JPS59166866A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試料およびラベル付き試薬を含有する反応混合
物を形成せしめ、試料中のアナライトの１によって決る
割合で二つの形の間に試薬を分割するように混合物を培
養することによって試料中のアナライト（ａｎａｌｙｔ
ｅ　）　ｉこ対する分析を行なう方法番こ関する。かか
る分析には良く知られている免疫分析、ワンサイト免疫
測定分析（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ　ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉ
ｃ　ａｓｓａｙＪ、ツーサイト（またはガントウィッチ
）免疫測定分析（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ　ｉｍｍｕｎｏｍｅ
ｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ　）および凝集反応分析（ａｇｇ
ｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　）を含む０不均質
分析においては、ラベル付き試薬の二つの形を分離する
ことが必要である、かくして一つの量または濃度が他に
よって妨害されることなく測定できる。種々な分離方法
が使用されており、これには沈澱、沈降、濾過、遠心分
離および傾瀉を含む。本発明はラベル付き試薬の二つの
形を分離する別の方法に関する。

ジエイ・エル・ギーゲル等はＣ工ｉｎ、Ｃｈｅｍ、２８
／９゜１９８４頁〜１８９８頁（１９ｇ２年）に放射状
分配免疫分析を発表しており、こｎはアナライトに対す
る抗体を（第二抗体によって）ガラス繊維戸紙の中心点
で非移動性番こしている。アナライトを含有する試料を
、アナライトの酵素ラベル付は変種（ｖｅｒｓｉｏｎ　
）での培養後、スポットに付与している。次に洗浄溶液
をスポットに付与し、非移動性にされた抗体に結合さｎ
なかったラベル付き試薬の部分をスポットから移動させ
ている。洗浄溶液は酵素の基質を含有する。最後にスポ
ットに残った酵素濃度を螢光１１材□ 料の生成速度によって測定する。酵素は自動操作番こ良
く適合されるが次の如き多くの弱点を有している： （１）意図するそｎぞれ異なる分析に対し別々のセット
のＰ紙を必要とする。

（１１）非移動性にさｎた抗体を用いｐ紙の副整に注意
を払わなければならない、何故なら反応性抗体の瞳は均
一番こ分布し、一つのＰ紙から他の戸紙へと同じでなけ
ればならない。

＋１１１１同時にＦ紙に一つより多くの試薬を加えるこ
とができない。各試薬の添加後火の試薬の添加前に培養
期間を行なわなけｎばならない。

さもないと第一の試薬は続く試薬の添加≦こよって不移
動性番こされた抗体から洗い出されてしまう。

ｔｌＶ）特に高温で行なうとき培養期間中にＰ紙が乾燥
するのを防ぐ予防策を講じなけわばならない。

本発明はこｎらの欠点を克服することにある。

本発明は試料中のアナライトの分析を行なう方法を提供
することにあり、この方法はクロマトグラフィ媒体を用
意し、一部が上記媒体に移動性である形で存在し、一部
が上記媒体に非移動性である形で存在するラベル付試薬
を含有する反応混合物を形成し、二つの形の割合を試料
中のアナライトの艮によって決定し、反応混合物をクロ
マトグラフィ媒体上のスポットに付与し、ラベル付き試
薬の移動性の形をスポットから移動させ、その後ラベル
付試薬の移動性および非移動性の形の一つまたは両者を
測定することからなる。

本発明方法によｎば水性媒体中の他の所望の試薬とアナ
ライトを含有する試料の反応混合物を形成し、培養し、
所望によってそ２１．を数段階で行なう。次いで反応が
完了したときまたは所望時間続けたとき、反応混合物の
全部または一部をクロマトグラフィ媒体上のスポットに
付与する。媒体上で非移動性である種はスポットで残り
、移動性の種はそこから移動し去る。所望によってはス
ポットに好適な溶媒を続いて付与することによって移動
を助けることができる。

好適な溶媒は非移動仕種でなく移動仲種をクロマトグラ
フィ媒体を通って移動される溶媒である。水性液体の使
用が好ましいが、エタノールの如き有機液体も使用可能
である。所望によってＣ１溶媒は、クロマトグラフィ媒
体中でラベル付き試薬を非移動性にす、るようラベル付
き試薬の形の一つを沈淑させるよう番こ選択してもよい
。

