CN1759319B - 生物液中肾上腺髓质素原中间区域部分肽在制备免疫诊断剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

为诊断目的检测生物液中肾上腺髓质素免疫反应性的方法，尤其是在脓毒症、心脏病和癌症诊断中，该方法中尤其借助利用至少一种特异性识别mid-proAM序列的标记抗体运作的免疫检测法来测定包含完整前肾上腺髓质素原(pre-proAM；SEQ ID NO：1)第(45-92)氨基酸的肾上腺髓质素原的中间区域部分肽(mid-proAM；SEQ ID NO：3)。

Description

生物液中肾上腺髓质素原中间区域部分肽在制备免疫诊断剂中的用途
本发明涉及，为医疗诊断目的，尤其是在诊断脓毒症中，以及例如，在癌症诊断和心脏病诊断或通常在那些检测肽肾上腺髓质素(AM)可以给出与诊断相关的结果的病理状态诊断中，检测生物液中的肾上腺髓质素原中间区域部分肽(mid-proAM)尤其是proAM(45-92)部分肽的方法。尤其通过其中使用了标记抗体的这一类型的免疫检测方法(夹心检测法；根据SPALT或SPART原则的竞争性检测法)来实施本发明的检测。
在本说明书中，术语“诊断”原则上用作一个简化的上位概念，它还有意包括预后判定/早期预后判定和伴随治疗的疗程监测 
Figure GA20179028200480006345201D00011
。
1993年Kitamura等人首次将已从人嗜铬细胞瘤 分离的肾上腺髓质素(AM)肽(参见18；数字信息基于所附参考文献列表)描述为一种具有52个氨基酸的新降压肽。同年，还描述了编码具有185个氨基酸的前体肽的cDNA和该前体肽的完整氨基酸序列(19；SEQ ID NO：1)。该前体肽，尤其是在N-末端包含一段21个氨基酸的信号序列，被称作“前肾上腺髓质素原”(pre-proAM)。本说明书中，所指明的所有氨基酸位置通常都涉及包含185个氨基酸、且具有序列SEQ ID NO：1的pre-proAM，除非在特定的上下文中有明显不同之处。
肾上腺髓质素(AM)肽是一段含有52个氨基酸的肽(SEQ ID NO：2)，它含有由蛋白酶剪切pre-proAM形成的pre-proAM的第95至146位氨基酸。时至今日，实质上在pre-proAM剪切形成的肽片段中只有几个 已经得到了较为精确的描述，尤其是生理活性肽肾上腺髓质素(AM)和“PAMP”，它是一段含有20个氨基酸(22-41)的肽，在pre-proAM中紧随于21个氨基酸的信号肽之后。此外AM和PAMP的生理活性子片断都已经被发现并得到了进一步的研究。
1993年AM的发现及描述引发了大量研究和众多文献，其结果在近期已经被归纳成各种综述性文章，在本说明书中，列出了尤其是在
“Peptides”(Peptides 22(2001))这本出版物中找到的关于AM的文章作为参考文献，尤其是(12)和(2)。还有一份综述是(3)。在至今的科学研究报告中，已经发现，尤其是，AM可以被看作是一种多功能调控肽。它以延长有甘氨酸的失活形式被释放到体循环中(5)。还有一种特异于AM、且可能同样调制AM的作用的结合蛋白(11)。
在迄今为止的研究报告中AM和PAMP的那些最重要的生理效应是其影响血压的效应。因此，AM是一种有效的血管扩张剂，低压效应有可能与尤其是AM的C-末端的肽部分有关。另一方面，AM的N-末端的肽序列表现高压效应(参见例如(6))。
此外，还发现由pre-proAM形成的上述另一个生理活性肽PAMP同样表现低压效应，即使它看起来似乎具有不同于AM的作用机制(除上述综述性文章(2)和(3)之外亦参见(8)、(9)或(14)和EP0 622 458 A2)。
还发现，可以在体循环和其它生物液中测得的AM浓度，在大部分病理状态下，显著高于在健康对照人中发现的浓度。因此，充血心脏衰竭、心肌梗塞、肾疾病、高血压疾病、糖尿病患者中、在休克急性期中以及脓毒症和脓毒症性休克中的AM水平，显著提高，尽管程度不同(参见例如(2)，第7部分7，和本文中所引用的文献)。在一些所述的病理状态中，PAMP浓度也增加，但是针对于AM其血浆水平相 对降低((2)；第1702页)。
还已知，通常在脓毒症和脓毒症性休克中观察到高浓度AM(参见(2)和(4)、(1)、(13)、(15)和(16))。这些发现涉及典型的血液动力学变化，已知该变化是脓毒症和其它比如SIRS这样的严重综合症患者病程中的典型现象。
