FI92110C - Useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittäminen - Google Patents
Useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittäminen Download PDFInfo
- Publication number
- FI92110C FI92110C FI900557A FI900557A FI92110C FI 92110 C FI92110 C FI 92110C FI 900557 A FI900557 A FI 900557A FI 900557 A FI900557 A FI 900557A FI 92110 C FI92110 C FI 92110C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- binder
- analyte
- binders
- sample
- liquid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/973—Simultaneous determination of more than one analyte
Description
921 ΊΟ
Useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden maarit-taminen
Keksinnon ala 5 Esllla oleva keksinto kohdistuu vallitsevien ana- lyyttikonsentraatioiden maarittamiseen nesteisså, esimer-kiksi sellaisten analyyttien, kuten hormonien, proteiinien ja biologisissa nesteisså, kuten kehon nesteisså, luonnol-lisesti esiintyvien tai keinotekoisesti låsnå olevien ana-10 lyyttien maarittamiseen.
Keksinnon tausta
Olen ehdottanut PCT-hakemuksessa W084/01031, ettå nesteessa olevan analyytin konsentraatio mitataan saatta-malla neste kosketukseen pienen måarån kanssa sidosainet-15 ta, kuten vasta-ainetta, joka on analyytille spesifinen siina mielessa, etta se sitoo palautuvasti analyytin mut-tei muita nesteen komponentteja, måaritetåan sidosaineen sidoskohtiin verrannollista miehitysta edustava måårå ja arvioidaan tasta maarSsta analyytin konsentraatio. Siina 20 patenttihakemuksessa kiinnitan huomiota siihen, etta edel- lyttaen, etta sidosaineen maara on riittavan alhainen, jotta sen lisaaminen nesteeseen ei aiheuta merkittavaa analyytin vallitsevan (sitoutumattoman) konsentraation pienentymista, niin sidosaineen sidoskohtien osittainen 25 miehittyminen analyytilla on tehollisesti riippumaton nesteen absoluuttisesta tilavuudesta ja sidosaineen absoluut-tisesta maarasta, ts. riippumaton tavallisesti osittaisen miehittymisen mittauksiin yhdistettyjen virherajojen puit-teissa. Tallaisissa olosuhteissa ja ainoastaan nåissa olo-30 suhteissa nesteessa olevan analyytin alkukonsentraatio [H] on verrannollinen analyytin miehittamien sidosaineen sidoskohtien osuuteen (Ab/Ab0) seuraavan yhtalon mukaises-ti:
Ab _ Kab[H]
Ab0 1 + Kab[H] 2
9211 O
jossa Kab (johon tåmån jålkeen viitataan symbolilla K) on tasapainovakio analyytin sitoutumiselle sidoskohtiin, ja se on vakio tietylle analyytille ja sidosaineelle missa tahansa låmpotilassa. Tama vakio tunnetaan yleensa affini-5 teettivakiona, erityisesti silloin, kun sidosaine on vas-ta-aine, esimerkiksi monoklonaalinen vasta-aine.
Kåsite, ettå kaytetaan vain pienia mååriå sidosai-netta, on vastakkainen yleensa suositellulle kaytannolle immunomååritysmenetelmien ja immunometristen tekniikkojen 10 alalla. Esimerkiksi sellaisessa hyvin tunnetussa tyosså kuten "Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology", toimittajat S. A. Berson ja R. S. Yalow, 1973, si-vut 111 - 116, ehdotetaan, ettå kilpailevassa immunomååri-tysmenetelmåsså maksimiherkkyys saavutetaan, jos sitoutu-15 van "indikaattori"-analyytin måårå on låhes 50 %. Jotta saavutettaisiin tållainen suuri analyytin sitoutumisaste, Bersonin ja Yalowin teoria, jonka muut alalla tyoskentele-vat ovat tåhån paivåan asti yleisesti hyvåksyneet, on edellyttanyt, ettå sidosaineen (tarkasti ottaen sidoskoh-20 tien, sidosaineen kunkin molekyylin, jolla perinteisesti on yksi tai enintåån kaksi sidoskohtaa) konsentraatio on oltava suurempi tai yhtå suuri kuin analyytin sidosaineen tasapainovakion [K] kåånteisarvo, ts. [AB] > 1/K. Nåyt-teen, jonka tilavuus on V, sidosaineen (tai sidoskohtien) 25 kokonaismåårån on siksi oltava suurempi tai yhta suuri kuin V/K. Sidosaineen, joka on monoklonaalkinen vasta-aine, tasapainovakio (K) voi esimerkiksi olla suuruusluokkaa 1011 1/mol tietylle antigeenille, johon se sitoutuu. Siten edellå mainitun yleisesti hyvåksytyn kåytånnon mukaisesti 30 tarvitaan sidosaineen (tai -paikan) konsentraatio suuruusluokkaa 10'11 moolia/litra tai enemmån tållaiset tasapai-novakiot omaavia sidosaineita vårten, ja nestemåisten nåy-tetilavuuksien ollessa 1 ml:n suuruusluokkaa 10'14 tai useampia mooleja sidosainetta (tai -paikkaa) on tavanomai-35 sesti pidetty tarpeellisena. Avogadron luku on noin 6 x 3
92( 1 O
1023, joten 10'14 moolia sidoskohtia vastaa yli 109 molekyylia sidosainetta jopa oletettaessa, ettå sidosaineessa on kaksi sidoskohtaa molekyylia kohden. Spesifisille sidosai-neille, joilla on suurin affiniteetti, K on alle 1013 1/ 5 mol, joten tavanomainen kSytanto edellyttåa enemman kuin 107 molekyylia sidosainetta, kun taas sidosaineet, joilla on pienempi, suuruusluokkaa 10® 1/mol oleva affiniteetti, edellyttavat useamman kuin 1012 molekyylin kåyttdå tavan-omaisessa kaytannossa. Itse asiassa kaikki kaupallisesti 10 markkinoidut immunomåaritysmenetelmakitit nykyisin vah-vistavat naita kasitteita ja kåyttåvåt sidosainetta lahes måMrån V/K tai useammin huomattavasti enemman; todellakin eraissa tietyntyyppisissa kiteisså, joiden kåyttd perustuu leimattuihin vasta-aineisiin, on tavanomaista kåyttaå niin 15 paljon sidosainetta kuin mahdollista analyytin sidososuuk-sien ylittaessa suuresti 50 %.
Testattavissa nestemaisissa naytteisså analyytin huomattavien osuuksien, esimerkiksi 50 %:n, sitoutumisen vuoksi tallaisissa systeemeissM sidosaineen sidoskohtien 20 osittainen miehittyminen ei ole riippumaton nestemaisen naytteen tilavuudesta, joten tarkoissa kvantitatiivisissa måaritysmenetelmisså on valttamåtontå kontrolloida naytteen tilavuutta tarkasti ja pitaa se vakiona kaikissa tes-teissa kaytettiinpå tuntematonta naytteen konsentraatiota 25 tai tunnettua standardinaytteen konsentraatiota annos-vas- tekayran synnyttamiseksi. Edelleen tållainen systeemi edellyttåa myos standardi- tai kontrolli-inkubointiputkis-sa olevan sidosainemaarSn tarkkaa kontrollointia. Nama esilla olevan tekniikan rajoitukset on yleisesti tunnis-30 tettu ja hyvaksytty.
GB-patenttihakemus 2 099 57 8A kåsittelee laitetta immunomååritysmenetelmiå vårten kSsittaen huokoisen kiin-tean kantajan, johon antigeenit tai harvemmin immunoglo-buliinit sidotaan moniin toisistaan erillåan oleviin paik-35 koihin, jolloin kyseinen laite sallii suuren maaran kva- 4 92110 litatiivisia tai kvantitatiivisia immunomåårityksia suo-rittamisen samassa kantajassa, esimerkiksi ihmisen veri-seeruminåytteen vasta-aineprofiilin aikaansaamiseksi.
Vaikka yksittaiset sijainnit saattavat olla niin kutsut-5 tuina mikropisteinå, jotka on saatu aikaan annostelemalla antigeenia sisaltavien liuosten tai suspensioiden pisaroi-ta, kussakin paikassa lasnaolevien antigeenimoolien luku-maåran kuitenkin kuvitellaan ilmeisesti viela olevan riit-tava, jotta se sitoo paaasiallisesti kaiken analyytin 10 (esim. vasta-aineen), jonka konsentraatio on tarkoitus maårittåå ja joka on lasna nestemåisesså naytteessa testin aikana. Tama on ilmeista tosiasiasta, etta tassa sovellu-tuksessa kaytetty kvantitatiivinen menetelmå (sivu 3, ri-vit 21 - 28) kMsittaa kalibroinnin tunnetuilla maårillå 15 immunoglobuliinia lisåttyna kantajaan; mutta tama tarkoit-taa sitå, etta testattavissa nåytteissa olennaisesti jo-kainen molekyyli taytyy uuttaa nåytteesta, jotta voidaan tehda todellinen vertailu ja etta kuhunkin mikropisteeseen vaaditaan suuria maaria antigeenia (ts. sidosainetta tassa 20 tilanteessa), suuresti ylimaarin analyytin kokonaismaaras-tå (ts. vasta-aine tassa tilanteessa), joka on lasna naytteessa.
