JP2002202310A - 物質の検出試薬及び検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 調製が容易で、製造コストが安く、調製ロッ
トの間でバラツキがなく、褪色し難くデータの保存性が
良好な物質の検出試薬及び検出方法を提供する。 【解決手段】 展開液を、試験領域を通して参照領域ま
で展開させる溶液展開法及びそれに用いる物質の検出試
薬において、参照領域が、アルカリ金属塩を除く金属化
合物を含有し、かつ、参照領域に集積され得る標識が、
参照領域に達する展開液に含まれることを特徴とする。
標識は、好ましくは有色微粒子であり、また、抗体又は
抗原と結合していることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、溶液展開法を用い
る物質の検出に関し、より詳しくは、展開終了の確認ま
たは半定量的な測定が可能な、物質の検出試薬（試験
片）及び検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】疾病の診断を行なうための手段として
は、被検試料、例えば血清、尿等の体液、培養液、抽出
液、糞便等に存在する原因物質（例えば抗原）、あるい
はこれに関連する物質（例えば抗体）を検出する方法が
一般的な方法であり、従来、抗原−抗体反応などの生物
学的特異反応を利用することにより被検試料中の抗体や
抗原などの被検物質の量が測定されている。このような
検出法の一つとして、イムノクロマト法などの溶液展開
法（クロマト法）がこれまでに提案されている（The Me
dical & Test Journal、第706号、第５頁、平成11年10
月11日）。

【０００３】溶液展開法は、試料を試験片の一部に塗布
し、通常は水のような展開液を用いて試料を試験片の材
料に浸透させ展開することにより、試料中に存在する被
検物質を検出する技術である。溶液展開法の一つである
イムノクロマト法では、試験領域において、被検物質と
これに対する物質との間で形成された免疫複合体を、標
識付試薬を用いて検出する。

【０００４】溶液展開法においては、被検物質を含む展
開液が試験片の試験領域に浸透し、展開が終了したか否
か、即ち試験の終了を確認するために展開終了確認領域
と呼ばれる特定部位を試験片に存在させることもでき
る。展開終了の信号は、試験結果の判定に際して該試験
系が満足すべき要件、即ち「ある特定の展開液量が、標
識付試薬とともに、ある時間をかけて試験領域を通過
し、更に展開終了確認領域まで到達した」旨の事実を試
験者に呈示する役割を担っており、試験者に対する試験
終了の合図である。その信号の確認は試験結果に信頼性
を与えるうえで重要である。例えば、試験の結果が陰性
（反応なし）であると確定等するために重要である。

【０００５】展開終了の信号を確認する方法として、抗
原−抗体反応する物質を展開終了確認領域に含ませる方
法、pHの変化に伴い発色又は変色する指示薬を展開終了
確認領域に含ませる方法等が知られている。

【０００６】また、溶液展開法は、その検出精度から、
通常は定性的な判定方法として利用されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記の
展開終了確認にかかわる従来技術において、抗原−抗体
反応による特異的反応を利用する場合は、抗原又は抗体
には生物学的材料を使用することとなり、調製に多くの
労力が必要となり、製造コストが高いという問題があ
る。更に、調製ロットの間で一定の活性を得ることが困
難であるという問題点もある。

【０００８】また、pHの変化に伴い発色又は変色する指
示薬を使用する場合には、試験片の保存時に乾燥等する
と褪色し易くデータの保存性が悪いという問題点があ
る。

【０００９】本発明の目的は、前記問題点のない、すな
わち、調製が容易で、製造コストが安く、調製ロットの
間でバラツキがなく、褪色し難くデータの保存性が良好
な新規な展開終了の信号の確認方法を利用した新規な物
質の検出試薬及び検出方法を提供することである。

【００１０】本発明の別の目的は、溶液展開法に基づい
た半定量的な測定を可能にする検出試薬および検出方法
を提供することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記従来
技術に鑑みて、前記問題点のない、展開終了の信号を確
認する方法を提供することを目的として、各種信号発生
法について試験した。

【００１２】その結果、本発明者らは、アルカリ金属塩
を除く金属化合物をイムノクロマト法において一般的に
常用されている展開担体であるニトロセルロース膜上に
塗布すると、金属化合物が比較的強固に固定されるとい
う事実を見出した。即ち、ニトロセルロース膜上に塗布
された金属化合物は、少なくともイムノクロマト法にお
いて一般的に常用されている緩衝液（水溶液）で展開し
ても、流出することなく塗布された位置に維持されるこ
とを見出した。

【００１３】更に、本発明者らは、検討を重ねた結果、
ニトロセルロース膜上の特定位置にアルカリ金属塩を除
く金属化合物を塗布すると、展開液の液流自体には何ら
影響がないが、展開液中に浮遊する微粒子に対し、その
流れを阻止する効果があることを見出した。つまり、金
コロイド、ラテックス等の有色微粒子により標識された
蛋白質（標識体）等を展開液とともに展開すると、金属
化合物を塗布した領域において標識体の流れが阻止さ
れ、標識体が集積される結果、拡散状態においては目視
できなかった標識体の存在が視認可能となり、展開終了
の信号を確認できることを見出した。

【００１４】前記知見に基づいて、本発明者らは、実用
化に向けて、鋭意検討を行なった結果、溶液展開法を用
いる物質の検出において、展開終了の確認のための参照
領域に、アルカリ金属塩を除く金属化合物を含有させ、
かつ、参照領域に達する展開液に、参照領域に集積され
得る標識が含まれるようにすることにより、前記の問題
点を解決し、調製が容易で、製造コストが安く、調製ロ
ットの間でバラツキがなく、褪色し難くデータの保存性
が良好な物質の検出試薬及び検出方法を提供できること
を見出した。

【００１５】また、参照領域に、アルカリ金属塩を除く
金属化合物を含有させることにより信号を発生させる場
合、該金属化合物の含有量の調整により信号を所望の強
度に容易に調整できることを見い出した。これらの知見
に基づき、本発明は完成された。

【００１６】本願の第一の発明は、展開液を、試験領域
を通して参照領域まで展開させる溶液展開法に用いる物
質の検出試薬において、参照領域に、アルカリ金属塩を
除く金属化合物を含有し、かつ、参照領域に集積され得
る標識が、参照領域に達する展開液に含まれることを特
徴とする検出試薬（以下、「本発明検出試薬」ともい
う）である。

【００１７】本発明検出試薬において、標識は有色微粒
子であることが好ましい。また、標識は抗体又は抗原と
結合していることが好ましい。さらに、検出試薬の展開
担体がニトロセルロース膜であることが好ましい。

【００１８】また、本発明検出試薬においては、所定量
の検出対象物質を含む展開液が展開されたときに試験領
域で生じる信号の強度と同等の強度の信号が参照領域で
生じるように、アルカリ金属塩を除く金属化合物が参照
領域に含有されていることが好ましい。この場合、本発
明検出試薬は、試験領域と参照領域とを設けた展開担体
を複数備え、各参照領域で生じる信号の強度は、それぞ
れ、異なる所定量の検出対象物質を含む展開液が展開さ
れたときに試験領域で生じる信号の強度と同等となるよ
うにされていることがさらに好ましい。

【００１９】本願の第二の発明は、展開液を、試験領域
を通して参照領域まで展開させることを含む物質の検出
方法において、参照領域が、アルカリ金属塩を除く金属
化合物を含有し、かつ、参照領域に集積され得る標識
が、参照領域に達する展開液に含まれることを特徴とす
る検出方法（以下、「本発明検出方法」ともいう）であ
る。

【００２０】本発明検出方法において、標識は有色微粒
子であることが好ましい。また、標識は抗体又は抗原と
結合していることが好ましい。さらに、検出試薬の展開
担体がニトロセルロース膜であることが好ましい。

【００２１】また、本発明検出方法は、所定量の検出対
象物質を含む展開液が展開されたときに試験領域で生じ
る信号の強度と同等の強度の信号が参照領域で生じるよ
うに、アルカリ金属塩を除く金属化合物が参照領域に含
有されており、試験領域で生じる信号の強度と参照領域
で生じる信号の強度とを比較することを含むことが好ま
しい。この場合、試験領域と参照領域とを設けた展開担
体を複数準備し、各参照領域で生じる信号の強度は、そ
れぞれ、異なる所定量の検出対象物質を含む展開液が展
開されたときに試験領域で生じる信号の強度と同等とな
るようにされていることがさらに好ましい。

【００２２】

【発明の実施の形態】次に、本発明について具体的に説
明する。なお、本明細書において百分率は、特に断りの
ない限り重量による表示である。

【００２３】本発明検出試薬は、展開液を、試験領域を
通して参照領域まで展開させる溶液展開法に用いる物質
の検出試薬において、参照領域に、アルカリ金属塩を除
く金属化合物を含有し、かつ、参照領域に集積され得る
標識が、参照領域に達する展開液に含まれることを特徴
とする。

