NO311112B1 - Fremgangsmåte for påvisning av en analytt i en pröve, et utstyrsett for denne, fremgangsmåte for fremstilling avsuperaggregat kompleks av et protein og en gull sol og etsuperaggregert kompleks - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for kvalitativ og kvantitiv bestemmelse av nærvær av en analytt i en væskeprøve.

Påvisningen og/eller analysen av analytter ved bruk av immunoanalyse-teknikker er vel kjent, spesielt i forhold til proteiner som antigener og antistoffer, så vel som sukre, lektiner og nukleinsyrer. Imidlertid er mange aktuelle teknikker som har høy grad av sensitivitet, ofte svært arbeidskrevende i og med at de består av mange trinn som hvert enkelt kan ha lang varighet. Det har vist seg mulig å forenkle noen av disse analysemetodene, ved å immobilisere en av komponentene i systemet på en fast fase, siden dette letter fjerning av reagensoverskudd. Slike analyser vil normalt involvere bruk av et merket makromolekyl, som kan være analytten selv eller en bindingspartner for analytten, merket med en egnet markør slik som en radioisotop, en fluorofor eller et enzym som produserer en karakteristisk reaksjon.

En forenkling som har vært foreslått er å bruke en farget forbindelse bundet til en av immunoanalysereaktantene som en synlig markør. Imidlertid er svært få fargede forbindelser i stand til å produsere et tilstrekkelig sterkt signal. US 4313734, Akzona Inc., beskriver bruken av, inter alia, kolloidalt gull som et slikt farget materiale, og spesifiserer at gullpartiklene skal ha en partikkelstørrelse på minst 5 nanometer, helst i området 10 til 100 nm.

Et forbedret immunoanalysesystem er beskrevet i WO 89/06801 hvor minst 75% av gullpartiklene har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 5 nanometer. Dette er hevdet og føre til en raskere reaksjon mellom gullreagenset og den immobiliserte reaktanten og også en økning i signalets fargeintensitet. Vi har nå funnet at en videre økning av signalets fargeintensitet kan oppnås ved at de svært små gullpartiklene fra WO 89/06801 danner større partikler (superaggregerte gullprotein kolloider) ved hjelp av en ny aggregeringsprosess. De superaggregerte partiklene er meget forskjellige fra de monolittiske gullpartikler til bruk i dagens immunoanalyser og tillater analyser av forbindelser ved enda lavere konsentrasjoner enn de allerede imponerende lave nivåer gjort mulig av systemet beskrevet i W089/06801.

Små gullpartikler er også brukt som markører i et blotting system, som beskrevet i US 4775636, Janssen Pharmaceutica N.V. Imidlertid finnes ingen forslag på at partiklene er aggregerte, de er tvertimot direkte bundet til komponenten som det er ønsket og visualisere.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse, har vi fremskaffet en fremgangsmåte for kvalitativ eller kvantitiv bestemmelse av en analytt i en prøve i hvilken et merket reagens omfattende en gull sol bundet til en forbindelse, i stand til spesifikt å binde seg til nevnte analytt eller til en spesifikk bindingspartner av denne, blir immobilisert i bundet form på en fast fase slik at det fremskaffes et signal på nærvær av og/eller mengde av analytten i prøven, kjennetegnet ved at det merkede reagenset omfatter et superaggregert kompleks av nevnte forbindelse eller en spesifikk bindingspartner av denne og en gull sol hvor minst 75 vekt% av gullpartiklene i gull sol'en har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 20 nanometer.

I mange typer av fast fase analyser, er det fordelaktig å koble en analog av analytten eller en spesifikk bindingspartner for analytten til en fast fase for å fremskaffe en fast fase til hvilken det merkede reagens immobiliseres. Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er derfor å fremskaffe en fremgangsmåte for kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av analytten i en væskeprøve, hvor prøven i et vandig analysemedium kontaktes med (i) en analyttanalog eller en spesifikk bindingspartner for analytten immobilisert på en fast fase og (ii) et merket reagens omfattende en gull sol bundet til et molekyl i stand til spesifikt og binde nevnte analytt eller en spesifikk bindingspartner av denne, og eventuelt et enzym i stand til å generere en karakteristisk reaksjon, hvor en mengde av nevnte merkede reagens er immobilisert på den faste fasen, påvisning eller bestemmelse av fargen av dette og/eller, fargen generert av nevnte enzym når dette eksponeres for et egnet substrat, benyttes for å indikere nærvær eller mengde av nevnte analytt i prøven, hvor det merkede reagens omfatter et superaggregert kompleks av nevnte forbindelse eller spesifikke bindingspartner for denne og eventuelt nevnte enzym, og en gull sol hvor minst 75 vekt% av gullpartiklene har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 20 nanometer.

Den faste fase på hvilken det merkede reagens er immobilisert kan alternativt være inert og immobilisere den bundne form av det merkede reagens ved fysisk oppfanging, for eksempel ved ikke å tillate den bundne form av det merkede reagens å passere porene i den faste fasen, mens det ubundne merkede reagens tillates å passere gjennom porene.

Betegnelsen "analyttanalog" som brukt her må forstås og inkludere alle forbindelser egnet til spesifikt å binde seg til en spesifikk bindingspartner for analytten som skal analyseres og således inkluderes innenfor rammen en ytterligere mengde av denne analytten.

Gjennomsnittsdiameteren til en partikkel, som kanskje ikke er fullstendig sfærisk, er gjennomsnittet av den største og minste diameter av partikkelen. Det foretrekkes at minst 75 vekt% av gullpartiklene som danner det superaggregerte kompleks har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 5 nm og spesielt foretrukket er minst 80% av gullpartiklene under denne grensen. En nedre grense for gjennomsnittsdiameteren av partiklene er passende 1 nm. Enkelte batcher av produktet Colloidal Gold Sol G5 fra Janssen Life Scienoes Products, solgt til bruk som en histologisk farge, har vist seg å være nyttige. I en enkelt batch var 85% av partiklene mindre enn 5 nm i diameter, den gjennomsnittlige diameter var 4.5 nm, med en Gauss fordeling på mellom 1.1 og 7.6 nm. Gull sol'er med gjennomsnitts-diametre i området 2-4 nm kan også lages ved mindre modifikasjoner av kjent metodologi, for eksempel variasjon av tanninsyre konsentrasjonen i prosedyren beskrevet av Slot og Geuze (Eur. J. Cell. Biol. 38, 87-93, 1985). Vi har funnet at partikler som har en gjennomsnittlig diameter i området 4-4.5 nm er å foretrekke.

