JPH07504498A - 改良された投与量応答曲線を有するアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良された投早量応答曲線を有するアッセイ発明の前景 本発明は、一般的に、分析物検出のためのイムノアッセイ及びより特定には、予 備選択された限界値を越える分析物濃度を検出するためにシグナルの変化に依存 するイムノアッセイに関する。

可視シグナル、たとえば色の変化、螢光、発光又は同様のものを生成するイムノ アッセイは特に、分析物の限界濃度の検出のために有用である。所望には、その ようなイムノアッセイシステムは、サンプル中の分析物の濃度が予備選択された 濃度値以下である場合、本発明において特に興味あるものは、アメリカ特許第４ ，８１８，６７７号に記載されるタイプの膜アッセイ及びアメリカ特許第４．９ ４３，５２２号に記載されるタイプの横流アッセイ（ｌａｔｅｒａｌ　Ｎｏ５ｅ 　ａｓｓａｙ）であり、それらの開示は、引用により本明細書に組込まれる。一 定の膜アッセイは、膜を通して垂直に液体サンプルを引き抜くことができる吸着 削土に配置される微小孔性膜を有する反応セルを利用する。

捕獲試薬、典型的には分析物に対して特異的な抗体が膜上に固定される。膜に適 用されるサンプルは吸着剤によりそれらから引き抜かれ、そして存在するいづれ かの分析物が試薬により捕獲される。シグナルが、分析物を特異的に認識し、そ してシグナル、たとえば色、螢光又は発光の生成を仲介するラベルされた抗体又 は他の試薬をさらに適用することによって生成され得る。

横流アッセイはまた、検出反応を行なうために多孔性膜を利用する。しかしなが ら、垂直に膜を通してサンプルを引き抜く代わりに、サンプルは通用部分から膜 表面上の反応部分に横方向に流れる。捕獲試薬はその反応部分に存在し、そして 捕獲された分析物は種々の手段、たとえば捕獲された分析物に関連する可視成分 の直接的な可視化により検出され得る（継続出願番号０７／６３９，９６７に記 載されるようにして；この開示は引用により本明細書に組込まれる）。

捕獲試薬として分析物に対して高い親和性を有する抗体を用いることによって、 可視シグナルの鋭く又は急速な変化が達成され得る。

すなわち、シグナルはひじように狭い濃度バンド上で変化するであろう、そのよ うな鋭く又は急速な変化が所望されるが、その変化が対象の濃度値で生じること がまた必要である。シグナル変化が対象の濃度値以上又は以下で生じる場合、そ のアッセイにより提供される情報は減じられた値の情報であろう。

検出された濃度を変えるための１つのアプローチは、アメリカ特許第４．９５２ ，５１７号及びヨーロッパ特許出願第３２７　、８４３号に記載される。未知の 量の分析物を有するサンプルが予備選択された限界量の遊離抗−分析物と組合さ れる。この抗−分析物は分析物を結合し、そして未結合抗−分析物は、サンプル 中の元の分析物濃度が限界値以下である場合にのみ残存する。（予備選択された 量の遊離抗−分析物により決定される）。次に、サンプルが、サンプルに残存す る遊離抗−分析物に結合するであろう限定された量の固定された分析物に接触さ れる。その固定された分析物をラベルされた抗−分析物に暴露することによって 、ラベルは、サンプル中の分析物濃度が限界濃度以下である場合においてのみ結 合するであろう０次に、結合されたラベルは、可視シグナルを生成する種々の従 来の技法により検出され得る。従って、サンプルに添加される遊離抗−分析物の 濃度及び固定された分析物の量を適切に選択することによって、検出される濃度 及び最小から最大にシグナルが変化する範囲の両者が制御され得る。

一般的に作用できるが、この方法の感受性は、サンプルと反応される固定された 分析物の量により一般的に制限される（すなわち、その方法は、固定された分析 物の量よりも低い限界量を検出するためには適切でない）、さらに、サンプル中 の高い分析物濃度はアッセイの結果を妨害する。すなわち、過剰量の遊離分析物 が担持され、そしてラベルされた抗−分析物を結合し、これはその結果に影響を 及ぼす、さらに、分析物の濃度範囲は、固定された分析物の量により制限される 。

予備選択された濃度値を検出するための可視シグナルイムノアッセイを行なうた めの第２のアプローチは、アメリカ特許第５，０２８，５３５号及び対応するＰ ＣＴ出１ｉＷ０９０１０８３１９に記載される。未知量の生来の分析物を含むサ ンプルが、反応混合物を形成するために、既知量のラベルされた分析物及び分析 物レセプター、通常抗−分析物抗体と接触せしめられる０分析物レセプターへの 結合のためにラベルされた分析物と未知（ラベルされていない）分析物との間の 競争が生じ、そして未結合のまま存続するラベルされた分析物の量はサンプルに 元来存在する未知の分析物の量に直接的に比例する０分離の後、未結合のラベル された分析物の量は、従来の可視検出システムにより検出され得、そしてサンプ ル中に初期において存在する分析物の量に直接的に関連する。

一般的には作用効果であるが、それらの検出システムは、生来の分析物とラベル された分析物との間での競争に依存し、平衡化に達する時間を要する。さらに、 そのアッセイの感度は、分析物レセプターの置及び平衡に達する時間の遅れによ り制限される。さらに、そのアッセイシステムは、分析物レセプターと分析物／ ラベルされた分析物との間での結合を分裂する障害物質により影響を受ける。

また、ラベルされた分析物は時々、生来の分析物よりも分析物レセプターにより 強く結合し、これはアッセイの結果に悪影響を与える。

従って、対象の分析物の予備選択された濃度値に関連する可視シグナルを提供す る改良されたイムノアッセイ型を提供することが所望される。その可視シグナル は、鋭いエンドポイントを定義し、すなわち予備選択された濃度値で集中される ひじょうに狭い濃度範囲にわたって最小又はゼロ値シグナルから明白に異なった シグナルに変化すべきである。可視シグナルが変化する濃度値は、それが対象の 測定値と相互関係されるように独立的に選択できるべきである。

