CN1522368A - 层析用试验片及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
一种免疫层析用试验片(10),如图1所示,由备有样品导入部(12)、标记部(13)和固定化部的基材(11)构成。基材(11)由浸含有检测对象物质的样品液的材料形成。这些材料可以通过毛细管现象将样品液的溶剂展开。样品导入部(12)是导入(例如滴下)含有检测对象物质的样品的区域,负载着金属盐。在标记部(13)中含有可洗脱到样品液中状态的标记抗体(15)。用标记物质标记的标记抗体(15)使用可与检测物质特异结合的抗体。在固定化部(14)上固定固定化抗体(16)。固定化抗体(16)使用与检测对象物质特异结合的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及对于样品液中特定成分能够简便地进行迅速而且高精度的定量的层析用试验片。
背景技术
以往,作为对样品液中的特定成分不进行样品液的稀释或搅拌等而简易定量方法有干式化学法。
所谓干式化学法是将液体状的样品滴到以干燥状态保存在薄膜、试纸那样的固相基质中试剂上,对样品液中的检测对象物质进行测定的方法。
作为干式化学法中使用的装置,有使试剂负载在滤纸的单层式以及使展开层、反应层、试剂层等层叠的多层式。无论哪一种装置,由于试剂已经负载到固相基质上,都具有不需要制备试剂、可以保存在小的空间、需要的样品液量很少的特征。
作为代表性的干式化学检查法,如利用抗原抗体反应和毛细管现象的检查法即免疫层析(例如,特开平10-73592号公报记载)。作为免疫层析中使用的装置,有如下试验片,即,由在以膜滤片为代表的浸渍含样品液的溶剂的材料构成的固相基质上,分别以干燥状态负载了被固定的抗体(以下略称为固定化抗体)和用标记物质标记的抗体(以下略称为标记抗体)的试验片。
测定时,就象图5(a)所表示的那样,如果将含有检测对象物质104的样品液由试验片的一端导入的话,就象图5(b)所表示的那样,由于毛细管现象样品液到达含有可洗脱到样品液中状态的标记抗体105的标记部102,在那里通过抗原抗体反应形成标记抗体105和检测对象物质104的混合物107。然后就象图5(c)所表示的那样,形成的复合物107沿着由于样品液的毛细管现象形成的液流,到达负载了固定化抗体106的固定化部103,在那里通过抗原抗体反应被捕获在固定化抗体106上。复合物107以外的物质沿着毛细管现象的液流,通过固定化部103,所以在固定化部103只剩下了复合物108。因此,通过对来自标记物质105的输出,可以进行样品液中检测对象物质104的检测或浓度的测定。作为抗原抗体反应的状态,除了夹层型的反应以外,还有利用竞争型反应的免疫层析法,试验片的构造和测定的方法是同样的。
作为使用免疫层析法的测定方法的优点,除了上述的干式化学法带来的优点外,还有操作简便、判定迅速、以及测定的费用低等优点。因此不止适用于临床检查,也适用于在近年受到人们注目的即时检验(以下略称为POC)。所谓POC是在临床现场,最受到重视的缩短从检体採集到结果出来的时间的临床检查的总称。
在实际的医疗现场等,在利用上述那样的免疫层析法对检测对象物质进行检测或对检测对象物质的浓度进行测定时,将使用注射针採集到採血管的血液的一部分作为样品液使用。
对于採血管根据用途可以含有各种各样的试剂。例如在血糖、醛固酮、或前列腺素E2测定用的採血管中可以含有作为螯合剂的EDTA等。而EGTA也可以预期有同样效果,也可以添加到採血管中。另外柠檬酸、苯二甲酸、草酸等羧酸类也同样表现出螯合效果,特别是柠檬酸往往包含在採血管中。检测对象物质是蛋白质,而且其蛋白质的结构中含有钙离子等2价金属离子时,如样品液中含有具有上述螯合效果的物质,由于具有螯合效果的物质整合了金属离子,所以2价金属离子从作为检测对象物质的蛋白质的结构内被排除掉。由于金属离子被排除,该检测对象物质蛋白质的立体结构发生了变化。
