JPH0698028B2 - 分析用組成物，分析要素及び被分析物の測定方法 - Google Patents

分析用組成物，分析要素及び被分析物の測定方法

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JPH0698028B2 JP62169909A JP16990987A JPH0698028B2 JP H0698028 B2 JPH0698028 B2 JP H0698028B2 JP 62169909 A JP62169909 A JP 62169909A JP 16990987 A JP16990987 A JP 16990987A JP H0698028 B2 JPH0698028 B2 JP H0698028B2
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に臨床化学に関する。特に、本発明は、
生物学的流体中の被分析物の測定に有用な分析組成物、
要素及び方法に関する。例えば、本発明は、免疫分析に
使用することができる。
〔従来の技術〕
水性液体をその液体中の被分析物の濃度に比例して検出
可能な生成物を生じうる試薬の配合物と接触させること
によって定量的又は定性的分析を実施することは周知で
ある。本明細書において、この試薬配合物とは、化学反
応、触媒活性又は適当な操作及び装置を用いて検出しう
る変化を最終的に生じうる他の化学的又は物理的相互作
用をしうる相互作用組成物という。
有用な分析の一つは、被分析物が、適切な試薬と接触し
たときに、適当な酵素の存在下に酸素と反応して被分析
物の濃度に比例して過酸化水素を生成する酵素反応を利
用する。検出可能な生成物は、試験される液体中の被分
析物の濃度に比例して過酸化水素の反応により生産され
る。ペルオキシダーゼは、一般にこのような分析におい
て、過酸化水素による相互作用組成物の酸化を触媒する
ため使用される。
ペルオキシダーゼは、種々の被分析物、例えばグルコー
ス、トリグリセリド、尿酸、コレステロール、クレアチ
ンキナーゼ等の診断的測定に使用され、また、免疫学的
に反応性の種の測定（すなわち、免疫分析）に使用され
るリガンドアナローグにおける標識として使用される。
このような測定は、溶液中で又は乾式分析要素で実施す
ることができる。
種々の基質とペルオキシダーゼとの反応の速度は、多く
の段階にわたって変動する。若干の場合に、反応が緩や
かに進行する場合には、反応速度を高めるため多量のペ
ルオキシダーゼを使用する。しかし、反応速度を高める
ため多量のペルオキシダーゼを使用することは、ある分
析では使用することができない。例えば、ペルオキシダ
ーゼ−標識リガンドアナローグを使用する酵素免疫分析
は、薬剤、抗原又は他の免疫学的に反応性の化合物を測
定するため重要になってきた。このような分析において
は、酵素反応速度を高めるために多量のペルオキシダー
ゼを添加することはできない。トリアリールイミダゾー
ルロイコ染料を利用する有用な分析法は、米国特許第4,
089,747号明細書に記載されている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかしながら、このような分析において、ペルオキシダ
ーゼによるロイコ染料の酸化は比較的遅いことが観察さ
れた。反応速度を高めるには、多量のペルオキシダーゼ
が必要であるが、ペルオキシダーゼの使用量を増加する
ことは、経済的理由から、又は例えばペルオキシダーゼ
が免疫分析における標識として使用される場合に、増加
した量が分析に不利に作用するので、しばしば望ましく
ないか又は実用的でない。従って、ペルオキシダーゼの
量を増加することなくロイコ染料のペルオキシダーゼ触
媒酸化の反応速度を増加しうることが望ましい。
〔問題点を解決するための手段〕
前記の問題点は、以下に詳しく説明する本発明によって
解決する。
本発明は、その１つの面において、ペルオキシダーゼ又
は免疫学的に反応性のリガンドのペルオキシダーゼ標識
アナローグ、ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下
に検出可能な色素を生成しうるイミダゾール又はトリア
リールメタンロイコ染料、並びにペルオキシダーゼの存
在下に過酸化水素と反応して、ロイコ染料より高い酸化
電位を有する中間化合物を生成しうるフェノール又はア
ニリン電子移動剤を含む分析用組成物にある。
本発明は、そのもう１つの面において、吸収性担持物質
を含み、そしてペルオキシダーゼ又は免疫学的に反応性
のリガンドのペルオキシダーゼ標識アナローグ、ペルオ
キシダーゼ及び過酸化水素の存在下に検出可能な色素を
生成しうるイミダゾール又はトリアリールメタンロイコ
