SE446666B - Forfarande och anordning for bestemning av en rorlig komponent i ett i en behallare infort vetskeprov, varvid denna komponent reagerar med immobiliserad komponent applicerad pa en matris med fenliknande utsprang - Google Patents

Description

446 666 kemiska metoder icke kan skiljas från andra substanser som vanligen är närvarnade i samma reaktionsblandning. Detta innebär att enbart försvinnande avfen reaktiv komponent ur lösningen eller ackumule- ring på den fasta fasen icke kan mätas direkt. Ytterligare steg måste därför genomföras för åstadkommande av en mätbar förändring relaterad till bindningsgraden.

Två olika huvudmetoder har hittills använts. Enligt den ena, kallad konkurrernade eller indirekt immunoanalys, är den immo- biliserade komponenten närvarande i reglerad mängd och den rörliga komponenten närvarande i okänd mängd. Till den okända mängden rör- lig komponent sättes en känd mängd av samma komponent, vilken har märkts genom tillsättning av en mätbar substituent som icke stör komponentens immunologiska reaktiva egenskaper. Märkningssubstansen kan utgöras av en radioisotop, en kromofor, en fluorofor eller ett» enzym. Den mängd märkt komponent som bindes immunokemiskt till den fasta fasen beror pà mängden omärkt komponent i lösning konkurreran- de om samma bindningsställen. Ju mera omärkt komponent som är när- varande, desto mindre mängd märkt Enligt den andra huvudmetoden, kallad sandvichmetoden eller den direkta metoden, underkastas den fasta fasen innehållan- de en viss mängd immunokemiskt bunden rörlig komponent inverkan av ett reagens som också kan bindas immunokemiskt till den fasta fasen men endast på ställen redan upptagna av den immunokemiskt bundna _rörliga komponenten. Reagenset kan vara märkt, t.ex. med en radio- istop, en fluorofor, en kromofor eller ett enzym. Mängden bundet märkt reagens är ett direkt mätt pá mängden bunden rörlig komponent, som i sin tur är ett mått på mängden rörlig komponent ursprungligen närvarande i reaktionsblandningen.

Om märkningssubstansen är en radioisotop, kallas metoden för radioimmunoanalys vare sig konkurrerande eller icke-konkurrer- ande teknik användes. Om märkningssubstansen är ett enzym, kallas metoden för enzymbunden immunoanalys. Mängden enzymmärkt reaktions- komponent mätes enligt vilken som helst lämplig metod för mätning av det använda enzymets aktivitet.

Nedan anges exempel pà andra reaktioner i fast fas av den ovan beskrivna typen. Immunoradiometrisk analys för kvantitativ be- stämning av ett antigen genomföres genom att man först omsätter ett känt överskott av märkt antïkropp med den okända mängden antigen i en reaktion i homogen fas. Immobiliserat antigen i överskottsmängd tillsättes därefter för bindning av den icke omsatta, lösliga, 446 666 3 märkta antikroppen. Mängden okänt antigen bestämmas genom att man mäter skillnaden mellan den totala mängden märkt antikropp och den mängd som bindes till den fasta fasen. Denna metod ger direkt kvan- titativa resultat endast med ett envärt antigen, dvs. ett antigen som kan binda endast en antikroppmolekyl.

Enzymkatalyserade reaktioner genomföres lämpligen i fast fas. Ett enzym immobiliserat på en fastfasmatris kan användas för kvantitativ bestämning eller kvalitativt pávisande av substratet för enzymet i ett prov av biologiskt material. Mjölksyra i serum kan t.ex. bestämmas med användning av en matris belagd med mjölk- syradehydrogenas. På liknande sätt kan karbamid bestämmas genom användning av en fastfasmatris uppbärande immobiliserat ureas. För- utom vid kliniska tillämpningar kan enzymanalyser användas för kva- litetskontroll vid industriella processer och även för genomförande av processteg. Immobiliserat penicillinas kan t.ex. användas för över- vakning av kvaliteten på ett penicillin under tillverkningen därav.

Immobiliserade proteaser eller nukleaser kan användas för att av- lägsna eller inaktivera förorenande proteiner eller nukleínsyror.

Insättningsmatriserna enligt uppfinningen kan bekvämt avlägsnas vid vilket som helst lämpligt reaktionssteg så att graden av den önska- de reaktionen lätt kan regleras.

Närvaro av ett kliniskt viktigt enzym i ett prov av bio- logiskt material kan också påvisas genom användning av ett substrat för enzymet nnnobiliserat på en fastfasmatris. Ett exempel på en dylik analys är den metod som beskrivas i den amerikanska patent- ansökan 795 497. Ett annat exempel på användning av immobiliserade substrat vid enzymanalyser är bestämning av lysozym, där radioaktivt märkt Micrococcus lysodeikticus är kovalent bunden pà ytan av en fastfasmatris.

Andra exempel pà användbara reaktioner i fast fas är specifika bindningsreaktioner med vissa proteiner. Såsom exempel kan nämnas ß-daktoglobulin som specifikt binder folinsyra, speci- fika receptorproteiner i stånd att binda hormoner, såsom den från bröstkancertumörceller hos råttor isolerade receptorsubstans som specifikt binder prolaktin, och den mångfald växtproteiner, t.ex. concanavalin A, som specifikt kan binda vissa kolhydrater.

Vanliga kemiska reaktionskomponenter kan användas i fast- fasreaktioner. Man kan t.ex. använda reaktionskomponenter kapabla att bilda färgade komplex, såsom bildning av glykosylderivat eller diazokoppling till ett reagens immobiliserat pà ytan av en fastfas- 446 666 matris, antingen separat eller i kombination med en enzymkatalyse- rad reaktion, så att en färgförändring äger rum på matrisens yta. Även jonbytesreaktioner kan bekvämt genomföras med användning av en fastfasmatris enligt. uppfinningen. Ovanstående exempel är en- dast illustrerande, och andra möjligheter är uppenbara för fack- mannen.

Vid dylik fastfasteknik immobiliseras det (de) använda reagenset (reagensen) vanligen genom beläggning på eller bindning till fastfasmaterialet, antingen genom adsorption eller genom ko- valent bindning, varefter fastfasmaterialet nedsänkes i det prov som skall analyseras. Olika metoder för koppling av reagens till fastfasmaterial är kända; se t.ex. de amerikanska patentskrifterna 3652 761, 3879 262 och 3896 217.

Såsom icke begränsande exempel på vanligen använda fast- fasmaterial kan man nämna glasrör och polymerrör, vilka belägges med ett eller flera reagens på innerytan;polymerbelagda stänger; mikro- och makropärlor framställda av polymerer, glas eller porösa material.

Immunokemiska analyser är mycket användbara vid medicinsk forskning och vid ställande av diagnoser. Dessa analyser är mycket specifika på grund av att antigen-antikropp-reaktioner är mycket selektiva. Antigen-antikropp-bfndningen är mycket fast, så att när bindningsreaktionen väl har ägt rum bestämmes påvisbarhetsgränsen av möjligheten att påvisa märkningssubstansen. Immunokemiska ana- lyser är ytterst mångsidiga på grund av att de kan användas för att bestämma specifika substanser selektivt mot en bakgrund av kemiskt liknande substanser. På grund av dessa fördelaktiga egenskaper har ett omfattande arbete nedlagts på att förbättra immunokemiska ana- lysers praktiska genomförande, känslighet, noggrannhet, snabbhet och användbarhet. Utvecklingen av immunoanalyser i fast fas har varit ett av de viktigaste framstegen inom detta område.

En av fördelarna med fastfassystem är att reaktionspro- dukten eller reaktionsprodukterna kan separeras från reaktionslös- ningen med relativ lätthet, dvs. genom fysikaliskt avlägsnande av fastfasmaterialet. Vid icke-fastfasreaktioner eller homogena reak- tioner erhålles däremot vanligen en homogen lösning, vilken kräver mera invecklade separationsmetoder.

Införandet av fastfasteknik har möjliggjort genomförande av nya processer, vilka har varit ytterst svåra att genomföra i fri 446 666 5 lösning. Ett exempel härpå är den ovan beskrivna sandwichtekniken.

