JPWO2003085402A1

JPWO2003085402A1 - クロマトグラフィー用試験片およびその製造方法

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Publication number: JPWO2003085402A1
Application number: JP2003582538A
Authority: JP
Inventors: 湯川　系子; 系子湯川; 北脇　文久; 文久北脇; 河村　達朗; 達朗河村
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2002-04-05
Filing date: 2003-04-07
Publication date: 2005-08-11
Also published as: US20040161857A1; EP1491892A4; WO2003085402A1; EP1491892A1; CN1522368A

Abstract

図１に示すように、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片１０は、試料導入部１２と、標識部１３と、固定化部１４とを備える基材１１から構成されている。基材１１は、検出対象物質を含む試料液の溶媒を含浸する材料から形成されている。これらの材料は、毛細管現象によって試料液の溶媒を展開することができる。試料導入部１２には、検出対象物質を含む試料液が導入（例えば、滴下）される領域であり、金属塩が担持されている。標識部１３には、標識物質で標識された標識抗体１５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている。標識抗体１５は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。固定化部１４には、固定化抗体１６が固定化されている。固定化抗体１６は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。

Description

技術分野
本発明は、試料液中の特定成分について、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施することができるクロマトグラフィー用試験片に関する。
背景技術
従来、試料液中の特定成分について、試料液の希釈や撹拌などを行なうことなく簡易に定量する方法として、ドライケミストリーが提案されている。
ドライケミストリーとは、フィルムや、試験紙のような固相マトリクスに乾燥状態で保存された試薬に対して、液状の試料を点着させて、試料液中の検出対象物質を測定する方法である。
ドライケミストリーに用いるデバイスとしては、濾紙に試薬を担持させた単層式と、展開層、反応層、試薬層などを積層させた多層式とがある。いずれのデバイスも、試薬が既に固相マトリクス上に担持されているため、試薬の調製が不要で、小スペースで保存でき、試料液量を少量しか必要としないこと等が特徴としてあげられる。
代表的なドライケミストリーによる検査法として、抗原抗体反応と毛細管現象を利用した検査法である免疫クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、特開平１０−７３５９２号公報に記載されている）。免疫クロマトグラフィーに用いるデバイスとしては、メンブレンフィルターに代表される試料液の溶媒を含浸する材料からなる固相マトリクスに、固定化された抗体（以下、固定化抗体と略称する）と標識物質により標識された抗体（以下、標識抗体と略称する）が、それぞれ乾燥状態で担持されている試験片がある。
測定の際に、図５（ａ）に示すように、検出対象物質１０４を含む試料液を試験片の一端から導入すると、図５（ｂ）に示すように、標識抗体１０５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている標識部１０２に、毛細管現象によって試料液が到達し、そこで標識抗体１０５と検出対象物質１０４との複合体１０７が形成される。さらに、図５（ｃ）に示すように、形成された複合体１０７は試料液の毛細管現象による流れに沿って、固定化抗体１０６が担持された固定化部１０３に到達し、ここで抗原抗体反応によって固定化抗体１０６に捕らえられる。複合体１０７以外のものは毛細管現象の流れにのり、固定化部１０３を通過するので、固定化部１０３には複合体１０８だけが残る。ここで、標識物質１０５に由来する出力を測定することによって、試料液中の検出対象物質１０４の検知や濃度の測定が可能になる。抗原抗体反応の形態としては、サンドイッチ型の反応のほかに競合型の反応を利用する免疫クロマトグラフィー法もあるが、試験片の構造および測定の方法は同様である。
免疫クロマトグラフィー法を利用した測定方法の利点としては、上記に示したドライケミストリーによる利点に加えて、操作の簡便性、迅速な判定、および測定コストの低下があげられる。従って、臨床検査に限らず、近年着目されているポイント・オブ・ケア（以下、ＰＯＣと略称する）においても、適用可能である。なお、ＰＯＣとは、医療現場において、検体採取から結果が出るまでの時間の短縮が最も重要視される臨床検査の総称である。
解決課題
実際の医療現場などで、上記のような免疫クロマトグラフィー法により検出対象物質を検出したり、検出対象物質の濃度を測定する際には、注射針を用いて採血管中に取り入れた血液の一部を試料液として用いる。
採血管には用途によって、いろいろな試薬が含まれている。例えば血糖、アルドステロン、またはプロスタグランジンＥ２測定用の採血管には、キレート剤であるＥＤＴＡなどが含まれている。また、ＥＧＴＡも同様にキレート効果が期待され、採血管に添加される可能性がある。さらにクエン酸、フタル酸、シュウ酸などのカルボン酸類も同様にキレート効果を示すことがあり、特にクエン酸は採血管に含まれていることが多い。
検出対象物質がタンパク質であり、且つそのタンパク質の構造内にカルシウムイオンなどの２価の金属イオンを含んでいる場合、上記のキレート効果を有する物質が試料液中に存在すると、キレート効果を有する物質がそれを取り込むため、２価の金属イオンが検出対象物質であるタンパク質の構造内より排出される。このため、その検出対象物質であるタンパク質の立体構造が変化してしまうことがある。
例えば、ＣＲＰは５つのサブユニットからなる五量体であり、５つのサブユニットのうちの４つにカルシウムイオンが含まれるが、キレート効果を有するＥＤＴＡ等と共に溶液内に存在すると、ＣＲＰ内よりカルシウムイオンが抜けて立体構造が変化する。また、採血後の血液の保存の状態が悪い場合にも、ＣＲＰからカルシウムイオンが脱落して立体構造が変化してしまうことがある。
免疫クロマトグラフィー法においては、２価の金属イオンが含まれた状態の検出対象物質に結合する抗体を用いているので、変化した構造の検出対象物質とは結合しない、あるいは検出対象物質と抗体とのアフィニティーに変化が生じることがある。このため、正確な結果が得られなくなるおそれがある。
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、試料液中の検出対象物質を正確に測定することができるクロマトグラフィー用試験片を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明のクロマトグラフィー用試験片は、試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片であって、試料導入部と、標識部と、固定化部とを有し、前記試料導入部に導入された前記試料液は、前記標識部を経て前記固定化部に移動するように前記試料導入部と、前記標識部と、前記固定化部とが配置された基材からなり、前記試料導入部、前記試料導入部から前記標識部までの間の部分、及び前記標識部の少なくともいずれかに金属塩が含まれている。