尽管AM和PAMP是从相同的前体肽pre-proAM(SEQ ID NO：1)形成的，在前体肽pre-proAM中对应于这两个肽的氨基酸序列以等摩尔量的部分肽存在，但是可以在生物液中测定的AM或PAMP浓度却显示不同。这没有什么不寻常的。一个或相同前体肽的不同降解产物的可测定浓度因为这样而可能不同，即，因为它们是不同的竞争降解途径的结果，这些降解途径例如在不同的病理状态下导致前体肽的不同片段化并由此导致不同的降解产物。前体肽中所包含的某些特定部分肽可能成为或不成为自由肽，和/或不同的肽以不同的方式和不同的量形成。即使加工前体肽只有一种降解途径，且由此所有的降解产物都从一个或者相同的前体肽产生且必定形成基质上相同的摩尔量，在生物液中可以测定的不同部分肽或片段的稳定状态浓度也可能非常不同，也即，例如，当其各单体肽以不同的速率形成时和/或在各自生物液中具有不同的个体稳定性(寿命)时，或者假如它们以不同的清除机制和/或以不同的清除速率从体循环中除去。
因此，与AM的形成相关，虽然可以推测，除AM和PAMP外，其它肽片段也必定在pre-proAM的蛋白水解加工中形成。然而，科学文献根本没有包含关于这样的其它可能片段的出现和稳定性的资料，即使对应于这样的pre-proAM肽片段的肽、以及用于检测它们的放射免疫检测法(RIA)是可以从商业途径获得以用于研究的，例如从PhoenixPharmaceuticals，Inc.获得。
基于已经从脓毒症中出现激素原和降钙素原而获得的知识(参见例如EP 0 656 121 B1)，并从对于脓毒症这种情况可能也可以在脓毒症患者的体循环中检测到其它通常观察不到的激素原这一假说出发，本申请人使用商业获得的RIA用结合pre-proAM第45-92位氨基酸、但不结合成熟AM的抗体实施了一个针对在脓毒症患者血清中检测肾上腺髓质素原的实验。WO 00/22439公开文本中描述的结果给出了一种暂时定名为肾上腺髓质素原的分析物的浓度，该浓度与健康对照人相比有所升高。然而，所测定的升高仅仅是在正常值的两倍这一数量级，也就是说是相当小的。根据文献资料报道了在脓毒症的情形下12倍于正常值这一数量级的升高的AM值所观察到的通过所使用的检测方法测定的proAM免疫反应性上升至约为正常值的两倍，这一提高对于在脓毒症诊断中检测该“proAM免疫反应性”来替代AM似乎并不很具有吸引力。在所述实验中是否确实测定了肾上腺髓质素原(22-185或22-146)或者按所述方式测定的肾上腺髓质素原免疫反应性是否归因于患者样品中存在的一个物种或者大量不同物种，不能根据所测结果来决定。
在对可临床用于脓毒症诊断的生物标记的广泛研究和开发过程中，以及特别是基于能够借助多参数检测方法(同时检测多种生物标记)改进脓毒症精确诊断这一目的，申请人还考虑了对在脓毒症中升高的AM的检测或附加检测。然而，正如我们发现的，对AM进行可以获得不受各别研究工作的限制而能够对所测结果做简单比较的检测并非立即就可能的。大多数研究工作信息都是利用以AM与标记肽竞争抗体的共同AM结合位点为基础的RIA得到的。不同的RIA常常各自发展，而且使用了各种不同的抗体和肽，这为在所测得的结果间做定量比较带来了更多困难(参见例如10)。此外，近期的研究结果已经显示，存在各种不同形式的AM(带有或不带有C-末端甘氨酸残基)，它们可能具有不同的活性(参见(2)和，例如，(5))。一种AM结合蛋白的发现使(参见11)得情况变得更加复杂——甘氨酸存在与否或AM 与其结合蛋白形成的复合物存在与否都能够以不可预计的方式影响对AM作为各检测方法的运作机能的检测。这些情况为适于常规调查的AM有效免疫检测法提出了更高的要求：对于这样一种检测方法，如果实际存在与那些没有被结合蛋白占据的AM区域结合的适宜抗体的话，则必须找到这样抗体。作为选择，必须采取预先的步骤来使结合蛋白与AM解放或分离开，这使得这一步骤对AM稳定性的影响和/或所得的测定值难于估计。除了完整的AM之外，发现不同部分肽也有生理作用并且它们似乎在整个生理过程中起重要作用，这一事实使得有效免疫检测法的形成与文献中出现的测定值的可比性更为复杂。
因此本申请人的目的是提供一种适于常规程序的有效方法，该方法本质上对上述直接测定AM的干扰因素不敏感，并能够在各种病理状态下给出AM和/或其前体的可靠的生理产生值，尤其是在脓毒症中或在其它发现AM值升高病理状态下。
