KR100908641B1 - 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지혈액 단백질의 분석방법 - Google Patents

칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지혈액 단백질의 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분석하고자 하는 단백질(항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 표면에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계와; 분석하고자 하는 단백질과 동일한 단백질에 표지시킨 표준 단백질을 준비하는 단계와; 상기 표준 단백질을 분석하고자 하는 단백질이 포함된 분석시료와 혼합하고, 항체가 고정된 단백질 칩의 표면에 적하하는 단계와; 상기 단백질 칩의 항체에 대하여 표준 단백질과 분석하고자 하는 단백질간의 경쟁적인 면역반응을 통해 나타나는 형광도를 형광 스캐너로 분석하는 단계;를 포함하는 단백질의 분석방법에 관한 것으로,
상기와 같은 분석방법은 분석하고자 하는 단백질이 함유된 분석시료의 표지 작업없이 미리 표지된 표준 단백질과의 경쟁적 반응을 통해 바로 분석이 가능하고 그 분석결과 또한 즉시 판독이 가능하므로 전체적인 분석시간을 줄일 수 있으며, 특히 다수의 혈액을 하나의 표준시료로 동시에 검사가 가능하므로 검사 비용의 절감 및 분석시간의 감소로 인하여 매우 높은 경제적인 효과를 가져올 수 있다.
단백질 칩, 항체, 항원, 혈액, 표지, 형광도

Description

칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법{Label-free analysis method of blood proteins with tagged-internal standards and chip technology}
도 1은 본 발명에 사용되는 단백질 칩의 제조과정을 설명하기 위한 도면
도 2는 본 발명의 혈액 단백질 분석방법을 설명하기 위한 도면
도 3a는 정상표준 혈청에서의 CRP 농도에 따른 형광도를 나타낸 이미지
도 3b는 정상표준 혈청에서의 CRP 농도에 따른 표준 검량곡선을 나타낸 그래프
도 4a는 다수의 혈액에서 본 발명에 따라 CRP의 양을 칩상에서 형광도로 분석한 결과를 나타낸 이미지
도 4b는 다수의 혈액에서 본 발명에 따라 분석한 CRP의 양과 탁도 면역검색법으로 분석한 CRP 양의 상관관계를 나타낸 그래프
본 발명은 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 심혈관 질환, 암 등의 환자 혈액 내에 존재하는 질병관련 단백질을 칩 형태의 기판을 이용하여 분석함에 있어 시료를 표지하지 않고 분석하고자 하는 단백질과 미리 표지된 표준 단백질과의 경쟁적 상호작용을 통해 분석하는 방법에 관한 것이다.
최근 게놈 프로젝트에 의해 인간 유전자는 약 10만여 개로 예측되고 있으며, 그 중 약 1만여 개의 기능이 밝혀져 있고, 이와 같이 밝혀진 유전자들의 대부분은 질환과 직접적인 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 대부분의 질병은 유전자 수준이 아닌 단백질 수준에서 유발되기 때문에, 현재까지 개발되었거나 개발 중에 있는 의약품의 95% 이상이 단백질을 표적으로 하고 있다.
이에 최근에는 혈액 또는 다른 생물학적 체액 내의 특정 단백질을 분석하여 질병에 대한 치료 및 예방법을 개발하는 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 상기와 같이 특정 단백질을 측정하고 분석하기 위하여 주로 단백질 칩이 연구 및 개발되고 있다.
이러한 단백질 칩은 작은 기판이나 슬라이드에 분석하고자 하는 목적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항원이나 항체 등의 단백질을 표면상에 고정시킨 후, 분석시료 내의 특정 단백질과의 상호작용(주로 면역 반응)을 이용하여 그 결합 결과를 분석함으로써 시료 내의 특정 단백질을 분석하는 것이다. 특히, 심혈관 질환, 암 등의 환자 혈액 내에 존재하는 질병관련 혈액 단백질을 분석하는데 유용하게 사용된다.