Denna teknik skulle kräva ett stort överskott av en av reaktions- komponenterna för att kunna genomföras i homogen lösning. Ännu vik- tigare är att separation av det första antigen-antikropp-komplexet från en homogen lösning kräver användning av invecklade fysikalisk- kemiska metoder, särskilt om antigenet är relativt litet jämfört med antikroppen och molekylviktsskillnaden är liten mellan den fria antikroppen och den komplexbundna antikroppen. Vid användning av fastfassystem är däremot separationsprocessen ytterst enkel. En av huvudfördelarna med fastfastekniken, nämligen lättheten att separe- 'ra de fasta och de flytande faserna, bringas till ett maximum vid genomförande av förfarandet enligt uppfinningen genom användning av ytterst enkla organ för separation av faserna. Detta beskrives längre fram i beskrivningen. Även om fastfasteknkken i teorin uppvisar många fördelar jämfört med analys i fri lösning eller homogena system, har den dock vissa begränsningar, huvudsakligen beroende på de fastfaskon- fïâurationer som hittills har använts. Eftersom minst ett av rea- gensen i ett fastfassystem är effektivt immobiliserat genom bindning till den fasta fasens yta, är rekatbnshastigheten i fastfassystem :::1íí:ïi::šr:nä:a:i:0ï0Efin:dsystem (fria lösningar). Vidare finns fasens yta varvid de:nananb' âeñgens som kan blndas på den fasta ' maxlmlmaflåd b@r0P på den specifika ytan, På Peaåensets renhet 00h Då den Specifika procedur som användes för ä: :lïïšßefi på ytan. optimalt bör så mycket som möjligt av alets Yta belaggas så att reaktionshastigheten ökar och reaktionstiden minskar. _ De först använda fastfassystemen var provrör belagda på Ü::::::::¿e§á:::ne::ï::lKïa kommersiella belagda rör kan man nämna USA; "Rianen" från New En~:ned šstruments, Sunnyvale, Kalifornien, setts, USA. och de rör sos :n K uclear, Northßillerica, Massachu- ten 3 867 gl? Även om beïa es rives i den amerikanska patentskrif. - gda ror har visat sig vara användbara, ger de icke alla de fördelar som kan uppnås med fastfassystem. En huvudnackdel är att förhållandet yta/volym är relativt litet, och rïaktionskinetiken kan ytterligare hindras genom att den reaktiva ïian ar belagen vid gransen av losningens volym, vilken gräns kan gga relativt lângtírån losningens huvudmassa. Det genomsnittliga avståndet mellan de rörliga reaktionskomponenterna och den reaktiva ytan är därför stort. Dessutom maste varje provrör belägga; sepa_ 446 666 6 rat under statiska betingelser, och detta villkor medför att mäng- den beläggningsmaterial varierar från rör till rör, något som med- för varierande analysresultat. Den anbragta beläggningen kan vara olikformig och även diskontinuerlig, så att nâgra areor av potenti- ellt reaktiv yta kan sakna beläggning medan andra kan vara alltför kraftigt belagda för att optimal reaktivitet skall uppnås. I båda fallen minskas den yta som är tillgänglig för reaktion med den rör- liga komponenten, vilket medför försämrad känslighet och reprodu- cerbarhet. Den satsvisa metoden för beläggning av rör är också re- lativt dyrbar. Reaktioner genomförda i belagda rör utsättes för fel förorsakade av konvektion i reaktionsfluiditet. Konvektion kan medföra att resultaten varierar med så mycket som en tiopotens.

Försök att förbättra belagda rör har lett till ett fler- tal system med ökat förhållande yta/volym hos fastfassystemet. man har sålunda åstadkommit mycket veckade ytor, minskat den erforder- liga vätskevolymen och framställt ytor av finfördelat material.

"SPAC"-systemet från Mallinkrodt Chemical Company ör ett belagt rörsystem med veckade ytor som ger ökad specifik yta. Rören är dessutom försedda med en löstagbar undre sektion, vilken kan satsbeläggas för att man skall uppnå större likformighet från rör till rör, Till följd av denna satsbeläggning av rörbottnarna kommer såväl utsidan som insidan av rören att bli belagd. Detta gör det svårt för laboratorieteknikern att arbeta med rören utan att komma i kontakt med beläggningsmaterialet på utsidan, och värdefulla im- munologiska raktionskomponenter går förlorade. Den veckade ytan säges öka den tillgängliga reaktiva ytan 3-4 gånger. Den reaktiva ytan förblir emellertid vid lösningens periferi, och man uppnår icke optimal geometri vad beträffar den genomsnittliga diffusions- sträckan från lösningen till den reaktiva ytan. På grund av ytans speciella struktur kan det vara svårt atttvätta ytan fri från föro- renande ämnen. "SPAC"- systemet är liksom rörsystem i allmänhet känsligt för konvektionsströmmar som kan ge stora fel (se ovan).

Konventionen kan minskas genom att reaktionen genomföres 1 ett bad med konstant temperatur. Denna teknik medför emellertid behov av ytterligare utrustning. Vid bestämning av haptenantigener är systemet dessutom icke optimalt, om reaktionen genomföras vid 57°C enligt tillverkarens rekommendationer. Det har visats, att en ökad tempe- ratur vid vissa antikropp-hapten-reaktioner tenderar att öka dissoeiationshastigheten för antikropp~hapten-komplexet i förhåll- 446 666 7 ande till bildningshastigheten; se Smith, T.W. och Skubitz, K.M. , Biochemistry, 14, 1496 (1975) och Keave, P.M., Walker, W.H.C.

Gauldie, J. och Abraham, G.E., Clin. Chem. 22, 70 (1976).

Olika typer av fastfasmatriser avsedda att införas i reaktionsfluidet har beskrivits. I den amerikanska patentskriften 3 951 748 beskrives t.ex. en veckad eller svampliknande matris av- sedd att införas i provlösningen. Denna matris har relativt stor specifik yta, men den kan vara svar att tvätta ordentligt efter av- slutad reaktion. Dessutom är ett dylika system i praktiekn begränsat till användning av sådana reagens och reaktionskomponenter som är relativt lätta att eluera från den svampliknande matrisen. Svamp- liknande matriser har vidare en tendens att reagera fullständigt med endast en del av reaktionsfluidet, dvs. med den del som tränger in i porerna.

En annan typ av matris, vid vars användning reaktions- fluidet utbredes i ett tunt skikt över den belagda matrisytan, be- skrives i de amerikanska patentskrifterna 3 826 619 och 3 464 798.

Båda dessa skrifter beskriver en kombination av en behållare och en insättningsmatris med sådan form, att den pressar ut reaktions- vätskan i ett tunt skikt mellan behállarväggen och matrisytan. In- sättningsmatrisen måste passa exakt i behållaren, och volymen reak- tionsvätska måste regleras noggrant, eftersom variationer ogynnsamt skulle påverka analysens reproducerbarhet. Apparaten enligt USP 3 826 619 är avsedd enbart för kvalitativ, direkt immunologisk ana- lys. Eftersom reaktionslösningen utpressas i ett tunt skikt av insätt- ningsmatrisen, mäste reaktionsvolymen med nödvändighet vara liten, och i USP 3 826 619 anges att den beskrivna anordningen är avsedd för små volymer outspätt serum. En av nackdelarna med denna typ av analys är att antigen-antikropp-reaktionernas hastighet kan va- riera till följd av variationer i det outspädda serumets pH-värde; detta pH-värde kan variera mellan 6 och 9 i kliniska prov. pH-värdet kan regleras genom tillsättning av buffert, men buffert- saltkoncentrationer högre än O,lM tenderar att dissociera antigen- antikropp-komplex. Därför måste man använda en stor volym buffert med låg jonstyrka för noggrann reglering av pH-värdet, och detta kan öka reaktionsvolymen i oacceptabel grad. Fel pá grund av olämp- ligt pH-värde kan tolereras vid kvalitativa analyser, särskilt vid analys av prover innehållande den substans som skall påvisas i hög koncentration, men icke vid sådana kvantitativa analyser som före- 446 666 8 liggande uppfinning avser. Om utspädning med buffert erfordras, kan en låg koncentration av det ämne som skall påvisas leda till ut- spädning bortom detektionsnivån, vilket kan leda till falska nega- tiva resultat. En utföringsform av ínsättningsmatrisen enligt USP 3 826 619 är en fenförsedd insättningsmatris, som något liknar ut- föringsformen med 4 fenor enligt föreliggande uppfinning. Denna kända matris är avsedd för kvalitativ analys, när stora mängder serum är tillgängliga, men det anges icke att den kan användas på något annat sätt än den runda eller koniska utföringsformen, dvs. för tunnskiktsanalys. De anordningar som beskrives i USP 3 826 619 har icke tillverkats kommersiellt.

En annan känd matristyp är "StiQ" från International Diag- nostic Technology Corporation, Santa Clara, Kalifornien, USA, vilken är avsedd att användas vid den analysmetod som beskrives i den amerikanska patentskriften 4 020 151. Härvid användes en skiv- formad, obelagd insättningsmatris av ett material som kan adsorbcra proteiner ur serum. Begränsningarna med detta system beror icke en- bart på ogynnsamma geometriska förhållanden eller ogynnsamt förhåll- ande yta/volym utan beror huvudsakligen på problem förknippade med det inledande adsorptionssteget, såsom närvaron av störande substan- ser och svårighet att erhålla mätbar adsorption av komponenter när- varande i låg koncentration.

Ett annat försök att öka förhållandet yta/volym genom minsk- ning av reaktionsvolymen beskrives av Friedel,R, och Dwenger, A. i Clin. Chem. 21, 967 (1975). Härvid belägges kapillärrör på insidan med ett specifikt adsorptionsmedel, och reaktionsblandningen införes i kapillärrören.

Ett system som ger en stor specifik yta per volymsenhet är belagda mikroglaspärlor, såsom "Immo Phase" från Corning Glass Works. Detta system är ett exempel på användning av finfördelade partiklar. Man använder en stor belagd yta och uppnår en hög reak- tionshastighet. På grund av sedimentering av partiklarna under reaktionen kräver en optimering av detta system att de provrör, vil- ka under reaktionen innehàller partiklarna, tillslutes och omskakas vertikalt under reaktionen för att alla ytorna skall komma i kon- takt med reaktionskomponenterna. Användning av partiklar kräver dessutom flera centrifugeringar och tvättningar för att man skall erhålla en fullständig separation av den immobiliserade.produkten från reaktionskomponenterna i lösningen. Ytor av glaspartiklar har den ytterligare nackdelen, att det sker en större icke-specifik bind- 446 666 - 9 nina av proteiner :iii glas än :111 plast.

