JP2690011B2 - 二種の標識マーカーを使用するアナライト濃度の測定 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は免疫検定技法または免疫定量技法により、二
種の異なる標識マーカーを使用して液体中のアナライト
（分析対象物）の濃度を測定する方法および測定用デバ
イスおよびキツトに関する。 背景技術 液体中の薬物またはホルモンのようなアナライトの濃
度を、その分子中にアナライトのための結合部位を有す
るレセプターにこの液体をさらし、結合したアナライト
を含有するレセプターを液体から分離し、レセプター分
子上の利用できる結合部位のうちのアナライト分子によ
り占拠された部位（これを部分的占拠と称する）の割合
を示す数値を測定し、次いでこの数値を、既知濃度のア
ナライトを含有する溶液で得られた相当する測定値と比
較することによつて、測定することは知られている。 問題の数値の測定は結合したアナライトを有するレセ
プター分子を標識した形態の該アナライトと接触させる
ことを含む逆滴定技法により達成することができる。標
識したアナライトの代りに、レセプター分子上のアナラ
イト結合性部位のうちのアナライトそれ自体によつて占
拠されていない部位だけを占拠することのできる他の標
識した物質を使用することもできる。これら２つの系
は、標識したアナライトまたは他の標識した物質が被測
定アナライトと競争して、レセプター分子上の結合部位
を占拠することから、競合系と称される。別法では、逆
滴定技法が結合したアナライトを有するレセプター分子
を、この結合したアナライトと結合できるか、または結
合したアナライトにより占拠されている結合部位とだけ
結合できる物質と接触させることを包含し、この場合
に、該物質はそれ自体が標識付与されているか、あるい
は標識マーカーの付加によつて引続いて標識付与される
ものである。この系は結合部位に対する競争がないこと
から、非競合系として知られている。 競合系および非競合系の両方において、逆滴定試薬
（アナライトまたは他の物質）はマーカーで標識されて
いる。種々のマーカー、たとえば放射性同位元素（ラジ
オイムノマツセイ）、酵素、化学発光系および螢光マー
カー（螢光免疫検定）が使用されている。螢光マーカー
はフルオレセインのような慣用の発光物質であるか、あ
るいはユーロピウムまたはその他のランタニドキレート
のような時間−分解パルス発生（time−resolved puls
e）螢光によつて、活性化および判定の時点にだけ螢光
体になる物質のどちらかであり、この場合に、適当な波
長の高い強度の光ビームを用いる走査によつて見い出さ
れる螢光の大きさが結合したアナライトを有するレセプ
ター分子により取り込まれた標識した物質の量の尺度に
なる。 従来既知の検定技法は各試料中に存在するレセプター
の総量が正確に認知されているか、あるいはレセプター
の量が試料間で、特に未知の試料と尺度として用いられ
る標準試料との間で正確に同一にとどまることが判つて
いるかに依存していた。従来の検定法ではまた、試料全
体の量が正確に判つていることが要求される。これらの
要件は、このような系における測定シグナル（たとえ
ば、螢光）が結合した標識物質の総量を表わすものであ
り、そして結合した標識物質が全部ではないならば（こ
の場合には、系は存在するアナライトの量の変化に応答
できない）、この総量はレセプター分子上の結合部位の
部分的占拠に依存して変化するばかりでなく、また存在
するレセプター分子の量にも依存して変化する。簡単に
言えば、従来既知の螢光免疫検定技法で発信される螢光
シグナルは複雑な様相で（しかも、実際に未知の様相
で）、系に使用されたレセプター分子の量に、およびま
た存在するアナライトの総量に必ず依存する。このこと
は、被験試料中のアナライト濃度の正確な判定を確実に
するためには、レセプターの使用量と試料の使用量との
両方を正確に標準化せねばならないことを意味し、この
ような標準化は従来既知の全ての螢光免疫検定技法、特
に前記に定義したような競合による技法の特徴的で必須
の要件である。このような技法においては、アナライト
による抗体の部分的占拠（従つて、発信される螢光シグ
ナル）それ自体が存在するレセプターの量に依存するこ
とは特に強調されるべきことである。たとえば、レセプ
ター分子の数が特定の因子により増加すればするほど、
そこに結合するアナライト分子の数は増加し、非常に異
なる因子によつては、レセプターの部分的占拠に著しい
変化が生じる。レセプターに結合する標識分子の量もま
た、全く同様に、非比例的様相で増加する。 レセプターの使用量の標準化が必要であること（これ
は放射性同位元素のような他のマーカーを使用する類似
の検定方法と共通する、従来既知の螢光免疫検定技法の
特徴である）は実験的に証明できることであるばかりで
なく、またレセプター／リガンド相互反応を支配する質
量作用の法則を考慮することによつて理論的に予期でき
ることである。さらにまた、この必要性は、免疫検定
系、特にレセプター（抗体）を固体支持体に結合させた
系において、各試料インキユベーシヨン混合物中に導入
される固体材料に正確に同一量のレセプターを結合させ
ることが技術的に困難であることがある場合に、この検
定系の質的コントロールに主要な問題が提起されること
から、これらの技法の重大な欠点として、以前から認識
されていたことである。このことに関して、固体支持体
に結合したレセプターの量をレセプターそれ自体の標識
付与（たとえば、放射性同位元素による）によつて追跡
もしくは検査して、その結合量を確実に一定にする操作
を当技術で実施することは決して珍らしいことではない
ことに留意されるべきである。さらにまた、このような
レセプター標識付与技法を使用することによつて、レセ
プター標準量からの差が認められた場合には、結合した
レセプターの量の僅かな変化はその一部分が補正できる
ことは当業者に認識されている。しかしながら、抗体の
結合性部位のアナライトによる部分的占拠は複雑であ
り、実際に、存在するレセプターの量およびアナライト
の量の両方に、未知の様相で依存することから、このよ
うなおおよその補正は有用性が限られており、また慣用