【００２４】本発明検出試薬は溶液展開法に用いる物質
の検出試薬の一種である。本発明検出試薬は、参照領域
に、アルカリ金属塩を除く金属化合物を含有し、かつ、
参照領域に集積され得る標識が、参照領域に達する展開
液に含まれることの他は、従来の検出試薬と同様の構成
でよい。すなわち、本発明の検出試薬は、溶液展開法に
用いる物質の検出試薬の各実施形態で実施可能であり、
具体的には、検出試薬（試験片）の下端（上流域）に検
体を受け入れるコンジュゲートパット（例えばミリポア
社製等）を貼付すること、検出試薬（試験片）を合成樹
脂製等の支持体で支持すること、検出試薬（試験片）の
上端（下流域）に展開液を吸収する吸収パットを貼付す
ること等が可能である。

【００２５】溶液展開法とはクロマト法とも呼ばれる方
法であり、溶液展開法においては、展開担体上に試験領
域が設けられ、検出対象物質を含む展開液が展開担体を
通して展開される。試験領域では、検出対象物質と検出
対象物質に対する反応性物質との反応が生じ、この反応
を検出することにより検出対象物質の検出がなされる。
反応の検出は、典型的には、試験領域に固定化した反応
性物質１と、標識化された反応性物質２とを用い、検出
対象物質及び反応性物質２を含む展開液が展開担体上を
ペーパークロマト法と同様の現象によって展開され、展
開担体上の反応性物質１の固定化部位（試験領域）に展
開流が到達したときに反応性物質１と反応性物質２とが
検出対象物質をサンドイッチ状に挟んだ複合体を形成
し、このとき試験領域に生じた標識を検出することによ
り行われる。

【００２６】上記反応性物質とは、抗体と抗原との反
応、糖鎖とレクチンとの反応、リガンドとレセプターと
の反応などの生物学的に特異的な反応に基づいて検出対
象物質と反応する物質を意味する。

【００２７】展開液は、水や緩衝液等であり、また、検
出対象物質を含む検体をこれらに溶解したものであって
もよい。検出対象物質を含む検体が液体である場合に
は、検体自体または検体の水や緩衝液等による希釈液も
展開液となり得る。

【００２８】臨床検査の領域において最も代表的なクロ
マト法として、標識化される反応性物質が抗体又は抗原
であるイムノクロマト法が例示できる。イムノクロマト
法は、典型的には、展開担体上に固定化した抗体１と、
有色微粒子により標識化された抗体２を用いる方法であ
り、検出対象物質及び抗体２を含む展開液が展開担体上
を展開し、展開担体上の抗体１の固定化部位（試験領
域）に展開流が到達したときに抗体１と抗体２とが検出
対象物質をサンドイッチ状に挟んだ複合体が形成され、
このとき有色微粒子の色調が膜上に認められ、検出対象
物質の存在が肉眼で確認できるというものである。

【００２９】参照領域は、展開の終了を確認するため、
および／または、試験領域の信号を評価する際の基準と
なる信号すなわち参照信号を発生させるための領域であ
る。

【００３０】試験領域より下流域にある参照領域に含有
される金属化合物は、試験領域における抗原抗体反応等
に一切影響を及ぼすものではないことから、参照領域は
試験領域よりも展開方向の下流域に存在することが好ま
しい。また、本発明検出試薬における参照領域が、展開
の終了を確認するための領域である場合には、展開担体
上の試験領域よりも展開方向の下流域に存在する必要が
ある。

【００３１】本発明検出試薬におけるアルカリ金属塩を
除く金属化合物としては、酢酸カルシウム・１水和物、
酢酸ランタン・ｎ水和物、塩化ランタン・７水和物、酢
酸セリウム・１水和物、塩化セリウム（III）・７水和
物、酢酸プラセオジム・ｎ水和物、酢酸ネオジム・ｎ水
和物、酢酸エルビウム・４水和物、酢酸マンガン・４水
和物、硫酸鉄（II）・７水和物、硫酸鉄（II）アンモニ
ウム・６水和物、酢酸コバルト（II）・４水和物、酢酸
ニッケル（II）・４水和物、酢酸銅（II）・１水和物、
塩化銅（II）・２水和物、硫酸銅（II）・５水和物、酢
酸亜鉛（II）・２水和物、酢酸カドミウム（II）・２水
和物、酢酸アルミニウム（水溶性）、硫酸アルミニウム
・カリウム・１２水和物、酢酸鉛（II）・３水和物等の
各種金属化合物を例示でき、これらの市販品を使用でき
る。尚、アルカリ金属塩を除くのは、後記する試験例か
らも明らかなとおり、臭化ナトリウム、塩化カリウム等
のアルカリ金属の塩類は展開担体上に固定化することが
困難であり、塗布しても展開液によって流出するため、
有色微粒子等の標識の流れを阻止できないためである。
また、過マンガン酸カリウム等の当初より強く着色して
いる金属化合物、及び無水硫酸銅、無水塩化コバルト等
の空気中の水分に触れるだけで容易に発色する金属化合
物は、展開終了の信号を誤認、妨害等する可能性がある
ことから、使用を避けた方が好ましい。従って、本発明
に使用される金属化合物より、過マンガン酸カリウム、
無水硫酸銅、無水塩化コバルトを除く方が好ましい。更
に、後記する試験例からも明らかなとおり、有色微粒子
として粒径が１５ｎｍと比較的小さな金コロイドを使用
した場合にも、着色度に優れていることから、酢酸ラン
タン・ｎ水和物、塩化ランタン・７水和物、酢酸セリウ
ム・１水和物、塩化セリウム（III）・７水和物、酢酸
プラセオジム・ｎ水和物、酢酸ネオジム・ｎ水和物、及
び酢酸エルビウム・４水和物に代表されるランタニド元
素からなる金属化合物、並びに硫酸鉄（II）・７水和物
及び硫酸鉄（II）アンモニウム・６水和物に代表される
鉄からなる金属化合物が特に好ましい。

【００３２】展開担体としては、その上に塗布された上
記金属化合物が、展開液で展開しても塗布された位置に
維持されるものである限りにおいて、クロマト法に使用
可能な多孔質物質の膜を使用することができる。膜とし
ては、ニトロセルロース膜が好ましく、好ましい態様で
あるイムノクロマト法において一般的に常用されている
孔径３〜12μｍのニトロセルロース膜を例示することが
できる。

【００３３】上記金属化合物を参照領域に含有させる方
法としては、上記金属化合物の水溶液を展開担体の参照
領域に塗布する方法が挙げられる。以下、ニトロセルロ
ース膜を展開担体として用いる、イムノクロマト法用の
検出試薬の場合を例にとって説明する。

【００３４】一般的に、イムノクロマト法では、ニトロ
セルロース膜に必要なタンパクを塗布した後、いわゆる
ブロッキング、及びその後の洗浄操作を行なうが、金属
化合物の塗布はこれらの操作の後に行なう。金属化合物
は、通常水溶性塩の水溶液として塗布するが、この場合
溶液の表面張力を低下させ、静電的反発を減らす目的
で、少量のアルコール類を添加して行なってもよい。通
常、洗浄操作は、ドデシル硫酸ナトリウム等の湿潤剤を
含有する、pH 7.5程度の弱塩基性の緩衝液を用いて行わ
れる場合が多いが、本発明においてもこれを特に変える
必要はなく、むしろ塗布前に弱塩基性の緩衝液による洗
浄を行なっておくのが望ましい。塗布後は、35℃にて一
晩乾燥させた後、室温で湿度30〜50％条件下で保存す
る。

【００３５】ニトロセルロース膜上への金属化合物の塗
布量は、通常には、0.2〜400μg/cm ²、好ましくは1.0〜
40μg/cm²である。

【００３６】本発明検出試薬においては、塗布時の金属
化合物濃度、塗布液の吐出量、塗布機の掃引速度等の調
節によって塗布量を調整することにより、参照領域に生
じる信号の強度を変化させることができる。例えば、所
定量の検出対象物質を含む展開液が展開されたときに試
験領域で生じる信号の強度と同等の強度の信号が参照領
域で生じるように、塗布量を調節することができる。