根据本发明如此实现了该目的，为诊断目的不检测AM或到目前为止所调查的另一pre-proAM部分肽，而是检测包含pre-proAM第42-95位氨基酸的中间区域部分肽(SBQ ID NO：3)，则这一检测特别优选利用使用了标记抗体的免疫检测法来完成。
权利要求1代表了本发明的核心。
本发明的有利之处及当前优选的实施方式描述于从属权利要求中。
为实现提供可靠测定各种病理状态下AM及其前体产物或副产物的形成的检测方法这一目的，尤其是在脓毒症中，以及例如心脏病、高血压疾病或癌症或其它可以观察到AM水平升高的疾病。尽管它不是很有保证的结果，一方面与描述于WO 00/22439的在脓毒症中“肾上 腺髓质素原免疫反应性”升高的结果相结合，另一方面，利用各种新的检测方法对脓毒症、癌症和心脏病患者血清测量进行补充的广泛临床研究，这一措施令人惊奇地给出了准确性大大提高的测定值。
以下详细描述了所完成的研究以及这些研究给出的最重要结果，参考文献用数字表示。
附图1显示，109位健康人血清中mid-proAM的测定结果，与110位脓毒症患者以及20位多发性损伤患者的血清的测定结果比较。所用测定均采用在实施例部分详细描述的SPALT检测方法完成。显著的是——与其它降钙素原和其它炎症标记相反——只有脓毒症患者的值(相对于健康人值33pmol/l，约为550pmol/l和550fmol/ml的高浓度)是升高的，多发性损伤患者的值却未升高。
附图2显示，利用实施例部分更详细描述的夹心检测法测定的274位健康人、267位脓毒症患者、20位心脏病患者和49位癌症患者血清中的mid-proAM测定值。
联系得到本发明的研究方法，关于处于各种疾病状态的物种的本质或者关于尤其是检测AM/proAM的适宜物种的问题是最重要的。因为RIA原则上不适于对这一问题给予有价值的信息，此外，由于各种原因，RIA对于为常规检测提供有效的检测方法这一发展目的似乎也不是很有希望，因此首先必须开发新的可以选择标记抗体的这一类型的检测方法、免疫检测方法。
在研究根据WO 00/22439测定的脓毒症中提高的肾上腺髓质素原免疫反应性值是否确实在所调查的样品中表现出升高的肾上腺髓质素原浓度这一问题时，首先开发了一种基于检测方法设计的夹心检测法，该方法本质上特异于肾上腺髓质素原(22-146或22-185)，因为它既 不能识别AM也不能识别不包含AM的pre-proAM部分肽。
该夹心检测法使用了两种不同的特异性识别肽(69-86：肽区段SPCD19；SBQ ID NO：4)或肽(129-147；C-末端AM肽)氨基酸序列的抗体。所使用的标准材料是重组完整肾上腺髓质素原(22-185)，其在商业竞争性AM检测法中已经得到校准。
在健康正常人血清和脓毒症患者血清的测定中，用该夹心检测法没有得到高出检测限度约40pg/ml的升高值(结果未显示)。从这些发现，必须得出这一结论：在脓毒症中发现的升高的proAM免疫反应性不是由于样品中肾上腺髓质素原肽的存在引起的。
为进一步核查关于早前测定的相对较轻微(约两倍)升高的“proAM免疫反应性测定值”是否真实以及由所使用的RIA引起的假象是否可能在这些测定起作用这一问题，又开发了一种基于所谓的SPALT原理的检测方法。在这样一种检测方法中，利用了结合于固相(固相＝SP)的分析物(“抗原”＝A)竞争剂与分析物对反应液中的标记抗体上的普通结合位点的竞争。在本发明的情况中，用发光示踪剂标记抗体(LT)(参见实施例部分)。分析物的存在以及样品中的竞争性结合部分对结合位点的占据是明显的，因为标记抗体与固相的结合减少。
所述SPALT中所使用的固相结合竞争剂是固相结合肽(69-86：肽区段SPCD19；SBQ ID NO：4)，所使用的抗体是抗该肽并识别该肽的标记抗-SPCD19-绵羊抗体(亲和纯化；参见实施例部分)。所使用的标准物包含正常马血清中的肽SPCD19稀释物。检测限度为约50pmol/l。在该检测中，将各样品100μl(标准)和100μl在包被有SPCD19肽的Polysorb试管中4℃中示踪剂孵育过夜，之后用申请人的 
Figure GA20179028200480006345201D00071
公司的4×1ml标准洗涤液洗涤，之后在照度计中测定。