それは、選択された濃度値が追加の段階を行なう必要性を伴わないでアッセイ中 にプロプラムされる場合にさらに所望される。さらに、本発明のアッセイは、こ れまでのイムノアッセイシステムに関連して上記に記載される欠点を克服するは ずである。

発明の要約 本発明は、サンプル中の分析物の限界濃度を検出するための改良されたアッセイ 法及びキットを含んで成る。アッセイ法は、反応されたサンプルに利用できる遊 離分析物の量を予備選択されたレベルに減じるように選択された予備決定された 最初の量の抗−分析物、通常分析物に対して特異的な抗体とサンプルとを反応せ しめることを含んで成る。特に、前記サンプルと反応された最初の量の遊離抗体 は、限界濃度よりもわずかに低い生来の分析物濃度が検出のために利用できる実 質的に残留遊離分析物を有さない反応されたサンプルをもたらすように選択され る。逆に、限界濃度よりもわずかに高い濃度で生来の分析物を含むサンプルが、 わずかに検出できるレベルよりも有意に高い残留遊離分析物濃度をもたらすであ ろう、従って、限界濃度でのサンプルにおける生来の分析物の存在が、高い感度 及び正確を伴って検出され得る。さらに、検出される限界濃度は、アッセイシス テムへの他の有意な修飾を伴わないでサンプルと反応される遊離抗−分析物の量 を変えることによって調節され得る。

最初の量の抗−分析物は、典型的には追加のアッセイ段階を必要とする、別々の 反応混合物においてサンプル及び抗−分析物を組合すことによって、サンプルと 反応せしめられ得る。次に、反応されたサンプルの量が残るアッセイ段階に使用 され得る。しかしながら、好ましくは、サンプルは、他のアッセイ段階の一部と して、たとえばサンプル移行（たとえば、最初の量の抗−分析物が移行用ピペッ ト又はフィルター上又はその中に固定される場合−サンプル適用（たとえば、最 初の量の抗−分析物が横流アッセイ装置の適用部分に固定される場合）、又はサ ンプル捕獲の前に存在するいづれか他のアッセイ段階の一部として抗−分析物と 反応せしめられるであろう、この場合、アッセイ段階の数が減じられ得、そして アッセイ信輔性が高められ得る。

サンプルと抗−分析物とを反応した後、その反応されたサンプルは固相上に固定 された追加の抗−分析物と接触される。従って、この固相は、次にサンプルから 固相を除去することによって分離され得る残る遊離分析物を結合することができ る。次ち、固相に結合される分析物の量が従来の技法により検出され、そしてサ ンプルに初めから存在する分析物の限界濃度の存在に関連する。

検出は通常、可視シグナルの生成に基づかれ、ここで極端なシグナル条件が、反 応されたサンプルに残る残留分析物が存在しない場合に生成され、そして反対の 極端なシグナル条件が、残留分析物がわずかに検出できるレベルを越える場合に 生成される。典型的な極端なシグナル条件は、色彩：色彩不在；光：光の不在； 螢光：螢光の不在及び同様のものを包含する。

本発明の第１の典型的なり樺においては、反応されたサンプルが多孔性試験膜を 通して垂直に通される。残留分析物の結合が、反応されたサンプルが通用される 部位で存在し、そして結合された分析物の存在が、前孔膜と分析物−ラベルされ た接合体、典型的には、酵素ラベルされた分析物とを接触することによって検出 される。膜上での固定された抗−分析物の量は、反応されたサンプルにおける過 剰の残留遊離分析物が、固相へのラベルの結合をもたらさない。

分析物−ラベル接合体を結合するために実質的にすべての利用できる部位をブロ ックするように制限される。逆に、限界濃度以下に下がる生来の分析物濃度に関 して、遊離抗体との反応の後、利用できる遊離分析物がほとんど又はまったく存 在しないであろう、従って、固相上の実質的にすべての結合部位が分析物−ラベ ル接合体に結合することができ、固相上に最大シグナルをもたらす。

この第１の態様においては、サンプルは別々の反応混合物における最初の量の抗 −分析物と反応せしめられ、ここですべての又は一部の液体反応混合物が膜に適 用され得る。他方、膜へのサンプルの移行に使用されるアプリケーターは、サン プル移行段階の一部として分析物を結合し７、そして分離する固定された抗−分 析物を含むことができる。膜に適用されるサンプルを濾過するために使用される マトリックスに固定された抗−分析物を組込むこともまた可能である。他のアプ ローチもまた利用できるであろう。

第２の典型的な態様においては、反応されたサンプルは、多孔性試験膜内の反応 部分に適用部分から横方向に流れを引き起こされる。

残留分析物（及び場合によっては、シグナル生成成分）の結合が、反応されたサ ンプルが適切な量の抗−分析物を含む反応部分を通して流れるにつれて生じる。

残留分析物と抗−分析物との間の結合は、種々の手段により結合され得る、そし て一段階手段が好ましい。

第２の典型的な態様の特定の観点においては、最初の量の抗〜分析物が適用部分 及び／又は層領域内に固定され得る。この場合、所望する量の遊離分析物が、別 の段階を行なうための必要性伴わないで、サンプルに適用段階の部分として結合 され得る。もちろん、第１の典型的な態様に関連して記載されるいづれか他の遊 離分析物分離技法もまた使用され得る。

本発明のもう１つの特定の観点（第１及び第２の典型的な態様の両者に適用でき る）においては、半定量結果が、試験領域又は膜の異なった領域に関して、種々 の量の°最初”の抗−分析物を用いることによって得られる。従って、試験膜の 個々の領域は、分析物の異なった限界濃度に対応し、濃度範囲の検出を可能にす る。そのような半定量アッセイは、便利には、検流試験膜を用いて行なわれ、こ こで多くのレーンが適用部分内に固定される種々の量の抗−分析物を有する個々 のレーンにより実施される。