されることはまれである。 一例として、国際特許出願WO80/02076では、この系で
二種の別々の標識（好ましくは螢光標識）を使用し、こ
の二種の標識のうちの一つを競合するリガンドに付け
（前記したとおりに）、そして第二の標識をレセプター
分子に付けることによつて、免疫検定法の質的コントロ
ールを改善することが提案されている。この特許出願に
は、レセプター分子の直接標識付与は、免疫検定操作の
間に、標識された（競合性）リガンドの定量分析とは独
立して、レセプター分子を定量分析することができ、従
つて、この免疫検定操作を自己−評価性（self−calibr
ation）にすることができるという利点を有する旨、記
述されている。この特許出願の発明の好適態様に従え
ば、レセプター分子上の螢光標識と標識されら（競合
性）リガンド上の螢光標識とが、これらを相互に結合さ
せながら定量分析され、そして未知の試料中に存在する
アナライトの量が二種の標識の量的測定値の比の関数と
して決定される。 WO80/02076の記載から明らかなように、第二の標識を
使用することを除けば、ここに開示されている免疫検定
は常法で行なわれている。いわゆる「コンペテイテイブ
イムノアツセイ」（競合性免疫検定法）では、通常、存
在する標識したリガンドと標識されていないアナライト
分子（標識されていないアナライト濃度はゼロに近い）
との両方の30〜50％を結合させるに充分のレセプターが
使用される。いわゆる、「非競合性検定法んでは、さら
に高いレセプター濃度、すなわち存在するアナライトの
100％近くまでを結合するレセプター濃度が慣用されて
いる。明らかなように、これらの状況の両方において、
標識されたレセプターにより発信されるシグナルと標識
された逆滴定マーカーによつて発信されるシグナルとの
比は、レセプターの量が変化する場合には、一定のまま
ではあり得ない。（たとえば、非競合性検定法では、標
識したレセプターの量を二倍にしても、アナライトの結
合量は有意に増加しない；この場合に、上記比はほとん
ど半減する。同様の考えはWO80/02076に記載の競合性系
にもあてはまる。） 従つて、WO80/02076では、前記したようなこのタイプ
の検定系において、存在するレセプター量の僅かな変化
をおおよそ補正できるだけの不充分な手段が提供されて
いるだけであり、このような手段はこの目的に対するそ
の使用が限られている。簡単に言えば、二種の標識（標
識したレセプターおよび方式した競合リガンド）の量的
測定値の比は理論的におよび実験的に証明することはで
きるが、この比は一般に、慣用のレセプターにもとずく
検定系（たとえば免疫検定系）におけるアナライトの量
の判定基準にはならない。従つて、この比を応答変数と
して使用すると、一般に、全体として誤つたアナライト
測定値がもたらされる。このように、WO80/02076には、
前記したように、各試料インキユベーシヨン管中に存在
するレセプターの量の僅かな変化を同時的に検査する
（そしておおよそ補正する）ための技法（有用性が制限
されている技法）は教示されているけれども、この特許
出願には、二種の標識の測定比が試料中のアナライト濃
度の正確で、信頼できる判定基準になる検定系のデザイ
ンおよび操作は記載されていない。 さらにまた、通常の場合のように、レセプターの量を
非常に精確に標準化できる場合でさえも（すなわち、各
インキユベーシヨン管中のレセプターの量を非常に近接
した限界内で一定に維持でき、WO80/02076に記載されて
いるような、レセプターの存在量に対する補正が不必要
であるか、あるいは不用である場合でさえも）、生じる
免疫検定系は通常、当技術で慣用されている「標準化」
（calibration）（すなわち、既知量のアナライトを含
有する一組の検定標準を含む）を必要とする。WO80/020
76において、レセプターに対する標識付与が免疫検定法
を確実に、「自己−評価」法にするものとしてなされて
いる特許請求の範囲内では、制限された意味で、シグナ
ル検出装置（例えば、使用された標識に応じて、放射性
同位元素カウンター、螢光測定計）における短期間の変
化を同様に自動的に補正することができるだけである
（これは一方の標識の検出効率における減少がもう一方
の標識の検出効率におけるおおよそ比例する減少を共な
い、この比をほぼ一定にとどまらせることが予想される
からである）。 従つて、結論として、WO80/02076の開示内容は精々、
（イ）レセプターにもとずく検定で使用されるレセプタ
ーの量の僅かな変化および（ロ）標識測定用装置のシグ
ナル検出効率における僅かな、短期間の変化、をおおよ
そ補正する手段を提供するものにすぎない。これらの補
正は確実に問題を含むものであり、用途が制限されてお
り、しかもこれらの理由で、慣用の検定の実施には適合
しないものである。 発明の要旨 本発明はWO80/02076に記載もしくは示唆されているも
のとは完全に異なる概念およびデザインのレセプター検
定法に関するものであり、本発明においては、レセプタ
ーの部分的占拠がメジウム中のアナライト濃度の真の精
確なそして信頼できる尺度になる（存在するアナライト
および（または）レセプターの総量に関係しない）。こ
れらの系（WO80/02076に引用されても、また明らかにさ
れてもいない）は必須で特別なものとして、レセプター
の部分的アナライト占拠を測定する、すなわち総レセプ
ター部位に対する未占拠部位（まあは占拠部位）の比を
測定する（あるいは、幾分基本的に均等な比、例えば未
占拠部位／占拠部位の比を測定する）ことによるもので
ある。本発明により、中でも、これらの系は、試験試料
中にレセプターを導入してもそこでアナライトの濃度に
対する有意の変化が生じないような、レセプターとアナ
ライトとの相対量およびそれらの間の親和性を必要とす
ることが見い出された。 従つて、本発明により、未知の液体試料中のアナライ
トの濃度の測定方法が提供され、この方法は試料を、そ
の分子中にこのアナライトのための結合部位を有し、か
つまた第一のマーカーで標識されているレセプターと接
触させて、レセプター分子の結合性部位の一部分がアナ
ライトにより占拠されるようにし、この部分的に占拠さ
れた結合部位を有するレセプターを、第一のマーカーと
は異なる第二のマーカーを含む系を包含する逆滴定技法