在一次用该SPALT检测方法测定脓毒症过程中，在脓毒症患者和健康正常人间发现巨大差异。在检测限度约1ng/ml时，脓毒症患者血清给出平均约为19000pg/ml的值。考虑到在使用商业RIA的预备实验中相当低的升高(WO 00/22439)，脓毒症患者和健康人之间的实质差别是非常惊人的。
将所述SPALT检测方法扩展到了临床测定。扩展研究结果用图表概括在附图1中，作为上述对附图1的说明的明确参考。
使用SPALT检测方法的上述阳性结果显示，(i)在脓毒症血清中测定的“proAM-免疫反应性”不能归结于肾上腺髓质素原的实际存在，但是(ii)对具有pre-proAM中间部分的氨基酸序列，更精确地说是根据SEQ ID NO：3的mid-proAM，的对应测定，适于清楚地将脓毒症患者与正常人区分。
根据这些结果，将调查向两个方面扩展：
1.鉴定体循环中实际出现的pre-proAM，以及可选地调查其作为常规测定中的生物标记的适宜性。
2.同时，进一步调查测定这些种类可以给出在诊断上有价值的结果的程度。
以下参照实施例部分更详细地描述结果。它们可以归纳如下：
1.包含pre-proAM第45-92氨基酸(SEQ ID NO：3)或由其组成的、且在本发明中称作的mid-proAM肽在体循环(血清、血浆)中以显著升高的浓度存在，而且可测定性可以良好重复。
2.利用特异性测定该mid-proAM的检测方法测定患者血清给出的测定结果不仅可以明显区分脓毒症患者和正常人而且还——结合临床研究——能够探测其它与形成升高的AM有关的痰病，尤其是心脏病和癌症。
因此该发明尤其涉及患者体循环，尤其是血浆样品，中mid-proAM的检测。
以下还详细解释了本发明优选实施方式的一些大致方面，以及对进一步选择出的实验结果做了更详细地说明。
对于本发明的实际实施，优选其中使用了标记抗体的检测方法，比如根据上述竞争性SPALT原理运作的检测方法(但是其它标记，例如SPART检测法中的放射性标记，也可以使用)。
然而，非竞争性夹心检测法，例如如同以下详细描述的所使用的用于进一步更广泛调查的这一类型，是尤其优选的。
与竞争性免疫检测法相比，非竞争性夹心检测法(双向免疫检测法)有诸多优点，包括它们可以比固相检测法(异源检测法)更好地设计这一事实，在操作上更牢固，能够得出具有更高敏感度的测定结果，以及还更适于自动化和系列测定。此外，与只用一种类型的抗体运作的竞争性免疫检测相比它们还可以给出附加的信息，因为夹心免疫检测仅识别那些在同一个分子中存在用于形成夹心的抗体的两个结合位点的分子或肽。
原则上该抗体可以是任何适宜的单克隆和/或多克隆抗体，但是优选亲和纯化的多克隆抗体。
尤其优选的是，其中一种抗体是通过用包含具有pre-proAM的第69-86位氨基酸和N-末端附加甘氨酸残基(SEQ ID NO：4)的合成肽序列的抗原免疫接种动物，尤其是绵羊，获得的。相应地可以用，例如，包含具有pre-proAM的第83-94位氨基酸(肽区段PSR13；SEQ ID NO：5)和N-末端的附加甘氨酸残基的合成肽序列的抗原获得另一个抗体。用共同包含proAM序列的连续中间区域的合成肽获得的抗体，仅识别上述mid-proAM(第45-92位氨基酸)区域中的结合位点，更精确地说是pre-proAM的第60-92位氨基酸。
在一种优选实施方式中，该方法作为一种异源夹心免疫检测法来实施，其中，一种抗体被固定在任意一种固相上，例如包被了的试管壁上(例如聚苯乙烯；“Coated Tubes”；CT)或微量滴定板上，例如聚苯乙烯，或颗粒上，例如磁珠，而另一种抗体带有表示可直接检测的标记、或者可以与抗体选择性连接、且用于检测所形成的夹心结构的残基。还可能用适宜的固相进行时间性延迟的或随后的固定。
原则上，可以使用在所述类型的检测方法中使用的所有的标记技术，这些技术包括用放射性、酶、荧光、同位素标记，或化学发光或生物发光标记，以及比如金原子和染料颗粒这样的直接可光学探测的颜色标记，尤其是如同在所谓的床旁(POC)或快速检测中所使用的。对于异源夹心免疫检测的情况，两种抗体也可以具有同源检测法中下述类型的部分检测系统。
本发明因此还涉及根据本发明将该方法设计为快速检测。
本发明的方法还可以被设计成同源方法，其中从两种抗体与所要探测的mid-proAM形成的夹心复合物保持悬浮于液相中。这种情况下，优选对作为检测系统一部分的两个抗体都进行标记，当两个抗体被整合在一个夹心中时，这个检测系统就能产生信号或者开启信号。这样 的技术可以设计成尤其是荧光扩增或荧光淬灭检测法。这一类型的一种尤其优选方法是涉及，使用成对使用的检测剂，例如，如US-A-4822733、EP-B1-180492或EP-B1-539477以及本文所引用的现有技术中所述的。它们可以直接在反应混合物中进行仅选择性探测在单个免疫复合物中同时包含两个标记成分的反应产物的检测。作为例子，提供了商标为 
