DK164944B

DK164944B - Fremgangsmaade, indretning og analysesaet til bestemmelse af koncentrationer af flere analytter i en vaeske

Info

Publication number: DK164944B
Application number: DK029390A
Authority: DK
Inventors: Roger Philip Ekins
Original assignee: Multilyte Ltd
Priority date: 1987-08-06
Filing date: 1990-02-05
Publication date: 1992-09-14
Also published as: GR3005905T3; FI92110C; AU2253488A; DE3872621D1; NO900534D0; NO177205C; ATE78101T1; ZA885825B; FI92110B; DE3872621T2; NO177205B; WO1989001157A1; CA1334278C; JP2562194B2; DK164944C; BR8807644A; DK29390A; KR890702033A; US5432099A; GB8803000D0

Description

i

DK 164944 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde, indretning og analysesæt til bestemmelse af analytkoncentrationer i en væske f.eks. bestemmelse af analytter såsom hormoner, proteiner og andre naturligt forekommende eller kunstigt 5 tilstedeværende substanser i biologiske væsker såsom legemsvæsker.

Det er i international patentansøgning W084/01031 blevet foreslået at måle koncentrationen af en analyt i et flui-10 dum ved at bringe dette i kontakt med en spormængde af et bindingsmiddel såsom et antistof, der er specifikt for analytten i den betydning, at det binder analytten reversibelt, men ikke binder andre komponenter i fluidet, bestemme en kvantitet, der er repræsentativ for den del 15 af bindingssteder på bindingsmidlet, der er besatte, og fra denne kvantitet estimere analytkoncentrationen. I ansøgningen bemærkes det, at såfremt mængden af bindingsmiddel er tilstrækkelig lav således, at dets indføring i fluidet ikke medfører nogen signifikant formindskelse af 20 koncentrationen af (ikke-bundet) analyt, er brøkdelen af bindingssteder på bindingsmidlet, der er besatte af analytten, effektivt uafhængig af det absolutte volumen af fluidet og af den absolutte mængde af bindingsmidlet, dvs. uafhængig inden for de fejlgrænser, der sædvanligvis 25 er forbundet med måling af besættelsesbrøkdelen. Under sådanne omstændigheder, og kun ved disse omstændigheder, er begyndelseskoncentrationen [H] af analyt i fluidet relateret til brøken Ab/AbQ af bindingssteder på bindingsmidlet, der er besatte af analytten, ved ligningen: 30

Ab = Kab[H] ^o 1 + Kabm 35 hvor Kah, herefter betegnet som K, er ligevægtskonstanten for bindingen af analytten til bindingsstederne og K er 4» 2

DK 164944 B

en konstant for en given analyt og bindingsmiddel ved en vilkårlig temperatur. Denne konstant er alment kendt som affinitetskonstanten, især når bindingsmidlet er et antistof, f.eks. et monoklonalt antistof.

5

Idéen med at anvende blot en spormængde af bindingsmiddel står i modsætning til almindeligvis anbefalet praksis inden for området af immunassay og immunometriske teknikker. F.eks. er det foreslået i et velkendt arbejde såsom 10 "Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology", ed. S.A. Berson og R.S. Yalow, 1973 på siderne 111-116, at der ved udførelse af’ et kompetitivt immunassay opnås maksimal følsomhed af assayet, såfremt delen af "sporana-lyt", der er bundet, nærmer sig 50%. For at opnå sådan en 15 høj grad af binding af analytten kræver teorien af Berson og Yalow, der i dag er alment accepteret af andre forskere på området, at koncentrationen af bindingsmiddel, eller strengt taget bindingssteder, idet hvert molekyle af bindingsmidlet konventionelt set har et eller maksi-20 malt to bindingssteder, skal være større end eller lig med den reciprokke værdi af ligevægtskonstanten K af bindingsmidlet overfor analytten, dvs. [Ab] ^ 1/K. For en prøve med volumet V, skal den totale mængde bindingsmiddel, eller bindingssteder, derfor være større end eller 25 lig med V/K. Et bindingsmiddel, som er et monoklonalt antistof, kan f.eks. have en ligevægtskonstant K af størrelsesordenen 1011 1/mol over for det specifikke antigen, til hvilket det binder sig. Under den ovenfor alment accepterede praksis kræves en koncentration af bin- -11 30 dingsmiddel eller -steder af størrelsesordenen 10 mol/1 eller mere for bindingsmidler med en sådan ligevægtskonstant, og for fluid-prøvevoluminer af størrelses- -14 ordenen 1 ml kræves konventionelt anvendelse af 10 eller flere mol bindingsmiddel eller bindingssteder.

23 -14 35 Avogadro's tal er ca. 6 x 10 saledes, at 10 mol bin- o dingssteder er ækvivalent til mere end 10 bindingsmiddelmolekyler, selv under antagelse af, at bindingsmid- 3

DK 164944 B

let besidder to bindingssteder per molekyle. For specifikke bindingsmidler af den allehøjeste affinitet, er K 13 mindre end 10 1/mol saledes, at den konventionelle 7 praksis kræver mere end 10 bindingsmiddelmolekyler, 5 hvorimod bindingsmidler med lavere affinitet af størrel- 8 sesordenen 10 1/mol nødvendiggør anvendelse af mere end 12 10 molekyler under konventionel praksis. Alle immun-assay-analysesæt, der markedsføres kommercielt i dag, er i overensstemmelse med disse begreber og benytter en 10 mængde bindingssteder, der nærmer sig eller hyppigere er betragteligt i overskud af V/K. I visse typer af kit, der bygger på benyttelsen af mærkede antistoffer, er det sædvane at benytte så meget bindingsmiddel som muligt, hvorved analytbindingsdelen kraftigt overstiger 50%.

15 På grund af bindingen af væsentlige dele f.eks. 50% af analytten i væskeprøven under afprøvning i sådanne systemer, er besættelsesbrøken af bindingssteder for bindingsmidlet ikke uafhængig af væskeprøvens volumen således, at 20 det for nøjagtig kvantitativ assay er nødvendigt at regulere prøvevolumet nøjagtigt, idet volumet holdes konstant i alle afprøvninger, hvad enten prøven er af ukendt koncentration eller af standardprøver med kendt koncentration, der anvendes til at danne dosis-responskurven. End-25 videre kræver sådanne systemer ligeledes omhyggelig regulering af mængden af bindingsmiddel, der er tilstede i standarden eller kontrolinkubationsreagensglassene. Disse begrænsninger hos kendt teknik er universelt erkendte og accepterede.