染料、並びにペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素と
反応して、ロイコ染料より高い酸化電位を有する中間化
合物を生成しうるフェノール又はアニリン電子移動剤を
含む分析用組成物を含有している、乾式分析のための分
析要素にある。
また、本発明は、そのもう１つの面において、 A.被分析物を含むと思われる液体試料をペルオキシダー
ゼ又は免疫学的に反応性のリガンドのペルオキシダーゼ
標識アナローグ、ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存
在下に検出可能な色素を生成しうるイミダゾール又はト
リアリールメタンロイコ染料、並びにペルオキシダーゼ
の存在で過酸化水素と反応して、ロイコ染料より高い酸
化電位を有する中間化合物を生成しうるフェノール又は
アニリン電子移動剤を含む分析用組成物と接触させ、そ
して B.被分析物の存在の結果として検出可能な色素を測定す
る 工程を含む被分析物の測定方法にある。
さらにまた、本発明は、そのもう１つの面において、ペ
ルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下に検出可能な色
素を生成しうるイミダゾール又はトリアリールメタンロ
イコ染料、およびペルオキシダーゼの存在下に過酸化水
素と反応して、ロイコ染料より高い酸化電位を有する中
間化合物を生成しうるフェノール又はアニリン電子移動
剤を含む分析用組成物にある。
実施態様 本発明は、水性液体中の化学的又は生物学的物質（本明
細書では、被分析物という）の測定（定性又は定量測
定）に関する。特に、本発明は、動物又は人間の生物学
的流体を分析するため使用することができる。このよう
な流体は、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊
髄液、睡液、汗及び排泄物を包含するが、これらに限定
されるものではない。ヒト又は動物の組織、例えば骨格
筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄又は皮膚の流体調製物を
分析することもできる。
本発明を用いて過酸化水素を測定することができる。更
に、本発明を使用して、過酸化水素を生成しうる被分析
物、すなわち、適当な相互作用組成物の存在で過酸化水
素を生成する１種以上の反応に関与しうる物質を測定す
ることができる。この方法で測定しうる被分析物は、グ
ルコース、トリグリセリド、尿酸、コレステロール、ガ
ラクトース、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ピルビン
酸塩、及び他の当業者に公知の物質を包含する。本発明
は、グルコース、トリグリセリド、尿酸、コレステロー
ル及びクレアチンキナーゼの測定に特に有用である。
好ましい実施態様において、本発明は、対応するレセプ
ターと特異的に複合する物質である免疫学的に反応性の
リガンドの測定に有用である。このようなリガンドは、
抗原、ハプテン、抗体、毒素、ホルモン、治療薬、天然
及び合成ステロイド、蛋白質、ウイルス、細菌、ペプチ
ド、ヌクレオチド等を包含するが、これらに限定されな
い。この実施態様において、測定すべきリガンド及び対
応する標識リガンドアナローグは、一定量の共通の反応
体に対して競合する。この反応体は、リガンド及びリガ
ンドアナローグを特異的に認識し、反応してそれらと複
合体を形成するものであり、本明細書においてはレセプ
ターという。
本発明の分析用組成物は、ペルオキシダーゼ又はペルオ
キシダーゼ−標識リガンドアナローグを含む。合成又は
天然産（すなわち、植物、ミルク、細菌及び他の公知資
源から得られる）のペルオキシダーゼを使用することが
できる。これらの物質は、一般に市場で入手しうるか又
は入手可能な資源から容易に抽出される。本発明に有用
なペルオキシダーゼ−標識リガンドアナローグは、当業
者に公知の適当な技法を使用して製造される。一般に、
これらは、結合を達成するため適当な方法で変性されう
るリガンド分子にペルオキシダーゼ標識を共有結合させ
る（結合基を用いるか又は用いないで）ことによって製
造される。
ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在で酸化されたと
きに検出可能な色素を生成しうる限り、任意の適当なロ
イコ染料を本発明の実施に使用することができる。有用
なロイコ染料は、例えば、イミダゾール誘導体、例えば
米国特許第4,089,747号明細書及び該明細書に記載され
ている参考文献、欧州特許出願第122,641号明細書及び
日本特許出願公報第58（1983）−045,557号公報に記載
