einem überzogenen Rohr bei einer 3stündigen Inkubation bei 37°C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 1,725 ml verglichen. Der Reaktionspuffer war der T4-Puffer von Beispiel 1. Während die 4- bzw. 8-flügeligen Einsätze einer Familie von Kurven der gleichen allgemeinen Form zu folgen schienen, waren die über­ zogenen Rohre in ihrem Verhalten unterschiedlich, was wiederum anzeigt. daß die Reaktionsgeschwindigkeit zwischen den Einsätzen und dem überzogenen Rohr sich zu unterscheiden schien. Es ist außerdem ersichtlich, daß die Kurven der Flügeleinsätze, insbe­ sondere der 4- und 8-flügeligen Einsätze, einem steileren Gefälle über einen weiten Bereich an Antigen-Konzentration folgen, als die Kurve für das überzogene Rohr. Die Flügeleinsätze sind somit in der Lage, eine bessere unterschiedliche Reaktion über einen weiten Bereich von Antigen-Konzentration zu schaffen.

In Fig. 8 werden die Ergebnisse eines ähnlichen Versuches ge­ zeigt, wobei das Verhältnis von 8-flügeligen und 16-flügeligen Einsätzen verglichen wird. In diesem Versuch wurden die Matrices 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur in einem Gesamtreaktionsvolumen von 1,428 ml für den 8-flügeligen Einsatz und 1,025 ml für den 16-flügeligen Einsatz inkubiert. Der 16-flügelige Einsatz ist für quantitative analytische Zwecke vorteilhaft, wegen seiner allgemein größeren Reaktion und dem allgemein steileren Gefälle seiner Reaktionskurve bei den meisten Konzentrationen von Antigen.

Fig. 9 zeigt die Ergebnisse eines ähnlichen Versuchs unter Verwendung einer 8-flügeligen Matrix in einer 45minütigen Reaktion bei 22°C. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 1,325 ml und das Probenvolumen 0,025 ml. Unter diesen Bedingungen ergab die 8-flügelige Matrix eine brauchbare Reaktion über den ge­ samten getesteten Konzentrationsbereich in einer relativ schnellen Reaktion.

Beispiel 4

Man stellte einen Vergleich an zwischen einem 8-Flügelstab und einem überzogenen Rohr in einer immunchemischen Insulinbe­ stimmung. Meerschweinchen-Antiserum gegen Insulin wurde auf den Oberflächen von Rohren und Stäben gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren immobilisiert. Die Reaktion wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, daß Insulin als Antigen verwendet wurde. Jedes Reaktionsrohr enthielt eine iden­ tische Menge an mit I¹²⁵ markiertem Insulin zusammen mit einer Menge an nichtmarkiertem Insulin in phosphatgepufferter Salz­ lösung, die Bovinserumalbumin enthielt. Das Gesamtreaktionsvolumen für beide Systeme war 1,3 ml, die 300 µl eines nichtmarkierten Insulin-Standards und 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung wie in Beispiel 1 enthielten, die 50 mg/ml Bovinserumalbumin ent­ hielt. Die Daten, ausgedrückt als % des gesamten, an die reaktiven Oberflächen gebundenen markierten Materials, werden in nachstehender Tabelle wiedergegeben.

Der Prozentsatz an mit dem 8-Flügelstab beobachteter Bindung betrug im allgemeinen mehr als das 2fache der bei dem überzogenen Rohr beobachteten Menge, obgleich der erstere nur etwa das 1,2fache der Oberfläche des letzteren hatte, wie in Beispiel 1 gezeigt wurde.

Beispiel 5

Der nachstehende Versuch war dazu bestimmt, um die Wirkungen von unterschiedlichen Oberflächen, von Flügeln, die sich nicht in den Rundbodenteil des Reaktionsrohres erstrecken und von möglichen Unterschieden in der Bindungsaffinität zwischen Polymethacrylat und Polystyrol in einem Vergleich zwischen den 8-Flügelstab- und überzogenen Rohr-Festphasen zu kontrollieren. Die Reaktion wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt unter Anwendung von Inkubationen für die angezeigten Zeiten bei Raumtemperatur.