本発明によれば、検出対象物質が金属イオンを内部に保持する場合においても、検出対象物質がキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオンを放出し、その立体構造が変化しても、標識部に接触する前に、試料液が金属塩と接触する。このことにより、検出対象物質は、金属イオンを取り込んで元の立体構造に戻る。従って、キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、試料液中の検出対象物質を正確に測定・検出することができる。
前記金属塩は、前記基材の表面または内部に存在する構成としてもよい。
前記標識部は、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を含み、前記固定化部は、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を含む構成としてもよい。
前記第１結合物質および前記第２結合物質は、前記検出対象物質に特異的に結合する抗体である構成としてもよい。
このことによって、免疫クロマトグラフィーによる検出対象物質の測定を行なうことができる。
前記金属塩は、２価の金属イオンの塩である構成としてもよい。
前記２価の金属イオンは、カルシウムイオンである構成としてもよい。
前記第１結合物質および前記第２結合物質は、抗ＣＲＰ抗体である構成としてもよい。
前記金属塩は、塩化カルシウムである構成としてもよい。
本発明の別のクロマトグラフィー用試験片は、試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片であって、基材と、前記基材上に設けられ、金属塩を備えている試料導入層と、前記基材上に前記試料導入層に接触して設けられ、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含む標識層と、前記基材上に前記標識層に接触して設けられ、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を固定化された状態で含む固定化層とを備える。
本発明によれば、検出対象物質が金属イオンを内部に保持する場合においても、検出対象物質がキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオンを放出し、その立体構造が変化しても、標識部に接触する前に、試料液が金属塩と接触する。このことにより、検出対象物質は、金属イオンを取り込んで元の立体構造に戻る。従って、キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、試料液中の検出対象物質を正確に測定・検出することができる。また、本発明によれば、試料導入層が標識層に接触して設けられているため、試料液の展開の途中で失われる試料液中の溶媒量が減少する。このため、標識層および固定化層に十分な量の試料液を供給することができる。
前記基材上に前記固定化層に接触して設けられた、前記試料液を吸収するための吸収層をさらに備える構成としてもよい。
本発明のクロマトグラフィー用試験片の製造方法は、試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片の製造方法であって、基材シートを用意する工程（ａ）と、前記基材シートに、金属塩担持領域と、標識抗体含有領域と、固定化抗体領域とを、それぞれが互いに平行に延び、且つ、前記標識抗体含有領域が前記金属塩担持領域と前記固定化抗体領域との間に配置されるように形成する工程（ｂ）と、前記金属塩担持領域、前記標識抗体含有領域および前記固定化抗体領域に対して直交する方向に沿って短冊状に切断する工程（ｃ）とを含み、前記金属塩担持領域は、金属塩が担持されており、前記標識抗体含有領域は、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含み、前記固定化抗体領域は、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を固定化された状態で含む。
このことによって、試料液中の検出対象物質を正確に測定することができるクロマトグラフ試験片が得られる。
最良の実施形態
以下、図を参照しながら本発明の実施の形態を説明する。
（実施形態１）
本実施形態では、免疫クロマトグラフィー用試験片を図を参照しながら説明する。図１は、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を表す図であり、図２（ａ）〜図２（ｃ）は本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を用いたときの作用を模式的に表す図である。
図１に示すように、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片１０は、試料導入部１２と、標識部１３と、固定化部１４とを備える基材１１から構成されている。
基材１１は、検出対象物質を含む試料液の溶媒を含浸する材料から形成されており、例えば、ニトロセルロース性メンブレン、酢酸セルロース性メンブレン、ガラス繊維濾紙、不織布などの多孔質性材料から形成されている。特に、ニトロセルロース性メンブレンが好ましい。これらの材料は、毛細管現象によって試料液の溶媒を展開することができる。
試料導入部１２には、検出対象物質を含む試料液が導入（例えば、滴下）される領域であり、金属塩が担持されている。
標識部１３には、標識物質で標識された標識抗体１５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている。標識抗体１５は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
固定化部１４には、固定化抗体１６が固定化されている。固定化抗体１６は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
試料導入部１２に担持されている金属塩は、検出対象物質に応じて選択される。例えば、検出対象物質がカルシウムイオンが保持されているＣＲＰである場合、ＣＲＰの立体構造を保持するためにカルシウムイオンが供給されるようにカルシウム塩を用いる。勿論、このとき、標識部１３および固定化部１４にそれぞれ含まれる標識抗体１５および固定化抗体１６は、カルシウムイオンが保持されている抗ＣＲＰ抗体を用いる。
このように、検出対象物質に応じて、金属塩と、標識抗体１５および固定化抗体１６とが選択される。
検出対象物質を測定する際には、本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０では以下のような現象が起こる。
まず、図２（ａ）に示すように、免疫クロマトグラフィー試験片１０を用意し、検出対象物質１７を含む試料液を免疫クロマトグラフィー試験片１０の一端にある試料導入部１２に滴下する。次に、試料液の溶媒を試料導入部１２から固定化部１６に向かって展開すると、図２（ｂ）に示すように、標識部１３に、毛細管現象によって試料液が到達し、抗原抗体反応によって標識抗体１５と検出対象物質１７との複合体１８が形成される。形成された複合体１８は、試料液の毛細管現象による流れに沿って、固定化抗体１６が固定化された固定化部１３に到達し、ここで抗原抗体反応によって固定化抗体１６に捕らえられ、図２（ｃ）に示すように、複合体１９が形成される。このとき、複合体１８以外のものは毛細管現象の流れに沿って、固定化部１３を通過するので、固定化部１３には複合体１９だけが残存する。ここで、標識物質１５に由来する出力を測定（例えば反射吸光度などを測定）することによって、試料液中の検出対象物質１７の検出、試料液中の検出対象物質１７の濃度の測定が可能になる。