De superaggregerte kompleksene kan dannes fra gull sol'er og reagenset som skal merkes (protein) ved å blande de ønskede mengder av disse i løsning, tilpasse pH i området 1-5, fortrinnsvis 3-4 eller helst 3.5, ved tilsetting av syre, for eksempel eddiksyre til en éndelig konsentrasjon på omtrent 10 mmol/l, og oppsamling av makroskopiske aggregater som er dannet, ved filtrering med vasking, eller alternativt ved gjentatt sentrifugering og resuspensjon. De makroskopiske aggregatene resuspenderes i en pH-nøytral væske, som for eksempel inneholder 2 vekt% bovint serum albumin (BSA) eventuelt etterfulgt av valgfri ultralyd behandling. De makroskopiske aggregatene forsvinner overraskende fort og etterlater en suspensjon av stabile superaggregerte gullprotein-komplekser. Superaggregerte kolloider kan også dannes med enkelte proteiner ved nøytral pH, forutsatt at kolloidene er i molart overskudd i forhold til proteinet, og at proteinet som anvendes har et visst antall positivt ladede grupper (>2) ved den aktuelle pH. Imidlertid, en sur pH gir normalt det beste resultat.

De superaggregerte kompleksene benyttet i metodene i henhold til oppfinnelsen er passende i området 50-5000 nm i størrelse, foretrukket 50-500 nm og mest foretrukket 100-200 nm. Antallet av gull sol partikler per kompleks vil åpenbart avhenge av partikkelstørrelsen og kompleksstørrelsen, men eksempelvis kan 5 nm partikler plasseres 10 nm fra hverandre ved mellomliggende proteinmolekyler. Under slike omstendigheter vil et 50 nm kompleks inneholde omtrent 15 partikler og et 5000 nm kompleks omtrent 20 millioner partikler. Et 200 nm kompleks er observert å inneholde omtrent 1000 partikler som er i overens-stemmelse med 10 nm interpartikkelmellomrom.

De superaggregerte gullkompleksene oppnåelig ved ovennevnte prosedyre, og prosedyrene for å danne dem, er nye og danner ytterligere aspekter ved oppfinnelsen.

I motsetning til den ovenstående beskrevne prosedyre, er den normale utførelsen av proteingullkonjugasjon å overføre proteinet til et lavsaltmedium med en pH nær pl for proteinet. Normalt er pH anbefalt å være en pH-enhet over pl. I denne situasjonen inneholder proteinet et minimum av positivt ladede grupper. Når denne løsningen blandes med gullkolloider, som man tror har en massiv overflate-lokalisering av elektroner, etableres bare et fåtall bindinger mellom protein og kolloid. I denne situasjon unngås dannelsen av broer mellom et flertall proteiner og kolloider, og kolloidene holdes i løsningen som enkle partikler dekket med proteinmolekyler.

Når pH i proteinløsningen senkes, øker antallet av positivt ladede grupper på hvert enkelt proteinmolekyl. Således vil antallet av mulige ioniske bindinger mellom protein og kolloid øke og føre til dannelse av multiple broer og dannelse av makroskopiske aggregater. Dette anses vanligvis som en høyst ugunstig situasjon som bør unngås. Imidlertid, den foreliggende oppfinnelse drar fordeler av denne effekten. Ved en videre tilsetning av protein, vil de makroskopiske aggregatene overraskende oppløses og etterlate en løsning av superaggregater av protein og gullkolloider av uniform størrelse. Siden kolloidene er adskilt av proteinmolekyler, tror vi at overflaten i stor grad er økt i hvert superaggregat. Siden det antas at fargen dannet av metallkolloider er et fysisk fenomen relatert til overflaten av kolloidene, er den massive økning av signalet sannsynligvis forårsaket av en tilsvarende massiv økning i total overflate pr superaggregerte kompleks.

En illustrasjon av forbedring oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse, er en 5-30 ganger større fargeintensitet ved bruk av superaggregerte komplekser inneholdende en bindingspartner for analytten immobilisert på en fast fase sammenlignet med fargen observert ved bruk av 4 nm gull-antistoff-konjugater, i henhold til W089/06801, avhengig av hvilket system som benyttes.

Det er mulig å danne superaggregerte gullkomplekser som inneholder to eller flere typer proteinmolekyler, således gis mange muligheter for å øke fleksibiliteten og følsomheten av analysemetodene i henhold til oppfinnelsen. En mulighet er å aggregere forbindelsen som er istand til å binde analytten (eller en spesifikk bindingspartner av denne) og et enzym istand til å generere en karakteristisk reaksjon i ett superaggregert kompleks. Dette gir mulighet for bestemmelse av nærvær og/eller kvantitet av analytten ved å inspisere eller bestemme fargen av gull sol'en og/eller ved å eksponere enzymet for et substrat og bestemme fargen generert av enzymet. Når fargen på gull sol'en er under den målbare grense, kan enzymet gi en påvisbar farge etter forlenget inkubering med et egnet substrat. Eksempler på egnede enzymer er basisk fosfatase og peroksidaser lik pepperrotperoksidase. I det tilfelle at fargen på gull sol'en er under den påvisbare grense for analyttbestemmelse, vil gull solsuperaggregatet virke som en spesielt mild form for protein-protein kryssbinding som under visse omstendigheter vil være fordelaktige sammenlignet med konvensjonell kovalent kryssbinding.