한편, 상기와 같은 단백질 칩을 기반으로 특정 단백질을 분석함에 있어, 분석시료 내의 분석대상물을 구별하고 검측하기 위해 표지(labeling) 작업을 시행하는 것이 필수적이며, 현재까지 알려진 표지(labeling) 방법으로는 유기 염료와 은을 이용한 염색방법(Organic dye and silver stain-based methods), 방사능 동위 원소 표지 방법 (Radioactive labeling methods), 형광 염색 방법 (Fluorescence-based staining methods), 화학 발광 염색 방법 (Chemiluminescence-based staining methods) 등이 사용되고 있다.
상기와 같은 표지 방법 중에서, 유기염료와 은을 이용한 염색방법은 낮은 검출 민감성 및 협소한 linear dynamic range로 인하여 사용의 한계성을 보이고 있으며, 방사능 동위 원소 표지 방법은 심각한 환경오염을 유발할 수 있고 값이 비싸다는 단점이 있다. 따라서, 최근에는 민감성과 재현성이 매우 높은 형광 염색방법이 가장 널리 이용되고 있다.
그러나, 상기한 형광 염색 방법은 분석시료 내의 모든 단백질을 형광염료로 표지해야하고, 표지 후에는 표지되지 않은 형광염료를 분리해야 되기 때문에 분석비용이 높고, 장시간의 분석시간이 요구되며, 특히 단백질을 표지하는 과정에서 단백질의 변성 등에 의한 활성도 감소가 발생될 수 있으며, 이로 인하여 실험적 오차가 생기기 때문에 정확한 분석이 어렵다는 문제점이 있다. 또한 이런 실험적 오차는 단백질의 분리 과정에서도 발생될 수 있어 분석방법상 전체적인 오차범위가 커지게 된다.
이와 같이 형광 염색 방법을 포함한 종래의 표지 방법들은 분석하고자 하는 단백질을 표지하게 됨에 따라 고비용 및 분석시간의 장기화, 정확성의 결여와 같은 다양한 문제점들을 내포하고 있으며, 이로 인하여 최근에는 단백질을 표지하지 않고 분석할 수 있는 비표지 방법에 대한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지는 그 연구결과가 미진한 실정이다.
이에 본 발명은 단백질 칩을 기반으로 혈액 내에 존재하는 질병 관련 단백질을 분석함에 있어 분석시료를 표지하지 않고, 분석하고자 하는 단백질과 미리 표지된 표준 단백질 간의 경쟁적 반응을 통하여 보다 쉽고 저비용으로 신속하면서도 정확한 분석이 가능한 비표지 혈액 단백질의 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
분석하고자 하는 단백질(항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 표면에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계와;
분석하고자 하는 단백질과 동일한 단백질에 표지(labeling)시킨 표준 단백질을 준비하는 단계와;
상기 표준 단백질을 분석하고자 하는 단백질이 포함된 분석시료와 혼합하고, 항체가 고정된 단백질 칩의 표면에 적하(spotting)하는 단계와;
상기 단백질 칩의 항체에 대하여 표준 단백질과 분석하고자 하는 단백질간의 경쟁적인 면역반응을 통해 나타나는 형광도(intensity)를 형광 스캐너(fluorescence scanner)로 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법을 제공함으로써 달성된다.
이하 본 발명에 따른 경쟁적 상호작용을 이용한 혈액 단백질의 분석방법에 대하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 단백질 칩을 기반으로 혈액 내에 존재하는 질병관련 단백질을 분석함에 있어, 분석하고자 하는 단백질(이하 '분석 단백질'이라 칭함)이 포함된 분석시료와, 상기 분석 단백질과 동일한 단백질에 구별 가능하도록 표지작업을 거친 표준 단백질을 혼합하고 단백질 칩에 적하하여, 분석 단백질과 표준 단백질의 경쟁적 면역을 통해 나타난 형광도(intensity)를 분석함으로써 분석 단백질을 포함하는 분석시료에 표지하지 않고 분석할 수 있는 비표지 혈액 단백질 분석방법을 제공한다.
