JPH0664059B2 - 被検体の濃度の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、流体中の遊離状体にある被検体の濃度、特に
は体液例えば唾液、血清、血液及び尿中のホルモン及び
他の生物学的活性物質の濃度の測定に関する。

背景技術 体液中のホルモンの濃度を測定するにあたり、正確に容
量を計った体液試料と、ホルモンに対して特異的な結合
部位を有する結合剤（通常は、抗体）及び放射性ラベル
を付したホルモンとを接触させることによって、前記濃
度を測定することは公知である。前記の結合剤は、ラベ
ルを付していないホルモンの一部分及びラベルを付した
ホルモンの一部分と結合するが、結合したラベルを付し
たホルモンの相対量は、前記試料中に存在するラベルに
付していないホルモンの量の関数となる。こうして得ら
れた結果は、ラベルを付していないホルモンの既知量を
含む標準溶液を使って得られた結果と比較することによ
って検量し、こうして未知試料中のラベルを付していな
いホルモンの実際の量を決める。

前記の公知技術の重要な欠点は、問題の体液試料を身体
から取出して試験管等に移す必要があり、しかもその絶
対量を知る必要がある点である。これらの困難な点の一
方又は両方を避けることができれば有利である。

発明の開示 本発明によれば、流体中で遊離状態にある被検体、例え
ばホルモン濃度を、被測定流体の容量を知らないで測定
することができ、しかも、体液が対象の場合には、その
体液を身体から取出すことを必要としない手段が提供さ
れる。

本発明の基礎となる事実は、従来知られておらず、被検
体例えばホルモンを含む流体と、被検体に特異的な結合
部位を有する抗体又はその他の結合剤とを接触させた場
合に、被検体による結合部位の占有度（結合部位が塞が
る又は占有される割合）は、前記流体の絶対容量及び結
合部位の絶対数と無関係であり、しかも結合剤の絶対量
とも無関係であるという事実である。但し、被検体と結
合剤との相対量及び両者の親和性は、流体内への結合剤
の導入が被検体の濃度に有意な影響をもたらさないもの
である場合に限られるという条件がある。すなわち、例
えば、結合剤の痕跡量だけを使用して、遊離状態にある
被検体がその結合剤に結合してもなお以下の等式が成立
する程度の小部分の被検体のみが結合剤と結合する場合
には、流体中の被検体の全体の濃度は、決して顕著に変
化しない。

上記の条件下においては、流体中の被検体の濃度〔Ｈ〕
と、占有された結合部位との分数（fraction）〔Ab/A
b_o〕は、 式 （式中、Ab_oは結合剤の結合部位の総量であり、Abは結
合剤の結合部位の内被検体の結合により占有される量で
あり、そしてＫ_abは結合部位に対する被検体の結合の平
衡定数であり、一定の被検体及び結合剤について一定温
度下では一定値をとる） で表わされる関係がある。

従って、Ab/Ab_oを測定することにより、被検流体中の被
検体の濃度〔Ｈ〕を算出することができる。

この基本的な思想と非常に良く似た思想は、雰囲気温度
を測定するために、簡単な温度計を使用することであ
る。温度計は、例えば室内に入れると、一般には温度計
によって熱が摂取されることとなり、室内の前の温度が
（通常は、わずかであるが）乱されることになる。室及
びその内にある物の熱容量が、温度計と比較して大きい
場合には、温度計が最終的に記録する温度は、元の室温
を本質的に反映したものとなる。同様に、生物学的流体
等に導入した抗体又は他の結合剤プローブの結合部位占
有度は、前記の条件が成立するとすれば、前記流体中に
元から存在した被検体の濃度を反映したものとなる。

従って、不動化した結合剤を低濃度で含むプローブを設
計し、遊離状態にある被検体の濃度が測定対象となって
いる流体中に前記プローブを導入し、平衡に達した後
で、被検体が占有した抗体の部位の割合を決定すること
が可能になる。前記の決定は、しばしば流体から取り出
した後のプローブについて行なわれる。もっとも、この
点は本発明の必須の事項ではない。場合によっては、検
出した被検体濃度のあるかもしれない不均衡を修正する
フィードバック測定を伴って、例えば、体液中のホルモ
ン水準を特定のものに維持して、前記決定をその場で行
なうことが好ましい場合もある。