特に、本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０によれば、検出対象物質１７が金属イオンを内部に保持する場合においても、検出対象物質１７が採血管内等に含まれるキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオンを放出し、その立体構造が変化しても、標識部１３に含まれる標識抗体１５に接触する前に、試料液が免疫クロマトグラフィー試験片１０に固定化された金属塩と接触する。このことにより、検出対象物質１７は、金属イオンを取り込んで元の立体構造に戻る。従って、キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、試料液中の検出対象物質１７を正確に測定・検出することができる。
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０では、標識部１３に標識物質で標識された標識抗体１５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている。具体的には、金コロイドで標識された抗体が挙げられるがこれに限定されない。例えば、標識抗体１５に代えて、標識物質で標識された酵素、リセプター、ＤＮＡなどの特異的配列を有する標識物質で標識されたヌクレオチド等を標識部１３に試料液中に溶出可能な状態で含めることによって、クロマトグラフィー用試験片としてもよい。
金属塩は、試料導入部１２、試料導入部１２から標識部１３までの間、及び標識部１３の少なくともいずれかに担持されていればよい。特に、試料導入部１２、または試料導入部１２に近い場所に担持されていると、検出対象物質１７と金属塩との反応時間がより長くなり、検出対象物質１７の立体構造が戻る効果が高くなるため、特に好ましい。
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０では、検出対象物質１７を特に限定しないが、金属塩をその構造内に含有するタンパク質を測定・検出することができる。検出対象物質１７としては、例えば、ＣＲＰ、トロポニン、カルモジュリン、パルブアルブミンなどが挙げられる。
本実施形態において、金属塩を構成する金属イオンは、検出対象物質１７に含まれる金属イオンのみに限定されない。例えば、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオンなどが挙げられる。
金属塩を構成する金属イオンが、検出対象物質１７に含まれる金属イオンと同じであると、検出対象物質１７と標識抗体１５および固定化抗体１６のそれぞれとのアフィニティーが低減しないので好ましい。
なお、金属塩は試料液中で溶解するものであれば特に限定されず用いることができる。特に、金属塩がハロゲン化物塩、硝酸塩、または硫酸塩であると、溶解性が高いため、本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０への担持が容易であり、かつ試料液中に金属イオンが容易に溶け出すので好ましい。
検出対象物質１７が、感染症のマーカーのひとつであるＣＲＰの場合、ＣＲＰはその構造内にカルシウムイオンを含んでいるので、２価の金属イオンの塩を構成する金属イオンがカルシウムイオンであることが好ましく、中でも２価の金属イオンの塩が塩化カルシウムであると、溶解性が高く、かつ安価なのでさらに好ましい。
試料液としては、水溶液および有機系溶液のいずれでもよく、例えば、体液、河川の水、海水、地下水、土壌や食品を溶解させた水溶液等が挙げられる。この中で体液としては、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗及び涙等が挙げられる。中でも、試料液が血液であることが好ましい。
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０への金属塩の担持量は、試料液に含まれ得るキレート剤の濃度に合わせて調整すればよい。試料液として、採血管から血液を得る場合、採血管より得られた血液中のＥＤＴＡ濃度は、一般に３ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内であるので、この濃度範囲をカバーするような量の金属イオンが供給されるように金属塩を担持させておくことが好ましい。具体的には、ＥＤＴＡのモル濃度に対してカルシウムイオンのモル濃度が同等以上であることが好ましい。
標識抗体１５および固定化抗体１６は、ともに、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。ただし、モノクローナル抗体を用いる場合には、標識抗体１５と固定化抗体１６とが検出対象物質１７を介して結合する際に立体障害が生じないようにすることが好ましい。
標識抗体１５を標識する標識物質としては、例えば、着色物質、蛍光物質、燐光物質、発光物質、酸化還元物質、酵素、核酸、小胞体等が挙げられる。ここで、着色物質としては、金コロイド、銀コロイド、セレニウムコロイド、着色ラテックス、シアニン及びアゾ等が挙げられる。特に、金コロイド粒子が好適に用いられる。
蛍光物質としては、ピレン等の芳香族化合物、ダンシル等の芳香族化合物に官能基が置換してあるもの、フルオレセイン、ローダミンおよびクマリン等が挙げられる。燐光物質としては、ベンゾフェノン等が挙げられる。発光物質としては、ルシフェリンとＡＴＰとの発光反応を生じるものが挙げられる。酸化還元物質としては、グルコースとグルコースオキシダーゼとの酸化還元反応により電流を生じるものが挙げられる。小胞体としては、ミセルおよびリポソーム等が挙げられる。
次に、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片の製造方法を図３（ａ）〜（ｃ）を参照しながら説明する。
まず、図３（ａ）に示すように、基材シート３１を用意する。基材シート３１は、上述した基材１１と全く同じ材料で形成されたものであり、例えば、ニトロセルロース性メンブレン、酢酸セルロース性メンブレン、ガラス繊維濾紙、不織布などの多孔質性材料から形成されている。
次に、図３（ｂ）に示すように、基材シート３１に金属塩を溶解した溶液を含浸し、乾燥させることによって金属塩担持領域３２を、標識物質で標識された標識抗体を試料液中に溶出可能な状態で含ませることによって標識抗体含有領域３３を、固定化抗体を固定化することによって固定化抗体領域３４を、それぞれ形成する。勿論、このとき用いられる標識抗体および固定化抗体は、検出対象物質に特異的に結合するものである。金属塩担持領域３２、標識抗体含有領域３３および固定化抗体領域３４は、基材シート３１上にそれぞれ互いに平行に延びるように形成され、標識抗体含有領域３３が金属塩担持領域３２と固定化抗体領域３４との間に形成される。
次に、金属塩担持領域３２、標識抗体含有領域３３および固定化抗体領域３４に対して直交する方向に沿って短冊状に切断することによって、図３（ｃ）に示すように、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片１０が得られる。
（実施形態２）
上記実施形態１では、単層型の免疫クロマトグラフィー用試験片を参照しながら説明したが、本実施形態では多層型の免疫クロマトグラフィー用試験片を説明する。図４（ａ）は、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を表す上面図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）中に示す線Ｘ−Ｘに沿った断面図である。
図４（ａ）および（ｂ）に示すように、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片４０は、基材４１と、基材４１上に設けられた標識層４３および固定化層４４と、基材４１上に設けられ、標識層４３に接触して設けられた試料導入層４２と、基材４１上に設けられ、固定化層４４に接触して設けられた吸収層４６とを備える。