30 GB patentansøgning nr. 2 099 578A beskriver en indretning til immunassay, der omfatter en porøs fast bærer, til hvilken antigener eller mindre hyppigt immunoglobuliner bindes på et antal rummeligt adskilte steder, hvilken 35 indretning tillader et stort antal kvalitative eller kvantitative immunassay at blive udført på den samme bærer, f.eks. for at etablere en antistofprofil af en prøve 4

DK 164944 B

af human blodserum. Skønt de individuelle anbringelsessteder kan være i form af såkaldte mikropletter, der er fremstillet ved at anbringe dråber af antigen-holdige opløsninger eller suspensioner derpå, anses molantallet af 5 antigener, der er tilstede på hvert sted, tilsyneladende stadigt som værende tilstrækkeligt til at binde i det væsentlige al analyt, f.eks. antistof, hvis koncentration i væskeprøven skal måles under afprøvningen. Dette er klart ud fra det faktum, at den kvantitative fremgangsmåde,· der 10 benyttedes i ansøgningen, side 3 linierne 21-28, involverer kalibrering med kendte mængder immunoglobulin, der påføres bæreren; men dette betyder, at i prøverne, der afprøves, skal i det væsentlige hvert molekyle ekstrahe-res fra prøven før en sand sammenligning kan udføres, og 15 dermed at store mængder antigen, f.eks. bindingsmiddel i denne situation, kræves i hver mikroplet, og hvilke mængder skal være i overskud af den totale mængde analyt, f.eks. i denne situation antistof, der er tilstede i prøven.

20

Resumé af opfindelsen

Den foreliggende opfindelse bygger på den opfattelse, at benyttelsen af høje mængder bindingsmiddel er hverken 25 nødvendig eller er alment ønskelig for at opnå en god følsomhed i immunassay. Såfremt mængden af bindingsmiddel, i stedet for at være holdt så stor som mulig, reduceres således, at kun en ubetydelig del af analytten er reversibelt bundet til det, almindeligvis mindre end 10%, 30 sædvanligvis mindre end 5% og for optimale resultater blot 1 eller 2%, eller mindre, er det ikke længere nødvendigt at benytte et nøjagtigt reguleret konstant volumen for alle væskeprøver, dvs. standardopløsninger og ukendte prøver, i en given assay. Endvidere er det muligt 35 at opnå pålidelige og nogle gange selv forbedrede estimater af analytkoncentrationer ved at anvende V/K mol bindingsmiddel-bindingssteder, der er meget mindre, f.eks.

5

DK 164944 B

ikke mere end 0,1 V/K og fortrinsvis mindre end 0,01 V/K.

For et bindingsmiddel med en ligevægtskonstant K for ana- 11 lytten af størrelsesordenen 10 1/mol og prøver af ca. 1 ml størrelse, er dette cirka ækvivalent til ikke mere end 8 7 5 10 , fortrinsvis mindre end 10 , bindingsmiddelmolekyler

på hvert sted i en individuel række. Såfremt værdien af K

13 6 5 er 10 1/mol, er tallene hhv. 10° og 10° molekyler, og

O

såfremt K er af størrelsesordenen 10 1/mol er tallene 11 10 2 hhv. 10 og 10 molekyler. For færre end 10 bindings- 10 middelmolekyler på et enkelt sted vil nøjagtigheden af målingen blive progressivt mindre, idet bindingsmiddel- stedernes besættelsesbrøk af analytten kun vil være i stand til at ændre sig i diskrete trin i takt med, at de individuelle steder bliver besatte eller ikke-besatte, 15 men i princippet vil benyttelse af så få som 10 molekyler være tilladelig, såfremt et estimat med en nøjagtighed på 10% er acceptabel. Praktiske overvejelser kan give anled- 4 ning til en præference for mere end 10 molekyler.

20 Det har vist sig generelt, at for antistof med en affinitetskonstant på K 1/mol for et antigen, følger relationen mellem antistofkoncentrationen og besættelsesbrøken af bindingsstederne ved en vilkårlig givet antigenkoncentration og relationen mellem antistofkoncentrationen og pro-25 centbundet antigen til bindingsstederne ved en vilkårlig given antigenkoncentration de samme kurver, såfremt antistofkoncentrationerne og antigenkoncentrationerne hver udtrykkes i brøker eller multipla af 1/K. Dette er illustreret på den ledsagende tegning, som viser en graf, der 30 repræsenterer to sæt kurver, som afbilder disse relationer. Hver kurve angår antistofkoncentrationen [Ab], der er udtrykt i enheder af 1/K, og afsat langs X-aksen.

For det sæt kurver, som er konstante eller hælder med voksende [Ab], repræsenterer Y-aksen besættelsesbrøk-35 delen, F, af bindingsstederne på antistoffet, der er besatte af antigenet. For det andet sæt kurver repræsenterer Y-aksen procent, b%, antigen, der er bundet til bin- 6

DK 164944 B

dingsstederne. De individuelle kurver i hvert sæt repræsenterer relationen, der svarer til fire forskellige antigenkoncentrationer [An], der udtrykt i enheder af K, nemlig 10/K, 1,0/K, 0,1/K og 0,01/K. Disse kurver viser, 5 at idet [Ab] falder, antager F et i det væsentlige konstant niveau, hvis værdi afhænger af [An].

Det forstås derfor, at den ovennævnte GB patentansøgning nr. 2 099 578A, der for kvantitative vurderinger bygger 10 på store mængder bindingsmiddel og i det væsentlige total beslaglæggelse af alle analytter, fejler i at erkende den opnåede fordel ved den forliggende opfindelse, som i stedet bygger på et andet analytisk princip, der kræver måling af besættelsesbrøkdelen af bindingsmidlet, og hvil-15 ket princip således kun kræver en meget lille del af de totalt tilstedeværende analytmolekyler, der skal beslaglægges fra prøven.

