CN1918473B - 出于医学诊断目的而测定内皮素形成的方法,以及用于实施所述方法的抗体和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在严重疾病的情况下，特别是在心血管疾病、炎症、败血症和癌症的情况下，出于医学诊断目的而测定人类患者的全血、血浆或血清中的内皮素形成的体外方法，在该方法中，测定经加工的原初前内皮素原或内皮素原的相对长寿的肽片段，特别是C-末端肽片段，所述肽片段既不包含真正的具有生物活性的内皮素，也不包含其直接的前体，即大内皮素。

Description

出于医学诊断目的而测定内皮素形成的方法,以及用于实施所述方法的抗体和试剂盒
本发明涉及出于医学诊断目的在严重疾病的情况下通过测定循环(全血、血浆或血清)中的相应的内皮素原的肽片段，特别是前内皮素原-1的相对长寿的C-末端部分肽，来测定内皮素的形成，更确切地说，特别是在败血症诊断、心脏病诊断中，例如还在癌症诊断中，更准确地说通常在其中内皮素对于疾病的过程起着重要作用的这样的病状的诊断中。
当在本申请中简单地使用“内皮素”时，这一术语首先表示内皮素-1(ET-1)。但是，相应的表述对于内皮素的其他同种型常常也是通用的，因为限制为内皮素-1似乎通常不是必需的，从广义上来说，本发明还应当涉及其他的内皮素。
在本说明书中，术语“诊断”在此原则上作为简化的上位术语进行使用，其特别应当还包括预后/早期预后和与治疗相伴的过程控制。
特别地，借助于特异性免疫诊断学方法，尤其是借助于一类其中使用至少一种标记的抗体的免疫测定法(三明治测定法；竞争测定法，例如根据SPALT或SPART-原理)，来进行所述测定。
内皮素-1(ET-1)是一种含有21个氨基酸的肽，其是已知最强的血管收缩剂。自从其在1988年被Yanagisawa及其同事[27；方括号中的数字涉及所附参考文献列表]发现以来，已经广泛地研究了其生物合成、作用方式和与疾病的关联，并概括在专题性的综述文章中[1、7、12、17、24]。存在三种由不同的基因编码的内皮素同种型(内皮素-1、内皮素-2、内皮素-3)，其中内皮素-1的浓度最大且最有效。内皮素-1在内皮细胞、肺、心、肾和脑中合成。人内皮素-1基因的初始的翻译产物是含有212个氨基酸的肽，即前内皮素原-1(SEQ ID NO：1)。在分泌过程中，由信号肽酶切除前内皮素原的短的N-末端信号序列(第1-17位氨基酸)。随后，在此获得的内皮素原由作用于双碱性氨基酸对的蛋白酶即弗林蛋白酶加工成没有生物活性的、含有38个氨基酸的肽，即大内皮素(big-Endothelin)(SEQ ID NO：3)，由此最后借助于内皮素转化酶(ECE)形成成熟的、具有生物活性的内皮素-1(SEQ ID NO：2)。内皮素通过与位于肌细胞、心肌细胞和成纤维细胞上的特异性受体结合而发挥作用。这种结合导致钙的流出、磷脂酶C的活化和Na/K ATP酶的抑制。除了血管收缩作用之外，内皮素还具有生长调节特性。
鉴于内皮素(特别是内皮素-1)的可检测的和推测中的大量和重大的生理学作用，自从鉴定出其的那时候开始，就已经开发出了多种不同的测定法以用于其免疫诊断测定，并将这些测定法用于测量内皮素，特别是在人血浆中。这样的测定是许多公开文献的主题。
对于多种疾病病状，已经描述了内皮素-1和大内皮素的血浆浓度升高[17]。属于此的疾病为心血管疾病[1](尤其是肺动脉高压[21]、动脉粥样硬化[13]、充血性心力衰竭[25]、心肌梗塞[20])、败血症和感染性休克[11、22、23]、癌症[2、3、15、18]，等等。
用于测量血浆样品中的内皮素的免疫测定法(参见[17]中的综述)特别属于放射免疫测定法的类型(使用标记的内皮素-1作为竞争者)，或者属于EIA/ELISA类型，而且这些方法仅仅旨在测定内皮素或者测定内皮素-免疫反应性。在此，RIA类型的测定法具有较低的特异性，并还包括了含有内皮素序列的相关肽。
