JPH03503081A - 数種の被検物質の環境内濃度の定量 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 数種の被検物質の環境内濃度の定量 発明の分野 本発明は、液体中の被検物質の環境内濃度の定量、たとえば、体液のよう々生物 学的液体中のホルモン、タンパク質および他の天然にまたは人為的に存在する物 質のよりな被検物質の定量に関する。

発明の背景 本発明者は、国際特許出願ｗｏ８４１０１０３１に、液体中の被検物質の濃度を 測定するにあたシ、その液体を、被検物質と可逆的に結合するが液体中の他の成 分とは結合しないという意味で被検物質に対して特異的な１．抗体のような結合 剤の痕跡量と接触させ、結合剤上の結合部位の占拠の比ａｔ示す量を測定し、そ の量から被検物質の濃度を算出する方法を、先に提案した。その出願において、 本発明者は、結合剤の量がそれを液体中に導入しても環境内（非結合）被検物質 の濃度の有意な減少を生じない程に十分少ない場合には、結合剤上の結合部位の 被検物質による占拠の割合は液体の絶対容量および結合剤の絶対量とは事実上独 立であること、すなわち、占拠の割合の測定値に通常伴う誤差の限界内で独立で あることを指摘している。このような環境では、そしてこのような環境でのみ、 液体中の被検物質の初期濃度〔Ｈ〕は、結合剤上の結合部位の被検物質によって 占拠された分画（Ａｂ　／　Ａｂｏ　）とは次式の関係がある。

る被検物質の結合に関する平衡定数で、与えられた被検物質および結合剤につい て、任意の温度において一定である。この定数は、とくに結合剤が抗体、たとえ ばモノクローナル抗体である場合、一般に親和性定数として知られている。

痕跡量の結合剤のみを使用するという考え方は、免疫検定および免疫測定技術の 分野において一般に推薦されている実務とは相反するものである。たとえば、” 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　工ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｄｉａｇｎｏ ｓｔｉｃ　Ｔ！ｒＭ！Ｌｏｃｒｉ−ｎｏｌｏｇｙ　”、　８＋Ａ、　Ｂｅｒｓｏ ｎ　＆　Ｒ，Ｓ、　Ｙａｌｏｗ編、１９７３年。

１１１〜１１６頁のようなよく知られた著書にも、炊合的免疫検定の実施にあた っては、結合する「トレーサー」被検物質の割合がほぼ５０優になるようにする と最大の検定感度が達成されると述べられている。被検物質のこのような高度の 結合を達成するためには、今日までこの分野の他の研究者によって一般に容認さ れてきたＢｅｒｓｏｎとＹａｌｏｗの理論では、結合剤（厳密にいえば結合部位 、結合剤の各分子は通常、１個または高々２個の結合部位を有する）の濃度は、 被検物質に関してのその結合剤の平衡定数の逆数よりも大きいか等しくなければ ならない。すなわち、〔Ａｂ〕≧１／にである。したがって、容量Ｖのサンプル については、結合剤（または結合部位）の総量はＶ／によシ大きいかそれと等し くなければならない。モノクローナル抗。

体である結合剤は、たとえば、それが結合する特異的抗原に対して、１０１１ｔ 　／　ｍｏｌｅのオーダーの平衡定数（Ｋ）をもつものである。すなわち、上述 の一般に受は入れられている実務では、このような平衡定数をもつ結合剤の場合 １０−”　ｍｏｌｅ　／　ｌまたはそれ以上の結合剤（または結合部位）濃度が 要求され、液体サンプル容量が１ｍｌのオーダーの場合１０−１４ｍｏｌｅまた はそれ以上の結合剤（または結合部位）の使用が通常必要とみなされる。アポが ドロ数？約６　Ｘ　１０２３とすると１０””’　ｍｏｌｅの結合部位は、結合 剤が１分子あたシ２個の結合部位をもつと仮定しても、１０ｇ個以上の分子に相 当する。最高の親和性を有する特異的結合剤でもＫは１０”　ｔ　／　ｍｏｌｅ 未満であって慣用の実際条件では１０７個以上の分子の結合剤が必要で、１０８ ｔ／ｍｏｌｅのオーダーのもつと親和性の低い結合剤は慣用の実際条件では１０ １２個以上の分子の使用が必要である。実際、現時点で市販されている免疫検定 キットはすべてこれらの考え方に従い、ｖ／Ｋにほぼ等しい、またはより多くの 場合Ｖ　／　Ｋよりかなり過剰の量の結合剤を使用している。実際、標識抗体の 使用に頼るある穫類のキットでは、可能な限り多重の結合剤を使用し、被検物質 の結合比率は５０壬をはるかに越えているのが慣例となっている。

このような系における試験では液体サンプル中の被検物質のかなシの部分、たと えば５０％が結合するので、結合剤の結合部位の占拠の割合は液体サンプルの容 量に独立ではあり得す、正確な定量的検定のためには、未知濃度のサンプルにつ いてもまた用量応答曲線を発生させるために用いる既知濃度の標準サンプルにつ いても、サンプルの容量を正確に制御して全試験でそれを一定に保つことが必要 である。さらに、このような系は、標準および対照インキュベーション管に存在 する結合剤の量の注意深い制御も要求する。現在の技術のこれらの限界は一般に 認識され、容認されている。

英国特許出願２，０９９，５７８　Ａには、間隔を置いて複数個の位置に抗原ま たは頻度は少ないが免疫グロブリンが結合されている多孔性固体支持体からなる 免疫検定用デバイスが開示されている。このデバイスによれば、同一の支持体上 で、たとえばヒト血清サンプルの抗体橡を確立するために多数の定性的および定 量的免疫検定を実施することが可能になる。しかしながら、個々の位置は抗原含 有溶液または懸濁液の小滴を供給することによって作成されるいわゆるミクロド ツトの形であっても、各位置に存在する抗原のモル数はなお、試験される液体サ ンプル中に存在しその濃度を測定する被検物質（たとえば抗体）のほぼすべて全 結合するのに十分なように意図されていることが明ｂ−ｉ−である。