Efter erkendelsen af, at benyttelsen af så små mængder 20 bindingsmiddel er tilladelig, bliver det gennemførligt at placere bindingsmidlet, der kræves for en enkelt koncentrationsmåling, på et meget lille område af en fast bærer og dernæst placere en lang række forskellige bindingsmidler, der er specifikke for forskellige analytter og 25 som enten er eller som kan være tilstede samtidigt i væsken, der skal analyseres, side om side med hinanden men på rummeligt adskilte punkter på en enkelt fast bæ rer. Samtidig eksponering af hver af de separate punkter for væsken, der skal analyseres, vil forårsage, at hver 30 bindingsmiddelplet optager analytten, for hvilken den er specifik, i en udstrækning, dvs. svarende til besættelsesbrøkdelen af bindingsstedet, der er repræsentativ for analytkoncentrationen i væsken, såfremt volumet af opløsningen og analytkoncentrationen deri er store nok, 35 således at kun en ubetydelig brøkdel, almindeligvis mindre end 10% sædvanligvis mindre end 5% af analytten, er bundet til dette punkt. Besættelsesbrøkdelen af bin- 7

DK 164944 B

dingsstederne for hvert bindingsmiddel kan dernæst blive bestemt ved anvendelse af separate sted-genkendende midler, som genkender enten de ikke-fyldte bindingssteder eller de fyldte bindingssteder af de forskellige bin-5 dingsmidler, og som er mærkede med markører, der gør det muligt at måle koncentrationsniveauerne af de separate reagenser, der er bundet til forskellige bindingsmidler, f.eks. fluorescensmarkører. Sådanne målinger kan udføres enten i en rækkefølge f.eks. ved anvendelse af en laser, 10 som scanner henover bæreren, eller samtidigt f.eks. ved anvendelse af en fotografisk plade, der afhænger af naturen af markørerne. Andre billedindretninger, såsom et TV-kamera kan ligeledes benyttes, hvor dette er passende.

Da bindingsmidlerne er rummeligt adskilte fra hinanden, 15 er det muligt at benytte blot et lille antal forskellige markører eller endda den samme markør hele tiden og scanne hvert bindingsmiddelsted særskilt for at bestemme tilstedeværelsen og koncentrationen af markøren. Ved at benytte opfindelsen kan væsentlig flere end tre analyser 20 udføres inden for en enkel eksponering af den faste bærer med væske, der skal analyseres, f.eks. 10, 20, 30, 50 eller selv op til 100 eller flere hundrede analyser.

Totalt set tilvejebringer den foreliggende opfindelse 25 derfor en fremgangsmåde til at bestemme koncentrationer af et antal analytter i en væskeprøve af voluminet V 1, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at et antal forskellige bindingsmidler, der hver er i stand til reversibelt at binde en analyt, som er eller kan være til-30 stede i væsken, og som er specifik for denne analyt sammenlignet med andre komponenter af væskeprøven, anbringes et bæremiddel på et antal rummeligt adskilte steder således, at hvert sted ikke har mere end 0,1 V/K mol af et enkelt bindingsmiddel, hvor K 1/mol er ligevægtskonstan-35 ten mellem bindingsmidlet og analytten, 8

DK 164944 B

det belagte bæremiddel bringes i kontakt med væskeprøven, der skal analyseres således, at hver af de rummeligt adskilte steder bringes i kontakt med væsken under den samme operation, idet mængden af benyttet væske i prøven er 5 således, at kun en ubetydelig del af en vilkårlig analyt, der er tilstede i væskeprøven, bliver bundet til bindingsmidlet, der er specifikt for det, og en parameter, der er repræsentativ for besættelsesbrøk-10 delen af bindingsmidler, der er besatte af analytten, måles ved de rummelig adskilte steder ved en kompetitiv eller ikke-kompetitiv assayteknik, der benytter et stedgenkendende middel for hvert bindingsmiddel, hvilket reagens er i stand til at genkende enten de ikke-fyldte bin-15 dingssteder eller de fyldte bindingssteder, på bindingsmidlet, og hvilket stedgenkendende middel er mærket med en markør, der gør det muligt at måle mængden af midlet på det pågældende sted, 20 Opfindelsen tilvejebringer ligeledes en indretning til brug ved bestemmelse af koncentrationer af et antal ana-lytter i en væskeprøve af volumen V 1, der er ejendommelig ved at omfatte et fast bæremiddel, der på et antal rummeligt adskilte steder har anbragt et antal forskel-25 lige bindingsmidler, der er i stand til reversibelt at binde en analyt, som er eller kan være tilstede i væskeprøven, og som er specifik for denne analyt sammenlignet med de øvrige komponenter af væskeprøven, idet hvert sted ikke har mere end 0,1 V/K, fortrinsvis mindre end 0,01 30 V/K mol, af et enkelt bindingsmiddel, hvor K 1/mol er ligevægtskonstanten af bindingsmidlet for reaktion med analytten, for hvilket det er specifikt.

Endvidere tilvejebringer opfindelsen tillige et analyse-35 sæt til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilket analysesæt omfatter 9

DK 164944 B

en indretning ifølge opfindelsen, et antal standardprøver indeholdende kendte koncentrationer af analytterne, hvis koncentrationer i væskeprøven 5 skal måles, og et sæt mærkede sted-genkendende reagenser, der kan reagere med fyldte eller ikke-fyldte bindingssteder på bindingsmidlerne - 10

Detaljeret beskrivelse

Valget af fast bærer er en sag der overlades til brugeren. Det foretrækkes, at bæreren er ikke-porøs således, at 15 bindingsmidlet er placeret på dens overflade f.eks. som et monolag. Benyttelse af en porøs bærer kan forårsage, at bindingsmidlet, afhængig af dets molekylstørrelse, bliver båret ned i bærerens porer, hvor dets eksponering for analy tten, hvis koncentration skal bestemmes, og 20 ligeledes kan være påvirket af geometrien af porerne således, at der opnås en falsk aflæsning. Porøse bærere såsom nitrocellulosepapir, der er plettet med pletter af bindingsmiddel, foretrækkes derfor mindre. Modsat de bærer, der anvendes i GB patentskrift 2 099 578A, som synes 25 at skulle være porøse pga. det store antal molekyler, der skal vedhæftes, benytter bærere til brug i den foreliggende opfindelse meget mindre mængder og behøver derfor ikke at være porøse. Ikke-porøse bærere kan f.eks. være af et plastmateriale eller glas og et vilkårligt bekvemt 30 stift plastmateriale kan benyttes. Polystyren er et fore-trukkent plastmateriale, skønt andre polyolefiner eller acryl- eller vinyl-polymere ligeledes vil kunne blive benyttet .