【００３７】アルカリ金属を除く金属元素の多くは、水
溶液中塩基性条件下で難水溶性の水酸化物、あるいは一
部が水酸基に置き換わった塩基性塩を形成して沈殿する
ことが知られている。また、空気中の炭酸ガスを吸収し
て難水溶性の異なる化学種に変化するものも知られてい
る。従って、展開担体上に保持される最終的な化学種
は、塗布時のままであるとは限らず、むしろ水に不溶性
の塩に変化している可能性が高い。これは塗布した金属
化合物によって当然異なるし、これを特定したとしても
最終的な化学種は必ずしも明確ではない。しかしなが
ら、上記金属化合物を塗布することによって本発明の効
果が得られることから、塗布する金属化合物により表す
ことは適切と考えられる。

【００３８】本発明検出試薬に使用される標識として
は、上記金属化合物を含む参照領域に集積され得る標識
であれば、特に限定されない。参照領域に集積されるか
否かは、後述の試験例１及び２のようにして決定するこ
とができる。

【００３９】好ましい標識は、有色微粒子である。有色
微粒子としては、金コロイド、ラテックス等が例示で
き、比較的粒径の大きなものが好ましい。粒径は、電顕
法による粒径で、通常には、３〜５００ｎｍ、好ましく
は１０〜３００ｎｍである。金コロイドについては、粒
径が少なくとも１５ｎｍのものが着色度合が優れるた
め、好ましい。

【００４０】本発明検出試薬の参照領域における展開終
了の信号または参照信号の発生は、展開液中の標識が、
展開担体上に金属化合物を塗布等により含有させておく
ことによって、塞き止められ、流れが阻止されるなどし
て標識が集積されることにより検出可能（好ましくは視
認可能）な信号が生じるという原理に基づいている。従
って、集積の程度は、検出可能な展開終了の信号または
参照信号を発生させるのに十分なものであればよい。ま
た、標識は、参照領域に達する展開液に含まれていれば
よく、本発明検出試薬に適用される最初の展開液に含ま
れている必要はない。また、標識は、試験領域において
捕捉されることなく通過した、標識された反応性物質に
おける標識であってもよいし、これとは別の標識であっ
てもよい。後者の場合には、例えば、最初の展開液に、
反応性物質の標識に使用された標識と異なる標識を含ま
せてもよいし、試験領域と参照領域との間に、展開液に
より移動可能なように標識を展開担体上に含ませておい
てもよい。

【００４１】本発明検出試薬においては、所定量の検出
対象物質を含む展開液が展開されたときに試験領域で生
じる信号の強度と同等の強度の信号が参照領域で生じる
ように、アルカリ金属塩を除く金属化合物が参照領域に
含有されていることが好ましい。この場合、本発明検出
試薬は、試験領域と参照領域と設けた展開担体を複数備
え、各参照領域で生じる信号の強度は、それぞれ、異な
る所定量の検出対象物質を含む展開液が展開されたとき
に試験領域で生じる信号の強度と同等となるようにされ
ていることがさらに好ましい。

【００４２】溶液展開法に用いる試薬の試験領域におい
て発生する信号について、これを単独に目視によって信
号強度を判定することは一般に困難である。一方、比較
用にもう一つ別に信号を発生させ、両者の信号の強弱を
比較判定することは、比較的容易である。本発明によれ
ば、上述のように参照領域に生じる信号を所望の強度に
調整可能であることを利用して、試験領域での信号強度
を半定量的に判定し得る。すなわち、本発明検出試薬に
おいて、所定量の検出対象物質を含む展開液が展開され
たときに試験領域で生じる信号の強度と同等の強度の信
号が参照領域で生じるようにした場合、試験領域と参照
領域とで生じる信号の強度の比較により、半定量的な測
定を行うことができる。

【００４３】以下、具体例を挙げて説明する。検出試薬
の試験領域に、検出対象物質を認識する抗体を、ある一
定量塗布する。この検出試薬に対し、検出対象物質を含
む検体を、微粒子で標識化した別の抗体とともに展開す
れば、検出対象物質は試験領域において捕捉されて信号
を発生する。この時の信号強度は、展開液中の検出対象
物質の濃度に依存的に変動するが、その強度から検出対
象物質濃度を目視により判定することは一般に困難であ
る。そこで、展開液中の検出対象物質の濃度が、例えば
５００ｎｇ／ｍｌであるときの試験領域で発生する信号
（以下、試験信号）の強度に対し、参照領域で発生する
信号（以下、参照信号）の強度がそれと同等になるよう
に、参照領域に塗布する金属化合物量を調整する。する
とこの検出試薬に対して、展開液中の検出対象物質の濃
度が、ちょうど５００ｎｇ／ｍｌである検体を展開した
とき、試験領域と参照領域で発生する信号の目視強度が
等しくなる。これに対し、もし展開液中の検出対象物質
の濃度が５００ｎｇ／ｍｌ未満であれば、試験信号は先
のものより弱くなり、逆に参照信号は強くなる。一方、
展開液中の検出対象物質の濃度が５００ｎｇ／ｍｌ超過
であれば、試験信号は先のものより強くなり、逆に参照
信号は弱くなる。こうして、ストリップ上の試験信号と
参照信号の強弱を比較することにより、展開液中の検出
対象物質の濃度を、５００ｎｇ／ｍｌ程度であるのか、
それを超過するのか、それ未満であるのか、を目視判定
することが可能となる。

【００４４】判定精度を上げるためには試験領域と参照
領域とを設けた展開担体（ストリップ）の数を増やすこ
とが好ましい。即ち、上の例で、試験領域に塗布する抗
体量を一定にしておき、参照信号強度を、試験信号 ５
００ｎｇ／ｍｌ相当のものに加えて、例えば ２００ｎ
ｇ／ｍｌ相当、及び １５００ｎｇ／ｍｌ相当のものを
調製する。つまり、試験領域に塗布する抗体量は一定で
あるが、参照領域に塗布する金属化合物量の異なる３種
類のストリップを用意する。即ち、参照信号の目視強度
と試験信号の目視強度とが、検出対象物質濃度２００ｎ
ｇ／ｍｌの検体液を展開したとき、ちょうど等しくなる
もの、検出対象物質濃度５００ｎｇ／ｍｌの検体液を展
開したとき、ちょうど等しくなるもの、そして検出対象
物質濃度１５００ｎｇ／ｍｌの検体液を展開したとき、
ちょうど等しくなるもの、の3種類である。以下、それ
ぞれを、ストリップＡ、ストリップＢ、ストリップＣと
呼ぶ。そして、検出対象物質濃度が未知の検体につい
て、この３種類のストリップで同時に展開する。

【００４５】ストリップＡにおいて試験領域と参照領域
の発色信号強度を比べて、もし試験信号が参照信号より
弱ければ、この検体中の検出対象物質質濃度は約２００
ｎｇ／ｍｌ未満であると判定することができる。もし試
験信号が参照信号より強ければ、ストリップＢにおける
試験信号と参照信号の強度を比べる。もし試験信号が参
照信号より弱ければ、この検体中の検出対象物質質濃度
は約２００ｎｇ／ｍｌ超約５００ｎｇ／ｍｌ未満である
と判定することができる。以下同様な手順によって、検
体中の検出対象物質質の濃度を 約２００ｎｇ／ｍｌ未
満、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ超約５０
０ｎｇ／ｍｌ未満、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ
／ｍｌ〜約１５００ｎｇ／ｍｌ未満、約１５００ｎｇ／
ｍｌそして１５００ｎｇ／ｍｌ超、というようにランク
に分けて半定量することができる。

【００４６】本発明における参照領域で発生する信号
は、目視比較が容易なことから、試験領域と質的に同等
のものであることが好ましい。例えば、試験領域におい
て捕捉されることなく通過した、標識された反応性物質
における標識による信号である場合には、試験領域で発
生する信号と同じく、同一の微粒子標識体の集積によっ
て生じるものであり、両者の信号は質的に同等になる。

【００４７】この試験領域における信号と、参照領域に
おける信号の強度比較に基づき、検出対象物質を半定量
する方法は、参照領域に抗抗体を塗布し、試験領域で捕
捉されることなく通過した標識抗体を捕捉することによ
って信号を発生させる免疫化学反応によるものでも原理
的には可能である。しかしながらこの場合、製造コスト
が高いという問題に加えて、生物学的材料故に調製ロッ
ト間で一定の活性を得るのが一般的に難しく、発生信号
強度の再現性に難点がある。更に、参照領域において、
試験信号と同等の強度を発生させるような適度な抗抗体
の塗布調整には多大の労力を要し、実用化には困難が伴
なう。これに対し、本発明によれば、金属化合物の塗布
量に対して発生する信号強度は安定した再現性を示すの
で、信号を所望の強度に調整することは容易である。

