JPS6285866A - 分析要素中での水平分離を利用する不均質免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学、並びに液体中の免疫学的に反応性の
リガンドを測定するための不均質な競合的結合免疫検定
法に関する。本発明は生物学的流体のような水性液体中
の上記のようなリガンドを測定するのに特に有用である
。

〔従来の技術〕

自然の免疫学的反応を利用する競合的結合免疫検定法は
臨床化学における分析技術として広範囲に及ぶ用途が見
いだされている。その反応は特異性があるので、その検
定法は、非常に低い濃度で存在しそれで化学技術によっ
ては適切に定量することのできない生物学的被分析物を
定量するのに特に有益である。そのような被分析物（本
明細書においてはリガンドと呼ぶ）としては、例えば、
治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、蛋白質等がある。非
常に低い濃度のリガンドを測定するために幾つかの技術
が案出されてきている。例えは、すガントを容易に測定
できるようにするために種々の手段によってリガンドを
標識することができる。

競合的結合測定法においては、標識されたりガントアナ
ログ（本明Ｍ書においてはりガントアナログとして同定
される）を、固定量の適切な結合性物質（本明細書にお
いては受容体と呼ぶ）との反応にたいして、標識されて
いないリガンドとの競合で配置する。未知濃度のリガン
ドは、結合されたりガントアナログ又は結合されなかっ
な（即ち、遊離の）リガンドアナログのいずれかの測定
された信号から測定することができる。その反応は次の
ように進行する： リガンド＋リガンドアナログ士受容体 ↑ｔ リガンド−受容体＋リガンドアナログー受容体複合体な
標識としては放射性標識、酵素、発色団、発蛍光団、安
定なａ離基、酵素補因子、酵素阻害物質及びアロステリ
ックエフェクターがある。

測定すべきリガンドの濃度が極めて低いので怒度は最も
重要である。最初の非常に敏感な検定法は標識として放
射性同位体を用いた。蛍光標識又は酵素標識はほとんど
の商業的免疫検定法において最近は好まれている。

競合的結合免疫検定法は不均質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ
ｏｕｓ）又は均質（ｈ　ｏ　ｍ　ｏ　ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　
ｏ　ｕ　ｓ　）のいずれかとして分類することもできる
。不均質免疫検定法は結合されたりガントアナログを遊
離のりガントアナログから分離することを必要とする。

結合されたりガントアナログの特性とＷ１離のりガント
アナログの特性とは有意には異なっていないので、この
分離が必要になる。均質免疫検定法は分離工程を必要と
はしない。なぜなら、結合されたりガントアナログの特
性と遊離のりガントアナログの特性とはそれらが識別可
能であるように十分に異なっているからである。

国際特許出願８２／２６０１には、単一層繊維質媒質で
実施される不均質免疫検定法が記載されている。

その記載された検定法は、その媒質の有限区画中に結合
性物質（即ち、受容体）を沈降させて固定させ、その有
限区画をリガンド及び標識指示薬を含有する試料と接触
させ、未反応の標識指示薬を溶剤流でその有限区画から
放射状に洗い出し、そしてその有限区画中に残っている
結合された標識指示薬の量を測定することによって実施
される。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記した免疫検定法は、遊離標識指示薬を結合標識指示
薬から水平に洗い去るために別個の洗浄工程必要とする
。結合リガンドアナログと遊離リガンドアナログとを分
離するための分離工程を必要とせず、従って使用及びオ
ートメーション化が一層簡単な免疫検定法をもつことが
望ましい。

〔問題点を解決するための手段〕

公知の免疫検定法の問題点は、多孔貰の拡散性層を含む
乾式分析要素を用いて免疫学的に反応性のリガンドを測
定する方法であって、 Ａ、標識リガンドアナログ及び前記リガンドの受容体の
存在下で、固定リガンド−受容体複合体をその拡散性層
の有限区域内に形成させるような、そしてその固定複合
体と非複合化リガンドとの実質的な水平分離を生じさせ
るようなり様で、そのリガンドを含有していると思われ
る液体試料をその拡散性層中に徐々に拡散させる工程、
及びＢ、その接触の完了の少なくとも５秒後に、その有
限区域の中心の範囲内の固定複合体を測定する工程、 を含むことを特徴とする上記の方法を用いて克服される
。