例如,CRP是由5个亚基组成的五聚体,5个亚基中的4个都含有钙离子,如果与具有螯合效果的EDTA等共存在于溶液内,钙离子从CRP内脱落,立体结构发生变化。而在採血后的血液保存的状态不好时,有时钙离子从CRP脱落后,立体结构也发生变化。
在免疫层析法中,由于使用与含有2价金属离子状态的检测对象物质结合的抗体,因此,有时与结构变化了的检测对象物质不结合,或检测对象物质和抗体的亲和性发生了变化。因此,担心得不到正确的结果。
发明内容
本发明正是借鉴于上述事情而完成的发明,目的在于提供能够正确地测定样品液中检测对象物质的层析用试验片。
本发明的层析用试验片,是用于测定样品液中含有的检测对象物质的层析用试验片,含有样品导入部、标记部、固定化部,由配置了上述样品导入部、上述标记部和上述固定化部的基材构成,以便使被导入到上述样品导入部的上述样品液经上述标记部移动到上述固定化部,而且试验片至少在上述样品导入部、上述样品导入部到上述标记部之间的部分以及上述标记部中的任一个部位含有金属盐。
利用本发明,即使在检测对象物质在内部保持金属离子时,即使由于检测对象物质与具有螯合效果的物质进行接触,放出金属离子,其立体结构既便变化,在接触标记部之前,样品液与金属盐进行接触。由此,检测对象物质通过整合金属离子又回到原来的立体结构。因此使用含有有螯合效果物质的採血管等对样品液进行处理时,也能正确测定和检测样品液中的检测对象物质。
上述金属盐存在于上述基材的表面或内部。
上述标记部含有被标记物质标记的与上述检测对象物质特异结合的第1结合物质,上述固定化部含有与上述检测对象物质特异结合的第2结合物质。
上述第1结合物质和上述第2结合物质可以是与上述检测对象物质特异结合的抗体。
由此,能够进行基于免疫层析法的检测对象物质的测定。
上述金属盐可以是2价金属离子盐。
上述2价金属离子可以是钙离子。
上述第1结合物质和上述第2结合物质可以是CRP抗体。
上述金属盐可以是氯化钙。
本发明的其他层析用试验片,是用于测定样品液中含有的检测对象物质的层析用试验片,备有:基材;设置在上述基材上并且具有金属盐的样品导入层;在所述基材上与所述样品导入层接触而设置的、含有可洗脱到样品液中状态的通过标记物质标记的与上述检测对象物质特异结合的第1结合物质的标记层;在所述基材上与所述标记层接触而设置的、含有固定化状态的与上述检测对象物质特异结合的第2结合物质的固定化层。
利用本发明,即使在检测对象物质内部保持金属离子,通过检测对象物质与具有螯合效果的物质进行接触,放出金属离子,其立体结构即使变化,在接触标记部之前,样品液与金属盐进行接触。通过接触,检测对象物质通过整合金属离子又回到原来的立体结构。因此使用含有有螯合效果的物质的採血管等对样品液进行处理时,也能正确测定和检测样品液中的检测对象物质。另外,利用本发明,由于上述样品导入层是与标记层接触而设置的,所以在样品液的展开途中失去的样品液中的溶剂量减少。因此可以向标记层以及固定化层供给充足量的样品液。
试验片还可以备有在上述基材上与所述固定化层接触而设置的、用于吸收所述样品液的吸收层。
本发明的层析用试验片的制造方法,是作为用于测定样品液中含有的检测对象物质的层析用试验片的制造方法,包括:准备基材片的工序(a);在上述基材片上使金属盐负载区域、含有标记抗体区域、固定化抗体区域彼此相互平行延伸、而且以含有上述标记抗体区域被配置在金属盐负载区域和上述固定化抗体区域之间的方式形成的工序(b);沿着与所述金属盐负载区域、所述含有标记抗体区域、以及所述固定化抗体区域垂直的方向,切成长方形的工序(c),上述金属盐负载区域负载金属盐,上述含有标记抗体的区域含有可洗脱到样品液中状态的被标记物质标记的与上述检测对象物质特异结合的第1结合物质,上述固定化抗体区域含有固定化状态的与上述检测对象物质特异结合的第2结合物质。