【００４８】複数のストリップを備える本発明検出試薬
の態様としては、複数のストリップが、放射状に配置さ
れており、中心に設置された試料注入孔から試料（展開
液）を注入することにより、一度の注入操作で、個々の
ストリップについて同時に展開可能な構造を有するもの
が挙げられる。この態様の本発明検出試薬によれば、半
定量測定を行う際に、一つのストリップを備える検出試
薬を複数用いた場合、ストリップの数だけ繰り返し行わ
なければならない試料の負荷・展開操作を、単回負荷・
同時展開操作とすることが可能になる。これにより、測
定の操作性が改善されると共に、繰り返し操作から発生
し得る測定誤差を最小限に抑えることができる。

【００４９】上記のような本発明検出試薬は、基板上に
放射状にストリップを配置し、ストリップを固定するカ
バーをかぶせ、中心に試料注入孔構成部材により試料注
入孔を設けることにより製造できる。

【００５０】基板は、複数のストリップがその数に応じ
て中心から放射状（好ましくは放射状かつ対称的）に配
置できる構造を有する。図１に基板の一例を示す。図１
に示す基板１では、三つのストリップが放射状かつ三回
対称に配置できるように、凹部２が設けられている。基
板の材料としては、通常には耐水性のあるものが使用さ
れ、例えば、合成樹脂、耐水性を有する（または耐水処
理を施した）紙等が挙げられる。使用後の試薬の処理の
点からは、紙製であることが好ましい。

【００５１】凹部２はストリップを配置するためのもの
であり、中心の円形部とそれから放射状に延びる長方形
部とからなり、凹部２の深さは通常２ｍｍ程度である。

【００５２】基板の形状や凹部の配置は、特に限定され
ず、ストリップが二つの場合には、端部が円形とされて
いてもよい長方形や長楕円形が挙げられる。三つ以上の
場合には、円形の他、数に応じて正三角形、正方形、正
五角形、その他の形状も可能である（図２）。

【００５３】基板の大きさは、使用するストリップの大
きさに応じて選択されるが、円形の場合、その半径は通
常５〜１０ｃｍ程度である。

【００５４】図３に示されるように、ストリップ３は、
その一端（展開方向の上流側）は基板中心にある凹部２
の円形部に一部はみ出すように長方形部に配置される。
中心の円形部は、試料（展開液）を一端保持するパッド
を置くためのスペースである。円形部の大きさは、展開
に必要な液量の保持に必要なパッドの体積により変わる
が、通常は直径１〜２．５ｃｍ程度である。長方形部の
寸法は、使用するストリップ３の大きさに応じて選択さ
れるが、幅は通常5.5〜8.5ｍｍ程度である。

【００５５】カバーは、上記基板上にストリップを配置
した後、これを固定するために基板上に貼り付けられる
ものであり、板状でもフィルム状でもよい。カバーの材
料は、基板と同様でよい。

【００５６】図４に示すように、カバー４において、基
板中心の凹部円形部に相当する部分は、同形状にくりぬ
かれている。ストリップを覆う部分については、試験領
域と参照領域で発生する信号が観察できるように、透明
とされるか、または、くりぬかれて、観察窓とされる。

【００５７】観察窓の位置、形状、大きさ等は、試験信
号と参照信号の両方が観察でき、対比が容易にできる限
り、特に限定されない。但し、ストリップの上流側端部
および展開液の展開を効率的に進行させるために最下流
（最円周寄り）に装着される吸収パッド部分は、試料
（血清、血漿、血液成分、尿等、または、それらの希釈
液）が比較的多量に保持される部分であり、ハザード防
止の観点から、これらの部分は不用意に触れることのな
いように完全に被覆されていることが好ましい。観察窓
の配置例を図４のＡ〜Ｃに示す。観察窓は、図４のＣに
示すように、試験領域用６と参照領域用５の二つに分離
していてもよい。

【００５８】カバー上には、各ストリップについての濃
度を表す表示（例えば数字）を付すことが好ましい。

【００５９】試料注入孔は試料注入孔構成部材により構
成される。試料注入孔構成部材７は、例えば、図５のＡ
およびＢに示すような、中心に窪んだ穴のある形状のも
のである。材料は合成樹脂等が挙げられる。図５のＣに
示すように、中心部の凹部円形部に、ストリップ３の端
の上に載るようにパッド９を置き、このパッド９を圧着
するように、カバー（図示しない）の中心のくりぬかれ
た部分に、試料注入孔構成部材７をはめ込むことにより
試料注入孔８が設けられる。従って、試料注入孔８から
試料が注入されると、この孔の直下にはパッド９が置か
れており、パッド９は更に、放射状に配置された各スト
リップ３の上流側端部と接触しているので、注入された
試料は、一端このパッド９に吸収保持された後、徐々に
各ストリップ３の下流へ向かって（中心から放射状に円
周方向へ）展開する。

【００６０】試料注入孔構成部材はカバーと一体になっ
ていてもよい。この場合には、基板の円形部に、ストリ
ップの端の上に載るようにパッドを置き、パッドを圧着
するようにカバーが基板に貼り付けられる。

【００６１】なお、上記の例では、ストリップを配置す
るための凹部は基板に設けられているが、凹部は、基板
とカバーが貼り付けられたときにストリップを基板とカ
バーとの間に配置できる限り、カバーに設けてもよい
し、基板とカバーの両方に設けてもよい。

【００６２】イムノクロマト法の試験領域については、
捕捉された免疫複合体の確認方法として、先に述べた有
色微粒子を用いる代わりに、酵素標識を行い展開終了後
にしかるべき発色処理を行って確認するものや、磁性微
粒子で標識を行ない、該試験領域の磁気量を機械的に測
定する方法等も提案されている。本発明は、これらの試
験領域確認方法を用いた系における展開終了の確認法と
しても適用可能である。即ち、該試験系の試験領域にお
ける抗原−抗体反応には全く関与しない蛋白質成分等
を、有色微粒子である金属コロイド、ラテックス等で標
識しておき、これをあらかじめ展開液中に共存させ、該
試験領域のさらに下流において、金属化合物を塗布した
参照領域を設定しておくことにより、標識体を捕捉集積
させ、それにより展開終了の信号を発生させることが可
能である。

【００６３】本発明検出方法は、展開液を、試験領域を
通して参照領域まで展開させることを含む物質の検出方
法において、参照領域が、アルカリ金属塩を除く金属化
合物を含有し、かつ、参照領域に集積され得る標識が、
参照領域に達する展開液に含まれることを特徴とする物
質の検出方法である。

【００６４】本発明検出方法は溶液展開法の一種であ
る。本発明検出方法は、参照領域が、アルカリ金属塩を
除く金属化合物を含有し、かつ、参照領域に集積され得
る標識が、参照領域に達する展開液に含まれることの他
は、従来の検出方法と同様の構成でよい。

【００６５】本発明検出方法における、展開液、試験領
域、参照領域、アルカリ金属塩、参照領域に集積され得
る標識、参照領域に達する展開液は、本発明検出試薬に
おいて説明した通りである。従って、本発明検出方法
は、前記の本発明検出試薬を用いて実施することができ
る。

【００６６】また、本発明検出方法は、所定量の検出対
象物質を含む展開液が展開されたときに試験領域で生じ
る信号の強度と同等の強度の信号が参照領域で生じるよ
うに、アルカリ金属塩を除く金属化合物が参照領域に含
有されており、試験領域で生じる信号の強度と参照領域
で生じる信号の強度とを比較することを含むことが好ま
しい。この場合、試験領域と参照領域とを設けた展開担
体を複数準備し、各参照領域で生じる信号の強度は、そ
れぞれ、異なる所定量の検出対象物質を含む展開液が展
開されたときに試験領域で生じる信号の強度と同等とな
るようにされていることがさらに好ましい。試験領域と
参照領域とを設けた展開担体を複数準備する場合、試験
領域と参照領域とを設けた展開担体を複数備えた本発明
検出試薬を準備してもよいし、複数個の本発明検出試薬
を準備してもよい。