基材４１を形成する材料としては、特に限定されないが、検出対象物質を含む試料液の溶媒を透過しない材料を用いることが好ましい。具体的には、ポリエチレンテレフタレートなどの樹脂が挙げられる。
試料導入層４２、標識層４３、固定化層４４および吸収層４６を形成する材料は、検出対象物質を含む試料液の溶媒を含浸する材料から形成されており、例えば、ニトロセルロース性メンブレン、酢酸セルロース性メンブレン、ガラス繊維濾紙、不織布などの多孔質性材料から形成されている。特に、ニトロセルロース性メンブレンが好ましい。これらの材料は、毛細管現象によって試料液の溶媒を展開することができる。なお、本実施形態では、試料導入層４２、標識層４３、固定化層４４および吸収層４６を形成する材料として、それぞれ不織布、ワットマン標識ろ紙、ニトロセルロースメンブレンおよびガラス繊維ろ紙が用いられている。
試料導入層４２には、検出対象物質を含む試料液が導入（例えば、滴下）される領域であり、金属塩が担持されている。
標識層４３には、標識物質で標識された標識抗体１５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている。標識抗体（不図示）は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
固定化層４４には、固定化抗体４５が固定化されている。固定化抗体４５は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
吸収層４６は、固定化層４４から試料液を吸収する。
本実施形態の多層型の免疫クロマトグラフィー用試験片４０によれば、試料導入層４２が標識層４３に接触して設けられているため、試料液の展開の途中で失われる試料液中の溶媒量が減少する。このため、標識層４３および固定化層４４に十分な量の試料液を供給することができる。
また、試料液を吸収するための吸収層４６が積層されているので、標識層４３および固定化層４４に含まれる余分な試料液を吸収することができる。なお、本実施形態では、吸収層４６を設ける構成としているが、必要に応じて設けない構成としても構わない。
さらに、標識層４３が試料導入層４２を兼ねる構成としても、その場合には標識層４３に試料液を直接点着することにより、免疫クロマトグラフィー用試験片４０に試料液を導入することができる。
実施例
以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
（実施例１）
本実施例では、上記実施形態１の免疫クロマトグラフィー用試験片１０を用いて検出対象物質の測定を行なった。なお、固定化部１４に留まった標識物質１５を目視で確認することによって、試料液内の検出対象物質を検出した。
−免疫クロマトグラフィー用試験片の作製−
ニトロセルロースメンブレン製の基材１１（幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍ）を１０ｍＭの塩化カルシウム水溶液に浸漬し、そのまま取り出して、水分が蒸発するまで乾燥し、試料導入部１２を形成した。次に、抗ＣＲＰ血清（免疫動物：ヤギ、コスモバイオ製）をアフィニティー精製し、標識物質として金コロイド粒子に感作させた抗ＣＲＰ抗体（５ｍｇ／ｍｌ）を標識抗体１５として、乾燥させた基材１１に５００μｌ担持させることにより標識部１３を形成した。次に、ニトロセルロースメンブレンに２００ｍｌの抗ＣＲＰモノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｍｌ：Ｏ−ＣＲＰ−ＭＣＡ、オリエンタル酵母社製）を滴下し乾燥させることによって、固定化抗体１６として抗ＣＲＰモノクローナル抗体を吸着させたニトロセルロースメンブレンを作製した。続いて、得られたニトロセルロースメンブレンを基材１１上に貼付して固定化部１４を形成し、図１に示す免疫クロマトグラフィー用試験片１０を得た。
作製した免疫クロマトグラフィー用試験片１０を用いて、ＥＤＴＡ−２Ｎａを３．７ｍｇ含有し、血糖、ＨｂＡ１およびＨｂＡ１ｃ測定用の採血管（ＦＡＬＣＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に採血量１ｍｌで採取したコントロール血液（ＣＲＰ１ｍｇ／ｄｌ）のうちの５０μｌを試料液として試料導入部１２に導入し、５分間室温でインキュベートした。
目視の結果、固定化部１４に金コロイドの赤紫色が確認できた。このことから、試料液中の検出対象物質であるＣＲＰを検出することができた。
なお、本実施例において、様々な濃度のＣＲＰを含有する血液を免疫クロマトグラフィー用試験片１０に適用し、デンシトメーターを用いて、固定化部１４における標識物質を測定したところ、血液中のＣＲＰ濃度と標識物質の濃度に比例関係があることを確認できた。
（比較例１）
実施例１と同様にコントロール血液（ＣＲＰ１ｍｇ／ｄｌ）５０μｌを試料液として、塩化カルシウム水溶液に浸漬しない以外、上記実施例１と同様に作製された免疫クロマトグラフィー用試験片に導入した。
目視の結果、固定化部に色の変化が生じなかったことから、試料液中の検出対象物質であるＣＲＰを検出することができなかった。
上記のように、本発明の免疫クロマトグラフィー用試験片によれば、キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、試料液中の検出対象物質を正確に測定することができる。
産業上の利用可能性
本発明は、環境測定、食品管理および医療診断の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、免疫クロマトグラフィー用試験片を表す模式図である。
図２（ａ）〜図２（ｃ）は、免疫クロマトグラフィー用試験片を用いた測定の原理を模式的に表す図である。
図３（ａ）〜図３（ｃ）は、免疫クロマトグラフィー用試験片の製造方法を示す工程図である。
図４（ａ）は、免疫クロマトグラフィー用試験片を表す上面図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）中に示す線Ｘ−Ｘに沿った断面図である。
図５は、従来の免疫クロマトグラフィー用試験片を用いた測定の原理を模式的に示す図である。

【書類名】明細書
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料液中の特定成分について、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施することができるクロマトグラフィー用試験片に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料液中の特定成分について、試料液の希釈や撹拌などを行なうことなく簡易に定量する方法として、ドライケミストリーが提案されている。
【０００３】
ドライケミストリーとは、フィルムや、試験紙のような固相マトリクスに乾燥状態で保存された試薬に対して、液状の試料を点着させて、試料液中の検出対象物質を測定する方法である。
【０００４】
ドライケミストリーに用いるデバイスとしては、濾紙に試薬を担持させた単層式と、展開層、反応層、試薬層などを積層させた多層式とがある。いずれのデバイスも、試薬が既に固相マトリクス上に担持されているため、試薬の調製が不要で、小スペースで保存でき、試料液量を少量しか必要としないこと等が特徴としてあげられる。
【０００５】
代表的なドライケミストリーによる検査法として、抗原抗体反応と毛細管現象を利用した検査法である免疫クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、特開平１０−７３５９２号公報に記載されている）。免疫クロマトグラフィーに用いるデバイスとしては、メンブレンフィルターに代表される試料液の溶媒を含浸する材料からなる固相マトリクスに、固定化された抗体（以下、固定化抗体と略称する）と標識物質により標識された抗体（以下、標識抗体と略称する）が、それぞれ乾燥状態で担持されている試験片がある。