されているもの、並びに例えば欧州特許出願公告第165,
685号公報に記載されているトリアリールメタン類を包
含するが、勿論これらに限定されない。
米国特許第4,089,747号明細書のトリアリールイミダゾ
ール類は、本発明の実施に好適である。
これらのロイコ染料は、一般に、次式を有する： 〔式中R1、R2及びR3はそれぞれ独立に有機基を表し、そ
のうち少なくとも１個は炭素原子数18以下のオルト−又
はパラ−ヒドロキシ置換アリール基であり、他の２個の
基は、化合物の酸化電位が炭素ベース電極を用いて標準
カロメル電極に対してサイクリック・ボルトメトリーで
測定して−70mV〜＋100mVの範囲であるように選択され
る〕。これらの好ましいロイコ染料及び酸化電位の測定
の技法について更に詳細には米国特許第4,089,7474号明
細書に記載されている。
本発明の実施に有用なフェノール類及びアニリン類は、
ロイコ染料を酸化して検出可能な色素を生成する際に電
子移動剤として作用するものである。これらのフェノー
ル類及びアニリン類は、ペルオキシダーゼの存在で過酸
化水素と反応して、分析に使用したロイコ染料より高い
酸化電位を有する中間化合物を生成する。フェノール又
はアニリン、過酸化水素及びペルオキシダーゼの反応
は、ロイコ染料、過酸化水素及びペルオキシダーゼの反
応より速く、これにより生成した中間体は、ロイコ染料
又は他の徐々に酸化される物質と迅速に反応しなければ
ならない。第一の反応は、第二の反応より少なくとも２
倍迅速であるのが好ましい。
従って、所定のフェノール又はアニリンが本発明に有用
であるか否かを測定するため、簡単な試験を実施するこ
とができる。ロイコ染料の酸化速度をフェノール又はア
ニリンの存在又は不存在で比較する。フェノール又はア
ニリンの存在での速度が少なくとも２倍速い場合に、そ
のフェノール又はアニリンは本発明の実施に有用であ
る。本発明に有用なフェノール又はアニリンは、すべて
のロイコ染料と共に有用であるわけではないが、どのロ
イコ染料及びフェノール又はアニリンが本発明の実施に
有用であるかは、当業者は容易に測定することができ
る。
本発明において有用な代表的フェノール類は、ｐ−ｐ′
−ビフェノール、４′−ヒドロキシアセトアニリド、ｐ
−メトキシフェノール、クロロフェノールレッド、ｐ−
クレゾール、ｍ−メトキシフェノール、バニリン、４−
クロロ−3,5−ジメチルアミノフェノール、ホモバリニ
ン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシフェニ
ル酢酸、ｎ−メトキシフェノール、フェノール、レゾル
シノール及びｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルを包含す
る。有用なアニリンは、ｐ−アニシジン、４′−アミノ
アセトアニリド、ｐ−ヒドロキシ−N,N−ジメチルアニ
リド及びｏ−フェニレンジアミンを包含する。ｐ−ｐ′
−ビフェノール、４′−ヒドロキシアセトアニリド、ｐ
−メトキシフェノール、ｐ−アニシジン及び４′−アミ
ノアセトアニリドが好ましく、４′−ヒドロキシアセト
アニリドが最も好ましい。
前記のように、過酸化水素以外の被分析物を測定するた
め、相互作用組成物を本発明の分析用組成物と共に使用
することができる。相互作用組成物は、被分析物と反応
して過酸化水素を生成する試薬を１種以上含む。適当な
相互作用組成物は、当業者に公知である。例えば、尿素
の測定用の相互作用組成物は、ウリカーゼを含み、グル
コースの測定用の相互作用組成物は、グルコースオキシ
ダーゼを含む。コレステロールの測定用の相互作用組成
物は、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロール
エステルヒドロラーゼを含む。
本発明の分析用組成物は、適当な標識に共有結合したリ
ガンドを含むリガンドアナローグを使用して免疫学的に
反応性のリガンドを測定するため使用することもでき
る。前記のように、ある実施態様では、その標識はペル
オキシダーゼである。他の実施態様では、標識は、ペル
オキシダーゼ以外の酵素、例えば被分析物の過酸化水素
への変換及びロイコ染料の検出可能な色素への変換に関
与するグルコースオキシダーゼ又はガガラクトースオキ
シダーゼである。これらのリガンドアナローグは、自体
公知の技法で製造することができる。リガンドアナロー
グは、グルコースオキシダーゼ又はペルオキシダーゼを
含むのが好ましい。
本発明の分析用組成物は、分析に一般に含まれる他の添
加物、例えば緩衝剤又は界面活性剤を従来公知の量で含
むことができる。
本発明の分析用組成物及び方法は、溶液及び乾式分析に
適用することができる。免疫反応性リガンド以外の被分