35 Bæremidler kan omfatte mikroperler f.eks. af et plastmateriale, som kan belægges med et ensartet lag af bindingsmiddel, og som kan tilbageholdes på specifikke ste- 10

DK 164944 B

der, f.eks. fordybninger, på en bæreplade. Alternativt kan materialet være i form af en flade eller plade, som er plettet med en række pletter af bindingsmidlet. Det kan være en fordel for konfigurationen af bæremidlet at 5 være indrettet således, at væskeprøver af ca. voluminet V 1 let tilbageholdes i kontakt med antallet af rummeligt adskilte steder, der er markeret med forskellige bindingsmidler. F.eks. kan de rummeligt adskilte steder være arrangeret i en brønd i bæremidlet, og et antal af brøn-10 de, der hver er tilvejebragt med den samme gruppe af forskellige bindingsmidler på rummeligt adskilte steder, kan være forbundet sammen for at udgøre en mikrotiterplade til brug sammen med et antal prøver.

15 Når bæremidlet skal bruges i forbindelse med et målesystem, der involverer lysscanning, er det ønskeligt at materialet, f.eks. plast, er uigennemsigtig for lys, f.eks. kan det være fyldt med et uigennemsigtigt materiale, som inter alia kan være hvidt eller sort såsom 20 carbonblack, når signalerne, der skal måles fra bindingsmidlet eller fra det sted-genkendende middel er lyssignaler fra fluorescens- eller luminescensmarkører. Almindeligvis foretrækkes reflektive materialer i dette tilfælde for at forøge lysopsamlingen i detektionsinstrumentet el-25 ler på den fotografiske plade. Det endelige valg af optimalt materiale er styret af dets evne til at vedhæfte bindingsmidlet til dets overflade, dets fravær af baggrundsemissionssignal og dets besiddelse af andre egenskaber, der har tendens til at maksimere signal-støj-30 forholdet for den særlige markør eller markører, der er hæftet til bindingsmidlet, som er anbragt på bærematerialets overflade. Meget tilfredsstillende resultateter blev opnået i de nedenfor beskrevne eksempler ved at benytte en hvid uigennemsigtig polystyrenmikrotitreplade, 35 der er kommerciel tilgængelig fra Dynatech under varemærket "White Microfluor"-mikrotitrebrønde.

DK 164944 B

11

Bindingsmidlerne, der anvendes, kan være bindingsmidler af forskellig specificitet, dvs. midler, som er specifikke for forskellige analytter, eller to eller flere af dem kan være specifikke midler af den samme specificitet, men 5 af forskellig affinitet, dvs. midler, som er specifikke for den samme analyt, men som har forskellig ligevægtskonstanter K for reaktionen med analytten. Det sidstnævnte alternativ er særligt nyttigt, hvor koncentrationen af analytten, der skal afprøves, i den ukendte prøve, kan 10 variere over betragtelige koncentrationer f.eks. 2 eller 3 størrelsesordener som i tilfældet af HCG-måling i urin fra gravide kvinder, hvor analytkoncentrationen kan variere fra 0,1 til 100 eller flere IU/ml.

15 De benyttede bindingsmidler vil fortrinsvis være antistof især fortrinsvis monoklonale antistoffer. Monoklonale antistoffer er en bred skare biologiske væskeingredienser, som er kommercielt tilgængelige eller som kan fremstilles ved kendte teknikker. Det anvendte antistof kan 8 20 udvise konventionelle affinitetskonstanter f.eks. fra 10 12

DK 164944 B

sætteisen af bindingssteder, er der ligeledes intet behov for at måle signalet fra den fulde plet, men scanning af blot en del af denne er tilstrækkelig. Hvert bindingsmiddel foretrækkes mærket med den samme markør, men forskel-5 lige markører kan benyttes.

Bindingsmidlerne kan påføres bæreren på et vilkårligt antal måder, der er kendte eller konventionelt brugte til belægning af bindingsmidler på bærere såsom reagensglas 10 f.eks. ved at bringe hver rummeligt adskilt sted på bæreren i kontakt med en opløsning af bindingsmidlet i form af en lille dråbe, f.eks. 0,5 ul på en 1 mm2 plet, og tillade dem at forblive i en kontakt over en periode før afvaskning af dråberne. En stort set konstant lille brøk-15 del af bindingsmidlet, der er tilstede i dråben, bliver adsorberet på bæreren som et resultat af denne procedure.

Det skal bemærkes, at belægningsdensiteten af bindingsmidlet på en mikroplet ikke behøver være mindre end belægningsdensiteten på konventionelt antistof-belagte rea-20 gensglas. Reduktionen i antal af molekyler på hver plet kan opnås alene ved at reducere størrelsen af pletten frem for belægningsdensiteten. En høj belægningsdensitet er generelt ønskelig for at maksimere signal-støjforhol det. Størrelsen af pletterne er med fordel mindre end 10 25 mm2, fortrinsvis mindre end 1 mm2. Adskillelsen er ønskelig, men ikke nødvendigvis, 2 eller 3 gange radius af pletten eller mere. Disse foreslåede geometrier kan ikke desto mindre ændres efter ønske, idet de alene er underkastet begrænsningerne på antallet af bindingsmiddel-30 molekyler i hver plet, det minimale volumen af prøven, for hvilket rækken af pletter vil blive eksponeret, og midlerne, der er lokalt til rådighed for bekvem fremstilling af en række pletter på den beskrevne måde.

35 Når bindingsmidlene først er blevet belagt på bæreren, er det konventionel praksis i tilfældet af antistof som bindingsmiddel at vaske bæreren med en opløsning indehold- 13

DK 164944 B

ende albumen eller andre proteiner for at mætte alle tiloversblevne ikke-specifikke absorptionssteder på bæreren og andre steder. For at bekræfte, at mængden af bindingsmiddel i en enkelt plet vil være mindre end den maksimale 5 mængde, 0,1 V/K, der er krævet for at være i overensstemmelse med princippet ifølge opfindelsen, kan mængden af bindingsmiddel, der er tilstede på et vilkårlig enkelt sted, kontrolleres ved at mærke bindingsmidlet med en de-tekterbar markør af kendt specifik aktivitet, f.eks. en 10 kendt mængde markør per vægtenhed bindingsmiddel, og måle mængden af tilstedeværende markører. Hvis anvendelsen af markørbinder ikke ønskes på den faste bærer, der benyttes i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan bindingsmidlet ikke desto mindre mærkes i et forsøgseksperiment, og 15 identiske betingelser til de, der findes i forsøget kan benyttes til at påføre ikke-mærket bindingsmiddel til bæreren, som aktuelt skal benyttes, for at gøre det muligt at korrigere belægningerne af bindingsmiddel.