【００６７】

【実施例】次に試験例及び実施例を記載して本発明を更
に詳述するが、本発明は以下の実施例により限定される
ものではない。

【００６８】

【試験例１】この試験は、各種金属化合物による展開終
了の信号の発生の有無、並びに有色微粒子の種類及びそ
の粒径の影響を調べるために行った。

【００６９】（１）金属化合物試料 試料１：酢酸カルシウム・１水和物（関東化学社製） 試料２：酢酸ランタン・ｎ水和物（和光純薬社製） 試料３：塩化ランタン・７水和物（関東化学社製） 試料４：酢酸セリウム・１水和物（和光純薬社製） 試料５：塩化セリウム（III）・７水和物（関東化学社
製） 試料６：酢酸プラセオジム・ｎ水和物（和光純薬社製） 試料７：酢酸ネオジム・ｎ水和物（和光純薬社製） 試料８：酢酸エルビウム・４水和物（和光純薬社製） 試料９：酢酸マンガン・４水和物（関東化学社製） 試料10：硫酸鉄（II）・７水和物（和光純薬社製） 試料11：硫酸鉄（II）アンモニウム・６水和物（和光純
薬社製） 試料12：酢酸コバルト（II）・４水和物（関東化学社
製） 試料13：酢酸ニッケル（II）・４水和物（関東化学社
製） 試料14：酢酸銅（II）・１水和物（関東化学社製） 試料15：塩化銅（II）・２水和物（関東化学社製） 試料16：硫酸銅（II）・５水和物（関東化学社製） 試料17：酢酸亜鉛（II）・２水和物（関東化学社製） 試料18：酢酸カドミウム（II）・２水和物（関東化学社
製） 試料19：酢酸アルミニウム（水溶性）（ナカライテスク
社製） 試料20：硫酸アルミニウム・カリウム・１２水和物（ナ
カライテスク社製） 試料21：酢酸鉛（II）・３水和物（関東化学社製） 試料22：臭化ナトリウム（和光純薬社製） 試料23：塩化カリウム（和光純薬社製）

【００７０】（２）検出試薬試料の調製 （ａ）金属化合物のニトロセルロース膜への塗布 ニトロセルロース膜（ミリポア社製：SRHF、200mm×200
mm）を0.01%ドデシル硫酸ナトリウム含有5mMリン酸緩衝
液（pH７．５）中で15分間振盪し、35℃にて一晩乾燥し
た。このニトロセルロース膜を、ヨコ200mm×タテ30mm
に裁断し、長辺の一端（以下、これを上端とする）から
8mmの位置に、塗布機（IVEK社製）を用いて前記金属化
合物試料の水溶液をそれぞれ塗布した。各金属化合物試
料は、各々20mgを小容器に秤量し、蒸留水1000μｌに溶
解させ、イソプロピルアルコール50μｌを添加して混合
した後、0.45μｍのフィルターを通して塗布用水溶液と
した。塗布機は、掃引速度：2.0cm／sec、塗布液の吐出
量：2.0μｌ／sec、すなわちニトロセルロース膜上の塗
布量：1μｌ／cm（金属化合物換算で約20μg／cm）、塗
布幅：約0.8mmで、前記塗布液を塗布した。

【００７１】（ｂ）標識抗体の調製 後記する参考例１及び３の方法にほぼ従って、抗ヒトア
ルブミン−モノクローナル抗体を、次に示す各種粒径の
金コロイド又はラテックスで感作標識した。 金コロイド：粒径8.5nm、15nm、25nm、及び40nm ラテックス：粒径190nm、及び300nm

【００７２】（ｃ）展開液の調製 次の、及びの各液を体積比75：20：5の割合で混
合したものを展開液として用いた。 10mMトリス−150mM NaCl(pH7.6)（以下、10mM TBS
（pH7.6）と略記する。） 10% Tween 20−10mM TBS（pH7.6） 各標識化抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体液

【００７３】（３） 試験方法 前記各金属化合物試料を塗布したニトロセルロース膜を
塗布方向と垂直方向に5mm幅に裁断して試験片とした。
マイクロプレートに前記展開液40μｌをとり、前記試験
片の下端（塗布位置から遠い方の端）を浸け、展開させ
た。展開液が試験片上端に達した時点をもって展開終了
とし、金属化合物試料を塗布した位置における標識抗体
の集積による着色状態を判定した。尚、各試料の着色状
態は、次の判定方法により、同一金属化合物試料毎に５
試験片を用いて判定した。

【００７４】（ａ）着色状態の判定方法 各試験片の展開終了確認のための参照領域（金属化合物
試料を塗布した位置）の着色状態を次のとおり判定し
た。

【００７５】肉眼観察により、着色なし（０点）、着色
ややあり（１点）、着色あり（２点）、着色強くあり
（３点）の4段階に評価し、評価点の平均値から、０．
５点未満をなし、０．５点以上１．５点未満をややあ
り、１．５点以上２．５点未満をあり、及び２．５点以
上３．０点未満を強くありと判定した。

【００７６】（４）試験結果 この試験の結果を表１に示す。表１から明らかなとお
り、金属化合物が臭化ナトリウム、塩化カリウム等のア
ルカリ金属塩の場合には、着色がなく展開終了の信号の
発生が認められないことが判明した。また、有色微粒子
として金コロイドに比較して粒径の大きなラテックスが
着色度合に優れることが判明した。更に、金コロイドに
ついては、粒径が少なくとも１５ｎｍの金コロイドが着
色度合に優れることが判明した。また、金属化合物とし
て、酢酸ランタン・ｎ水和物、塩化ランタン・７水和
物、酢酸セリウム・１水和物、塩化セリウム（III）・
７水和物、酢酸プラセオジム・ｎ水和物、酢酸ネオジム
・ｎ水和物、酢酸エルビウム・４水和物、硫酸鉄（II）
・７水和物、又は硫酸鉄（II）アンモニウム・６水和物
を使用した場合に、有色微粒子として粒径が１５ｎｍと
比較的小さな金コロイドを使用した場合にも、着色度が
優れていることから、これらの金属化合物が好ましいこ
とが判明した。

【００７７】尚、前記各検出試薬試料の調製において、
ニトロセルロース膜の種類、標識体の種類、又は展開液
の種類を適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得
られた。

【００７８】また、有色微粒子としてラテックスを使用
し、アルカリ金属塩、過マンガン酸カリウム、無水硫酸
銅、及び無水塩化コバルトを除く金属化合物について、
その種類を適宜変更して試験したが、着色ありというほ
ぼ同様の結果が得られた。

【００７９】

【表１】

【００８０】

【試験例２】この試験は、ニトロセルロース膜上への金
属化合物の塗布量と着色度合との関係を調べるために行
なった。

【００８１】（１）金属化合物試料 酢酸ランタン・ｎ水和物（和光純薬社製）

【００８２】（２）検出試薬試料の調製 （ａ）金属化合物のニトロセルロース膜への塗布 ニトロセルロース膜上への金属化合物試料の塗布量を2
0、5、1.25、0.63、及び0.16μg／cmに変更したことを
除き、前記試験例１に記載の塗布方法により塗布した。 （ｂ）標識抗体の調製 粒径190nmのラテックスを使用したことを除き、前記試
験例１に記載の調製方法で調製した。 （ｃ）展開液の調製 前記試験例１に記載の調製方法で調製した。

【００８３】（３） 試験方法 各試料の着色状態を、前記試験例１に記載の判定方法に
より各試料毎に５試験片を用いて判定した。

【００８４】（４）試験結果 この試験の結果を表２に示す。表２から明らかなとお
り、ニトロセルロース膜上への金属化合物の塗布量とし
ては、少なくとも１．２５μｇ／ｃｍである場合に、着
色度合が優れることが判明した。

【００８５】尚、前記各検出試薬試料の調製において、
ニトロセルロース膜の種類、標識体の種類、又は展開液
の種類を適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得
られた。

【００８６】また、アルカリ金属塩、過マンガン酸カリ
ウム、無水硫酸銅、及び無水塩化コバルトを除く金属化
合物について、その種類を適宜変更して試験したが、ほ
ぼ同様の結果が得られた。

【００８７】

【表２】

【００８８】

【参考例１】（ラテックス標識化抗ヒトアルブミンモノ
クローナル抗体の調製）抗ヒトアルブミンモノクローナ
ル抗体（日本バイオテスト社製、10mg／ml）34.5μｌ
に、粒径（電顕法により測定した粒子の直径）が190nm
のポリスチレン製赤色ラテックス粒子（ＪＳＲ社製、10
w/v%）0.1ml、及び、緩衝液0.9mlを添加し、室温で一昼
夜攪拌し、次いで4℃で遠心分離し（15000回転、20分
間）、沈殿を0.5%牛血清アルブミン（シグマ社製）及び
0.1%アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製）を含む緩
衝液に懸濁し、超音波処理により分散させ、ヒト血清ア
ルブミンと特異的に結合するモノクローナル固定ラテッ
クス粒子懸濁液を得た。

【００８９】

【参考例２】（ウサギ抗ヒトラクトフェリン−ポリクロ
ーナル抗体の調製）免疫原として、ヒトラクトフェリン
（Sigma社製；Ｌ−０５２０）の生理食塩水溶液(4mg/m
l)と等量のフロイント完全アジュバント（Difco社製）
を混合し、油中水型に乳化したものを、日本白色種ウサ
ギ（体重３ｋｇ；雄）に対して皮内注射（ヒトラクトフ
ェリンとして2mg）することにより免疫を行った。以
後、抗体価をモニターしつつ、4週間の間隔をおきなが
ら追加免役（一回当たりヒトラクトフェリンとして0.5m
g）を行った。抗体価の上昇が確認できた時点で追加免
役を中止し、採血を行い、抗血清を得た。この抗血清に
対して50％飽和硫安塩析を行い、IgG粗画分を得た。得
られた画分を10mMリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、予
め同一の緩衝液で平衡化したセファデックスG−25カラ
ムを使用してゲル濾過し、免役グロブリン画分を得て、
これを凍結乾燥し、保存した。