ラベル付試薬の移動性の形の移動が充分な程度に生じた
とき、ラベル付き試薬の移動性または非移動性の形の何
れかが他から妨害されることなく測定できる。好ましく
は移動性の形のラベル付き試薬を少なくともＱ、　５　
ＱＴｎ移動させる。

スポットに残った非移動性の形のラベル付き試薬を測定
するのが好ましい。

本発明方法においては、通常の分析に使用できる任意の
ラベルを使用できる。最も普通の群のラベルは放射性原
子、酵素、および螢光および発光材料である。

使用するクロマトグラフィ媒体は、ラベル付き試薬が分
配さ２′シた二つの形か異なる移動性を有する媒体であ
り、か（すると一つの形を他の形から物理的に分離でき
る。一つの形か媒体で実質的に非移動性、好ましくは完
全に非移動性である、しかし僅かな移動性は必ずしも本
発明方法を無効にすることはない。媒体はカラムの形で
あるとよく、ラベル付き試薬の移動性の形はそれに沿っ
て移動させる。好ましくは媒体はシート、例えばクロマ
トグラフィ紙の形である、そして反応混合物をその上番
こスポットで付与し、移動性の形のラベル付き試薬をス
ポットから放射状に移動させる。媒体が紙の詰物または
材料のブロックの形であるとき、（イ動件の形のラベル
付試薬は詰物またはブロック中に移動せしめられ、その
表面から消失する。或いは一枚の紙または他のクロマト
グラフィ媒体を反応混合物中に浸漬する、このとき移動
性の形のラベル付き試薬は上方へ移動せしめられる。或
いは一つの形が磁性的に官応性であるとき、外部磁界を
適用することによってそれは非移動性にすることができ
、一方非磁性の形のものは移動性のまま残る。

クロマトグラフィ手段によってラベル付き試薬の結合さ
れた形および結合されない形の分離を有利に行なうこと
のできるそれ自体良く知られた各種の分析がある。

（ａｌ二重抗体例。　競争分析において、試料中のアナ
ライト、およびアナライトのラベル付き変種をアナライ
トに対する特定結合剤の限定量と競争反応させる。アナ
ライトが抗原体またはハプテンであるとき、特定結合剤
は一般にその連合した抗体である。アナライト／特定結
合剤錯体は特定結合剤に抗体（第二抗体）の添加により
不溶性にされる。特定結合剤はアナライトおよびラベル
付きアナライトで培養する前、培養中または培養後節二
抗体と反応してもよい。

反応混合物をクロマトグラフィ媒体上のスポットに付与
したとき、二重抗体錯体はスポットに近く残り、一方非
結合ラベル付き試薬は続いて適当な溶媒を付与すること
によってスポットから除去される。

ｆｂ１粒状固体相。　抗体納会ラベル付き試薬および非
結合ラベル付き試薬間の区別は叫々方法（ａ目こよって
達成するのが困難である。これは高分子量のアナライｍ
ｌこ対するプｔつかの競争分析でそうである、或いは免
投測定分析系を使用するとき更に重要である。かかる場
合、アナライトに対する特定結合剤は粒状固体相に結合
させるとよい、粒状固体相は、クロマトグラフィ媒体上
のスポットに付与したとき、粒子カ続いて付与した溶媒
の影Ｊ下に著しい程度に移動しないように選択する。好
適な粒状材料は市場で入手でき、それらに試薬を結合さ
せる方法は良く知られている。続いて付与する溶媒は非
結合ラベル付き試薬をスポットから移動し去るようにす
る。

本発明のこの応用は競争分析例えば免投分析に好適であ
る、しかし特に試料中のアナライトが過剰の非移動性に
さｎた特定結合剤に結合せしめらｎ、アナライトＪこ対
するラベル付き特定結合剤がアナライトの空の結合位置
に結合せしめられているツーザイト免疫測定分析に好適
である。良く知らｎているように試料中のアナライトは
、二つの特定結合剤（一つは非移動性にされ、他はラベ
ル付けされている）で、何れかの順序でまたは同時に培
養できる。非移動性にさｎた材料に結合されたラベル付
き試薬の；孟は試料中のアナライトの量番こ正比例する
。