但是，发现内皮素-1(ET-1)具有极短的在循环中的停留时间，在1-2分钟之后其就已经从循环中被清除[6]。由于认为在血液和血浆中的内皮素-1是稳定的[6]，所以其分配入其他组织中以及其快速和高亲和力地与受体结合被看作是短的停留时间的最重要原因。因此，在某些组织和体液中，能够测得比例如在血浆中明显更高的内皮素-1浓度[1、7]。鉴于这些情况，测定血浆样品中的ET-1的正确性受到了严重的质疑[17]。也就是说，认为对于内皮素(ET-1)的生理作用来说，在血浆样品中可测定的短暂的(也许只是反映了过渡状态的)ET-1浓度是不重要的，然而所有在生物体中存在的游离的和结合的(例如与组织和受体结合的)生理ET-1浓度的总和则具有大得多的相关性。
相对于测定ET-1来说，测定ET-1前体即所谓的大内皮素(“bigET-1”；SEQ ID NO：3)具有优点，即“大内皮素”在循环中的停留时间比从其释放的ET-1的停留时间明显更长。因此，在一系列的研究中，没有测定真正的内皮素，而是测定了该“大内皮素”。特别地，使用三明治型的测定法用于其特异的测定，所述三明治型的测定法使得能够可靠地区分大内皮素-1与经加工的ET-1和其他内皮素[4、8、10]。显示出，在某些疾病的情况下，测量出ET-免疫反应性升高可归因于大内皮素。
选择性地测量大内皮素-1只是问题的逐渐改善，而没有实际解决问题，因为大内皮素也能够在血液循环中快速地被加工成内皮素[1、5、9]。因此，其同样也具有相对较短的生物半寿期(20-25分钟)[10]，因而在血浆中可测定的大内皮素的测量值同样也只是代表了短暂的血浆浓度，而没有反映真正起生理作用的内皮素浓度。当测定大内皮素-1时，在疾病条件下生理形成的、但已经经过加工的并结合在组织中或受体上的ET-1是不包括在内的。因此，在测量大内皮素的情况下，也低估了具有生理活性的内皮素的总量。尝试了补充地特异性测量在大内皮素-1的酶促裂解时除了ET-1之外而形成的大内皮素-1的C-末端肽片段(具有前内皮素原的第74-90位氨基酸或大内皮素的第22-38位氨基酸)，结果表明这样的肽的稳定性比ET-1还要差，因而不适合于测量[10]。
对于测量除了大内皮素之外的内皮素原的范围，从现有技术中仅获知一种商业的竞争性测试法(N-末端区域18-50，从PhoenixPharmaceuticals商购获得；对于败血症诊断的用途描述在WO00/22439中)。对于待用这种测定法进行测量的分析物的稳定性和性质，没有公开任何信息。
本发明的目标是开发出一种测定方法，该方法能够比迄今的对于血浆中的ET或大内皮素的测定更可靠地反映大内皮素或内皮素的内源形成，即总的生理浓度，和由此反映内皮素的作用。
一种这样的方法应当是有效的和适于程式化的，并能够提供在各种不同的疾病状况的情况下关于ET(ET-1)和/或其前体的生理产生的可靠值，特别是在败血症或其他其中内皮素的值升高起着作用的疾病状况的情况下。
本发明的目标通过如此来达到，即出于诊断目的，在人类患者的全血、血浆或血清样品中不测定ET或大内皮素，而是测定不含有ET或大内皮素序列的相对长寿的前内皮素原-或内皮素原-部分肽，特别是C-末端部分肽，其至少含有前内皮素原-1的第168-212位氨基酸。
权利要求1涉及本发明的原理。本发明有利的并且目前优选的实施方案描述在从属权利要求中。
本发明基于申请人的实验研究，在这些实验研究中能够表明，前内皮素原的这样的部分不是内皮素的直接的前体，其包括适合于测量目的的长寿的肽，这些长寿的肽能够在血液样品中可靠地和以高临床价值得到测量。
在生理学上，内皮素-1通过更大的前体分子即前内皮素原(SEQ IDNO：1)或者从中获得的分泌的内皮素原的加工而形成。在这样的加工过程中，除了大内皮素(和从中而来的内皮素)之外，必须以初始化学计算量形成其他的肽，这些肽迄今仍然从未成为科学研究的对象，并且关于其可能的其他加工和稳定性是未知的。在申请人的研究开始时，希望能够证实，血液样品(全血、血浆或血清样品)中存在至少一种假设的其他的肽-裂解产物，并经证明是相对稳定的，因而可以适合于作为内皮素的生理形成的量度，而不管实际的在血浆中可测得的内皮素浓度。
因此，测量这样的裂解产物可能就是所寻求的用于测定内皮素生理浓度或产生的方法，其在权利要求中称为测定“内皮素的形成”。该术语涉及，在假设只有一条即单个已知的从前内皮素原形成内皮素-1的形成途径的情况下，与疾病相关地形成的内皮素-1的生理浓度只能相应于先前加工的前内皮素原或内皮素原的量。如果除了大内皮素或内皮素之外以相同的化学计量浓度形成的部分肽是稳定的“代谢废料”，其既不结合受体也不分配入组织中，那么其必须在循环中重新找到。并不由此必需牵涉某一生理学机制，所以还可以将“测定/测量内皮素的形成”认为是测量“分泌活性”或者“分泌性内皮素原的产生”。