20 Den minimale størrelse af væskeprøven, V 1, er korreleret til antallet af mol bindingsmiddel, mindre end 0,1 V/K, således at kun en ubetydelige del af den tilstedeværende analyt i væskeprøven bliver bundet til bindingsmidlet.

Denne del er som en almen regel mindre end 10%, sædvan-25 ligvis mindre end 5%, og om ønsket 1 eller 2%, eller mindre, afhængigt af nøjagtigheden, der ønskes for afprøvningen, idet større nøjagtighed opnås alt andet lige, når mindre andele af analytten er bundet, og afhængigt af størrelsen af andre fejl-introducerende faktorer, der er 30 tilstede. Prøvestørrelser af størrelsesordenen 1 eller få ml eller mindre, f.eks. ned til 100 ul, eller mindre, foretrækkes ofte, men omstændigheder kan forekomme, hvor større volumen bekvemt afprøves, og geometrien kan være justeret i overenstemmelse hermed. Prøven kan blive an-35 vendt ved dens naturlige koncentrationsniveau eller såfremt det ønskes, kan den være fortyndet i et kendt omfang.

14

DK 164944 B

De sted-genkendende reagenser, der anvendes i fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan selv være antistof, f.eks. monoklonale antistoffer, og de kan være anti-idiotypiske eller anti-analyt antistoffer, idet sidstnævnte genkender 5 besatte steder. Alternativt kan f.eks. for en analyt af lille molekylstørrelse såsom thyroxin, T4, ikke besatte steder blive genkendt ved enten selve analytten, der er udstyret med passende mærke, eller analytten, der er kovalent koblet til et andet molekyle, f.eks. et protein-10 molekyle, hvilket molekyle er direkte eller indirekte mærket. De sted-genkendende reagenser kan være direkte eller indirekte mærkede med konventionelle fluorescensmærker såsom fluorescein, rhodamin eller Texas rød, eller materialer, der er anvendelige til tids-opløst pulseret 15 fluorescens såsom europium og andre lanthanide chelater, på en konventionel måde. Andre markører såsom chemilumi-niscens-, enzym- eller radioisotopiske markører kan anvendes, såfremt dette er passende. Hvert sted-genkendende reagens foretrækkes at være mærket med den samme markør, 20 men forskellige markører kan anvendes for forskellige reagenser. De sted-genkendende reagenser kan være specifikke for en enkelt af bindingsmiddel/analyt/pletterne i hver gruppe af pletter, eller under visse betingelser, som med glycoproteinhormoner såsom HCG og FSH, som har et 25 fælles bindingssted, kan de være krydsreagerende reagenser, der er i stand til at reagere med besatte bindingssteder i mere end en af pletterne.

I assayteknikken kan signaler, der er repræsentative for 30 besættelsesbrøken af bindingsmidlet i afprøvningsprøverne af ukendte koncentrationer af analytterne, være kalibreret ved reference til dosis-responskurver, der er tilvejebragt ud fra standardprøver indeholdende kendte koncentrationer af de samme analytter. Sådanne standardprø-35 ver behøver ikke indeholde alle analytterne sammen, såfremt hver af analytterne er tilstede i visse af standardprøverne. Besættelsesbrøken kan måles ved at estimere

DK 164944B

15 de besatte bindingssteder, ligesom med anti-analyt antistof, eller ikke-besatte bindingssteder, som med et anti-idiotypisk antistof, idet den ene er den omvendte af den anden. For større nøjagtighed er det ønskeligt at måle 5 brøkdelen, som er tættere mod nul, fordi en ændring i besættelsesbrøken på 0,01 er forholdsmæssigt større i dette tilfælde, skønt for besættelsesbrøker i området 25-75% er begge alternativer generelt tilfredsstillende.

10 I en udførelsesform ifølge opfindelsen, som bygger på fluorescensmarkører, kan målingen af den relative intensitet af signalerne fra de to markører, den ene fra bindingsmidler og den anden fra det sted-genkendende reagens, udføres ved hjælp af et konfokalt laser-scannings-15 mikroskop såsom et Bio-Rad Lasersharp, MRC 500, der er til rådighed fra Bio-Rad Laboratories Ltd., og som har et dobbeltkanal-detektionssystem. Dette instrument virker på basis af en laserstråle, der scanner pletterne eller lignende på bæreren for at bevirke fluorescens fra markø-20 rerne, samt på basis af bølgelængdefiltre til at adskille og måle mængden af emitteret fluorescens. Tids-opløste fluorescens-fremgangsmåder kan ligeledes anvendes. Interferences såkaldt krydstale, mellem de to kanaler kan blive kompenseret ved standardkorrektion, såfremt det 25 forekommer, eller konventionelle tiltag kan udøves for at reducere den. Diskriminering af to fluorescenssignaler, der er emitteret af dobbelt-mærkede pletter, opnås i den foreliggende udførelsesform af instrumentet ved hjælp af filtre, der er i stand til at skelne mellem de karakte-30 ristiske bølgelængder af de to fluorescensemissioner. Fluorescenssubstanser kan blive skelnet ved hjælp af andre fysiske karakteristika såsom foreskelle i fluorescens-henfaldstider, udglødningstider, etc., og en vilkårlig af disse kan blive anvendt enten alene eller i 35 kombination til at differentiere mellem to fluoroforer og dermed tillade måling af forholdet mellem to fluorescensmærkede bestanddele, bindingsmiddel og sted-genkendende

DK 164944B

16 reagens, der er tilstede på en enkelt plet, ved anvendelse af velkendte teknikker inden for fluorescensmåleom-rådet. Når blot en fluorescensmarkør er tilstede, kan de samme teknikker anvendes, såfremt der drages omsorg, for 5 at hele pletten scannes i hvert tilfælde og pletterne indeholder essentielt set de samme mængder bindingsmiddel fra et assay til det næste, når ukendte prøver og standardprøver benyttes.