〔実施態様〕

本発明は免疫学的に反応性の化学種を測定するための特
殊な結合検定法、例えば免疫検定法、である。これらの
測定法においては、測定されるべき種及び相当する標識
種は、固定量の共通の反応体にたいして競合する。測定
されるべき種は本明細書においてリガンドと称され、そ
して標識種はりガントアナログと称される。リガンド及
びリガンドアナログを特異的に見分けそしてそれらと反
応して複合体を形成する化き物は本明細書において受容
体と称される。

本発明は生物学的流体（例えば、全血液、血清、血漿、
尿、髄液、ヒト又は動物の組織の懸濁液、糞便、唾液、
リンパ液等）のような液体中の低濃度の免疫学的に反応
性のリガンドを測定するのに利するように用いることが
できる。リガンドは１０−　”　Ｍのような低い濃度で
、そして最も一般的には１０−９〜１０〜４Ｍの濃度で
測定することができる。

定性的に又は定量的にのいずれかで上記のように測定す
ることができるリガンドとしては、治療薬（例えば、ジ
フェニルヒダントイン、フェノバルビタール、セオフィ
リン、ジェンタマイシン、キニジン、プロパノロール、
トブラマイシン、リドカイン、プロ力インアミド等）、
天然又は合成のステロイド（例えば、コルチゾール、ア
ルドステロン、テスＩ・ステロン、プロゲステロン、エ
ストリオール８′）、ホルモン（例えば、甲状腺ホルモ
ン、ペプチドホルモン、インシュリン等〉、蛋白質（例
えば、アルブミン、ＩｇＧ、ＩＢＭ等）、抗原、抗体、
及び受容体と自然に反応するその他の種がある。本発明
はセオフィリン、フェノバルビタール又はジフェニルヒ
ダントインのような治療薬の測定に特に有用である。

本発明の免疫検定法は、希釈された又は希釈されていな
い試験試料（例えば１−〜２００μｒ）を収容するのに
適した多孔度をもつ最外部の多孔質拡散性層を上部にも
っている支持体からなる乾式分析要素を用いて成功裏に
天施される。好ましくは、その拡散性層は等方性的に多
孔質であり、その特性は区画を構成している諸粒子の間
の相互連絡された空間によって作られている。等方性的
に多孔質とは、その拡散性層がその付与された流体を放
射状にその層全体に均一に拡散させることを意味する。

木明＃ＩＩ書及び特許請求の範囲の文脈においては、実
質的な水平分離とは、得るべき複合化リガンドの意味の
ある定量について十分に有意の分離をいう。

本発明の一実施態様においては、徐々に拡散する態様及
び固定複合体と非複合化リガンドとの実質的な水平分離
を生じるＲ様で液体試料がその層に付与される限りは、
任意の拡散性層を分析要素に用いることができる。液体
付与についての特定の技術は後記する。

そのような多孔質の拡散性層を作るのに有用な吸収材は
、水、又は全血液又は血清のような生物学的流体に暴露
した時にも不溶性でありそしてそれらの構造保全性を維
持する。有用な要素は紙、多孔買粒状ｔＲ造物、多孔質
ポリマーフィルム、セルロース、木材、ガラス繊維、（
合成又は非合成の）繊維質織布及び不織布等から調製さ
れた拡散性層をもつことができる。そのような層を作る
のに有用な材料及び方法は当該技術で周知である。

多孔質の拡散性層は任意の適した繊維質又は非繊維賞材
料あるいはそのいずれかの又は両方の混合物から調製す
ることができる。

有用な拡散性層は米国特許第４，２９２，２７２号明細
書に記載されているように、適した結合材と混合されて
いるか又は織布に織られているがのいずれかの繊維質材
料を用いて調製することができる。

他の方法として、そして好ましくは、拡散性層は、米国
特許第３，９９２，１５８号及び第４，２５８，００１
号明細書に記載されているように、ポリマー配合物（例
えば白化（旧ｕｓｈ）ポリマー）又は粒状材料、例えば
結合接着剤と共に又は結合接着剤なしで結きされたビー
ズから調製される。

種々のタイプの粒状物くその総てが、液体成分中におい
て非膨潤性であり、そして液体成分に対して化学的に不
活性であり、不透過性であることが望ましい）が拡散性
層を形成するのに有用であり、その例としては、例えば
、顔料（二酸化チタン、硫酸バリウム等）、珪藻土、コ
ロイド物τ丁、樹脂ビーズ又はガラスピーズ等がある。