Alternativt kan det dannes et superaggregert kompleks inneholdende to forbindelser istand til å binde to forskjellige målmolekyler for eksempel på den ene siden et antistoff (Ab1) for analytten og på den andre siden et antistoff (Ab2) for et annet antigen. Når først komplekset er bundet via Ab1 til analytten, selv bundet direkte eller indirekte til en fast fase, eksponeres det hele for et ytterligere superaggregert kompleks som inneholder antigenet (Ag2) antistoffet Ab2 vil da forårsake en gruppe av nye komplekser rundt det første kompleks og en økning i den totale gull sol fargen blir resultatet. Prosessen kan utvides med videre trinn hvis ønskelig, for eksempel kan det andre komplekset inneholde to antigener Ag2 og Ag3, hvor sistnevnte kan brukes som et tilknytningspunkt for et ytterligere kompleks inneholdende et antistoff (Ab3).

Andre reseptor-ligand par kan selvfølgelig inkluderes i slike forsterknings-system slik som (strept)avidin og biotin, enzymer og enzyminhibitorer, lektiner og glykoproteiner, protein A og immunoglobuliner etc.

Systemet kan også bringes til å danne voksende komplekser av aggregater ved samtidig tilsetning av to hybridaggregater, ett som kan bindes til en immobilisert analyttreseptor, og hvor begge har multiple reaksjonsgrupper av minst to typer hver, hvor den ene reagerer med det andre aggregatet. Resultatet blir dannelsen av et nettverk av aggregater som kan dannes på en dose-avhengig måte dersom reagensene tilsettes et gjennomstrømningssystem hvor analytten er immobilisert.

Gullkolloider aggregert med et antistoff reagerende med et analyttantigen kan agglutinere ved tilsetning av analytten. Denne reaksjonen kan være sen. En amplifikasjon kan oppnås ved å danne et første hybrid aggregat av gullkolloider og et første antistoff Ab1 som reagerer med analyttantigenet Ag1, og et andre antistoff Ab2. Et andre aggregat inneholdende multiple antigener Ag2 som reagerer med Ab2, tilsettes og øker agglutinasjonsreaksjonen.

Metodene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan utføres i et hvilket som helst fast fase system for påvisning eller bestemmelse av analytter. Følgende typer tester er typiske: 1. En sandwich test hvor komponent A er bundet til en fast fase. Prøveløsning med analytt B tilsettes hvorpå B bindes til A. Gullmerket komponent C tilsettes og siden C bindes til B immobiliseres kolloidalt gull og farger den faste fase.

Komponentene A, B og C er alle av typen reseptor-ligand hvor både A og C reagerer med B, og hvor A og C ikke bindes direkte til hverandre. 2. En sandwich test som i 1 unntatt at prøveløsningen med analytt B og gullmerket komponent C er blandet og blandingen er tilsatt den faste fase til hvilken komponent A er bundet. 3. En konkurrerende test hvor komponent A er bundet til en fast fase. Prøveoppløsningen med analytt B blandes med en gitt mengde av gullmerket analytt B og tilsettes den faste fase. B og gullmerket B vil konkurrerer i å bindes til A og en reduksjon i kolloidalt gull fargen på den faste fase indikerer økende mengde av analytt B i prøveløsningen. 4. En konkurrerende test som i 3, men sekvensiell tilsetning av prøveløsningen og gullmerket B. 5. Komponent A i overskudd er merket med kolloidalt gull og blandes med prøveløsningen som inneholder en ukjent mengde av analytt B. A og B bindes. Blandingen tilsettes en porøs fase hvorpå komponent B er immobilisert. Resten av ubundet merket A bindes til den immobiliserte B på den faste fasen. 6. Analytt B reagerer med gullmerket komponent C, eventuelt sammen med en eller flere andre bindingspartnere for analytt B for å danne et kompleks aggregat. Reaksjonsblandingen diffunderer gjennom et inert filter medium, hvor porene er for små til at kompleks aggregatet passerer, men store nok til å tillate overskudd av gullmerket komponent c å passere igjennom.

Den faste fase eller støtte hvorpå den merkede reagens immobiliseres, kan ha mange ulike former, hvor følgende er illustrative: En plastikkpinne eller remse, eventuelt dekket med et lag av et hvilket som helst porøst materiale. Pinnen/remsen kan dyppes i reaksjonsblandingene for utføring av de varierende trinn i testen.

Veggen til et prøverør, en brønn i en mikrotiterplate eller veggen i ethvert

annet egnet reaksjonskammer.

Et porøst materiale, vanligvis et menibran, hvor reaksjonsløsningene kan diffundere transversalt igjennom eller lateralt. Ved bruk av filtrerings-prinsippet vil slike materialer fordelaktig tillate overflødige reagenser å passere igjennom og kan eventuelt kombineres med en absorbent for slike overskudds -væsker.

Kuler (inklusive mikrosfærer) som kan isoleres ved sentrifugering, filtrering eller, hvor kulene inneholder ferromagnetiske forbindelser, magnetisme.

Bindingen av analyttanalogen eller den spesifikke bindingspartner for analytten som skal måles til den faste fasen kan være kovalent, elektrostatisk eller hydrofobiske eller en kombinasjon av disse metodene. Slike metoder er godt kjent i faget.

Oppfinnelsens metode kan brukes til å påvise eller måle et bredt spekter av analytter som kan utvelges, for eksempel fra følgende ligand-reseptor forbindelser: antigen/antistoff, hapten/antistoff, hormon/hormonreseptor, sukker/lektin, biotin/avidin- (streptavidin), protein A/immunoglobulin, enzym/enzym kofaktor, enzym/enzyminhibitor og nukleinsyre parforbindelser (DNA-DNA, DNA-RNA eller RNA-DNA). Minst en av disse reaktantforbindelser kan bindes eller danne komplekser med andre molekyler. Således kan biotin eller avidin eller et bredt spekter av antistoffer bindes til andre molekyler for å fremskaffe et middel til testing av sistnevnte. For eksempel kan en spesifikk nukleinsyre probe merkes via introduksjon av biotinylerte nukleosidtrifosfater. En slik probe, etter binding til analytt DNA eller RNA, kan da påvises eller måles ved bruk av avidin eller streptavidin merket med gull sol.