【０００６】
測定の際に、図５（ａ）に示すように、検出対象物質１０４を含む試料液を試験片の一端から導入すると、図５（ｂ）に示すように、標識抗体１０５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている標識部１０２に、毛細管現象によって試料液が到達し、そこで標識抗体１０５と検出対象物質１０４との複合体１０７が形成される。さらに、図５（ｃ）に示すように、形成された複合体１０７は試料液の毛細管現象による流れに沿って、固定化抗体１０６が担持された固定化部１０３に到達し、ここで抗原抗体反応によって固定化抗体１０６に捕らえられる。複合体１０７以外のものは毛細管現象の流れにのり、固定化部１０３を通過するので、固定化部１０３には複合体１０８だけが残る。ここで、標識物質１０５に由来する出力を測定することによって、試料液中の検出対象物質１０４の検知や濃度の測定が可能になる。抗原抗体反応の形態としては、サンドイッチ型の反応のほかに競合型の反応を利用する免疫クロマトグラフィー法もあるが、試験片の構造および測定の方法は同様である。
【０００７】
免疫クロマトグラフィー法を利用した測定方法の利点としては、上記に示したドライケミストリーによる利点に加えて、操作の簡便性、迅速な判定、および測定コストの低下があげられる。従って、臨床検査に限らず、近年着目されているポイント・オブ・ケア（以下、ＰＯＣと略称する）においても、適用可能である。なお、ＰＯＣとは、医療現場において、検体採取から結果が出るまでの時間の短縮が最も重要視される臨床検査の総称である。
【特許文献１】特開平１０−７３５９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
実際の医療現場などで、上記のような免疫クロマトグラフィー法により検出対象物質を検出したり、検出対象物質の濃度を測定する際には、注射針を用いて採血管中に取り入れた血液の一部を試料液として用いる。
【０００９】
採血管には用途によって、いろいろな試薬が含まれている。例えば血糖、アルドステロン、またはプロスタグランジンＥ２測定用の採血管には、キレート剤であるＥＤＴＡなどが含まれている。また、ＥＧＴＡも同様にキレート効果が期待され、採血管に添加される可能性がある。さらにクエン酸、フタル酸、シュウ酸などのカルボン酸類も同様にキレート効果を示すことがあり、特にクエン酸は採血管に含まれていることが多い。
【００１０】
検出対象物質がタンパク質であり、且つそのタンパク質の構造内にカルシウムイオンなどの２価の金属イオンを含んでいる場合、上記のキレート効果を有する物質が試料液中に存在すると、キレート効果を有する物質がそれを取り込むため、２価の金属イオンが検出対象物質であるタンパク質の構造内より排出される。このため、その検出対象物質であるタンパク質の立体構造が変化してしまうことがある。
【００１１】
例えば、ＣＲＰは５つのサブユニットからなる五量体であり、５つのサブユニットのうちの４つにカルシウムイオンが含まれるが、キレート効果を有するＥＤＴＡ等と共に溶液内に存在すると、ＣＲＰ内よりカルシウムイオンが抜けて立体構造が変化する。また、採血後の血液の保存の状態が悪い場合にも、ＣＲＰからカルシウムイオンが脱落して立体構造が変化してしまうことがある。
【００１２】
免疫クロマトグラフィー法においては、２価の金属イオンが含まれた状態の検出対象物質に結合する抗体を用いているので、変化した構造の検出対象物質とは結合しない、あるいは検出対象物質と抗体とのアフィニティーに変化が生じることがある。このため、正確な結果が得られなくなるおそれがある。
【００１３】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、試料液中の検出対象物質を正確に測定することができるクロマトグラフィー用試験片を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のクロマトグラフィー用試験片は、試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片であって、試料導入部と、標識部と、固定化部とを有し、前記試料導入部に導入された前記試料液は、前記標識部を経て前記固定化部に移動するように前記試料導入部と、前記標識部と、前記固定化部とが配置された基材からなり、前記試料導入部、前記試料導入部から前記標識部までの間の部分、及び前記標識部の少なくともいずれかに金属塩が含まれている。
【００１５】
本発明によれば、検出対象物質が金属イオンを内部に保持する場合においても、検出対象物質がキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオンを放出し、その立体構造が変化しても、標識部に接触する前に、試料液が金属塩と接触する。このことにより、検出対象物質は、金属イオンを取り込んで元の立体構造に戻る。従って、キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、試料液中の検出対象物質を正確に測定・検出することができる。
【００１６】
前記金属塩は、前記基材の表面または内部に存在する構成としてもよい。
【００１７】
前記標識部は、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を含み、前記固定化部は、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を含む構成としてもよい。
【００１８】
前記第１結合物質および前記第２結合物質は、前記検出対象物質に特異的に結合する抗体である構成としてもよい。
【００１９】
このことによって、免疫クロマトグラフィーによる検出対象物質の測定を行なうことができる。
【００２０】
前記金属塩は、２価の金属イオンの塩である構成としてもよい。
【００２１】
前記２価の金属イオンは、カルシウムイオンである構成としてもよい。
【００２２】
前記第１結合物質および前記第２結合物質は、抗ＣＲＰ抗体である構成としてもよい。
【００２３】
前記金属塩は、塩化カルシウムである構成としてもよい。
【００２４】
本発明の別のクロマトグラフィー用試験片は、試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片であって、基材と、前記基材上に設けられ、金属塩を備えている試料導入層と、前記基材上に前記試料導入層に接触して設けられ、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含む標識層と、前記基材上に前記標識層に接触して設けられ、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を固定化された状態で含む固定化層とを備える。
【００２５】
本発明によれば、検出対象物質が金属イオンを内部に保持する場合においても、検出対象物質がキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオンを放出し、その立体構造が変化しても、標識部に接触する前に、試料液が金属塩と接触する。このことにより、検出対象物質は、金属イオンを取り込んで元の立体構造に戻る。従って、キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、試料液中の検出対象物質を正確に測定・検出することができる。また、本発明によれば、試料導入層が標識層に接触して設けられているため、試料液の展開の途中で失われる試料液中の溶媒量が減少する。このため、標識層および固定化層に十分な量の試料液を供給することができる。
【００２６】