を用いて逆滴定し、二種のマーカーにより生じる二種の
シグナルの相対強度を測定して、レセプター分子上の結
合部位のアナライトによる部分的占拠を表わす数値を
得、次いでこの数値を、既知のアナライト濃度を有する
一種または二種以上の標準液体試料を用いて同一の方法
で得られた一つまたは二つ以上の相応する数値と比較す
ることよりなる方法であつて、未知の液体試料と標準液
体試料とをそれぞれ、アナライトに対するレセプターの
親和定数を考慮して、このレセプターにアナライトの有
意でない部分が結合するように、少量の該レセプターと
接触させることを特徴とする方法である。 「アナライトの有意でない部分」の用語は初めのアナ
ライト濃度の変化を許容することによつて導入される誤
差が試料および試薬の取り扱い、シグナル測定、標準
化、温度変化などの精確度に対する限界によつて、測定
プロセスのどこかで不回避的に導入される誤差と同様に
小さいか、あるいはこのような誤差により小さいように
するに充分に小さい部分を意味するものとする。一般的
に言えば、このような誤差は通常、（全体として）10％
またはそれ以下に相当し、従つて、試験試料中の総アナ
ライトの５％またはそれ以下の結合であればこれにより
生じる試料間の測定誤差は全体からみて無視しうるであ
ろう。しかしながら、この限界が時には、損失を伴なう
ことなく超えられることもある。しかしながら、理想的
には、レセプターに対して結合させるアナライトの量は
総量の１〜２％（またはそれ以下）に減じることによつ
て、測定誤差を最少にすることが好ましい。 有意でない部分だけのアナライトを結合させるかぎ
り、レセプター分子上の結合部位の部分的占拠（Ｆ）は
下記の式により資料中のアナライトの濃度に関連してい
ることが見い出された（熱力学的平衡で）： この式において、［Ａ］は試料中のアナライトの濃度
であり、そしてＫはアナライトに対するレセプターの親
和定数であつて、この定数は一定温度における定数であ
る。 本発明による方法においては、いずれか既知の種類の
マーカー、たとえば放射性同位元素（例えば放射性ヨー
素）、化学発光物質、螢光マーカーおよび酵素を使用す
ることができる。これらは慣用の方法で、レセプター分
子および逆滴定試薬に付加することができる。両方のマ
ーカーは通常、同一種類のものであるが、異なつていて
もよい。これらのマーカーはそれらの種類に対して適当
な方法により、たとえば放射性マーカーの放射能を測定
するか、あるいは螢光マーカーを、必要に応じて、活性
化した後に、光ビームにより検出することによつて、定
量的に検出することができる。好ましくは、螢光マーカ
ーあるいは潜在的螢光マーカーを使用する。二種の螢光
マーカー標識を適当な波長の一つの光ビームにより同時
的に発光させ、二つの螢光シグナルの相対強度を測定す
ることができる。この比はレセプターの結合部位の部分
的占拠数を直接に表わすものであり、上記条件の下で、
存在するレセプターの正確な量および総量のうち光ビー
ムを用いる検出による測定に利用される割合とは独立し
ている。従つて、不変の、または正確に知られている量
のレセプターを使用する必要はもはやなく、その基体上
のレセプターの表面密度を均一にする必要もない。 本発明はもう一つの態様において、本発明による方法
における中間物質として、標識された生成物の生成を包
含しており、この標識された生成物は第一の、好ましく
は螢光マーカーで標識されており、かつまたその一部分
がアナライトの分子により占拠されている結合部位を有
するレセプター分子および第二の、好ましくは第一のも
のとは異なる螢光マーカーで標識されており、かつまた
占拠されている結合部位または占拠されていない結合部
位に直接に、または間接的に結合する物質よりなるもの
である。この生成物にはアナライトに対して痕跡量だけ
のレセプターが使用されているので、レセプター分子上
のアナライト分子により占拠されている結合部位の比率
が試料中のアナライト濃度を充分に表わすことができ
る。 もう一つの態様において、本発明は液体試料中のアナ
ライトの濃度を測定する方法で使用するためのキツトを
提供する。このキツトは第一の、好ましくは螢光マーカ
ーで標識されており、かつまたアナライトのための結合
部位を有するレセプターの分子がそこに付着している固
体基体を含み、この基体上のレセプターの量は試料中の
アナライトの有意でない部分だけがレセプターに結合す
るように液体試料の大きさによつて選択される。このキ
ツトはまた、既知濃度のアナライトを含有する一種また
は二種以上の標準溶液および第二の、好ましくは第一の
ものとは異る螢光マーカーで標識されており、かつまた
結合したアナライトと、あるいは結合したアナライトに
より占拠されている結合部位と直接に、または間接的に
結合できるか、あるいは結合したアナライトにより占拠
されていない結合部位と結合することができる逆滴定試
薬を包含する。 もう一つの新規な検定用具として、本発明はまた、板
状体または棒状体のような長形の固体基体を提供する。
この固体基体は複数の間隔をあけた場所に、それぞれが
その分子中にアナライトのための結合部位を有する複数
のレセプターを含有しており、いずれか一つの場所に存
在するレセプターは一つまたは二つ以上の他の場所に存
在するレセプターに対するものとは異なるアナライトに
特異的な結合部位を有しており、そしてこれらのレセプ
ター分子はそれぞれ、マーカーによつて標識されている
か、あるいはマーカーによつて標識できるものである。 添付図面において、 第１図は本発明による競合系および非競合系を図で説
明するものであり、そして 第２図は本発明による検定用用具の透視画である。 第１図を参照すると、この図面には方式されたレセプ
ター１、たとえば第一螢光体（図示されていない）で標
識された、脱一の抗アナライト抗体が示されている。レ
セプター１はその分子状に、結合部位２を有し、この結
合部位のうちのいくつかはアナライト分子３で占拠され
ている。非競合系Ａにおいては、結合したアナライト分
子３は次いで、第二の螢光体（図示されていない）で標
識されている標識された物質、たとえば第二の抗−アナ
ライト抗体４に結合されている。競合系Ｂにおいては、
第一の抗−アナライト抗体状のアナライト３によつて占