Vanligvis når analytten er en av de som nevnt ovenfor, vil en bindingspartner til bruk i metoden ifølge oppfinnelsen være den motsatte komponenten av paret. I sandwich-systemer hvor analytten bindes både til en immobilisert bindingspartner og en bindingspartner merket med gull sol, vil bindingspartnerne være de samme eller ulike. Foretrukket vil bindingspartnerne være antistoff reagens rettet mot ulike adskilte determinanter av analytten.

Det forstås her at begrepet "antistoff som benyttes omfatter

(a) hvilket som helst av de ulike klasser eller underklasser av immunoglobin, for

eksempel IgG, IgM, avledet fra et av de vanligvis brukte dyrene;

(b) monoklonale antistoffer; og

(c) fragmenter av antistoffer, monoklonale eller polyklonale som bibeholder et antigenbindingssete, for eksempel fragmenter fri for Fc-del (for eksempel Fab, Fab', F(ab')2) eller de såkalte "halv-molekyl" fragmenter oppnådd ved reduktiv spalting av disulfid broer mellom de tunge kjede-komponentene i det intakte antistoff.

Under er en liste over eksempler på typer av immunogener som kan påvises eller kvantifiseres ved hjelp av metoden ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Spesielt interessante analytter for undersøkelse med metoden ifølge oppfinnelsen er blodproteiner slik som fibrin degraderingsprodukter, for eksempel D2, som bindes av immunoglobuliner slik som IgG; human C-reaktivt protein; kreatininkinase isoenzymer; og myoglobin.

Analyttløsningen kan benyttes direkte eller fortynnes, for eksempel med en egnet buffer løsning. Gull sol preparatet kan også tillages i varierende fortynninger ved bruk av en passende buffer løsning, og fortynningene velges slik at det oppnås en farge av ønsket intensitet (f.eks. optisk tetthet eller refleksjon) ved prosedyrens slutt. Det kan være ønskelig å vaske den faste fasen for å fjerne overskuddsreagenser, f.eks. med en bufferløsning før måling for å redusere bakgrunnsfargen.

Hvor testen er basert på den totale mengde av gull sol holdt igjen på den immobiliserte fase, kan fargen estimeres med et reflektometer, densitometer eller lignende utstyr.

Den faste fasen brukt til å immobilisere en av bindingspartnerne i testen eller en analyttanalog kan for eksempel være nitrocellulose, papir eller cellulose-acetat aktivert med reagenser som cyanogenbromid og nylon modifisert ved introduksjon av tertiære aminogrupper. Slike faser er vanligvis brukt i form av porøse membraner.

I en spesielt foretrukket metode i henhold til oppfinnelsen er den inerte fasen en membran, for eksempel en nylonmembran slik som Hybond N som lett absorberer proteiner og som har porer som tillater passasje av væske. En absorbent slik som trekkpapir kan fordelaktig plasseres på den andre siden av membranen og et væske-ugjennomtrengelig ark, helst hvitt, plasseres under absorbenten. Et tilsvarende væske-ugjennomtrengelig ark plasseres over membranen, arket er utstyrt med hull, for eksempel omtrent 3,5 mm i diameter som tillater applikering av analyttløsningen og testløsningene på membranen. Initialt aktiveres membranen ved applikering av et lite volum, for eksempel omtrent 2 ul, av en vandig løsning som inneholder en gitt mengde bindingspartner for analytten, etterfulgt av tørking, for eksempel, ved romtemperatur. Et kjent volum av vandig løsning som inneholder analytten, for eksempel 25 tilsettes så membranen og tillates å passere igjennom til absorbenten under. En vandig løsning, for eksempel 25 som inneholder en gitt mengde av kolloidale gull sol partikler merket med en bindingspartner for analytten, som kan være den samme som eller forskjellig fra den som først ble anvendt på membranen, tilsettes og tillates å passere igjennom membranen.

Et lite volum av vann eller buffer kan eventuelt tilsettes for å vaske igjennom gull sol reagenset og således minimalisere bakgrunnsfargen. Mengden av gull sol immobilisert på membranen bestemmes ved hjelp av et reflektometer eller av det nakne øye ved sammenligning med en fargeskala.

I metoden (6) som beskrevet ovenfor, kan membranen være et ark materiale av den ønskede porøsitet som ellers er inert så lenge som dets eneste funksjon er å fungere som et filter. Aggregasjonen av analytten med komponent C kan forsterkes ved å inkludere to eller flere forskjellige bindingspartnere til analytten for å oppnå dannelse av kryss-bindinger som fører til større aggregater. Alternativt kan komponent C omfatte bindingspartneren for analytten immobilisert på kuler, for eksempel monodisperse kuler slik som Dynospheres.

Oppfinnelsen omfatter også utstyr for å kunne utføre oppfinnelsens metode som omfatter (a) en fast fase på hvilken et merket reagens immobiliseres for å fremskaffe en indikasjon på nærvær eller mengde av analytten i prøven og (b) et merket reagens,karakterisert vedat det merkede reagens omfatter et superaggregert kompleks av en forbindelse som er i stand til spesifikt og bindes til nevnte analytt eller til en spesifikk bindingspartner av denne og en gull sol hvor minst 75% vekt av gull partiklene av gull sol'en har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 20 nanometer. En foretrukket form for kit omfatter (a) en fast fase for immobilisering av en analyttanalog eller en spesifikk bindingspartner for analytten eller et kompleks av analytten med en eller flere andre reagenser, (b) nevnte analyttanalog eller bindingspartner og (c) et reagens omfattende et superaggregert kompleks av et molekyl i stand til spesifikt å binde til analytten eller en spesifikk bindingspartner derav og en gull sol hvor minst 75% vekt av partiklene av gull sol har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 20 nm. Når et enzym som er i stand til å generere en karakteristisk reaksjon er inkludert i det superaggregerte kompleks, kan også et substrat for enzymet inngå i utstyrsettet.