在本申请中，待测定的肽片段的特征在于“长寿”。该术语是表示，待测定的肽片段在循环中(在全血中)的停留时间明显比内皮素或大内皮素片段长。特别地，使用“长寿的”这一术语是表示，这样的肽片段在全血和由此获得的血浆中没有经历进一步的快速的蛋白酶解性裂解，并且与内皮素和受体的结合速率以及可裂解片段的蛋白酶解性裂解速率相比，其以明显更慢的速率从循环或代谢中被清除。
由于所述的较长的稳定性或“长寿性”，在存在这样的片段的情况下，关于已经流逝的分泌活性的信息被存贮了一段时间，这段时间至少对于无问题的测量是合适的。如果推测，例如，内皮素前体以单次、短时间倾出的方式释放，那么在某一时间之后可测量的“长寿的”片段的量相当于最初倾出的量只减去与待测量的肽片段在循环中的生理半寿期相关联的量。另一方面，如果推测，例如，在疾病发生期间，内皮素前体或多或少地持续产生，那么在上述意义上长寿的肽片段的可测量的浓度中累积性地反映了过去的前体的生理产生，而只是再次要减去依照其生理清除速率的在同样的时间内发生的肽片段浓度降低。活性内皮素或者其前体即大内皮素在同样的时间内早已进行了加工或者从循环中清除，和例如结合在受体上，因此不再是可测量的。肽片段越长寿，或者其清除速率越小，那么测量时间点对于上述的生物标记物(即内皮素)“形成”的测定准确性的影响就越小。在这种情形下，在较长的时间内恒定的浓度表明，形成和清除之间达到了平衡。如果浓度降低，那么这可能表明，前体分子(例如内皮素原)的分泌已经终止，例如因为分子储库被耗尽，和待观察的浓度变化只由清除速率决定。
因此，没有已知的生理功能的长寿肽片段的测量结果不仅定量地而且定性地提供了与相当短寿的活性肽或者其同样相对短寿的前体的测量不同的结果。
下面将详细描述的申请人的研究表明，上述的方法在测定内皮素形成的情况下提供了富有成效的结果。
所实施的研究和这些研究的最重要的结果在下文中将进行更准确的解释，其中将参考附图。
附图说明：
图1：在实验部分更准确描述的目前优选的三明治测定法的典型标准曲线，以便测定人血浆中的C-末端内皮素原肽序列，所述三明治测定法使用两种抗体，其结合相当于前内皮素原-1的位置168-181和200-212的氨基酸序列；
图2：图，其显示了，在败血症和心脏病患者的EDTA-血浆样品于室温放置12小时的情况下，在根据图1的测定法中没有出现显著的免疫反应性的损失；
图3a：与显然健康的个体的测量相比较，具有不同的疾病/诊断的5组人类患者的血浆测量；点状线表示在健康个体中发现的最大值(基于健康的对照，100％特异性的线)；
图3b：与图3a相应的图，其对于另4组的患者血清。
本发明的方法在其最总括的方面涉及，当严重疾病时，在患者的全血、血浆或血清样品(即循环)中测定内皮素原-1的相对长寿的肽片段，其不含有内皮素-1或者其前体即大内皮素的氨基酸序列，以便间接地测定内皮素(特别是内皮素-1)的形成。根据一个优选的实施方案，所测定的肽片段是C-末端片段，有两种抗体与之结合，这两种抗体可结合具有相当于前内皮素原-1的位置168-181和200-212的氨基酸序列的肽。
对于本发明的实际转化，特别优选的是计划采用非竞争性三明治测定法，例如用于继续的深入研究并在下文中将更准确地进行描述的这种类型的。
相对于竞争性免疫测定法，非竞争性三明治免疫测定法(双侧免疫测定法)具有许多优点，包括能够比固相测定法(异相测定法)更好地进行设计，能够在可操作性方面更稳固，能够以更高的灵敏度提供测量结果，以及还更好地适合于自动化和批量测量。此外，与只用一种类型的抗体进行工作的竞争性免疫测定法相比，非竞争性三明治免疫测定法还能够提供额外的信息，这是通过三明治免疫测定法只识别这样的分子或肽而完成的，即在这些分子或肽中，于同一个分子上存在两个对于为了形成三明治而使用的抗体的结合位点。
原则上，可使用的抗体可以是任何合适的单克隆和/或多克隆抗体，但是，其中经亲和纯化的多克隆抗体在目前是优选的。