Sowohl die in diesem Versuch verwendeten Rohre als auch die Stäbe waren aus Polymethacrylat konstruiert. Die Rohre waren mit einem flachen Boden ausgestattet und einer überzogenen Oberfläche, die groß genug war, um eine Oberfläche zu liefern, die gleich derjenigen des überzogenen Stabes war. Die Daten sind in Fig. 13 gezeigt. Daraus ist ersichtlich, daß der Wegfall der vor­ stehend genannten Variablen das allgemeine Ergebnis der vor­ stehenden Beispiele nicht wesentlich verändert, d. h., daß die Bindung an die überzogenen Stäbe der Erfindung im allgemeinen schneller erfolgt als an überzogene Rohre, selbst wenn die über­ zogenen Oberflächen beide die gleichen sind.

Beispiel 6

Die Ergebnisse einer Sandwich-Bestimmung von α-Fetoprotein im Vergleich zwischen 8-flügeligen und 12-flügeligen Matrices mit einem überzogenen Rohr werden in Fig. 12 gezeigt. Antikörper gegen α-Fetoprotein wurden durch Adsorption immobilisiert. Die 8- und 12-flügeligen Stäbe wurden in 1,5 ml einer Lösung, die 18 µg α-Fetoprotein-Antikörper je ml 0,5M Natrimcarbonat­ puffer mit einem pH-Wert von 9,5 enthielt, getaucht und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Polystyrolrohre wurden auf die gleiche Weise überzogen, indem man sie in 1,5 ml der gleichen Antikörper­ lösung in das Rohr tat und unter den gleichen Bedingungen in­ kubierte. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Rohre und die Matrices abgespült und 1 Stunde lang in eine phosphatgepufferte Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4, die 10 ml/mg Bovinserum­ albmin enthielt, getan. Die Rohre und Matrices wurden wieder gespült, und der Bestimmungspuffer wurde den Rohren zugesetzt, die die 8-Flügelstäbe, Gesamtvolumen 1,5 ml, 12-Flügelstäbe, Gesamtvolumen 1,1 ml, und die überzogenen Rohre, Gesamtvolumen 1,5 ml, enthielten. Der Bestimmungspuffer war identisch mit dem vorstehend beschriebenen T4-Puffer im Beispiel 1 mit dem Unter­ schied, daß das Merthiolat weggelassen wurde und der Gehalt an Bovinserumalbumin 10 mg/ml betrug. Es wurde α-Fetoprotein den Reaktionsrohren zugesetzt, wobei eine Gesamtkonzentration von 1 ng, 2 ng, 20 ng, 200 ng und 400 ng je ml Serum auf der Basis eines Probevolumens von 0,1 ml erzielt wurden. Unmittelbar nach Zugabe von α-Fetoprotein wurden 100 µl I¹²⁵-markierter Antikörper gegen α-Fetoprotein zugesetzt, wobei eine Gesamtmenge von 40 000 cpm erhalten wurde. Das Gemisch wurde 1¼ Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Matrices entfernt und die Rohre dekantiert. Sowohl Rohre als auch Matrices wurden kurz gespült und die daran gebundene Radioaktivität in einem Gammazähler gemessen.

Die erfindungsgemäßen Flügelstabmatrices gaben unterschiedliche Reaktionen von größerer Vergrößerung bei allen Antigen-Konzentra­ tionen als mit den überzogenen Rohren beobachtet wurde, was von besonderer Bedeutung ist bei den niederen getesteten Konzentra­ tionen. Die 12-flügelige Matrix gab eine Reaktion von größerer Vergrößerung als alle Konzentrationen von getestetem Antigen und lieferte eine etwas größere Differentialreaktion.

Beispiel 7

Eine immunologische Bestimmung von Thyroxin-Stimmulierungshormon (TSH) wurde unter Anwendung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung durchgeführt. Matrices in der Form, wie sie im wesentlichen in Fig. 1 dargestellt werden, mit 18 Flügeln wurden aus gegossenem Polypropylen unter Verwendung einer Form mit polierten Oberflächen hergestellt, um den an dem Griffteil be­ festigten planen Flügeln maximale Glätte zu verleihen.