Tidigare försök att förbättra fastfasmatriser, såsom belagda ror, har vanligen lett till en viss förbättring av reaktionshastig- heten eller reaktionstiden, men en dylik förbättring har vanligen àtfoljts av en besvärligare analysprocedur eller en försämrad flexi- bilitet. Enligt föreliggande uppfinning åstadkommas både ett större förhållande yta/volym och en förbättrad reaktionskinetik. Dessutom förbättras màngsidigheten och förenklas analysproçeduren.

Såsom exempel på teknikens ståndpunkt kan man även nämna den amerikanska patentskriften 3 206 602, vilken dock icke beskriver någon fastfasmatris.

Enligt föreliggande uppfinning àstadkommes ett förfarande för bestämning av en rörlig komponent i ett i en behållare infört vätskeprov, varvid den rörliga komponenten reagerar med en immo- biliserad komponent på en inuti vätskeprovet nedsänkt, handtags- försedd insats i behållaren. Detta förfarande kännetecknas av att den immobiliserade komponent som användes har applicerats i form av en fastsittande likformig beläggning pá minst 8, företrädes- vis 8-18 från insatsens handtag radiellt åt olika håll utskjutande fenor med släta ytor och med stora dimensioner i förhållande till behållarens inre utrymme, att den genomsnittliga diffusions- sträckan för den rörliga komponentens molekyler till de med den immobiliserade komponenten belagda fenytorna blir avsevärt mindre än den genomsnittliga diffusionssträckan till behållarens inner- ytor i frånvaro av insatsen; och att man mäter en genom komponen- ternas reaktion pá dessa fenytor uppkommen kemisk, enzymatisk el- ler immunokemisk förändring såsom mått pá den rörliga komponentens koncentration i provet.

Uppfinningen avser även en anordning för bestämning av en rörlig komponent i ett vätskeprov, omfattande en behållare för vätskeprovet, företrädesvis ett provrör, och en i vätskeprovet i behållaren nedsänkbar handtagsförsedd insats, som uppbär en immo- biliserad komponent, avsedd att reagera med den rörliga komponen- ten. Denna anordning kännetecknas av att insatsen i och för bestämning av den rörliga komponentens koncentration omfattar minst 8, företrädesvis 8-18 från insatsens handtag åt olika håll utskjutande fenor, som har släta ytor, uppbär den immobiliserade komponenten i form av en fastsittande likformig beläggning och har så stora dimensioner i förhållande till behållarens inre ut- rymme, att den genomsnittliga diffusionssträckan för den rörliga 446 666 10 komponentens molekyler till de med den immobiliserade komponenten belagda fenytorna blir avsevärt mindre än den genomsnittliga dif- fusionssträckan till behâllarens innerytor i frånvaro av insatsen.

Fördelarna med uppfinningen är att tidsfel vid påbörjande och avbrytande av reaktionen elimineras, vidare att reaktionshastigheten är hög, att fel vid volym- överföring minskas, att mätfelen blir mindre vid en given känslig- het, och att manipulerandet förenklas. Den höga reaktionshastighet som kan uppnås med de föredragna utföringsformerna gör det möjligt att genomföra immunokemiska analyser vid rumstemperatur eller lägre temperatur, något som kan vara fördelaktigt jämfört med högre tempe- raturer för reaktioner som närmar sig jämvikt. Anordningen enligt uppfinningen är enkel att tillverka och följaktligen billig.

Många olika matriser kan konstrueras enligt de principer som anges i föreliggande beskrivning. De väsentliga kännetecknen är att ma- trisen innefattar ett handtag och ett flertal huvudsakligen släta, plana eller krökta ytor fästade vid handtaget, varvid dessa ytor är anordnade på sådant sätt och har sådan form och storlek i förhållan- de till reaktionsvätskan, att införande av matrisen däri minskar den genomsnittliga diffusionssträckan för den rörliga komponentens molekyler till matrisytorna jämfört med den genomsnittliga diffusions- sträckan till reaktionskärlets innerytor i frånvaro av matris. De specifikt beskrivna utföringsformerna anges endast såsom exempel och är icke avsedda att begränsa uppfinningen. En given matrisform kan men behöver icke vara utformad i överensstämmelse med storle- ken och formen hos det reaktionskärl, i vilket matrisen skall in- föras. Vidare erfordras ingen finpassning inuti reaktionskärlet.

Matrisen måste naturligtvis sträcka sig i huvudsak längs hela höjden av vätskeprovet. I några system sträcker sig matrisytan företrädes- vis ovanför reaktionsvätskans yta, varigenom man åstadkommer ett i 446 666 ' 11 huvudsak konstant geometriskt förhållande längs vätskeprovets hela höjd och desutom säkerställer att samma geometriska förhållande kom- mer att ràda oberoende av eventuella förändringar i vätskevolymen.

Föredragna anordningar med en given storlek är t.ex. lika lämpade för olika analyser där reaktionsvolymerna áciljer sig åt med upp till 3 gånger.

En alternativ utföringsform av en fastfasmatris enligt upp- finningen användbar vid kemiska, enzymatiska och immunokemiska ana- lyser är speciellt användbar i samband med automatisk pipetterings- utrustning. Denna matris kan också användas för genomförande av van- liga manuella satsanalyser. Matrisen har en sluten bäraryta som av- gränsar en brunnliknande volym, vari ett vätskeprov kan anbringas när matrisen placeras i en behållare, såsom ett provrör. Ett fler- Ital inâtriktade organ bildar företrädesvis ett enhetligt stycke tillsammans med den slutna bärarytan. Den innersta änden av dessa inåtriktade organ avgränsar en centralt belägen cylindrisk volym, 1 vilken man kan insätta en automatisk pipetteringsanordning för införande och uppsugning av vätskeprov.

Användning av den föredragna fenförsedda matrisen har i nâgra fall resulterat i en oväntad och ännu oförklarad ökning av reaktionshastigheten utöver vad som kunde förutses på basis av den specifika ytan. Efter upptäckten av att geometriska faktorer påver- kar reaktionshastigheten har det blivit viktigt att säkerställa likformig fastfasgeometri.frán ett prov till ett annat för att säk- ra resultat skall erhållas. Anordningarna enligt uppfinningen ger dylik likformighet och bidrager dessutom till att eliminera mänsk- liga och mekaniska fel, såsom variationer i omrörningshastighet, tidsfel, konvektionoch liknande.

Vid förfarandet enligt uppfinningen genomföres en fastfas- reaktion med användning av en eller flera reaktionskomponenter fixe- rade pà ytan av en matris nedsänkt i reaktionsvätskan. Såsom exem- pel beskrives reaktioner genomförda i provrör, i vilka matriser in- sättes. Reaktionen startas genom att en matris införes i ett prov- rör innehållande den rörliga komponenten, och reaktionen avbrytes genom avlägsnande av matrisen. Eventuellt kan reaktionen igàngsät~ tas på nytt genom förnyat införande av matrisen, eller en andra reaktion kan startas genom införande av en ny matris uppbärande en andra fixerad komponent. Matrisen kan eventuellt placeras i ett andra provrör innehållande ett reagens, eller den kan direkt över- 446 666 12 föras till en kammare för radioaktivitetsräkning eller till någon annan mätutrustning beroende på naturen av analysmetoden.

Kinetiken för fastfasreaktioner är mera komplex än kineti- ken för reaktioner i homogen fas. En detaljerad teoretisk grund för optimering av insättningsmatrisens konstruktion är icke till- gänglig. Vissa grundläggande fakta av allmän natur kan man dock ta hänsyn till. Den totala arean i kontakt med lösningen är en viktig faktor. Ju större denna area är, desto större mängd fixerad komponent kan delta i reaktionen. En ökning av den verksamma koncentrationen av endera komponenten ökar vanligen den totala reaktionshastigheten.

Eftersom mängden fixerad komponent bland annat bestämmes av den fasta fasens area, varierar reaktionshastigheten direkt med förhål- landet yta/volym. Ett ökat förhållande yta/volym uppnås enligt upp- finningen medelst en insättningsmatris, som har en süirre yta än provrörets inneryta. En annan faktor som möjligen_påverkar reak- tionshastigheten är det genomsnittliga diffusionsavstàndet mellan den rörliga och den fixerade reaktionskomponenten. Med "det genom- snittliga diffusionsavståndet" avses summan av de sträckor, som varje molekyl rörlig komponent måste diffundenför att längs kortaste möjliga väg nå en fixerad komponent, dividerad med det totala an- talet dylika molekyler. Matriserna enligt uppfinningen är konstru- erade så att det genomsnittliga diffusionsavståndet mellan moleky- lerna av den rörliga komponenten och en komponent fixerad på ma- trisens ytor är avsevärt mindre än det genomsnittliga diffusions- avståndet när den fixerade komponenten i stället häftar vid reak- tionskärlets innerytor och ingen insättningsmatris är närvarande. Överföring av rörliga komponenter till de reaktiva ytorna an- tages underlättas genom en minskning av genomsnittsavstàndet mel- lan de rörliga komponenterna och de reaktiva ytorna. Ökade reak- tionshastigheter har iakttagits vid använining av insättningsma- triserna enligt uppfinningen (se utföringsexemplen).