通过该制造方法可以得到能够正确测定样品液中的检测对象物质的层析试验片。
附图说明
图1是表示免疫层析用试验片的模式图。
图2(a)~图2(c)是表示使用免疫层析试验片的测定的原理的模式图。
图3(a)~图3(c)是表示使用免疫层析试验片的制造方法的工序图。
图4(a)是表示免疫层析用试验片的上面图,图4(b)是沿着图4(a)中表示的X-X的剖面图。
图5是表示使用以往的免疫层析用试验片的测定原理的模式图。
具体实施方式
以下边参照图边对本发明的实施方式进行说明。
(实施方式1)
在本实施方式中,边参照图边对免疫层析用试验片进行说明。图1是表示本实施方式的免疫层析用试验片的图。图2(a)~图2(c)是表示本实施方式的使用免疫层析试验片时的作用的模式图。
就象图1所表示的那样,本实施方式的免疫层析用试验片10由备有样品导入部12、标记部13和固定化部14的基材11构成。
基材11由浸渍含有检测对象物质的样品溶液的溶剂的材料形成,例如由硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维滤纸、无纺布等多孔质性材料形成。其中硝酸纤维素膜特别理想。这些材料可以利用毛细管现象将样品液的溶剂展开。
样品导入部12是导入(例如、滴下)含有检测对象物质的样品液的区域,负载着金属盐。
标记部13含有可洗脱到样品液中状态的标记抗体15。标记抗体15使用可与检测物质特异结合的抗体。
在固定化部14固定着固定化抗体16。固定化抗体16使用与检测对象物质特异结合的抗体。
负载在样品导入部12的金属盐可以根据检测对象物质选择。例如,检测对象物质是保持钙离子的CRP时,为了保持CRP的立体结构使用能够供给钙离子的钙盐。不用说,此时在标记部13和固定化部14分别含有的标记抗体15和固定化抗体16可以使用保持钙离子的CRP抗体。
向上述那样,根据检测对象物质选择金属盐、标记抗体15和固定化抗体16。
对检测对象物质进行测定时,在本实施方式的免疫层析试验片10中会发生以下那样的现象。
首先,就象图2(a)所表示的那样,准备免疫层析试验片10,将含有检测对象物质17的样品液滴到处于免疫层析试验片10一端的样品导入部12。然后,将样品液的溶剂由样品导入部12向固定化部14展开,就象图2(b)所表示的那样,由于毛细管现象样品液到达标记部13,通过抗原抗体反应形成标记抗体15和检测对象物质17的复合物18。形成的复合物18沿着样品液毛细管现象形成的液流,到达固定了固定化抗体16的固定化部14,在那里通过抗原抗体反应被固定化抗体16捕获,就象图2(c)所表示的那样,形成复合物19。此时,复合物18以外的物质沿着毛细管现象的液流,通过固定化部14,所以在固定化部14只剩下了复合物19。因此,通过对来自标记物质15的输出(例如测定反射吸光度等)进行测定,可以进行样品液中检测对象物质17的检测、样品液中检测对象物质17的浓度的测定。
特别是利用本实施方式的免疫试验片10,即使在检测对象物质17内部保持金属离子,通过检测对象物质17与採血管内等含有的具有螯合效果的物质接触,放出金属离子,其立体结构即使变化,在接触标记部13含有的标记抗体15之前,样品液与固定在免疫试验片10的金属盐接触。通过接触,检测对象物质17整合金属离子后又回到原来的立体结构。因此即使使用含有有螯合效果的物质的採血管等对样品液进行处理时,也能正确测定和检测样品液中的检测对象物质17。