Keksinnon yhteenveto
Esilla oleva keksinto kasittaå oivalluksen, etta 25 suurien sidosainemaarien kaytto ei ole tarpeellista hyval-le herkkyydelle immunomaaritysmenetelmissa, eikå se myos-kaan ole yleensS toivottavaa. Jos sen sijaan, etta sidos-aineen måårS pidetSan niin suurena kuin mahdollista, sita rajoitetaan siten, etta siihen sidotaan palautuvasti mer-30 kityksettomia osuuksia analyyttiS, tavanomaisesti alle 10 %, yleensa alle 5 %, optimituloksia vårten vain 1 tai 2 % tai vahemman, niin enaa ei ole yksistaan pakko kayttåa tarkasti kontrolloitua vakiotilavuutta kaikille nestemSi-sille nåytteille (standardiliuokset ja tuntemattomat nayt-35 teet) tietyssa maarityksessa, vaan on mahdollista myos 5
9211 O
kåyttaå luotettavia ja joskus jopa parannettuja arvioita analyyttikonsentraatiosta kayttåen paljon våhemman kuin V/K moolia sidosaineen sidoskohtia, esimerkiksi ei enempaa kuin 0,1 V/K ja edullisesti alle 0,01 V/K. Sidosaineelle, 5 jonka analyytin tasapainovakio (K) on suuruusluokkaa 1011 1/mol, ja kooltaan noin 1 ml oleville nåytteille tama vas-taa likimåarin enintaan 108, edullisesti alle 107, molekyy-lia sidosainetta kussakin paikassa eri naytteissa. Jos K-arvo on 1013 1/mol, luvut ovat 106 ja vastaavasti 105 mole-10 kyylia, ja jos K on suuruusluokkaa 10® 1/mol, ne ovat 1011 ja vastaavasti lo10 molekyyliå. Alle 102 molekyylissa sidosainetta yksittaisesså paikassa mittausten tarkkuudesta tulisi enenevasti pienempi, kun sidosainepaikkojen osit-taisen miehittymisen analyytilla olisi mahdollista muuttua 15 vain epajatkuvin askelin, kun eri paikat miehittyisivat tai eivåt miehittyisi, mutta periaatteessa vahintaan niin vahan kuin 10 molekyylin kaytto olisi sallittua, jos arvion 10 % tarkkuus olisi hyvaksyttåvisså. Kåytannolliset nakokohdat saattavat lisåta etusijaa useammalle kuin 104 20 molekyylille.
Olen havainnut, ettå yleisesti ottaen vasta-aineil-le, joiden affiniteettivakio antigeenin suhteen on K 1/ mol, suhde vasta-aineen konsentraation ja sidoskohtien osittaisen miehittåytymisen valilla tietysså antigeenikon-25 sentraatiossa ja suhde vasta-ainekonsentraation ja sidos-kohtiin sitoutuneen antigeenin osuuden valilla missa ta-hansa tietysså antigeenikonsentraatiossa seuraa samaa kay-raa sillS ehdolla, ettS vasta-aineen konsentraatiot ja antigeenin konsentraatiot ilmaistaan kukin 1/K:n murto-30 osien tai kerrannaisten muodossa. Tata valaisee oheinen kuvio, joka on graafinen kaavio, joka esittSa naita suh-teita kartoittavaa kahta kayrasarjaa. Kukin kHyra liittyy vasta-aineen konsentraatioon [Ab], ilmaistuna 1/K:na, x-akselille piirrettyna. KSyrasarjaa vårten, joka jaa va-35 kioksi tai laskee, kun [Ab] kasvaa, y-akseli esittåa vas- 6 92110 ta-aineen sidoskohtien osittaista miehittymistå (F) anti-geenilla; toisessa sarjassa y-akseli esittåå nåihin sidos-kohtiin sitoutuneen antigeenin osuutta (b%). Eri kåyråt kussakin sarjassa esittåvåt neljån erilaisen antigeenikon-5 sentraation [An] ilmaistuna K:n avulla, nimittain 10/K, 1,0/K, 0,1/K ja 0,01/K vastaavia suhteita. Kåyrat osoit-tavat, ettå kun [Ab] laskee, F saavuttaa olennaisesti va-kiotason, jonka arvo on riippuvainen [An]:sta.
Tåstå voidaan ymmårtåå, ettå yllå mainittu GB-pa-10 tenttihakemus 2 099 578A, joka kvantitatiivisia arvioita vårten perustuu suuriin sidosainemååriin ja olennaisesti kaiken analyytin eriståmiseen kokonaan, epåonnistuu esillå olevassa keksinnosså saavutetun edun tunnistamisessa; esillå oleva keksinto puolestaan perustuu erilaiseen ana-15 lyyttiseen periaatteeseen, joka edellyttåå sidosaineen osittaisen miehittymisen mittaamista ja joka siten edellyttåå vain hyvin våhåistå osuutta nåytteestå eristettå-vien, låsnå olevien analyyttimolekyylien kokonaismååråstå.
Kun seurataan havaintoa, ettå tållaisten pienten 20 sidosainemåårien kåytto on sallittua, tulee mahdolliseksi sijoittaa sidosaine, joka tarvitaan yksittåiseen konsen-traatiomittaukseen, pienelle alalla kiinteåtå kantajaa ja siten sijoittaa useita erilaisille analyyteille spesifi-siå erilaisia sidosaineita, joita on tai voi olla låsnå *, 25 samanaikaisesti analysoitavassa nesteesså, rinnakkain toi- siinsa nåhden mutta erillisiin kohtiin yksittåiseen kiin-teåån kantajaan. Kunkin erillisen kohdan asettaminen sa-manaikaisesti alttiiksi analysoitavalle nesteelle saa ai-kaan sen, ettå kukin paikalla oleva sidosainetåplå tarttuu 30 analyyttiin, jolle se on spesifinen analyyttikonsentraa-tiota nesteesså edustavassa mååråsså (ts. osittainen si-doskohdan miehittyminen) sillå ehdolla, ettå liuoksen ti-lavuus ja analyytin konsentraatio siinå ovat tarpeeksi suuria, jotta vain merkitykseton osuus (tavallisesti alle 35 10 %, yleenså alle 5 %) analyytistå sitoutuu tåhån koh- • * * i 92110 7 taan. Kunkin sidosaineen osittainen sidoskohdan miehitty-minen voidaan sitten måårittåå kåyttåen erillistå paikan tunnistavaa reagenssia, joka tunnistaa eri sidosaineiden joko tåyttymåttomåt tai tåyttyneet sidoskohdat ja jotka 5 leimataan merkkiaineilla, jotka sallivat erilaisiin sidos-aineisiin sitoutuneiden erillisten reagenssien konsentraa-tiotasojen mittaamisen, esimerkiksi fluoresoivilla merkki-aineilla. Tallaiset mittaukset voidaan toteuttaa perak-kåin, esimerkiksi kåyttåen laseria, joka skannaa kantajan 10 yli, tai samanaikaisesti, esimerkiksi kayttaen valokuvaus-levyå, leimojen luonteesta riippuen. Muita kuvantamislait-teita, kuten esimerkiksi televisiokameraa, voidaan myos kåyttåå, milloin se on sopivaa. Koska sidosaineet ovat erillåån toisistaan, on mahdollista kayttaa vain pienia 15 maåria erilaisia merkkiaineleimoja tai jopa samaa merkki-aineleimaa koko ajan tai skannata kukin sidosainepaikka erikseen leiman låsnå olon ja konsentraation måårittåmi-seksi. Kun kåytetåån keksintoå, voidaan suorittaa huomat-tavasti useampia kuin kolme analyysiå altistamalla kiin-20 teå kantaja yhden kerran analysoitavalle nesteelle, esimerkiksi 10, 20, 30, 50 ja jopa 100 tai satoja analyysejå.
Siksi esillå oleva keksinto tarjoaa menetelmån useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden måå-rittåmiseksi tilavuudeltaan V litran nestemåisesså nåyt-·. 25 teesså, jolloin menetelmåsså useita erilaisia sidosaineita, joista kukin kyke-nee sitomaan palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla låsnå nesteesså, ja on spesifinen tålle analyytille ver-rattuna nestemåisen nåytteen toisiin komponentteihin, vie-30 dåån kantajavålineeseen useisiin toisistaan erillåån ole-viin kohtiin siten, ettei yhdellåkåån kohdalla ole enempåå kuin 0,1 V/K moolia yksittåistå sidosainetta, jolloin K 1/mol on sidosaineen tasapainovakio analyytille, miehitetty kantajavåline ja analysoitava neste saa-35 tetaan kosketukseen siten, ettå kukin erillåån olevista 8 9 2110 kohdista asetetaan kosketukseen samassa toimenpiteesså nestemåisen naytteen kanssa nåytteen nestemåårån ollessa sellainen, etta vain merkitykseton osuus nestemaisessa naytteessa mahdollisesti låsnå olevasta analyytista sitou-5 tuu spesifiseen sidosaineeseensa, ja sidosaineiden analyyttien osittaista miehittymistå edustava parametri mitataan toisistaan erillåan olevissa kohdissa kilpailevan tai kilpailemattoman mååritysmenetel-man tekniikkalla kåyttaen kullekin sidosaineelle paikan 10 tunnistavaa reagenssia, joka kykenee tunnistamaan joko tåyttymåttomåt sidoskohdat tai tayttyneet sidoskohdat, jolloin kyseisen kohdan tunnistava reagenssi on leimattu merkkiaineella mahdollistaen tietysså kohdassa olevan ky-seisen reagenssin maaran mittaamisen.
15 Keksinto tarjoaa myos laitteen kaytettHvaksi usei- den analyyttien vallitsevien konsentraatioiden xnåarittåmi-seksi tilavuudeltaan V litran nestemaisessa naytteessa, jolloin laite kåsittåå kiinteåt kantajavålineet, joille on sijoitettu useisiin, toisistaan erillaan oleviin kohtiin 20 suuri maara erilaisia sidosaineita, jolloin kukin sidosai-ne kykenee sitomaan palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla lasnå nestemaisessa naytteessa, ja on spesifinen tålle analyytille verrattuna muihin nestemåisesså nåyt-teesså oleviin komponentteihin, kun kussakin kohdassa on 25 enintåån 0,1 V/K, edullisesti alle 0,01 V/K, moolia eri sidosainetta, jolloin K 1/mol on tåmån sidosaineen tasa-painovakio reaktiolle analyytin kanssa, jolle sidosaine on spesifinen.