これは、その出願に用いられた定量方法（第３頁、第２１〜２８行）が支持体に 既知量の免疫グロブリンを適用する検量を包含する事実から明白である。これは 、試験されるサンプル中のほぼすべての分子が真に比較されるためにサンプルが ら抽出されね＆工ならず、したがって、大量の抗原（すなわち、この場合は結合 剤）がサンプル中に存在する被検物質（すなわち、この場合は抗体）の総量に対 して大過剰に、各ミクロドツト中に要求されることを意味している。

発明の要約 本発明は、良好な感度のために大量の結合剤の使用を必要とせず、また一般にそ れが望ましくない免疫検定法を実現するものである。結合剤の量を、可能な限り 大量に使用するのではなくて、被検物質の有意でない、わずかな比率、一般的に は１０優未満、通常は５壬未満、至適な結果を得るためにはわずか１ないし２壬 もしくはそれ未満が可逆的に結合すする程度に減少させると、与えられた検定に おけるすべての液体サンプル（標準溶液および未知サンプル）について、正確な 、制御された、一定の容量にも早必要でないはかシか、結合剤結合部位ｆ　Ｖ　 ／　Ｋ　ｍｏｌｅよりはるかに少量、すなわち０．ＩＶ／に未満、好ましくは０ ．０１Ｖ／に未満使用して被検物質の信頼できる、ときにはさらに改善された評 価値を得ることが可能である。被検物質に対する平衡定数が１０”　ｔ　／　ｍ ｏｌｅのオーダーの結合剤の場合、サンプルサイズを約１ｍＡ！とすると、これ は各配列における各位置あたシ、結合剤分子１０８個未満、好ましくは１０７個 未満にほぼ相当する。Ｋの値が１０１３１　／　ｍｏｌｅであれば、この数字は それぞれ１０６および１０５個分子に、Ｋが１０８１　／　ｍｏｌｅのオーダー であれば、これらはそれぞれ１０１１および１０１°個分子になる。単一の位置 における結合剤が１０２個分個分下になると、被検物質による結合剤部位の占拠 の割合は個々の部位が占拠されるかまたは占拠されないかに応じて不運的な段階 でしが変化できなくなるので、測定の正確度は次第に低下するが、１０優の正確 度の評価値が許容されるならば原理的には少なくとも１０個までの少なり分子の 使用も可能である。実際問題としては、分子１０４個以上が好ましい。

本発明者は、一般的にいえば、ある抗原に対する親和性定数がＫ　ｔ　／　ｍｏ ｌｅの抗体の場合、抗体の濃度と任意の特定の抗原濃度における結合部位の占拠 の割合との関係、および抗体の濃度と任意の特定の抗原濃度における結合部位へ 結合する抗原の割合は、抗体濃度および抗原濃度をそれぞれ１／にの分数または 倍数で表すと同じ曲線になることを発見した。これは、これらの関係をプロット した２組の曲線で表されるグラフである図面によって例示されるとおシである。

各曲線は、１／Ｋによって表し、Ｘ軸に沿ってプロットした抗体濃度〔Ａｂ〕に 関するものである。〔Ａｂ〕が増加しても一定に保持されまた低下する曲線のセ ットでは、ｙ軸は、抗体上の結合部位の抗原による占拠の割合（Ｆ）を表し、第 二のセットでは、ｙｌｌｌは、それらの結合部位に結合した抗原の百分率（幅） ヲ表す。各セットの何個の曲線は、Ｋで表した４種の異なる抗原濃度（Ａｎ）す なわち１０／Ｋ　、　１．０／Ｋ　、　０．１　Ｋおよび０．０１　／Ｋに相当 する関係を示している。これらの曲線は、〔Ａｂ〕が低下するとＦはほぼ一定の レベルに到達し、その値は〔Ａｎ〕に依存することを示している。

したがって、大量の結合剤と全被検物質のほぼ完全な封鎖に基づく定量的評価法 である上述のドイツ特許出願２，０９９．５７８　Ａは、結合剤の占拠された分 画の測定を必要とする別個の分析加理に基づき、存在する全被検物質のきわめて 僅かな部分のみのサンプルからの封鎖を要求する本発明によって達成される進歩 を認識したものではないことが明白であろう。

このような少量の結合剤の使用が可能であることが認識された結果、単一の濃度 測定に必要な結合剤を固体支持体のきわめて狭い領域上に配置することが可能に なり、したがって、分析すべき液体中に同時に存在するかまたは存在する可能性 がある様々な被検物質に対して特異的な広範囲の異なる結合剤を単一の固体支持 体上に互いに並列に、しかし空間的に分離した点に配置することが可能になる。

別個の点それぞれを分析すべき液体に同時に暴露することにより、各結合剤スポ ットにはそれに特異的な被検物質が、液体中の被検物質濃度を表現するだけ（す なわち、結合部位の部分的占拠）取り込まれる。この場合、溶液の容量およびそ の中の被検物質の濃度が十分に大きく、被検物質の有意でない分画（一般的には １０壬未満、通常は５壬未満）のみがその点に結合するのみであればよい。各結 合剤についての結合部位の部分的占拠を、ついで、様々の結合剤の占拠された結 合部位もしくは占拠されていない結合部位全認識し、様々な結合剤に結合した別 個の試薬の濃度レベルの測定を可能にするマーカーたとえば螢光マーカーで標識 された別個の部位認識試薬を用いて定量することができる。このような測定は、 連続的にたとえば支持体をレーデ−で走査して、または同時にたとえば感光板を 使用して、標識の性質に応じ実施することができる。他の結像装置たとえばテレ ビカメラも必要に応じて使用することができる。結合剤は互いに空間的に離して 配置されるので、わずか小数の異なるマーカー標識のみをまたはすべて同一のマ ーカー標識のみを使用し、各結合剤位置を別個に走査して標識の存在および濃度 を決定することが可能になる。本発明の使用により、分析すべき液体への固体支 持体の１回の暴露で３糧をかなり越える分析、たとえば１０，２０．３０．５０ また１００もしくは数百までもの分析を実施することができる。