在本实施方式的免疫试验片10中的标记部13含有可洗脱到样品液中状态的用标记物质标记的标记抗体15。具体来说,如用胶体金标记的抗体,但并不限定于此。例如通过取代标记抗体15,在标记部13含有可洗脱到样品液中状态的用标记物质标记的酶、受体、用含有DNA等特异序列的标记物质标记的核苷酸等,也可以作为免疫用试验片。
金属盐至少在上述样品导入部12、上述样品导入部12到上述标记部13之间的部分以及上述标记部13的任一个部位含有。特别是在样品导入部12、或靠近样品导入部12的地方负载时,检测对象物质17和金属盐之间的反应时间变得更长,由于检测对象物质17的立体结构恢复效果变高,所以特别理想。
在本实施方式的免疫试验片10中,虽然没有特别限定检测对象物质17,但可以对其结构中含有金属盐的蛋白质进行测定和检测。作为检测对象物质17,如CRP、肌钙蛋白、钙调蛋白、微白蛋白等。
在本实施方式中,构成金属盐的金属离子并不只限定于检测对象物质17中含有的金属离子。其他的如钙离子、锶离子、锰离子、镁离子等。
构成金属盐的金属离子如果与检测对象物质17中含有的金属离子相同,由于检测对象物质17和标记抗体15以及固定化抗体16的各个亲和性没有降低,所以最理想。
另外只要是金属盐在样品液中可以溶解的,没有限定都可以使用。特别是金属盐是卤化物盐、硝酸盐、或硫酸盐时,由于溶解度高,向本实施方式的免疫层析试验片10的负载容易,而且金属离子容易洗脱到样品液中,所以最理想。
检测对象物质17是传染病的标记物之一的CRP时,由于CRP其内部含有钙离子,所以构成2价金属离子盐的金属离子是钙离子比较理想,其中如果2价的金属离子盐是氯化钙,由于溶解度高,而且便宜,所以更理想。
作为样品液,无论水溶液还是有机溶液都可以,例如体液、河水、海水、地下水、使土壤和食品溶解的水溶液等。其中作为体液,例如血液、血浆、血清、尿、唾液、汗以及泪等。这其中,样品液为血液比较好。
金属盐向本实施方式的免疫层析试验片10的负载量,可以根据样品液中含有的螯合剂的浓度进行调整。作为样品液,从採血管得到血液时,由于从採血管得到的血液中的EDTA浓度一般在3mM~10mM的范围内,所以负载能够供给覆盖上述浓度的那样量的金属离子的金属盐比较好。具体来说,钙离子的摩尔浓度相对于EDTA的摩尔浓度处于同等以上为好。
标记抗体15和固定化抗体16都可以是单克隆抗体,也可以都是多克隆抗体。但是,使用单克隆抗体时,最好是在标记抗体15和固定化抗体16通过检测对象物质17结合时不产生立体障碍。
作为标记抗体15的标记物质,如着色物质、荧光物质、磷光物质、发光物质、氧化还原物质、酶、核酸、内质网等。这里,作为着色物质如胶体金、胶体银、胶体硒、着色乳胶、花青以及偶氮染料等。胶体金特别适用。
作为荧光物质如芘等芳香族化合物、对丹酰等芳香族化合物进行官能团置换后的产物、荧光素、若丹明和香豆素等。作为磷光物质如二苯甲酮等。作为发光物质如产生虫荧光素和ATP的发光反应的物质。作为氧化还原物质如通过葡萄糖和葡萄糖氧化酶的氧化还原反应产生电流的物质。作为内质网如微胶粒和脂质体等。
下面边参照图3(a)~(c),边对本实施方式的免疫层析试验片10的制造方法进行说明。
首先就象图3(a)所表示的那样,准备基材片31。基材片31可以是用与上述基材11完全相同材料形成的,例如由硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维滤纸、无纺布等多孔质性材料形成。
然后,就象图3(b)所表示的那样,在基材片31中通过浸含溶解了金属盐的溶液、干燥后形成金属盐负载区域32,通过含有可洗脱到样品液中状态的用标记物质标记的标记抗体形成标记抗体含有区域33,通过对固定化抗体进行固定,形成固定化抗体区域34。不用说,此时用的标记抗体和固定化抗体是与检测对象物质特异结合的抗体。金属盐负载区域32、标记抗体含有区域33和固定化抗体区域34在基材片31上是沿着彼此互相平行方向形成的,标记抗体含有区域33在金属盐负载区域32和固定化抗体区域34之间形成。