Die Matrix wurde mit Anti-TSH-Antikörper überzogen, indem man den Flügelteil 2 Stunden lang bei 37°C in 1,2 ml einer Lösung eintauchte, die etwa 1 µg gereinigten Antikörper und 10 µg Bovinserumalbumin in 0,01M Kaliumphosphatpuffer mit einem pH- Wert von 9 enthielt. Die Matrix wurde anschließend mit Wasser gewaschen und in eine 0,005%ige Lösung (V/V) von Glutaraldehyd in 0,01M Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 9,5 gegeben und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Matrix wurde nochmals mit Wasser gewaschen, dann 10 Minuten lang mit einer langsam fließenden wäßrigen Lösung von Triton-X-100, vertrieben durch Rohm und Haas Corporation (2 mg/ml) bei einem pH-Wert von 1,85 und schließlich mit Leitungswasser gewaschen und bis zum Gebrauch in phosphatgepufferter Salzlösung bei 4°C aufgehoben.

Matrices, die wie beschrieben hergestellt worden waren, wurden in Rohre eingetaucht, die 0,2 ml von TSH-Standards in Mengen, die von Rohr zu Rohr unterschiedlich waren und 0,2 ml I¹²⁵-markierten Anti-TSH-Antikörper enthielten, was eine Gesamtzählung pro Minute pro Rohr von 174 535 ergab. Eine Reaktion dieser Art, in der die mobile Komponente der Festphasen-Reaktion und der Indikator gleichzeitig mit dem Festphasen-Reaktionsteilnehmer inkubiert werden, bezeichnet man als simultane Sandwich-Be­ stimmung. Ein Satz Matrices wurde 2 Stunden lang bei 37°C und ein zweiter Satz 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 0,4 ml.

Die Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle wiedergegeben:

Die Ergebnisse der zweifachen Versuche zeigen ein hochpro­ duzierbares Reaktionssystem an. Die relativ geringe Erhöhung der Menge an gebundenem markiertem Stoff als Ergebnis einer zusätzlichen 1stündigen Inkubierung zeigt eine schnelle Reaktions­ geschwindigkeit an, bei der die meiste Bindung bereits in den ersten beiden Stunden erfolgte. Das System besitzt eine Empfind­ lichkeit, um Mengen von nur 1,5 Mikroeinheiten/ml TSH-Antigen zu messen, wärend es gleichzeitig eine Kapazität zur Messung von bis zu mindestens 100 Mikroeinheiten/ml aufweist.

Beispiel 8

Eine Bestimmung nach der konkurrierenden Methode unter Verwendung einer bevorzugten Ausführungsform einer 18-flügeligen Matrix, wie sie im Beispiel 7 beschrieben wird, wird erläutert. Die Matrix war mit Anti-Digoxin-Antikörper überzogen im wesentlichen nach dem im Beispiel 7 zum Überziehen einer Matrix beschriebenen Verfahren. Es war soviel Antikörper vorhanden, um etwa 250 ng Antikörper je Matrix zu erzielen.

Die konkurrierende Reaktionsflüssigkeit enthielt unmarkiertes Digoxin in einer Menge von 0, 0,5 und 6,0 ng/ml und 16 163 Gesamtzählungen/Minute [H³] Digoxin in 0,01M Kaliumphosphat­ puffer bei einem pH-Wert von 7,5. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 1,2 ml. Die Reaktionsflüssigkeit wurde in Gegenwart der Matrix bei 37°C oder bei Raumtemperatur während der in nachstehender Tabelle angegebenen Zeit inkubiert. Die Ergebnisse werden als % an gebundenem markiertem Digoxin ausgedrückt, wobei der Durchschnitt der Ergebnisse aus 2 Versuchen angegeben wird.

Bei der 0,5 ng/ml-Menge erhielt man einen maximalen Unterschied mit einer 90minütigen Inkubierung bei 37°C, obgleich leicht meß­ bare Unterschiede bei 10minütigen Inkubierungen entweder bei 37°C oder bei Raumtemperatur erzielt wurden.