상기와 같이 혈액 단백질을 분석함에 있어, 가장 첫 번째 단계로 분석 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 표면상에 고정된 단백질 칩을 제조한다. 이와 같은 단백질 칩은 종래 통상적으로 사용되어온 모든 단백질 칩이 적용 가능하나, 본 발명에 가장 유용하게 사용될 수 있는 단백질 칩에 대해서 도면에 첨부된 도 1을 참고로 하여 하기와 같이 설명한다.
도 1은 본 발명에 사용되는 단백질 칩의 제조과정을 설명하기 위한 도면이다.
먼저, 기판을 3-아미노프로필트리메톡시실란 (aminopropyltrimethoxysilane)이 함유된 용액에 침적하여 기판의 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 도입하는 단계를 거치게 된다.
여기서 3-아미노프로필트리메톡시실란 함유용액은 에탄올과 같은 알코올류 용매에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 용해시켜 제조된 것으로서, 본 발명에서는 작업의 편의성을 고려하여 에탄올에 3-아미노프로필트리메톡시실란이 1 내지 2중량% 함유되도록 하나, 반드시 그 농도를 한정할 필요는 없다.
기판의 침적시간은 적어도 2시간 실시하면 충분하며, 2시간 정도 경과한 후에는 기판을 에탄올과 증류수로 번갈아가며 5분씩 3번 세척한 다음, 110℃ 오븐에서 1시간 동안 건조하게 되면 기판의 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된다.
이때, 기판은 당해분야에서 널리 사용되는 금속 기판이나 슬라이드 글라스 기판이 사용될 수 있으며, 상기 기판은 사용 전에 충분히 세정한 후 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 100중량부에 대하여 과산화수소(H2O2) 10 내지 40중량부와 암모니아수(NH4OH) 10 내지 40중량부를 혼합한 세정액에 적어도 10분간 침적하여 세정한 다음에 사용한다.
상기한 단계를 거쳐 기판의 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 도입시 킨 후, 상기 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 3-아미노프로필트리메톡시실란이 노출된 다수의 스폿(spot)을 갖는 어레이(array) 칩을 제조하는 단계를 거치게 된다.
스폿의 수는 기판의 크기나 스폿의 모양 등에 따라 임의적인 선택이 가능하며, 테이프는 반응성이 적은 테플론 테이프 등이 사용될 수 있다.
다음 단계로서, 상기와 같이 제조된 어레이(array) 칩의 스폿(spot)에 3-아미노프로필트리메톡시실란과 카르복실기로 개질된 라텍스 비드(carboxylate modified latex bead)를 반응시켜 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 라텍스 비드를 도입하는 단계를 거치게 된다.
여기에서 카르복실기로 개질된 라텍스 비드는 당해분야 즉, 단백질 분석칩 분야에서 일반적으로 사용되는 것을 적용하면 되며, 본 발명에서는 500㎚ 크기의 라텍스 비드를 사용한다.
이와 같이 라텍스 비드를 도입하는 것은 후술하는 프로테인 G(Protein G)를 용이하게 도입하기 위하여 실시하는 것이며, 카르복실기로 개질된 라텍스 비드와 3-아미노프로필트리메톡시실란을 반응시키면 카르복실기와 아민기의 상호 반응에 의하여 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 라텍스 비드가 도입되게 된다.
이 때 보다 원활한 반응을 위하여 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 존재하에서 반응시켜 활성화시킨 다음, 상기 반응 용액을 3-아미노프로필트리메톡시실란 층에 적하하여 반응시키는 것이 좋으 며, 이러한 과정을 거치면 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 라텍스 비드가 도입되게 된다.
여기서 카르보디이미드는 촉매로서의 역할로 카르복시기를 활성화시켜 라텍스 비드의 카르복실기 말단(-OH)에 N-하이드록시쑥신이미드가 용이하게 치환될 수 있도록 도와주는 역할을 한다.