（ｃｌ凝集反応。　凝集の終点は肉眼および器械使用に
よる多くの方法で評価できる。しかしながら低凝集度で
は、少数のａ果物は非凝集粒子の大きな背景によって不
明瞭になることがあり、判別困難にし、分析の感度を低
下させる。本発明方法を使用すると、クロマトグラフィ
媒体上のスポットに付与したとき、凝集した粒子はスポ
ット近くに残り、一方非凝集粒子は適当な溶媒ｔＣよっ
て除去されるように粒子特性を選択することかできる。

螢光または着色粒子を用いることによって、非凝集粒子
の不存在−ドスポットで凝集粒子を検出（肉眼または器
械測定嘉こよって）ことができる。この方法で、感度が
改良さてしる。凝集した粒子は、米国特許第４３３２７
８８号に記載されている如く、固定化合物を用いること
番こより非凝集粒子からクロマトグラフィにより分離す
る前に安定化することができる。

凝集反応≦こラベル付き粒子を使用することは知られて
おり、例えば米国特許第３８５３９８７号および第４３
３２７８８号に記載されている。

しかしクロマトグラフィによるラベルの二つの形の分離
は教示されていない。

下記実施例は本発明を示す。

実施例　ｌ 〔方法［ａｌを示す〕 チロキシンの放射線免疫分析 １、下記試薬を一連の試験管中で一緒に室温で４５分間
培養した。

２０μｌのヒト血清中のチロキシンの標準溶液。

５０μｊの好適な緩衝剤中の１′５エラベル付きチロキ
シン。

５０μｌのトリス／ＮａＣ１緩衝剤中で稀釈した羊抗チ
ロキシン血清（γ−グロブリン画分）。

２．５％ＰＥＧ　６０００を含有するトリス／ＮａＣ１
緩衝剤中で稀釈したろば抗羊γ−グロブリン血清１００
μｌを各試験管に加え、室温で更に５分培養した。

３、各試験管中の反応ｉＭ台物から１００μｌ容ノ■を
取り、周辺で支持された直径２．５　ｃ！ｍのガラス繊
維フィルター盤（ワットマンＧＦ／Ｄ）の中心に徐々に
付与した。

４、トリス／ＮａＣ１緩衝剤４００μＥ容着を次いで各
フィルター盤の中心に徐々に付与した。

５、フィルター盤の中心に残っている放射能を。

盤の中心部分のみがカウンターに曝露されるよつｇこ規
準させたγ−シンチレーションカウンターを用いて測定
した。

チロキシン標準　　　盤の中心に残っている０　　　　
　　　　　　　　　　　７３．３２　　　　　　　　　
　　　　　４５．３６　　　　　　　　　　　　　　２
９．３１２　　　　　　　　　　１６．０ ２５　　　　　　　　　　　　　　８．７実施例　２ 〔方法ｆｂｌを示す〕 １、ホスフェート緩衝剤中で適当量の羊抗チロキシン血
清（γ−グロブリン画分）およびろば抗羊γ−グロブリ
ン血清を混合し、室温で一夜培養して抗体錯体の懸濁液
を形成した。

２、下記試薬を一連の試験管内で室温で２時間−緒に培
養した。

１００μｌのヒト血清中のチロキシンの標準溶液。

２００μｌのβ−ガラクトシダーゼに抱合させホスフェ
ートｇ＠剤で稀釈したチロキシン。

４００μｌの上述した第二抗体錯体の懸濁液。

３、各試験からの反応混合物５０μ！容量をガラス繊ｔ
ａｇ＜ワットマンＯＦ／Ｄ）の中心に徐々に付与した。

４、１　’Ｉｆｆ　／　ｍｌ　ノ牛血清アルフミン、９
　’Ｗ　／　ｍｌ　０）ＮａＣ１および１０ｎ＋Ｍの塩
化マグネシウム示含有すルホスフエートＭ　ｍ　ＡＩＪ
中の０ＮＰＧ　（オルンニトロフェニルガラクトシド）
の２０ｍＭ溶液４００μｌ容量を各フィルター盤の中心
に徐々に付与した。