本発明のアッセイキットは、必要な試薬、試験膜、サンプルアプリケーター、フ ィルター及び同様のものを保持するための容器、及び前記の方法を実施するため の手段を示すインストラクションを包含する。典型的には、キットの成分は、１ 又は複数のアッセイを行なうための十分な成分を含む適切なパッケージに存在す るであろう。

本発明のアッセイ及びキットは、生物学的サンプル、たとえばホルモン、モルモ ン代謝物、及び尿、唾液及び血液サンプルに存在する薬物における小さな分子の 限界濃度を検出するために特に適切である。このアッセイは、特に高い親和性抗 −分析物が使用される場合、そのような限界濃度の高い感度の検出を提供する。

そのアッセイ方法は、サンプルにおける所望する量の生来の分析物をブロックし 、又は分離（封鎖）するために種々の量の初期抗−分析物を用いることによって 、検出されるべき限界濃度の実質的に任意の選択を可能にする。

図面の簡単な説明 第１図は、抗−分析物（遊離抗体）添加を伴って、及び伴わないで行なわれるア ッセイに関しての投与量応答曲線を伴って、実験セフシランにおける比較例の結 果を示し、そして前記のような抗−分析物添加に起因する投与量応答曲線におけ るシフトを示す。

特定の態様の記載 サンプルにおける限界濃度の分析物の存在を検出するための方法及びキットが提 供される。サンプルにおける生来の分析物の実際の濃度は広範囲に変化し、そし て本発明は、限界濃度が存在し又は限界を越える場合、シグナル、通常可視シグ ナルの検出できる変化を提供する。限界濃度の値は、この後に詳細に記載される ように、アッセイに使用される試薬の量及び濃度を適切に選択することによって 、かなり広い限界内で選択され得る。場合によっては、半定量的濃度決定が、同 じサンプルにおける多くの限界濃度を同時に測定することによって行なわれ得る ０本発明は、初めに予備決定された量の抗−分析物、通常分析物に対して高い結 合親和性を有する遊離又は固定された抗体とサンプルとをまず初めに反応せしめ ることによって、サンプルに存在する予備決定された量の生来の分析物のブロッ キング又は分離に依存する。抗−分析物の量は、種々の残留量をそのままにして 、組合されたサンプルにおける生来の分析物を予備選択された差異量だけ減じる のに十分であり、ここで前記種々の残留量はアッセイの続く検出相において容易 に検出できる０通常、差異量は、サンプルに存在する分析物の実際の量が限界量 以下であり、すなわちその差異量が限界量にほぼ等しい場合、残留分析物をほと んど又はまったく残さないように選択されるであろう、従って、サンプルにおけ る分析物の量が限界濃度によりもわずかに低い場合、極端なシグナル条件（最大 か又はシグナルが存在しない）がアッセイの続く検出相において生成されるであ ろう、逆に、サンプルにおける分析物の量が限界値に等しく又はそれ以上である 場合、予測できる最少残留量の分析物が存在し、そしてアッセイの検出相は逆の 極端なシグナル条件を提供するように企画されるであろう。

従って、本発明の方法およびキットは、分析物の限界濃度が試験されるサンプル に存在するか又は限界値を越えるかいづれかを知ることが所望される試験を行な うために有用である。その方法及びキットは、複数の限界濃度が単一のサンプル から同時に検出される半定量的アッセイを行なうためにもまた有用である０両者 の場合、試験は訓練されていない及び少々訓練された人々によって便利に行なわ れ得る。サンプル調製物は通常、最少であり、そしてアッセイ法段階はアッセイ キットに付随するインストラクションを読む個人により容易に行なわれ得る。多 くの場合、試験方法は、必要なサンプルが単に試験製品及び可視結果読取り又は いくらかの反応時間の後、前記製品に通用される一段階アッセイを提供する。本 発明のアッセイは、高められた感度及び読取り能力を提供し、そして特に、シグ ナルのひじょうに大きな変化が正のアッセイにおいて存在し、そして試験結果が 容易に読取られ、そして訓練されていない人々によってさえ理解されることを確 保することにおいて特に有用である。

本発明は、液体であり、液化され得る又は液体に懸濁され得る実質的にいづれか のタイプのサンプルにおける広範囲の種類の分析物についてアッセイすることに おいて有用である。その方法及びキットは、生物学的検体、たとえば血液、血清 、血漿、尿、脳液、を髄液、眼球レンズ液（涙）、唾液、痰、精液、頚部粘液、 スクレーピング（ｓｃｒａｐｉｎｇ）　、スラブサンプル及び同様のものに使用 されるであろう、また、産業、環境及び食品サンプル、たとえば水、処理水、ミ ルク、肉、家キン類、魚、条件付けされた媒体、及び同様のものにも使用される 。ある環境下で、アッセイの残る段階によりサンプルの適合性を改良するために 、サンプルを、たとえば液化、分離、希釈、濃縮、濾過、化学処理又はそれらの 組合せにより予備処理することが所望される。免疫学的試験の前、生物学的、産 業及び環境的サンプルの選択及び予備処理は当業者において良く知られており、 そしてさらに説明する必要はない。

検出されるべき分析物は、免疫学的に検出され得る、実質的にいづれかの化合物 、組成物、凝集物又は他の物質であり得る。すなわち、分析物又はその一部は、 少な（とも１つの決定部位を有する抗原性又はハブテン性であり、又は天然に存 在する結合対、たとえば炭水化物及びレクチン、ホルモン及びレセプター、相補 的核酸及び同様のもののメンバーであろう。特に興味ある分析物は、抗原、抗体 、タンパク質、炭水化物、ハブテン、薬物、ホルモン、ホルモン代謝物、巨大分 子、トキシン、細菌、ウィルス、酵素、腫瘍マーカー、核酸及び同様のものを包 含するが、但し、他のタイプの物質もまた検出され得る。典型的な分析物の列挙 は、アメリカ特許第４．３６６．２４１号のカラム１９の第７行〜カラム２６の 第４２行に示されており、この開示も引用により本明細書に組込む。