Figure GA20179028200480006345201D00111
(Time Resolved Amplified Cryptate Emission)和 的技术，这些技术可以执行上述应用的教导。
已经令人惊奇地发现，根据本发明对mid-proAM(SEQ ID NO：3)的这一检测给出极为显著的测定结果。正如以下将显示的，这一论断不仅适用于脓毒症的诊断也适用于心脏病和癌症的诊断。
据推测，本发明的检测方法尤其有利的还可以在所谓的多参数诊断中实施，尤其是在心脏病诊断领域以及脓毒症和癌症诊断领域。由此测定的其它参数是，例如，心脏参数ANP、BNP、proANP或proBNP或选自例如抗-神经节苷脂抗体、降钙素原蛋白、CA 125、CA 19-9、S100B、S100A蛋白、LASP-1、可溶性细胞角蛋白片段、尤其是CYFRA 21、TPS和/或可溶性细胞角蛋白片段(sCY1F)、Inflammin肽和CHP、其它肽激素原、甘氨酸-N-酰基转移酶(GNAT)、氨甲酰基磷酸合成酶1(CPS 1)和C-反应蛋白(CRP)或其片段的脓毒症参数。对于所述多参数检测的情况，意欲同时或平行检测多参数的测定结果并对其进行评估，例如，借助于也利用诊断显著性参数相关性的计算机程序。
以下通过对优选检测组分的制备、夹心类型检测方法的一种优选实施方式、以及用这样一种检测方法检测对照人以及脓毒症、心脏病和癌症患者的EDTA血浆中mid-proAM检测结果进行说明，来更详细的解释本发明。
此外，还描述了对体循环中实际检测和出现的proAM部分肽的鉴 定。
实验部分
材料和方法
1.肽合成
从已知的人前肾上腺髓质素原氨基酸序列(SEQ ID NO：1)选择第一区段(第69-86位：肽区段SPCD19；SEQ ID NO：4)和第二区段(第83-94位：肽区段PSR13；SEQ ID NO：5)。各区段N-末端都补加半胱氨酸残基，两个区段都经标准方法合成、纯化、利用质谱法和反向HPLC进行质量控制、并以等分量冻干(JERINI AG，Berlin，Germany)。这些肽的氨基酸序列是：
Peptid SPCD19：CRPQDMKGASRSPEDSSPD(SEQ ID NO：4)
Peptid PSR13： CSSPDAARI RVKR(SEQ ID NO：5)
此外，合成了完整的mid-proAM(对应于SEQ ID NO：3的45-92位)作为标准：
ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRV(SEQ ID NO：3)
2.缀合及免疫
借助MBS(间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)将上述肽SPCD19和PSR13与载体蛋白KLH(匙孔 
Figure GA20179028200480006345201D00121
血蓝蛋白)缀合(参见PIERCE的工作指导“NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers”，Rockford，IL，USA)。根据以下方案用这些缀合物接种绵羊：各绵羊 最初接受100μg缀合物(基于缀合物肽部分的粗略数据)，之后每四周接受50μg缀合物(基于缀合物肽部分的粗略数据)。从初始接种后的第四个月开始，每四周从各绵羊抽取700ml血液，并将这些血液离心获得抗血清。缀合物、接种和抗血清的获得都由MicroPharm，Carmarthenshire，UK完成。
3.抗体的纯化
在一步法中，按照下述从自接种后第四个月开始获得的抗血清中制得肽-特异性抗体。
为此，首先将上述肽SPCD19和PSR13与SulfoLink Gel偶联(参见PIERCE公司的工作指导“SulfoLink Kit”，Rockford，IL，USA)。对各肽，每5ml凝胶都使用5mg肽进行偶联。
根据下述从抗这些肽的绵羊抗血清的亲和纯化出肽-特异性抗体：