すなわち、本発明は全体として、容量ｖｔの液体サンプル中の複数個の被検物質 の環境内濃度を測定するにあたシ、 液体中に存在するまたは存在する可能性のある被検物質とそれぞれ可逆的に結合 可能で、液体サンプルの他の成分に比較してその被検物質に対して特異的な複数 個の異なる結合剤を支持手段上の空間的に離れた複数個の位置に、各位置に単一 の結合剤がＱ、１Ｖ／Ｋｍｏｌｅ未満（Ｋ　ｔ　／　ｍｏｌｅはその結合剤の被 検物質に対する平衡定数である）存在するように負荷し、負荷された支持手段を 分析すべき液体サンプルと接触させ、この場合、空間的に離れたそれぞれの位置 が同一の操作で液体サンプルと接触し、サンプルに使用される液体の量はその液 体サンプル中に存在する被検物質の有意でない量のみがそれに特異的な結合剤に 結合するような量とし、 空間的に離れた位置における結合剤の被検物質による占拠の割合を表すパラメー ターを、結合剤上の占拠された結合部位もしくは占拠されていない結合部位のい ずれかｆ：認識できる各結合剤に対する部位認識試薬であって、特定の位置にお けるその試薬量の測定を可能にするマーカーで標識されている部位認識試薬を用 い競合的または非競合的技術によって測定することを特徴とする方法を提供する 。

本発明はまた、容量ｖｔの液体サンプル中の複数個の被検物質の環境内濃度の測 定に用いられる装置であって、液体中に存在するまたは存在する可能性がある被 検物質とそれぞれ可逆的に結合可能で液体サンプルの他の成分に比較してその被 検物質に対して特異的な複数個の異なる結合剤が空間的に離れた複数個の位置に 配置された固体支持体手段からなり、各位置には単一の結合剤がＱ、１Ｖ　／　 Ｋ　ｍｏｌｅ未満、好ましくは０．０１Ｖ　／　Ｋ　ｍｏｌｅ未満（Ｋ　ｌ　／ 　ｍｏｌｅはその結合剤の、それに特異的な被検物質との反応についての平衡定 数である）存在する装置を提供する。

本発明の方法に使用するキットは、本発明の装置、液体サンプル中のその濃度を 測定しようとする被検物質の既知濃度を含有する標準サンプルを複数個、および 結合剤上の占拠されたまたは占拠されていない結合部位と反応する、標識された 部位認識試薬のセットから構成される。

詳細な説明 固体支持体の選択は使用者に残された問題である。

好ましくは支持体は非多孔性であって、結合剤はその表面上にたとえば単層とし て配置される。多孔性支持体の使用は、結合剤の分子の大きさによっては、結合 剤を支持体の孔部内へ落ち込ませることに々シ、この場合、濃度全測定しようと する被検物質へのその暴露も孔部の→測的性質によってｒＦｆＪ様に影響され、 誤まった読みが得られる可能性が生じる。し７たがって、結合剤のスポラトラ点 在させたニトロセルロースｇ紙のような多孔性支持体はあまり好ましくない。多 数の分子を付着させるために多孔性であることが必要と思われる、Ｇ　Ｂ　２， ０９９．５７８　Ａで用いられる支持体と異なシ、本発明に使用される支持体で ははるかに少量の分子を使用するので、多孔性である必要はなり０非多孔性支持 体は、たとえばプラスチック材料またはがラスで作成され、任意の慣用されてい る剛性プラスチック材料が使用できる。ポリスチレンは好ましいプラスチック材 料であるが、他のポリオレフイ／またはアクリル酸もしくはビニルポリマーも同 様に使用可能であった。

支持手段は、たとえばこのようなプラスチック材料のマイクロビーズであっても よく、結合剤の均一な層で被覆され、支持体プレート上の特定の位置たとえば凹 部に維持させることができる。別法として、この材料は、結合剤のドラトラ並べ て点在させたシートまたはプレートの形とすることもできる。支持手段の立体構 造は、様々の結合剤を付着させた複数個の空間的に離れた位置が容量的Ｖｔの液 体サンプルと接触状態に保持されやすいようにするのが有利である。たとえば、 空間的Ｖｃ１１１れた位置は支持手段内のウェル中に配列し、各ウェルには同一 群の異なる結合剤が空間的に離れた位置に配置され、このようなウェルが複数何 重いに連結された、複数個のサンプルに対して使用するためのマイクロタイター プレートを形成させることもできる。

支持手段が光走査を含む測定系と連結して用いられる場合は、支持体の材料たと えばプラスチックは光に対して非透過性であることが望ましい。たとえば、結合 剤または部位認識試薬からの測定すべきシグナルが、螢光または発光マーカーか らの光シグナルのような場合、支持体にはとくに白または黒のたとえばカーボン ブラックのような不透明化剤を充填することかできる。

一般的には、検知装置または感光板への光の収集を強めるため、この場合には反 射性材料が好ましｂ０至適材料の最終的な選択は、その表面へ結合剤を付着させ る能力、バックグラウンドシグナル発光の不存在、およびその表面に配置される 結合剤に付着する特定のマーカーまたはマーカ一群についてシグナル／ノイズ比 を最大にするような他の性質によって決定される。きわめて満足な結果が、以下 の例に記載したように、ＤｙｎａｔｅｃｈからＷｂｔｔａ　Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏ ｒ　？イクロタイターウエルの商品名で市販されている白色不透明ポリスチレン マイクロタイタープレートによって得られた。