特别优选的是通过用抗原免疫动物(特别是绵羊)而获得的抗体，所述抗原含有相应于前内皮素原-1的短氨基酸序列并在N-末端具有额外的半胱氨酸残基的合成的肽序列。在随后的实验部分，特别描述了结合第161-181位和第200-212位的氨基酸序列的抗体或其在测定法中的应用。但是，在研究的范围内还可以使用另外的抗体，其相应地结合位置184-203和136-148。在测量中使用这些其他的抗体而获得的额外的结果在本申请中只是概括性地进行了讨论。
在一个优选的实施方案中，该方法作为异相(heterogener)三明治免疫测定法来施行，其中一种抗体固定在任意的固相上，例如涂覆的测试小管(例如由聚苯乙烯制成；“包被的管(Coated Tubes)”；CT)的壁，或者固定在例如由聚苯乙烯制成的微量滴定板上，或者固定在颗粒例如磁性颗粒上，而另一种抗体具有这样的残基，即该残基是可直接检测的标记物或使得能够选择性地与标记物相连接，和有助于检测所形成的三明治结构。使用合适的固相的、在时间上延迟的或者说随后的固定化也是可能的。
原则上，可以使用所有在所述类型的测定法中可使用的标记技术，属于此的有用放射性同位素、酶、荧光标记物、化学发光标记物或生物发光标记物进行标记，和直接通过视觉可检测的颜色标记，例如金原子和染料微粒，正如其特别用于所谓的床旁(Point-of-Care，POC)测试或快速测试用于在全血样品中的测定。在异相三明治免疫测定法的情况下，两种抗体还可以具有下文中关于单相测定法(homogenenAssays)所描述的类型的检测系统的部分。
因此，将本发明的方法布置成快速测试也在本发明的范围内。
此外，本发明的方法可以布置成单相方法，其中由两种抗体和待检测的肽片段所形成的三明治复合物保持悬浮在液相中。在这样的情况下，优选的是用检测系统的部分标记两种抗体，如果两种抗体整合入单个的三明治中，那么所述的检测系统使得能够产生信号或触发信号。这样的技术特别可布置成荧光增强或荧光猝灭检测方法。一种特别优选的这一类型的方法涉及使用成对使用的检测试剂，如其例如在US-A-4822733、EP-B1-180492或EP-B1-539477以及其中所引用的现有技术中所描述的。其使得能够直接在反应混合物中进行只选择性地包括反应产物的测量，所述反应产物含有在单个免疫复合物中的两个标记组分。作为实例可参见以商标(时间分辨扩增穴合物发射(Time Resolved Amplified Cryptate Emission))或
Figure S05804634320060818D00008153709QIETU
提供的技术，其实现了上述申请的教导。
在申请人的研究中证实了，根据本发明测定前内皮素原-1的C-末端肽片段提供了非常有意义的且相关的测量结果。正如下文中将要证实的，该信息不仅可应用于败血症的诊断，而且可应用于心脏病的诊断和癌症的诊断。
此外，认为本发明的测定方法还可以特别有利地在所谓的多参数诊断的范围内进行实施，而且不仅可以应用于心脏病诊断的领域，还可以应用于败血症和癌症诊断的领域。其他在此确定的参数例如为心脏参数ANP、BNP、proANP、proADM或proBNP，或者败血症参数，其例如选自抗神经节苷脂抗体，蛋白质降钙素原，CA125，CA19-9，S100B，S100A-蛋白质，LASP-1，可溶的细胞角蛋白片段，特别是CYFRA21、TPS和/或可溶的细胞角蛋白-1片段(sCY1F)，肽Inflammin和CHP，其他肽类激素原，甘氨酸-N-酰基转移酶(GNAT)，氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)和C-反应性蛋白(CRP)或者其片段。在所述的多参数测定的情况下，预定同时或平行地测定多个参数的测量结果，并例如借助于计算机程序进行评价，所述计算机程序还利用诊断上显著的参数相关性。
在下文中，将通过对下述内容的描述而更详细地说明本发明：优选的测定法组分的制备，三明治类型的测定法的优选实施方案的实施，和通过使用这样的测定法而获得的对照个体以及败血症、心脏病和癌症患者的EDTA-血浆中的C-末端肽片段的测定结果。
实验部分
A. 材料和方法
1.肽的合成