一般的には、そのような物質は結き刑に配分される。

粒状物質は隣接粒子の表面域で相互にｆ４着する粒子を
得るように処理することができ、この場合にこれらの粒
子は最近接して凝集性の三次元格子を形成し、この格子
は試験すべき液体に本質的に非膨潤性である。

その他の有用な粒状物質の例としては米国特許第４，４
３０，４３６号明細書に記載されたポリマー粒子があり
、その粒子は粒子中に含まれた反応性基によって粒子の
接触点で相互に化学結合されている。

その他の有用なポリマー粒子は特開昭５７−１０１７６
０号公報に記載されており、その粒子は低分子呈接着性
化合物（例えば、ビフエ、／−ル、ジカルボン酸、又は
アミノ化合物等の反応生成物）との接触点で相互に化学
結合している。

特に有用な拡散性層は、有機ポリマー粒子と（前記の）
米国特許第４，２５８，００１号明細書に記載のこれら
の粒子用のポリマー接着剤とによって形成された粒状構
造をもつものである。ポリマー接着剤によって粒状構造
内の有機ポリマー粒子の粒状一体性を維持することによ
って融合及び空隙中への粒子の流入を防止し、そして隣
接粒子に接触しているその構造物の粒子表面域での接着
剤濃度は、そグ）接着剤が空隙中に流入して目詰まりさ
せることのないことを確実にする。

本発明を実施するのに好ましい拡散性層を調製するのに
用いられる物質は米国特許第４，２５８，００１号明細
書にかなり詳しく記載されている。その記載されている
粒状構造物の厚さは有機ポリマー粒子の大きさに依存し
て変化する。最適の液体拡散性のためには、粒子付着量
（ｐａｒｔｉｃｌｅ　　ｃｏｖｅｒａｇｅ）は一般的に
は２５〜１８０ｇ／ｌ１１２の範囲内である。

本発明の実施に有用な熱安定性有機ポリマー粒子は一最
的には直径１〜２００μ鎖の範囲内の粒度をもつ球状ビ
ーズである。好ましくはそれらは直径２〜５０μｍの範
囲内の粒度をもつ。

粒子は天然及び合成の両方のポリマーを含めて、必要な
特性をもつ広範囲の有機ポリマーで構成することができ
る。しかしながら、好ましくは、粒子はエチレン性不飽
和重き性モノマー一種以上から形成された一種以上のけ
加ポリマー、例えば単一モノマーの付加ホモポリマー又
は二種以上のそのようなモノマーから形成されたコポリ
マー、で構成される。これらのポリマーは種々の標準的
な重合法（例えば、溶液重合法、乳化重合法、分散重合
法、懸濁重合法等）の内の任意の方法によって調製する
ことができる。所望ならば、その粒状ポリマーはその粒
子に種々の相互作用性組成物を結合させるために一個以
上の反応部位を含有することができるが、本発明はその
ように限定されるものではない。

特に有用な付加ポリマーは一種以上の下記のエチレン性
不飽和の重合性上ツマ−を重合させることによって形成
されたものである： し）０〜１００、好ましくは０〜９９重量％のアミン置
換基のないビニル芳香族モノマー一種以上、（ｂ）０〜
２５重量％のアクリル酸エステル一種以上、 （ｃ）　Ｏ〜１００、好ましくは０〜７５重呈％のメタ
クリル酸エステル一種以上、 （ｄ）０〜３０重量％のエチレン性不飽和カルボン酸一
種以上、 （ｅ）　０〜７５重量％のエチレン性不飽和ニトリル一
種以上、 （ｆ）０〜２０重景％のアミノ置換ビニル芳香族モノマ
ー一種以上、 輸〉０〜２０、好ましくは０〜１０重旦％の架橋性基含
有エチレン性不飽和モノマー（ジアミン又はゼラチン硬
化剤で架橋することのできるもの並びに二個以上のエチ
レン性不飽和の重合性基をもつものを含む）一種以上、 （ｈ）０〜２０重量％の第三アミノアルキルアクリレー
ト又はメタクリレート一種以上、 （ｉ）０〜１００、好ましくは０〜７５重址％の重合性
Ｎ−複素環式ビニルモノマー一種以上、及び（ｊ）０〜
２０重量％のアクリルアミド又はメタクリルアミド一種
以上。

特に有用な付加ポリマーとしては米国特許第４．２５８
，００１号明細書の第１表に列記されているものがある
。［］括弧内の数字はポリマーのＴＡ製に用いたモノマ
ーブレンド中の諸モノマーの重量比である。ポリ　（ビ
ニルトルエン−ｃｏ−ｐ−ｔ−ブチルスチレン−ｃｏ−
メタクリル酸）　［６１：３７：２］、ポリ　（スチレ
ン−ｃｏ−アクリル酸ｎ−ブチル）　［７５：２５］及
びポリスチレンが好ましいポリマーである。