首先用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸，pH2.2)和结合缓冲液(100mM磷酸钠，0.1％Tween，pH6.8)各10ml交替洗涤肽柱三次。将100ml绵羊抗血清滤过0.2μm，并与现有的柱材料混合。为此，在柱外用10ml结合缓冲液定量洗涤凝胶。室温下涡旋孵育过夜。将孵育物定量转移到空柱上(NAP 25，Pharmacia，清空)。弃去流过液。之后用250ml结合缓冲液洗涤至不含蛋白(洗脱液的蛋白质含量＜0.02 A280nm)。向洗过的柱中加入洗脱缓冲液，收集到了1ml级分。用BCA法确定各级分的蛋白质含量(参见PIERCE公司的工作指导，Rockford，IL，USA)。收集蛋白质浓度＞0.8mg/ml的级分。用BCA法对这些收集物做蛋白质检测后，获得了49mg抗-SPCD19抗体(亲和纯化的；多克隆)和60mg抗-PSR13抗体(亲和纯化的；多克隆)。
4.标记
根据工作指导，在NAP-5凝胶过滤柱(Pharmacia)柱上将500μl纯化的抗-SPCD19抗体(参见上述)重新缓冲于1ml 100mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)中。抗体溶液的蛋白质浓度测定值为1.5mg/ml。
为了对抗体做化学发光标记，向67μl抗体溶液中加入10μl MA70吖啶酯NHS酯(1mg/ml；来自HOECHST Behring)，并在室温下孵育15分钟。之后，加入423μl 1M的甘氨酸，室温下再孵育10分钟。之后，根据工作指导在NAP-5凝胶过滤柱(Pharmacia)将标记物重新重新缓冲于1ml流动相A(50mM磷酸钾，100mM NaCl，pH7.4)并低分子量成分中脱离出来。为了分离出未结合于抗体的最终标记残余，进行凝胶过滤HPLC(柱：Waters Protein Pak SW300)。加入样品，用流动相A层析，流速1ml/分钟。用流式光度计测定280nm和368nm波长。作为抗体标记程度量度的吸收比率368nm/280nm在峰处为0.10。收集含有抗体的单个级分(滞留时间8-10分钟)，置于3ml 100mM磷酸钠、150mM NaCl、5％胎牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠中，pH7.4。
一方面按照以下更为详细描述的将所标记的抗体用于夹心免疫检测中，另一方面，也用在已经描述过的SPALT中。
5.偶联
为提供夹心免疫检测的固相，按照下述用纯化的抗-PSR13抗体包被经过照射的5ml聚苯乙烯试管(来自Greiner)：将抗体在50mMTris、100mM NaCl，pH7.8中稀释至浓度6.6μg/ml。将300μl该溶液滴入各管。22℃孵育管20小时。用泵抽滤该溶液。然后向各管中填充4.2ml 10mM磷酸钠、2％Karion FP、0.3％胎牛血清白蛋白， pH6.5。20小时后，用泵抽滤该溶液。最后，在真空干燥机中干燥这些管。
还用各个其它抗体以基本相同的方式进行了所述标记和固定化方法，得到“反向”夹心检测。按照类似于以下描述的利用这样的“反向”标记/固定化免疫检测的测定来完成测定给出了基本相同的结果，因此不再描述。
6.进行夹心免疫检测及其评估
制备具有以下组分的检测缓冲液：
100mM磷酸钠，150mM NaCl，5％胎牛血清蛋白，0.1％非特异性绵羊IgG，0.1％叠氮化钠，pH7.4。
所使用的标准材料是化学合成的mid-proAM(SEQ ID NO：3)。在正常马血清(来自SIGMA)中连续稀释该肽。根据肽的样品重量决定如此制备的标准物的浓度。
所测定的样品是外表健康的人、脓毒症患者、心脏病患者、癌症患者的EDTA血浆。
将10μl标准物或样品和200μl检测缓冲液、含有一百万RLU(相对发光单位)的MA70-标记的抗-SPCD19抗体滴入测试试管。22℃振荡孵育两小时。之后每次用1ml洗涤溶液每管(0.1％Tween 20)洗涤四次，倒掉洗涤液，并在照度计(BERTHOLD，LB952T；BRAHMS AG的基础试剂)中测定结合于试管的化学发光。
用MultiCalc软件(Spline Fit)，从标准曲线读取样品的中间 区域肾上腺髓质素原浓度。结果用图形归纳于附图2。
7.进行SPALT免疫检测及其评估