I ett antal fall har man överraskande funnit, att den er- hållna ökningen av reaktionshastigheten var större än vad som kun- de förväntas på basis av det ökade förhållandet yta/volym. Reak- tionerna har också visat sig nå jämvikt snabbare vid användning av fenförsedda matriser än vid användning av belagda rör. Även om dessa fenomen icke är väl karakteriserade ellerkvañtifierade, synes de observeras oftare och tydligare vid användning av fenförsedda 446 666 13 matriser med ett större antal fenor.

Den ökade reaktionshastigheten och det snabbsre uppnáendet av jämvikt observeras med tillräcklig frekvens (även om dessa fe- nomen icke alltid uppträder) för att motivera antagandet att an- dra geometriska faktorer än matrisens specifika yta signifikant kan påverka fastfasreaktioners hastighet. Användning av matriser enligt uppfinningen förväntas därför ge gynn_samma reaktionshastigheter för fastfasreaktioner i allmänhet. Det inses lätt att praktiska överväganden~kan bestämma en övre gräns för det antal separata ele- ment, såsom fenor, som kan fästas vid matrisens handtag. Elementen bör t.ex. icke sitta alltför tätt, ty då kan kapillärkrafter för- orsaka att reaktionsblandning kvarhålles mellan elementen, något som försvårar tvättning och dränering. Om en fenförsedd stång skall framställas genom formning, kan dessutom antalet fenor begrän- sas av möjligheten att tillverka en form med önskat antal fenor.

Den genom dylika hänsyn påtvingade övre gränsen beror på matrisens storlek och det ändamål för vilket den skall användas. För matri- ser avsedda att användas i reaktionsvolymer av storleksordningen 1 ml är det föredragna antalet fenor minst 8. I en särskilt före- dragen utföringsform användes 18 fenor anordnade radiellt omkring ett centralt handtag.

Uppfinningen medför även andra fördelar. Ökningen av den totala ytan gör det möjligt att genomföra kvantitativa bestämning- ar inom ett brett koncentrationsintervall för den rörliga komponen- ten på grund av ökad detekterbarhet i den undre delen av konoen- I trationsintervallet och ökad bindningskapacitet, så att en proportio- nell respons är möjlig vid högre koncentrationer av den rörliga komponenten. Dessutom kan matriserna enligt uppfinningen användas för genomförande av kvantitativa analyser enligt den direkta me- toden (sandwichmetoden). För denna användning är den ökade bind- ningskapaciteten hos matriserna enligt uppfinningen nödvändig för immobilisering av material över hela intervallet av möjliga kon- centrationer, mera än vad som erfordras för enkla "ja-nej" -försök (se amerikanska patentskriften 3826 619). Enligt en föredragen ut- föringsform av uppfinningen (se exempel 7) kan man kvantitativt bestämma antigenkoncentrationer inom ett brett intervall vid immu- nuanalys enligt sandwichmetoden. Vid immunoanalyser av konkurrer- ande typ bestämmas analysomràdet av en komplex växelverkan mellan matrisgeometrin, mängden och fördelningen av antikropp immobiliserad 446 666 14 på matrisytan och immobiliseringsmetoden. Antalet, placeringen, storleken och formen av matrisens ytelement påverkar den immuno- kemiska reaktionens kinetik, som i sin tur påverkar den mängd immo- biliserad komponent som erfordras för att ge en differentiell respons pá den mängd rörlig komponent som skall mätas. Den bundna komponentens stabilitet och likformigheten av denna komponents för- delning är andra parametrar som påverar den belagda matrisens ut- formning. Fördelaktiga resultat erhålles vid konkurrerande immuno- analys med användning av belagda matriser enligt uppfinningen genom att det är möjligt att reglera alla väsentliga faktorer som påver- kar känslighet, analysomráde och reproducerbarhet. Vid förfarandet enligt uppfinningen användes dessutom en tillräckligt stor reaktions- volym för att ett serumprov skall kunna utspädas med buffert för reglering av pH-värdet och minskning av fel beroende på variationer i pH-värdet eller andra faktorer, såsom proteinkoncentrationen, från prov till prov. Dessutom kan en konstant provvolym åstadkommas. An- ordningarna enligt uppfinningen är icke begränsade till användning i en enda bestämd reaktionsvolym, eftersom de icke är beroende av finpassning med reaktionskärlet. Reaktionskärlet behöver icke ha speciell form eller storlek. Matrisen enligt uppfinningen behöver icke passa exakt i reaktionskärlet eller ens vidröra kärlets väggar Matriselementen med släta, plana eller krökta ytor bör væa jämnt anordnade längs höjden av reaktionsvätskan och i nâgra system före- trädesvis sträcka sig ovanför vätskeytan för att ge ett i huvud- sak likformigt geometriskt förhållande mellan den rörliga komponen- tens molekyler och matrisytorna vid olika stora vätskevolymer.

Vid både direkt och indirekt immunoanalys beror den erfor- derliga reaktionstiden på den hastighet, med vilken reaktionen när- mar sig jämvikt. Vid förfarandet enligt uppfinningen nås jämvikt snabbare än vid konventionell analys i belagda provrör, varför den erforderliga reaktionstiden är kortare. Vid användning av en ma- atris enligt uppfinningen kan man desutom mycket exakt påbörja och avbryta reaktionen. Denna fördel blir betydelsefull, när det är nödvändigt att genomföra ett stort antal analyser samtidigt. I dy- lika fall minskas till ett minimum den manipuleringstid som åtgår för att starta och stoppa reaktionen, och reaktionstiden kan regleras exakt för alla proverna 1 en serie. Detta är en stor fördel jämfört med användning av belagda rör, vilka mäste dekanteras, svamplik- 446 666 15 nande matriser, vilka måste urpressas för avlägsnande av de sista spåren reaktionsblandning, och partikelfcrmigt material, som måste centrifugeras och dekanteras.

En ytterligare fördel beroende pà den ökade reaktionshas- tighetnaoch matrisernas ökade kapacitet är att samma matris kan användas för både sandwichanalyser och konkurrernade analyser. Vid användning för kvantitativ konkurrernade analys ger matrisen enligt uppfinningen ett proportionellt reaktionsgensvar inom ett brett koncentrationsintervall.

Den geometriska konfigurationen av matriserna enligt upp- finningen medför ytterligare fördelar. Såsom ovan har angivits resulterar användning av matriserna i en tydlig ökning av reak- tionshastigheten som icke kan tillskrivas den ökade ytan. Även om detta fenomen hittills icke har kunnat förklaras, antages det att en serie plana eller krökta ytor sträckande sig i hela vätskeprovets höjd minskar det genomsnittliga avståndet mellan rörliga komponenter och fixerade komponenter fördelade på nämnda ytor och att denna minskning medför en högre total reaktionshastighet. Förutom högre reaktionshastighet och därmed sammanhängande fördelar ger anordning- en enligt uppfinningen mera likformiga resultat. Det geometriska sambandet mellan den rörliga och den fixerade komponenten är kon- stant och reproducerbart från försök till försök i motsats till när man använder partikelformiga fasta faser, där partiklarna har en tendens att sedimentera med en hastighet som beror på partikel- storleken och partikelstorleksfördelningen. Förfarandet enligt uppfinningen är mindre känsligt för konvektionsfel, som är ett stort problem vid användning av belagda rör. Anordningarna enligt uppfinningen är försedda med i huvudsak släta ytor, vilka möjlig- gör snabb dränering av reaktionsblandningen när matrisen upptages ur lösningen. Denna egenskap gör det möjligt att snabbt avbryta re- aktionerna, förenklar eller eliminerar tvättningssteg samt minskar eventuella föroreningsrisker när radioisotoper användes. Manga möje liga mänskliga felkällor elimineras härigenom. Man föredrager att an- vända matriser med maximal ytjämnhet tillverkade genom formning, var- vid formytorna poleras till spegelglans. Maximal ytjämnhet kan upp- nås genom att matrisen formas av plast i en form med ytorna polera- de till spegelglans. Att fördelar 446 666 16 uppnås med maximalt släta ytor kan synas oväntat, eftersom ojämna ytor ger en större specifik yta. Dylika maximalt släta ytor användes emellertid i en föredragen utföringsform av anordningen för att maximera avlägsnandet av reaktionsvätska från matrisytorna och mi- nimera icke-specifika bakgrundsstörningar.