상기 카르보디이미드로는 당해분야에서 일반적으로 사용되는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)나 N,N'-디싸이클로헥실 카르보이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide; DCC) 또는 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide)에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
이와 같은 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드의 혼합용액에 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 넣은 다음, 이 용액을 3-아미노프로필트리메톡시실란에 적하하여 약 20분간 방치하면 전술한 반응이 이루어진다. 이 때 적하량은 스폿을 충분히 덮을 정도의 량이면 되는데, 이하의 설명에서도 적하량은 스폿을 충분히 덮을 정도의 량을 나타낸다. 이때 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드의 혼합용액에 첨가되는 카르복실기로 개질된 라텍스 비드의 첨가량은 반드시 한정할 필요는 없으나, 본 발명에서는 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드의 혼합용액 100중량부에 대하여 카르복실기로 개질된 라텍스 비드 20 내지 50중량부 첨가하며, 더욱 바람직하게는 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드의 혼합용액에 동일량의 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 첨가하여 희석한다. 아울러 카르보디이미드는 N-하이드록시쑥신이미드와 다양한 당량비율로 혼합하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 2~4:1의 당량비율이 되도록 혼합한 것을 사용하였으나, 필요에 따라서는 다양하게 변화가 가능하다.
이와 같은 반응으로 라텍스 비드가 도입된 기판을 PBST(Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20; 인산완충식염수에 Tween 20을 0.1% 함유되도록 첨가하여 제조된 용액임)나 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 라텍스 비드가 도입되게 된다. 여기서 PBST는 pH7.2~7.6의 범위에 있는 것을 사용하면 된다.
그 다음 단계로서, 상기와 같이 도입된 라텍스 비드 상에 프로테인 G가 용해된 소듐 아세테이트 완충용액(sodium acetate buffer)을 적하하여 라텍스 비드에 프로테인 G를 도입하며, 상기 프로테인 G는 다음 단계에서 도입되는 항체(antibody)의 Fc 부분과 결합력을 갖고 있는 물질이다.
이와 같이 라텍스 비드 상에 프로테인 G가 도입되는 것은, 프로테인 G에 포함된 아민기와 라텍스 비드의 카르복실기와의 반응에 의해 이루어진다. 따라서 보다 용이하게 라텍스 비드에 프로테인 G를 도입하기 위해서는 라텍스 비드 상에 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 혼합용액을 적하하여 라텍스 비드의 카르복실기를 활성화시킨 다음 여기에 소듐 아세테이트 완충용액에 용해된 프로테인 G를 용해시킨 것을 적하하는 것이 바람직하다.
카르보디이미드는 전술한 바와 같이 촉매로서의 역할을 수행하며 카르복시기를 활성화시켜 라텍스 비드의 카르복실기 말단(-OH)에 프로테인 G가 용이하게 도입될 수 있도록 도와주는 역할을 한다. 마찬가지로 상기 카르보디이미드로는 당해분 야에서 일반적으로 사용되는 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드나 N,N'-디싸이클로헥실 카르보이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide; DCC) 또는 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide)에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 아울러 카르보디이미드는 N-하이드록시쑥신이미드와 다양한 당량비율로 혼합하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 전술한 바와 같이 2~4:1의 당량비율이 되도록 혼합한 것을 사용하였다.
이상과 같이 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드의 혼합용액을 라텍스 비드 상에 적하한 후 약 10분간 방치하면 라텍스 비드의 카르복실기가 활성화되며, 이 상태에서 프로테인 G가 용해된 소듐 아세테이트 완충용액을 적하한 후 적어도 2시간 방치하면 라텍스 비드에 프로테인 G가 도입되게 되며, 두 시간 정도 경과하여 반응이 완료되면 PBST나 증류수 등으로 세척한 후 건조한다. 이 때 소듐 아세테이트 완충용액은 pH4~5의 범위내로 제조된 것을 사용한다.