10 I tilfældet af andre markører såsom radioisotopiske markører, chemiluminiscensmarkører eller enzymmarkører er analoge midler til at skelne de individuelle signaler fra hinanden eller for hver af et par af sådanne markører 1 9ζ 1 qi velkendte. F.eks. to radioisotoper såsom I og I kan 15 let skelnes på basis af de forskellige energier af deres respektive radioaktive emissioner. Ligeledes er det muligt at identificere produkterne fra to enzymreaktioner, der er afledt ud fra to dobbeltenzym-mærkede antistofkoblingspar, hvilke f.eks. kan være af forskellige farver, 20 eller to chemiluminiscensreaktioner, f.eks. af forskellig chemiluminiscenslevetid eller bølgelængde af emissionslyset, ved hjælp af kendte teknikker på de respektive områder .

25 Opfindelsen kan benyttes til afprøvning af analytter, der er tilstede i biologiske væsker f.eks. humane legemsvæsker såsom blod, serum, salvie eller urin. De kan anvendes til afprøvning af en bred skare af hormoner, proteiner, enzymer eller andre analytter, som enten er tilstede na-30 turligt i væskeprøven eller som kan være kunstigt tilstede såsom lægemidler, forgiftninger eller lignende.

For eksempel kan opfindelsen benyttes til at tilvejebringe en indretning til kvantitativ afprøvning af et antal 35 hormoner, der er relateret til graviditet og reproduktion, såsom FSH, LH, HCG, prolactin og steroidhormoner, f.eks. progesteron, estradiol, testosteron, og androte- 17

DK 164944 B

sten-dion, eller hormoner fra den adrenale hypofysære akse" såsom cortisol, ACTH og aldosteron, eller thyroid-relaterede hormoner såsom T4, T3 og TSH og deres bindingsprotein TBG, eller vira såsom hepatitis, AIDS eller 5 herpes virus eller bakterier såsom stafylococci, streptococci, pneumococci, gonococci og enterococci, eller tumor-relaterede peptider såsom AFP eller CEA, eller lægemidler såsom de lægemidler, der er forbudte som ulovlige stimuleringsmidler for atleters ydeevne, eller føde-10 vareforurenende stoffer. I hvert tilfælde vil de anvendte bindingsmidler være specifikke for analytterne, der skal afprøves, sammenlignet med andre komponenter af prøven, og kan være bindingsmidlernes monoklonale antistoffer derfor.

15

Yderligere detaljer vedrørende metodikken kan findes i den internationale patentansøgning nr. W088/01058.

Opfindelsen er illustreret ved de følgende eksempler.

20 EKSEMPEL 1

Et anti-TNF-antistof, tumor nekrosefaktor, med en affi- g nitetskonstant for TNF ved 25 °C på ca. 1 x 10 1/mol er 25 mærket med Texas rød. En opløsning af antistoffet med en koncentration på 80 ug/ml fremstilles og 0,5 ul prøver af denne opløsning tilsættes i form af dråber til hver brønd af "Dynatech Microfluor" (uigennemsigtig hvid) -fyldte polystyren-mikrotitreplader med 12 brønde.

30

Et anti-HCG-antistof, human chorion gonadotropin, med en

Q

affinitetskonstant for HCG ved 25 "C på ca. 6 x 10 1/mol mærkes ligeledes med Texas rød. En opløsning af antistoffet fremstilles med en koncentration på 80 ug/ml og 0,5 35 ul prøver af denne opløsning tilsættes i form af dråber til hver brønd af samme "Dynatech Microfluor" mikrotitreplade.

18

DK 164944 B

Efter tilsætning af dråberne efterlades pladen i få timer i en fugtig atmosfære for at forhindre fordampning af dråberne. I denne tid bliver nogle af antistofmolekylerne i dråberne adsorberet til pladen. Dernæst vaskes brøndene 5 adskillige gange med en phosphatbuffer og de fyldes dernæst med ca. 400 ul 1% albumen-opløsning og efterlades i flere timer for at mætte rest-bindestederne i brøndene. Derefter vaskes de igen med phosphatbuffer.

10 Den resulterende plade har i hver af dens brønde to pletter hver med et areal på ca. 1 mm2. Måling af mængden af fluorescens viser, at i hver brønd indeholder en plet ca. g 5 x 10 molekyler anti-TNF-antistof og den anden plet g indeholder ca. 5 x 10 molekyler anti-HCG-antistof. Brøn- 15 dene er konstrueret til brug for væskeprøver af 400 ul -14 volumen, således at 0,1 V/K er 4 x 10 mol, anti-TNF- antistof, hvilket er ækvivalent til 2,4 x 101® molekyler, -14 og 7 x 10 mol anti-HCG-antistof, hvilket er ækvivalent 10 til 4 x 10 molekyler.

20 EKSEMPEL 2

En mikrotitreplade, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 1, benyttes i et assay for en kunstigt produce-25 ret opløsning indeholdende TNF og HCG. En testprøve af opløsningen, på ca. 400 ml tilsættes til en af brøndene og inkuberes i flere timer. Ca. 400 μΐ forskellige stan-dardopløsninger indeholdende kendte koncentrationer, 0,02, 0,2, 2 og 20 ng/ml TNF eller HCG tilsættes til hver 30 af pladens brønde og inkuberes ligeledes i flere timer. Brøndene vaskes dernæst flere gange med bufferopløsning.

Som sted-genkendende reagens benyttes for TNF-pletterne et anti-TNF-antistof, der har en affinitetskonstant for 35 TNF ved 25 “C på ca. 1 x 101^5 1/mol, og for HCG-pletterne et anti-HCG-antistof, der har en affinitetskonstant for HCG ved 25 “C på ca. 1 x 1011 1/mol. Begge antistoffer er 19

DK 164944 B

mærket med fluorescein, FITC. 400 μΐ prøver af opløsningerne af disse mærkede antistoffer tilsættes til brøndene og henstilles i få timer. Brøndene vaskes dernæst med buffer.