来源于已知的人前内皮素原-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选择出三个区域(位置168-181、184-203、200-212)。在每种情况下，以补充N-末端半胱氨酸残基的方式，根据标准方法作为可溶的肽化学合成这些区域，纯化，借助于质谱法和反相HPLC进行质量控制，并冻干成等分试样(JERINI AG公司，柏林，德国)。这些肽的氨基酸序列如下：
肽PCT15                   (168-181+N-末端半胱氨酸)
CRSSEEHLRQTRSET           (SEQ ID NO：4)
肽PCW14                   (200-212+N-末端半胱氨酸)
CSRERYVTHNRAHW            (SEQ ID NO：5)
肽PNR20                   (184-203+N-末端半胱氨酸)
NSVKSSFHDPKLKGKPSRER      (SEQ ID NO：6)。
此外，作为用于校准测定法的标准，合成了下述的肽：
标准肽PSW44(169-212)
SSEEHLRQTRSETMRNSVKSSFHDPKLKGKPSRERYVTHNRAHW
(SEQ ID NO：7)。
2.缀合和免疫
借助于MBS(间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，将肽PCT15和PCW14缀合在载体蛋白KLH(匙孔血蓝蛋白)上(参见操作指南“NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers”，PIERCE公司，Rockford，IL，USA)。根据下述的计划方案，用这些缀合物免疫绵羊：起初，每只绵羊得到100μg缀合物(基于缀合物的肽部分的质量值)，随后，每4个星期给予每只绵羊50μg缀合物(基于缀合物的肽部分的质量值)。从开始免疫之后的第4个月开始，每4个星期对于每只绵羊抽血700ml，并通过离心从中获得抗血清。缀合、免疫和抗血清的获得由MicroPharm公司(Carmarthenshire，UK)来实施。
3.抗体的纯化
在1-步骤方法中，从在免疫之后的第4个月开始而获得的抗血清中制备肽特异性抗体。
为此，首先将肽PCT15和PCW14偶联在SulfoLink凝胶上(参见操作指南“SulfoLink Kit”，PIERCE公司，Rockford，IL，USA)。在此，每次对于每5ml凝胶提供5mg肽用于偶联。
从绵羊抗这两种肽的抗血清中亲和纯化出肽特异性抗体如下进行：
首先，肽柱每次用10ml洗脱缓冲液(50mM柠檬酸，pH2.2)和结合缓冲液(100mM磷酸钠，0.1％Tween，pH6.8)交替地洗涤三次。将100ml抗血清通过0.2μm进行过滤，并掺入存在的柱材料中。为此，将凝胶定量地用10ml结合缓冲液从柱中漂洗出来。在室温下，摇动温育过夜。将温育混杂物定量地转移至空的柱(NAP25，Pharmacia，排空的)中。丢弃流出物。随后，用250ml结合缓冲液洗涤至无蛋白质(洗涤洗出液的蛋白质含量<0.02，A280nm)。向经洗涤的柱添加洗脱缓冲液，并以1ml的体积收集级分。借助于BCA-方法(参见操作指南，PIERCE公司，Rockford，IL，USA)测定每个级分中的蛋白质含量。汇集蛋白质浓度>0.8mg/ml的级分。在借助于BCA-方法对汇集物进行蛋白质测定之后，收获了97mg抗-PCT15抗体0407-pAk，和60mg抗-PCW14抗体0410-pAk。
4.标记
将抗-PCW14抗体0410-pAk如下进行处理：
根据操作指南，通过NAP-5凝胶过滤柱(Pharmacia)将500μl纯化的抗体重新缓冲在1ml100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中。抗体溶液的蛋白质浓度测定的结果是1.5mg/ml。