然后通过沿着与金属盐负载区域32、标记抗体含有区域33、固定化抗体区域34垂直的方向,切成长方形,就象图3(c)所表示的那样,可以得到本实施方式的免疫层析用试验片10。
(实施方式2)
在上述实施方式1中,参照图对单层型的免疫层析用试验片进行了说明,在本实施方式中对多层型的免疫层析用试验片进行说明。图4(a)是表示本实施方式的免疫层析用试验片的上面的图,图4(b)是沿着图4(a)中表示的X-X的剖面图。
就象图4(a)和图4(b)所表示的那样,本实施方式的免疫层析用试验片40备有:基材41;在基材41上设置的标记层43和固定化层44;在基材41上设置的与标记层43接触的样品导入层42、在基材41上设置与固定化层44接触的吸收层46。
作为形成基材41的材料没有特别限定,最好使用不透过含有检测对象物质的样品液的溶剂的材料。具体来说,如聚对苯二甲酸乙二醇酯等树脂。
形成样品导入层42、标记层43、固定化层44和吸收层46的材料是由浸渍含有检测对象物质的样品液的溶剂的材料形成的,例如由硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃纤维滤纸、无纺布等多孔质性材料形成。其中硝酸纤维素膜特别好。这些材料可以利用毛细管现象将样品液的溶剂展开。另外在本实施方式中,作为形成样品导入层42、标记层43、固定化层44和吸收层46的材料可以使用无纺布、沃特曼滤纸、硝酸纤维素膜和玻璃纤维滤纸。
样品导入层42是导入含有检测对象物质的样品液的区域,负载金属盐。
标记层43含有可洗脱到样品液中状态的用标记物质标记的标记抗体15。标记抗体(没有图示)可以使用与检测对象物质特异结合的抗体。
固定化层44固定了固定化抗体45。固定化抗体45可以使用与检测对象物质特异结合的抗体。
吸收层46从固定化层44吸收样品液。
利用本实施方式的多层型的免疫层析用试验片40,由于样品导入层42设计成与标记层43接触,所以在样品液的展开的途中损失的样品液中的溶剂量减少。因此,可以向标记层43和固定化层44供给充足量的样品液。
另外由于用于吸收样品液的吸收层46层叠,所以可以吸收标记层43和固定化层44含有的多余的样品液。另外在本实施方式中,可以设置吸收层46,但根据需要也可以不设置吸收层。
另外,标记层43也可以兼任样品导入层42,这种现况下,通过将样品液直接点到标记层43上,可以将样品液导入免疫层析用试验片40中。
(实施例)
以下列举具体的实施例,对本发明进行更详细地说明。
(实施例1)
在本实施例中,使用上述实施方式1的免疫层析用试验片10进行检测对象物质的测定。另外通过对积存在固定化部14的标记物质15用目视进行确认,检测出样品液内的检测对象物质。
—免疫层析用试验片的制作—
将用硝酸纤维素膜制造的基材11(宽5mm,长50mm)浸渍到10mM的氯化钙水溶液中,原封不动取出,进行干燥直至水分蒸发掉,形成样品导入部12。然后对抗CRP血清(免疫动物:山羊,cosmobio制造)进行亲和纯化,将使标记物质胶体金离子致敏的抗CRP抗体(5mg/ml)作为标记抗体15,通过使500μl的抗体负载到干燥的基材11形成标记部13。然后将200ml的抗CRP单克隆抗体(2.5mg/ml:O-CRP-MCA,东方酵母公司制造)滴到硝酸纤维素膜上,通过使其干燥,制作吸附作为固定化抗体16的抗CRP单克隆抗体的硝酸纤维素膜。接着,将得到的硝酸纤维素膜贴到基材11上,形成固定化部14,得到图1所表示的免疫层析用试验片10。