Av ovanstående framgår att utformning av en riktigt funge- rande matris kräver uppmärksamhet på alla de faktorer och variabler som påverkar den reaktion som skall genomföras. Förutom att åstad- komma en matris som ger ökad reaktionshastighet, driftfördelan mi- mala bakgrundsstörningar och alla andra fördelar med uppfinningen är det viktigt att åstadkomma en belagd yta med immobiliserad reak- tionskomponent fördelad på sådant sätt att dess reaktivitet är maximal. Den immobiliserade komponenten bör fördelas så likformigt som möjligt över ytan. Man måste undvika luckor i beläggningen; dylika luckor kan förorsakas av t.ex. luftbubblor belägna på ma- trisytan under beläggningssteget. Molekylerna av den immobilisera- de komponenten måste exponeras på matrisytan och får icke begravas i överskott av reaktionskomponent eller annat bärarmaterial. Den immobiliserade komponenten bör företrädesvis vara tillräckligt starkt bunden till matrisen för att icke en märkbar mängd av denna komponent skall desorberas eller på annassätt avlägsnas under inku- berings- och tvättningsstegen.

Utföringsformer försedda med ett flertal individuella ut- skjutande ytor, såsom fenor eller pinnar, kan användas för genom- förande av flera analyser samtidigt, om olika fenor belägges med olika material (olika immobiliserade komponenter). Den utförings- form som visas i fig. 3 är särskilt lämpad för dylika ändamål.

Pinnarna eller stavarna kan vara individuellt fästbara och löstag- bara sâ att man kan genomföra en kombination av önskadeznalyser i ett enda reaktionssteg och därefter mäta resultaten individuellt.

Förutom de ovan angivna fördelarna med de nya insättnings- matriserna vid kvantitativa analyser existerar också produktions- fördelar av kommersiell betydelse. Man kan särskilt immobilisera den fixerade komponenten på ett stort antal matriser samtidigt, an- tingen satsvis eller kontinuerligt. Detta ger likformiga produkter till lågt pris.

En utföringsform av matrisen enligt uppfinningen är lämplig att använda i kombination med en automatisk pipetteringsapparat. 446 666 17 Denna utföringsform saknar handtag och har i stället en bäraryta avgränsande en cylindrisk, brunnliknande volym, vilken fylles med vätskeprov när matrisen placeras i ett provrör. Ett flertal radiellt inåtriktade organ har sin ytterände fästad vid bärarytans insida.

De inåtriktade organen och bärarytan är företrädesvis framställda i ett stycke genom formpressning eller strängpressning. Alternativt kan de framställas i_separata stycken, vilka fästes vid varandra genom någon lämplig hopfogningsteknik, såsom spont och not, eller med hjälp av bindemedel. Organens innerändar avgränsar en centralt belägen oylindrisk volym, vilken gör det möjligt att snabbt införa (och även avlägsna) en automatisk pipetteringsapparats sond ända till botten av ett provrör innehållande matrisen. De radiellt inåt- riktade organen är anordnade i plan som skär den centralt belägna cylindriska volymens mittaxel. Ju större antalet dylika organ är, desto större är den reaktiva arean och desto snabbare sker reak- tionen med de praktiska begränsningar som ovan har diskuterats i samband med matrisen i form av en fenförsedd stäng. Alternativt kan matrisens ena ände vara tillsluten till bildning av ett rör med inàtriktade organ, vars fria ändar avgränsar en central volym, i vilken en pipett kan införas.

Matriserna enligt uppfinningen kan också användas i indu- striella laboratorier för genomförande av kemiska eller enzymkataly- serade rutinanalyser (t.ex. kvalitetskontroll) som kan genomföras i fastfassystem. Dessutom kan matriserna användas vid kontinerliga eller diskontinuerliga processer, där man önskar avlägsna en speci- fik substans ur en reaktionsblandning. Matriser belagda med jonbyta- re kan t.ex. användas för att avlägsna specifika joner ur lösningar, och specifikt adsorberande proteiner immobiliserade på matriser enligt uppfinningen kan användas för att avlägsna föroreningar, såsom spårmetaller, ur produktionsströmmar. Konventionella katalysatorer kan anbringas på ytorna av de beskrivna insättningsmatriserna för kontinuerlig omvandling av reaktionskomponenter, behandling av av- lopp och liknande. Matriser enligt uppfinningen avsedda att passa till reaktionskärl av lämplig storlek kan användas för processer i industriell skala eller laboratorieskala. Fastfasreaktioner med gasformiga reaktionskomponenter, àngor, aerosoler, partikelsuspen- sioner och liknande kan också genomföras. Matriserna enligt uppfin- ningen kan vara speciellt användbara i strömmande system, vari man önskar genomföra reaktioner utan att minska strömningshastigheten 446 666 18 eller införa ett mottryek.

Uppfinningen beskrives närmare nedan under hänvisning till den bifogade ritningen, på vilken fig. l visar den föredragna ut- föringsformen av en fastfasmatris enligt uppfinningen; fig. 2 visar en modifikation av utföringsformen i fig. l innefattande ett flertal hålför ökning av den reaktiva arean; fig. 3 visar en annan utförings- form innefattande ett flertal nedàtriktade pinnar; fig. 4 visar en utföringsform med kcncentriska cylindriska ytor; fig. 5 visar en ut- föringsform med en kontinuerligt utskjutande yta i form av en spi- ralramp; fig. 6 visar en utföringsform med ovanför varandra anordnade skivor; fig. l4a och 14 b är mikrofotografier av matrisytor tagna i avsökningselektronmikroskop.

I fig. 1 visas den föredragna geometriska formen av en in- sättningsmatris lO konstruerad i enlighet med uppfinningen. Denna matris är försedd med ett flertal, på lika avstånd från varandra anordnade fenor 12, vars ytterkanter 14 avgränsar en i stort sett cylindriskvplym som passar i ett provrör 16, varvid ytterkanterna 14 blir belägna mycket nära rörets innervägg 18. Provröret 16 funge- rar såsom en behållare för det prov som skall analyseras (kvanti- tativ eller mnditativ bestämning av sådana komponenter som anti- kroppar och antigener). Matrisen har ett vertikalt stångformat handtag 22, vid vilket de radiellt utskjutande fenorna 12 är fästade.

Fenornas radie är lika med eller något mindre än provrörets 16 ra- die. Varje fenas bottendel 26 är företrädesvis formad på sådant sätt att matrisen följer rörets botten. Fenorna utgör företrädes- vis delar av en enhetlig struktur innefattande den centrala stången.

Fenorna kan dock även fästas vid stången genom någon lämplig hop- fogningsteknik, såsom spont och not, eller med hjälp av något lämp- ligt bindemedel.

Den i fig. l visade utföringsformen är försedd med åtta radiellt utskjutande och på lika avstånd från varandra anordnade fenor, men man kan även använda ett annat antal fenor och en annan konfiguration. En ökning av matrisens area genom ökning av antalet fenor har visat sig öka hastigheten av reaktionen mellan den rörliga och den fixerade komponenten. Vidare har man överraskande funnit, att en med åtta fenor försedd matris i många fall ger en proportio- nellt större reaktionshastighet i relation till ett belagt rör än vad som kan förklaras medelst skillnaden i reaktiv area (se fig. 7 446 666 _ 19 och 10). Liknande fördelar har observerats med ett större antal fenor, såsom 12, 16 och 18. Med hänsyn till dessa iakttagelser ut- göres den föredragna utföringsformen av en sådan matris som visas i fig. 1 försedd med 8-18 fenor. En matris med 18 fenor är den allra mest.firedragna utföringsformen. Vid användning av dylika fenför- sedda matriser begränsas antalet fenor i praktiken av den ökade svå- righeten att erhålla fri dränering på grund av kapillärvidhäftning av reaktionsvätskan, särskilt nära handtaget där fenorna närmar sig varandra under en allt mindre vinkel med ökat antal fenor.

En jämförelse mellan de i fig. 7 visade resultaten med en matris med 8 fenor och ett belagt rör indikerar att även andra faktorer påverkar reaktionshastigheten än storleken av den expone- rade area som är belagd med fixerad komponent. Dessa faktorer är för närvarande icke kända, men det antages att det minskade genom- snittliga diffusionsavstándet vid användning av en matris med 8 fenor (jämfört med användning av ett belagt rör) är en dylik fak- tor.

I fig. 2 visas en utföringsform, vilken är identisk med den i fig. 1 visade i alla avseenden förutom att den är försedd med ett flertal hål 28 i fenorna för ökning av den area med fixerad komponent som vätes av det prov som analyseras. Hålen 28 kan sträcka sig fullständigt genom fenorna. Såsom visas i fig. 2 kan hålen vara cirkulära eller avlånga; de kan även ha vilken som helst annan form. För att matrisens area skall ökas genom åstadkommande av cirkulära hål måste hálens radie vara mindre än dubbla väggtjock- leken 30.

I fig. 3 visas en utföringsform innefattande ett handtag 50, vid vilket är fästat en plan skiva 52 med en diameter något mindre än diamekrn av det provrör, i vilket matrisen är avsedd att passa. Ett flertal nedåtriktade pinnar 54 är fästade vid ski- van 52. Pinnarna 54 kan vara lika långa, eller de kan vara olika långa så att de följer provrörets rundade botten. De i fig. 5 vi- sade pinnarna har oirkulärt tvärsnitt, men även andra tvärsnitt är möjliga. Pinnarna 54 kan vara individuellt fästbara eller löstag- bara . Den i fig. 3 visade utföringsformen är särskilt lämpad för invecklade analyser innefattande flera olika testreaktioner i samma prov, men den är också helt allmänt användbar vid fastfasreaktioner.