그 다음 단계로서, 상기와 같이 프로테인 G가 도입된 라텍스 비드 상에 분석 단백질과 특이적으로 결합(항원·항체 반응을 통한 결합)하는 항체(antibody)가 용해된 인산 완충용액(phosphate buffer)을 적하하여 프로테인 G에 항체 단백질을 도입함으로써 어레이 타입의 단백질 칩의 제조를 완료하게 된다. 상기 프로테인 G는 항체 또는 항원의 Fc 부분과 결합력을 갖고 있어 용이하게 도입된다. 이 때 사용되는 인산 완충용액은 pH7~8의 범위내로 제조된 것을 사용하며, 항체를 도입한 후 두 시간 정도 경과하여 반응이 완료되면 PBST나 증류수 등으로 세척한 후 건조한다.
이때 분석의 정확도를 높이기 위하여, 상기와 같이 제조된 단백질 칩의 항체 와 결합되지 않은 스폿의 빈부분을 블로킹(blocking)시키는 것이 바람직하다. 이러한 블로킹은 BSA(Bovine serum albumin), 표준혈청(normal serum) 또는 탈지유(skim milk) 등으로 처리하게 된다. 본 발명에서는 PBST(Tween 20가 포함된 phosphate buffered saline)에 BSA가 1~10중량% 포함되도록 용해시켜 얻은 블로킹 용액을 적하하여 1시간동안 방치하여 블로킹시킨다. 이와 같이 블로킹이 완료되면 PBST나 증류수 등으로 세척하고 건조하게 되면 항체가 도입되지 않은 빈부분에 BSA가 도입되게 되며, 이 BSA는 후술하는 단계의 반응에 영향을 주지 않게 되어 분석 정확도를 높이는데 기여하게 된다.
상술한 바와 같이 실시하여 제조된 항체가 도입된 어레이 타입의 단백질 칩은 후술하는 단계를 통해 혈액 내의 질병관련 단백질을 분석하는데 사용되며, 이에 대하여 도면에 첨부된 도 2를 참고로 하여 하기와 같이 설명한다.
도 2는 본 발명의 단백질 분석방법을 설명하기 위한 도면이다.
전술한 과정을 통해 제조된 단백질 칩이 준비되면, 이와 별도로 분석 단백질과 동일한 단백질에 분석 단백질과 구별되도록 표지시킨 표준 단백질을 준비한다. 이러한 표지는 주지된 Alexa 시리즈를 비롯하여 Cy3(green), Cy5(red), FITC(green), Alexa, BODIPY, Rhodamine, Q-dot와 같은 형광염료를 사용하여 형광표지할 수도 있으며, 최근 생명과학분야에서 널리 사용되고 있는 바이오틴(biotin)으로도 표지할 수 있다. 이러한 바이오틴으로 결합된 단백질은 형광염료나 HRP가 결합된 아비딘을 이용하여 형광으로 표지하거나 발색반응을 통해 분석할 수 있다.
상기의 표준 단백질을 분석 단백질이 포함된 분석시료와 마이크로퓨즈 튜브 등과 같은 용기에 균일하게 혼합한 다음 항체가 고정된 단백질 칩의 표면에 적하(spotting)하는 단계를 거치게 된다. 상기 표준 단백질과 분석시료의 혼합비율은 특별하게 한정되지는 않지만, 분석의 객관성을 유지하기 위하여 1:1의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 혼합된 분석시료와 표준 단백질의 혼합물을 전술한 방법으로 제조된 단백질 칩의 스폿(spot)에 적하하게 되면, 단백질 칩에 고정된 항체와 결합하기 위하여 분석 단백질과 표준 단백질은 상호 경쟁적인 반응을 하게 된다. 즉, 분석시료 내의 분석 단백질의 함유량에 따라 단백질 칩에 결합될 수 있는 표준 단백질의 양이 달라지게 되며, 이에 따라 단백질 칩에 나타나는 형광도(intensity)는 분석시료 내의 분석 단백질의 함유량에 따라 다르게 나타난다.