本発明は大きな及び小さな分子、特に抗−分析物上の単一の結合部位により通常 分離される約５．０００ダルトン以下の分子量を有する小さな分子の検出のため に有用である。大きな分析物は、１つの抗−分析物分子よりもより結合し、そし てより問題なことには、種々の数の抗−分析物分子を結合し、アッセイを反復不 可能にする。典量的な小さな分子は、ホルモン代謝物、たとえばプレグナンジオ ール−３−グルクロニド（ＰＤＧ）、エストロン−３−グルクロニド及び同様の もの、及び治療用薬物、たとえばジゴキサン、フェノバルビトール、フェニトイ ン；及び乱用薬物、それらの代謝物及び同様のものを包含する。そのような小さ な分子は一般的に、抗−分析物に結合される場合、完全に分離されるであろう、 二価抗体、たとえばＩｇＧの場合、個々の抗体分子は典型的には２つの小さな分 子分析物に分離し、続く検出ために利用できなくする。

本発明はまた、特に分析物が使用される抗−分析物に対して一価である場合、ｓ 、ｏｏｏダルトン及びそれ以上の分子量を有する大きな分析物の検出にも有用で ある。たとえば、ヒトコリオゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、抗−分析物としてｈ ｃＧのＣ−末端ペプチドに対して向けられるモノクローナル抗体を用いて測定さ れる。予備決定された量のｈＣＧがこの抗体の一定量を用いて除去される。残留 する未結合ｈＣＧを含むサンプルは、次にその表面に結合されるｈＣＧのＣ−末 端ペプチドに対して同じ抗体を有する膜に通用される。抗−ｈＣＧ抗体を有さな い残留ｈｃｃのみが膜に結合する。次に、残留ｈｃｃは、Ｃ−末端ペプチドに対 して特異的でない第２のラベルされた抗−ｈＣＧ、たとえばｈＣＧのαサブユニ ットに対する抗体により検出される。

抗−分析物は、高い親和性、典型的には、少なくとも約１０＠Ｍ−’、通常少な くとも約１０”　Ｍ−’及び時々ＩＯＩＯＭ−１又はそれ以上の親和性で分析物 に直接的又は間接的に結合できる特異的結合物質であろう。

抗−分析物は、サンプル又はアッセイ試薬に存在できる他の物質との交叉反応性 から開放されるべきである。最とも通常には、抗−分析物は、分析物に対して発 生されるモノクローナル又はポリクローナル抗体であるが、しかしある場合、上 記のように、生物学的分析物のための天然のレセプターを使用することが可能で ある。分析物が抗体自体である場合、抗−分析物として抗体により認識される抗 原又はヘプテンを用いることがもちろん可能であろう。

抗−分析物は分析物に直接的にほとんどしばしば結合するのに対して、本発明は また、分析物への抗−分析物の間接的結合、すなわち分析物への結合を封鎖し又 はもたらすために１又は複数の中間結合物質の使用を包含する。たとえば、固相 に結合する場合、分析物に対して特異的である可溶性物質、たとえば分析物を認 識するビオチニル化された抗体又は第二抗体に直接的に結合できる一次結合物質 、たとえばアビジン又は第一抗体を固相上に提供することが可能である。広範囲 の種類のそのような間接的結合法は入手可能であり、そして科学及び特許文献に 十分に記載されている。本願明細書及び請求の範囲に使用される場合、用語“抗 −分析物”とは分析物を直接的に（すなわち、中間結合物質を伴わないで）又は 間接的に（すなわち、結合を形成する１又は複数の中間結合物質を伴う）結合で きるすべての物質を意味する。

本発明のアッセイの第１段階は、予備選択された差異量だけ、反応されたサンプ ルにおける利用できる遊離分析物の量を減じるように選択された予備選択された 最初の量の抗−分析物と分析物を含むと思われるサンプルとを反応せしめること を含んで成る。前記差異量は、分析物が限界濃度で又はそれ以上でサンプル中に 初期において存在する場合、アッセイの検出相の間、極端なシグナル条件を提供 するのに十分であろう残留量の分析物を残すように選択される。

逆に、分析物が限界濃度以下でサンプル中に初期において存在する場合、残留分 析物はほとんど又はまった（存在せず、そしてその結果はアッセイの検出相の間 、反対の極端なシグナル条件であろう。

“極端なシグナル条件”とは通常、下記により詳細に記載されるように、可視シ グナル、たとえば色彩の生成、螢光、発光及び同様のものの存在又は不在であろ う。

遊離分析物と初めの量の抗−分析物との間の反応は種々の手段でもたらされ得る 。たとえば、初めの量の抗−分析物は遊離しており（未結合である）、そして適 切な緩衝液は他の液体キャリヤーに存在し、そしてサンプルと共に組合され得る 。他方、その初めの量の抗−分析物は固相、たとえば粒子、ビーズ、２デイプス テイツク、アガロースゲル又は同様のもの上に存在し、そして液体サンプルと共 に組合される。

しかしながら、多くの場合、固定された初めの量の抗−分析物を使用することが 所望され、ここで固定された抗−分析物は、他のアッセイ段階、たとえばサンプ ル移行、サンプル通用又は同様の段階の間、サンプルに暴露され得る。特に、最 初の量の抗−分析物は、下記により詳細に記載されるように、固相膜にサンプル を通用するために使用される移行用ピペット又はフィルターの内部に結合され得 る。そのような移行用ピペット及びフィルターはアメリカ特許第４．８１８，６ ７７号に詳細に記載されており、この開示を引用により本明細書に組込む、初め の量の抗−分析物を固定するために適切な内部フィルターマトリックスを有する 移行用ピペットは、継続出願第０７／６０４．３９８号に記載されており、この 開示を引用により本明細書に組込む。他方、その初めの量の抗−分析物は適用部 分及び／又は適用部分と反応部分との間に、横流膜アッセイシステムにおいて固 定され、これらはアメリカ特許第４，９４３，５２２号及び継続出願第０７／６ ３９．９６７号に記載されており、これらの開示は、引用より本明細書に組込ま れる。