I fig. 4 visas en utföringsform med en central stång 22, vid vilken ett flertal koncentriska cylindriska ytor är fästade 446 666 20 med hjälp av radiellt utskjutande stag 64. I fig. 4 visas tvâ cy- lindriska ytor, 60 och 62. För att man skall erhålla en anpassning till provrörets rundade botten sträcker sig den inre cylindern 60 nedanför den yttre cylindern 62, och den centrala stången 22 sträcker sig längre ned än den inre cylindern 60. En grupp av nedre stag 66 ger styvhet åt matrisens nedre del och underlättar också dräneringen av vätska: I fig. 5 visas en utföringsform med en radiellt utskjutande yta i form av en spiralramp 56, som slingrar sig omkring en central kärna 32 fästad vid ett handtag 22. Denna anordning innefattar en kontinuerlig, i huvudsak horisontell yta 36 och en vertikal yta 54 bildade av rampen respektive av dess yttersida. Rampens lutning ger fri tyngdkraftsdränering av reaktionsvätskan när anordningen upp- tages därur. Matrisen i fig. 5 är särskilt lämpad för genomförande av reaktioner, vid vilka omrörning är önskvärd. Matrisen är avsmal- nande vid den nedre änden 38 så att den passar i ett provrör med rundad botten.

I fig. 6 visas en utföringsform med ett flertal horisontellt anordnade skivor 42 fästade vid ett centralt handtag 22. Skivorna 42 har i huvudsak parallella övre och undre ytor 44 samt vertikala kanter 46. I den nedre delen 48 av matrisen har skivorna en kontur passande till ett provrör med rundad botten. Även om den i fig. 6 visade matrisen är användbar, kräver den och liknande utförings- former saknande fritt dränerbara ytor en längre tvättningstid än de fritt dränerbara utföringsformerna enligt fig. l-5. Även matriser med andra geometriska konfigurationer än vad som visas i fig. l-6 är användbara enligt uppfinningen. De geome- triska konfigurationerna bör företrädesvis ha vertikalt orientera- de släta ytor i kontakt med vätskeprovet för att underlätta tyngd- kraftsdränering efter upptagande ur provröret. Man kan enligt upp- finningen använda vilken som helst geometrisk konfiguration, som har en fritt dränerbar, relativt stor area. Ju större den vätbara arean är, desto snabbare sker reaktionen mellan den rörliga och den fixerade komponenten.

Innan insättningsmatrisen enligt uppfinningen nedföres i ett vätskeprov innehållande en rörlig komponent, vilken skall be- stämmas kvatitativt eller påvisas kvalitativt, belägges alla ytor med den fixerade komponenten. Ett stort antal matriser kan beläggas 446 666 21 samtidigt, varvid tillverkningskostnaderna kan nedbringas ända där- hän, att det blir ekonomiskt att kasta bort använda matriser.

Matriserna kan tillverkas av nästan vilket som helst sta- bilt, vattenolösligt material, ç.ex. polymetakrylat, polypropen och polystyren.

Fig. l4a är ett mikrofotografi av ytan av en föredragen utföringsform, en med 18 fenor försedd matris formad i en polerad form. Förstoring 500 gånger; elektronstràlens avsökningsvinkel 450.

Fig. lüb är ett mikrofotografi av ytan av en prototypmatris formad av samma plastmaterial som ovan (fig. l4a) men i en opolerad form. Förstoring 300 gånger; elektronstrålens avsökningsvinkel 450.

Uppfinningen illustreras genom följande exempel.

Exempel l.

Man framställde matriser av polymetakrylat i form av stänger försedda med 2, 4 resp. 8 fenor. Dessutom framställdes för jämförel- se ett belagt polystyrenrör. Matriserna liknade den i fig. l visade matrisen förutom att fenorna icke var rundade i nederdelen och där- för icke sträckte sig ända ned till den rundade bottendelen av reak- tionsröret. De uppmätta reaktiva ytorna var följande.

Belagt rör 899 mmz Matris med 2 fenor 452 mm2 " " Ä " 660 mm2 " " 8 " 1075 m? Testreaktionen var en antigen-antikroppreaktion mellan l25I-tyroxin (T4) och anti-tyroxin-antikroppar från kanin. Antik- kroppen användes såsom fixerad komponent, och det radioaktiva anti- genet användes såsom rörlig komponent.

För att immobilisera. antikroppen pà de ovan angivna fasta ytorna utspädes en 2,5%-ig lösning av glutaraldehyd med en lika stor volym 0,5 M natrimkarbonatbuffert med pH 9,5. De fasta ytorna nedsänktes i glutaraldehydlösningen under minst 3 timmar vid rums- temperatur och tvättades sedan med vatten. De med glutaraldehyd behandlade ytorna omsattes därpå omedelbart med en l:lOO0 utspäd- ning av anti-T4-serum i 0, 5 M natriumkarbonatbuffert (pH 9,5) un- der l2 timmar vid rumstemperatur.

Ytorna tvättades sedan med vatten och förvarades i fosfat- buffrad saltlösning bestående av 0,006 M NaH2P0¿, 0,024 M KEHPOÄ och 0,15 M natriumklorid (pH 7,4); till denna lösning hade satts 446 666 22 O,l% oxserumalbumin och tillräckligt med mertiolat för frigörande av eventuellt T4 bundet till serumprotein. Hela blandningen kallas nedan för T4-buffert.

Reaktioner_genomfördes genom att den belagda ytan uppbärande immobiliserade anfirtyroxin-antikroppar inkuberades med en liten mängd l25I-tyroxin i en total reaktionsvolym av 1,6 ml. Proverna ínkuberades under olika långa tider vid rumstemperatur. Resultaten anges i nedanstående tabell.

Procent märkningssubstans bunden efter lvæatris med 2 fenor 9,5 17,4 21,7 26,7 31,9 52,0 68,2 raatris med 4 fenor 14,2 22,2 28,3 34,2 38,1 70,6 75,7 Matris med S fenor 20,4 31,1 ' 40,3 36,6 58,7 81,4 85,3 belagt rör 16,1 21,8 24,4 28,5 36,4 60,6 75,6 15 min 30 min 45 min l h 2 h l6h 65h Fördelarna med de fenförsedda matriserna framgår klart av dessa resultat. Det bör påpekas, att renheten av det använda 1251- tyrokinet var 65-90%, varför den maximalt uppnâbara bidningsgraden var 85-90%. Vid användning av matrisen med 8 fenor hade man således nästan uppnått jämvikt efter 16 timmar. Anmärkningvärt är, att ma- trisen med 4 fenor, vars yta var endast ca 3/4 av det belagda rörets yta, immobiliserade antigen med något högre hastighet än det belag- da röret. Även matrisen med två fenor immobiliserade mera antigen per ytenhet än det belagda röret. w hxemgel 2.

Man genomförde samma försök på samma sätt som i exempel 1, varvid reaktionerna fick äga rum under olika långa tider vid rums- temperatur resp. vid 37°C. Resultaten vid 3700 visas grafiskt i fig. 10. Av fig. 10 framgår, att matrisen med fyra fenor vid rumstempe- ratur band en större procent antigen än det belagda röret under större delen av reaktionstiden trots att den hade en mindre area än röret. Vid 37°C band matrisen med fyra fenor icke mer antigen än det belagda röret. Däremot band matrisen med 8 fenor nästan 1,6 gånger så mycket antigen som det belagda röret efter 60 minuters inkubering trots att dess yta endast var 1,2 gånger det belagda rörets yta. 446 666 23 Exempel 2.

Man jämförde olika matrisers uppförande vid ökning av anti- genkoncentrationen. lan genomförde försöken på ungefär samma sätt som i exempel l med den skillnaden att antigenkdbentrationen vari- erades genom tillsättning av proteinbaserade standarder av omärkt tyroxin,under det att koncentrationen av 1251-tyroxin hölls konstant.

Antigenkoncentrationen varierades från 25 till N00 nanogram tyroxin per ml serum, räknat på en provvolym av 0,025 ml. man jämförde ma- triser med 2, 4 och 8 fenor med ett belagt rör vid inkubering under 3 timmar vid 57°C i en totalleflktionsvolym av 1,725 ml. Reaktions- bufferten var den i exempel 1 beskrivna TÅ-bufferten. Resultaten visas grafiskt i fig. ll. De fenförsedda matriserna enligt uppfin- ningen uppförde sig på ungefär samma sätt (kurvor av samma form), medan det belæda röret uppförde sig annorlunda, vilket visar att reaktionshastigheten är olika i fenförsedda matriser och belagda rör. Man kan också se, att kurvorna för de fenförsedda matriserna (särskilt de med 4 och 5 fenor) har en större lutning över ett bre- dare intervall av antigenkonoentrationer än vad kurvan för det be- lagda röret har. De fenförsedda matriserna kan därför ge ett bättre differentiellt gensvar över ett bredare intervall av antigen- koncentrationer. ' I fig. 8 visas resultat från ett liknande experiment, där man jämförde en matris med 5 fenor med en matris med 16 fenor. Vid detta experiment inkuberades matriserna under 1,5 timmar vid rums- temperatur i en total reaktionsvolym av l,Ä25 ml (ßfenor) resp. 1,025 ml (16 fenor). Matrisen med 16 fenor är lämpligast för kvanti- tativa analyser, eftersom den ger en större respons och en brantare responskurva vid de flesta antigenkoncentrationer.