예를 들어, 분석시료 내에 분석 단백질이 적게 함유되었을 경우 확률적으로 단백질 칩에는 표지된 표준 단백질이 분석 단백질 보다 더 많이 결합하기 때문에 이때 형광도는 비교적 밝게 나타난다. 반대로, 분석시료 내에 분석 단백질이 많이 함유되었을 경우 확률적으로 단백질 칩에 결합되는 표준 단백질의 양이 감소하기 때문에 이때 형광도는 다소 어둡게 나타난다.
이와 같이 표준 단백질과 분석 단백질의 경쟁적인 상호 작용을 통하여 나타나는 형광도(intensity)를 형광 스캐너(fluorescence scanner)로 그 세기를 측정함으로써, 분석시료 내의 분석 단백질의 포함 유무와 농도를 판별할 수 있다.
상기와 같은 분석방법에 있어서, 분석 단백질의 농도에 따라 형광도가 세기 별로 기재된 대조표를 동시에 제작하면, 분석과정에서 나타난 단백질 칩의 형광도를 제작된 대조표의 형광도와 비교 분석함으로써 분석 단백질의 농도를 즉각적으로 정량 분석할 수 있다.
이상과 같이 설명한 단계를 거쳐 시행되는 단백질 분석 방법은 종래처럼 분석 단백질이 함유된 분석시료 전체를 표지하지 않고 미리 표지된 표준 단백질과의 경쟁적 반응을 통해 단시간에 분석이 가능하고 그 분석결과 또한 즉시 판독이 가능하므로 전체적인 분석시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 특히 다수의 혈액 단백질을 하나의 표준물질을 이용해 동시에 검사가 가능하므로 검사 비용의 절감 및 분석시간의 감소로 인하여 매우 경제적이라는 것이다.
또한, 종래 분석 시료를 표지하는 과정에서 발생될 수 있는 단백질의 변성에 의한 단백질 활성도 감소 및 분석시료 내 표지물질의 분리작업이 생략되어, 이로 인한 오차 발생의 문제점을 해결할 수 있어 보다 정확한 분석이 가능하게 된다.
상기와 같은 본 발명의 단백질 분석방법은 심혈관 질환, 암 등의 환자 혈액 내에 존재하는 다양한 질병관련 단백질을 분석하는 것으로 한정되는 것이 아니라, 모든 단백질 분석에 적용할 수 있음은 당연한 바, 더 나아가서는 뇨 단백질이나 타액 단백질과 같은 인간과 동물의 생물학적 체액을 비롯한 세포내 단백질 등 모든 형태의 단백질을 분석하는데 적용할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아 니다.
<제조예>
-단백질 칩의 제조-
에탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란이 1.5중량% 함유되도록 용해시켜 제조한 용액에 슬라이드 글라스를 2시간 동안 침적한 다음 에탄올과 증류수로 세척하고, 110℃ oven에서 1시간동안 건조하여 슬라이드 글라스 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 도입하였다. 이때 슬라이드 글라스는 70℃의 세정액(H2O2:NH4OH:dH2O = 1:1:5)에서 10분간 침적하여 세정한 것을 사용하였다.
펀치를 이용하여 직경 1.5mm의 스폿을 형성한 테플론 테이프를 상기 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된 슬라이드 글라스 표면에 부착하여 200(8×25)개의 스폿을 갖는 어레이 칩을 제조하였다.
PBS로 세척한 500×100nm 크기의 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 200mM EDC와 50mM NHS의 혼합용액에 동일양으로 첨가한 다음 어레이 칩의 스폿에 적하하여 20분간 방치한다. 이후 0.1% Tween 20 포함된 PBS로 1시간 동안 세척해 준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기를 불어주면서 건조하여 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 라텍스비드를 도입하였다.