所述SPALT检测中所使用的固相结合竞争剂是固相结合肽SPCD19(肽区域69-86；SEQ ID NO：4)，它已经结合于Polysorb试管壁。所使用的抗体是在如1至4中所述获得的标记的抗-SPCD19-绵羊抗体(亲和纯化)。用正常马血清中的肽SPCD19稀释物作为标准。
检测时，将各100μl样品(或标准)和100μl示踪剂于4℃下在包被有SPCD19肽的Polysorb试管中孵育过夜，此后用申请人的 的4×1ml的标准洗涤溶液洗涤，之后在照度计中测度。
利用该检测获得的测量值系列示于附图1。
8.鉴定在所述检测中测定的分析物
为了浓缩被在上述检测中所使用的抗体识别的分析物，将三份单独的脓毒症血浆直接经C18反向HPLC分馏分析，用线性乙腈梯度洗脱。收集1ml级分并干燥。将级分置于检测缓冲液中，检测各个级分的SPCD19免疫反应性。为此，将抗-SPCD19抗体(参见上述3)固定在Polysorb试管壁上，并检测样品(级分)的竞争和该抗体的发光-标记的SPCD19。
在这样的一个分析中发现，对于全部的脓毒症血浆，在相同的级分(级分22)中发现了最大免疫反应性。
为进一步鉴定所测定分析物，收集了7份约3ml的脓毒症血清(终体积为22ml)。用带有抗-SPCD19抗体的Carbolink柱亲和纯化所收 集的血清，如上述经C18反相HPLC分级分离酸性洗脱物。干燥级分22并做质谱分析调查。
在直接质谱分析中，检测到所分离分析物的摩尔质量值约为5146Dalton。该值对应于包含第45-92位氨基酸序列的proAM片段，也即mid-proAM，的摩尔质量(理论值为5146.72Dalton，假设其中存在的两个甲硫氨酸被氧化)。
在对所分离的级分22胰蛋白酶消化物所作的MALDI-TOF分析中，特别是对应于pre-proAM第79-89、75-89、61-74和61-78位氨基酸的肽片段被鉴定为单一同位素质量(M+H+)。胰蛋白酶降解物的摩尔质量数据和质谱分析共同证明了，包含在所分离级分中的肽是名称为mid-proAM(45-92)(SEQ ID NO：3)的肽。其形成可以用信号肽酶、激素原转化酶(在碱性氨基酸间切割)和氨基-和羧基-肽酶(除去碱性氨基酸)对原始pre-proAM翻译产物的蛋白酶水解加工来解释(参见(20)中降钙素原降解的类似流程)。
9.稳定性调查
为考察关于在mid-proAM的测定中是否可能会因为mid-proAM在样品或测定溶液中没有充足的稳定性而出现问题这一问题，对20份各在新鲜状态下以及在室温下存放3天后的脓血症血清进行了测定。结果归纳于下表。它们显示，保存3天后免疫反应性本质上没有改变。这证明，mid-proAM的稳定性是其在处理诊断方面的一个主要优势。
表1
病人# mid-proAM[nmol/l]天数＝0 mid-proAM[nmol/l]天数＝3 变化
1 6.2 6.1 98.8％
2 3.3 3.2 98.1％
3 2.2 2.1 97.0％
4 1.6 1.5 95.4％
5 1.1 1.0 92.7％
6 1.3 1.2 95.7％
7 1.9 2.1 109.6％
8 2.6 2.7 102.8％
9 2.8 2.7 96.4％
10 3.1 3.1 99.9％
11 4.6 4.9 106.3％
12 5.8 5.9 102.1％
13 3.6 3.4 95.2％
14 4.2 4.6 110.7％
15 3.0 2.4 80.0％
16 1.2 1.3 105.5％
17 1.5 1.5 102.2％
18 1.7 1.8 103.4％
19 2.0 1.8 89.5％
20 2.1 2.0 94.1％
平均值＝98.8％
概言之，可以说检测mid-proAM，使用例如SPCD19抗体，相比检测，例如，AM具有许多优点：
mid-proAM的检测不受到任何已知的由于存在结合蛋白、片段和弱浓度动力学而导致的限制的约束。
分析物mid-proAM还具有良好的稳定性，也即，在室温存放过程中极少丧失免疫反应性，这对于诊断性常规检测是一个主要的实践优点。
观察到了非常好的动力学，而且这不被认为仅特异于脓毒症。
因此认为，检测mid-proAM能够对所有被描述有AM浓度上升的疾病表征都具有优势，其中在目前看来尤其有利于脓毒症、心脏病和癌症的诊断。
序列表
<110>B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft
 