5

Det resulterende fluorescensforhold af hver plet kvantificeres med et Bio-Rad Lasersharp MRC 500 konfukalt mikroskop. Fra standardopløsningerne opbygges dosis-responskurver for TNF og HCG, hvilke tal for TNF er som 10 følger: TNF-koncentraton - pa TNF-plet ng/ml Texas rød fluorescens 0,02 1,1 15 0,2 4,6 2 7,9 20 42,5 og de for HCG er som følger: 20 HCG-koncen tration FITC-fluorescens på HCG-plet ng/ml Texas rød fluorescens 0,02 1,8 0,2 7,2 25 2 16,0 20 28,2

Den kunstigt fremstillede opløsning blev fundet at give forhold aflæsninger på 5,9 på TNF-pletten og 10,5 på HCG-30 pletten, hvilket korrelerer godt med de aktuelle koncen trationer af TNF på 0,5 ng/ml og af HCG på 0,5 ng/ml, der er opnået ud fra dosis-responskurver.

EKSEMPEL 3 35

Under anvendelse af tilsvarende procedurer som de, der er beskrevet i eksempel 1 fremstilles en mikrotitreplade, 20

DK 164944 B

der indeholder pletter med mærket anti-T4-antistof (thy- roxin) med en affinitetskonstant på ca. 1 x 10 1/mol ved 25 °C, mærket anti-TSH-antistof (thyroid-stimulerende g hormon) med en affinitetskonstant på ca.. 5 x 10 1/mol 5 ved 25 °C, og mærket anti-T3-antistof (triiodthyronin) 11

med en affinitetskonstant på ca. 1 x 10 1/mol ved 25 °C

i hver af de individuelle brønde, hvilke pletter inde- -12 holder mindre end 1 x 10 V mol anti-T4-antistof eller mindre end 2 x 10-1^ V mol anti-TSH-antistof eller mindre -12 10 end 1 x 10 V mol anti-T3-antistof.

Det fremkaldende antistof (sted-genkendende reagens) for TSH-assayet er et anti-TSH-antistof med en affinitetskonstant for TSH på ca. 2 x 10^ 1/mol ved 25 °C. Dette 15 antistof er mærket med fluorescein, FITC. Det sted-genkendende reagens for T4- og T3-assay er T4 og T3 koblet til poly-lysin og mærket med FITC, og de genkender de ikke-fyldte steder på deres respektive første antistoffer.

20

Ved anvendelse af 400 ul prøver af standardopløsningerne indeholdende forskellige kendte mængder af T4, T3 og TSH, opnås dosis-responskurver ved fremgangsmåder, der er analoge til fremgangsmåderne i eksempel 2, idet fluorescens-' 25 forhold korreleres med T4, T3 og TSH-koncentrationer.

Pladen benyttes til at måle T4, T3 og TSH-niveauer i serum fra human patienter med god korrelation med resultaterne, der opnås ved andre fremgangsmåder.

30 EKSEMPEL 4

Ved anvendelse af tilsvarende procedurer som de, der er 35 beskrevet i eksempel 1 fremstilles en mikrotitreplade, der indeholder pletter af et første mærket anti-HCG-anti-

O

stof med en affinitetskonstant på ca. 6 x 10 1/mol ved 21

DK 164944 B

25 °C, et andet mærket anti-HCG-antistof med en affinitetskonstant på 1,3 x 1011 1/mol ved 25 °C, og mærket anti-FSH-antistof (follikel-stimulerende hormon) med en g affinitetskonstant på ca. 1,3 x 10 1/mol ved 25 °C i 5 hver af de individuelle brønde, hvilke pletter hver indeholder mindre end 0,1 V/K mol af de respektive antistoffer. Et krydsreagerende (alfa-underenhed) monoklonalt antistof 8D10 med en affinitetskonstant på 1 x 10^ 1/mol benyttes som et fælles fremkaldende antistof for både 10 HCG- og FSH-assay.

Ved anvendelse af 400 al prøver af standardopløsninger indeholdende forskellige kendte koncentrationer af HCG og FSH, opnås dosis-responskurver ved fremgangsmåder, der er 15 analog til de, der er anvendt i eksempel 2, idet fluorescensforhold korreleres med HCG og FSH-koncentrationer. Kurven, der opnås med højere affinitets-anti-HCG-anti-stof, giver mere koncentrationsfølsomme resultater ved de lavere HCG-koncentrationer, hvorimod kurven for den lave-20 re affinitets-anti-HCG-antistof er mere koncentrations følsom ved højere HCG-koncentrationer. Pladen benyttes til at måle HCG- og FSH-koncentrationer i urinen hos kvinder under graviditetsafprøvning, hvilket giver gode korrelationer med resultater, der er opnået ved andre 25 midler og opnår effektive koncentrationsmålinger for HCG over et koncentrationsområde på to eller tre størrelsesordener ved korrekt valg af den bedste HCG-plet og dosis-responskurve.

30

Fremstilling af mærket antistof Mærkningen af antistofferne med fluorescensmarkører kan 35 udføres ved en velkendt og standardiseret teknik, se Leslie Hudson og Frank C. Hay, "Practical Immunology", Blackwell Scientific Publications (1980), s. 11-13, 22

DK 164944 B

f.eks. som følger:

Det monoklonale antistof anti-FSH 3G3, et FSH-specifikt (beta-underenhed) antistof, der har en affinitetskonstant

O

5 K på 1,3 x 10 1/mol, blev fremstillet hos Middlesex Hospital Medical School og var mærket med TRITC (rhodamin isothiocyanat) eller Texas rød for at give en rød fluorescens .

10 Det monoklonale antistof anti-FSH 8D10, et krydsreagerende (alfa-underenhed) antistof, der har en affinitetskonstant K på 1 x 1011 1/mol, blev ligeledes produceret hos Middlesex Hospital Medical School og blev mærket med FITC (fluorescens isothiocyanat) for at give en gul-grøn fluo-15 rescens.

Den almene procedure, der blev benyttet, involverede as-citesvæskeoprensning, dvs. ammoniumsulfatudfældning og T-gel-chromatografi, efterfulgt af mærkning ifølge de følg- 20 ende trin: 1.a. Ammoniumsulfatoprensning 1. Tilsæt 4,1 ml mættet ammoniumsulfatopløsning til 5 ml 25 antistof præparat, dvs. kultursupernatant eller 1:5 fortyndet ascitesvæske, under konstant omrøring, dvs. 45%'s mætning.

2. Fortsæt omrøringen i 30-90 min. Centrifuger ved 2500 30 omdrejninger pr. minut i 30 minutter.

3. Bortkast supernatanten og opløs precipitatet i PBS til et slutvolume på 5 ml. Gentag trin 1 og 2, eller 35 4. Tilsæt 3,6 ml mættet ammoniumsulfat, 40%'s mætning, under konstant omrøring. Gentag trin 2.