析物に関する溶液分析では、適当な容器（例えば、試験
管、シャーレ、ビーカー又はキュベット）中で分析用組
成物及び相互作用組成物（含まれる場合）を、被分析物
を含まれると思われる液体試料と接触させ、混合する。
得られる溶液を短時間40℃以下の温度で静置し、被分析
物の存在により生成する検出可能な色素を適当な検出装
置及び操作を用いて測定する。
本発明の免疫分析においては、標識リガンドアナローグ
の結合（複合）又は非結合（非複合）フラクションを測
定することができる。必要に応じて、結合リガンドアナ
ローグと非結合リガンドアナローグとの物理的分離を任
意の適当な技法を用いて達成することができる。溶液免
疫分析においては、リガンドアナローグ、適切なレセプ
ター及びリガンドを含むと思われる液体試料を前記のよ
うな容器中で混合する。複合後、試料を適当な装置及び
操作を用いて結合又は非結合リガンドアナローグを測定
して評価する。
溶液分析においては、使用したロイコ染料の量は、生成
した色素の吸光係数に左右される。適切な量は容易に決
定することができる。一般に、ロイコ染料は、少なくと
も４×10-7モル、好ましくは２×10-6〜１×10-4モル濃
度で存在する。同様に、ペルオキシダーゼは、ロイコ染
料を酸化して検出可能なシグナルを生じるのに充分な量
で存在する。一般に、ペルオキシダーゼは、少なくとも
10-13モル濃度の量で存在する。本発明の利点は、本明
細書に記載したフェノール又はアニリンが酵素の反応速
度を向上させるので、多くの分析においてより少ない量
のペルオキシダーゼを使用すればすむことである。分析
に使用するフェノール又はアニリンの量は、使用するロ
イコ染料及び色素への酸化速度に応じて変動しうる。し
かし、一般に、これは少なくとも10-6モル濃度、好まし
くは10-4〜10-2モル濃度の量で存在する。
溶液免疫分析においては、リガンドアナローグは、一般
に、少なくとも10-11モル濃度、好ましくは10-10〜10-7
モル濃度で存在する。対応するレセプター（例えば、単
クローン性又は多クローン性抗体）は、一般に、少なく
とも10-8モル濃度、好ましくは10-8〜10-3モル濃度の量
で存在する。
本発明方法を乾式分析要素を使用して実施することもで
きる。最も簡単な要素は、本発明の分析用組成物を含む
吸収性担持物質、例えば自立性吸収性又は吸水性物質の
薄いシート、例えばロ紙又はストリップから成る。要素
を担持物質の個々の帯域に組成物の異なる成分を組み込
んだ２個以上の別々の帯域に分割することができる。こ
のような要素は、従来、試験ストリップ、診断要素、浸
漬スチック、診断剤等として知られている。
有用な吸収性担持物質は、水又は生物学的液体、例えば
全血又は血清にさらされても不溶性であり、その構造的
一体性を保有するものである。有用な要素は、紙、多孔
性粒状構造体、多孔性ポリマーフィルム、セルロース、
ガラス繊維、織布及び不織布から製造することができ
る。このような要素を製造するために有用な物質及び操
作は、文献、例えば米国特許第3,092,465号、同第3,80
2,842号、同第3,915,647号、同第3,917,453号、同第3,9
36,357号、同第4,248,829号、同第4,255,384号、同第4,
270,920号及び同第4,312,834号明細書に良く知られてい
る。
本発明の乾式分析要素の吸収性担持物質は、多孔性拡散
帯域であるのが好ましい。この帯域は、自立性（すなわ
ち、その一体性を保持するのに充分に硬い物質から成
る）であってよいが、別の支持体上に担持されているの
が好ましい。このような支持体は、任意の適当な寸法安
定性で、好ましくは、200〜900nmの波長の電磁線を透過
する非多孔性で透明な物質である。特定の要素に対して
選択される支持体は、所定の検出方法（透過又は反射分
光分析）と矛盾しないものであるべきである。有用な支
持体は、紙、金属箔、ポリスチレン、ポリエステル、ポ
リカーボネート又はセルロースエステルから製造するこ
とができる。
多孔性拡散帯域は、米国特許第4,292,272号、同第3,99
2,158号、同第4,258,001号及び同第4,430,436号明細書
並びに特開昭57−101760号公報に記載されているような
任意の適当な繊維状若しくは非繊維状物質又はその一方
若しくは両方の混合物から製造することができる。拡散
帯域は等方性に多孔性である（すなわち、孔度が粒子、
繊維又はポリマーストランドの間の連続空間又は孔によ
って生じるように、帯域のどの方向でも同一であること
を意味する）のが望ましい。
要素は、２個以上の別々の帯域を同じ層内に又は重ねら
れた層として有することができる。その帯域の少なくと
も１個は多孔性拡散帯域であるのが好ましい。他方の帯
域は、試薬帯域又は記録帯域（これらの帯域は従来公知