<120>生物液中肾上腺髓质素原中间区域部分肽的诊断检测，和实施这样的检测的免疫检测
方法
 
<130>3723PCTCN
 
<140>
<141>
 
<150>DE 10316583.5
<151>2003-04-10
 
<160>5
 
<170>PatentIn Ver.2.1
 
<210>1
<211>185
<212>PRT
<213>智人
 
<400>1
Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe
  1               5                  10                  15
Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys
             20                  25                  30
Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met
         35                  40                  45
Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala
     50                  55                  60
Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg
                 85                  90                  95
Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe
            100                 105                 110
Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
        115                 120                 125
Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln
    130                 135                 140
Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly
145                 150                 155                 160
Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro
                165                 170                 175
Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu
            180                 185
 
<210>2
<211>52
<212>PRT
<213>智人
 
<400>2
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
  1               5                  10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
             20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
         35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
     50
 
<210>3
<211>48
<212>PRT
<213>智人
 
<400>3
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
  1               5                  10                  15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
             20                  25                  30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
         35                  40                  45
 
<210>4
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
 
<400>4
Cys Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser
  1               5                  10                  15
Ser Pro Asp
 
<210>5
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列：合成肽
 
<400>5
Cys Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg
  1               5                  10

Claims (17)

1.至少一种特异性识别SEQ ID NO：3所示肾上腺髓质素原中间区域部分肽mid-proAM的氨基酸序列或其片段的抗体用于制备免疫检测法诊断剂的用途，所述诊断剂用于检测生物液中的mid-proAM免疫反应性，其特征在于所述mid-proAM含有SEQ ID NO：1所示的完整前肾上腺髓质素原pre-proAM的45-92氨基酸或其片段。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于该免疫检测法是一种使用结合于固相的分析物竞争剂和标记抗体的SPALT检测法或使用了至少两种特异性结合于不同的mid-proAM的部分序列的抗体的夹心检测法。
3.根据权利要求1的用途，其特征在于，检测循环性mid-proAM，且生物液是血浆。
4.根据权利要求2的用途，其特征在于，两种抗体都结合于mid-proAM中的一段从pre-proAM第60至第94位氨基酸的区域。
5.根据权利要求1至4中任一的用途，其特征在于，抗体是单克隆和/或多克隆的抗体。
6.根据权利要求2的用途，其特征在于，两种抗体都是亲和纯化的多克隆抗体。
7.根据权利要求1至4中任一的用途，其特征在于，抗体中的一种是通过用包含含有SEQ ID NO：4所示的pre-proAM第69-86位氨基酸的合成肽序列的抗原免疫接种动物获得的，抗体中的另一种是通过用包含含有SEQ ID NO：5所示的pre-proAM第83-94位氨基酸的合成肽序列的抗原免疫接种获得的。 
8.根据权利要求1至4中任一的用途，其特征在于，其中一种抗体被标记，另一种抗体与固相结合或能够选择性地结合到固相上。
9.根据权利要求1至4中任一的用途，其特征在于，第一种和第二种抗体都分散在液体反应混合物中，且作为基于荧光和化学发光淬灭或放大的标记系统一部分的第一种标记组分与第一种抗体结合，该标记系统的第二种标记组分与第二种抗体结合，由此在待检测的mid-proAM与两种抗体都结合后，即产生一个使得可以在测定溶液中探测所得夹心复合物的可测定信号。
10.根据权利要求9的用途，其特征在于，该标记系统含有稀土穴状化合物或稀土螯合物以及荧光或化学发光染料。
11.根据权利要求1至4中任一的用途，其特征在于，所述诊断剂用于脓毒症诊断、严重性和预后的确定以及脓毒症的过程伴随性疗法控制。
12.根据权利要求11的用途，其特征在于，所述诊断剂同时还实施至少检测一个其它与脓毒症诊断相关的参数的多参数检测。
13.根据权利要求12的用途，其特征在于，另外一个或多个与脓毒症诊断相关的参数选自抗-神经节苷脂抗体、蛋白质降钙素原、CA 125、CA 19-9、S100B、S100A蛋白、LASP-1、可溶性细胞角蛋白片段、TPS和/或可溶性细胞角蛋白-1片段sCY1F、Inflammin肽和CHP、甘氨酸-N-酰基转移酶GNAT、氨甲酰基磷酸合成酶1和C-反应蛋白CRP或其片段。
14.根据权利要求1至4中任一的用途，其特征在于，所述诊断剂用在心脏病诊断领域。 
15.根据权利要求14的用途，其特征在于，所述诊断剂同时还实施检测其它与心脏病诊断相关的参数的多参数检测。
16.根据权利要求1至4中任一的用途，其特征在于，所述诊断剂用在癌症诊断领域。
17.根据权利要求16的用途，其特征在于，所述诊断剂同时还实施检测其它与癌症诊断相关的参数的多参数检测。 
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