拠されていな結合部位２が第二の螢光体（図示されてい
ない）で標識されている標識された試薬、たとえば抗−
イデオタイプ抗体５により占拠されている。完成した系
はレーザービーム６で走査する。第一螢光体はα−ホト
ン７を発射し、そして第二螢光体は或る種の性質または
作用がα−ホトンと異なるβ−ホトン８を発射する。α
−ホトンとβ−ホトンとの両方のシグナルは存在する第
一抗−アナライト抗体の総量または表面密度における変
化によつて均等に影響される。ただし、結合部位の部分
的占拠数には変化はなく、α−ホトンシグナルだけが結
合部位のアナライトによる的占拠数における変化により
影響を受け、非競合系では占拠数が増加すればするほど
増加し、他方競合系では占拠数が増加すればするほど減
少する。従つて、二つのシグナルの比は部分的占拠数に
依存するが、第一の抗−アナライト抗体の総量には依存
しない。 本発明はその分子に相当する結合部位を有するレセプ
ターが知られており、あるいはこのようなレセプターが
製造できるアナライトのいずれをも検出するために使用
することができる。特に、本発明はピコモルまたはナノ
モル範囲の、およびまたミクロモル範囲の高い方の濃
度、たとえば10^-9〜10^-5モルの濃度を精確に検定するた
めに使用することができる。この方法で検定することが
できるアナライトには、チロイドホルモンまたはステロ
イドホルモンのようなホルモン（たとえば、コルチゾ
ル）、ビタミン、タンパク質およびインシユリンおよび
ゴナドトロピンのようなタンパク質ホルモン、ウイル
ス、薬物、毒物および人間まあは動物の体液、たとえば
血液、血清、唾液、尿等のその他の正常成分または異常
成分が含まれる。このようなアナライトの例は前記のWO
80/02076にあげられており、それらの濃度を本発明の方
法により測定することができる。毒素、異種タンパク質
などのような食品中の痕跡量の汚染物質および水および
その他の液体中の生物学的汚染物質もまた検定すること
ができる。被検定アナライトは内生の結合性タンパク質
のような結合剤に可逆的に結合させた同一アナライトと
平衡状態で、試料中に存在させることができ、この場合
には、遊離のアナライトの濃度を本発明の方法により測
定する。別法として、試料は可逆的に結合したアナライ
トを含有しないものであることができ、本発明は、可逆
的に結合させたアナライトがレセプター分子による吸着
により解離し、従つてアナライト濃度における変化を干
渉するために利用できない場合に、極めて重要であるこ
とができる。 使用されるレセプターはその分子上に被検定アナライ
トのための結合部位を有するものである。これらの結合
部位は分子当りの数が実質的に一定であるべきであり、
そして物理的吸着部位であるよりもむしろ、化学的結合
部位であるべきである。これらの部位はまた、検定され
る試料中のいずれか他の成分と比較して、アナライトに
よつて独占的に占拠されうるものであるべきである、す
なわち好ましくは、アナライトに対して特異的であるべ
きである。抗体、たとえば単クローン性抗体は特に好ま
しいレセプター分子であるが、各アナライトに対して特
異的である酵素はまた、使用することができるレセプタ
ー分子の別の例である。広く種々のアナライトに対する
抗体は既知であるか、あるいは文献に記載されている
か、あるいは市販されており、他のホルモンなどに対し
て特異的な他の抗体は本発明の一部分を構成しない既知
の技法により製造することができる。測定の精度を最高
にするためには、レセプターは好ましくは、レセプター
分子上の結合部位の25％〜75％が未知試料中のその予想
される濃度の、アナライトにより占拠されるような、該
アナライトに対する親和定数を有するように選択する。
すなわち、レセプターは予想されるアナライト濃度の逆
数の1/3〜３倍の親和定数を有する。レセプターの親和
定数は標準的Scatchard分析法［Ann.N.Y.Sci.、51（194
6年）、660頁］により測定することができる。 免疫螢光定量法または螢光免疫検定法用に標識される
物質はこれが抗体（抗−アナライト抗体および抗−イデ
オタイプ抗体の両方）、酵素、アナライトあるいは同様
の物質であるかにかかわらず、フルオレセインのような
慣用の螢光物質により、あるいはユーロピウムおよびそ
の他のランタニドキレートのような時間−分解パルス発
信螢光発光に有用な物質［たとえば、W.Buttにより編集
された「Practical Immunoassay」（Mercel Dekker In
c.）の71〜101頁（1984年）中のS.Dakubu等による「Hig
h sensitivity pulsed−lighy time−revolved fluoroi
mmunoassay」参照］により標識することができ、両タイ
プの物質が螢光マーカー」の用語に含まれる。螢光マー
カーで物質を標識して、相当する（充分に高い）特異活
性（総分子または総結合部位に対する標識された分子の
割合）を与える方法は当技術で知られており、文献、た
とえばJon Wiley ＆ Sons Ltd.により出版されたW.P.Co
llins編集の「Alternative immunoassay」（1985年）、
特に13章、およびこの文献で引用されているSoiniを、
およびHemmilaa I.によるFluoroimmunoassay:present a
nd keyproblems」、Clin.Chem.、25、353〜361頁（1979
年）に記載されている。本発明者が共同出願人である、
ヨーロツパ特許出願2,963,および同64,484、英国特許第
1,560,402号明細書および国際特許出願WO86/01064、お
よびまた本明細書または調査報告書で引用記載されてい
る、前記WO80/02076は同標的刊行物の他の例である。こ
れらの技術を本発明で使用するレセプター分子の標識付
与に使用することができる。標識付与はまた、組換えDN
A技法を用いて、蛍光体単位を適当な物質中に組入れる
ことによつて行なうこともできる。前記したように、放
射性同位元素および他のマーカーによる標識付与も本発
明の範囲内にある。 競合系、たとえば抗−イデオタイプ抗体または標識さ
れたアナライトを用いる競合系で使用するか、あるいは