Keksinnon mukaisessa menetelmåsså kåytettåvåksi 30 tarkoitetut kitit kåsittåvåt keksinnon mukaisen laitteen, useita standardinåytteitå, jotka sisåltåvåt tunnettuja konsentraatioita analyyttejå, joiden konsentraatiot nestemåisesså nåytteesså on måårå mitata, ja sarjan leimattuja, kohdan tunnistavia reagensseja reaktioille sidosaineiden 35 tåyttyneiden tai tåyttymåttomien sidosaineiden sidoskoh-tien kanssa.
• · 9
9211 O
Yksityiskohtainen kuvaus
Kiinteån kantajan valinta on asia, joka jatetaan kayttåjalle. Edullisesti kantaja ei ole huokoinen, jolloin sidosaine sijoitetaan sen pinnalle esimerkiksi monokerrok-5 sena. Huokoisten kantajien kaytto voi aiheuttaa sidosai-neen, sen molekulaarisesta koosta riippuen, kulkeutumisen kantajan huokosten sisalle, jossa sen olemiseen esilla analyytille, jonka konsentraatio on tarkoitus måårittåå, huokosten geometria voi vaikuttaa siten, ettå havaitaan 10 vaarå lukema. Huokoiset kantajat, kuten nitroselluloosa-paperi, joka on pilkutettu sidosainetaplin, ovat siksi våhemmån edullisia. Toisin kuin GB-julkaisussa 2 099 578A kaytetyt kantajat, joiden on oltava huokoisia kiinnitettå-vien molekyylien suuresta mååråstå johtuen, esilla olevas-15 sa keksinnosså kaytettavåt kantajat kayttavat paljon pie-nempiå måariå, ja siksi niiden ei tarvitse olla huokoisia. Kantajat, jotka eivat ole huokoisia, voivat esimerkiksi olla muovimateriaalia tai lasia, ja mitå tahansa sopivan jaykkåa materiaalia voidaan kayttaå. Polystyreeni on edul-20 linen muovimateriaali, vaikka muita polyolefiineja tai akryyleja tai vinyylipolymeereja voitaisiin kayttaå samal-la tavalla.
Kantajavålineet voivat kåsittåå mikrohelmiå esim. sellaisista muovimateriaaleista, jotka voidaan påållyståå 25 tasaisilla sidosainekerroksilla ja pitaå tietyisså pai-koissa, esim. onkaloissa, kantaja-alustalla. Vaihtoehtoi-sesti materiaali voi olla arkkina tai levynå, joka on tåp-litetty sidosainetåplåjonoin. Voi olla eduksi, ettå kanta-javålineiden rakenne on sellainen, ettå tilavuudeltaan 30 noin V litran nestemåiset nåytteet jååvåt helposti koske-tukseen useiden, toisistaan erillåån olevien paikkojen kanssa, jotka on merkitty erilaisilla sidosaineilla. Erillåån olevat paikat voidaan esimerkiksi jårjeståå kantaja-vålineen syvennykseen, ja joukko syvennyksiå, joissa kus-35 sakin on sama ryhmå eri sidosaineita erillåån olevissa v»· 10 92110 paikoissa, voidaan yhdiståa mikrotiitterilevyn muodostami-seksi, jota voidaan kayttaa nåytejoukolle.
Kun kantajavalinettS kaytetaan yhdessa valoskan-nauksen sisaltåvån mittaussysteemin kanssa, kantajan mate-5 riaali, esim. muovi, on mieluiten valoa lapikuultamaton, se voidaan esimerkiksi tayttaa samentavalla materiaalilla, joka voi mm. valkoista tai mustaa, kuten hiilimustalla, kun sidosaineesta tai paikan tunnistavista reagensseista mitattavat signaalit ovat valosignaaleja, kuten fluoresoi-10 vista tai luminoivista merkkiaineista mitattavat signaalit. Tavallisesti heijastavat materiaalit ovat edullisem-pia tåssa tapauksessa lisaamaan valon keraamista ilmaisin-laitteeseen tai valokuvauslevylle. Optimimateriaalin lo-pullisen valinnan mååraa sen kyky kiinnittaa sidosaine 15 pinnalleen, taustasignaaliemission puuttuminen siita ja muut ominaisuudet, jotka pyrkivat maksimoimaan signaali/ kohina-suhteen sen pinnalla olevaan sidosaineeseen kiinni-tetylle tietylle merkkiaineelle tai kiinnitetyille merkki-aineille. Erittåin tyydyttavia tuloksia on saatu alia ku-20 vatuissa esimerkeissa kayttaen valkoista, lapikuultamaton-ta polystyreenimikrotiitterilevyå, joka on kaupallisesti saatavana Dynatech'ista kauppanimella White Microfluor -mikrotiitterisyvennykset.
Kaytettåvat sidosaineet voivat olla erilaisen spe-25 sifisyyden omaavia sidosaineita, toisin sanoen aineita, jotka ovat spesifisia erilaisille analyyteille, tai kaksi tai useammat niistM voivat sidosaineita, joiden spesifi-syys on sama mutta joiden affiniteetti on erilainen, toisin sanoen aineita, jotka ovat spesifisia samalle analyy-30 tille, mutta joiden tasapainovakio K reaktiolle sen kanssa on erilainen. JalkimmSinen vaihtoehto on erityisen kayttokelpoinen, kun analysoitavan analyytin konsentraatio tuntemattomassa nåytteessa voi vaihdella huomattavan suu-rella alueella, esimerkiksi kaksi tai kolme kertaluokkaa, 35 kuten HCG-mittausten tapauksessa raskaana olevien naisten 92110 11 virtsasta, jossa se voi vaihdella 0,1 - 100 IU/ml tai enemmån.
Kåytettåvåt sidosaineet ovat edullisesti vasta-ai-neita, edullisemmin monoklonaalista vasta-aineita. Mono-5 klonaalisia vasta-aineita suurelle joukolle biologisten nesteiden aineosia on saatavana kaupallisesti tai niita voidaan valmistaa tunnetun tekniikan avulla. Kaytettavilla vasta-aineilla voi olla tavanomamiset affiniteettivakiot, esimerkiksi yli 108 tai 109 1/mol, esim. suuruusluokkaa 1010 10 tai 1011 1/mol, mutta suuren affiniteetin omaavia vasta-aineita, joiden affiniteettivakiot ovat 1012 - 1013 1/mol, voidaan myos kåyttåå. Keksinnossa voidaan kayttåå sellai-sia sidosaineita, jotka eivat itsessaan ole leimattuja. On kuitenkin myos mahdollista ja usein toivottavaa kayttaa 15 leimattuja sidosaineita siten, etta systeemi sidosaine/ analyytti/paikan tunnistava reagenssi kåsittåå kaksi eri-laista saman tyypin leimaa, esim. fluoresoivan, kemilumi-noivan, entsyymin tai radioisotooppisen, yhden sidosai-neessa ja yhden paikan tunnistavassa reagenssissa. Mit-20 tausoperaatio mittaa tålloin kahden signaalin intensitee-tin suhteen ja eliminoi siten tarpeen viedå sama måårå leimattua sidosainetta kantajaan, kun signaalit mitataan standardinaytteista kalibrointitarkoituksiin, kuten mitat-taessa signaaleja tuntemattomista naytteista. Koska sys-; 25 teemi on kokonaan riippuvainen sidoskohtien miehitysta edustavan suhteen mittauksesta, ei myoskaan ole tarvetta mitata signaalia koko taplåstå, vaan vain osan skannaus on riittavå. Kukin sidosaine on edullisesti leimattu samalla leimalla, mutta eri leimoja voidaan kayttåå.
30 Sidosaineet voidaan viedå kantajaan millå tahansa tunnetulla tai tavanomaisesti kåytetyllå tavalla, joita kåytetåån kantajien, kuten putkien, påållyståmiseen sidos-aineilla, esimerkiksi antamalla kunkin kantajassa erillåån olevan kohdan joutua kosketukseen pienen pisaran muodossa 35 olevan sidosaineliuoksen kanssa, esimerkiksi 0,5 μΐ 1 mm2:n 1 · 12 92110 kohtaan, ja antamalla niiden jåådå kosketukseen joksikin aikaa, ennen kuin pisarat peståån pois. Karkeasti vakio, pieni osa sidosainetta, joka on lasnå pisarassa, adsorboi-tuu kantajaan tåmån menettelyn seurauksena. On huomattava, 5 ettå sidosaineen påållystystiheyden mikrotåplåsså ei tar-vitse olla pienempi kuin påållystystiheyden tavanomaisissa vasta-aineella påållystetyisså putkissa; våheneminen mole-kyylien mååråsså kussakin kohdassa voidaan saada aikaan yksiståån pienentåmållå kohdassa pikemminkin kokoa kuin 10 påållystystiheyttå. Suuri påållystystiheys on yleenså toi-vottavaa signaali/kohina-suhteen maksimoimiseksi. Tåplien koot ovat suotuisasti alle 10 mm , edullisesti alle 1 mm . Erottuminen on toivottavaa mutta ei vålttåmåtontå, 2 tai 3 kertaa tåplån såde tai enemmån. Tåtå ehdotettua geometriaa 15 voidaan kuitenkin muuttaa tarvittaessa; geometriaa rajoit-taa yksiståån sidosainemolekyylien lukumåårå kussakin tåp-låsså, nåytteen minimitilavuus, johon tåplåjono asetetaan, ja paikallisesti kåytettåvisså olevat vålineet valmistaa helposti tåplåjono edellå kuvatulla tavalla.