使用される結合剤は、様々な特異性をもつ複数の結合剤すなわち様々な被検物質 に特異性を有する複数の結合剤でも、またそれらの２種もしくは３ｍ以上は特異 性は同一であるが親和性の異なる結合剤すなわち同一の被検物質に特異的である がそれとの反応の平衡定数には異なる結合剤でもよい。後者の方法は、検定すべ き被検物質の未知試料中の濃度がかなりの範囲にわたって、たとえば２ないし３ オーダーも変動するような、たとえば姓娠女性の尿中のＨＣＧの測定の場合のよ うに０．１から１００　工Ｕ　／ａｔまたはそれ以上まで変動するようなときに とくに有用である。

使用される結合剤は抗体であることが好ましく、モノクローナル抗体であること がさらに好ましい。生物学的液体の広範囲の成分に対するモノクローナル抗体が 市販品を入手できるし、また公知の技術で製造できる。使用される抗体は、通常 の親和性定数たとえば１０８もしくは１０Ｑｔ　／　ｍｏｌｅからそれ以上比と えば１０１０もしくは１　Ｑ”　ｌ　／　ｍｏｌｅ　ｆ示す４　（７）　テヨイ カ、１０１２〜１０１３ｔ　／　ｍｏｌｅの親和性定数を有する高親和性抗体も 使用できる。本発明では、それ自体扛標識されていない結合剤を使用することが できる。しかしながら、結合剤／被検物質／部位認識試薬の系が、同種類の異な る２ｆｆｉの標識、たとえば螢光、化学発光、酵素または放射性同位元素全、ひ とつは結合剤上にひとつは部位認識試薬上に包含するように、標識された結合剤 を使用することも可能であり、それが望ましい場合も多い。ついで、測定操作に より２種のシグナルの強度の比を測定する。すなわち、未知サンプルからのシグ ナルの測定時と同量の標識結合剤を、検量の目的での標準サンプルからのシグナ ルの測定時に支持体上に配置する必要はなくなる。この系は、結合部位の占拠を 表す比の測定にもっばら依存するので、全スポットからのシグナルを測定する必 要はなく、一部分についての走査で十分である。各結合剤は同一のラベルで標識 することが好ましいが、異なるラベルも使用できる。

結合剤は公知のまたは慣用されている任意の方法で支持体に適用することができ る。結合剤をチューブのような支持体上に被覆する場合には、たとえば支持体上 の空間的に離れた各位置を結合剤溶液の小滴とたとえば１ｆ１２のスポットを０ ．５μ乙の小滴と接触させ、ある時間放置して接触を続けたのち小滴を洗い流す 。この操作の結果、小滴中に存在する結合剤のほぼ一定の小部分が支持体上に吸 着される。マイクロスポット上の結合剤の被覆密度は、慣用の抗体被覆チューブ の場合の被覆密度よシ小さくする必要はない。各スポットにおける分子数の減少 はもっばらスポットの大きさを小さくすることによって行われ、被覆密度にはよ らない。高い被覆密度は一般に、シグナル／ノイズ比を最大にするために望まし い。スポットの大きさは１０ｍｍ２未満とするのが有利で、１１Ｉ２未満が好ま しい。分離はスポットの半径の２〜３倍またはそれ以上とすることが望ましいが 、必ずしも必須ではない。これらのことは、幾何的配置が、もっばら各スポット における結合剤の分子数、配列されたスポットが暴露されるサンプルの最小容量 および上述の様式でのスポットの配列を有利に調製するために局所的に利用され る手段に関する制限次第で必要に応じて変化できることを示唆している。

結合剤が支持体上に被覆されたならば常法により、結合剤が抗体である場合には アルジミンまたは他のタンパク質を含有する溶液で洗浄して、支持体上および他 の場所に残っている非特異的吸着部位を飽和させる。

個々のスポットにおける結合剤の量が本発明の原理に合致するために必要な最大 量（０，１Ｖ／Ｋ）未満であることを確認するためには、結合剤を比活性が既知 の検出可能なマーカー（結合剤単位重量あたう既知量のマーカー）で標識し、存 在するマーカーを測定することによって任意の個々の位置に存在する結合剤の量 をチェックすることができる。すなわち、本発明の方法に用いられる支持体に標 識された結合剤の使用を望まない場合は、結合剤を標識した試行実験を行い、そ の試行で明らかにされた結合剤の正しい負荷が起こるのと同じ条件を、実際に用 いられる支持体への非標識結合剤の適用に際しても使用することができる。

液体サンプルの最小の大きさくＶ／、）は結合剤の分子数（０，ＩＶ／に未満） に相関するので、液体サンプル中に存在する被検物質の有意でない割合のみが結 合剤に結合する。この割合は一般に１０係未満、通常は５壬未満、望ましくは１ もしくは２壬またはそれ未満であって、検定に望まれる正確度（他の事項が同一 であれば、被検物質の結合する割合が小さいほど、正確度は大きくなる）および 存在する他の誤差誘発因子の大きさによって決定される。サンプルの大きさは、 １もしくけ数ゴまたはそれ未満たとえば１００μ乙までもしくはそれ未満のオー ダーが多くの場合好ましいが、もつと大きい容量で検定を行う方か便利な環境で は、幾何的配置金それに応じて調整する。サンプルは天然の濃度レベルで用いて もよく、また所望により既知の倍率に希釈してもよい。