상기 라텍스 비드 위에 다시 200mM EDC와 50mM NHS 혼합용액을 적하한 후 10분간 방치하고, 증류수로 세척한 다음 공기를 불어주면서 건조하였다. 그런 다음 프로테인 G가 500 ㎍/㎖의 농도로 용해된 소듐 아세트산 완충용액(pH4.5)을 적하하 고, 2시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치하였다. 이후 0.1% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 에어로 건조하여 라텍스 비드에 프로테인 G를 도입하였다.
상기 프로테인 G 위에 항체(anti-CRP)가 200 ㎍/㎖의 농도로 용해된 인산완충용액(pH7.4)을 적하하고, 2시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치한 후, 0.1% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척하고 다시 5분간 증류수로 세척해준 다음, 에어로 건조하여 라텍스 비드에 항체(anti-CRP)를 도입하였다.
상기 항체(anti-CRP)가 도입된 라텍스 비드에 PBST(0.1중량% Tween 20가 포함된 Phosphate buffered saline)에 BSA를 3중량%가 되도록 첨가한 블로킹 용액을 적하하고 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치한 후 0.1% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 에어로 건조하여 어레이 타입의 단백질 칩을 제조하였다.
<실시예 1>
항원(CRP)에 형광물질인 Alexa546으로 표지시킨 1 ㎍/㎖ 농도의 표준 단백질과 5중량% BSA가 포함된 PBST(0.1중량% Tween 20가 포함된 phosphate buffered saline)로 농도별로 희석한 비표지 항원(CRP)을 각각의 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)에 동일 중량비율로 혼합한 후, 제조예에서 만들어진 항체가 붙어있는 단백질 칩의 상단에 적하하고, 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치한 다음, 1% Tween 20 포함된 PBS로 1시간 동안 세척하고 다시 5분간 증류수로 세척한 후 에어로 건조하였다. 상기 단백질 칩의 스폿 부분에 나타난 형광도를 형광 스캐 너(Scan Array Lite; GSI Lumonics. Kanata, Ontario, Canad)로 스캐닝하여 그 이미지를 도 3a에 나타내었고, 항원의 농도에 따른 표준 검량곡선을 도 3b에 나타내었다.
이와 함께, 분석하고자 하는 단백질이 함유된 혈액을 5중량% BSA가 포함된 PBST로 10배 희석한 분석시료와 상기의 표준시료를 혼합하고, 전술한 방법과 동일한 방법으로 단백질 칩을 통해 분석하여 그 형광도를 스캐닝하였으며, 상기 스캐닝된 이미지를 도 4a에 나타내었고, 표준 검량곡선에 대입하여 얻은 항원(CRP)의 양과 임상적으로 널리 사용되고 있는 항원의 농도탁도 면역검색법(turbidimetry immunoassay)으로 분석한 항원(CRP)의 양을 비교하여 그 상관관계를 도 4b에 나타내었다(n = 69, r = 0.96268, p < 0.0001).
이에 도시된 바와 같이 항원(CRP) 분석시스템을 사용하여 얻은 항원(CRP)의 양과 농도탁도 면역검색법을 통해 얻은 항원(CRP)의 양 사이에 매우 높은 상관관계가 있음을 확인할 수 있으며, 따라서 매우 정확한 단백질 분석이 가능함을 알 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 혈액 단백질의 분석방법은 분석하고자 하는 단백질이 함유된 분석시료의 표지 작업없이 미리 표지된 표준 단백질과의 경쟁적 반응을 통해 바로 분석이 가능하고 그 분석결과 또한 즉시 판독이 가능하므로 전체적인 분석시간을 줄일 수 있으며, 특히 다수의 혈액을 하나의 표준시료로 동시에 검 사가 가능하므로 검사 비용의 절감 및 분석시간의 감소로 인하여 매우 높은 경제적인 효과를 가져올 수 있다.
또한, 본 발명의 분석방법은 종래 분석 시료를 표지하는 과정에서 발생될 수 있는 단백질의 변성에 의한 단백질 활성도 감소를 방지하고 분석시료의 형광염료의 분리작업이 생략되어, 이로 인한 오차 발생의 문제점을 해결할 수 있어 보다 정확한 분석이 가능하다는 또 다른 효과를 가져올 수 있다.