その有機ポリマー粒子は、所望ならば、当業界で公知の
ようにその他の付加物を含有することができる。

本発明で有用なポリマー接着剤は有機ポリマー粒子を相
互に結合させて拡散性層中に凝集性の三次元格子を提供
する。この接着剤の詳細は前記の米国特許第４，２５８
，００１号明ＩＰａ書に記載されている一般的には、そ
の接着剤はその粒子中に含まれている特殊なポリマーと
は異なる有機ポリマーで構成されているが、実際に一般
的にその接着剤は粒子のポリマー組成物中に存在するあ
るものと同−又は類似の多くの繰り返し単位を含むポリ
マーである。

好ましくは、接着剤は一種以上のエチレン性不飽和の重
合性モノマーから形成された一種以上の付加ポリマー、
例えば二種以上のそのようなモノマーから形成された付
加コポリマー、で構成される。接着剤は種々の標準的な
重合法のいずれかによって調製することができる。

一般的には、粒状構造物中に含まれる接着剤の量は、最
適の接着及び液体拡散時間を提供するためには粒子の重
量に基づいて１０％未満、好ましくは２〜６％、一層好
ましくは３〜４％である。

接着剤として用いられる特に有用な付加ポリマーは下記
のブレンドから選ばれたエチレン性不飽和の重合性モノ
マーのブレンドを重合させること。　　によって形成さ
れる。

Ａ、前記したアミノ置換基のないビニル芳香族モノマー
一種以上１〜３５好ましくは１０〜３０重量％及びアク
リル酸アルキル又はメタクリル酸アルキル一種以上６５
〜９９好ましくは７０〜９０重量％を含有するブレンド
、 Ｂ、アミン置換基のないビニル芳香族モノマ−、アクリ
ル酸エステル、メタクリル酸エステル又は架橋性基含有
エチレン性不飽和の重合性モノマー一種以上２０〜９５
好ましくは５０〜９５重量％、及び活性水素をもつエチ
レン性不飽和の重合性モノマー又はその塩一種以上５〜
８０好ましくは５〜５０重量％を含有するブレンド、 Ｃ，１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニル−２−ピロリ
ドン、ビニルベンジルアルコール、アクリル酸エチル、
アクリルアミド又はメタクリルアミドからなる群から選
ばれたエチレン性不飽和モノマー一種以上１５〜１００
重量％、及び架橋性基を含有するエチレン性不飽和の重
合性モノマー一種以上０〜８５重呈％を含有するブレン
ド、Ｄ、アクリル酸エステル又はメタクリル酸エステル
一種以上６０〜９８好ましくは９０〜９８重量％、及び
一種以上の、陰イオン部分く例えば、カルボキシ、スル
フィノ、スルホ、ホスホノ等、又はそれらのアルカリ金
属塩又はアンモニウム塩）−個以上を含有するエチレン
性不飽和の重合性モノマー一種以上２〜４０好ましくは
２〜１０重量％を含有するブレンド。

特に有用な付加ポリマーは米国特許第４，２５８，００
１号及び第４，２８３，４９１号明細書の第２表に列記
されている。「　］括弧内の数字はポリマーの調製に用
いたモノマーブレンド中の諸モノマーの重量比である。

ポリ　（アクリル酸メチル−ｃｏ−メタクリル酸２−ア
セトアセトキシエチル−ｃｏ−２−アクリルアミド−２
−メチルプロパンスルホンＭ）　ｃｓｓ＋７：５］、ポ
リ　（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、及びポリ（アク
リル酸ｎ−ブチル−ｃｏ−スチレン−ｃｏ−２−アクリ
ルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ナトリウム
塩）　［７５：２０：　５　］が好ましい接着剤ポリマ
ーである。

前記した粒子及び接着剤をもつ粒状構造物を調製するの
に種々の方法を用いることができる。有用な方法の特定
の詳細は米国特許第４，２５８，００１号明細書に記載
されている。

本発明の一実施態様においては、その要素拡散性層は、
粒子が２〜２０好ましくは４〜１２μ…の範囲の粒度を
もつという臨界的特色をもつ前記の粒状構造物で構成さ
れている。この大きさの粒子を用いると、適切な毛管作
用及び液体試料保持時間が得られ、このことは特定の結
合反応を生じさせそして複合されなかったリガンドを拡
散性層中で複合されたリガンドから水平に移動し去らせ
る。