本発明の方法に用いられる部位認識試薬は、それ自体抗体たとえばモノクローナ ル抗体でもよく、また抗−イディオタイプ抗体もしくは抗−被検物質抗体でもよ く、後者は占拠された部位を認識する。別法として、たトエばサイロキシン（Ｔ 、）のような分子サイズの小さい被検物質の場合には、非占拠部位が、適当に標 識された被検物質自体、または直接的もしくは間接的に標識された他の分子たと えばタンパク質分子に共有結合された被検物質を用いて認識される。部位認識試 薬は、慣用の螢光試薬たとえばフルオレセイン、ローダミンモジくはテキサスレ ッド、または時間分解パルス螢光に使用できる物質たとえばユーロピウムおよび 他のランタニドキレートによシ、常法に従って直接または間接的に標識できる。

他の標識たとえば化学発光、酵素または放射性同位元素標識も必要に応じて使用 できる。各部位認識試薬は同じラベルで標識するのが好ましいが、異なる試薬に は異なる標識も使用できる。

部位認識試薬は各スポット群中の結合剤／被検物質スポットの単一のスポットに 特異的であってもよく、またある種の環境では、たとえば共通の結合部位をもっ ＨＣＣ）ｉ−よびＦＳＨのような糖タンパク質ホルモンの場合にはスポットの２ 種以上の占拠された結合部位と反応できる交差反応試薬であってもよい。

検定技術においては、未知濃度の被検物質を含む試験サンプル中の結合剤の占拠 分画を表すシグナルを、同じ被検物質の既知濃度を含有する標憩サンプルから得 られる用量反応曲線と対比して検量できる。このような標準サンプルはすべての 被検物質を一緒に含有する必要はなく、各被検物質が一部の標準サンプル中に存 在すればよい。占拠された割合は占拠された結合部位（抗−被検物質抗体で）ま たは占拠されていない結合部位（抗−イディオタイプ抗体）を評価することによ って測定できる。この両者は互いに逆の関係にある。

正確度を大きくするためには、０に近い方の分画を測定することが望ましい。こ の場合、０゜０１の占拠分画が比例して大きくなるからであるが、２５〜７５壬 の範囲の占拠分画であればどちらを測定しても一般に満足な結果が得られる。

２種の螢光マーカーによる本発明の態様においては、一方は結合剤上、他方は部 位認識試薬上の２種のマーカーからのシグナルの相対強度の測定ｆ　、Ｂｉｏ− ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、から市販されているＢｉｏ−Ｒａｄ 　Ｌａ５ｅｒ−ｓｈａｒｐ　ＭＲＣ５００のような２チヤンネル検出システムを 有するレーデ−走査共焦点顕微鏡によって行われる。

この装置は、支持体上のドツト等を走査してマーカーに螢光を生じさせるレーデ −光線と、発光する螢光を識別して測定する波長フィルターによるものである。

時間分解螢光法を使用することもできる。２つのチャンネル間の干渉（いわゆる 混線）はもし起これば標準補正によって補償できるし、また通常の努力によって それを減少させることができる。二重標識によって発生する２つの螢光シグナル の識別は、この装置の現在の形式では２種の螢光発光の特性波長を識別できるフ ィルターによって行われる。しかしながら、螢光物質は他の物理学的特性たとえ ば螢光崩壊時間、漂白時間等によっても識別することが可能で、２種の螢光体の 間の識別にはこれらの任意の方法を単独でまたは組合せて使用することができ、 したがって螢光測定分野においてよく知られた技術を用いて各スポット上に存在 する２種の螢光標識体（結合剤および部位認識試薬）の比の測定が可能になる。

１種の螢光標識のみが存在する場合にも同じ技術を使用できるが、各場合とも全 スポットが走査されるように注意を払い、スポットは未知および標準サンプルを 使用するときの全検定において同量の結合剤を含有することが必要である。

他の標識たとえば放射性同位元素標識、化学発光標識または酵素標識の場合も、 このような標識の１種からまたは対のそれぞれからの個々の標識を識別するため の類似の手段がよく知られている。たとえば　１２５工と１３１１のような２種 の同位元素は、それらの個々の放射性発光のエネルｆ−差に基づいて容易に識別 できる。同様に、二重酵素標識抗体共役体から誘導される２種の酵素反応、たと えば色の相違を、また２種の化学発光たとえば発光の寿命もしくは波長の差を、 それぞれの分野でよく知られた技術によって同定することができる。

本発明は、生物学的液体たとえば血液、血清、唾液または尿のようなヒト体液中 に存在する被検物質の検定に使用することができる。本発明は、広範囲のホルモ ン、タンパク質、酵素または液体サンプル中に天然にもしくは人工的に存在する 他の被検物質たとえば薬物、毒物等の検定に使用することができる。

たとえば、本発明は、広範囲の姶娠および生殖に関連するホルモンたとえばＦＳ Ｈ、ＬＨ、ＨＣＣ）　、プロラクチンおよびステロイドホルモン（たとえばプロ ーステロン、エストラジオール、テストステロンおよびアンドロステン−ジエン ）、または副腎−下垂体系ホルモンたとえばコルチゾール、ＡＣＴＨおよびアル ドステロン、または甲状腺関連ホルモンたとえばＴ、　、　Ｔ３およびＴＳＨな らびにそれらの結合タンパク質ＴＢＣ）　、ウィルスたとえば肝炎、ＡＩＤＳも しくはヘルペスウィルス、または細菌たとえばブドウ状球菌、連鎖球菌、肺炎球 菌、淋菌および腸球菌、または腫瘍関連ペプチドたとえばＡＦＰもしくはＣＥＡ 　、または薬剤たとえば違法な運動能力改善剤として禁じられている薬剤、また ｈ１品汚染物質の定量的検定用デバイスの調製に使用することができる。