23

DK 164944 B

5. Bortkast supernatanten og opløs den lille kugle i den ønskede buffer.

6. Udfør dialyse natten over under kulde mod den samme 5 buffer ved anvendelse af frisk, "boiled-in-d/wM dialysepose.

7. Bestem proteinkoncentrationen enten ved A280 e-*-ler ve<* "Lowry-estimation".

10 l.b. T-gel-chromatografi: (buffer 1M Tris-Cl, pH 7,6, fast kaliumsulfat).

1. Klargør 2 ml ascitesvæske ved centrifugering ved 4000 15 omdrejninger pr. minut.

2. Tilsæt 1 M Tris-Cl-opløsning for at opnå slutkoncen-tration på 0,1 M.

20 3. Tilsæt tilstrækkelig mængde fast kaliumsulfat. Opnå en slutkoncentration på 0,5 M.

4. Tilsæt ascitesvæsken til T-gel-kolonnen.

25 5. Vask kolonnen med 0,1 M Tris-Cl-buffer indeholdende 0,5 M kaliumsulfat indtil proteinprofilet ved A2gQ returnerer til nul.

6. Eluer det absorberede protein ved anvendelse af 0,1 M

30 Tris-Cl buffer som elueringsmiddel.

7. Bland fraktionerne, der indeholder antistofaktivitet, og opkoncentrer under anvendelse af en Amicon 30 koncen-trator.

35 8. Hvis HFHT-oprensning skal udføres, benyt da HPHT-chro-matografi begyndelsesbuffer under trin 7.

24

DK 164944 B

2. Mærkning af antistof FITC/TRITC-konj ugation: 1. Dialyser det oprensende 1 g protein ind i 0,25 M car-bon-bicarbonatbuffer, pH 9,0, til en koncentration på 20 5 mg/ml.

2. Tilsæt FITC/TRITC for at opnå et l:20-forhold med protein, f.eks. 0,05 mg for hver 1 mg protein.

10 3. Bland og inkuber ved 4 °C i 16-18 timer.

4. Separer det konjugerede protein fra ikke-konjugeret ved: 15 a. Sephadex G-25-chromatografi for FITC-mærke, eller b. DEAE-Sephacel-chromatografi for TRITC/FITC-mærke.

Buffersystem: 20 PBS for (a).

0,005 M phosphat, pH 8,0 og 0,18 M phosphat, pH 8,0 for (b).

25 Beregning af FITC - proteinkoblingsforhold: 2,87 x O.D.495 nm O.D.280 nm - 0,35 x O.D.495 mn 30 35

Claims

25 DK 164944 B Patentkrav :

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationer af et 5 antal analytter i en væskeprøve af volumen VI, k e n -detegnet ved, at et antal forskellige bindingsmidler, der hver er i stand til reversibelt at binde en analyt, som er eller kan være tilstede i væskeprøven, og som er specifik for denne analyt sammenlignet med andre 10 komponenter af væskeprøven, anbringes på et bæremiddel på et antal rummeligt adskilte steder således, at hvert sted ikke har mere end 0,1 V/K mol af et enkelt bindingsmiddel, hvor K 1/mol er ligevægtskonstanten mellem bindingsmidlet og analytten, 15 det belagte bæremiddel bringes i kontakt med væskeprøven, der skal analyseres således, at hver af de rummeligt adskilte steder bringes i kontakt med væskeprøven under den samme operation, idet mængden af benyttet væske i prøven 20 er således, at kun en ubetydelig del af en vilkårlig analyt, der er tilstede i væskeprøven, bliver bundet til bindingsmidlet, der er specifikt for det, og en parameter, der er repræsentativ for besættelsesbrøk-25 delen af bindingsmidler, der er besatte af analytterne, måles ved de rummeligt adskilte steder ved en kompetitiv eller ikke-kompetitiv assayteknik, der benytter et stedgenkendende reagens for hvert bindingsmiddel, hvilket reagens er i stand til at genkende enten de ikke-fyldte 30 bindingssteder eller de fyldte bindingssteder på bindemidlet, og hvilket sted-genkendende middel er mærket med en markør, der gør det muligt at måle mængden af midlet på det pågældende sted.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hver af de rummeligt adskilte steder har mindre end 0,01 V/K mol af et enkelt bindingsmiddel. 26 DK 164944 B

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de benyttede bindingsmidler har ligevægtskonstan- 8 13 ter for analytterne fra 10 til 10 1/mol.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de benyttede bindingsmidler har ligevægtskonstan- 10 11 ter for analytterne af størrelsesordenen 10 eller 10 1/mol.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at voluminet af væskeprøven ikke er mere end 0,1 1.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at voluminet af væskeprøven er 400 til 1000 ul. 15

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bindingsmidlerne, der pålægges bæremidlet, er antistoffer for analytterne, hvis koncentrationer skal bestemmes . 20

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bindingsmidlerne er mærket med markører, der gør det muligt at måle koncentrationsniveauerne af bindingsmidlet . 25

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at bindingsmidlerne og de sted-genkendende reagenser er mærkede med fluorescensmarkører således, at ved de individuelt rummeligt adskilte steder måler assayteknikken 30 til måling af besættelsesbrøkdelen af bindingsmidlerne forholdene mellem signalerne, der emitteres af fluorescensmarkørerne .

10. Indretning til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1, 35 kendetegnet ved, at den består af et fast bæremiddel, hvorpå et antal forskellige bindingsmidler er placeret på et antal rummeligt adskilte steder, hvilke 27 DK 164944 B bindingsmidler hver er i stand til reversibelt at binde en analyt, som er eller kan være tilstede i væskeprøven, og som er specifik for denne analyt sammenlignet med de øvrige komponenter i væskeprøven, idet hvert sted ikke 5 har mere end 0,1 V/K mol af et enkelt bindingsmiddel, hvor K 1/mol er ligevægtskonstanten af bindingsmidlet for reaktionen med analytten, for hvilket det er specifikt.

11. Analysesæt til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at det omfatter et fast bæremiddel ifølge krav 10, et antal standardprøver, der indeholder kendte koncentra-15 tioner af analytterne, hvis koncentrationer i væskeprøven skal måles og et sæt mærkede sted-genkendende reagenser til reaktion med fyldte eller ikke-fyldte bindingssteder på bindings-20 midlerne. 25 30 35