I fig. 9 visas resultat från ett likannde experiment, där man använde en matris med 8 fenor och genomförde en reaktion vid 22°C under 45 minuter. Den totala reaktionsvolymen var 1,525 ml, och provvolymen var 0,025 ml. Under dessa betingelser gav matrisen med 8 fenor ett användbart gensvar inom hela det provade koncentra- tionsområdet, och reaktionen var relativt snabb.

Exempel 4.

En matris med 8 fenor jämfördes med ett belagt rör vid im- munokemisk bestämning av insulin. Insulin-antiserum från marsvin immobilíserades på ytorna av rör och matriser på samma sätt som 446 666 24 beskrives i exempel 1. Reaktionen genomfördes på samma sätt som i exempel l förutom att insulin användes såsom antigen. Varje reaktions- rzsr innehöll en identisk mängd l25I-närkc insulin tillsammans med en mängd omärkt insulin i fosfatbuffrad saltlösning innehållande oxserumalbumin. Den totala reaktionsvolymen var i båda fallen 1,5 ml innehållande 500lul omärkt insulinstandard och l ml fosfatbuff- rad saltlösning (se exempel l) innehållande 50 mg oxserumalbumin per ml. I nedanstående tabell anges försöksresultaten såsom procen- tuell andel bunden märkningssubstans.

Procent bundet märkt antigen 6,25 mikroenheter 25 mikroenheter 200 mikroenheter' matris belagt matris belagt matris belagt Tid, n enl. rör enl. rör enl. rör uppf. uppf. uppf. l 35 12 33 12 18 6 2 45 19 53 12+ 25 8 3 51 20 44 16 30 7 Den procentuella bindningsgraden var vanligen mera än dub- belt så stor vid användning av matrisen enligt uppfinningen med 8 fenor som vid användning av det belagda röret fastän matrisens yta endast var ca l, 2 gånger rörets yta (se exempel 1).

Exemnel_§¿ _ Man jämförde matriser med 8 fenor med belagda rör och under- sökte inverkan av olika specifik yta, avsaknad av fenor sträckande sig ned i reaktionsrörets rundade botten, och eventuella skillnader i bindningsaffinitet mellan polymetakrylat och polystyren. Reak- tionen genomfördes på samma sätt som i exempel 3, varvid man inku- berade vid rumstemperatur under viss tid. Både rören och matriserna var tillverkade av polymetakrylat. Rören hade en plan botten, och rören och matriserna hade en lika stor belagd yta. Försöksresultaten visas grafiskt i fig. 13. Av resultaten framgår, att eliminering av de ovan angivna variablerna icke nämnvärt ändrade det allmänna re- sultatet i de föregående exemplen, dvs. att bindningen sker snabbare med de fenförsedda matriserna enligt uppfinningen än med belagda rör även när den belagda ytan är lika stor. 446 666 25 Exempel 6.

I fig. l2 visas resultat av en sandwichanalys för bestäm- ning av u-fetoprotein, varvid matriser med 8 resp. l2 fenor jämför- des med ett belagt rör. Antikroppen till a-fetoprotein immobiliserades genom adsorption. De fenförsedda matriserna nedsänktes i 1,5 ml av en lösning innehållande 18 pg a-fetoprotein-antikropp per ml 0,5 M natriumkarbonatbuffert (pH 9,5) och inkuberadcs under två timmar vid 3700. Polystyrenrör belades pà liknande sätt genom att l,5 ml av samma antikropplösning infördes i varje rör, varpå man inkuberade under samma betingelser. Efter avslutad inkubationsperiod sköljdes rören och matriserna, varpå de under l timme placerades i fosfat- buffrad saltlösning (pH 7,4) innehållande 10 mg oxserumalbumin per ml. Rören och matriserna sköljdes därefter på nytt, och analysbuf- fert sattes till rören innehållande matriserna med 8 fenor (total volym l,5 ml), till rören innehållnde matriserna med 12 fenor (total volym l,l ml) och till de belagda rören (total volym 1,5 ml). Analys- bufferten var identisk med den i exempel 1 beskrivna T4-bufferten förutom att den icke innehöll mertiolat och att halten oxserumalbu~ min var lO mg/ml. Alfa-fetoprotein sattes till reaktionsrören i sä- dana mängder att man erhöll slutkoncentrationer av l ng, 2 ng, 20 ng, 200 ng och 400 ng per mL serum, räknat på en provvolym av 0.1 ml.

Omedelbart efter tillsättningen av d-fetoprotein tillsattes 100 ml 1251-märkt antixtopp till a-fetoprøtein (total aktivitet: 40 ooo registreringar per minut). Blandningen inkuberades vid }7°C under 1 timme 15 minuter. Efter inkuberingen avlägsnades matriserna, och rören dekanterades. Både rören och matriserna sköljdes snabbt, varpå den bundna radioaktiviteten räknades 1 en gamma-räknare.

Av resultaten i fig. 12 framgår, att de fenförsedda matriser- na enligt uppfinningen gav en större differentiell respons än det be- lagda röret vid alla antigenkoncentrationer, något som är av särskild betydelse vid de lägre koncentrationerna. Matrisen med 12 fenor gav den största responsen vid alla provade antigenkoncentrationer och gav också en något större differentiell respons än matrisen*med 8 fenor.

Exempel Z.

En immunoanalys för bestämning av tyroxinstimulerande hor- mon (TSH) genomfördes med användning av en föredragen utföringsform av uppfinningen. Man använde matriser av polypropen av den typ som 446 666 26 visas i fig. l men med 18 fenor. Matriserna framställdes genom form- ning i en form med.polerade ytor så att de vid handtaget fästade fe- norna erhöll maximal ytjämnhet.

Matrisen belades med anti-TSH-antikropp genom att den fen- försedda delen nedsänktes i l,2 ml av en lösning innehållande ca l ng renad antikropp och lO ng oxserumalbumin i 0,0l M kalïumfosfat- buffert (pH 9,0) under 2 timmar vid BTOC. Matrisen tvättades därpå med vatten och nedsänktes i en lösning av gluaraldehyd (0,005 volym- procent) i 0,01 M kaliumfosfatbuffert (pH 9,0) under 2 timmar vid §7°C. Iatrisen tvättades sedan med vatten, tvättades därpå under 10 minuter med en långsamt rinnande vattenlösning av "Triton X-lOO" 2 mg/ml; pH 1,85), tvättades ånyo med vatten och förvarades fram till användningen l en fosfatbuffrad saltlösning vid 4%.

Matriser framställda på detta sätt nedsänktes i rör inne- hållande 0,2 ml TSH-standard (varierande aktivitet från rör till rör) och 0,2 ml 1251-märkt anti-TSH-antikropp (total aktivitet: l74 535 registreringar per minut per rör). En reaktion av denna typ, där den rörliga komponenten och indikatorn inkuberas-samtidigt tillsammans med den fixerade komponenten, kallas för en samtidig sand- wichanalys. En grupp av matriser inkuberades under 2 timmar vid 5700, en andra grupp inkuberades under 3 timmar vid 5700. Den to- tala reaktionsvolymen var 0,4 ml.

De erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell. 446 666 vi 2 mfiå SSS ä.

Sån ä SSS S2 2.2 SEN äfi SSS 258 . 3%: Sn 2.2 S22 :Um H22 022 .SSS 3 Siw 82 Sá SSS Så SS 92 SSS 3.3 SNS 2% SS 22 m . .Så Son S ~ SSS än ä; ZS S4 S3 Qïfl SS 34 22 . . šfl 33 RS S o S2: äó S3 83 . S2 S Qßmpfi: wmofi nfiuum mohxfiu ñvwuflc _ . -mm :mm »mm ^mnw>w -flwämmm ._ He pdnmwfimnoxv :nswwmcflsxnmë mmm nomswfiwwmwm |nfimmmcww~mmwwm .Hwuw w^ \ , wnmuwnsmwmcfiffi :wøcflnv 99:45 :flaaoxv mcwuwnøm sm . .. n: omwïë» .šmwfi :massa \.Hmmc..nmwn»wflww«a -wmnflflxsms cwøcfln. ïämwzwnmö psmfls mms ubwvoäïwwwwm .aoflgsxsfi s n Éwoopaflwuwwh .cofiwnsmwmfinwwfi 446 666 28 Resultaten av de dubblerade experimenten visar att reak- tíonssystemet är mycket reproducerbart. Den relativt obetydliga ök- ningen av mängden bunden märkningssubstans vid en ökning av inkuba- tionstiden från 2 till 3 timmar visar att reaktionen är snabb; hu- vuddelen av bindningen sker redan under de första två timmarna.

Systemet har sådan känslighet, att man kan mäta så låga TSH-halter som 1,5 mikroenheter per ml, samtidigt som kapaciteten är tillräck- lig för mätning av TSH-halten upp till åtminstone 100 mikroenheter per ml.

Exempel 8.