いづれの場合においても、所望する差異の量の生来の分析物を除去するために必 要な抗−分析物の量は、いくつかの要因、たとえば（１）抗−分析物の原子価、 （２）抗−分析物の親和性、（３）分析物の原子価及び／又はサイズ及び（４） いづれかの中間結合物質の原子価及び存在に依存する。小さな分子の分析物、た とえばホルモン代謝物及び薬物を直接的に結合し、そして封鎖するために使用さ れる高い親和性のＩｇＧ抗体のほとんどの場合、抗−分析物の原子価は２であり 、ところが分析物の“原子価”は１であり、すなわちそれが抗体にたった１つの 結合部位を提供するのに十分に小さい。

抗−分析物の高い親和性性質は、実質的にすべての抗体結合部位が分析物により 占められることを確保する（サンプル中に十分な分析物が存在する限り）。

一般的に、分析物が限界濃度で存在するサンプルから生来の分析物の大部分を除 去することが所望されるであろう、しかしながら、除去される又は実質的に除去 される分析物の量は、一定であり、その結果、分析物濃度が限界濃度をひじょう に越える場合、除去される生来の分析物の割合はひじょに低い、逆に、生来の分 析物が限界濃度よりも実質的に低い場合、実質的にすべての分析物が除去され、 通常、過剰の抗−分析物が残る。生来の分析物除去の最適％は特定の分析物及び 検出システムに依存して変化し、そして分析物の所望する限界濃度で極端なシグ ナル条件間での転移を提供するために実験的に決定され得る。

サンプルと初期号の抗−分析物との間の反応は通常、少なくとも約１０秒間道行 し、より通常には少なくとも１〜２分間を要するいづれか続（アッセイ段階の前 、進行せしめられる（場合によっては、必ずしも、平衡に達する必要はない）。

反応が生じた後、続くアッセイ段階か、通常、初めの量の抗−分析物に結合され る生来の分析物の分離を伴わないで開始されであろう。しかしながら、特に、そ の初めの量の抗−分析物が固相上に固定されている場合、そのような分離をもた らすことが可能である。サンプルが初めの量の抗−分折物に少々暴露される場合 、たとえば抗−分析物が移行用ピペット又は横流膜の導入部分に固定される場合 、アッセイでの追加の段階の実施の前、十分且つ調和した結合を確保するために 、高い親和性の結合を選択し、そして急速なシステム運動等を企画する必要があ る。

生来の分析物と初めの量の抗−分析物との間の反応が達成された後、その反応サ ンプルは固相上に固定される第２の量の抗−分析物と接触される。この場合、反 応されたサンプルに残存する残留遊離分析物（すなわち初めの量の抗−分析物に より分離されていない分析物）は、固相に結合されるようになるであろう、固相 は粒子、ビーズ、ディプスティック、アガロースゲル、マイクロタイターウェル 又は異種イムノアッセイに通常使用される広範囲の種類の他の不溶性材料のいづ れがであり得る。好ましくは、この後詳細に記載されるような膜固相が使用され る。

第１の好ましい態様において、アッセイは、アメリカ特許第４．８１８，６７７ 号に一般的に記載されるように、垂直流膜上で行なわれ、前記開示は引用により 本明細書に組込まれる。第２量の抗−分析物は膜上の検出部分内に固定され、そ してその残留遊離分析物に結合する能力が制限されるように限定される。特に、 膜上に固定される第２量の抗−分析物は、限界濃度の生来の分析物が元のサンプ ルに存在する場合、その反応されたサンプルに存在する予測される残留量の生来 の分析物を結合のに十分であることが所望される。この場合、限界濃度又はそれ 以上で生来の分析物を含むサンプルは、膜上の第２量の抗−分析物の実質的にす べての結合能力をブロックするであろう。逆に、サンプル中の実際の分析物濃度 が限界濃度以下に実質的に低下する場合、反応されたサンプルに残留遊離分析物 が存在せず、そして固相上の抗−分析物の結合能力のブロッキングも存在しない であろう、それは、分析物濃度における比較的小さな変化に基づいて極端をシグ ナル条件間での突然な変化を可能にするアッセイのこの観点である。限界濃度又 はそれ以上でのサンプルは、完全にブロックされる膜をもたらすが、しかし少量 （選択できる量）だけ限界濃度以下であるサンプルは、実質的に十分に結合能力 を保持する膜をもたらす。

多孔性膜は通常、その膜との液体受容関係において吸着剤を含む反応セルの一部 である微小多孔性膜である。微小多孔性膜は、その上に固定される第２量の抗− 分析物を有し、結合することを意図され、そしてアッセイ法の一部として膜に適 用されるサンプルから分析物を分離する膜の形及び寸法は臨界ではないが、しか し膜はその部分上で結合されたラベルの続く可視化を可能にするのに十分に大き な暴露部分を有し、通常可視シグナルと膜の残存物との間の対比が容易に観察さ れるように十分な過剰部分を有すべきである。

微小多孔性膜は、広範囲の種類の半透膜材料、たとえば有機ポリマー、たとえば ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン及びそれらのコポリマー−焼結ガラ ス、及びセラミック材料；及び同様のものから形成され得る。材料の平均孔直径 は通常臨界ではないが、但し、材料の孔直径は約０．２〜１０μｍの範囲であり 、通常的１〜５μｍの範囲であろう。