垂直分離（即ち、層から層へ）は有意の程度には生じな
い。

本発明で有用な要素の拡散性層は適した支持体上に支持
される。そのような支持体は寸法的に安定で、好ましく
は非孔質で透明な（即ち、放射線透過性の）任意の適し
た物質であることができ、これは２００〜９００ｎ…の
波長の電磁線を透過させる。

特定の要素についての選択範囲の支持体は意図された検
出方式（反射、透過又は蛍光分光分析法）に適合すべき
である。有用な支持体物■としてはポリスチレン、ポリ
エステル［例えば、ポリ　（エチレンテレフタレート）
コ、ポリカーボネート、セルロースエステル（例えば酢
酸セルロース）等がある。

好ましくは、その要素は又、指示薬組成物を含有する試
薬層を含む。場合によっては存在してもよいその他の層
、例えば下塗り層、放射線遮断層等、を所望によって含
むことができる。その要素の総ての層が相互に流体接触
となっており、このことは、流体及びその流体中の試薬
及び非複６化反応生成物が隣接層の重ね合わされた区域
相互の間を通過することができることを意味する。しか
しながら、拡散の間は、非複合化リガンドアナログの主
要移動は垂直よりはむしろ水平である。

その要素の試薬層は一般的には、一種以上の合成又は天
然結合剤、例えばゼラチン、又はその他の天然産コロイ
ド、ホモポリマー及びコポリマー、例えばポリ　（アク
リルアミド）、ポリ　（ビニルピロリドン）、ポリ　（
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ　（アクリル
アミド−ｃｏ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）及び類似
コポリマー、中に分散した一種以上の試薬からなる指示
薬組成物を含有する。

その要素の拡散性層は、測定時に測定されるべきリガン
ド用の受容体を含有することができる。

もしリガンドが抗原であるならば、受容体はその抗原に
対して特異的な抗体であり、その抗体はその抗原と反応
して複合体を形成する。もしリガンドが抗体であるなら
ば、受容体は適切な抗原である。本発明の好ましい実施
態様においては、リガンドは治療薬（例えば、セオフィ
リン、フエメバルビタール又はジフェニルヒダントイン
）であり、そして受容体はその治療薬のための抗体であ
る。

受容体は一般的には商業的に入手でき、あるいはそれら
は公知の出発材料及び方法を用いて調製することかでき
る。一般的には、適切な受容体例えば抗体は、適した動
物にリガンドを接種して適切なプロトコール（ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌ）に従って抗体を生じさせ、そしてその発生し
た抗体をその動物から取り出すことによって製造される
。これらの技術は当業界で周知である。

その受容体は適した方法で拡散性層中に固定することが
できる。例えば、受容体はガラスピーズ、ポリマービー
ズ又はその他の粒子、樹脂等のような担体に固定するこ
とができる。有用な担体の一例は微生物、例えばスタフ
ィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）である。他の方法としては、ビー
ズ化された拡散性層は担体として役立つことができ、そ
れで受容体は追加の担体なしで拡散性層に固定される。

その固定された受容体は一般的にはその拡散性区域にお
いて１０−６〜］１？／ｎ＋２の量である。

受容体は固定された形態で拡散性層に加えることがてき
、あるいはりガントアナログを拡散性層に付与する時の
測定の直前又はその間に拡散性層に固定することができ
る。好ましくは、受容体は要素の製造中に拡散性層に固
定される。

本発明の検定法は、リガンドに結合してリガンドアナロ
グを形成することのできる適した任意の標識を用いて実
施することができる。有用な標識としては放射性標識、
発蛍光体、酵素、酵素阻害物置、アロステリックエフェ
クター、酵素補因子及びその他の公知の酵素モジュレー
タ−がある。

グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカ
リ性ホスファターゼのような酵素は好ましい標識である
。