本発明の方法についてのさらに詳述な記載に本発明者の国際特許公告Ｗ○８８１ ０１０５８にあるので、その内容を参考に本明細書に導入する。

本発明全以下の実施例により例示する。

例　　１ ２５℃においてＴＮＦに対する親和性定数約ｌＸ１０’ｔ／　ｍｏｌｅの抗−Ｔ ＮＦ　（腫瘍壊死因子）抗体をテキサスレッドで標識する。この抗体の８０μ９ ／ＵＬＩ濃度の溶液ｔ−調製し、この溶液の０．５μｔｔ、１２ウエルのポリス チレンマイクロタイタープレートを充填したＤｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏｆｌ ｕｏｒ　（不透明白色）の各ウェルに小滴を形成させて添加する。

２５℃においてＨＣＧに対する親和性定数約６×１０８ｔ／　ｍｏｌｅ　ｆ有す る抗−ＨＣＧ　（ヒト絨毛性ブナドトロピン）抗体もテキサスレッドで標識する 。この抗体の８０μｇ／Ｍｌ濃度の溶液を調製し、この溶液の０．５μｔを同一 のＤｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ　？イクロプレートの各ウェルに小 滴を形成させて添加する。

小滴の添加後、プレートを数時間高湿雰囲気内に放置して、小滴の蒸発を防止す る。この間に、小滴中の抗体分子の一部はプレート上に吸着する。次にウェルｔ 　ＩＪン酸緩衝液で数回洗浄し、ついで約４００μｔの１憾アルデミン溶液を充 填して数時間放置し、ウェル内の残った結合部位を飽和させる。矢に再びリン酸 緩衝液で洗浄する。

生成したプレートはその各ウェル中に、それぞれ面積が約１ｆｆｉＩ＋２の２個 のスポットを有する。螢光の測定により、一方のスポットは約５Ｘ１０’個の分 子の抗−ＴＮＦ抗体を、他方のスポットは約５　Ｘ　１０’個の分子の抗−ＨＣ Ｇ抗体を含むことがある。ウェルは４００μを容量の液体サンプル全使用するよ うに設計されているので、０．ＩＶ／には、抗−ＴＮＦ抗体については４Ｘ　１ ０−１４ｍｏｌｅ　（２−４Ｘ　１０”　分子ＶＣ相当）、抗−ＨＣＧ抗体につ いては７　×１０−１′ｔｏｏｌｅ　（４ｘ　１０１０分子に相当）である。

例１に記載したようにして製造したマイクロタイタープレー）　ＴＮＦおよびＨ ＣＧ　Ｔｈ含む人工的に調製した溶液の検定に使用する。この溶液の試験サンプ ル約４００μｔｔ−ウェルの１つに加え、数時間インキュベートする。このプレ ートの他のウェルには既知濃度（０，０２゜０．２　、２および２０　ｎｇ　／ ｍ／　）のＴＮＦまたｉ　ＨＣ’Ｇ　ｔ−含む各穫標準溶液４００μｍ１加え、 同様に数時間インキュベートする。ついでウェルｔ−ＩＪン酸緩衝液で数回洗浄 する。

部位認識試薬としては、ＴＮＦスポットについては２５℃におけるＴＮＦに対す る親和性定数約Ｉ　Ｘ　１０１゜ｔ／ｍｏｌｅの抗−ＴＮＦ’抗体を、ＨＣＧス ポットにツイテは２５°ＣにおけるＨＣＧに対する親和性定数約Ｉ　Ｘ　１０１ １ｔ／　ｍｏｌｅの抗−ＨＣＧ抗体を使用する。両抗体ともフルオレセイン（Ｆ ｒＴＣ）で標識する。これらの標識抗体の溶液４００μｔをウェルに加え、数時 間放置する。

ついでウェルを緩衝液で洗浄する。

各スポットで得られた螢光比ｆ　Ｂｉｏ−ＦＬａｄ　’ＬａｓｅｒｓｈａｒｐＭ ＲＣ５００共焦点顕微鏡で定量する。標準溶液からＴＮＦおよびＨＣＧ　Ｋ対す る月量反応曲線を作成すると、ＴＮＦについての数値は、 ＨＣＧについての数値は 人工的に調製した溶液の比の読みは、ＴＮＦスポットについで５．９　、　ＨＣ Ｇスポットについて１０．５で、用量反応曲線から得られた値は実際のＴＮＦ　 （０，５ｎｇ　／ｍｌ）およびＨＣＧ　（０，５ｎｇ　／ｖｔｌ　）の濃度とよ く相関した。

例　　３ 例１に略述した操作と同様の操作を用い、個々のウェルにそれぞれ標識抗−Ｔ４ （サイロキシン）抗体く２５°Ｃにおける親和性定数約Ｉ　Ｘ　１０１１乙／　 ｍｏｌｅ　）、標識抗−ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）抗体（２５°Ｃにおける 親和性定数約５　Ｘ　１０’　ｌ／　ｍｏｌｅ　）、および標識抗−Ｔ３（トリ ヨードサイロニン）抗体（２５℃における親和性定数約Ｉ　Ｘ　１０１１１／　 ｍｏｌｅ　）のスポットを含有するマイクロタイタープレートラ調製する。

スポットは抗−Ｔ４抗体１Ｘ　１Ｑ”　Ｖ　ｍｏｌｅ未満または抗−ＴＳＨ抗体 ２　Ｘ　Ｉ　Ｑ−１１Ｖ　ｍｏｌｅ未満または抗−Ｔ３抗体Ｉ　Ｘ　１０−１２ Ｖ　ｍｏｌｅ未満を含む。

ＴＳＨ検定のための検出抗体（部位認識試薬）は２５℃におけるＴＳＨへの親和 性定数２　Ｘ　１０１０１　／　ｍｏｌｅの抗−ＴＳＨ抗体とする。この抗体は フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識する。Ｔ４オよびＴ３検定のための部位認識 試薬はボＩＪ　ＩＪジョンカップリングさせ、Ｆ’ＩＦＣで標識したＴ、および Ｔ３で、それぞれの最初の抗体で充填されない部位を認識する。