５、盤の中心で黄色スポットの強度を肉眼で測定する前
に室温で５分間盤を放置した。

０　　　　　　　　　　　　　　＋＋＋２　　　　　　
　　＋＋＋ ６　　　　　　　　　　　　　　＋＋ １２　　　　　　　　　　＋ ２５　　　　　　　　　　春色ナシ 実施例　３ 〔方法（口を示す〕 チロキシンの放射線免疫分析 １、一連の試験管内で下記試薬を室温で４５分間−線番
こ培養した。

２０μｌのヒト血清中のチロキシンの標準溶液。

５０μｌの好適な緩衝剤中の１２５１−ラベル付きチロ
キシン。

１００μｌの羊抗チロキシン血渭で被覆したポリビニル
トルエンラテックス粒子（直径２．１μうの懸濁液。

２、各試験管中の反応混合物から１００μｌ容１を取り
出し、２．５ｃｍのプレフィルタ−盤（ミリボア）の中
心に徐々に付与した。

３、各フィルター盤の中心にトリス／ＮａＣ１緩衝剤の
４００μｌ容量を徐々に付与し、盤の中心に残った放射
能を実施例１に記載した如く測定した。

チロキシン標準　　　　　　盤の中心に残ったＱ　　　
　　　　　　　　　　９３．７２　　　　　　　　　　
　　５２．２ ６　　　　　　　　　　　　３３．７ １２　　　　　　　　　　　１７．０ ２５　　　　　　　　　　　１５．３ 実施例　４ 〔方法（Ｕを示す〕 ヒト胎盤ラクトゲンに対する免疫放射能測定分立 １、一連の試験管内で一ド記試薬を室温で３０分−緒に
培養した。

１２０μｌのヒト血清中のヒト胎盤ラクトゲン（ＨＰＬ
　）の標準溶液。

３００μｌの羊抗ＨＰＬ血清で被覆したポリスチレンラ
テックス粒子（０，８μ直径）の懸濁液。

３００μｌの１２５■でラベル付けした１ｉＰＬに対す
る羊抗体の溶液。

２、各試験管中の反応混合物から１００μｌ容量を取り
、２．５ｃｍプレフィルタ−盤（ミリポア）の中心に徐
々番こ付与した。

３、５００μｌ容量のトリス／ＮａＣＩＪｆｆｉ衝剤を
各フィルター盤の中心番こ徐々番こ付与し、盤の中心に
残った放射能を実施例ｉｔこ記載した如く測定した。

ＨＰＬ標準　　　　　盤の中心に残った（　ｎｌ／１ｔ
ｔｌ）　　　　　　放射能彊０１．８ ０．１４　　　　　　　　　　　　９．５０．５４　　
　　　　　　　　　　２３．１１．０７　　　　　　　
　　　　２９．２３．３　　　　　　　　　　　　　４
２．５９．９８　　　　　　　　　　　　４５．９実施
例　５ 〔方法ｆｂｌを示す〕 ７エリチンの免疫酵素測定分析 １、下記試薬を一連の試験管内で一緒に室温で４５分培
養した。

２００μｌのホスフェート緩衝剤中のフェリチンの標準
溶液。

１００μｌの羊抗フェリチン血清で被覆したポリスチレ
ンラテックス粒子（直径０．８μ）の懸濁液。

２００μｌの山葵ペルオキシダーゼに抱合したフェリチ
ンに対する羊抗体の溶液。

２、各試験管中の反応混合物から１００μｌ容量を取り
、２．５ｍプレフィルタ−盤（ミリボア）の中心に徐々
ζこ付与した。

３、テトラメチルベンチジン、過酸化水素およびトリト
ン１００を含有するｐｕｓ、ｏの０．２Ｍアセテート緩
衝剤５００μｌ容量を各フィルター盤の中心に徐々に付
与した。

４、各盤の中心で青色スポットの強度の肉眼による測定
の前≦こ各盤を５分間放置した。色の強度は、フェリチ
ンの標準濃度がゼロから２０００ｎｇ／ｇ／まで上昇す
るに従って増大した。肉眼での検知限界は３０ｎｆ／ｌ
ｔｌ　フェリチンであった。