【００９０】

【参考例３】（金コロイド標識化抗ヒトラクトフェリン
モノクローナル抗体の調製）マウス抗ヒトラクトフェリ
ンモノクローナル抗体（Hytest社製：4L2、clone：2B
8、リン酸緩衝液 pH 7.4）1.0mlを2mM Na₂B₄O₇緩衝液
（pH 9.0）に対して4℃にて一晩透析した。

【００９１】粒径が15nmの金コロイド液（British Bioc
ell社製：EMGC15）20mlに0.2M炭酸カリウム水溶液を加
えてpH 9.0に調整し、上記抗体液264μlを加えて10分間
静置した。次いで10% BSA 2mlを添加して10分間静置し
た後、遠心分離し（35000回転、1時間）、上清を除去し
た。沈渣に1% BSAを含有する20mM TBS（20mM Tris−150
mM NaCl、pH 8.0）20mlを加えて、再び遠心分離し（350
00回転、1時間）、上清を除去した。沈殿した金コロイ
ド標識化抗体を、1% BSA及び0.05%アジ化ナトリウム
（ナカライテスク社製）を含有する20mM TBSにて、全量
が1mlとなるように懸濁し、4℃にて保存した。

【００９２】

【実施例１】［検出試薬（試験片）の調製］ （１） ニトロセルロース膜上試験領域への抗ヒトアル
ブミン−ポリクローナル抗体の塗布 抗ヒトアルブミン−ポリクローナル抗体（Bethyl社製；
10mMリン酸緩衝液−150mM NaCl）を、10mMリン酸緩衝液
（pH 7.4）にて25倍希釈し、イソプロピルアルコールの
最終的な濃度が5%v/vとなる量のイソプロピルアルコー
ルを添加して混合した後、0.45μmのフィルターを通し
て塗布用液とした。

【００９３】ニトロセルロース膜（ミリポア社製：SRH
F）を、ヨコ200mm×タテ30mmに裁断し、長辺の一端（以
下、これを下端とする）から12mmの位置に、塗布機（IV
EK社製）を用いて掃引速度：2.0cm/sec、塗布液の吐出
量：2.0μｌ／sec、即ちニトロセルロース膜上の塗布
量：1μｌ／cm、塗布幅：約0.8mmで、前記塗布液を塗布
した。

【００９４】塗布後35℃にて2時間乾燥し、0.5%ポリビ
ニルピロリドンK-15水溶液中で15分間振盪させてブロッ
キングを行ない、次いで、0.01%のドデシル硫酸ナトリ
ウムを含有する5mMリン酸緩衝液（pH 7.5）中で15分間
振盪させて洗浄した後、35℃にて一晩乾燥した。

【００９５】（２） ニトロセルロース膜上参照領域へ
の酢酸ランタン・ｎ水和物の塗布 酢酸ランタン・ｎ水和物（和光純薬工業社製）を蒸留水
に溶解し、0.2mg／ml濃度の水溶液を調製し、イソプロ
ピルアルコールの最終的な濃度が5%v/vとなる量のイソ
プロピルアルコールを添加して混合した後、0.45μmの
フィルターを通して塗布用液とした。

【００９６】前記第（１）項で調製したニトロセルロー
ス膜に対し、上端から8mmの位置に、前記酢酸ランタン
塗布液を、塗布機（IVEK社製）を用いて掃引速度： 2.0
cm/sec、塗布液の吐出量：2.0μｌ／sec、即ちニトロセ
ルロース膜上の酢酸ランタンの塗布量：1μｌ／cm（酢
酸ランタン・ｎ水和物換算で約0.2μｇ／cm）、塗布
幅：約0.8mmで塗布した。

【００９７】塗布後、35℃にて一晩乾燥した後、室温に
て湿度30〜50%の条件下に保存した。次いで、塗布方向
と垂直方向に5mm幅に裁断して、イムノクロマト用検出
試薬（試験片）を得た。

【００９８】［検出方法］ （１）検出対象物質としてのヒトアルブミン溶液 ヒトアルブミン（シグマ社製）5.0mgを秤量し、10mMト
リス−150mM NaCl(pH 7.4)（以下、10mM TBS（pH 7.4）
と略記する。）に溶解させて全量を1.0mlとした。これ
を原液として、10mM TBS（pH 7.4）にて順次希釈し、次
の濃度の溶液を調製した。 （a）20μｇ／ml、（b）5.0μｇ／ml、（c）1.2μｇ／m
l、（d）0.3μｇ／ml、（e）0.08μｇ／ml、及び（f）
０μｇ／ml

【００９９】（２）標識抗体 標識化抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体として、
前記参考例１に記載の方法に従って調製したラテックス
標識化抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体を使用し
た。

【０１００】（３）展開液 下記、、及びの各液を体積比65：20：10：5の
割合で混合したものを展開液として用いた。 10mM TBS（pH7.6） 10% Tween 20−10mM TBS（pH7.6） 各濃度のヒトアルブミン溶液 標識化抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体液 従って、各展開液中の検出対象物質であるヒトアルブミ
ンの最終濃度は、前記第（１）項に記載したヒトアルブ
ミン溶液の濃度の１０分の１となる。

【０１０１】（４）検出操作 マイクロプレートに前記展開液40μｌをとり、前記検出
試薬（試験片）の下端を浸け、展開させた。展開液が試
験片上端に達した時点をもって展開終了とし、抗ヒトア
ルブミン−ポリクローナル抗体を塗布した試験領域、及
び、酢酸ランタン水溶液を塗布した参照領域における標
識抗体の集積による着色状態を評価した。

【０１０２】[検出結果] （１）試験領域の着色 検出対象物質であるヒトアルブミン濃度に対して用量依
存的な着色が認められた。

【０１０３】（２）参照領域の着色 検出試験を行なった全てのヒトアルブミン濃度におい
て、ラテックスにより標識された標識抗体の流れが酢酸
ランタンを塗布した部位（参照領域）で阻止され、標識
抗体の集積によるバンドの生成が視認でき、展開終了の
信号が発生した。この参照領域の信号強度は、検出対象
物質であるヒトアルブミン濃度が高くなるに従って、即
ち、試験領域の着色強度が強くなるに従って、これに相
反して減弱することが認められたが、展開終了の確認に
影響を及ぼすものではなかった。

【０１０４】

【実施例２】［検出試薬（試験片）の調製］ （１）ニトロセルロース膜上試験区域への抗ヒトラクト
フェリン−ポリクローナル抗体の塗布 前記参考例２に記載の方法に従って調製したウサギ抗ヒ
トラクトフェリン−ポリクローナル抗体溶液に、イソプ
ロピルアルコールの最終的な濃度が5%v/vとなる量のイ
ソプロピルアルコールを添加して混合した後、0.45μm
フィルターを通して塗布用液とした。

【０１０５】ニトロセルロース膜（ミリポア社製：SRH
F）を、ヨコ200mm×タテ30mmに裁断し、長辺の一端（以
下、これを下端とする）から12mmの位置に、塗布機（IV
EK社製）を用いて掃引速度：2.0cm/sec、塗布液の吐出
量：2.0μｌ／sec、即ちニトロセルロース膜上の塗布
量：1μｌ／cm、塗布幅：約0.8mmで、前記塗布液を塗布
した。

【０１０６】塗布後35℃にて2時間乾燥し、0.5%ポリビ
ニルピロリドンK-15水溶液中で15分間振盪させてブロッ
キングを行ない、次いで、0.01%のドデシル硫酸ナトリ
ウムを含有する5mMリン酸緩衝液（pH 7.5）中で15分間
振盪させて洗浄した後、35℃にて一晩乾燥した。

【０１０７】（２） ニトロセルロース膜上参照領域へ
の塩化セリウム（III）・７水和物の塗布 塩化セリウム（III）・７水和物（関東化学社製）を蒸
留水に溶解し、0.2mg／ml濃度の水溶液を調製し、イソ
プロピルアルコールの最終的な濃度が5%v/vとなる量の
イソプロピルアルコールを添加して混合した後、0.45μ
mのフィルターを通して塗布用液とした。