各種既知濃度のＴ４．Ｔ、およびＴＳＨを含有する標準溶液の一部４００μｔを 用い、例２の場合と類似の方法により、Ｔ、　、　Ｔ３ｉ−よびＴＳＨ濃度と螢 光比の相関を示す用量反応曲線を得る。このプレート’６用いて、ヒト患者から の血清中のＴ、　、　Ｔ、および’Ｉ’ＳＨレベルを測定すると、他の方法で得 られた結果と良好な相関を示す。

例　　４ 例１に略述した操作と同様の操作を用い、個々のウェルにそれぞれ、第一の標識 抗−ＨＣＧ抗体（２５℃における親和性定数約６　Ｘ　１０８１／　ｍｏｌｅ　 ）、第二の標識抗−ＨＣＧ抗体（２５℃における親和性定数約１．３×１０”　 ｌ　／　ｍｏｌｅ　）、および標識抗−ＦＳＨ（濾胞刺激ホルモン）抗体（２５ ℃における親和性定数約１．３×１０８ｔ　／　ｍｏｌｅ　）のスポットを含む マイクロタイターグレートを調製する。各スポットは各抗体０．ＩＶ／Ｋｍｏｌ ｅ未満を含有する。ＨＣＧおよびＦＳＨの両者の検定のための共通の検出抗体と して、親和性定数Ｉ　Ｘ　１０”ｌ　／　ｍｏｌｅの交差反応性（α−サブユニ ット）モノクローナル抗体８Ｄ１０を使用する。

各種既知濃度のＨＣＧおよびＦＳＨｉ含有する標準溶液の一部４００μｔｋ用い 、例２の場合と類似の方法により、ＨＣＯおよびＦＳＨ濃度と螢光比の相関ヲ示 す用量反応曲線が得られる。親和性の高い抗−ＨＣＧ抗体で得られる曲線は低濃 度のＨＣＧで濃度感受性の高い結果を与え、一方、親和性の低い抗−ＨＣＧ抗体 からの曲線は高濃度のＨＣＧで高い濃度感受性を示す。このプレートを使用して 、姓娠テストでの女性尿中のＨＣＧおよび旧濃度を測定すると、他の方法で得ら れた結果と良好な相関を示し、最良のＨＣＧスポットおよび用量反応曲線を正し く選択することによって２ないし３オーダーの濃度範囲にわたるＨＣＣ）濃度の 有効な測定が可能になる。

螢光標識による抗体の標識は、よく知られている標準技術（Ｌｅｓｌｉｅ　Ｈｕ ｄｓｏｎ　＆　Ｆｒａｎｋ　Ｃ，Ｈａｙ：　”　ＰｒａｃｔｉｃａｌＩｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ’＋　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａ ｔｉｏｎｓ。

１９８０年刊、年刊−１３頁参照）により、たとえば以下のように実施すること ができる。

親和性定数（Ｋ）が１．３　Ｘ　１０８ｔ　／　ｍｏｌｅのＦＳＨ特異的（β− サブユニット）抗体であるモノクローナル抗体、抗−ＦＳＨ３Ｇ　３は、Ｍｉｄ ｄｌｅｓｅｘ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　ＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌで製造され、Ｔ ＲＩＴＣ（ローダミンインチオシアネート）またはテキサスレッドで標識された 。赤色の螢光を与える。

親和性定数（Ｋ）が１　×１０１１ｔ／　ｍｏｌｅの交差反応性（α−サブユニ ット）抗体であるモノクローナル抗体、抗−ＦＳＨ８Ｄ　１０は同様にＭｉｄｄ ｌｅｓｅｘ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　ｌ＆ｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌで製造され、ＦＩ ＴＣ（フルオレセインインチオシアネート）で標識された。黄緑色の螢光を与え る。

使用された一般的操作は、以下の工程による腹水精製（硫酸アンモニウム沈降お よびＴ−１”ルクロマトグラフイー）ついで標識を包含するものである。すなわ ち、 １ａ、硫酸アンモニウム沈降 １）抗体プレバレージョン（培養上清または１：５希釈腹水）５ばて絶えず攪拌 しながら飽和硫酸アンモニウム４．１　ｍノを加える（４５チ飽和）２）３０〜 ９０分攪拌を続ける。２５０　Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離する。

３）上清を捨て、沈殿をＰＢＳに溶解する（最終容量５ゴ）。工程１）および２ ）を反復するか、または４）絶えず攪拌しながら飽和硫酸アンモニウム６．６１ を加える（４０壬飽和）。工程２）を反復する。

５）上清を捨て、ベレットを所望の緩衝液に溶解する。

６）冷却しながら同一の緩衝液（新鮮な、ｄ／ｗ透析バッグ中で煮沸）に対して 透析する。

７）Ａ２８゜においでまたはＬｏｖｒｒｙ法でタンパク質濃度を測定する。

１１：＋、　Ｔ　−ｒルクロマトグラフイ−（緩衝液＝１ＭＴｒｉｓ−Ｃ６，ｐ Ｈ７，６＋固体硫酸カリウム）１）腹水２　ｍｐｆ　４，０００　ｒｐｍで遠心 分離して溌明化する。