20 Kun sidosaine on påållystetty kantajan påålle, on tavanomaista, kun sidosaineet ovat vasta-aineita, pestå kantaja liuoksella, joka sisåltåå albumiinia tai muuta proteiinia, jåljelle jååvien ei-spesifisten adsorptiokoh-tien kyllåståmiseksi kantajassa ja muualla. Jotta varmis-,· 25 tutaan, ettå sidosainemåårå yksittåisesså tåplåsså on pie nempi kuin maksimimåårå (0,1 V/K), joka tarvitaan esillå olevan keksinnon periaatteen mukaisesti, yksittåisesså kohdassa låsnå olevan sidosaineen måårå voidaan tarkistaa leimaamalla sidosaine havaittavalla, tunnetun spesifisen 30 aktiivisuuden omaavalla merkkiaineella (ts. tunnettu måårå merkkiainetta sidosaineen yksikkopainoa kohti) ja mittaa-malla låsnå olevan merkkiaineen måårå. Tåten jos leimatun sidosaineen kåytto ei ole toivottavaa kiinteåsså kantajassa, jota kåytetåån keksinnon menetelmåsså, voidaan sidos-35 aine kuitenkin leimata esikokeessa, ja identtisiå olosuh- » » • « 13 92110 teita, joiden esikokeessa havaittiin saavan aikaan oikean sidosaineiden miehityksen, voidaan kåyttåå leimaamattomien sidosaineiden viemiseen kantajiin, joita todella kayte-taan.
5 Nestemåisen naytteen minimikoko (V litraa) korre- loidaan sidosaineen moolien lukumåaraan (alle 0,1 V/K) siten, etta vain merkitykseton osa nestemaisesså nåyttees-sa lasna olevasta analyytista sitoutuu sidosaineeseen. Tåma osuus on yleisen saannon jnukaan alle 10 %, yleensa 10 alle 5 % ja toivottavasti 1 tai 2 % tai alle, riippuen måaritysmenetelmåIle toivotusta tarkkuudesta (suurempi tarkkuus saadaan muiden tekijoiden ollessa yhtalåisiå, kun pienempiå analyytin osuuksia sidotaan) ja muiden lasna olevien, virhetta aiheuttavien tekijoiden suuruudesta.
15 Suuruudeltaan yksi tai muutamia millilitroja olevat tai pienemmat, esim. 100 ^l:aan asti tai sen alle, olevat naytteen koot ovat usein edullisia, mutta saattaa syntya olosuhteita, joissa suuremmat tilavuudet ovat kåytannolli-semmin maaritettaviS, ja geometria voidaan asettaa niiden 20 mukaisesti. Naytetta voidaan kayttaa sen luonnollisella konsentraatiotasolla tai, jos halutaan, sitå voidaan lai-mentaa tunnettuun maaraan.
Keksinnon mukaisessa menetelmassa kåytetyt paikan tunnistavat reagenssit voivat itse olla vasta-aineita, ·. 25 esim. monoklonaalisia vasta-aineita, ja ne voivat olla an- ti-idiotyyppisiS tai antianalyyttivasta-aineita jalkimmai-sen tunnistaessa miehitetyt paikat. Vaihtoehtoisesti esi-merkiksi pienen molekyylikoon omaavien analyyttien, kuten tyroksiinin (T4), miehittamattomat paikat voidaan tunnis-30 taa kåyttåen joko analyyttia itseåån, sopivasti leimattu-na, tai kovalenttisesti toiseen molekyyliin - esim. pro-teiinimolekyyliin - kytkettya analyyttiS, joka on suoraan tai epåsuorasti leimattu. Paikan tunnistavat reagenssit voidaan leimata suoraan tai epasuorasti tavanomaisilla 35 flouresoivilla leimoilla, kuten fluoreseiinilla, rodamii- » · · 14 921 1 0 14 nilla tai Texas Red'11a, tai materiaaleilla, joita voidaan kåyttåå aikaerotteisessa pulssifluoresenssissa, kuten eu-ropiumilla tai muita lantanidikelaateilla, tavanomaiseen tapaan. Muita leimoja, kuten kemiluminoivia, entsyymi- tai 5 radioisotooppileimoja voidaan kåyttåå, jos se on tarkoi-tuksenmukaista. Kukin paikan tunnistava reagenssi on edul-lisesti leimattu samalla leimalla, mutta eri leimoja voidaan kayttaa eri reagensseissa. Paikan tunnistavat rea-genssit voivat olla spesifisia yhdelle yksittaiselle si-10 dosaineelle/analyyttitaplalle kussakin tåplan ryhmassa tai tietyissa olosuhteissa, kuten kun kyseessa ovat glykopro-teiinihormonit, kuten HCG ja FSH, joilla on yhteinen si-doskohta, ne voivat olla ristiin reagoivia reagensseja, jotka kykenevat reagoimaan miehitettyjen sidoskohtien 15 kanssa useammassa kuin yhdessa taplasså.
Maåritysmenetelmån tekniikassa signaalit, jotka edustavat sidosaineen osittaista miehittymistå tuntematto-man konsentraation omaavien analyyttien koenåytteisså, voidaan kalibroida vertaamalla niitå annos-vastekåyriin, 20 jotka saadaan standardinåytteistå, jotka sisåltåvåt tun-nettuja konsentraatioita samoja analyyttejå. Tållaisten standardinåytteiden ei tarvitse sisåltåå kaikkia analyyttejå yhdesså sillå ehdolla, ettå kukin analyytti on låsnå jossakin standardinåytteesså. Osittainen miehittyminen 25 voidaan mitata arvioimalla miehitetyt sidoskohdat (kuten antianalyyttivasta-aineen tapauksessa) tai miehittymåttd-måt sidoskohdat (kuten anti-idiotyyppisen vasta-aineen tapauksessa), koska toinen on toisen kåånteinen suure. Suurempaa tarkkuutta vårten on toivottavaa mitata osuus, 30 joka on låhempånå nollaa, koska muutos osittaisessa mie-hittymisesså 0,01 on suhteellisesti suurempi tåsså tapauksessa, vaikka osittaiselle miehittymiselle 25 - 75 %:n alueella kummatkin vaihtoehdot ovat tavallisesti tyydyt-tåviå.
9211 O
15
Tasså esillå olevan keksinnon suoritusmuodossa, joka perustuu kahteen fluoresoivaan merkkiaineeseen, kah-desta merkkiaineesta tulevien signaalien, toinen sidosai-neesta ja toinen paikan tunnistavasta reagenssista, suh-5 teellisen intensiteetin mittaaminen voidaan suorittaa sa-mapolttopisteisella laser-pyyhkåisymikroskoopilla, kuten Bio-Rad Lasersharp MRC 500 -laitteella, joka on saatavana Bio-Rad Laboratories Ltd. -yhtiostå ja jossa on kaksikana-vainen ilmaisinsysteemi. Tåmå laite perustuu siihen, ettå 10 laser-såde skannaa kantajassa olevat taplat tai vastaavat aiheuttaen merkkiaineiden fluoresenssin, ja aallonpituuden suodattimet erottavat ja mittaavat emittoituvan fluoresenssin maåran. Aikaerotteisia fluoresenssimenetelmiå voidaan myos kayttaa. Interferenssi (niin kutsuttu ylikuulu-15 minen) kahden kanavan vålillå voidaan kompensoida standar-dikorjauksin, jos sita tapahtuu, tai voidaan ponnistella tavanomaisesti sen våhentåmiseksi. Kaksinkertaisesti lei-mattujen tåplien emittoimien kahden fluoresoivan signaa-lin erottaminen saadaan aikaan taman laitteen nykyisessa 20 muodossa suodattimin, jotka pystyvåt erottamaan kahden fluoresoivan sateilyn ominaisaallonpituudet; fluoresoivia aineita voidaan kuitenkin erottaa muiden fysikaalisten ominaisuuksien avulla, kuten eroavien fluoresenssin hajoa-misaikojen, vaalenemisaikojen jne. avulla, ja mita tahansa : : 25 nåista keinoista voidaan kayttaa joko yksistaån tai yhdis- telmina kahden fluoroforin erottamiseksi toisistaan, ja nåin on mahdollista mitata kahden yksittåisessa taplassa lasnåolevan fluoresoivan, leimatun kokonaisuuden (sidosai-neen ja paikan tunnistavan reagenssin) suhde kåyttaen 30 fluoresenssimittausten alalla hyvin tunnettua tekniikkaa.
Kun ISsna on vain yksi fluoresoiva leima, voidaan samaa tekniikkaa kayttSå sillå ehdolla, ettå huolehditaan siitå, ettå koko tåplå skannataan kussakin tapauksessa ja ettå tåplåt sisåltåvåt oleellisesti saman måårån sidosainetta 35 mååritysmenetelmåstå toiseen, kun kåytetåån tuntemattomia nåytteitå ja standardinåytteitå.
• · I
16 92110
Muiden leimojen, kuten radioisotooppisten leimojen, kemiluminoivien leimojen tai entsyymileimojen, tapauksessa tunnetaan hyvin analogisia keinoja yksittåisten signaalien erottamiseksi yhdesta tai kustakin tållaisesta leimaparis-5 ta. Esimerkiksi kaksi radioisotooppia, kuten 125I ja 131I, voidaan helposti erottaa niiden vastaavien radioaktiivis-ten sateilyjen erilaisten energioiden perusteella. Vastaa-vasti on mahdollista tunnistaa kahden entsyymireaktion tuotteet, jotka ovat peraisin kaksinkertaisesti entsyymi-10 leimatuista vasta-ainepareista ja ovat esim. erivårisia, tai kahdesta kemiluminoivasta reaktiosta, esim. erilaisis-ta kemiluminesenssin elinajasta tai valosateilyn aallonpi-tuudesta, kayttaen hyvin tunnettua tekniikkaa vastaavilla aloilla.
15 Keksintoa voidaan kayttaa biologisissa nesteisså låsnå olevien analyyttien, esimerkiksi ihmisen kehon nes-teiden, kuten veren, seerumin, syljen tai virtsan analyyttien, analysointiin. Niitå voidaan kåyttåå lukuisten hor-monien, proteiinien, entsyymien tai muiden analyyttien 20 analysointiin, joita voi olla lasna luonnostaan nestemai-sessa naytteessa tai joita voi olla lasna keinotekoisesti, kuten laakeaineiden, myrkkyjen tai vastaavien analysointiin.