従って、本発明は、広い意味では、一つの面で、流体中
の遊離状態にある被検体の濃度を測定する方法を提供す
るものであり、前記の方法は、被検体に特異的な結合部
位を有する痕跡量の結合剤と容量を測定していない流体
とを接触させ、前記結合部位の占有割合から、流体中の
被検体の濃度を定量することを含んでなるものである。
本明細書において、「痕跡」なる用語は、流体中の遊離
の被検体の全濃度に対し、有意な作用を行わない量、す
なわち被検体と結合剤が結合することにより被検体の全
濃度が実験誤差を越える程変化して、前記等式で示され
る関係が破壊されない程度の量を意味する。この量は既
知濃度の被検体を用いる実験により容易に知ることがで
きる。

本発明方法は、特異的結合剤が利用可能である限り、す
べての型の被検体の定量に使用することができる。しか
しながら、本発明の方法は他の定量方法がより複雑であ
る、生物学的活性材料例えば医薬、ウィルス及び特には
ホルモンの定量について最も価値があると考えられる。
被検体としては、単純な水溶液からあらゆる型の生物学
的流体に至る任意の流体に存在するが、体液中の濃度の
定量が特に重要な領域である。他の成分の存在又は不在
は、それらの成分が被検体の結合剤への結合を妨害しな
い限り、問題とはならない。ホルモンは、内因性結合ホ
ルモンをも含む流体中に存在するものでもよいが、この
ことは必須の事項ではない。

結合剤は、問題の流体中に存在する他の成分と比較し
て、問題の被検体に特異的な結合部位を有するものであ
る限り、広い範囲のものを使うことができる。ホルモン
又は他の天然に存在する生体化学物質の濃度を定量する
場合には、問題の化学物質の、簡単に得ることのできる
抗体を使うことが有利である。しかしながら、他の結合
剤例えば結合性タンパク質又は受容体調製物（問題の化
学物質が通常結合する身体の領域に由来する、受容体部
位を含む調製物）を使うこともできる。

使用する結合剤は、固体支持体上に不動化することが便
利である（もっとも、可溶性結合剤を使用し、後にこれ
を沈澱させるか又は分離し、結合部位の占有度を定量す
ることもできる）。使用する固体支持体は、前記の目的
に通常使用するもの、例えば、セルロース、ポリサッカ
ライド及びセファデックス（Sephadex：登録商標）等で
あることができる。本発明の好ましい態様に基づいて、
体液中の被検体濃度を、身体から体液を取り出さずに定
量する場合においては、前記支持体は、身体の適当な部
分に導入するのに便利な任意の形、例えばポリスチレン
又は他の剛性で無害のプラスチック材料から成るプロー
ブの形であることができる。

選択する結合剤は、その平衡定数Ｋ_ab（前記の式参照）
が、流体中における被検体の予想濃度において被検体に
よって塞がれる結合部位の割合が100％より可成り下、
更に好ましくは75％未満であるものであることが好まし
い。これによって、種々の濃度に対する一層大きな感度
が提供される。従って、選択する結合剤は、抗体上の結
合部位の占有度ができるだけ高くそして平衡定数もでき
るだけ高いことが望ましい、ホルモン濃度の公知のラジ
オイミュノアッセイ測定法において使用するために選ば
れる抗体とは、熱力学的特性の点で異なっている。

その存在を認識することのできる試薬例えば放射性ラベ
ルに付した形の被検体による、非占有部位への結合を含
む方法により、結合剤上の結合部位の占有度を決定する
場合には、平衡定数Ｋ_abは、結合部位の実質的な割合が
有利には少なくとも25％占有されるものであることが好
ましい。なぜなら、これによって、最終測定において感
度がより大きくなるからである。前記の事情の下では、
結合剤の平衡定数は、これが50％に近い結合部位占有度
に導くので、予想される被検体濃度の逆数（reciproca
l）に近いことが好ましい。

前述の結合性タンパク質上の結合部位の被検体による占
有度を定量する種類の方法は、最も広い形での本発明の
必須の部分ではなく、種々の方法を使うことができる。
これらの中で最も簡単なものは、非占有部位と結合する
ラベル付き試薬を使用することによる、非占有部位の逆
滴定であるが、サンドイッチ型又はトウーサイト（two-
site）法も使うことができる。あるいは、占有度合は、
その場にある生物学的又は他の手段により測定すること
ができる。