前記基材上に前記固定化層に接触して設けられた、前記試料液を吸収するための吸収層をさらに備える構成としてもよい。
【００２７】
本発明のクロマトグラフィー用試験片の製造方法は、試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片の製造方法であって、基材シートを用意する工程（ａ）と、前記基材シートに、金属塩担持領域と、標識抗体含有領域と、固定化抗体領域とを、それぞれが互いに平行に延び、且つ、前記標識抗体含有領域が前記金属塩担持領域と前記固定化抗体領域との間に配置されるように形成する工程（ｂ）と、前記金属塩担持領域、前記標識抗体含有領域および前記固定化抗体領域に対して直交する方向に沿って短冊状に切断する工程（ｃ）とを含み、前記金属塩担持領域は、金属塩が担持されており、前記標識抗体含有領域は、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含み、前記固定化抗体領域は、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を固定化された状態で含む。
【００２８】
このことによって、試料液中の検出対象物質を正確に測定することができるクロマトグラフ試験片が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、図を参照しながら本発明の実施の形態を説明する。
【００３０】
（実施形態１）
本実施形態では、免疫クロマトグラフィー用試験片を図を参照しながら説明する。図１は、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を表す図であり、図２（ａ）〜図２（ｃ）は本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を用いたときの作用を模式的に表す図である。
【００３１】
図１に示すように、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片１０は、試料導入部１２と、標識部１３と、固定化部１４とを備える基材１１から構成されている。
【００３２】
基材１１は、検出対象物質を含む試料液の溶媒を含浸する材料から形成されており、例えば、ニトロセルロース性メンブレン、酢酸セルロース性メンブレン、ガラス繊維濾紙、不織布などの多孔質性材料から形成されている。特に、ニトロセルロース性メンブレンが好ましい。これらの材料は、毛細管現象によって試料液の溶媒を展開することができる。
【００３３】
試料導入部１２には、検出対象物質を含む試料液が導入（例えば、滴下）される領域であり、金属塩が担持されている。
【００３４】
標識部１３には、標識物質で標識された標識抗体１５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている。標識抗体１５は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
【００３５】
固定化部１４には、固定化抗体１６が固定化されている。固定化抗体１６は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
【００３６】
試料導入部１２に担持されている金属塩は、検出対象物質に応じて選択される。例えば、検出対象物質がカルシウムイオンが保持されているＣＲＰである場合、ＣＲＰの立体構造を保持するためにカルシウムイオンが供給されるようにカルシウム塩を用いる。勿論、このとき、標識部１３および固定化部１４にそれぞれ含まれる標識抗体１５および固定化抗体１６は、カルシウムイオンが保持されている抗ＣＲＰ抗体を用いる。
【００３７】
このように、検出対象物質に応じて、金属塩と、標識抗体１５および固定化抗体１６とが選択される。
【００３８】
検出対象物質を測定する際には、本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０では以下のような現象が起こる。
【００３９】
まず、図２（ａ）に示すように、免疫クロマトグラフィー試験片１０を用意し、検出対象物質１７を含む試料液を免疫クロマトグラフィー試験片１０の一端にある試料導入部１２に滴下する。次に、試料液の溶媒を試料導入部１２から固定化部１６に向かって展開すると、図２（ｂ）に示すように、標識部１３に、毛細管現象によって試料液が到達し、抗原抗体反応によって標識抗体１５と検出対象物質１７との複合体１８が形成される。形成された複合体１８は、試料液の毛細管現象による流れに沿って、固定化抗体１６が固定化された固定化部１３に到達し、ここで抗原抗体反応によって固定化抗体１６に捕らえられ、図２（ｃ）に示すように、複合体１９が形成される。このとき、複合体１８以外のものは毛細管現象の流れに沿って、固定化部１３を通過するので、固定化部１３には複合体１９だけが残存する。ここで、標識物質１５に由来する出力を測定（例えば反射吸光度などを測定）することによって、試料液中の検出対象物質１７の検出、試料液中の検出対象物質１７の濃度の測定が可能になる。
【００４０】
特に、本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０によれば、検出対象物質１７が金属イオンを内部に保持する場合においても、検出対象物質１７が採血管内等に含まれるキレート効果を有する物質と接触することによって金属イオンを放出し、その立体構造が変化しても、標識部１３に含まれる標識抗体１５に接触する前に、試料液が免疫クロマトグラフィー試験片１０に固定化された金属塩と接触する。このことにより、検出対象物質１７は、金属イオンを取り込んで元の立体構造に戻る。従って、キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、試料液中の検出対象物質１７を正確に測定・検出することができる。
【００４１】
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０では、標識部１３に標識物質で標識された標識抗体１５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている。具体的には、金コロイドで標識された抗体が挙げられるがこれに限定されない。例えば、標識抗体１５に代えて、標識物質で標識された酵素、リセプター、ＤＮＡなどの特異的配列を有する標識物質で標識されたヌクレオチド等を標識部１３に試料液中に溶出可能な状態で含めることによって、クロマトグラフィー用試験片としてもよい。
【００４２】
金属塩は、試料導入部１２、試料導入部１２から標識部１３までの間、及び標識部１３の少なくともいずれかに担持されていればよい。特に、試料導入部１２、または試料導入部１２に近い場所に担持されていると、検出対象物質１７と金属塩との反応時間がより長くなり、検出対象物質１７の立体構造が戻る効果が高くなるため、特に好ましい。
【００４３】
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０では、検出対象物質１７を特に限定しないが、金属塩をその構造内に含有するタンパク質を測定・検出することができる。検出対象物質１７としては、例えば、ＣＲＰ、トロポニン、カルモジュリン、パルブアルブミンなどが挙げられる。
【００４４】
本実施形態において、金属塩を構成する金属イオンは、検出対象物質１７に含まれる金属イオンのみに限定されない。例えば、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオンなどが挙げられる。
【００４５】
金属塩を構成する金属イオンが、検出対象物質１７に含まれる金属イオンと同じであると、検出対象物質１７と標識抗体１５および固定化抗体１６のそれぞれとのアフィニティーが低減しないので好ましい。
【００４６】