对于抗体的化学发光标记，向67μl抗体溶液中掺入10μl MA70-吖啶鎓-NHS-酯(1mg/ml；HOECHST Behring公司)，并在室温下温育15分钟。然后，加入423μl1M甘氨酸，并再温育10分钟。随后，根据操作指南，通过NAP-5凝胶过滤柱(Pharmacia)将标记混杂物重新缓冲在1ml移动相A(50mM磷酸钾，100mM NaCl，pH7.4)中，并在此除去低分子量成分。为了分离未结合在抗体上的标记物的最后的残留物，进行凝胶过滤-HPLC(柱：Waters Protein Pak SW300)。施加样品，并以1ml/分钟的流速用流动相A施行色谱法。用流式光度计(Duchfluβphotometer)测量波长280nm和368nm。作为抗体标记程度的量度的吸收率368nm/280nm在峰值为0.10。收集含有单体抗体的级分(保留时间8-10分钟)，并收集在3ml100mM磷酸钠，150mM NaCl，5％牛血清清蛋白，0.1％叠氮化钠，pH7.4。
5.偶联
将抗-PCT15抗体0407-pAk如下进行处理：
将经辐射的5ml聚苯乙烯小管(Greiner公司)用纯化的抗体如下进行包被：将抗体在50mM Tris，100mM NaCl，pH7.8中稀释至6.6μg/ml的浓度。在每个小管中，移入300μl这样的溶液。将小管在22℃温育20小时。吸去溶液。然后，用4.2ml10mM磷酸钠，2％Karion FP，0.3％牛血清清蛋白，pH6.5充满每个小管。20小时后，吸去溶液。最后，将小管在真空干燥器中进行干燥。
B.免疫测定法的实施和评价
制备具有下列组成的测定法缓冲液：100mM磷酸钠，150mM NaCl，5％牛血清清蛋白(BSA)，0.1％非特异性绵羊IgG，0.1％叠氮化钠，pH7.4。
上述化学合成的肽(肽PSW44)用作标准材料，其相当于前内皮素原-1的位置169-212。该肽在马正常血清(SIGMA公司)中作系列稀释。将根据称量肽而得到的浓度归因于如此制备的标准。
测量样品为看上去健康的个体、患败血症的患者和患不同的心血管疾病的患者的EDTA-血浆。
在测试小管中，移入50μl标准或样品以及200μl测定法缓冲液。在22℃，摇动温育2小时。然后，以每次每个小管1ml洗涤溶液(0.1％Tween20)洗涤4次，并让其控干。然后，移入200μl测定法缓冲液，其含有1百万RLU(相对光单位)的MA70-标记的抗体。在22℃，摇动温育2小时。然后，以每次每个小管1ml洗涤溶液(0.1％Tween20)洗涤4次，控干，并在发光计(BERTHOLD公司，LB952T；Basisreagenzien BRAHMS AG)中测量结合在小管上的化学发光。
使用软件MultiCalc(Spline Fit)，在标准曲线上读出样品的浓度。
C.结果
用所开发出的三明治免疫测定法(针对位置168-181和200-212的抗体)可测量的分析物在下文中称为C-末端-内皮素原或者Ct-内皮素原。所开发出的测试的典型标准曲线显示在图1中。使用该测试，还能够测定远低于50pg/ml的Ct-内皮素原的浓度。
为了检查在测量C-末端肽片段时，是否必须考虑由于在样品或测量溶液中的稳定性不足而引起的问题这一疑问，将5个败血症血浆每次在新鲜时和贮存12小时之后于室温进行测量。结果概括在图2中。其显示出，在贮存12天之后，免疫反应性仍有最初测量的免疫反应性的大约93％，几乎没有变化。这种所检测的稳定性从对于诊断的操作观点来看是很大的优点。
使用该测试，测量了心脏病以及败血症患者的血浆。获得的结果显示在图3a和3b中。对于所有的被研究的心脏病疾病病状，发现对于正常对照均具有升高的值。同样地，对于患有SIRS(全身性炎症反应综合征)和败血症状况的患者也发现具有升高的值。在此，诊断灵敏度(当基于健康的对照，给定100％的特异性时)随着疾病的严重程度而升高：败血症32.3％，严重的败血症65.5％，和感染性休克75％。
当用经修改的测定法测量样品时，如所预期的，得到了基本上相同的结果，在该经修改的测定法中，上述三明治测定法的一种抗体用识别前内皮素原-1的第184-203位氨基酸的抗体替代。
与此相反，如果所使用的抗体中的一种抗体识别位于更接近前内皮素原的N-末端方向的氨基酸序列(32-52或136-148)，则不能获得相对于健康个体来说升高的测量值。这表明，内皮素原本身不存在于所测量的血浆样品中，并且不仅经蛋白酶解进行加工而形成大内皮素，而且在此释放的C-末端序列93-212还进一步进行裂解，其中至少一个这样的裂解位点必须位于第149-167位氨基酸的范围内。该信息适用于具有所研究的疾病的患者的血浆。但是，不能排除，在其他患者组中仍然获得例如完整的C-末端片段93-212，和其选择性的测量能够提供在诊断上相关的结果。