【０１０８】前記第（１）項で調製したニトロセルロー
ス膜に対し、上端から8mmの位置に、前記塩化セリウム
塗布液を、塗布機（IVEK社製）を用いて掃引速度：2.0c
m/sec、塗布液の吐出量：2.0μｌ／sec、即ちニトロセ
ルロース膜上の塩化セリウムの塗布量：1μｌ／cm（塩
化セリウム（III）・７水和物換算で約0.2μｇ／cm）、
塗布幅：約0.8mmで塗布した。

【０１０９】塗布後、35℃にて一晩乾燥した後、室温に
て湿度30〜50%の条件下に保存した。次いで、塗布方向
と垂直に5mm幅に裁断して、イムノクロマト用検出試薬
（試験片）を得た。

【０１１０】［検出方法］ （１）検出対象物質としてのヒトラクトフェリン溶液 ヒトラクトフェリン（シグマ社製：L0520）4.5mgを秤量
し、10mM TBS（pH 7.4）1125μｌに溶解させ（4mg／m
l）、この50μｌに10mMトリス−150mM NaCl（pH8.0。以
下、10mM TBS（pH 8.0）と略記する。） 950μｌを加え
たものを原液（200?g/mL）として、10mM TBS（pH 8.0）
にて順次希釈し、次の濃度の溶液を調製した。 （a）128μｇ／ml、（b）32μｇ／ml、（c）8.0μｇ／m
l、（d）2.0μｇ／ml、（e）0.5μｇ／ml、及び（f）０
μｇ／ml

【０１１１】（２）標識抗体 標識化抗ヒトラクトフェリン−モノクローナル抗体とし
て、前記参考例３に記載の方法に従って調製した金コロ
イド標識化抗ヒトラクトフェリンモノクローナル抗体を
使用した。

【０１１２】（３）展開液 下記、、、の各液を体積比65：20：10：5の割
合で混合したものを展開液として用いた。 10mM TBS（pH8.0） 10% Tween 20−10mM TBS（pH8.0） 各濃度のヒトラクトフェリン溶液 標識化抗ヒトラクトフェリン−モノクローナル抗体液 従って、各展開液中の検出対象物質であるヒトラクトフ
ェリンの最終濃度は、前記第（１）項に記載したヒトラ
クトフェリン溶液の濃度の１０分の１となる。

【０１１３】（４）検出操作 マイクロプレートに前記展開液40μｌをとり、前記検出
試薬（試験片）の下端を浸け、展開させた。展開液が試
験片上端に達した時点をもって展開終了とし、抗ヒトラ
クトフェリン−ポリクローナル抗体を塗布した試験領
域、並びに塩化セリウム水溶液を塗布した参照領域にお
ける標識抗体の集積による着色状態を評価した。

【０１１４】[検出結果] （１）試験領域の着色 検出対象物質であるヒトラクトフェリン濃度に対して用
量依存的な着色が認められた。

【０１１５】（２）参照領域の着色 検出試験を行なった全てのヒトラクトフェリン濃度にお
いて、金コロイドにより標識された標識抗体の流れが塩
化セリウム水溶液を塗布した部位（参照領域）で阻止さ
れ、標識抗体の集積によるバンドの生成が視認でき、展
開終了の信号が発生した。この参照領域の信号強度は、
検出対象物質であるヒトラクトフェリン濃度が高くなる
に従って、即ち、試験領域の着色強度が強くなるに従っ
て、これに相反して減弱することが認められたが、展開
終了の確認に影響を及ぼすものではなかった。

【０１１６】

【実施例３】 ［検出試薬（試験片）の調製］ （１）抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体のニトロ
セルロース膜上試験領域への塗布 抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体液（日本バイオ
テスト社製 ＃３０３、10mMリン酸緩衝液−150mM Ｎａ
Ｃｌ、pH 7.2中、10μｇ／μｌ）９０μｌを取り、10mM
リン酸緩衝液（pH 7.2）７６５μｌ及びイソプロピルア
ルコール（以下、IPAと記す）４５μｌを加えて混合す
ることにより１０倍希釈して、塗布液（抗体濃度：１．
０μｇ／μｌ）とした。

【０１１７】ニトロセルロース膜（ミリポア社製：ＳＮ
ＨＦ）をヨコ２００ｍｍ×タテ２５ｍｍに裁断し、長辺
の一端（以下、これを下端とする）から８ｍｍの位置
に、塗布機（ＩＶＥＫ社製）を用いて、掃引速度：５．
０ｃｍ／ｓｅｃ、塗布液の吐出量：２．０μｌ／ｓｅ
ｃ、即ちニトロセルロース膜上の塗布量：０．４μｌ／
ｃｍ、塗布幅約０．４ｍｍで、前記塗布液を塗布した。

【０１１８】塗布後、３５℃にて２時間乾燥し、０．５
％ポリビニルピロリドンK-15水溶液中で１５分間振盪さ
せてブロッキングを行ない、次いで０．０１％ドデシル
硫酸ナトリウム含有５ｍＭリン酸緩衝液（pH 7.5）中で
１５分間振盪させて洗浄した後、３５℃にて一晩乾燥し
た。

【０１１９】（２）酢酸ランタンのニトロセルロース膜
上参照領域への塗布 酢酸ランタン・ｎ水和物（和光純薬工業社製）３０．０
ｍｇを秤量し、蒸留水１５００μｌに完全に溶解させた
後、０．４５μｍフィルターを通してろ過して、原液と
した。この原液２００μｌに蒸留水７５０μｌ及びIPA
５０μｌを加えて混合し、塗布液Ａ（酢酸ランタン濃
度：４．０μｇ／μｌ）を調製した。次いで、原液１７
５μｌに蒸留水７７５μｌ及びIPA５０μｌを加えて混
合し、塗布液Ｂ（酢酸ランタン濃度：３．５μｇ／μ
ｌ）を調製した。更に原液１５０μｌに蒸留水８００μ
ｌ及びIPA５０μｌを加えて混合し、塗布液Ｃ（酢酸ラ
ンタン濃度：３．０μｇ／μｌ）を調製した。以下、同
様の手順によって原液と蒸留水の量を変えることによ
り、IPAの最終濃度が5%v/vである塗布液Ｄ（酢酸ランタ
ン濃度：２．５μｇ／μｌ）、塗布液Ｅ（酢酸ランタン
濃度：２．０μｇ／μｌ）、塗布液Ｆ（酢酸ランタン濃
度：１．５μｇ／μｌ）、塗布液Ｇ（酢酸ランタン濃
度：１．０μｇ／μｌ）、塗布液Ｈ（酢酸ランタン濃
度：０．５μｇ／μｌ）、塗布液Ｉ（酢酸ランタン濃
度：０．２４μｇ／μｌ）、及び塗布液Ｊ（酢酸ランタ
ン濃度：０．１２μｇ／μｌ）を調製した。

【０１２０】前記（１）項で調製した、抗ヒトアルブミ
ン−モノクローナル抗体を塗布済みのニトロセルロース
膜に対し、上端から８ｍｍの位置に、上記５％IPA含有
酢酸ランタン水溶液（塗布液Ａ〜Ｊ）を、塗布機（ＩＶ
ＥＫ社製）を用いて、掃引速度：５．０ｃｍ／ｓｅｃ、
塗布液の吐出量：２．０μｌ／ｓｅｃ、即ちニトロセル
ロース膜上に塗布液量：０．４μｌ／ｃｍ、塗布幅約
０．４ｍｍで塗布した。塗布後３５℃にて一晩乾燥した
後、室温にて湿度３０〜５０％の条件下に保存した。

【０１２１】次いで、塗布方向と垂直方向に５ｍｍ幅に
裁断して、イムノクロマトグラフィー用検出試薬（試験
片）を得た。つまり、ニトロセルロース膜参照領域上の
酢酸ランタンの塗布量が、１．６μｇ／ｃｍ（試験片
Ａ）、１．４μｇ／ｃｍ（試験片Ｂ）、１．２μｇ／ｃ
ｍ（試験片Ｃ）、１．０μｇ／ｃｍ（試験片Ｄ）、０．
８μｇ／ｃｍ（試験片Ｅ）、０．６μｇ／ｃｍ（試験片
Ｆ）、０．４μｇ／ｃｍ（試験片Ｇ）、０．２μｇ／ｃ
ｍ（試験片Ｈ）、０．１μｇ／ｃｍ（試験片Ｉ）、及び
０．０５μｇ／ｃｍ（試験片Ｊ）のものを其々調製し
た。