Beispiel 9

Eine simultane Sandwich-Bestimmung für TSH, wie sie in Beispiel 7 beschrieben wurden, wurde ausgeführt unter Verwendung einer hier nicht gezeigten Parallel-Flügelmatrix mit 6 Flügeln und einem flachen Boden, die in einer nichtpolierten Form wie in Beispiel 10 beschrieben gegossen worden war.

Antikörper gegen TSH wurden durch Adsorption in 0,01M Kalium­ phosphat mit einem pH-Wert von 9,0 das 1,4 µg/ml Anti-TSH-Anti­ körperprotein und 15 µg/ml IgG enthielt, 1,5 Stunden lang bei 37°C immobilisiert. Nach der Adsorptionsperiode wurden die Matrices zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung, die 10 µg/ml Bovinserumalbumin enthielt, gewaschen.

Die Reaktion wurde in Gegenwart der angegebenen Mengen TSH durchgeführt unter Verwendung eines [I¹²⁵]-markierten Anti- TSH-Antikörper-Indikators mit Gesamtzählungen/Minute von 127 000. Der Reaktionspuffer war phosphatgepufferte Salzlösung, und die Reaktionen wurden während der angezeigten Zeiten bei 37°C durchgeführt. Um das Ablaufenlassen von und das Waschen der Vorrichtung zu erleichtern, wurde die Matrix aus der Reak­ tionsflüssigkeit entfernt, kurz abgetrocknet, indem man den flachen Boden gegen ein saugfähiges Polster drückte und dann in einem Rohr zentrifugiert, das zur Stütze der Matrix eine Glaskugel enthielt, um die letzten Spuren der Reaktionsflüssigkeit zu entfernen. Die Matrix wurde dann in einen Waschpuffer eingetaucht und das Verfahren zweimal wiederholt. Die Ergebnisse werden in nachstehender Tabelle wiedergegeben.

Obgleich das vorstehende eine der am wenigsten bevorzugten Ausführungsformen ist, ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung und das Verfahren selbst wenn sie auf diese Weise angewandt werden wirksam sind.

Beispiel 10

Eine 18-flügelige bevorzugte Matrix wie die in den Beispielen 7 und 8 verwendeten wurde unter einem Abtastelektronenmikroskop geprüft, um die Wirkung der Oberflächenglätte der bei der Her­ stellung verwendeten polierten Form zu bestimmen. Zum Vergleich wurde die Oberfläche eines Prototyps einer Matrix, die aus dem gleichen Plastikmaterial in einer unpolierten Form gegossen worden war, ebenfalls geprüft. Fig. 14a zeigt die Oberfläche der in der polierten Form gegossenen Matrix in 300facher Ver­ größerung bei einem Abtastwinkel von 45°. Fig. 14b zeigt die Oberfläche der in der nichtpolierten Form gegossenen Matrix unter den gleichen Bedingungen. Die Verwendung einer Form mit spiegelpolierten Oberflächen hat eine wesentlich verbesserte Oberflächenglätte zur Folge.

Obgleich beide Oberflächen vom sensorischen Standpunkt aus im wesentlichen glatt sind und somit innerhalb des Rahmens der Erfindung liegen, ist interessanterweise laufend festzustellen, daß die in der polierten Form hergestellte Matrix bevorzugt wird.

Die Verwendung der Matrix der bevorzugten Ausführungsform wie sie in Fig. 14a gezeigt wird hatte hochreproduzierbare Ergebnisse zur Folge mit einem geringen Hintergrund von nichtspezifischer Bindung.