２）　　１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｔ溶溶液金兄て最終濃度０．１Ｍとする。

６）十分量の固体硫酸カリウムを加える。最終濃度＝　０．５　Ｍ ４）腹水をＴ−ビルカラムに適用する。

５）カラムを、０．５Ｍ硫酸カリウム含有Ｑ、１Ｍ　Ｔｒｌｓ−Ｃｔｔ衝液で、 タンパク質＠　（Ａ２Ｂ。における）が０に戻るまで洗浄する。

６）吸着したタンパク質を、溶出液として０．１　ＭＴｒｉｓ−Ｃ１緩衝液を用 いて溶出する。

７）抗体活性を含有する分画をプールし、Ａｍ１ｃｏｎ３０濃縮装置を用いて濃 縮する。

３）　　ＨＰ！（Ｔ精製を実施する場合には、工程７）時にＨＰＨＴクロマトグ ラフィー開始緩衝液を使用する。

２、抗体１４ＴＣ／　ＴＲＩＴＣ接合体の環識１）精製されたタンパク質１ｇｋ ０．２５Ｍ炭酸塩−る。

２）　　ＦＩＴＣ／　ＴＲＩＴＣを加え、タンパク質との比を１：２０にする（ すなわちタンパク質１ηあたり０．０５■）。

３）混合し、４°Ｃで１６〜１８時間インキュベートする。

４）接合タンパク質を非接合タンパク質から、ａ、　　ＦＩＴＣ標識について５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５りｏ’ｖトゲラフイーまたは す、　　ＴＲＩＴＣ／　ＦＩＴＣ標識についてはＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｃｅｌク ロ！トゲラフイーによシ、 緩衝系としては、 （ａｌについてはＰＢＳ　、　（ｂｌについては０．ＣＩ　０５　Ｍリン酸塩ｐ Ｈ８，０および［１，１８Ｍリン酸塩ｐＨ８，０を用いて分離する。

ＦＩＴＣ：タンパク質カップリング比の計算：手続補正書（自発） 平成２年３月２日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．容量Ｖｌの液体サンプル中の複数個の被検物質の環境内濃度を測定するにあ たり、 液体サンプル中に存在するまたは存在する可能性のある被検物質とそれぞれ可逆 的に結合可能で、液体サンプルの他の成分に比較してその被検物質に対して特異 的友複数個の異なる結合剤を支持体上の空間的に分離された複数個の位置に、各 位置に単一の結合剤が０．１ｖ／Ｋｍｏｌｅ未満（Ｋｌ／ｍｏｌｅはその結合剤 の被検物質に対する平衡定数である）存在するように負荷し、 負荷された支持手段を分析すべき液体サンプルと接触させ、この場合、空間的に 分離されたそれぞれの位置が同一の操作で液体サンブルと接触し、サンブルに使 用される液体の量はその液体サンプル中に存在する被検物質の有意でない量のみ がそれに特異的な結合剤に結合するような量とし、 空間的に分離された位置における結合剤の被検物質による占拠の割合を表すパラ メーターを、結合剤上の占拠された結合部位もしくは占拠されていない結合部位 のいずれかを認識できる各結合剤に対する部位認識試薬であって、特定の位置に おけるその試薬量の測定を可能にするマーカーで標識されている部位認識試薬を 用い競合的または非競合的技術によつて測定することを特徴とする方法。
2. ２．空間的に分離された各位置には、単一の結合剤０．０１Ｖ／Ｋｍｏｌｅ未満 が存在する請求項１記載の方法。
3. ３．使用される結合剤は被検物質に対する平衡定数１０８〜１０１３ｌ／ｍｏｌ ｅを有する請求項１．記載の方法。
4. ４．使用される結合剤は１０１０たいし１０１１ｌ／ｍｏｌｅのオーダーの被検 物質に対する平衡定数を有する請求項１．記載の方法。
5. ５．液体サンプルの容量は０．１ｌ未満である請求項１．記載の方法。
6. ６．液体サンブルの容量４００〜１０００μｌである請求項１．記載の製法。
7. ７．支持手段上に負荷される結合剤は、濃度を測定される被検物質に対する抗体 である請求項１．記載の方法。
8. ８．結合剤は、結合剤の濃度レベルの測定を可能にするマーカーで標識される請 求項１．記載の方法。
9. ９．結合剤および部位認識試薬を螢光マーカーで標識し、空間的に分離された各 位置にかいて、結合剤の占拠の割合を測定する技術により螢光マーカーによつて 放出されたシグナルの比を測定する請求項１．記載の方法。
10. １０．容量Ｖｌの液体サンプル中の複数個の被検物質の環境内濃度の測定に用い られる装置であつて、液体サンブル中に存在するまたは存在する可能性がある被 検物質とそれそれ可逆的に結合可能で液体サンプルの他の成分に比較してその被 検物質に対して特異的な複数個の異在る結合剤が空間的に分離された複数個の位 置に配置された固体支持手段からなり、各位置には単一の結合剤が０．１ｖ／Ｋ ｍｏｌｅ未満、好ましくは０．０１Ｖ／Ｋｍｏｌｅ未満（Ｋｌ／ｍｏｌｅはその 結合剤の、それに特異的な被検物質との反応についての平衡定数である）存在す ることを特徴とする装置。
11. １１．容量Ｖｌの液体サンプル中の複数個の被検物質の環境内濃度を測定するた めに使用されるキットにおいて、 液体サンブル中に存在するまたは存在する可能性がある被検物質とそれぞれ可逆 的に結合可能で液体サンプルの他の成分に比較してその被検物質に対して特異的 左複数個の異なる結合剤が空間的に分離された複数個の位置に配置されている固 体支持手段であつて、各位置には単一の結合剤が０．１Ｖ／Ｋｍｏｌｅ未満、好 ましくは０．０１Ｋ／Ｖｍｏｌｅ未満（Ｋｌ／ｍｏｌｅはその結合剤の、それに 特異的な被検物質との反応についての平衡定数である）存在する固体支持体、液 体サンプル中の濃度を測定しようとする被検物質の既知濃度を含有する複数個の 標準サンプル、および結合剤上の充填または非充填結合部位と反応させるための 標識された部位認識試薬のセットから構成されるキット。