Eventuelt kan den faste fase i utstyrsettet være en fast faste klar for kontakt med analytten ved preliminær binding av en analyttanalog eller en spesifikk bindingspartner for analytten til fasen. I noen tester kan slike kit inkludere en standard mengde av analytten, en standard mengde av en spesifikk bindingspartner derav og gull sol reagenset. Standard mengder av analytten eller spesifikk bindingspartner eller reagens kan være i form av en vandig løsning eller, mer vanlig, lyofiliserte tilberedninger tilpasset for oppløsning før bruk. I en utførelses-form av testen kan den faste fase være en inert porøs membran som tjener til å holde igjen et kompleks av analytten og en bindingspartner i aggregert form, men tillater diffusjon av gull sol reagenset, som i metode (6) ovenfor. I et slikt system kan størrelsen på analyttkomplekset økes ved at den nevnte bindingspartner eller analyttanalogen bindes til relativt store partikler, som f.eks. Dynospheres som tidligere nevnt.

Til tross for at den foregående diskusjon og de følgende eksempler konsentreres om reseptor-ligandtester, må det forstås at de nye superaggregerte komplekser vil ha et bredt spekter av andre anvendelser innen områder hvor gullkolloider kan benyttes. Således kan aggregater bli brukt i blottingteknikker når de er bundet til et antistoff eller andre typer bindingsmaterialer rettet mot en forbindelse som mistenkes for å være tilstede i en prøve; de vil også kunne være nyttige i farging av vevssnitt for lys- eller elektronmikroskopi og i andre farge-teknikker; i sentrifugering vil de være nyttig som markører; og i agglutineringstester kan de erstatte latex-partikler som ofte brukes. Andre anvendelser vil for en fagmann på området være åpenbare der de superaggregerte kompleksene kan erstatte andre typer partikler i bruk i dag.

Følgende eksempler tjener kun som illustrasjon;

Eksempel 1

Kolloidalt gull med en gjennomsnittsdiameter på 4 nm ble produsert som beskrevet i Mulphfordt (1982), Experienta 38, (pp 1127-1128).

Et mus monoklonalt antistoff S4H9 rettet mot fibrin degrasjonsproduktet D-dimer, ble utviklet ved ordinær hybridoma-teknologi, antistoffet ble produsert i mus' bukhulevæske og til slutt renset. Det rensede antistoff ble dialysert før bruk mot destillert vann og justert til en konsentrasjon på 1,5 mg/ml.

En suspensjon av gullkolloider som har en optisk tetthet på 40 ved 540 nm (estimert ut fra fortynning av kolloid suspensjonen) ble brukt. Suspensjonen ble sentrifugert, 90-95% av supernatanten ble fjernet, og resuspendert i destillert vann før bruk. Til 25 ml av denne løsningen tilsettes eddiksyre til en sluttkonsentrasjon på 10 mmol/l som gir en pH-verdi på ca 3,5, umiddelbart tilsettes 15 ml av den dialyserte løsningen av antistoffet S4H9. Blandingen røres i 20 minutter. Makroskopiske aggregater er straks synlige. Etter 20 minutter sentrifugeres suspensjonen ved 5000xg i 10 minutter. Supernatanten ble fjernet, og de bunnfelte aggregater ble resuspendert i destillert vann til et sluttvolum på 40 ml. 10 ml av en løsning på 10% bovint serumalbumin (BSA) ble tilsatt. Suspensjonen ble nedkjølt på is og deretter gjenstand for lett ultralydbehandling i ca 15 sekunder. Større volum kan med fordel sonikeres i et flow-system. Suspensjonen ble fortynnet fire ganger til et sluttvolum på 200 ml og sterilfiltrert i et 0,22 mikrometer filter og til slutt justert til 20 mmol/l NaCI. Elektronmikroskopering åpenbarte at kolloidene er tilstede som klustre med diametre på 100-200 nm (Fig. 1).

Suspensjonen passerte 0,22 mikrometer filteret, (=220 nm), mens filtre med diametre 100 nm og 50 nm fullstendig stanset de fargede kolloider.

Et standard konjugat ble laget ved bruk av en standard merkingsmetode for antistoffer som beskrevet av Slot og Geuze (Eur. J. Cell. Biol. pp 87-93,1985). I denne prosedyren dannes ingen aggregater siden pH holdes nær pl for antistoffet under konjugasjonsprosedyren. Estimert forhold mellom gull og antistoff i de resulterende koniugater var 1:1, og elektronmikroskopering verifiserer at gull partiklene var tilfeldig distribuert i løsningen (Fig. 2).

Konjugatene ble testet i den følgende testanordningen:

Et 1 x 1 cm stykke av nitrocellulosemembran med porestørrelse 0,6 ble plassert under en strimmel av hvitt polyvinylklorid (PVC), 0,28 mm tykk, og med et 3,5 mm hull sentrert over membranen. Membranen ble klebet på plastikken ved bruk av dobbeltsidig tape. PVC-strimmelen med membranen ble anordnet til en 1 mm tykk pad av cellulosepapir til tapeområdet som ikke er dekket av membranen. Testanordningen ble lukket under med en annen PVC strimmel som er 0,40 mm tykk, og festes til paden ved bruk av dobbelsidig tape. Denne konstruksjonen gjør det mulig for en væske å passere igjennom hullet i den øvre PVC strimmelen, gjennom membranen, og akkumulere i paden. Membranen ble aktivert ved å tilsette 2 \ i\ av en 3,0 mg/ml løsning av antistoffet S4H9 og membranen tørkes deretter før videre bruk.

25 jxl med plasmaprøve kjent for å inneholde D-dimer, ble tilsatt membranens overflate i parallelle hull i testanordningen. Etter ca 20 sekunder hadde plasmaet passert gjennom membranen til paden. 25 ul med gullkonjugat i aggregert form, og 25 ul med gullkonjugat i ikke-aggregert form ble tilsatt til hvert av to parallelle hull. Når væsken hadde passert membranen, ble en dråpe av 0,15 mol/l NaCI tilsatt for å vaske ut overflødig konjugat. Som en kontroll ble plasma, kjent for å inneholde normale lave nivåer av D-dimer, gjenstand for samme prosedyre med bruk av de to konjugater. Resultatene ble avlest ved bruk av et reflektometer (Color Eye, Macbeth), koblet til en IBM PC og ved bruk av Macbetl<Y>s software-prog ram.