Beispiel 11

Die in Beispiel 7 beschriebene Festphasen-Matrix wurde in einer enzymgebundenen immunologischen Bestimmung für Ferritin verwendet und die Ergebnisse mit denjenigen verglichen, die unter Ver­ wendung eines überzogenen Rohres erzielt wurden. Die Bestimmungs­ methode war eine Sandwich-Bestimmung, worin die 18-flügelige Matrix bzw. das Reaktionsrohr mit Antikörper gegen Ferritin über­ zogen worden waren und wobei man dieselben in einer Reaktions­ flüssigkeit, die eine Testprobe von Ferritin enthielt, reagieren ließ. Die Matrix oder das Rohr wurden dann von der Reaktionsflüssigkeit abgetrennt, gewaschen und mit einem enzym­ konjugierten Antiferritin-Antikörper inkubiert. Alternativerweise könnte eine simultane Sandwich-Bestimmung durchgeführt werden, worin die Ferritin- und Antiferritin-Antikörper-Enzymkonjugate zusammen mit dem immobilisierten Antiferritin-Antikörper inku­ biert werden. In jedem Fall gestattete die Gegenwart von Ferritin die Bindung des Antikörper-Enzymkonjugats an die Festphase in Mengen, die proportional der vorhandenen Ferritinmenge waren. Die Menge an gebundenem Antikörper-Enzymkonjugat wurde durch Einführung eines chromogenen Enzymsubstrats gemessen, wobei die Wirkung des gebundenen Enzymteils des Konjugats eine Farbänderung verursachte. Die Menge an Farbänderung war proportional der Menge an gebundenem Konjugat.

Beim Vergleich der Ergebnisse einer solchen Bestimmung unter Verwendung von entweder der 18-flügeligen Matrix oder einem überzogenen Rohr wurde festgestellt, daß bei der gleichen Inku­ bierungszeit die Verwendung der 18-flügeligen Matrix eine optische Dichte zur Folge hatte, die in der Größenordnung von 8 oder mehrfach größer war als diejenige, die bei Verwendung eines überzogenen Rohres erzielt wurde.

Claims (5)

1. Festphasen-Matrix zum Einsatz in ein Reaktionsgefäß oder in Form eines einseitig geschlossenen zylindrischen Rohres zur Bestimmung oder zum Nachweis einer mobilen Komponente in einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe, welche gleichmäßig mit einer Zusammensetzung überzogen ist, an der die zu bestimmende mobile Komponente, falls vorhanden, haften wird, gekennzeichnet durch
entweder ein vertikal sich erstreckendes Griffteil (22, 50), an dessen einem Ende eine Vielzahl von Elementen mit glatten planen oder gekrümmten Oberflächen in Form von radial sich erstreckenden Flügeln (12) mit oder ohne Aussparungen (28), ausgenommen eine Festphasen-Matrix zum Einsatz in ein Reaktionsgefäß mit Flügeln ohne Aus­ sparungen mit einem Querschnitt von der Form eines X, nach unten sich erstreckenden Zinken (54), konzentrisch zylindrischen Oberflächen (60, 62), die mit Hilfe von radial sich erstreckenden Streben (64) verbunden sind, einer radial sich erstreckenden Spiralrampe (36) oder horizontal angeordneten Scheiben (42) befestigt ist,
oder, sofern die Matrix durch ein zylindrisches Rohr gebildet ist, eine Trägeroberfläche mit einer Vielzahl an radial nach innen ragenden Flügeln, deren äußeres Ende mit der Innenfläche der Trägeroberfläche verbunden ist und deren inneres Ende ein zentral angeordnetes zy­ lindrisches Volumen bildet, in das eine Pipette einge­ setzt werden kann,
wobei die Elemente gegenseitig und gegenüber dem Griff­ teil bzw. die Flügel gegenseitig und gegenüber der Trägeroberfläche so angeordnet sind und eine derartige Größe und Form aufweisen, daß, wenn die Matrix in den Flüssigkeitsbehälter eingesetzt wird, die Matrix sich durch die Tiefe der Flüssigkeitsprobe erstreckt und daß die Elemente gleichmäßig innerhalb der Tiefe der Flüs­ sigkeit verteilt sind.

2. Festphasen-Matrix nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der radial sich erstreckenden Flügel (12) 8 bis 18 beträgt.

3. Festphasen-Matrix nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der radial sich erstreckenden Flügel (12) 16 bis 18 beträgt.

4. Festphasen-Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da­ durch gekennzeichnet, daß sie durch ein Gießverfahren unter Verwendung einer Form mit polierten Oberflächen hergestellt wurde.

5. Festphasen-Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 4, da­ durch gekennzeichnet, daß die an dem Griffteil befestigten Elemente so dimensioniert sind, daß sich die Matrix der gleichen Größe für die Verwendung in Reaktionsflüssigkeitsvolumen eignet, die mindestens um das 3fache schwanken.