なお、金属塩は試料液中で溶解するものであれば特に限定されず用いることができる。特に、金属塩がハロゲン化物塩、硝酸塩、または硫酸塩であると、溶解性が高いため、本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０への担持が容易であり、かつ試料液中に金属イオンが容易に溶け出すので好ましい。
【００４７】
検出対象物質１７が、感染症のマーカーのひとつであるＣＲＰの場合、ＣＲＰはその構造内にカルシウムイオンを含んでいるので、２価の金属イオンの塩を構成する金属イオンがカルシウムイオンであることが好ましく、中でも２価の金属イオンの塩が塩化カルシウムであると、溶解性が高く、かつ安価なのでさらに好ましい。
【００４８】
試料液としては、水溶液および有機系溶液のいずれでもよく、例えば、体液、河川の水、海水、地下水、土壌や食品を溶解させた水溶液等が挙げられる。この中で体液としては、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗及び涙等が挙げられる。中でも、試料液が血液であることが好ましい。
【００４９】
本実施形態の免疫クロマトグラフィー試験片１０への金属塩の担持量は、試料液に含まれ得るキレート剤の濃度に合わせて調整すればよい。試料液として、採血管から血液を得る場合、採血管より得られた血液中のＥＤＴＡ濃度は、一般に３ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内であるので、この濃度範囲をカバーするような量の金属イオンが供給されるように金属塩を担持させておくことが好ましい。具体的には、ＥＤＴＡのモル濃度に対してカルシウムイオンのモル濃度が同等以上であることが好ましい。
【００５０】
標識抗体１５および固定化抗体１６は、ともに、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。ただし、モノクローナル抗体を用いる場合には、標識抗体１５と固定化抗体１６とが検出対象物質１７を介して結合する際に立体障害が生じないようにすることが好ましい。
【００５１】
標識抗体１５を標識する標識物質としては、例えば、着色物質、蛍光物質、燐光物質、発光物質、酸化還元物質、酵素、核酸、小胞体等が挙げられる。ここで、着色物質としては、金コロイド、銀コロイド、セレニウムコロイド、着色ラテックス、シアニン及びアゾ等が挙げられる。特に、金コロイド粒子が好適に用いられる。
【００５２】
蛍光物質としては、ピレン等の芳香族化合物、ダンシル等の芳香族化合物に官能基が置換してあるもの、フルオレセイン、ローダミンおよびクマリン等が挙げられる。燐光物質としては、ベンゾフェノン等が挙げられる。発光物質としては、ルシフェリンとＡＴＰとの発光反応を生じるものが挙げられる。酸化還元物質としては、グルコースとグルコースオキシダーゼとの酸化還元反応により電流を生じるものが挙げられる。小胞体としては、ミセルおよびリポソーム等が挙げられる。
【００５３】
次に、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片の製造方法を図３（ａ）〜（ｃ）を参照しながら説明する。
【００５４】
まず、図３（ａ）に示すように、基材シート３１を用意する。基材シート３１は、上述した基材１１と全く同じ材料で形成されたものであり、例えば、ニトロセルロース性メンブレン、酢酸セルロース性メンブレン、ガラス繊維濾紙、不織布などの多孔質性材料から形成されている。
【００５５】
次に、図３（ｂ）に示すように、基材シート３１に金属塩を溶解した溶液を含浸し、乾燥させることによって金属塩担持領域３２を、標識物質で標識された標識抗体を試料液中に溶出可能な状態で含ませることによって標識抗体含有領域３３を、固定化抗体を固定化することによって固定化抗体領域３４を、それぞれ形成する。勿論、このとき用いられる標識抗体および固定化抗体は、検出対象物質に特異的に結合するものである。金属塩担持領域３２、標識抗体含有領域３３および固定化抗体領域３４は、基材シート３１上にそれぞれ互いに平行に延びるように形成され、標識抗体含有領域３３が金属塩担持領域３２と固定化抗体領域３４との間に形成される。
【００５６】
次に、金属塩担持領域３２、標識抗体含有領域３３および固定化抗体領域３４に対して直交する方向に沿って短冊状に切断することによって、図３（ｃ）に示すように、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片１０が得られる。
【００５７】
（実施形態２）
上記実施形態１では、単層型の免疫クロマトグラフィー用試験片を参照しながら説明したが、本実施形態では多層型の免疫クロマトグラフィー用試験片を説明する。図４（ａ）は、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片を表す上面図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）中に示す線Ｘ−Ｘに沿った断面図である。
【００５８】
図４（ａ）および（ｂ）に示すように、本実施形態の免疫クロマトグラフィー用試験片４０は、基材４１と、基材４１上に設けられた標識層４３および固定化層４４と、基材４１上に設けられ、標識層４３に接触して設けられた試料導入層４２と、基材４１上に設けられ、固定化層４４に接触して設けられた吸収層４６とを備える。
【００５９】
基材４１を形成する材料としては、特に限定されないが、検出対象物質を含む試料液の溶媒を透過しない材料を用いることが好ましい。具体的には、ポリエチレンテレフタレートなどの樹脂が挙げられる。
【００６０】
試料導入層４２、標識層４３、固定化層４４および吸収層４６を形成する材料は、検出対象物質を含む試料液の溶媒を含浸する材料から形成されており、例えば、ニトロセルロース性メンブレン、酢酸セルロース性メンブレン、ガラス繊維濾紙、不織布などの多孔質性材料から形成されている。特に、ニトロセルロース性メンブレンが好ましい。これらの材料は、毛細管現象によって試料液の溶媒を展開することができる。なお、本実施形態では、試料導入層４２、標識層４３、固定化層４４および吸収層４６を形成する材料として、それぞれ不織布、ワットマン標識ろ紙、ニトロセルロースメンブレンおよびガラス繊維ろ紙が用いられている。
【００６１】
試料導入層４２には、検出対象物質を含む試料液が導入（例えば、滴下）される領域であり、金属塩が担持されている。
【００６２】
標識層４３には、標識物質で標識された標識抗体１５が試料液中に溶出可能な状態で含まれている。標識抗体（不図示）は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
【００６３】
固定化層４４には、固定化抗体４５が固定化されている。固定化抗体４５は、検出対象物質に特異的に結合するものが用いられる。
【００６４】
吸収層４６は、固定化層４４から試料液を吸収する。
【００６５】
本実施形態の多層型の免疫クロマトグラフィー用試験片４０によれば、試料導入層４２が標識層４３に接触して設けられているため、試料液の展開の途中で失われる試料液中の溶媒量が減少する。このため、標識層４３および固定化層４４に十分な量の試料液を供給することができる。
【００６６】
また、試料液を吸収するための吸収層４６が積層されているので、標識層４３および固定化層４４に含まれる余分な試料液を吸収することができる。なお、本実施形態では、吸収層４６を設ける構成としているが、必要に応じて設けない構成としても構わない。
【００６７】
さらに、標識層４３が試料導入層４２を兼ねる構成としても、その場合には標識層４３に試料液を直接点着することにより、免疫クロマトグラフィー用試験片４０に試料液を導入することができる。
【実施例】
【００６８】
以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
【００６９】
（実施例１）