Keksintoa voidaan esimerkiksi kåyttaå antamaan .: 25 kayttoon laite erilaisten raskauteen ja suvun jatkamiseen liittyvien hormonien, kuten FSH:n, LH:n, HCG:n, prolaktii-nin ja steroidihormonien (esim. progesteronin, estradio-lin, testosteronin ja androsteenidionin), tai adrenaaliai-volisakerungon hormonien, kuten kortisolin, ACTH:n ja al-30 dosteronin, tai kilpirauhaseen liittyvien hormonien, kuten T4:n, T3:n ja TSH:n ja niitå sitovan proteiinin, TBG:n, tai virusten, kuten hepatiitin, AIDSin tai herpesviruksen, tai bakteerien, kuten stafylokokin, streptokokin, pneumo-kokin, gonokokin ja enterokokin, tai kasvaimiin liittyvien 35 peptidien, kuten AFP:n tai CEA:n, tai laakeaineiden, kuten 92110 17 kiellettyjen, urheilijoiden suorityskykyå luvattomasti parantavien lååkeaineiden, tai elintarvikkeiden epapuh-tauksien kvantitatiiviseen analysointiin. Kussakin tapauk-sessa kåytetyt analyytit ovat spesifisiå analysoitavalle 5 sidosaineelle (verrattuna muihin naytteessa oleviin) ja voivat olla monoklonaalisia vasta-aineita.
Metodologian låhempiå yksityiskohtia loytyy PCT-patenttijulkaisustani W088/01058, jonka sisalto liitetaan tahan viitteeksi.
10 Keksintoa kuvataan seuraavin esimerkein.
Esimerkki 1
Anti-TFN (kasvainkuoliotekija) vasta-aine, jonka TNF:n affiniteettivakio 25 °C:ssa on noin 1 x 109 1/mol, leimataan kåyttåen Texas Red'ia. Valmistetaan vasta-aine-15 liuos, jonka konsentraatio on 80 μg/lni, ja 0,5 μ1:η nåyt-teet liuosta lisåtåan pisaroiden muodossa kuhunkin tayt-teisen, 12 syvennysta sisaltåvan Dynatech Microfluor -po-lystyreenimikrotiiterilevyn (låpinåkymåton, valkoinen) sy-vennykseen.
20 Anti-HCG (ihmisen koriongonadotropiini) -vasta-ai- ne, jonka HCG:n affiniteettivakio 25 °C:ssa on noin 6 x 108 1/mol, leimataan myos kayttåen Texas Red'ia. Valmistetaan vasta-aineliuos, jonka konsentraatio on 80 μg/mol, ja 0,5 μ1:η nåytteet tåtå liuosta lisåtåan pisaroiden muodossa • 25 saman Dynatech Microfluor -mikrotiiterilevyn kuhunkin sy- vennykseen.
Pisaroiden lisåyksen jålkeen levy jåtetåån muuta-maksi tunniksi kosteaan ympåristoon pisaroiden haihtumisen eståmiseksi. Tånå aikana jotkut pisaroiden vasta-ainemole-30 kyylit adsorboituvat levylle. Seuraavaksi syvennyksiå pes- tåån useita kertoja fosfaattipuskurilla, ja sitten ne tåy-tetåån 400 plzlla l-%:ista albumiiniliuosta ja jåtetåån seisomaan useaksi tunniksi jåljelle jååneiden sidoskohtien kyllåståmiseksi syvennyksisså. Sen jålkeen ne peståån 35 uudelleen fosfaattipuskurilla.
i. · · • 18 92110
Tuloksena syntyvån levyn kussakin syvennyksesså on kaksi tåplåå, kumpikin alaltaan noin 1 mm2. Fluoresenssin maaran roittaukset osoittavat, etta kussakin syvennyksessa toinen tåpla sisaltåå noin 5 x 109 molekyyliå anti-TNF-vas-5 ta-ainetta ja toinen sisåltåå noin 5 x 109 molekyyliå anti-HCG-vasta-ainetta. Syvennykset on suunniteltu kaytettavik-si tilavuudeltaan 400 μΐ olevien nestemåisten naytteiden kanssa siten, etta 0,1 V/K on 4 x lo'14 moolia (vastaa 2,4 x lo10 molekyyliå) anti-TNF-vasta-aineelle ja 7 x 10*14 moo-10 lia (vastaa 4 x lO10 molekyyliå) anti-HCG-vasta-aineelle.
Esimerkki 2
Mikrotiitterilevya, joka valmistettiin kuten esi-merkisså 1 kuvattiin, kåytetaån keinotekoisesti valmistet-tujen TNFraa ja HCG:tå sisaltavien liuosten måårityksesså.
15 Liuoksen koenayte, jonka måårå on noin 400 μΐ, lisataan yhteen syvennyksista ja sallitaan inkuboitua usean tunnin ajan. Noin 400 μΐ erilaisia standardiliuoksia, joiden TNF-ja HCG-konsentraatiot (0,02, 0,2, 2 ja 20 ng/ml) ovat tun-nettuja, lisataan levyn muihin syvennyksiin ja myos niiden 20 annetaan inkuboitua usean tunnin ajan. Syvennykset pes-taan sitten useita kertoja puskuriliuoksella.
Paikan tunnistavina reagensseina kåytetaån TNF-tåp-liå vårten anti-TNF-vasta-ainetta, jonka TNF:n affiniteet-tivakio 25 °C:ssa on noin 1 x 1010 1/mol, ja HCG-tåplille 25 anti-HCG-vasta-ainetta, jonka HCG:n affiniteettivakio on 25 °C:ssa noin 1 x 1011 1/mol. Molemmat vasta-aineet on lei-mattu fluoreseiinilla (FITC). 400 μ1:η nåytteet nåiden leimattujen vasta-aineiden liuosta lisåtåån syvennyksiin ja annetaan seistå muutaman tunnin ajan. Syvennykset pes-30 tåån sitten puskurilla.
Kuhunkin tåplåån syntynyt fluoresenssisuhde mååri- tetåån Bio-Rad Lasersharp MCR 500 samapolttopisteisellå mikroskoopilla. Standardiliuoksista muodostetaan annos-vastekåyråt TNF:åå ja HCG:tå vårten, TNF:Ile luvut ovat 35 seuraavanlaisia: « 19 921 ΊΟ TNF-konsentraatio FITC-fluoresenssi_ TNF-tåplåsså ng/1 Texas Red -fluoresenssi 0,02 1,1 0,2 4,6 5 2 7,9 20 42,5 ja vastaavat luvut HCG:le vårten ovat seuraavanlaisia: HCG-konsentraatio FITC-fluoresenssi HCG-tåplåsså ng/1 Texas Red -fluoresenssi 10 0,02 1,8 0,2 7,2 2 16,0 20 28,2 15 Keinotekoisesti valmistettujen liuosten todettiin antavan suhteelle lukemia 5,9 TNF-tåplåsså ja 10,5 HCG-tåplåsså, jotka vastaavat hyvin todellisia TNF (0,5 ng/ml) konsentraatiota ja HCG (0,5 ng/ml) konsentraatioita, jotka saadaan annos-vastekayralta.
20 Esimerkki 3 Kåyttåen samanlaisia menetelmia, joita esimerkissa 1 on kuvattu, valmistetaan mikrotiitterilevy, joka sisal-taa leimatun anti-T4 (tyroksiini) -vasta-aineen (affini-teettivakio on noin 1 x 1011 1/mol 25 °C:ssa) tåplia, leima- * 25 tun anti-TSH (kilpirauhasta stimuloiva hormoni) -vasta- aineen (affiniteettivakio noin 5 x 109 1/mol 25 °C:ssa) tåplia ja leimatun anti-T3 (trijodityroniini) -vasta-aineen (affiniteettivakio noin 1 x 1011 1/mol 25 °C:ssa) tåp-liå kussakin yksittåisesså syvennyksesså, tåplien sisåltå-30 esså alle 1 x 10*12 V moolia anti-T4-vasta-ainetta tai alle 2 x 10’11 V moolia anti-TSH-vasta-ainetta tai alle 1 x 10' 12 V moolia anti-T3-vasta-ainetta.
Kehitevasta-aine (paikan tunnistava reagenssi) TSH-mååritykseen on anti-TSH-vasta-aine, jonka TSH:n affini-35 teettivakio on 2 x 1010 1/mol 25 °C:ssa. Tåmå vasta-aine 4·· 20 92110 leimataan fluoreseiinilla (FITC). Paikan tunnistavia rea-gensseja T4- ja T3-måårityksisså ovat polylysiiniin yhdis-tetyt, FITC:11a leimatut T4 ja T3, ja ne tunnistavat tåyt-tymåttomåt kohdat vastaavissa ensimmåisisså vasta-aineis-5 sa.
Kun kåytetåån 400 μ1:η mååriå standardiliuoksia, jotka sisaltavat erilaisia tunnettuja maåria T4:åå, T3:a ja TSH:ta, annos-vastekåyråt saadaan kåyttåen menetelmiå, jotka ovat analogisia esimerkin 2 menetelmien kanssa, kor-10 reloiden fluoresenssisuhteet T4-, T3- ja TSH-konsentraa- tioihin. Levyå kaytetaan T4-, T3- ja TSH-tasojen mittaami-seen ihmispotilaiden seerumista tulosten vastatessa hyvin muilla menetelmillå saatuja tuloksia.
Esimerkki 4 15 Kåyttåen samanlaisia menetelmiå, joita esimerkisså 1 on kuvattu, valmistetaan mikrotiitterilevy, jossa on ensiksi leimattua anti-HCG-vasta-ainetta (affiniteettiva-kio on noin 6 x 108 1/mol 25 °C:ssa), toiseksi leimattua anti-HCG-vasta-ainetta (affiniteettivakio noin 1,3 x 1011 20 1/mol 25 °C:ssa) ja leimattua anti-FSH (munarakkulaa stimu-loiva hormoni) -vasta-ainetta (affiniteettivakio noin 1,3 x 1081/mol 25 °C:ssa) sisåltåviå tåpliå kussakin yksittåi-sesså syvennyksesså, kunkin tåplån sisåltåesså alle 0,1 V/K moolia vastaavaa vasta-ainetta. Ristiin reagoiva (alfa- • 25 alayksikko) monoklonaalinen vasta-aine 8D10, jonka affini- teettivakio on 1 x 1011 1/mol, kåytetåån yhteisenå kehite-vasta-aineena sekå HCG- ettå FSH-mååritysmenetelmiin.