非競合系、たとえば抗−アナライト抗体を用いる非競合
系で使用する逆滴定技法で用いるのに適する試薬はま
た、当技術で既知であるか、あるいは慣用の技法により
製造することができる。試薬はそれら自体を、既知であ
るか、または既知のあるいは慣用の技法を用いて、慣用
のタイプのマーカー、好ましくは螢光マーカーで標識す
ることができ、その後で使用するか、またはそれ自体が
このようなマーカーで標識されている別の試薬とその場
で反応させることができる。これらは必要である場合、
たとえば二種の螢光マーカーを使用する場合に、これら
が光ビーム（このような技法を使用した場合）による同
時的走査において区別することができるシグナルを発信
することを確実にすることが必要な場合を除いて、標識
されていないレセプター分子に用いる慣用の免疫検定技
法で用いられる逆滴定試薬と異なつている必要はない。
逆滴定は引続いて、レセプター分子と接触している未結
合アナライトを分離するか（二段階検定法）、あるいは
試料容積が既知である場合には、未結合アナライトをレ
セプター分子と同時的に接触させる（一段階検定法）。 二種のマーカーから発信されるシグナルは種々の変更
方法で、たとえば発射されるホトンの波長により、ある
いは時間−分解パルス発信蛍光体の場合における螢光の
減衰時間（マーカーの両方または一方だけがこのような
減衰を示す）により、あるいは偏光により、区別させる
ことができる。種々のマーカー系の波長、時間−減衰パ
ターンなどはすでに文献から知られており、その他は既
知の技法により測定することができる。二種のマーカー
はこれらが測定装置で区別されるに充分に異なるシグナ
ルを提示しなければならない。種々の螢光マーカーか
ら、特定の条件の下で発信させる螢光シグナルの特徴は
すでに知られているか、または文献に記載されており、
その他のシグナルは慣用の方法で測定することができ
る。従つて、適当な一組のマーカーの選択は当業者の技
術範囲内にある。 シグナル比の測定は原則的に溶液中で行なうことがで
きるが、このためには、測定を行なう前に標識したレセ
プター分子／結合アナライト系に結合していない標識さ
れた逆滴定試薬の全部を、たとえば免疫吸着剤を使用し
て、完全に分離する必要があり、このような分離工程は
簡単ではない。従つて、標識したレセプター分子が、シ
グナル比の測定を行なう前に、固体基体に単層として結
合されており、そして検定しようとする液体（一種また
は二種以上）中に存在する残留未結合の標識した逆滴定
反応からおよび残留する未結合アナライトから分離され
ていると好ましい。適当な基体はガラス、プラスチツク
などから形成し、このような表面に対する抗体のような
レセプター分子の結合方法は既知であつて、本発明の目
的に使用することができる、たとえば米国特許第4,399,
217号、同第4,381,291号、同第4,357,311号、同第4,34
3,312号および同第4,260,679号参照。 もう一つの関連発明において、板状または棒状の、た
とえばポリスチレンのような不活性プラスチツク材料か
らなる、１個の長形固体基体上に、間隔をあけた場所
に、種々の異なる標識を付けたレセプター分子を結合さ
せることができる。これらの異なる場所にはそれぞれ、
一種の特定のレセプターを付与し、このようにして、異
なる場所に異種のアナライトを結合させることができ
る。このようなマルチ−スポツト デバイスは一つの液
体試料中に存在する複数種のアナライトの濃度を測定す
るために使用することができ、この場合には、異なるア
ナライトのそれぞれに対する分離した標識された逆滴定
試薬を付与して、一組の標識をそれぞれ、区別でき、シ
グナルの強度の比を測定できるようにする。これは、体
液のような液体が数種の異なる対象成分を含有するか、
または含有することができ、そしてこれらそれぞれの濃
度を知る必要がある場合に特に有利である。（このよう
なマルチ−スポツト デバイスの製造では、レセプター
分子の量がスポツト間およびデバイス間で一定である必
要はないので、標識したレセプター分子の使用は容易で
あるが、標識されていないレセプター分子を使用して、
このような板状体を製造することもできる。但し、この
場合には、各スポツトのレセプター分子の量は別の手段
により正確に判定し、デバイス間で一定であるように精
確に制御する）。 このような検定用用具が添付図面の第２図に示されて
いる。この図面を引用すると、長方形または他の都合の
良い形状を有する板20はポリスチレンまたは他の不活性
材料から作られている。板には、複数個のくぼみもしく
は凹部21を形成し、その大きさはポリスチレンまたは他
の不活性材料からまた形成されており、適当には約1mm
またはそれ以下の直径を有するマイクロビーズ22が収容
される大きさにする。これらのビーズにはビーズの表面
上にレセプターが層として沈着するように、抗体のよう
なレセプターを含有する溶液を慣用の方法で予め吸着さ
せる。異なるビーズ毎に、異種のレセプターを含有する
異なる溶液を吸着させ、これらの種々のレセプターは検
出しようとするアナライトにより選択し、そして場合に
より、適当なマーカーで標識する。マイクロビーズ22は
通常の市販されているポリスチレン用接着剤などの適当
な不活性接着剤によつて凹部21に保留する。 標識されたマイクロビーズを有するこのようなデバイ
スを使用する場合には、板状体20上のマイクロビーズ22
を、検定しようとするアナライト（一種または二種以
上）を含有する試料と接触させ、次いで適当な標識を付
けた相応する逆滴定試薬と接触させ、その後、二種のマ
ーカーの相対的シグナル強度を評価する。異なるマーカ
ーを異なるビーズ毎に、かつまた異なる逆滴定試薬毎に
選択し、１個のビーズの読み取りが、他のビーズのもの
と分離できるようにする。あるいは、別法として、ビー
ズをそれぞれ、分離して検査する。この別法は螢光マー
カーまたは螢光源性んマーカーの使用により容易にな
る。 このようなデバイスは多くのその他の方法で形成する
ことができる。一例として、ビーズ22を省略し、レセプ
ターを溶液として凹部21に直接に加え、次いで場合によ
り溶剤を除去して、固体層を残す方法がある。あるい
は、ビーズおよび凹部を省略し、レセプターを板表面上