De oppnådde resultater viser at fargen som dannes med normalt plasma med lave nivå av D-dimer, produserer en tilsvarende lav reflektans <0,18 ved 540 nm. Fargen dannet med det ikke-aggregerte konjugatet var generelt svak, mens fargen dannet med det aggregerte konjugat var ca ti ganger sterkere vurdert ut fra reklektansverdiene. Resultatene viser at den nye formen for konjugater produserer et sluttresultat som var markert sterkere enn med de ordinære konjugater. Bakgrunnssignalet ble ikke påvirket av aggregeringen.

Videre viste filtreringstesten at størrelsen på de aggregerte gullkolloider var i området 100-200 nm. Dette ble bekreftet med elektronmikroskopi.

Eksempel 2

I dette eksempel demonstreres det at de aggregerte konjugater også kan dannes ved bruk av en enklere metode uten sonikasjon.

Gullkolloider, testutstyr og antistoffer ble laget som beskrevet i eksempel 1. Gullkolloid-suspensjonen ble behandlet som beskrevet til nivået for justering av pH til 3,5 ved bruk av eddiksyre. 25 ml av den pH-justerte kolloid-suspensjonen ble tilsatt 12,5 ml av en løsning på 1,5 mg/ml av S4H9. Etter 25 minutter ved 20°C, ble suspensjonen tilsatt en løsning av 10% BSA justert til pH 9,0. Sluttkonsentrasjonen av BSA var 0,2%. Suspensjonen var da justert til 40 mmol/l Tris-HCI (pH 7,3). Når suspensjonen ble rørt i over natten, forsvant de synlige aggregatene, og suspensjonen passerte et sterilt filter med porestørrelse 0,22 (im, men ikke et 100 nm filter. Elektronmikroskopi avslørte at aggregater var dannet, skjønt ikke så tett pakket som i prosedyren beskrevet i eksempel 1. Testing ifølge oppsettet i eksempel 1, avslørte at signalet var økt med ca fem ganger sammenlignet med ordinære, ikke-aggregerte konjugater.

Eksempel 3

Prosedyren i eksempel 1 ble gjentatt med ett unntak, gullkolloid-suspensjonen ble tilsatt NaCI til 5 mmol/l og lagret ved 4 °C i 14 dager før bruk. Denne prosedyren gjør at gullkolloidene danner aggregater på en mer utpreget måte. Når konjugatene ble testet i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1, var fargesignalene ca tredve ganger sterkere enn signalene oppnådd ved bruk av ikke-aggregert gull. Bakgrunnsnivået var økt litt som følge av at aggregatene som var dannet hadde større diametre.

Eksempel 4

I dette eksemplet er det demonstrert at visse antistoffer kan danne aggregater med gullkolloider ved pH nær til nøytral. Størrelsen og signal-intensiteten som fremkommer ved bruk av slike aggregater kan tilpasses ved å variere forholdet mellom protein og gull i konjugasjonsprosedyren.

Et mus monoklonalt antistoff benevnt 2D2, spesifikt mot human serum albumin, var utviklet ved bruk av velkjent hybridoma teknologi. Antistoff-produksjonen var skalert opp ved bruk av mus bukhulevæske-teknikk, antistoffet ble renset, og dialysert mot 2 mmol/l natrium fosfatbuffer (pH 6,8). Sluttkonsentrasjonen av antistoff var 1,0 mg/ml.

Gullkolloider ble laget som beskrevet i eksempel 1. Kolloidalsuspensjonen ble justert til optisk tetthet på 40 ved 540 nm.

Antistoff løsning og gullkolloid-suspensjon ble blandet i følgende forhold: 1+2,1+2,2,1+2,5,1+3,1+3,5.

Etter 25 minutter ved 20 °C ble løsningene tilsatt en lik mengde av 1% BSA-løsning.

Konjugatene ble testet i anordninger som beskrevet i eksempel 1. Membranene ble aktivert ved tilsats av 2 ul av en 3,0 mg/ml løsning av et annet mus monoklonalt antistoff (2D3) rettet mot human serumalbumin. Membranene ble tørket før bruk.

Human urinprøver med tilsatt albumin henholdsvis 0 (kontroll), 10, 25, 50, 100 og 200 mg/l ble fortynnet i 0,15 mol/l av NaCI i forholdet 1+20. 25 ul av hver fortynning ble tilsatt til fem parallelle hull i testanordningene. Når de fortynnede prøvene hadde suget seg inn i membranen, ble en dråpe av hver av konjugatene tilsatt hvert enkelt hull i hver enkelt av de parallelle seriene. Til slutt ble en dråpe av 0,5 mol/l NaCI tilsatt for å vaske membranen, og hvert hull ble avlest som beskrevet i eksempel 1.

Resultatene er vist i Fig. 3, som viser at det er en markert økning i signalet når mengden av antistoff øker. Ikke i noen av tilfellene ble frie antistoffer (ikke konjugert til gullpartikler) påvist i løsningene. På grunn av dette, og på grunn av den relative økningen i reflektansverdier, kan økningen av signalet ikke forklares med en økning av antall reaktive antistoffer som sådan. Eksperimenter med 50 nm filtre viste også at 1+2 ratio konjugatet hovedsaklig ble stanset av filteret, mens 1+3,5 ratio konjugatet passerte fritt. Således hadde aggregater med økt evne til å forsterke signalet blitt dannet med antistoff 2D2 med pH nær til nøytral.

Eksempel 5

Prosedyren i eksempel 1 ble gjentatt, med det unntak at antistoffet ble erstattet med et monoklonalt antistoff T11G8 rettet mot C-reaktivt protein. Konsentrasjonen av antistoff, oppløsningen for antistoffet, gullkolloidet og den fullstendige prosedyren var den samme som i eksempel 1. Filtreringstesten viste passasje gjennom 200 nm filtre, men ikke gjennom 50 eller 100 nm filtre.

Til sammenligning ble et standard konjugat laget ved pH 6,5 som er nær pl for T11G8. Dette konjugatet passerer lett et 50 nm filter som indikerer at aggregater ikke ble dannet. Elektronmikroskopi bekreftet dette og viste bare mindre grupper av gullkolloider i sluttløsningen.