酵素標識を用いるときには、その酵素の基質は好ましく
は要素中に、例えば試薬層中に存在する。

他の方法としては、液体試料の前に又は液体試料と同時
に、又は結合反応の完了後にその基質を要素に加えるこ
とができる。所定の標識について適している基質を決定
することは臨床化学における当業者の熟練の範囲内であ
る。その基質は酵素標識によって直接に作用される物質
であることができ、あるいは標識の酵素反応を伴う一連
の反応に伴なわれる物質であることができる。酵素標識
がペルオキシダーゼであるならば、基質は過酸化水素で
ある６−例として、グルコースを用いる時には、基質は
一般的には試薬層中に少なくとも０．０１モル／　ｍ　
２、好ましくは０．０１〜約２．５モノし／ｍ２の量で
存在する。測定法で用いられる酵素標識の量に対する特
定の基質の量をどのように調整するかは当業者の知って
いるところである。

ある種の標識例えば酵素、酵素補因子、蛍光化合物又は
酵素モジュレータ−を用いる時には、標識の反応結果と
して検知可能な種を提供する試薬一種以上を含む指示薬
組成物を試薬層が含有する。

好ましくは、指示薬組成物は酵素で標識されなりガント
アナログと基質との酵素反応の結果として比色的に検知
可能な種を提供する比色指示薬組成物である。指示薬組
成物は酵素反応で検知可能な染料を作る単一化合物でも
、あるいは染料を作る試薬の組合せでもよい。例えば、
基質としてグルコースを用いそして酵素標識としてグル
コースオキシダーゼを用いる時には、比色指示薬組成物
は、反応して発色染料を提供するカラーカプラー及び被
酸化性化合物を含有することができる。他の方法として
は、その組成物は、グルコースオキシダーゼがグルコー
スをグルコン酸に転化させる時に作られる過酸化水素の
形成の結果として検知可能な染料を発生させるロイコ染
料及びペルオキシダーゼ又はその他の適した過酸化性化
き物を含有することができる。有用なロイコ染ｆ）は当
業界で公知であり、その例としては米国特許第４，０８
９，７４７号明細書及びヨーロッパ特許公開筒１６２，
６８５号明ｍ書に記載されているものがある。比色指示
薬組成物及びそれの種々の成分の特定量は当業者の熟練
の範囲内である。

その要素の諸層はその他の種々の望ましいがしかし必須
てはない成分（表面活性剤、増粘剤、緩衝液、硬化剤、
酸化防止剤、カプラー溶剤、及び当業界で公知のその他
の物質を含む）を含有することができる。これらの成分
の量も当業者の熟練の範囲内である。

本発明の実施に有用なりガントアナログは公知の出発材
料及び方法を用いて調製することができ、あるいは商業
的に入手することができる。一般的には、アナログのり
ガント部分は共有結合によって５識（例えば、酵素部分
又は発蛍光体）に結合される。

本発明の免疫検定法は手動でも自動化されていてもよい
。一般的には、液体中のリガンドの量は、要素を供給ロ
ール、チップパグット又はその他の源から取りそして拡
散性層の有限域を液体試料（例えば、１〜２００μｍ）
と物理的に接触させことによって決定される。その接触
する有限域は一般的にはせいぜい約１００ｆｆｌＩＩ＋
２である。

拡散性層に２〜２０μｍの粒子を用いて前記の本発明を
実施する一方法においては、拡散性層に液体試料を付与
する技術は臨界的ではない。

しかしながら、本発明を実施する他の方法においては、
試料の接触は、リガンドと受容体との間の複き並びに複
合化リガンドと非複合化リガンドとの実質的な水平分離
が、液体の導入の間に生じるように液体試料の拡散が十
分に遅いような態様で成就されなければならない。この
接触は、ピペット又は試験試料を分配するのに適したそ
の他の分配手段を用いて手動で又は機械で実施される。

液体試料は水平分離を生じさせるために多数の方法で要
素の拡散性層に付与することができる。例えば、比較的
多量のく例えば、１００μｐまでの）液体試料はピペッ
ト、毛細管又はその他の手段を用いて連続法で徐々に（
例えば、少なくとも５秒間にわたって）付与することが
できる。他の方法としては、試料は小部分に別けて、例
えば、一連の二滴以上の液滴（例えば、０．１〜１μＮ
）としである時間（例えは、少なくとも５秒間）にわた
って付与することができる。この実施態様においては、
リガンド−受容体の複合及び水平分離の両方が拡散の間
に生じるように試料を十分に遅く付与することが臨界的
である。

垂直分離は本発明のいずれの実施態様においても有意の
程度には生じない。分離は要素への試料の付与が完了し
た５〜１８０秒後に本質的に完了する。

もじりガントアナログが製造中に要素中に混入されてい
ないならば、要素との接触と同時に又はその前にリガン
ドアナログを試験試料と混合することができる。

いずれかの実施態様で試料を付与した後、その要素を何
等かのコンディショニング（例えば、インキュベーショ
ン、加熱等）に暴露する。そのことは試験結果の収得を
速めるかあるいは又容易にするのに望ましいであろう。