である）、付加的拡散帯域、輻射線遮断若しくはフィル
ター帯域、下塗帯域又はバリヤ帯域等であってよい。帯
域は一般に、相互に液体接触〔すなわち、一般に液体、
試薬及び反応生成物（例えば着色色素）が隣接帯域の重
なった領域の間を通過又は移動しうることを意味する〕
している。帯域は、別々に塗布された層であるのが好ま
しい。
本発明の要素において、分析用組成物の成分は溶液分析
に関連して上記したのと同じファクターに応じて変動し
うる量で存在する。一般に、ロイコ染料は少なくとも20
mg/m2の量で存在する。ペルオキシダーゼは少なくとも1
0I.U./m2の量で存在し、フェノール又はアニリンは少な
くとも2.5I.U./m2の量で存在する。最適のレベルは当業
者には容易に決定することができる。本発明の要素は、
種々の製造又は操作上の利点のため要素に一般に求めら
れる他の添加剤を１種以上含むことができる。このよう
な添加剤は、界面活性剤、緩衝剤、溶剤又は硬化剤を含
む。これらの物質は、前記の要素の１個以上の帯域中に
独立して存在することができる。若干の実施態様では、
フェノール及びロイコ染料は、同じ帯域で存在する。他
の実施態様では、フェノール又はアニリン及びペルオキ
シダーゼが同じ帯域に存在する。
本発明の要素を免疫分析に使用する際には、標識リガン
ドアナローグ及び対応するレセプターを使用前に要素に
混入するか、又は分析の時点で添加することができる。
いずれの場合にも、これらは一般に溶液免疫分析につい
て上記した量で存在する。両者を使用前に要素中に混入
するのが好ましい。標識リガンドアローグを別個の水溶
性帯域又は層中に混入してレセプターから単離しておく
ことができる。
レセプターは、使用前、例えば製造の間、要素内に固定
するのが好ましい。例えば、レセプターを要素の吸収性
担持物質内に固定することができる。更に詳述すれば、
レセプターを担持物質、例えばガラス若しくはポリマー
のビーズ又は他の粒子、樹脂又は繊維上の多孔性拡散帯
域内に固定する。有用な担持物質の一つは、微生物、例
えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）であ
る。また、多孔性吸収性担持物質は、固定用の担持物質
として作用することができる。
本発明により、分析方法に応じて異なる種々の要素を製
造することができる。任意の所望の幅の長いテープ、シ
ート、スライド又はチップを含めて種々の形で要素を構
成することができる。
本発明の分析は、手操作で又は自動的にすることができ
る。一般に、乾式要素を使用する場合、要素を供給ロー
ル、チップ包装物又は他の供給源から採取し、被分析物
を含むと思われる液体の試料（例えば１〜200μｌ）
と、試緑と試薬が要素内で混合されるように物理的に接
触させることによって被分析物を測定する。このような
接触は、任意の適当な方法で、例えば要素を試料中に浸
漬するか、又は好ましくは適当な分配手段を用いて一滴
の試料を手で又は機械で要素に落とすことによって達成
される。
試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。
本発明の免疫分析は、要素中でリガンド及びリガンドア
ナローグ及びレセプターの間で複合体が形成されるよう
な方法で実施する。複合体形成が起こったら、適当な分
離技法を使用して、複合したリガンドアナローグと未複
合リガンドアナローグとを垂直方向又は水平方向に分離
することができる。
一つの実施態様においては、試料の接触は、レセプター
及びリガンドの複合並びに未複合及び複合リガンドの実
質的に水平の分離が試料の導入の間に起こるような方法
で達成することができる。この接触は、手で又はピペッ
ト若しくは試験試料を分配するのに適当な他の分配装置
を用いて機械により実施することができる。液体試料を
水平分離を行う多数の方法で要素に適用することができ
る。例えば、比較的に多量の液体試料（例えば、200μ
ｌ）を適当な分配装置を使用して連続的方法で徐々に
（例えば少なくとも５秒かけて）適用することができ
る。また、試料を少量ずつ、例えば、２滴以上ずつ（例
えば0.1〜１μｌ）一定時間かけて（例えば少なくとも
５秒かけて）適用する。
別の実施態様では、液体試料を要素に適用した後、洗浄
液を徐々に添加することによって分離を達成することが
できる。この洗浄は、未複合物質を複合物質から移動さ
せて引き離す。
試験試料中のリガンドの量は、ペルオキシダーゼ及び基
質の反応の結果としてロイコ染料の酸化により生成した
色素（例えば反射又は透過濃度の変化）を検出すること
によって測定する。この方法で、複合又は未複合リガン
ドを測定することができる。
水平分離に関する前記の実施態様においては、複合リガ