使用制作的免疫层析用试验片10,将採集到含有3.7mg EDTA-2Na、血糖、HbA1和HbA1c测定用的採血管(FALC Obiosystems公司制造)的1ml採血量的对照血液(CRP1mg/dl)中的50μl作为样品液导入样品导入部12,于室温下温育5分钟。
通过目视,结果可以确认固定化部14中胶体金的紫红色。由此可以检测作为样品液中检测对象物质的CRP。
另外,在本实施例中,含有各种浓度的CRP的血液都适用于免疫层析用试验片10,使用密度计对位于固定化部14的标记物质进行测定时,可以确认血液中的CRP浓度与标记物质的浓度中存在比例关系。
(比较例1)
与实施例1同样,将对照血液(CRP1mg/dl)50μl作为样品液,除了没有浸渍氯化钙水溶液以外,导入到与上述实施例1同样制作的免疫层析用试验片。
目视结果由于在固定化部没有颜色的变化,所以不能检测样品液中检测对象物质CRP。
象上述那样,利用本发明的免疫层析用试验片,即使是使用含有有螯合效果的物质的採血管等对样品液进行处理时,也可以正确地测定样品液中的检测对象物质。
本发明可用于环境测定、食品管理以及医疗诊断的领域。
Claims (11)
1.一种层析用试验片,用于测定样品液中含有的检测对象物质,具有样品导入部、标记部、固定化部,由配置了上述样品导入部、上述标记部和上述固定化部的基材构成,以便使被导入到上述样品导入部的上述样品液经上述标记部而移动到上述固定化部,
至少在上述样品导入部、上述样品导入部到上述标记部之间的部分以及上述标记部中的任一个部位含有金属盐。
2.根据权利要求1所述的层析用试验片,其中,上述金属盐存在于上述基材的表面或内部。
3.根据权利要求1所述的层析用试验片,其中,上述标记部含有被标记物质标记的与上述检测对象物质特异结合的第1结合物质,
上述固定化部含有与上述检测对象物质特异结合的第2结合物质。
4.根据权利要求3所述的层析用试验片,其中,上述第1结合物质和上述第2结合物质是可以与上述检测对象物质特异结合的抗体。
5.根据权利要求1所述的层析用试验片,其中,上述金属盐是2价金属离子盐。
6.根据权利要求5所述的层析用试验片,其中,上述2价金属离子是钙离子。
7.根据权利要求6所述的层析用试验片,其中,上述第1结合物质和上述第2结合物质是抗CRP抗体。
8.根据权利要求5所述的层析用试验片,其中,上述金属盐是氯化钙。
9.一种层析用试验片,用于测定样品液中含有的检测对象物质,备有:
基材;
设置在上述基材上,备有金属盐的样品导入层;
在上述基材上与上述样品导入层接触而设置的、含有以可洗脱到样品中状态的通过标记物质标记的与上述检测对象物质特异结合的第1结合物质的标记层;
在上述基材上与上述样品导入层接触而设置的、含有固定化状态的与上述检测对象物质特异结合的第2结合物质的固定化层。
10.根据权利要求9所述的层析用试验片,其中,还备有在上述基材上与上述固定化层接触而设置的用于吸收上述样品液的吸收层。
11.一种层析用试验片的制造方法,是用于测定样品液中含有的检测对象物质的层析用试验片的制造方法,包括:
准备基材片的工序(a);
在上述基材片上使金属盐负载区域、含有标记抗体区域、固定化抗体区域彼此相互平行延伸、而且以含有上述标记抗体区域被配置在金属盐负载区域和上述固定化抗体区域之间的方式形成的工序(b);
沿着与所述金属盐负载区域、所述含有标记抗体区域、所述固定化抗体区域垂直的方向,切成长方形的工序(c),
上述金属盐负载区域负载金属盐,
上述含有标记抗体的区域含有可洗脱到样品液中状态的被标记物质标记的与上述检测对象物质特异结合的第1结合物质,
上述固定化抗体区域含有固定化状态的与上述检测对象物质特异结合的第2结合物质。
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