【０１２２】［検出方法］ （１）検出対象物質としてのヒトアルブミン溶液の調製 ヒトアルブミン（シグマ社製）５．０ｍｇを秤量し、１
０ｍＭトリス−１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．６、以
下、１０ｍＭ ＴＢＳ (ｐＨ ７．６) と略記する。）に
溶解させて全量を１．０ｍｌとした。これを原液として
１０ｍＭ ＴＢＳ (ｐＨ ７．６) にて順次希釈して、次
の濃度の溶液を調製した。 （a）３０μｇ／ｍｌ、（b）２５μｇ／ｍｌ、（c）２
０μｇ／ｍｌ、（d）１５μｇ／ｍｌ、（e）１０μｇ／
ｍｌ、（f）７．５μｇ／ｍｌ、（g）５．０μｇ／ｍ
ｌ、（h）２．５μｇ／ｍｌ、（i）２．０μｇ／ｍｌ、
（j）１．０μｇ／ｍｌ、（k）０．５０μｇ／ｍｌ、及
び（l）０μｇ／ｍｌ

【０１２３】（２）標識抗体 抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体（日本バイオテ
スト社製 ＃３０１）及び粒径１９０ｎｍポリスチレン
製赤色ラテックス粒子（ＪＳＲ社製）を用いて、参考例
１に記載したのと同一の方法により標識抗体液を得た。

【０１２４】（３）展開液 下記、、、及びの各液を体積比６５：２０：１
０：５の割合で混合したものを展開溶液として用いた。 １０ｍＭ ＴＢＳ (ｐＨ ７．６) ５％Ｔｗｅｅｎ８０−１０ｍＭ ＴＢＳ (ｐＨ ７．
６) 上記（１）で調製した各濃度のヒトアルブミン溶液 上記（２）で調製した標識化抗ヒトアルブミン−モノ
クローナル抗体液

【０１２５】従って、各展開溶液中の検出対象物質であ
るヒトアルブミンの最終濃度は、上記（１）で調製した
各ヒトアルブミン溶液の濃度の１０分の１となる。

【０１２６】（４）検出操作 マイクロプレートに上記展開液４０μｌをとり、前記検
出試薬（試験片）の下端を浸け、展開させた。展開液が
試験片上端に達した時点をもって展開終了とし、抗ヒト
アルブミン−モノクローナル抗体を塗布した試験領域で
の発色信号強度と、酢酸ランタンを塗布した参照領域で
の発色信号強度とを比較した。

【０１２７】[結果]上記（２）で調製した、参照領域に
おける酢酸ランタン塗布濃度の異なる試験片Ａ〜Ｊにつ
いて、種々の濃度のヒトアルブミンを含む溶液を展開し
た。その結果は以下の通りであった。 １．試験片Ｃに対して、ヒトアルブミン濃度が２．０μ
ｇ／ｍｌの溶液を展開したとき、試験信号と参照信号は
ほぼ等しい強度を示した。 ２．試験片Ｄに対して、ヒトアルブミン濃度が１．０μ
ｇ／ｍｌの溶液を展開したとき、試験信号と参照信号は
ほぼ等しい強度を示した。 ３．試験片Ｅに対して、ヒトアルブミン濃度が０．５μ
ｇ／ｍｌの溶液を展開したとき、試験信号と参照信号は
ほぼ等しい強度を示した。 ４．試験片Ｉに対して、ヒトアルブミン濃度が０．１μ
ｇ／ｍｌの溶液を展開したとき、試験信号と参照信号は
ほぼ等しい強度を示した。

【０１２８】また、この免疫化学測定系における、ヒト
アルブミンの検出限界は０．０５μｇ／ｍｌ近辺と判断
された。一方、ヒトアルブミン濃度が３．０μｇ／ｍｌ
以上の展開液では、いわゆるプロゾーン現象が出現し、
ヒトアルブミン濃度が２．０μｇ／ｍｌの展開液に比べ
て、明らかな試験信号の低下が認められた。

【０１２９】以上から、本ヒトアルブミン検出系の適正
検出範囲は、０．０５〜２．０μｇ／ｍｌであると認め
られる。これらのストリップによる半定量能について、
さらに検証を行なった。

【０１３０】即ち、上述の結果を基に、試験片Ｉ、試験
片Ｅ及び試験片Ｄの3種類のストリップによる、検体中
のヒトアルブミン濃度の半定量測定について検討した。

【０１３１】ヒトアルブミンの最終濃度が其々０．０５
〜１．５μｇ／ｍｌの濃度既知の溶液を新たに調製し、
上記３種のストリップに対して同時に展開し、その試験
信号と参照信号の強度を、目視にて比較判定することに
より、各溶液のヒトアルブミン濃度を、 約０．１μ
ｇ／ｍｌより低、 約０．１μｇ／ｍｌ、 約０．１
μｇ／ｍｌと約０．５μｇ／ｍｌとの間、 約０．５
μｇ／ｍｌ、 約０．５μｇ／ｍｌと約１．０μｇ／
ｍｌの間、 約１．０μｇ／ｍｌ、そして 約１．０
μｇ／ｍｌより高、の七つのランクへの類別を試み、そ
の判定精度について検討した。その結果、いずれの溶液
においても、３回の試行について、再現性よく、ランク
付けできることが確かめられた。

【０１３２】

【発明の効果】以上詳記したとおり、本発明により奏せ
られる効果は次のとおりである。 １） 本発明の物質の検出試薬は、調製が容易で、製造
コストが安く、展開終了の信号および／または参照信号
に調製ロットの間でバラツキがない。 ２） 本発明の物質の検出試薬は、展開終了の信号およ
び／または参照の信号が褪色し難くデータの保存性が良
好である。 ３） 本発明の物質の検出方法によれば、参照領域を展
開終了の確認に用いた場合には、展開終了の信号を確実
に確認できる。 ４） 本発明の物質の検出方法によれば、参照領域を参
照信号の発生に用いた場合には、半定量的な測定を簡便
かつ容易に実施することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 複数のストリップを備える本発明検出試薬を
構成する基板の一例を示す。

【図２】 基板の形状および凹部の配置の例を示す。

【図３】 ストリップを配置した図１の基板を示す。

【図４】 カバーにおける観察窓の配置例を示す。

【図５】 注入孔構成部材の一例を示す。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 展開液を、試験領域を通して参照領域ま
   で展開させる溶液展開法に用いる物質の検出試薬におい
   て、参照領域に、アルカリ金属塩を除く金属化合物を含
   有し、かつ、参照領域に集積され得る標識が、参照領域
   に達する展開液に含まれることを特徴とする検出試薬。
2. 【請求項２】 標識が有色微粒子である請求項１に記載
   の検出試薬。
3. 【請求項３】 標識が抗体又は抗原と結合している請求
   項１又は２に記載の検出試薬。
4. 【請求項４】 検出試薬の展開担体がニトロセルロース
   膜である請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出試
   薬。
5. 【請求項５】 所定量の検出対象物質を含む展開液が展
   開されたときに試験領域で生じる信号の強度と同等の強
   度の信号が参照領域で生じるように、アルカリ金属塩を
   除く金属化合物が参照領域に含有されている請求項１〜
   ４のいずれか１項に記載の検出試薬。
6. 【請求項６】 試験領域と参照領域とを設けた展開担体
   を複数備え、各参照領域で生じる信号の強度は、それぞ
   れ、異なる所定量の検出対象物質を含む展開液が展開さ
   れたときに試験領域で生じる信号の強度と同等となるよ
   うにされている請求項５記載の検出試薬。
7. 【請求項７】 展開液を、試験領域を通して参照領域ま
   で展開させることを含む物質の検出方法において、参照
   領域が、アルカリ金属塩を除く金属化合物を含有し、か
   つ、参照領域に集積され得る標識が、参照領域に達する
   展開液に含まれることを特徴とする検出方法。
8. 【請求項８】 標識が有色微粒子である請求項７に記載
   の物質の検出方法。
9. 【請求項９】 標識が抗体又は抗原と結合している請求
   項８に記載の検出方法。
10. 【請求項１０】 検出試薬の展開担体がニトロセルロー
    ス膜である請求項７〜９のいずれか１項に記載の検出方
    法。
11. 【請求項１１】 所定量の検出対象物質を含む展開液が
    展開されたときに試験領域で生じる信号の強度と同等の
    強度の信号が参照領域で生じるように、アルカリ金属塩
    を除く金属化合物が参照領域に含有されており、試験領
    域で生じる信号の強度と参照領域で生じる信号の強度と
    を比較することを含む請求項７〜１０のいずれか１項に
    記載の検出方法。
12. 【請求項１２】 試験領域と参照領域とを設けた展開担
    体を複数準備し、各参照領域で生じる信号の強度は、そ
    れぞれ、異なる所定量の検出対象物質を含む展開液が展
    開されたときに試験領域で生じる信号の強度と同等とな
    るようにされている請求項１１記載の検出方法。