ンドアナローグを接触した領域の中心における一定部分
内で測定する。試験試料中のリガンドの量は、その一定
部分内で測定したリガンドアナローグの量に反比例す
る。一般に、リガンドアナローグの測定は、試験試料を
要素に適用してから５〜500秒の後に実施する。
本明細書において、I.U.は酵素活性に関する国際単位で
あって、その酵素の標準pH及び温度条件下に１分当たり
に１マイクロモルの基質の変換を触媒するのに必要な酵
素活性の量を１単位と定義される。
〔実施例〕
例１ ペルオキシダーゼ反応速度の増大のための電子移動剤と
してｐ−メトキシフェノールの使用 K2HPO4（4.36g/500ml水）及びKH2PO4（3.41g/500ml水）
から燐酸カリウム緩衝液（50マイクロモル、pH6.5）を
製造した。界面活性剤溶液は、50ミリモル緩衝液中のト
リトン（TRITON）Ｘ−165（10重量％）から製造した。
２−（3,5−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−
4,5−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾー
ルロイコ染料の溶液を下記のようにして製造した。前記
のトリトンＸ−165溶液（28.6ml）及び前記の50ミリモ
ル緩衝液（171.4ml）を窒素でパージし、ロイコ染料0.2
gを添加した。生成した混合物を、溶液が得られるまで
（約２時間）、25℃で撹拌した。この溶液を200ミリモ
ルの緩衝液で1:19に希釈した。
キュベットに試薬を下記の順序で加えることによって試
験溶液を製造した：ロイコ染料溶液3ml、200ミリモルの
緩衝液中の10ミリモル過酸化水素10μｌ、ｐ−メトキシ
フェノール（下記の第Ｉ表に示した種々の濃度）及びペ
ルオキシダーゼ溶液10μｌ（200ミリモルの緩衝液25ml
中の165プルプロガリン単位/mgの活性を有する酵素7.58
mg）。
30℃で標準分光光度計を使用して670nmで吸光度を測定
した。１分後の吸光度の変化（ΔＡ）として下記の第Ｉ
表に示す。得られたデータは、ｐ−メトキシフェノール
（PMP）の存在でペルオキシダーゼによって触媒されて
ロイコ染料の酸化速度が向上したことを示す。
第Ｉ表 PMP濃度（モル濃度） ΔA ０ 0.344 3.3×10-8 0.369 8.3×10-8 0.368 1.7×10-7 0.400 3.3×10-7 0.398 8.3×10-7 0.467 1.7×10-6 0.560 3.3×10-6 0.652 8.3×10-6 1.004 1.7×10-5 1.240 3.3×10-5 1.675 6.6×10-5 2.314 9.9×10-5 2.516 例２ ペルオキシダーゼ反応速度の増大のための電子移動剤と
しして４′−ヒドロキシアセトアニリドの使用 前記の例１に使用したロイコ染料溶液をこの例にも使用
した。キュベットに試薬を下記の順序で加えることによ
って試験溶液を製造した：ロイコ染料溶液（3.0ml）、2
00ミリモルKP緩衝液中の10ミリモル過酸化水素10μｌ、
４′−ヒドロキシアセトアニリド（下記の第II表に示し
た種々の濃度）及びペルオキシダーゼ溶液10ml（200ミ
リモルの燐酸カリウム緩衝液50ml中の165プルプロガリ
ン単位/mgの活性を有する酵素3.03mg）。
30℃で標準分光光度計を使用して670nmで吸光度を測定
した。１分後の吸光度の変化（ΔＡ）として下記の第II
表に示す、得られたデータは、４′−ヒドロキシアセト
アニリド（４−HA）の存在でペルオキシダーゼによって
触媒されてロイコ色素の酸化速度が向上したことを示
す。
第II表 ４−HA濃度（モル濃度） ΔA ０ 0.167 8.3×10-8 0.178 1.7×10-7 0.200 3.3×10-7 0.226 8.3×10-7 0.265 1.7×10-6 0.356 3.3×10-6 0.535 8.3×10-6 0.831 1.7×10-5 1.108 3.3×10-5 1.544 8.3×10-5 1.900 1.7×10-4 2.078 3.3×10-4 2.104 6.6×10-4 1.743 1.7×10-3 1.461 例３ ペルオキシダーゼ反応速度の増大のための電子移動剤と
してのp,p′−ビフェノールの使用 ロイコ染料の溶液を下記の物質、すなわち、200ミリモ
ル燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）、100ミリモルグルコ
ース溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（緩衝液50ml中5
g）、燐酸カリウム緩衝液50ml中のロイコ染料0.05g、0.