に適当な方法で印刷する。この板状体の代りにまた、棒
状体またはその他の基体を使用することもできる。異種
のレセプターの数は２種のように少なくてもよく、ある
いは格別に多く、たとえば５種、10種またはそれ以上で
あつてもよい。同一レセプターを有する異なるスポツト
の数は１個または２個以上であることができ、同一レセ
プターを有する数個のスポツトを使用する場合には、１
個のスポツトからの結果を判定するための手段を用意す
る。 板状体のような固体基体上の物質から発信された螢光
シグナルを測定できる装置は既知であり、たとえば溶液
中のシグナルを測定するための装置として、Toronto,On
tario,CanadaのCyber Flour Inc.により供給されている
ような装置がある。一段階で当該比を直接に測定する装
置が利用できない場合には、好ましさは少ないが、二つ
のシグナルを別々に測定し、これらの測定値から適当な
保護手段を用いて比率を作成することができる。前記WO
80/02076には、本発明で使用することができる他の測定
装置が記載されている。検査用光ビームは好ましくは、
高強度の単色ビームまたは実質的に単色のビーム、特に
レーザー ビームである。検査用光ビームを用いて螢光
を励起させるための波長は既知の原則に従つて螢光マー
カーの種類によつて選択すべきであり、単一の波長のビ
ームによつて、両方のシグナルを励起させることができ
れば、明らかに好ましい。時間−分解発信された螢光
は、これが背景界面をさらに容易にうつし出すことがで
きることから好ましい技法であるが、本発明の必須の要
件ではない。他の種類のマーカーを使用する場合には、
その代りに、相応する標準計数器または検出器を使用す
る。 本発明は試料中に存在するアナライトの総量のうちの
有意でない部分だけ（通常、５％より少なく、好ましく
は１％より少ない）がレセプター分子と結合するような
検査しようとするアナライトに対する親和定数を有し、
しかも少量の抗体またはその他のレセプター分子を使用
して操作するので、濃度測定に既知量の試料を使用する
か、あるいは基準化試験用に一定量の試料を使用する必
要はなく、またこのような量を正確に測定する必要もな
いか、または全く測定する必要はない。レセプターの量
に対して試料の量をアナライトの有意でない部分だけが
レセプターに結合するのに充分に多い量にすることが必
要なだけである。従つて、本発明のデバイスは工業的方
法で見い出されるような大量の液体中の混合アナライト
の濃度を追跡するための探測手段（プローブ）として使
用することができる。 螢光マーカーを使用し、光ビームで検査する場合に、
光ビームを、レセプター分子を含有するスポツト全体に
わたつて当てる必要はなく、スポツトの一部分を単に選
び出すことができることは本発明のもう一つの利点であ
り、これは結合したアナライトおよびレセプター分子の
総量を測定する必要がないためである。 逆滴定に競合形を使用する場合にはまた、標識した抗
−イデオタイプ抗体または他の方式した逆滴定試薬がア
ナライトにより占拠されずに残つている結合部位の全部
を占拠する必要はなく、未知のアナライト濃度を有する
液体試料を使用する場合の推定値と既知のアナライト濃
度を有する標準値との関係において一定で残される結合
部位の一部分をアナライトが占拠することができればよ
い。この方法は一般に、痕跡量のレセプター分子／結合
アナライト系にさらされる抗−イデオタイプ抗体または
他の標識した逆滴定試薬を一定の（相対高度の）濃度で
使用するか、あるいは一定量ならびに一定濃度で使用す
ることを包含する。同様の注意は非競合性逆滴定系にお
ける結合アナライトとアナライト占拠結合部位との反応
にもあてはまる。 本発明は病院などにおけるアナライトの検査で商業的
に使用するために、固体基体上の標識したレセプター分
子とアナライトの標準溶液と標識した逆滴定試薬とより
なるキツトの形で、適当な螢光測定装置と組合せて、セ
ツトにすることができる。このようなキツトを使用する
と、測定を適当な装置で一定の手順で行なうことができ
る。 本発明を次例でさらに説明する。 例１ 放射性標識（¹³¹I）した抗チロキシン抗体および放射
性標識（¹²⁵I）したチロキシンを使用するチロキシン
（T4）の検定方法および確実な標識比免疫検定法を行な
うための試薬濃度の選択に係る基本原則を説明する。 （抗チロキシン抗体は市場で容易に入手するとがで
き、またDepartment of Molecular Endocrinology,the
Middlesex Hospital Medical Scool,Mortimer、Street,
Londonで、慣用の（インビボ）免疫付与技法およびイン
ビトロ単クローン性抗体産生法の両方によつて、製造さ
れている。）この例で使用した抗チロキシン抗体は免疫
原として牛チログロブリンを使用してマウスに免疫付与
することにより産生された範囲の抗体から選択すること
によつて調製された特異性「４単クローン性抗体であつ
た。これは10⁹/Mの程度の結合定数を有し、その結合
特性において、他は完全である。これはヨー素標識抗体
および他のタンパク質の調製に常用されている慣用のク
ロラミン−Ｔ技法を用いて、¹³¹Iで標識した。引続い
て、慣用の技法［Clinica Chimica Acta、118巻、（198
2年）、129〜134頁］を用いて、市販の微結晶セルロー
ス（Sigma−Cell Type20）に結合させた。 高い特異活性を有する¹²⁵I標識したチロキシンはAmer
sham International,Amersham,Berksから購入した。 血清（1ml）中に存在するT4を市販のアニオン交換樹
脂（BioRad AG 1×２（400〜600メツシユ）カラム）を
使用し、次いで洗浄後に70％酢酸で溶出した（Endocrin
ology、117（1985年）、1890頁参照）。回収実験（無視
できる痕跡量の¹²⁵I標識T4を初めに被験血清に加える操
作を使用）は70％程度の総回収率を示した。被験血清溶
出液をそれぞれ、標準Hepes緩衝液（50ml）に再溶解
し、溶解物として計算して、0.5〜1.5ng/mlの濃度範囲
（すなわち、10^-9M/の程度のT4溶液を生成した。標準
T4溶液はT4の原液をHepes緩衝液で適当に稀釈して、溶