Man genomförde en analys av konkurrerande typ med en matris med 18 fenor. Matrisen belades med anti-digoxin-antikropp enligt en metod i huvudsak liknande den som beskrivas i exempel 7. Mängden anbragt antikropp var ca 250 ng per matris.

Man använde-en reaktionsvätska innehållande O, 0,5 el 6,0 ng omärkt digoxin per ml samt 1_3H_]-digoxin (totalt 16 l ; re- gistreringar per minut) i 0,01 M kaliumfosfat-buffert (pH 7,5É. Den totala reaktionsvolymen var 1,2 ml. Matrisen inkuberades i reak- GI' _. l 6 . N . o . _ . ionsvatskan vid 37 C eller vid rumstemperatur under de tidsperio- CI' O» er som anges i nedanstående tabell. Resültaten i tabellen anger proeent bundet märkt digoxin (medelvärden av två bestämningarš.

Reaktionstemperatur Inkubationstid Digoxin-koncentration fng/ml- (minuter) O 0,5 6,0 37°C 10 41.09.! 30, 3:15 5, 5% 30 å snofiš 1+1,1:«ä 7,91% 90 1 65,2? 43,l% 7,9? Rumstemp. 10 É 33,5% 26,6% 6,55 I 90 58,5% 43,7% 6,l% Vid nivån 0,5 ng/ml erhölls maximal skillnad vid en inkuba- tionstid av 90 minuter vid 5700, men fullt mätbara skillnader er- hölls redan efter 10 minuters inkubering vid såväl rumstemperatur som 3700. 446 666 29 Exemnel Q.

Man genomförde en samtidig sandwichanalys för bestämning av TSH på det sätt som beskrives i exempel 7, varvid man använde en matris med 6 parallella fenor och plan botten (denna utförings- form är icke visad på ritningen). Denna matris formades i en opole- rad form (se exempel 10).

TSH-antikropp immobiliserades genom adsorption (1,5 timmar vid 3700) í 0,01 M kaliumfosfatbuffert (pH 9,0) innehållande 1,5 pg anti-TSH-antikropprotein per ml och 15/ug I g G per ml. Efter ad-I sorptionsperioden tvättades matriserna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning innehållande 10 yg oxserumalbumin per ml.

Reaktioner genomfördes i närvaro av de nedan angivna mäng- derna TSH-antikropp såsom indikatorreagens_ (total aktivitet: 127 OOO registreringar per minut). Reaktionsbufferten var fosfat- buffrad saltlösning, och reaktionerna genomfördes vid 37°C under de nedan angivna tidsperioderna. För att underlätta dränering och tvättning av matriserna efter upptagning ur reaktionsvätskan torka- des varje matris snabbt genom att den plana botten sattes mot en absorberande dyna, varefter matrisen centrifugerades i ett rör innehållande glaspärlor stödjande matrisen så att de sista spåren av reaktionsvätska avlägsnades. Matrisen nedsänktes därpå i en tvättbuffert, och processen upprepades tvâ gånger. De erhållna re- sultaten visas i nedanstående tabell.

TSH(mikroenheter/ml) Procent bunden märkningssubstans (korrigerat för 75% antikroppaffinitet, 1 h 2 h 16 h O 2,2% 2,6% 4,4% 1 2,7% 4,4% 25 4,¶% 5,13 50 5,8% 7,5% 7,2% Även om den använda matrisen är en av de minst föredragna utföringsformerna, ger dock även den mycket tillfredsställande re- sultat. gggmgel 10.

En matris med 18 fenor av den typ som användes i exempel 7 och 8 undersöktes i ett avsökningselektronmikroskop för bestämning 446 666 30 av den vid tillverkningen använda polerade formens effekt på yt- jämnheten. För jämförelse undersöktes även ytan av en prototypma- tris formad av samma plastmaterial i en opolerad form. I fig. l4a visas ytan av den i den polerade formen framställda matrisen (för- string B00 gånger; avsökningsvinkel 450). I fig. lüb visas ytan av den i den opolerade formen framställda matrisen (samma förstoring och avsökningsvinkel). Användning av en form med spegelpolerade ytor ger alltså en kraftigt förbättrad ytjämnhet. Även om båda ytorna känns ungefär lika släta och följakt- ligen är inom ramen för uppfinningen, föredrages vanligen den i den polerade fornæn framställda matrisen.

Vid användning av en föredragen matris, såsom den som visas i fig. l§a, erhålles mycket reproducerbara resultat med en låg bak- grund av icke-specifik bindning.

Exempel ll. _ Den i exempel 7 beskrivna matrisen användes vid enzymbunden immunoanalys för bestämning av ferritin, och resultaten jämfördes med dem som erhölls vid användning av ett belagt rör. Analysen var en sandwichanalys, där matrisen med 18 fenor eller det belagda röret belades med ferritin-antikropp och sedan fick reagera med en reaktionsvätska innehållande ett ferritinprov. Matrisen eller det belagda röret separerades därpå från reaktionsvätskan, tvättades och inkuberades med en anti-ferritin-antikropp konjugerad med ett enzym. Alternativt genomfördes en samtidig sandwichanalys, där ferritin och anüfferritin-antikropp-enzym-konjugat inkuberades till- sammans ned den immobiliserade anti-ferritin-antikroppen. I bada fallen erhölls bindning av öantikropp-enzym-konjugatet till den fasta fasen i en mängd proportionell mot mängden närvarande ferri- tin. Mängden bundet antikropp-enzym-konjugat mättes genom införande av ett kromogent enzymsubstrat, varvid den bundna enzymdelen av konjugatet gav en färgförändring. Graden av färgförändring var propor- tionell mot mängden bundet konjugat.

Vid samma inkubationstid gav användning av matrisen med 18 fenor en optisk täthet som var av storleksordningen 8 eller flera gånger större än den optiska täthet som erhölls vid användning av det belagda röret.

Ovan har föredragna utföringsformer av uppfinningen beskri- vits, men det är uppenbart att många olika modifikationer kan göras inom ramen för uppfinningen.

Claims (9)

446 666 ' 31 P a t e n t k r a V

1. l. Förfarande för bestämning av en rörlig komponent i ett i en behållare infört vätskeprov, varvid den rörliga komponenten reagerar med en immobiliserad komponent på en inuti vâtskeprovet nedsänkt, handtagsförsedd insats i behållaren, k ä n n e t e c k n a t a v att den immobiliserade komponent som användes har applicerats i form av en fastsittande likformig beläggning på minst 8, företrädes- vis 8-18 frân insatsens handtag radiellt åt olika håll utskjutande fenor med släta ytor och med så stora dimensioner i förhållande till behàllarens inre utrymme, att den genomsnittliga diffusionssträckan för den rörliga komponentens molekyler till de med den immobiliserade komponenten belagda fenytorna blir avsevärt mindre än den genomsnitt- liga diffusionssträckan till behâllarens innerytor i frånvaro av in- satsen; och att man mäter en genom komponenternas reaktion på dessa fenytor uppkommen kemisk, enzymatisk eller immunokemisk förändring såsom mått på den rörliga komponentens koncentration i provet.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att den på fenytorna applicerade, immobiliserade komponenten är en anti- kropp, att den rörliga komponenten är ett antigen, och att reaktionen är bindning av antigenet till antikroppen.

3. ' 3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att den på fenytorna applicerade,immobiliserade komponenten är ett enzym, och att den rörliga komponenten är en substans som kan undergâ en ke- misk omvandling katalyserad av enzymet.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att den rörliga komponenten är ett enzym, och att den på fenytorna appli- cerade, immobiliserade komponenten är en substans som kan undergâ en kemisk omvandling katalyserad av enzymet.

5. Anordning för bestämning av en rörlig komponent i ett vätske- prov, omfattande en behållare (16) för vätskeprovet, företrädesvis ett provrör, och en i vätskeprovet i behållaren nedsänkbar handtags- försedd insats (10), som uppbär en immobiliserad komponent, avsedd att reagera med den rörliga komponenten, k ä n n e t e c k n a d av att insatsen (10) i och för bestämning avåfin rörliga komponentens koncen- tration omfattar minst 8, företrädesvis 8-18 från insatsens handtag åt olika hål1\fi$kjütande fenor (12), som har släta ytor, uppbär den immo- biliserade komponenten i form av en fastsittande likformig beläggning I 446 666 32 och har så stora dimensioner i förhållande till behållarens (16) inre utrymme, att den genomsnittliga diffusionssträckan för den rör- liga komponentens molekyler till de med den immobiliserade komponenten belagda fenytorna blir avsevärt mindre än den genomsnittliga diffu- sionssträckan till behâllarens innerytor i frånvaro av insatsen.

6. Anordning enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a d a v att fenornas (12) ytterkanter är formade i överensstämmelse med behål- larens (16) form.

7. Anordning enligt krav 5 eller 6, k ä n n e t e c k n a d a v , att insatsen (10) innefattar 16-18 fenor (12).

8. Anordning enligt något av kraven 5-7, k ä n n e t e c k n a d a v att insatsen (10) är tillverkad genom formning i en form med po- lerade ytor.

9. Anordning enligt något av kraven 5-8, k ä n n e t e c k n a d a v att handtaget (22) är en central stång, varvid fenorna (12) sträcker sig utmed en del av stångens längd.