05モルジメドン及び1.25ミリモル過酸化水素から製造し
た。
キュベットに試薬を下記の順序で加えることにより試験
溶液を製造した：ロイコ染料溶液790μｌ、ペルオキシ
ダーゼ（10プルプロガリン単位/ml）200μｌ及びp,p′
−ビフェノール（第III表に示した種々の量）。
30℃で標準分光光度計を使用して670nmで吸光度を測定
した。１分後の吸光度の変化（ΔＡ）として下記の第II
I表に示す、得られたデータは、４回の測定値の平均で
あり、p,p′−ビフェノールの存在でペルオキシダーゼ
によって触媒されてロイコ染料の酸化速度が向上したこ
とを示す。
第III表 p,p′−ビフェノール濃度（モル濃度） ΔA ０ 0.004 10-5 0.382 ２×10-5 0.670 ３×10-5 0.886 ５×10-5 1.145 10-4 1.406 例４ 分析要素を使用したジゴキシンの測定 この例は、ジゴキシンの測定のための本発明の実施を説
明するものである。
下記の構造及び成分を有する本発明の要素を製造した： この要素を使用して下記の方法でジゴキシンを測定し
た。緩衝液（pH7）中で種合の量のリガンドであるジゴ
キシンを含む一連の試験試料を製造した。各試験試料の
10μｌの試料を要素に施して37℃で約５分間静置した。
この時点で、α−グリセロールホスフェート100ミリモ
ルを含む洗浄液10μｌの試料を要素に、試験試料と接触
した拡散層部分上に施して未複合リガンドアナローグを
複合リガンドアナローグから水平方向に洗浄除去し、検
出可能な色素を生成する酵素反応を開始させる。次に、
複合リガンドアナローグを標準反射計を用いてスポット
部分の中心で670nmで反射濃度を監視することによって
測定した。色素濃度の変化率を静置中に60秒と120秒の
間で行った測定から計算した。ウィリアムス−クラッパ
ー（Williams−Clapper）変換（J.Optical Soc.Am.、43
巻595頁、1953）を使用して反射濃度値から透過濃度値
を測定した。試験液中のジゴキシンの濃度は、色素形成
の速度に反比例することが観察された。
例５ 分析要素を使用したフェニトインの測定 下記の構造及び成分を有する、フェニトイン測定用の分
析要素を製造した。フェニトインは、ジフェニルヒダン
トインとしても知られている。
0.01モルの３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン
酸緩衝液（pH7）、0.15モルの塩化ナトリウム及び0.05
％のウサギγ−グロブリンを含む緩衝液中で種々の量の
フェニトインを含む一連の試験試料を製造した。試験試
料中のフェニトインの濃度を下記の第IV表に示す。
試験には、下記の標識接合体を使用した:5−エチル,5−
フェニルヒダントイン−バレレ−ト−グルコースオキシ
ダーゼ。
標識を各試験試料と混合し、得られた混合物の８μｌの
試料を要素上に落とし、要素を37℃で７分静置すること
によって試験した。静置の間、反射率計を用いて670nm
で反射濃度を監視した。色素濃度の変化率を静置中に60
秒と120秒の間で行った測定から計算した。ウィリアム
スークラッパー（Williams−Clapper）変換（J.Optical
Soc.Am.、43巻595頁、1953）を使用して反射濃度値か
ら透過濃度値を測定した。
結果を下記の第IV表に示す。これらのデータは、観察さ
れた変化率（時間と共に透過濃度における変化として示
した）が試験試料中のフェニトインの濃度に反比例する
ことを示す。これらのデータを使用してプロットした用
量応答曲線から、 0.155の動的範囲が得られた。
第IV表 フェニトイン濃度 ＤＴ／分（モル濃度） （本発明） ０ 0.307 10-8 0.289 10-7 0.267 10-6 0.225 10-5 0.188 10-4 0.154 ２×10-4 0.152 例６ コレステロールの測定 この例は、本発明の分析要素を使用してコレステロール
を測定するための本発明の実施を説明するものである。
下記の成分及び構造を有する要素を製造した： この要素を評価するため、ウシ及びヒト血清から、41mg
/dl〜876mg/dlのコレステロール濃度のコレステロール
標準列を製造した。
要素にこれらの標準品の10μｌの小滴スポットを落と
し、エクタヘム（EKTACHEM）臨床化学分析装置を使用し
て標準操作を用いて540nmで、37℃で反射濃度を読み取
った。種々の濃度で得た反射濃度（ＤＲ）を下記の第Ｖ
表に示す。