解物として０〜10ng/mlのT4濃度範囲を生成することに
より調製した。 初めの一連の実験では、異なる量の固体相化した¹³¹I
−標識抗体を、痕跡量の¹²⁵I−標識T4とともにT4を含有
する標準溶液（この組合せのT4濃度は0.1ng/mlに等し
い）1ml量とともに、10分〜８時間の種々のインキユベ
ーシヨン時間の間、インキユベートした。インキユベー
シヨンに引続いて、固体相状抗体を遠心分離し、洗浄
し、次いで吸着された¹²⁵I−標識T4を２チヤンネル ガ
ンマ カウンターおよび慣用の基準化法を用いて測定
し、¹²⁵I放射能それ自体を識別した。インキユベーシヨ
ン時間および標識抗体の量に対する抗体吸着した¹²⁵I放
射能の関係を曲線に描いた。このデータにもとづき、抗
体の量およびインキユベーシヨン時間を、インキユベー
シヨン混合物中に存在する総T4の５％程度（すなわち、
約5pg、これは約1000 ¹²⁵I cts/分をもたらす）が抗体
によつて吸着されるものとして計算されるように選択し
た（すなわち、約100 ¹³¹I cts/分を生じる抗体量およ
び４時間の総インキユベーシヨン時間）。これらの条件
の下で、ファクター２までの使用された抗体の量の増加
または減少が有意（すなわち、２％の範囲内）に¹²⁵I/
¹³¹I比を変えないこと、（ロ）使用した標準溶液の量の
増加が¹²⁵I/¹³¹I比に作用を及ばさないこと、を確認し
た。 この標準量の抗体を使用して、検定評価を下記の方法
で行なつた。標準量の抗体を前記の標準T4濃度の1ml量
と４時間、インキユベートした。固体相変した抗体を次
いで、それぞれ、遠心により分離し、緩衝液で短時間洗
浄し、次いで約1ng/mlのT4を含有する¹²⁵I−標識T4の標
準溶液3ml容量とさらに４時間の間、再インキユベート
した。固体相変した抗体を、それぞれ、また遠心分離
し、注意して４回洗浄して、残留する¹²⁵I−標識T4溶液
の全部を除去し、標準T4濃度のそれぞれに相当する¹²⁵I
/¹³¹I比を測定した。この一連の実験では、標準量の抗
体（約200 ¹³¹I cts/分を生じる量）を使用したので、
¹³¹I数値はそれぞれの場合に実質的に一定であつた。し
かしながら、¹²⁵I数値はゼロのT4濃度標準の場合の約20
00cst/分から10ng/ml T4標準の場合の約200cts/分まで
変化した（すなわち、¹²⁵I/¹³¹I比は10:1〜1:1の範囲に
わたる）。もう一つの一連の実験において、（イ）固体
相化した抗体の使用量を５倍に変えても、投与量応答曲
線の形状および位置が影響されないこと、および（ロ）
標準T4溶液の量の比較用の階乗増加がまた、この曲線に
影響を及ぼさないこと、をまた確認した。これらの結果
はこの系が試料の容量および抗体濃度と独立しているこ
とを示した。この系を引続いて、上記で得られたT4抽出
液を、未知の¹²⁵I/¹³¹I比値を常法により標準曲線と比
較する検定に使用し、結果を慣用のT4検定法で得られた
結果と比較した。この結果はほとんど匹敵するものであ
り、一致度は通常、５％の範囲内であり、10％より悪い
ことはほとんどなかつた。 例２ 二重螢光T4検定法の確立 例１は効果的な「二重標識比」（dual label ratio）
競合性免疫検定法が確立された経過を例示するものであ
る。Tfを標識するために、¹²⁵Iの代りにフルオレセイン
標識を使用し、そして抗Tf抗体の標識に¹³¹Iの代りにロ
ーダミン標識を使用して、同様の二重螢光比免疫検定法
を創造することができた。これらの螢光標識による抗体
およびT4の標識付与は慣用の方法、「Immunochemistry
in Practice」、A Johnston and R Thorpe、Blacwell S
cientific Pub（1982年）、により行なつた。しかしな
がら、正しい試薬濃度の選択を助けるために、二重標識
抗体（すなわち、¹³³Iおよびローダミンで標識）および
二重標識T4（すなわち、¹²⁵Iおよびフルオレセインで標
識）を使用する或る実験を行なつた。さらにまた、抗体
は例１に記載のマイクロセルロースに共有結合させるの
ではなく、小型ポリスチレン デイスク上に、ポリスチ
レン被覆用の良く知られている技法を用いて被覆した
（吸着による）。この例において、未知試料中に存在す
るT4濃度をローダミン／フルオレセイン螢光比から測定
した。Perkin Elmer Type LF−５ルミネセンス分光計
（螢光測定計）を用いて、螢光シグナルを逐次測定し
た。このようにして得られた結果をまた、例１に記載の
同位元素比の測定による結果と、およびまた慣用のT4検
定法と比較し、充分の一致を得た。 例３ 時間−分解パルス発信螢光体を含む二重螢光T4検定法の
確立 例２におけるフルオレセインおよびローダミンによる
T4および抗−T4抗体の標識付与の代りに、これらを、既
知の方法で抗体上に結合させたEDTA（エチレン ジアミ
ン テトラ酢酸）とのテルビウムおよびユーロピウム
キレートでそれぞれ標識した。シグナル比は既知の時間
−分解螢光計測計を用いて、既知の発信−光螢光技法に
よつて測定し、未知の試料で得られた結果を標準溶液で
得られた基準曲線と比較した。他の方法で得られた結果
との充分の一致がまた、得られた。 例４ 本発明によるRSH（チロトロビン）の検査に使用する
ためのキツトを下記の部品から構成した： （ａ）Department of Endocrinology,the Middlesex Ho
spital Medical School,Mortimer Street,Londonから市
販されている単クローン性抗−TSH抗体を固体板上に固
定し、次いでフルオレセインで標識付与する。 （ｂ）標準溶液は１モル当りで0.2、1.0、5.0、20.0お
よび100マイクロ−国際単位のTSHを含有する。 （ｃ）逆滴定試薬はまた市販の抗−TSH単クローン性抗
体であり、これは発行国際特許出願WO80/01604に提案さ
れている方法と同様の方法でトリフルオロアセチルアセ
トン第二銅およびホルムアルデヒドによるユーロピウム
（III）キレートで標識されている。上記の第一の抗体
は永久螢光体であり、そして第二の抗体は時間−分解パ