本発明の実施においては洗浄工程は用いる必要がない。

リガンドの量は、複合したりガントアナログを直接に検
知するか又は酵素標識と基質との酵素反応の結果として
形成された検知可能な種を検知するのに適した装置にそ
の要素を通すことによって測定される。例えば１、その
種は一般的に公知の方法を用いて、適した放射線測定装
置、蛍光測定装置又は分光光度装置で検知することがで
きる。酵素反応においては、生成染料は、試験試料と接
触りまた有限域の中心で反射密度、透過密度又は蛍光を
測定することによって求められる。測定される面積は一
般的には直径３〜’ｚｎｍである。はとんどの複合した
リガンドはこの有限域にある。液体試料中のリガンドの
量はその有限域の中心て測定された標識の量に反比例す
る。一般的には、標識の測定は試料の接触及び拡散の５
〜１８０秒後に実施される。

以下の諸実施例によって本発明を更に具体的に説明する
。

本明細書及び特許請求の範囲の文脈で用いる時には、１
．Ｕ、は、酵素について標準的なｐＨ及び温度条件下で
毎分１μモルの基質の転化を触媒するのに必要な酵素活
性量を１１．Ｕ、であるとして定義した酵素活性につい
ての国際単位である。

犬１１　　　セオフィリンの１ セオフィリン（ｔｂｅｏｐｈｙｌ　ｌ　１ｎｅ）の測定
のための、次の構成及び成分をもつ分析要素を調製した
。拡散性層は５〜２０μｍのビーズを含有している。従
って、その層は多孔性となって試料の拡散が遅くなり、
そのために本発明の利益が達成される。

以下金白 されたポリスチレンビーズ　　　１４０Ｈ／ｍ２ポリ　
（アクリル酸ローブチル −ｃｏ−スチレ７−ｃ　Ｏ−２−アクリルアミド−２−
メチルプロパン 拡散性層　スルホン酸、ナトリウム塩〉［７５：２０：
５の重量比コ接着剤　　　８ｇｌ丘２ゾニル（Ｚｏｎｙ
ｉ）　Ｆ　Ｓ　Ｎ表面活性剤　　　　　　　　　　　１
・Ｉｇ／’ｍ２セオフィリン抗血清で被覆さ ロイコ染料［４，５−ビスく４−ジ メチルアミノフェニル）−２＝ （４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキ シフェニル）イミダゾール］　　　０．３ｇ／ｍ２試薬
ＩＰ！２．４−ジーｎ−アミルフェノール　　１．８ｇ
、／ｍ２ジメドン　　　　　　　　　　　０　、２２Ｆ
Ｋ、’　ｍ　２アルカノール ＸＣ　（ＴＭ）表面活性剤　　　　０．７Ｈ／ｎ＋２グ
ルコース　　　　　　　　　　１．９ｇ／ｍ２濃度が１
〜１２８μｇ／ｍｌで変化する一連の血清系セオフィリ
ン標準物を調製した。各々の標準物の１０μ！アリコー
トを、標準物の希釈が１：４０でありそしてアナログの
濃度が４Ｘ１０−８Ｍであるように、セオフィリンーグ
ルコースオキシダーゼアナログ及び希釈剤（０．０１Ｍ
燐酸カリウムバッファー、ｐＨ７．　Ｏ　　Ｏ．１５Ｍ
　Ｎａｆ！！及び０．１％ウサギガンマグロブリンを含
有する）と混きした。その試料の生成溶液を次いで、各
々の溶液の一滴１０μｌを用いてその要素の拡散性層の
有限域に点滴した。

３７℃で試料の点滴の後２〜３分間のインキュベーショ
ンの酸、その反射密度を、商業的に入手できる改良型反
射計で６７０ｎｍでその有限域の中心て測定した。透過
密度値を求めるためにＷｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｔａｐｐｅ
ｒのトランスフオーム（Ｊ　、Ｏｐｔｉｃａｌ　ｓｏｃ
。