第Ｖ表 コレステロール濃度 ＤＲ （mg/dl） 540nm、37℃ 41.0 0.522 93.0 0.756 144.0 0.926 198.0 1.060 268.0 1.205 308.3 1.288 392.0 1.387 438.0 1.456 441.8 1.526 533.0 1.589 649.0 1.691 876.0 1.770 例７ テオフィリンの測定 下記の構造及び成分を有する、テオフィリン測定用の分
析要素を製造した。
テオフィリン−グルコースオキシダーゼ接合体を0.5×1
0-8モル〜８×10-8モルの範囲で変動する濃度で含み、
テオフィリンを含む（10-3モル）溶液及びテオフィリン
を含まない溶液を製造した。これらの溶液の試料（10μ
ｌ）を前記要素の拡散層の一定領域上に落とした。37℃
で２〜３分間静置した後、反射濃度を変形標準反射計を
用いて670nmで各要素の一定領域の中心で測定した。ウ
ィリアムスークラッパー（Williams−Clapper）変換
（J.Optical Soc.Am.、43巻、595頁、1953）を使用して
透過濃度値（ＤＴ）を測定した。
下記の第VI表に示す、得られた結果は、テオフィリンを
含む溶液と含まない溶液との間の変化率（ＤＴ／分）の
差を示す。これらのデータから、この溶液がテオフィリ
ンの測定に有用であることが判る。
〔発明の効果〕 本発明は、ロイコ染料と組み合わせて使用する場合にペ
ルオキシダーゼ触媒によるロイコ染料の酸化反応の速度
を向上させる手段を提供する。この利点は、溶液分析又
は乾式分析においてペルオキシダーゼ及びロイコ染料と
共に一定のフェノール類又はアリニン類を使用すること
によって達成される。これらのフェノール類又はアリニ
ン類は、電子移動剤とて作用しうる、すなわち、ペルオ
キシダーゼの存在で過酸化水素と反応してロイコ色素よ
り酸化電位の高い中間化合物を生成しうるものでなけれ
ばならない。本発明は、反応速度が極めて高いという利
点と共に、高い吸光度の色素を生成するロイコ染料の使
用により得られる利点を結合して有する。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ペルオキシダーゼ又は免疫学的に反応性の
    リガンドのペルオキシダーゼ標識アナローグ、ペルオキ
    シダーゼ及び過酸化水素の存在下に検出可能な色素を生
    成しうるイミダゾール又はトリアリールメタンロイコ染
    料、並びにペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素と反
    応して、ロイコ染料より高い酸化電位を有する中間化合
    物を生成しうるフェノール又はアニリン電子移動剤を含
    む分析用組成物。
  2. 【請求項２】吸収性担持物質を含み、そしてペルオキシ
    ダーゼ又は免疫学的に反応性のリガンドのペルオキシダ
    ーゼ標識アナローグ、ペルオキシダーゼ及び過酸化水素
    の存在下に検出可能な色素を生成しうるイミダゾール又
    はトリアリールメタンロイコ染料、並びにペルオキシダ
    ーゼの存在下に過酸化水素と反応して、ロイコ染料より
    高い酸化電位を有する中間化合物を生成しうるフェノー
    ル又はアニリン電子移動剤を含む分析用組成物を含有し
    ている、乾式分析のための分析要素。
  3. 【請求項３】A.被分析物を含むと思われる液体試料をペ
    ルオキシダーゼ又は免疫学的に反応性のリガンドのペル
    オキシダーゼ標識アナローグ、ペルオキシダーゼ及び過
    酸化水素の存在下に検出可能な色素を生成しうるイミダ
    ゾール又はトリアリールメタンロイコ染料、並びにペル
    オキシダーゼの存在で過酸化水素と反応して、ロイコ染
    料より高い酸化電位を有する中間化合物を生成しうるフ
    ェノール又はアニリン電子移動剤を含む分析用組成物と
    接触させ、そして B.被分析物の存在の結果として検出可能な色素を測定す
    る 工程を含む被分析物の測定方法。
  4. 【請求項４】ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下
    に検出可能な色素を生成しうるイミダゾール又はトリア
    リールメタンロイコ染料、およびペルオキシダーゼの存
    在下に過酸化水素と反応して、ロイコ染料より高い酸化
    電位を有する中間化合物を生成しうるフェノール又はア
    ニリン電子移動剤を含む分析用組成物。
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