本実施例では、上記実施形態１の免疫クロマトグラフィー用試験片１０を用いて検出対象物質の測定を行なった。なお、固定化部１４に留まった標識物質１５を目視で確認することによって、試料液内の検出対象物質を検出した。
【００７０】
―免疫クロマトグラフィー用試験片の作製―
ニトロセルロースメンブレン製の基材１１（幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍ）を１０ｍＭの塩化カルシウム水溶液に浸漬し、そのまま取り出して、水分が蒸発するまで乾燥し、試料導入部１２を形成した。次に、抗ＣＲＰ血清（免疫動物：ヤギ、コスモバイオ製）をアフィニティー精製し、標識物質として金コロイド粒子に感作させた抗ＣＲＰ抗体（５ｍｇ／ｍｌ）を標識抗体１５として、乾燥させた基材１１に５００μｌ担持させることにより標識部１３を形成した。次に、ニトロセルロースメンブレンに２００ｍｌの抗ＣＲＰモノクローナル抗体（２．５ｍｇ／ｍｌ：Ｏ−ＣＲＰ−ＭＣＡ、オリエンタル酵母社製）を滴下し乾燥させることによって、固定化抗体１６として抗ＣＲＰモノクローナル抗体を吸着させたニトロセルロースメンブレンを作製した。続いて、得られたニトロセルロースメンブレンを基材１１上に貼付して固定化部１４を形成し、図１に示す免疫クロマトグラフィー用試験片１０を得た。
【００７１】
作製した免疫クロマトグラフィー用試験片１０を用いて、ＥＤＴＡ−２Ｎａを３．７ｍｇ含有し、血糖、ＨｂＡ１およびＨｂＡ１ｃ測定用の採血管（ＦＡＬＣＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に採血量１ｍｌで採取したコントロール血液（ＣＲＰ１ｍｇ／ｄｌ）のうちの５０μｌを試料液として試料導入部１２に導入し、５分間室温でインキュベートした。
【００７２】
目視の結果、固定化部１４に金コロイドの赤紫色が確認できた。このことから、試料液中の検出対象物質であるＣＲＰを検出することができた。
【００７３】
なお、本実施例において、様々な濃度のＣＲＰを含有する血液を免疫クロマトグラフィー用試験片１０に適用し、デンシトメーターを用いて、固定化部１４における標識物質を測定したところ、血液中のＣＲＰ濃度と標識物質の濃度に比例関係があることを確認できた。
【００７４】
（比較例１）
実施例１と同様にコントロール血液（ＣＲＰ１ｍｇ／ｄｌ）５０μｌを試料液として、塩化カルシウム水溶液に浸漬しない以外、上記実施例１と同様に作製された免疫クロマトグラフィー用試験片に導入した。
【００７５】
目視の結果、固定化部に色の変化が生じなかったことから、試料液中の検出対象物質であるＣＲＰを検出することができなかった。
【００７６】
上記のように、本発明の免疫クロマトグラフィー用試験片によれば、キレート効果を有する物質を含む採血管等を用いて試料液を取り扱う場合であっても、試料液中の検出対象物質を正確に測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、環境測定、食品管理および医療診断の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、免疫クロマトグラフィー用試験片を表す模式図である。
【図２】図２（ａ）〜図２（ｃ）は、免疫クロマトグラフィー用試験片を用いた測定の原理を模式的に表す図である。
【図３】図３（ａ）〜図３（ｃ）は、免疫クロマトグラフィー用試験片の製造方法を示す工程図である。
【図４】図４（ａ）は、免疫クロマトグラフィー用試験片を表す上面図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）中に示す線Ｘ−Ｘに沿った断面図である。
【図５】図５は、従来の免疫クロマトグラフィー用試験片を用いた測定の原理を模式的に示す図である。

Claims

試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片であって、
試料導入部と、標識部と、固定化部とを有し、前記試料導入部に導入された前記試料液は、前記標識部を経て前記固定化部に移動するように前記試料導入部と、前記標識部と、前記固定化部とが配置された基材からなり、
前記試料導入部、前記試料導入部から前記標識部までの間の部分、及び前記標識部の少なくともいずれかに金属塩が含まれている、クロマトグラフィー用試験片。
請求項１に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記金属塩は、前記基材の表面または内部に存在する、クロマトグラフィー用試験片。
請求項１に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記標識部は、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を含み、
前記固定化部は、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を含む、クロマトグラフィー用試験片。
請求項３に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記第１結合物質および前記第２結合物質は、前記検出対象物質に特異的に結合する抗体である、クロマトグラフィー用試験片。
請求項１に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記金属塩は、２価の金属イオンの塩である、クロマトグラフィー用試験片。
請求項５に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記２価の金属イオンは、カルシウムイオンである、クロマトグラフィー用試験片。
請求項６に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記第１結合物質および前記第２結合物質は、抗ＣＲＰ抗体である、クロマトグラフィー用試験片。
請求項５に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記金属塩は、塩化カルシウムである、クロマトグラフィー用試験片。
試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片であって、
基材と、
前記基材上に設けられ、金属塩を備えている試料導入層と、
前記基材上に前記試料導入層に接触して設けられ、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含む標識層と、
前記基材上に前記標識層に接触して設けられ、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を固定化された状態で含む固定化層と、
を備える、クロマトグラフィー用試験片。
請求項９に記載のクロマトグラフィー用試験片において、
前記基材上に前記固定化層に接触して設けられた、前記試料液を吸収するための吸収層をさらに備える、クロマトグラフィー用試験片。
試料液に含まれる検出対象物質を測定するためのクロマトグラフィー用試験片の製造方法であって、
基材シートを用意する工程（ａ）と、
前記基材シートに、金属塩担持領域と、標識抗体含有領域と、固定化抗体領域とを、それぞれが互いに平行に延び、且つ、前記標識抗体含有領域が前記金属塩担持領域と前記固定化抗体領域との間に配置されるように形成する工程（ｂ）と、
前記金属塩担持領域、前記標識抗体含有領域および前記固定化抗体領域に対して直交する方向に沿って短冊状に切断する工程（ｃ）とを含み、
前記金属塩担持領域は、金属塩が担持されており、
前記標識抗体含有領域は、標識物質により標識された、前記検出対象物質に特異的に結合する第１結合物質を試料液中に溶出可能な状態で含み、
前記固定化抗体領域は、前記検出対象物質に特異的に結合する第２結合物質を固定化された状態で含む、クロマトグラフィー用試験片の製造方法。