第２量の抗−分析物は一般的に、初めの量の抗−分析物とサンプルとの反応の後 に残る予測される量の残留する生来の分析物に結合するために十分であろう、従 って、必要とされる第２量の抗−分析物は、特定のアッセイ企画により決定され るこの予測される残留値に依存するであろう。

固定された第２量の抗−分析物を有する膜は、残留遊離分析物（存在するなら） と固定された抗−分析物との間で結合を達成するのに十分な時間、組合されたサ ンプルと接触したまま存在するであろう。典型的には、接触は約１分までの間、 維持され、そして２分又はそれ以上の間、維持され得る。結合が生じた後、結合 された分析物の量が決定される。

多くの多価分析物の場合、すなわち複数の結合部位を含む分析物の場合、種々の ２部位（サンドイッチ）検出技法が存在する。そのような２部位検出は、典型的 には、ラベルされた抗−分析物を用いることによって、膜表面上に結合される分 析物への検出可能なラベルを導入することに依存する。場合によっては、種々の シグナル増幅技法が使用され得る。たとえば、分析物に対して特異的な一次抗体 がまず導入され、そしてその−次抗体に対して特異的な第２のラベルされた抗体 が続いて導入される。他方、ビオチニル化された一次抗体が導入され、続いてラ ベルされたアビジンが導入される。そのような２部位検出技法の使用は、特許及 び科学文献に十分に記載されている。たとえばアメリカ特許第４．２２８，２３ ７号；第４，２９８．６８５　ｉ及び第４，６８４，６０９号を参照せよ（それ らの開示は引用により本明細書に組込まれる）。

小さな分析物、すなわち第２結合を可能にしない分析物の場合、膜表面の検出部 分上で、残存する抗−分析物にラベルを特異的に結合することが好ましい０便利 には、これは、膜表面と分析物又は分析物類似体に接合されるラベルとを接触す ることによって行なわれ得る。これは、サンプルにおける生来の分析物の存在に 逆に関連する固相へのラベルの結合をもたらす。すなわち、限界濃度に等しいか 又はそれを越える、サンプル中の分析物濃度は固相表面に結合されるラベルをも たらさないが（すべての結合部位が残留する生来の分析物によりブロックされる であろうから）、シかし限界量だけ限界濃度以下に下がる分析物濃度が固相上で のすべての抗−分析物へのラベルの結合をもたらすであろう（初めの量の抗体が 固相へのその結合を妨げるためにすべての利用できる生来の分析物を分離するで あろうから）。

分析物はラベルへの共有結合又は非共有結合を促進するように誘導体化されるで あろう。通常、ラベルは良く知られた技法により共有結合されるであろう。たと えばアメリカ特許第４．２９９，９１６号、カラム２３の６１行〜カラム２４の ５１行の記載を参照のこと（この開示は引用により本明細書に組込まれる）。Ｐ ＤＧ類位物に酵素ラベルを結合するための特定の方法は、この後の実験セフシラ ンに記載される。

他方、分析物は、中間結合物質、たとえばビオチン、アビジン又は同様のもの、 及びそのような中間結合物質のための関連するレセプターを用いて導入されるラ ベルを包含するように誘導体化され得る。

ある場合、分析物−ラベルされた接合体の一部を形成する分析物はさらに、面相 表面上に固定される抗−分析物へのその結合親和性をもたらすように変性され得 る。たとえば、生来の分析物のための抗−分析物の結合親和性以下に分析物−ラ ベル接合体の結合親和性を減じることが所望される。この場合、これまで結合さ れた生来の分析物を置換するラベルされた分析物の傾向が減じられ又は排除され るであろう、減じられた結合親和性を有する変性された分析物−ラベル接合体は この後の実験セフシランに例示される。

ラベルは、固相表面上で検出できる可視シグナルを生成できるシグナル生成シス テムの一部であろう、そのような可視ラベルは、着色された粒子、色彩生成シス テム、螢光システム及び発光システムを包含する。適切なシグナル生成システム は少な（とも１種の成分を包含し、そして複数の成分、たとえば酵素、基質、触 媒、エンハンサ−及び同様のものを含んで成る０通常、シグナル生成システムの 少なくとも１種の成分が分析物又は分析物類似体にラベルとじて結合され、そし て従って、本発明のアッセイの検出部において固相に結合されるであろう、多く の適切なシグナル生成システムは特許及び科学文献に記載される。たとえば、ア メリカ特許第４．３６６．２４１号、カラム２７の３５行〜カラム３６の６３行 を参照のこと（この開示は引用により本明細書に組込まれる）、固相上に染料の 付着をもたらす色彩生成システムの使用が好ましい０次の例においては、アルカ リホスファターゼに接合されるＰＤＧ分析物は、これまで記載されるような方法 によりラベルとして固相に結合される。インドキシルホスフェート基質への固相 膜の続（暴露は、ラベルが試験されるサンプルにおいて低い分析物濃度の結果と して膜に結合される場合、膜固相上に暗青色染料の付着をもたらす。

本発明の第２の好ましい態様は、アメリカ特許第４．９４３，５２２号及び継続 出願第０７／６３９．９６７号に記載される検流膜アッセイシステムを使用する （前記開示は、引用により本明細書に組込まれる）０本発明に従って変性され得 る他の横流アッセイシステムはアメリカ特許第４．８６１，７１１号；公開ヨー ロッパ特許出願第３０６，７７２号；イギリス特許出願第２，２０４．３９８　 ；及びヨーロッパ特許出願第２７６．１５２号に記載されており、それらの開示 は引用により本明細書に組込まれる。

そのような横流膜アッセイシステムは一般的に、インジケータ一部分から横方向 に離れた空間の適用部分を有する細長い膜を利用する。膜は、典型的には、細管 誘導流れにより、適用部分からインジケータ部分へのサンプルの流れを可能にす る。膜自体は吸収性が強く、この場合、それはまたクロマトグラフ的であるが、 しかし好ましくは、非吸収性が強く、その結果、分析物及び他の成分の流れが妨 げられない、特定の膜材料の選択のための詳細はこれまで引用により組込まれて 来た特許文献に記載される。