逆滴定法は、例えば特開昭55-146034の第６頁右下欄に
記載されているように、次の様にして行うことができ
る。

ａ）液体サンプル残部から固定化非結合およびリガンド
結合抗体を分離する ｂ）分離した固定化抗体を既知量の標識リガンドを含む
液体と接触させ、標識リガンドの一部を固体化抗体に結
合させる ｃ）固定化非結合および（標識および非標識）リガンド
結合抗体を液体残部から分離する ｄ）固定化抗体に結合した標識リガンドの量を定量する ｅ）固定化抗体にはじめに結合した非標識リガンドの量
および／または初期サンプル中の遊離リガンド量を、既
知遊離リガンド濃度を有する標準液体サンプルから得ら
れた検量線を用いて求める。

逆滴定検出法を使用する場合には、被検体の結合剤から
の早期解離のために生ずる測定誤差を避けるために、被
検体の非結合解離定数が低い結合剤を使うことが好まし
い。平衡に達する速度は遅くてもよいが、被検体に対し
て使用する結合剤の量が充分に少ない量には、比較的速
く平衡に達することが必要である。平衡に達する前に測
定を行ない、その結果から含有濃度を推定することも可
能であるが、この方法は操作を複雑にし、正確度を減ず
るので、推奨されるものではない。

前記試験方法のために少量の結合剤の使用にあたり、存
在する占有及び非占有結合部位の絶対数は一般に少しな
ので、非占有結合部位の割合を決定するために逆滴定用
の高特異的活性のラベル付き試薬をもつことがより重要
になる。従って、通常の放射性同位体ラベルの代わり
に、他の型のラベル例えば蛍光ラベルを使うことが望ま
しい。

被検体のラベル付け用に、非常に高い特異的活性をもつ
蛍光ラベル等を使用することの更に有利な点は、それら
の使用により、例えば適当なプラスチック材料の表面上
に付着する〔ラベル付き抗体及び（又は）ラベル付き被
検体を含んでなる〕蛍光ラベルの分配の走査に依存する
非常に高感度の多被検体分析の開発を可能にする点であ
る。種々の抗体の混合物で「プリント」され、続いて試
験下の生物学的流体に露出される前記表面は、同一試料
中の多数の異なる被検体の濃度を知るために使用するこ
とのできる可能性がある。かかる要求があると考えられ
るのは、ウィルス性抗原及び（又は）抗体、腫瘍性抗
原、ホルモン等の複合混合物の存在に対して血液をモニ
ターすることである。

「イミュノメータ」、すなわち上記段落で議論した被検
体濃度検出装置、の概念は、研究及び日常的臨床診断に
おいて大きな変化をもたらすものと考えられる。例え
ば、ステロイド及び甲状腺ホルモンの水準を、現在一般
的に行なわれているように血液試料を分析することによ
ってではなく、プラスチックプローブを２〜３分間被検
者の口中に挿入して唾液中に存在するホルモンの存在状
態水準に露出してからプラスチックプローブにおける抗
体結合部位占有度を検査することによって、結果的にモ
ニターをすることができる。

以下の実施例によって、本発明の基礎を更に説明する。

例１ 体液中に存在するホルモンに対する抗体を、pH8.7で0.0
5Ｍバルビタールバッファー中で希釈し、得られる流体
をポリスチレン製のプラスチック支持体の形のプローブ
に、２〜16時間雰囲気温度で露出する。次にこのプラス
チック支持体を取り出し、充分に洗うと、公知の方法に
よって親和性（平衡定数）及び結合容量を査定した後
で、本発明方法によって適当な流体中のホルモンの濃度
を評価するプローブとして使うことができる。

例２ ウエーズのカルディフ（Cardiff）のウェルシュ・ナシ
ョナル・スクール・オブ・メディシン（Welsh National
School of Medicine）、テノビラス・インスティテュ
ート・フォー・カンサー・リサーチ（Tenovirus Instit
ute for Cancer Research）で得た、ヒドロコルチゾン
（コルチソル）に対する抗体を、固体支持体と結合さ
せ、得られた材料の平衡定数（Ｋ_ab）及び結合容量をス
キャチァード（Scatchard）分析法によって測定したと
ころ、それぞれ２×10¹⁰／モル及び100ｐモル／ｍ
であった。

ゼラチン（イングランド、プーレのBDH Chemicals Ltd.
のNo.44045）0.1重量％を含む、0.05MKH₂PO₄及び0.15Ｍ
ＮａＣ（pH7.4に）のバッファー溶液（以下、PBSと
称す）中に、純粋のコルチソル（イングランド、プーレ
のSigma Chemical Co.のH4001）を溶かすことによっ
て、コルチソルを100pM，1nM，10nM，100nM及び１μＭ
の濃度で含むコルチソル標準溶液を調製した。