De to konjugater ble testet i en anordning lik den som beskrevet i eksempel 1. Membranen var aktivert ved tilsats av 2 mikroliter av en 3,0 mg/ml løsning av monoklonal antistoff G405 rettet mot C-reaktivt protein og tørket før bruk. 25 \ i\ av fortynnede plasmaprøver kjent for å inneholde C-reaktivt protein, ble tilsatt til hvert stykke av membranen gjennom hullene i plastikklaget, fulgt av 25jai med konjugatløsning i en av de to former, og deretter en dråpe av 0,15 mol/l NaCI for å fjerne bakgrunnsfargen.

Figur 4 viser resultatene som er oppnådd ved serie fortynning fra 1:50 til 1:800 av en plasmaprøve som inneholder 32 mg/l med CRP. Fortynningsmidlet var 0,15 mol/l NaCI. Som figuren viser, viser de to typer av konjugater en betydelig forskjell i fargeintensitet på membranen, det aggregerte konjugat resulterte i et mer enn ti ganger økt signal.

Begge konjugater ble lagret ved 4 °C i en periode på ni måneder og regelmessig testet. Ingen av konjugatene viste endrete egenskaper etter denne tids lagring, hvilket indikerer at de aggregerte konjugater er ekstremt stabile.

Eksempel 6

Eksperimentet ovenfor ble gjentatt men istedenfor antistoffet T11G8 ble et renset kanin anti-humant serum albumin (anti-HSA) benyttet. De resulterende konjugatene ble testet i en anordning som inneholdt membraner belagt med et monoklonalt anti-HSA antistoff ved bruk av samme prosedyre som i eksemplene 1 og 5. Resultatene viste at etter å tilsette fortynnet urin som inneholdt albumin, resulterte det aggregerte konjugat i ca åtte ganger økt fargesignal sammenlignet med det konvensjonelle ikke-aggregerte konjugat.

Eksempel 7

Aggregerte konjugater kan også dannes ved bruk av proteiner forskjellige fra antistoffer. Tillagingsprosedyren av gullkolloider og aggregerte konjugater fra eksempel 1 ble gjentatt, denne gangen ved å erstatte antistoffet med bovint serum albumin. Albuminkonsentrasjonen som ble brukt var 1,5 mg/ml, som for anti-stoffene. Aggregater med egenskaper i filtre tilsvarende antistoff-aggregatene ble dannet. Albuminaggregert gullkolloid ble undersøkt med elektronmikroskop og demonstrerte en tilfeldig distribusjon av grupper av kolloider lik de som ble dannet i eksempel 1.

Eksempel 8

Et annet protein forskjellig fra antistoffer som kan konjugeres til kolloidalt gull i en aggregert form, er protein A. Den samme prosedyren som i eksempel 1 ble brukt, protein A konsentrasjonen var på 1,5 mg/ml som med de andre proteinene. Det resulterende aggregerte konjugatet såvel som et konvensjonelt ikke-aggregert, ble testet i en anordning lik den som beskrevet i eksempel 1. Membranen var belagt med et monoklonalt IgG antistoff rettet mot human serum albumin. Siden protein A reagerer direkte med immunoglobuliner, viste tilsettingen av ulike fortynninger av de to konjugater at ved tilsetting av en like stor mengde av konjugert protein A, produserte det aggregerte konjugat et signal som var ca tolv ganger sterkere enn signalet som ble oppnådd med konvensjonelt konjugat.

Eksempel 9

I dette eksempelet demonstreres dannelsen av et hybridaggregat som inneholder to forskjellige proteiner som fortrinnsvis kan brukes til binding og signal-dannelse. Enzymet basisk fosfatase (ALP) er ko-konjugert med gullpartikler sammen med kanin anti-mus IgG. Et slikt konjugat tillater påvisning av mus lgG's enten ved å observere gullfargen direkte, eller ved å anvende enzymet på en ELISA-måte.

Enzymet (ALP) og antistoffet ble avsaltet ved gelfiltrering på en PD-10 kolonne ekvilibrert med 10 mmol/l eddiksyre, og deretter blandet i et mengde-forhold på 1,5:1 (enzym:antistoff). Proteinblandingen ble da konjugert til gullkolloider i 10 mmol/l eddiksyre, summen av massene av de to proteiner tilsvarer samme protein: gullforholdet beskrevet i eksempel 1. De superaggregerte, presipiterte konjugatene fikk sedimentere passivt, ble sonikert og blokkert med bovint serum albumin (BSA), og til slutt sterilfiltrert, hele prosedyren tok ca en time. Figur 5 demonstrerer påvisningspotensialet av det resulterende hybridkonjugatet. Fortynninger av konjugatet ble direkte påsatt nitrocellulose med en jevn distribusjon over sirkler med diameter 3,5 mm. Gullfargen ble målt med et reflektometer. Nitrocellulosen ble deretter overført til en basisk fosfatasesubstrat-løsning som inneholdt bromokloroindolylfosfat (BCIP). Etter inkubering og lett risting i 30 minutter, presipiterte et mørkt, fiolett produkt fra ALP's reaksjon med BCIP på nitrocellulosen. Figur 5 viser at en videre økning i følsomheten med ti ganger mer enn det som ble oppnådd med gullfargen ble oppnådd ved bruk av denne valgfrie enzymaktiviteten. Figur 6 viser at påvisninger av et mus monoklonalt IgG påsatt nitrocellulose, ved bruk av hybridkonjugatet. En total på 0,1 til 100 ng antistoff fortynnet i 100 Mg/ml BSA ble påsatt nitrocellulosen i duplikat. Nitrocellulosen ble tørket, blokkert med BSA og inkubert med konjugatet i nærvær av 0,1% Tween 20 i 20 minutter. En av flekkene ble overført til enzymsubstrat (BCIP) løsningen og inkubert som beskrevet ovenfor. De utviklede flekker viser at 1 ng av antistoffet kan detekteres ved bruk av gullfargen, mens 0,1 ng påvises ved bruk av enzymet. Enzymfargen synes å gi en total økning i følsomheten på ca 15 ganger sammenlignet med gullfargen.