分析物に対して特異的な抗−分析物又は他の捕獲試薬はインジケータ部分内に存 在し、その結果、分析物はサンプル流れるにつれて、前記部分内で複合体化され 又は結合されるであろう、横流アッセイシステムは、典型的には、一段階アッセ イが行なわれ得るように膜自体に導入される成分を用いて、インジケータ一部分 内の捕獲された分析物の可視化を提供するであろう、たとえば及び好ましくは、 膜は、その膜を通してのサンプルの流れにより運ばれ、そしてインジケータ一部 分内で複合体化される分析物に結合する着色された物質を含むことができる。こ の場合、一般的アッセイ法が実施され得、ここでエンドポイントはインジケータ 一部分において観察される色である。すなわち、必要な使用者は、適用部分にサ ンプルを単に適用し、予備決定された期間待ち、そしてその後、アッセイ結果を 読取るためにインジケータ一部分内での色彩の存在（又は不在）を観察する。他 の検出システム、たとえば本発明の垂直流膜態様を有する上記に一般的に記載さ れるシステムが利用され得る。他の適切な検出システムは、引用により本明細書 に組込まれた特許出願に詳細に記載される。

本発明は、改良された横流膜アッセイシステムを提供し、ここでサンプルは上記 に記載されるように、所望する差異量の分析物を除去し又は封鎖するように予備 反応されるであろう０分析物の除去又は封鎖は、垂直流膜アッセイシステムにつ いて上記に記載される方法のいづれかにより行なわれ得る。好ましくは、その予 備反応は、膜の適用部分内及び／又は通用部分とインジケータ一部分との間の膜 の領域内での初めの量の抗−分析物の固定化によりもたらされ得る。サンプル中 の分析物と初めの量の抗−分析物との間の反応は、サンプル通用段階の間、及び 場合によっては、膜を通してのサンプルの流れの間にもたらされるであろう。従 って、その横流アッセイは、初めの量の抗−分析物と共にサンプルの別々のイン キュベーシヨンの必要性を伴わないで行なわれ得る。それは特に、第２アッセイ 段階の必要性が存在しないので、１段階アッセイ法のために重要である。

適用部分内又は膜内の他の部分内に抗−分析物を固定するための方法は、引用に より本明細書に組込まれた種々の特許文献に記載される。インジケータ一部分に おける抗−分析物の固定化のための方法と同一であろう。

本発明の好ましい観点においては、半定量的分析物測定が、初めの量の抗−分析 物の異なった濃度にサンプルの異なったアリコートを当てはめることによって行 なわれ得る。従って、アッセイは所望する範囲内での分析物濃度の検出を可能に する、多くの限界濃度分析物を同時に検出するように適合され得る。その範囲の 数及び精度が、適切な初期量の抗−分析物を用いることによって使用者により選 択され得る。そのような半定量的アッセイは、横流膜アッセイにより好都合に行 なわれ得、ここで異なった初期量の抗−分析物が適用部分の異なった領域内に結 合される。他方、通用部分の異なった領域が配列され、その結果、サンプルは膜 における分離されたレイズ下に流れ、ここで１つのレンズが適用部分の個々の領 域に関係される。適用部分内の対応する部分は、異なった限界濃度をそれぞれ言 及するであろう。

半定量的アッセイは、本発明の垂直流アッセイシステムを用いても行なわれ得る 。たとえば、サンプルの多くのアリコートが、所望する限界検出に対応する、検 出部分内の異なった領域に固定された異なった初期量の抗−分析物と反応せしめ られ得る０反応されたサンプルの個々のアリコートを膜の異なった領域に適用す ることによって、その異なった領域が同時に検出され、そして可視化され、そし て初期サンプルに存在する濃度範囲が決定される０便利には、そのようなアッセ イは、アメリカ特許第４，８１８．６７７号及び第５，０７９，１７０、号に記 載されるタイプの複数区間フィルターアプリケータを用いて行なわれ得、ここで 前記開示は引用により本明細書に組込まれ°る。

本発明のキットは、固相表面に結合される第２量の抗−分析物を有する少な（と も１つの固相、必要な液体試薬を保持する容器、サンプルアプリケーター及び一 般的に上記に示されるような方法の段階を示すインストラフシランを包含するで あろう０通常、キットのすべての成分は、パッケージに含まれるであろう。

次の例は例示的であって、本発明を制限するものではない。

１豆 林料 Ｅ、コリのアルカリホスファターゼを、ｌｌｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｃｏ、、　 Ｆｒｅｅｈｏｌｄ＋ＮＪ　（ＣａＬａｌｏｇ　Ｎｏ、　ＢＡＰＰ）から得た。プ レグナンジオール　グルクロニド（ＰＤＧ）及びプレグネノロン　グルクロニド （ＰＮＧ）を、５Ｌｅｒｉｏｄｓ＋Ｉｎｃ、、　ＷｉｌＬｏｎ　Ｎｌｌ　（Ｃａ ｔａｌｏｇ　Ｎｏ、　Ｐ４Ｏ１０及び５５２０）から得た。接合体の調製のため に必要とされる試薬は、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（＾１ｄｒｉｃ ｈ、旧１ｗａｕｋｅｅ＋　ＭＬ　（Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ、　１３０６７−２） 　ｉ■−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩 （Ｓｉｇ＋ｗａ　Ｃｏ、、　Ｓｔルｏｕｉｓ＋　ＭＯ＋　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ 、ＥＴ７５０）及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　（＾Ｉｒ１ｃｈ　Ｃｏ、 、　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ、１５４８１−４）であった。