八ｍ．，　　４３：５９５　、　１９５３）を用いた。

その結果を下記の第１表に挙げる。そのデーターから分
るように、染料形成速度は被分析物の濃度に反比例しな
。

以下，↑二白 策−」−」及 セオフィリンｆ４庁くμｇ社）　　　遣戊−Ｕ光１　　
　　　　　　　　０．１５７ ２　　　　　　　　　　０．１４５ ４　　　　　　　　　　０．１３１ ８０．１１０ １６　　　　　　　　　　０．０８５ ３２　　　　　　　　　　０．０８２ ６４　　　　　　　　　　０．０６８ １２８　　　　　　　　　　０．０６１フエノバルビタ
ール及びジフェニルヒダントインの定量分析のための必
要な試薬を含有している分析要素を実施例１に従って調
製しな。これらの実施例における評価法は次の点を除い
て実施例１で記載した方法と同じであった。即ち、フエ
ノバルビタールの検定においては、希釈係数は１ニア５
でありそしてフェノパルビタールー酵素アナログ濃度は
３ＸｉＯ−”Ｍであり、またジフェニルヒダントイン検
定においては、希釈係数は１：２５でありそしてジフェ
ニルヒダントイン−酵素アナログ濃度は３Ｘ１０−”Ｍ
であった点で異なっていた。

フエノバルビタールについての測定結果を下記の第２表
に挙げる。ジフェニルヒダントインについての測定結果
を下記の第３表に挙げる。両実施例において、染料形成
速度はリガンド濃度に反比例した。

以下栄白 第−ゴし−に− フェノハ゛ルビタール濃度（μｇ／ｍｉ’）　　　　　
　　速度、　ＤＴ／分０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．１６１Ｌ４　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．１５４２・６　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．１４２５．２　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．１３６１０．４　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．１１６２０．８　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．１０７４１．３　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．０９３８０．８　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．０Ｂ１１６５．０　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．０６９は下７パ白 第−一尤一人− 外フェニルヒタ′ントイン濃度（μ８／ｍｌ）　　　　
　　塩り度、　旧１５ｆ−０，１０，１２７ １，００，１＋７ ２．０　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１０４
３．８　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０９７
７．５　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｏ、ｏ８
９１４．７　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０
８３２９．２　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
０７３５７．０　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．０６５１２２．０　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．０６５〔発明の効果〕 本発明は結合リガンド及び遊離リガンドの水平分離を得
るのに別個の洗浄工程を必要としない簡単な免疫検定法
である。本発明の検定法は高度に自動化された分析機で
用いることのできる乾式分析要素を利用する。これらの
要素においては、結きされたリガンドと遊離のリガンド
との放射状分離即ち水平分離が試料の拡散の間に生じる
。それ故に、別個の洗浄工程は必要ではない。その測定
法は簡単で、迅速でそして好都合である。最小量の試料
の調製が！ｚ・要であり、それでその測定は、試料が要
素と接触した後の３分間のように短時間で完了する。

前記した利益は液体試料を拡散性層の有限域中に遅く拡
散させることによって成就される。この遅い拡散は、有
限域内での固定リガンド−受容体複今体の形成に対して
、並びに固定複合体からの非複合化リガンドの突貫的な
水平分離に対して適切な時間を与える。

を記のことが達成できる幾つかの方法がある。

例えば、その方法は、２〜２０μｍの粒度をもちそして
隣接粒子の各々の表面域で相互に結合されている多数の
粒子を含む粒状構造からなる（この場合に諸隣接粒子が
最近接して′ａ集性の三次元格子を形成し、この格子は
水性液体に本貫的に非膨潤性である）多孔質拡散性層を
もつ要素で実施することができる。

他の実施例においては、遅い拡散及び結合リガンドと遊
離リガンドとの分離は、要素を液体試料と徐々に接触さ
せることによって達成される。このことは、リガンドと
受容体との複合化が試料の拡散の間に生じることを保証
する。その接触技術は前記に一層詳しく記載されている
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多孔質の拡散性層を含む乾式分析要素を用いて免疫
   学的に反応性のリガンドを測定する方法であって、 （Ａ）標識リガンドアナログ及び前記リガンドの受容体
   の存在下で、固定リガンド−受容体複合体をその拡散性
   層の有限区域内に形成させるような、そしてその固定複
   合体と非複合化リガンドとの実質的な水平分離を生じさ
   せるような態様で、そのリガンドを含有していると思わ
   れる液体試料をその拡散性層中に徐々に拡散させる工程
   、及び（Ｂ）その接触の完了の少なくとも５秒後に、そ
   の有限区域の中心の範囲内の固定複合体を測定する工程
   、 を含むことを特徴とする上記の方法。