Kun kåytetåån 400 μ1:η mååriå standardiliuoksia, jotka sisåltåvåt erilaisia tunnettuja HCG- ja FSH-konsent-30 raatioita, annos-vastekåyråt saadaan kåyttåen menetelmiå, jotka ovat analogisia esimerkin 2 menetelmien kanssa, kor-reloiden fluoresenssisuhteet HCG- ja FSH-konsentraatioi-hin, jolloin kåyrå, joka saadaan suuremman affiniteetin omaavalla anti-HCG-vasta-aineella, antaa konsentraatioher-35 kempiå tuloksia alhaisemmassa HCG-konsentraatiossa, kun * · « 92110 21 taas pienemman affiniteetin omaavan anti-HCG-vasta-aineen kayra on konsentraatioherkempi suureitunissa HCG-konsentraa-tiossa. Levyå kaytetaan naisten virtsassa olevien HCG- ja FSH-konsentraatioiden mittaamiseen raskaustestisså ja saa-5 daan hyva korrelaatio muilla keinoilla saatujen tulosten kanssa ja saadaan aikaan tehokkaat HCG:n konsentraatio-mittaukset suuruudeltaan kahden tai kolmen kertaluvun kon-sentraatioalueella, kun valitaan oikein paras HCG-tapla ja annos-vastekayra.
10 Leimattuien vasta-aineiden valmistaminen
Vasta-aineiden leimaaminen fluoresoivilla leimoil-la voidaan toteuttaa kayttaen hyvin tunnettua ja standar-ditekniikkaa, katso Leslie Hudson ja Frank C. Hay, "Practical Immunology", Blackwell Scientific Publications 15 (1980), sivut 11 - 13, esimerkiksi seuraavasti:
Monoklonaalinen vasta-aine anti-FSH 3G3, FSH-spesi-finen (beeta-alayksikko) vastaine, jonka affiniteettivakio (K) on 1,3 x 10® 1/mol, valmistettiin Middlesex Hospital Medical School'ssa, ja se leimattiin TRITCrlla (rodamiini-20 isotiosyanaatti) tai Texas Red:11a, jotka antavat punaisen fluoresenssin.
Monoklonaalinen vasta-aine anti-TSH 8D10, ristiin reagoiva (alfa-alayksikko) vasta-aine, jonka affiniteettivakio (K) on 1 x 1011 1/mol, valmistettiin vastaavasti *· 25 Middlesex Hospital Medical School'ssa ja leimattiin FITC:lla (fluoresiini-isotiosyanaatti), joka antaa kel-tavihrean fluoresenssin.
Tavanomaisesti kaytetty menettely kasittaå vesivat-sanesteen puhdistuksen (ammoniumsulfaattisaostus ja T-gee-30 likromatografia), joita seuraa leimaaminen, seuraavien vaiheiden mukaisesti: l.a. Ammoniumsulfaattipuhdistus 1. Lisåå 4,1 ml kyllåstettyå ammoniumsulfaatti-liuosta 5 mlraan vasta-ainevalmistetta (viljelysuperna-35 tantti tai 1:5 laimennettu vesivatsaneste) tasaisesti se-koittaen (45-%:inen kyllåstys).
22 92110 2. Jatka sekoittamista 30 - 90 minuutin ajan. Sent-rifugoi 2 500 kerrosta minuutissa 30 minuutin ajan.
3. Heita pois supernatantti ja liuota sakka PBSraan (lopullinen tilavuus 5 ml.). Toista vaiheet 1 ja 2, TAI
5 4. LisSa 3,6 ml kyllåstettyå ammoniumsulfaattia (40-%:inen kyllastys) sekoittaen tasaisesti. Toista vaihe 2.
5. Heita pois supernatantti ja liuota nappi halut-tuun puskuriin.
10 6. Dialysoi yon yli kylmassa samaa puskuria vastaan (kayttaen tuoretta, deionisoidussa vedesså keitettyå dia-lyysipussia).
7. Maarita proteiinikonsentraatio joko A280:ssa tai Lowryn arviota kayttaen.
15 l.b. T-geelikromatografia: (Puskuri: 1 M Tris-Cl, pH 7,6. kiintea kaliumsulfaatti) 1. Puhdista 2 ml vesivatsanestetta sentrifugoimalla 4 000 kierrosta minuutissa.
2. Lisaa 1 M Tris-Cl-liuos saadaksesi lopulliseksi 20 konsentraatioksi 0,1 M.
3. Lisaa riittava måara kiinteåta kaliumsulfaattia. Lopullinen konsentraatio = 0,5 M.
4. Laita vesivatsaneste T-geelipylvååseen.
5. Pese pylvås 0,1 M Tris-Cl-puskurilla, joka si- : 25 såltåå 0,5 M kaliumsulfaattia, kunnes proteiinikuvio (A280:ssa) palaa nollaan.
6. Eluoi adsorboitunut proteiini kayttaen 0,1 M Tris-Cl-puskuria eluenttina.
7. Yhdistå vasta-ainetta sisåltåvåt fraktiot ja 30 konsentroi kayttaen Amicon 30 -vakevdimislaitetta.
8. Jos HPHT-puhdistus toteutetaan, kaytå HPHT-kro-matografin aloituspuskuria vaiheen 7 aikana.
2. Vasta-aineiden FITC/TRITC-yhdistelmien leimaami- nen: 35 1. Dialysoi puhdistettu 1 g proteiinia 0,25 M kar- 23
9211 O
bonaattibikarbonaattipuskuriin, pH 9,0, konsentraatioon 20 mg/ml.
2. Lisaa FITC/TRITC saadaksesi suhde 1:20 proteii-nin kanssa (ts. 0,05 mg kutakin 1 mg proteiinia kohti).
5 3. Sekoita ja inkuboi 4 °C:ssa 16 - 18 tunnin ajan.
4. Erota konjugoitunut proteiini konjugoitumatto-masta seuraavasti: a. Sephadex G-25 -kromatografia FITC-leimaa vårten tai 10 b. DEAE-Sephacel-kromatografia TRITC/FITC-leimaa vårten.
Puskurisysteemi: PBS (a):ta vårten; 0,005 M fosfaatti, pH 8,0, ja 0,18 M 15 fosfaatti, pH 8,0, (b):tå vårten.
FITC:n laskeminen: Proteiinin kytkeytymissuhde: 2,87 X O.D.495 nm O.D.280 nm - 0.35 x O.D.495 nm u ·
Claims (11)
1. Menetelmå useiden analyyttien vallitsevien kon-sentraatioiden måårittåmiseksi tilavuudeltaan V-litraises- 5 sa nestemåisesså nåytteesså, tunnettu siita, ettå viedaan useita erilaisia sidosaineita, joista kukin kykenee sitomaan palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla låsnå nestemåisesså nåytteesså, ja on spesifinen tålle analyytille verrattuna muihin nestemåisen nåytteen 10 komponentteihin, kantajavålineeseen useisiin, toisistaan erillåån oleviin kohtiin siten, ettei yhdessåkåån kohdassa ole enempåå kuin 0,1 V/K moolia yksittåistå sidosainetta, jolloin K 1/mol on sidosaineen tasapainovakio analyytille; 15 saatetaan miehitetty kantajavåline kosketukseen analysoitavan nestemåisen nåytteen kanssa siten, ettå kukin erillåån oleva kohta saatetaan kosketukseen samassa toimenpiteesså nestemåisen nåytteen kanssa, jolloin nåytteesså oleva nesteen måårå on sellainen, ettå ainoastaan 20 merkitykseton osuus nestemåisesså nåytteesså låsnå olevas-ta analyytistå sitoutuu siile spesifiseen sidosaineeseen, ja mitataan sellainen parametri, joka edustaa sidosai-neiden osittaista miehittymistå analyyteillå toisistaan « 25 erillåån olevissa kohdissa kilpailevalla tai kilpailemat- tomalla mååritysmenetelmållå kåyttåen kullekin sidosai-neelle paikan tunnistavaa reagenssia, joka kykenee tun-nistamaan tåyttymåttomån sidoskohdan tai tåyttyneen sidos-kohdan sidosaineessa, jolloin kyseinen paikan tunnistava 30 reagenssi leimattu merkkiaineella, joka sallii kyseisen reagenssin måårån mittauksen tietysså kohdassa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kussakin erillåån olevassa kohdassa on alle 0,01 V/K moolia yksittåistå sidosainetta. • 1 25 92110
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettS kaytettyjen sidosaineiden ta-sapainovakiot analyyteille ovat 108 - 1013 1/mol.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 5 tunnettu siita, etta kaytettyjen sidosaineiden ta-sapainovakiot analyyteille ovat suuruusluokkaa 1010 tai 1011 1/mol kohti.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta nestemaisen naytteen tilavuus 10 on enintaan 0,1 litraa.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta nestemaisen naytteen tilavuus on 400 - 1 000 μΐ.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 15 tunnettu siita, etta kantajavalineeseen miehitetyt sidosaineet ovat vasta-aineita analyytille, jonka konsent-raatio on tarkoitus maarittaa.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta sidosaineet on leimattu merk- 20 kiaineilla, jotka mahdollistavat sidosaineen konsentraa- tiotasojen mittaamisen.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta sidosaineet ja paikan tunnis-tavat reagenssit leimataan fluoresenssimerkkiaineilla si- : 25 ten, etta yksittåisissa, erillaan olevissa kohdissa maari- tysmenetelmån sidosaineiden osittaista miehittymista mit-taava tekniikka mittaa fluoresoivien merkkiaineiden emit-toimien signaalien suhteita.