コルチソル10fモル未満と結合する量の抗体調合物を、
それぞれ0.2,0.4及び0.8ｍの容量のコリチソル標準溶
液の各試料と20℃で平衡に達するまで（16時間、もっと
も実用上は20分間以内に平衡が達成された）インキュベ
ートした。インキュベートした後、試料を氷上で４℃に
冷却し、固体材料をPBSで充分に洗った。

コルチソルによる抗体結合部位の占有度合は、ウェール
ズ、カルディフのRIALtd.から得た、高特異的沃素化コ
ルチソル（約1000Ci/mモル¹²⁵I）をラベル付き材料とし
て使う、ラジオイミュノアッセイ逆滴定により、各々の
場合に、決定した。

濃縮した¹²⁵I−コルチソルを各試料中に加えて、固体材
料と混合し、インキュベートを４℃で１時間続けた。固
体材料を再び充分に洗い、結合した放射活性を決定し
た。添付図面は、標準溶液の試料のコルチソル濃度（n
M）と観察された放射加勢（１分間当りのカウント数）
との関係を示すグラフである。実験誤差の範囲内におい
て、結合放射活性の水準はコルチソル同一濃度の３種の
試料すべてにおいて同一であり、それらの容量の差によ
っては影響を受けなかった。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の方法によりコルチソルの濃度を測定
した場合の、コルチソル濃度と標識の放射能（CPM）と
の関係を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イ−キンズ・ロジヤ−・フイリツプ イギリス・ロンドン・ダブリユ１エヌ８エ −エ−・モ−テイマ−・ストリ−ト（番地 なし）ザ・ミドルセツクス・ホスピタル・ メデイカル・スク−ル・インステイテユ− ト・オブ・ニユ−クリア・メデイシン内 (56)参考文献 特開 昭55−146043（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−51665（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−172551（ＪＰ，Ａ)

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）被検体を含有する流体を、その流体
   中に存在する他の物質に比べて被検体に特異的な結合部
   位を有する結合剤と接触させることにより、結合剤のあ
   る比率の結合部位を被検体が占有するようになる工程、 （ｂ）前記結合剤の結合部位の前記比率を表わす数値を
   測定する工程、および （ｃ）前記数値から流体中の被検体濃度を評価する工程
   を含んでなる、 流体中の被検体濃度であって該流体の希釈に依存するも
   のの測定方法において、 （ｄ）前記結合剤の接触の結果、前記結合剤の結合部位
   に結合した被検体の比率が流体中の未結合被検体の濃度
   に有意な変化を起こさせない程の少量であるように、前
   記結合剤を流体中の全被検体が結合するのに必要な量に
   比べ痕跡量で使用することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】前記被検体が生物学的活性材料であり、前
   記結合剤が前記被検体の抗体である請求の範囲第１項記
   載の方法。
3. 【請求項３】前記の生物学的活性材料がホルモンである
   請求の範囲第２項記載の方法。
4. 【請求項４】前記結合剤と接触させる流体の容量の正確
   な測定を行なわない請求の範囲第１から３項のいずれか
   に記載の方法。
5. 【請求項５】前記結合剤を、固体支持体上に不動化した
   状態で前記流体と接触させ、結合剤と固体支持体とを流
   体から分離し、続いて結合部位の占有割合を表わす数値
   を決定する請求の範囲第１から４項のいずれかに記載の
   方法。
6. 【請求項６】被検体による結合剤の結合部位の占有度割
   合を表わす数値を、蛍光ラベルを付した試薬を使用する
   逆滴定によって決定する請求の範囲第５項記載の方法。
7. 【請求項７】前記流体が体液であり、体液中に導入及び
   体液から取り出すことのできるプローブ上に前記結合剤
   を不動化した請求の範囲第１から６項のいずれかに記載
   の方法。
8. 【請求項８】流体中における被検体の予想濃度において
   被検体が占有する結合剤の結合部位が75％未満となる、
   被検体の結合部位に対する結合の平衡定数を有するもの
   の中から結合剤を選ぶ請求の範囲第１から７項のいずれ
   かに記載の方法。
9. 【請求項９】流体中における被検体の予想濃度において
   被検体が占有する結合剤の結合部位が25％を越えるもの
   となる、被検体の結合部位に対する結合の平衡定数を有
   するものの中から結合剤を選び、そして結合部位の占有
   割合を表わす数値を、その存在が認識できる試薬で非占
   有部位の結合を起こす方法によって測定する請求の範囲
   第８項記載の方法。