ルス発信螢光により評価することができる。 このようなキツトは上記例１〜３に記載の方法と同様
の方法によりTSHの検出に使用することができる。この
場合に、抗−TSH抗体の量およびTSH含有試料の量は試料
中のTSHの約５％またはそれ以下が板上の抗−TSH抗体に
結合するような相互関係で選択する。逆滴定は競合性系
よりはむしろ非競合性系よりなるが、原則的には、同一
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エキンズ，ロジャー フィリップ イギリス国 ロンドン，ダブリュ１エヌ ８エーエー，モーティマー ストリー ト （番地なし），ミドルセックス ホ スピタル メディカル スクール，デパ ートメント オブ モールクラー エン ドクリノロジィ気付 (56)参考文献 特開 昭56−51665（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−146043（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−126856（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501480（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．未知液体試料中のアナライトの濃度を測定するため
   に、試料をアナライトに対する結合部位を有し、かつ第
   一のマーカーで標識されているレセプターと接触させる
   方法において、 （ｉ）レセプターのアナライトとの親和性を考慮して、
   レセプターの結合部位の一部がアナライトの有意でない
   一部によって占拠され、かつ、レセプター中のアナライ
   ト占拠部位の割合は試料中のアナライトの濃度に相関
   し、しかも用いられるレセプターの量とは実質的に無関
   係であるように少量のレセプターを使用する条件下に、
   試料とレセプターを接触させ、 （ii）ついで、アナライトにより占拠されていないレセ
   プターまたはレセプターに結合したアナライトまたはア
   ナライトにより占拠されたレセプターを、第一のマーカ
   ーとは異なる第二のマーカーを有する結合物質によって
   逆滴定し、 （iii）上記二種のマーカーによって生成する二種のシ
   グナルの相対強度を、レセプター中のアナライト占拠部
   位の割合を示す値として得て、 （iv）上記値から試料中のアナライトの濃度を決定する
   方法。 ２．上記マーカーが蛍光マーカーであることを特徴とす
   る、請求項１に記載の方法。 ３．上記逆滴定がマーカーで標識したアナライトおよび
   レセプターの未占拠アナライト結合部位だけを占拠する
   ことができる、マーカーで標識されている他の物質から
   選ばれる逆滴定試薬を含む競合系を含むことを特徴とす
   る、請求項１または２のいずれか一つに記載の方法。 ４．上記逆滴定が結合したアナライトと結合できるか、
   または結合したアナライトにより占拠されているレセプ
   ター結合部位だけと結合することができ、そしてすでに
   標識されているか、または引続いてマーカーで標識付与
   される逆滴定試薬を含む非競合系を含むことを特徴とす
   る請求項１または２のいずれか一つに記載の方法。 ５．上記有意でない一部が存在するアナライトの総量の
   ２％より少ないことを特徴とする、請求項１〜４のいず
   れか一項に記載の方法。 ６．上記レセプターがアナライトに対する抗体であるこ
   とを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方
   法。 ７．上記アナライトがホルモンであることを特徴とす
   る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 ８．上記アナライト含有試料が結合物質に可逆的に結合
   したアナライトを含有していないことを特徴とする、請
   求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 ９．上記マーカーが活性化されたときだけ蛍光を発す
   る、種々のランタニドキレートであり、そして上記蛍光
   が高強度光ビームによる走査を包含する時間−分解パル
   ス蛍光により検出されることを特徴とする、請求項２〜
   ８のいずれか一項に記載の方法。 １０．液体試料中のアナライトの濃度を定量的に測定す
   るための分析装置であって、複数の間隔をあけた位置
   に、それぞれアナライトに対する結合部位を有する複数
   の異なるレセプターを付着した固体基体からなり、いず
   れか一つの位置のレセプターは一つ以上の他の位置のレ
   セプターが特異的結合部位を有するアナライトとは異な
   るアナライトに対する特異的結合部位を有し、各レセプ
   ターはマーカーで標識されており、間隔をあけた各位置
   のレセプターの量は前記液体試料の量に関して少量であ
   り、各アナライトの有意でない一部がレセプターに結合
   し、そしてアナライトにより占拠されるレセプターの結
   合部位の一部は用いるレセプターの量とは実質的に無関
   係である、分析装置。 １１．液体試料中のアナライトの濃度を測定する方法に
   使用するキットであって、 （ｉ）第一のマーカーで標識した、アナライトに対する
   結合部位を有するレセプターを付着した固体基体、 （ii）未占拠レセプターまたはアナライトまたは占拠レ
   セプターに結合することができる逆滴定試薬およびこの
   逆滴定試薬を標識するための第二のマーカー、ここで、
   このマーカーは前記第一のマーカーとは異なる、および （iii）既知濃度のアナライトを含有する一つ以上の標
   準溶液からなり、上記（ｉ）における基体上のレセプタ
   ーの量は上記液体試料の量に関して少量であり、アナラ
   イトの有意でない一部がレセプターに結合し、そしてア
   ナライトにより占拠される結合部位の一部は用いるレセ
   プターの量とは実質的に無関係である、キット。 １２．請求項10に記載の分析装置を含むことを特徴とす
   る、請求項11に記載のキット。