実施例　６ 〔方法（ｃｌを示す〕 工、下記試薬を一緒ｌこ室温で１時間培養した。

２０μｊｐホスフエート緩衝剤中のフェリチンの標準溶
液。

２０μｌの羊抗フェリチン血清で被覆したポリスチレン
ラテックス粒子（ローダミン螢光染料を含有する直径１
．２μ）の懸濁液。

２、ホスフェート緩衝した食塩水（１％Ｖ／Ｖ　）中の
グルタルアルデヒドの溶液４０ｔｔｌを各反応試験管に
加え、更に１５分室温で培科した。

３、ゆるやかに攪拌後、各反応混合物５０μｌを２．５
側ガラス繊維盤（ワットマンＧＦ／Ｄ）の中心に徐々に
付与した。

４、各ガラス繊維盤の中心にホスフェート緩衝した食塩
水４００μｌ容量を徐々に付与した。

５、次に盤を紫外線の下で観察し、各盤の中心での赤色
螢光スポットの強度を測定した。フェリチンの標準濃度
の上昇に従い螢光の強度は増大した。肉眼による検知限
界は１５ｎ９／肩ｌ　フェリチンであった。

ン 英国パツキンガムシャイア・ウ エンドオーヴアー・ペリイ、ス トリート３９ ０発　明　者　マルコルム・ロバート・サマーズ 英国パツキンガムシャイア・ア イルズバリイ・ストラフ・マン デヴイル・ヒューエンデン拳グ リーン２１ 手続補正書（１） 小牲え沫 ３、補正をする者 事１′１との関係　　ン￥九″ｒか、々々／、典中年輔
←刊判 ４、代理人 ／、神゛ｌ・（Ｊ本 乙＾（１−ｉ尖句（口陣

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　クロマトグラフィ媒体を用意し、一部を上記媒体
   上で移動性の形で、一部を上記媒体上で非移動性の形で
   存在するラベル付き試薬を含有する反応混合物を形成し
   、二つの形の割合は試料中のアナライトの量で決定し、
   クロマトグラフィ媒体上のスポットに反応混合物を適用
   し、ラベル付き試薬の移動性の形をスポットから移動せ
   しめ、その後ラベル付き試薬の移動性の形および非移動
   性の形の一つまたは両者を測定することを特徴とする試
   料中のアナライトの分析を行なう方法。 ２、　クロマトグラフィ媒体がシートの形であり、反応
   混合物をシート上のスポットに付与し、ラベル付き試薬
   の移動性の形をスポットから放射状に移動させる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３、移動を、移動仕種（非移動他種でない）をクロマト
   グラフィ媒体を通って移動させる溶媒をスポットに続い
   て付与することによって助長する特許請求の範囲第１項
   または第２項記載の方法。 ４、溶媒が水性液体である特許請求の範囲第３項記載の
   方法。 ５、試料中のアナライトおよびアナライトのラベル付き
   変種を限定量のアナライトに対する特定結合剤との反応
   に競争させて反応混合物を形成させ、アナライト／特定
   結合剤錯体を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第４項
   の何ｎか一つに記載の方法。 ６、　アナライト／特定結合剤錯体を、特定結合剤とそ
   の抗体との反応によって不溶性にし、上記反応をアナラ
   イトおよびラベル付きアナライトで培養する前、培養中
   または培養後に行なう特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ７、反応混合物を試料中のアナライトを過剰の非移動性
   にされた特定結合剤に結合させることによって形成し、
   アナライトに対するラベル付き特定結合剤をアナライト
   の空結合位置番こ結合させる特許請求の範囲第１項〜第
   ４項の何ｎか一つに記載の方法。 ８、特定結合剤が粒状固体相Ｓこ結合させることにより
   非移性にさｎた特許請求の範囲第５項または第７項記載
   の方法。 ９、反応混合物を、アナライトを含有する試料をアナラ
   イトに対する特定結合剤を担持するラベル付き粒子で培
   養すること番こより形成し、これによってアナライトを
   粒子の凝集を生せしめる特許請求の範囲第１項〜第４項
   の何れか一つ番こ記載の方法。