左広 アルカリホスファターゼ及びプレグネノロングルクロニド（ＰＮＧ）の接合体を 次のようにして製造した。無水ＤＭＦ２＋ｉｌ中、プレグネノロングルクロニド ５．２霧ｇ１スルホーＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステル３．８　ｍｇ及び ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド４．４　ｍ ｇを、気密性容器において一晩混合し、ＰＮＧの活性エステルを生成した。アル カリホスファターゼを、０．１　Ｍの炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ８，５）に対して 透析した。その透析されたアルカリホスファターゼ（６０■ｇ）をＰＮＧエステ ルと共に、そのエステルのゆっくりした添加により混合した。接合体をＧ−２５ カラム上で精製し、過剰の反応体を除去した。精製されたＰＮＧ−アルカリホス ファターゼ接合体を、長期安定性のためにタンパク質を含む緩衝液に貯蔵した。

反区立土 反応セルを組立て、そしてアメリカ特許第４．８１８．６７７号に記載されるよ うにして抗体をスポットした。簡単には、活性化されたナイロン＠　（Ｂｉｏｄ ｙ■ｅ−Ｃ）を吸着剤の上部に積層した。その膜及び吸着剤を、内部多孔性スペ ーサー層により分離した。膜の完全なアセンブリーを、−緒に溶接される２つの プラスチック製ストリップ間にサンドイッチした。プラスチック層の上部は、抗 体及び溶液の適用を可能にするために大きなオリフィスを含んだ、１μｇの抗− ＰＤＧ抗体（４ｍｇ／ｍｌ）を膜に適用した。膜上の残る結合部位をカゼイン溶 液によりブロックした０反応セルストリップを真空チャンバー内で乾燥し、そし て個々の反応セルに切断した。

ヱヱ皇不抜 ＰＤＧ標準を試験のためリン酸塩緩衝化ゼラチンにおいて調製した。

そられの標準（２００μｍ）を、０．５０又は１００μｇの縁結乾燥された抗− ＰＤＧ抗体と共に２分間インキュベートした。２分の最後で、すべての反応混合 物を、固定された抗−分析物を膜上に有する反応セルに添加した。第１段階から の遊離抗−分析物に結合されない分析物は面相上の固定された抗体を結合した。

この段階は１分であった。

１５０μｌの接合体（ＰＮＧ−アルカリホスフェート）を反応セルに添加し、そ して１分間インキュベートした。基質を添加し、さらに１分間インキュベートし た０反応を３００μ亘の水の添加により停止した。試験スポットの色の強度を、 Ｍａｃｂｅ　ｔｈ透過モニターを用いて記録した。

超重 アッセイを上記のようにして行なった。試験スポットの光学密度（０，Ｄ、）を 、膜を４５℃で乾燥した後に、読み取った。　ＰＤＧの種々の濃度で得られた０ 、Ｄ、を、第１表及び第１図に示す。

第１表 ＰＤＧ　Δ試験 ０　１．０９　１．０４　１．１２ １．０　０．５８　０．９６　１．１３２．０　０．３７　０．７２　１．０１ ３．０　０．２５　０．４７　０．９１４．０　０．２０　０．３０　０．６１ ５．０　０．１６　０．１８　０．３４６．０　０．１４　０．１５　０．２０ 上記から、種々の量の遊離抗体の添加は、アッセイが正から負に変化するにつれ てその濃度範囲を効果的にシフトし、そしてそのシフトの量は、試験に添加され る遊離抗体量に一般的に比例するや前記発明は、理解を明白にするために詳細に 記載されて来たが、本発明の範囲内で修飾を行なうことは明白であろう。

投与量応答シフト ＰＤＧ濃度（μｇ／ｍｌ）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプル中の分析物が固定された抗一分析物と共に組合され、そして前記分 析物の量が前記分析物と前記固定された抗一分析物との間の結合に基づいて決定 されるタイプの特異的結合アッセイであって、固定された抗一抗体と組合す前、 初期量の抗一分析物とサンプルとを反応せしめ、それによって、前記初期量の抗 一分析物により結合されていない残留分析物のみが固定された抗一分析物への結 合に利用できることを特徴とするアッセイ。
2. ２．十分な量の遊離抗一分析物が、サンプル中の分析物の量が限界量を越える場 合のみ、結合された分析物の検出を可能にするために導入される請求の範囲第１ 項記載のアッセイ。
3. ３．前記分析物が、ホルモン代謝物及び薬物から成る群から選択された小さな分 子である請求の範囲第１項記載のアッセイ。
4. ４．前記抗一分析物が、少なくとも約１０■Ｍ−１の前記小さな分子への結合親 和性を有する抗体である請求の範囲第３項記載のアッセイ。
5. ５．前記分析物及び前記初期量の抗一分析物が、中間結合物質の存在を伴わない で直接的に反応する請求の範囲第１項記載のアッセイ。
6. ６．前記分析物及び固定された抗一分析物が、中間結合物質の存在を伴わないで 直接的に結合する請求の範囲第５項記載のアッセイ。
7. ７．前記分析物及び固定された抗一分析物が少なくとも１種の中間結合物質の存 在下で間接的に結合する請求の範囲第５項記載のアッセイ。
8. ８．サンプル中の限界濃度の生来の分析物の存在を決定するためのキットであっ て： 初期量の抗一分析物： 固相の第１表面に結合される第２量の抗一分析物を有する固相；ここで、前記初 期量の抗一分析物は容器に存在するか又は固相の第２表面に結合されており；及 び 次の手段を示す取扱説明書： 分析物を含むと思われるサンプルと初期量の抗一分析物とを反応せしめ； その反応されたサンプルを前記固相の第１表面に適用し；そしてサンプル中の少 なくとも限界濃度の分析物の存在を示す可視シグナルについて前記固相の第２表 面を観察すること；を含んで成るキット。
9. ９．前記抗一抗体が、ホルモン代謝物又は薬物に結合する抗体である請求の範囲 第８項記載のキット。
10. １０．前記固相が膜である請求の範囲第８項記載のキット。