10. Laite kaytettavåksi patenttivaatimuksen I mu- 30 kaisessa menetelmassa useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden maarittamiseen nestemaisessa, tilavuu-deltaan V-litraisessa naytteessa, tunnettu siita, etta se kasittaa kiinteån kantajavalineen, jolle on sijoi-tettu useisiin erillaan oleviin kohtiin useita erilaisia 35 sidosaineita, kunkin sidosaineen ollessa kykenevå sitomaan • · 26 92110 palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla låsnå neste-måisesså nåytteesså, ja ollessa spesifinen tålle analyy-tille verrattuna muihin nesteen komponentteihin, ja kus-sakin kohdassa on enintåån 0,1 V/K moolia yksittåistå si-5 dosainetta, jolloin K 1/mol on tåmån sidosaineen tasapai-novakio reaktiolle analyytin kanssa, jolle se on spesifinen.
11. Kitti kåytettåvåksi patenttivaatimuksen 1 mu-kaisessa menetelmåsså useiden analyyttien vallitsevien 10 konsentraatioiden måårittåmiseen nestemåisesså, tilavuu-deltaan V-litraisessa nåytteesså, tunnettu siitå, ettå se kåsittåå kiinteån kantajavålineen, jolle on sijoitettu usei-siin erillåån oleviin kohtiin useita erilaisia sidosainei-15 ta, kunkin sidosaineen kyetesså sitomaan palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla låsnå nestemåisesså nåytteesså, ja ollessa spesifinen tålle analyytille verrattuna muihin nestemåisen liuoksen komponentteihin, ja kussakin kohdassa on enintåån 0,1 V/K, edullisesti alle 0,01 V/K, 20 moolia yksittåistå sidosainetta, jolloin K 1/mol on tåmån sidosaineen tasapainovakio reaktiolle analyytin kanssa, jolle se on spesifinen, tunnettuja konsentraatioita useita standardinåyt-teitå, jotka sisåltåvåt analyyttejå, joiden konsentraatiot : 25 nestemåisesså nåytteesså mitataan, ja sarjan leimattuja, paikan tunnistavia reagensseja reaktiolle tåyttyneiden ja tåyttymåttomien sidoskohtien kanssa sidosaineissa. 27 9 21 1 0
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/GB1987/000558 WO1988001058A1 (en) | 1986-08-06 | 1987-08-06 | Determination of analyte concentration using two labelling markers |
| GB8700558 | 1987-08-06 | ||
| GB8800649 | 1988-01-13 | ||
| GB888803000A GB8803000D0 (en) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | Determination of ambient concentrations of several analytes |
| PCT/GB1988/000649 WO1989001157A1 (en) | 1987-08-06 | 1988-08-05 | Determination of ambient concentration of several analytes |
| GB8803000 | 1998-02-10 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI900557A0 FI900557A0 (fi) | 1990-02-05 |
| FI92110B FI92110B (fi) | 1994-06-15 |
| FI92110C true FI92110C (fi) | 1994-09-26 |
Family
ID=10631410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI900557A FI92110C (fi) | 1987-08-06 | 1990-02-05 | Useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittäminen |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5432099A (fi) |
| EP (2) | EP0304202B1 (fi) |
| JP (1) | JP2562194B2 (fi) |
| KR (1) | KR970007079B1 (fi) |
| AT (1) | ATE78101T1 (fi) |
| AU (1) | AU625052B2 (fi) |
| BR (1) | BR8807644A (fi) |
| CA (1) | CA1334278C (fi) |
| DE (1) | DE3872621T2 (fi) |
| DK (1) | DK164944C (fi) |
| ES (1) | ES2034245T3 (fi) |
| FI (1) | FI92110C (fi) |
| GB (1) | GB8803000D0 (fi) |
| GR (1) | GR3005905T3 (fi) |
| HU (1) | HU884720D0 (fi) |
| NO (1) | NO177205C (fi) |
| WO (1) | WO1989001157A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA885825B (fi) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5807755A (en) * | 1987-08-06 | 1998-09-15 | Multilyte Limited | Determination of ambient concentrations of several analytes |
| GB8810400D0 (en) | 1988-05-03 | 1988-06-08 | Southern E | Analysing polynucleotide sequences |
| US7811751B2 (en) | 1988-05-03 | 2010-10-12 | Oxford Gene Technology Limited | Analysing polynucleotide sequences |
| US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US6379895B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-04-30 | Affymetrix, Inc. | Photolithographic and other means for manufacturing arrays |
| US6551784B2 (en) | 1989-06-07 | 2003-04-22 | Affymetrix Inc | Method of comparing nucleic acid sequences |
| US5656207A (en) * | 1989-06-24 | 1997-08-12 | Gen Probe Incorporated | Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques |
| WO1992010588A1 (en) * | 1990-12-06 | 1992-06-25 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides |
| EP0608370B1 (en) * | 1991-10-15 | 1998-01-07 | Multilyte Limited | Binding assay employing labelled reagent |
| US6943034B1 (en) * | 1991-11-22 | 2005-09-13 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US5395752A (en) * | 1993-03-19 | 1995-03-07 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Long emission wavelength chemiluminescent compounds and their use in test assays |
| US6893816B1 (en) | 1993-10-28 | 2005-05-17 | Houston Advanced Research Center | Microfabricated, flowthrough porous apparatus for discrete detection of binding reactions |
| GB9326450D0 (en) * | 1993-12-24 | 1994-02-23 | Multilyte Ltd | Binding assay |
| GB9326451D0 (en) * | 1993-12-24 | 1994-02-23 | Multilyte Ltd | Binding assay |
| US7625697B2 (en) | 1994-06-17 | 2009-12-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby |
| US6207369B1 (en) * | 1995-03-10 | 2001-03-27 | Meso Scale Technologies, Llc | Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing |
| US6416714B1 (en) * | 1995-04-25 | 2002-07-09 | Discovery Partners International, Inc. | Remotely programmable matrices with memories |
| GB9602323D0 (en) * | 1996-02-06 | 1996-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Materials and methods relating to binding assays |
| US5874216A (en) * | 1996-02-23 | 1999-02-23 | Ensys Environmental Products, Inc. | Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof |
| EP0904542B1 (en) * | 1996-03-01 | 2005-06-29 | Beckman Coulter, Inc. | System for simultaneously conducting multiple ligand binding assays |
| US6821707B2 (en) | 1996-03-11 | 2004-11-23 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Optical information recording medium, producing method thereof and method of recording/erasing/reproducing information |
| IL126544A (en) | 1996-04-25 | 2004-08-31 | Genicon Sciences Inc | Test for component detection using detectable particles in diffused light |
| US6586193B2 (en) * | 1996-04-25 | 2003-07-01 | Genicon Sciences Corporation | Analyte assay using particulate labels |
| US5981956A (en) * | 1996-05-16 | 1999-11-09 | Affymetrix, Inc. | Systems and methods for detection of labeled materials |
| EP0874242B2 (en) * | 1997-04-21 | 2009-06-03 | Randox Laboratories Ltd. | Device and apparatus for the simultaneous detection of multiple analytes |
| BR9800655A (pt) * | 1997-04-21 | 1999-08-10 | Randox Lab Ltd | Dispositivo de estado sólido para efetuar ensaios com múltiplos analisados seu uso e e sistema para análise de múltiplos analisados |
| DE19731465A1 (de) * | 1997-07-22 | 1999-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von Kontrollflächen zur Detektion von Störproben in einem Nachweisverfahren |
| JPH11134720A (ja) | 1997-08-28 | 1999-05-21 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 光学的情報記録媒体及びその記録再生方法 |
| US6343062B1 (en) | 1997-09-26 | 2002-01-29 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd | Optical disk device and optical disk for recording and reproducing high-density signals |
| US7157234B2 (en) * | 1997-10-24 | 2007-01-02 | Beckman Coulter, Inc. | Detection of very low quantities of analyte bound to a solid phase |
| DE19748489A1 (de) | 1997-11-03 | 1999-05-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren |
| US20070166741A1 (en) | 1998-12-14 | 2007-07-19 | Somalogic, Incorporated | Multiplexed analyses of test samples |
| US6242246B1 (en) | 1997-12-15 | 2001-06-05 | Somalogic, Inc. | Nucleic acid ligand diagnostic Biochip |
| JP2002502977A (ja) | 1998-02-04 | 2002-01-29 | インビトロジェン コーポレイション | マイクロアレイとその使用 |
| US6576478B1 (en) * | 1998-07-14 | 2003-06-10 | Zyomyx, Inc. | Microdevices for high-throughput screening of biomolecules |
| TW448443B (en) | 1998-08-05 | 2001-08-01 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Optical information storage media and production method as well as the storage reproducing method and device |
| JP5006494B2 (ja) * | 1999-08-13 | 2012-08-22 | バイエル・テクノロジー・サービシーズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 複数の分析物を測定するためのデバイス及び方法 |
| US6623936B1 (en) | 1999-09-24 | 2003-09-23 | Imgenex | Compositions and methods for improved detection and classification of neoplasms |
| WO2001083827A1 (en) * | 2000-05-04 | 2001-11-08 | Yale University | High density protein arrays for screening of protein activity |
| US20030138208A1 (en) * | 2000-05-06 | 2003-07-24 | Michael Pawlak | Grating optical waveguide structure for multi-analyte determinations and the use thereof |
| JP4812223B2 (ja) * | 2000-06-02 | 2011-11-09 | バイエル・テクノロジー・サービシーズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 多分析対象物測定のためのキット及び方法 |
| AU2001292959A1 (en) | 2000-09-22 | 2002-04-02 | Clontech Laboratories, Inc. | Highly sensitive proteomic analysis methods and kits and systems for practicing the same |