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 분석하고자 하는 단백질(항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 표면에 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 단계와; 분석하고자 하는 단백질과 동일한 단백질에 표지시킨 표준 단백질을 준비하는 단계와; 상기 표준 단백질을 분석하고자 하는 단백질이 포함된 분석시료와 혼합하고, 항체가 고정된 단백질 칩의 표면에 적하(spotting)하는 단계와; 상기 단백질 칩의 항체에 대하여 표준 단백질과 분석하고자 하는 단백질간의 경쟁적인 면역반응을 통해 나타나는 형광도(intensity)를 형광 스캐너(fluorescence scanner)로 분석하는 단계;를 포함하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법에 있어서,
    상기 단백질 칩은 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane) 함유용액에 기판을 침적하여 기판의 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 도입하는 단계와;
    상기 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 3-아미노프로필트리메톡시실란이 노출된 다수의 스폿(spot)을 갖는 어레이(array) 칩을 제조하는 단계와;
    상기 어레이 칩의 3-아미노프로필트리메톡시실란과 카르복실기로 개질된 라텍스 비드(carboxylate modified latex bead)를 반응시켜 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 라텍스 비드를 도입하는 단계와;
    상기 라텍스 비드가 도입된 어레이 칩에 프로테인(Protein) G가 용해된 소듐 아세테이트 완충용액(sodium acetate buffer)을 적하하여 라텍스 비드에 프로테인 G를 도입하는 단계와;
    상기 프로테인 G가 도입된 어레이 칩에 항체(antibody)가 용해된 인산 완충용액(phosphate buffer)을 적하하여 프로테인 G에 항체를 도입하는 단계;에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 어레이 칩에 항체를 도입한 후 항체와 결합되지 않은 스폿의 빈부분을 블로킹(blocking) 용액으로 처리하여 블로킹시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  4. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서,
    상기 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 라텍스 비드를 도입하는 단계에서 카르복실기로 개질된 라텍스 비드를 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 존재하에서 반응시켜 카르복실기를 활성화시킨 다음 이 반응 용액을 3-아 미노프로필트리메톡시실란에 적하하여 반응시키는 것임을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 카르보디이미드가 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드나 N,N'-디싸이클로헥실 카르보이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide; DCC) 또는 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide)에서 선택된 것임을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 라텍스 비드에 프로테인 G를 도입하기 전에 3-아미노프로필트리메톡시실란의 아민기 말단에 도입된 라텍스 비드 상에 N-하이드록시쑥신이미드와 카르보디이미드 혼합용액을 적하하여 라텍스 비드의 카르복실기를 활성화시킨 다음 여기에 프로테인(Protein) G가 용해된 소듐 아세테이트 완충용액을 적하하는 것임을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 카르보디이미드가 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하 이드로클로라이드나 N,N'-디싸이클로헥실 카르보이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide; DCC) 또는 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide)에서 선택된 것임을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  8. 청구항 2에 있어서,
    상기 표준 단백질은 Alexa 시리즈를 비롯하여 Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, Rhodamine, Q-dot중에 선택된 하나를 사용하여 형광표지된 것임을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  9. 청구항 2에 있어서,
    상기 표준 단백질는 바이오틴(biotin)으로 표지된 것임을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  10. 청구항 8 또는 청구항 9에 있어서,
    상기 분석하고자 하는 단백질은 혈액 내에 존재하는 질병관련 단백질(항원)임을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 형광 스캐너에 의해 단백질 칩의 형광도(intensity)를 분석한 후 미리 제작된 표준 단백질의 농도에 따른 형광도가 세기별로 기재된 대조표와 비교 분석하여 분석하고자 하는 단백질의 농도를 산출하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 칩 기술을 기반으로 하는 경쟁적 상호작용을 이용한 비표지 혈액 단백질의 분석방법.
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