Eksempel 10

I dette eksempelet demonstreres dannelsen av et hybrid superaggregat som inneholder gullkolloid og to forskjellige proteiner, ett som er en spesifikk bindingspartner for analytten og ett annet protein som ikke deltar i reaksjonen, eller som ikke er tilstede i prøven eller på andre måter i reagensene. Dette hybrid-superaggregatet kan brukes til videre økning av følsomheten i testen ved tilsetting av et andre superaggregat som inneholder kolloidalt gull og en spesifikk bindingspartner for det nevnte andre protein.

Nitrocellulosemenibraner ble belagt med monoklonalt antistoff S4H9 (1 mg/ml), spesifikt for fibrindegraderingsproduktet D-dimer, og nitrocellulose-membranen ble plassert i en testanordning som beskrevet i eksempel 1. Løsninger som inneholdt D-dimer i konsentrasjonsområdet 0-8 mg/l, løst i 0,1 mol/l Tris-HCI-buffer (pH7,4) og inneholdende 50 mg/ml BSA ble tilsatt (50 jai) og trakk gjennom membranen. D-dimer molekylene fanget opp av det immobiliserte antistoff ble deretter visualisert ved tilsats av 50^l av en løsning som inneholdt et superaggregat på 4 nm kolloidalt gull, S4H9, og humant serum albumin (HSA). Dette superaggregat var laget som i eksempel 1 med et 1:1 (w/w) forhold mellom S4H9 og HSA. Membranen ble vasket og signalstyrken av gullkolloidet på membranen ble målt ved bruk av et reflektometer. Et andre superaggregert kompleks av kolloidalt gull og monoklonalt antistoff 2D2 ble laget som beskrevet i eksempel 4. Det andre superaggregatet ble tilsatt nitrocellulosen, og aggregatet ble immobilisert ved binding mellom HSA i det første superaggregatet og antistoff 2D2 i det andre aggregatet. Membranen ble vasket, og det resulterende signal ble målt med et reflektometer. Det kan vises at det oppnådde signal etter annet trinn var fire ganger sterkere enn signalet oppnådd etter første trinn.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for kvalitativ eller kvantitativ påvisning av en analytt i en prøve hvor et merket reagens omfattende en gull sol bundet til en substans, som er istand til å bindes spesifikt til analytten eller til en spesifikk bindingspartner av denne, immobiliseres i bundet form på en fast fase for å fremskaffe indikasjon på nærvær og/eller kvantitet av analytten i prøven, karakterisert vedat det merkede reagenset omfatter et superaggregert kompleks av nevnte substans eller en spesifikk bindingspartner av denne og en gull sol hvor minst 75 vekt% av gullpartiklene i gull solen har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 20 nanometer.

2. Fremgangsmåte, som krevet i krav 1, karakterisert vedat nevnte prøve kontaktes i et vandig prøvemedium med (i) en analyttanalog eller en spesifikk bindingspartner for nevnte analytt immobilisert på en fast fase og (ii) et merket reagens omfattende et superaggregert kompleks som definert i krav 1, hvor en mengde av nevnte merkede reagens immobiliseres på nevnte fase for direkte eller indirekte å fremskaffe en fargeforandring som indikerer nærvær av og/eller kvantitet av nevnte analytt i prøven.

3. Fremgangsmåte, som krevet i hvilken som helst av de forannevnte krav,karakterisert vedat minst 75 vekt% av gullpartiklene av gull solen har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 5 nanometer.

4. En fremgangsmåte, som krevet i hvilket som helst av de forannevnte krav,karakterisert vedat en konkurrerende test utføres.

5. Fremgangsmåte, som krevet i ett av kravene 1 til 3, karakterisert vedat en sandwich-test utføres.

6. Fremgangsmåte, som krevet i hvilket som helst av de forannevnte krav,karakterisert vedat den faste fasen er en inert membran som lett absorberer protein og som har porer som tillater passasje av væske.

7. Fremgangsmåte, som krevet i krav 1, karakterisert vedat det superaggregerte kompleks er et hybridkompleks av to eller flere proteiner inkludert et enzym som er i stand til å generere en karakteristisk reaksjon når det eksponeres for et substrat.

8. Fremgangsmåte, som krevet i krav 1, karakterisert vedat det superaggregerte kompleks er et hybridkompleks av to eller flere proteiner og en fargeamplifikasjon oppnås ved tilsetting av ett eller flere superaggregerte komplekser som er i stand til å binde det første hybridkompleks.

9. Utstyrsett for kvalitativ eller kvantitativ påvisning av en analytt i en prøve som inneholder (a) en fast fase hvorpå et merket reagens kan immobiliseres for å fremskaffe en indikasjon på nærvær av og/eller kvantitet av analytten i prøven og (b) et merket reagens, karakterisert vedat det merkete reagenset omfatter et superaggregert kompleks av en substans som er istand til spesifikt å bindes til den nevnte analytt eller til en spesifikk bindingspartner av denne og en gull sol hvorav minst 75 vekt% av gullpartiklene av gull solen har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 20 nanometer.

10. Utstyrsett, som krevet i krav 9, karakterisert vedat det superaggregerte kompleks videre inneholder et enzym som er i stand til å generere en karakteristisk reaksjon, utstyrsettet inneholder videre et substrat for det nevnte enzym.

11. Fremgangsmåte for å lage et superaggregert kompleks av et protein og en gull sol hvorav minst 75 vekt% av gullpartiklene har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 20 nanometer karakterisert vedat den omfatter: (i) blanding av protein og gull sol ved en pH hvor proteinmolekylet har minst to positivt ladede grupper; (ii) oppsamling av de makroskopiske aggregater som dannes; (iii) resuspensjon av de makroskopiske aggregatene i et pH-nøytralt medium, eventuelt med ultralydbehandling, for å danne en suspensjon av stabile superaggregerte komplekser.

12. Fremgangsmåte, som krevet i krav 11, karakterisert vedatpHi trinn (i) er fra 1 til 5.

13. Superaggregert kompleks av et protein og en gull sol,karakterisert vedat minst 75 vekt% av gullpartiklene har en gjennomsnittsdiameter på mindre enn 20 nanometer, og som kan oppnås med fremgangsmåten i krav 11 eller krav 12.