| AU2002224831A1 (en) * | 2000-11-17 | 2002-05-27 | Zeptosens Ag | Kit and method for determining multiple analytes |
| GB0102357D0 (en) | 2001-01-30 | 2001-03-14 | Randox Lab Ltd | Imaging method |
| JP2005507489A (ja) * | 2001-02-23 | 2005-03-17 | ジェニコン サイエンスィズ コーポレーション | 検体分析において拡張ダイナミックレンジを提供する方法 |
| US20030013208A1 (en) * | 2001-07-13 | 2003-01-16 | Milagen, Inc. | Information enhanced antibody arrays |
| AU2002361223A1 (en) * | 2001-08-27 | 2003-03-18 | Zeptosens Ag | Bioanalytical recognition surface with optimised recognition element density |
| EP1481090A4 (en) * | 2002-02-15 | 2006-08-09 | Somalogic Inc | METHOD AND REAGENTS FOR DETECTING BINDING OF TARGET MOLECULES BY NUCLEIC ACID ELECTRODES |
| WO2003096018A2 (de) * | 2002-05-13 | 2003-11-20 | Zeptosens Ag | Kit zur assay-entwicklung und für serien-analysen |
| US20040248323A1 (en) * | 2003-06-09 | 2004-12-09 | Protometrix, Inc. | Methods for conducting assays for enzyme activity on protein microarrays |
| US20050079507A1 (en) * | 2003-10-09 | 2005-04-14 | Ye Fang | Target evaluation using biological membrane arrays |
| US20050141843A1 (en) * | 2003-12-31 | 2005-06-30 | Invitrogen Corporation | Waveguide comprising scattered light detectable particles |
| GB0409775D0 (en) * | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Mabtech Ab | Assay |
| GB0409771D0 (en) * | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Mabtech Ab | Assay |
| EP1626279B1 (en) * | 2004-08-12 | 2008-04-16 | Roche Diagnostics GmbH | Method for diagnosing liver fibrosis |
| EP1626280B1 (en) * | 2004-08-12 | 2007-02-14 | Roche Diagnostics GmbH | Method for diagnosing liver fibrosis |
| GB0421838D0 (en) | 2004-09-30 | 2004-11-03 | Congenia S R L | Cancer markers |
| DE102004052729A1 (de) | 2004-10-30 | 2006-05-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Immunkomplex-spezifsicher Antikörper zur Reduktion des Nullwerts beim Nachweis von Antigen-spezifisch gebundenen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in Array-Testformaten |
| EP2302055B1 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-27 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules |
| ES2525324T3 (es) * | 2005-04-26 | 2014-12-22 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Nuevo aparato y procedimiento de recubrimiento de sustratos portadores para la detección de analitos mediante un procedimiento de detección por afinidad |
| US20080311679A1 (en) * | 2005-12-23 | 2008-12-18 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Biosensor Device |
| EP1994171B1 (en) * | 2006-01-17 | 2015-03-11 | Somalogic, Inc. | Multiplexed analyses of test samples |
| AU2007299748A1 (en) | 2006-09-19 | 2008-03-27 | Asuragen, Inc. | miR-15, miR-26, miR -31,miR -145, miR-147, miR-188, miR-215, miR-216 miR-331, mmu-miR-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
| US7855054B2 (en) * | 2007-01-16 | 2010-12-21 | Somalogic, Inc. | Multiplexed analyses of test samples |
| US20110136099A1 (en) * | 2007-01-16 | 2011-06-09 | Somalogic, Inc. | Multiplexed Analyses of Test Samples |
| US8906700B2 (en) | 2007-11-06 | 2014-12-09 | Ambergen, Inc. | Methods and compositions for phototransfer |
| US8304255B1 (en) | 2008-02-11 | 2012-11-06 | Access Medical Systems, Ltd. | Immunoassay cuvettes |
| CN103109190B (zh) | 2010-08-19 | 2015-07-22 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于测量结合治疗性单克隆抗体的抗体的测定法 |
| GB201016403D0 (en) | 2010-09-29 | 2010-11-10 | Bath Ventures | Novel interaction between staphylococcus aureus Sbi and C3d protiens |
| ES2935257T3 (es) | 2013-03-15 | 2023-03-03 | Univ Chicago | Métodos y composiciones relacionadas con la actividad de las células T |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4292296A (en) * | 1978-09-12 | 1981-09-29 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Diagnostic method |
| DE3269567D1 (en) * | 1981-04-29 | 1986-04-10 | Ciba Geigy Ag | New devices and kits for immunological analysis |
| JPH0664059B2 (ja) * | 1982-08-27 | 1994-08-22 | マルティライト リミティド | 被検体の濃度の測定方法 |
| US4591570A (en) * | 1983-02-02 | 1986-05-27 | Centocor, Inc. | Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens |
| GB8421318D0 (en) * | 1984-08-22 | 1984-09-26 | Ekins R P | Potentiating antibodies/other macro-molecules |
| US5096807A (en) * | 1985-03-06 | 1992-03-17 | Murex Corporation | Imaging immunoassay detection system with background compensation and its use |
| AU614935B2 (en) * | 1986-08-06 | 1991-09-19 | Multilyte Limited | Determination of analyte concentration using two labelling markers |
-
1988
- 1988-02-10 GB GB888803000A patent/GB8803000D0/en active Pending
- 1988-08-05 ES ES8888307273T patent/ES2034245T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-05 AU AU22534/88A patent/AU625052B2/en not_active Expired
- 1988-08-05 DE DE8888307273T patent/DE3872621T2/de not_active Ceased
- 1988-08-05 CA CA000573974A patent/CA1334278C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-05 EP EP88307273A patent/EP0304202B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-05 EP EP88906976A patent/EP0375700A1/en active Pending
- 1988-08-05 WO PCT/GB1988/000649 patent/WO1989001157A1/en active IP Right Grant
- 1988-08-05 BR BR888807644A patent/BR8807644A/pt not_active Application Discontinuation
- 1988-08-05 AT AT88307273T patent/ATE78101T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-08-05 JP JP63506680A patent/JP2562194B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-05 KR KR1019890700588A patent/KR970007079B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-08-05 HU HU884720A patent/HU884720D0/hu unknown
- 1988-08-08 ZA ZA885825A patent/ZA885825B/xx unknown
-
1990
- 1990-02-05 FI FI900557A patent/FI92110C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-02-05 DK DK029390A patent/DK164944C/da not_active IP Right Cessation
- 1990-02-05 NO NO900534A patent/NO177205C/no not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-10-08 GR GR920401798T patent/GR3005905T3/el unknown
- 1992-12-01 US US07/984,264 patent/US5432099A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR3005905T3 (fi) | 1993-06-07 |
| CA1334278C (en) | 1995-02-07 |
| EP0304202B1 (en) | 1992-07-08 |
| ATE78101T1 (de) | 1992-07-15 |
| NO177205B (no) | 1995-04-24 |
| BR8807644A (pt) | 1990-08-07 |
| EP0304202A1 (en) | 1989-02-22 |
| EP0375700A1 (en) | 1990-07-04 |
| DK29390A (da) | 1990-04-05 |
| FI900557A0 (fi) | 1990-02-05 |
| US5432099A (en) | 1995-07-11 |
| DK164944C (da) | 1993-02-01 |
| AU625052B2 (en) | 1992-07-02 |
| KR890702033A (ko) | 1989-12-22 |
| DK164944B (da) | 1992-09-14 |
| FI92110B (fi) | 1994-06-15 |
| NO177205C (no) | 1995-08-02 |
| DK29390D0 (da) | 1990-02-05 |
| DE3872621D1 (fi) | 1992-08-13 |
| NO900534L (no) | 1990-02-05 |
| JP2562194B2 (ja) | 1996-12-11 |
| JPH03503081A (ja) | 1991-07-11 |
| NO900534D0 (no) | 1990-02-05 |
| ZA885825B (en) | 1989-04-26 |
| AU2253488A (en) | 1989-03-01 |
| HU884720D0 (en) | 1990-09-28 |
| DE3872621T2 (de) | 1993-02-18 |
| GB8803000D0 (en) | 1988-03-09 |
| KR970007079B1 (ko) | 1997-05-02 |
| WO1989001157A1 (en) | 1989-02-09 |
| ES2034245T3 (es) | 1993-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI92110C (fi) | Useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittäminen | |
| US5807755A (en) | Determination of ambient concentrations of several analytes | |
| US4923819A (en) | Time-resolved fluorescence immunoassay | |
| EP0250137B1 (en) | Colloidal gold immunoassay | |
| US5569608A (en) | Quantitative detection of analytes on immunochromatographic strips | |
| Barnard et al. | Idiometric assay: noncompetitive immunoassay for small molecules typified by the measurement of estradiol in serum | |
| US5296347A (en) | Bridge immunoassay | |
| EP0138826B1 (en) | Detection of human chorionic gonadotropin | |
| US4786589A (en) | Immunoassay utilizing formazan-prelabeled reactants | |
| KR920005963B1 (ko) | 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법 | |
| US20060257862A1 (en) | A highly cost-effective analytical device for performing immunoassays with ultra high sensitivity | |
| EP0516095A2 (en) | Process and device for specific binding assay | |
| JPH03502244A (ja) | 試験方法およびそのための試薬キツト | |
| JPH07503540A (ja) | 半定量結合検定用校正試薬および装置 | |
| EP0864090A1 (en) | Method and apparatus for quantitative and semi-quantitative determination of an analyte | |
| US5719063A (en) | Multiplex immunoassay system | |
| US5464749A (en) | Immunoassay of free substances in biological fluids | |
| EP0603958A1 (en) | Improvement of the dynamic range in specific binding assays | |
| JPS62112064A (ja) | 結合性被分析物の測定法 | |
| JPH0421819B2 (fi) | ||
| JPH02502122A (ja) | 液体中のリガンドを検出及び定量する方法 | |
| EP0596074A1 (en) | Improved wash technique for immunoassay | |
| JPS6336151A (ja) | 微粒子の螢光強度測定による定量方法 | |
| Haasnoot et al. | 5. Immunochemical and receptor technologies | |
| WO1983001118A1 (en) | Monoclonal antibody detection system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: MULTILYTE LIMITED |
|
| MA | Patent expired |