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Figure IYZ000001551306400011
Figure IYZ000001551306400021
Figure IYZ000001551306400041

Claims (14)

1.用于免疫诊断的体外确定在严重疾病中内皮素的形成的试剂盒，其测定人类患者的全血、血浆或血清中衍生于前内皮素原-1的氨基酸序列SEQ ID NO：1的肽，所述肽包含前内皮素原-1的第168-212位氨基酸范围内的肽序列，其特征在于，所述试剂盒，除了常规的作为标准的试剂、缓冲剂和洗涤溶液外还包含特异性识别前内皮素原-1的氨基酸序列SEQ ID NO：1的C-末端片段的一种或多种抗体，所述C-末端片段包含前内皮素原-1的第168-212位氨基酸SEQ ID NO：7范围内的所述肽序列，所述严重疾病为全身性炎症反应综合征、败血症状况、心脏病疾病病状和癌。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于，至少一种抗体是经标记的抗体。
3.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，通过竞争性免疫测定法或三明治免疫测定法进行所述确定。
4.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，包含抗体对，所述抗体对结合存在于具有前内皮素原-1的第168-212位氨基酸的C-末端片段SEQ ID NO：7中的两种不同的肽序列，所述不同的肽序列选自具有前内皮素原-1的第168-181位、第184-203位和第200-212位氨基酸的肽序列。
5.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，将其设计为用于实施免疫层析床旁测试法的试剂盒。
6.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，所述抗体是经亲和纯化的多克隆抗体。
7.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，所述抗体通过用抗原免疫动物而获得，所述抗原含有选自肽SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的合成的肽。
8.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，包含两种不同的抗体，其中一种进行标记，而另一种结合在固相上或者可以选择性地结合在固相上。
9.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，包含两种不同的抗体，这两种抗体均分散地存在于液态反应混合物中，其中结合第一种抗体的第一种标记组分是基于荧光或化学发光猝灭或增强的标记系统的部分，且该标记系统的第二种标记组分结合第二种抗体，从而在这两种抗体结合在待检测的肽片段上之后，产生了可测量的信号，该信号使得能够检测在测量溶液中形成的三明治复合物。
10.根据权利要求9的试剂盒，其特征在于，所述标记系统包含稀土元素穴状化合物或螯合物，以及荧光或化学发光染料。
11.多克隆抗体，其特异地结合由相应于前内皮素原-1的第168-181位氨基酸SEQ ID NO：4、第184-203位氨基酸SEQ ID NO：6和第200-212位氨基酸SEQ ID NO：5氨基酸的氨基酸序列组成的肽。
12.根据权利要求11的抗体，其特征在于，其是经亲和纯化的多克隆抗体。
13.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其至少包含：(a)根据权利要求11和12中任一项的第一种抗体，(b)根据权利要求11和12中任一项的第二种其他抗体，其中一种抗体进行标记，而另一种抗体被固定化或者是可固定化的，以及(c)具有至少包含前内皮素原的第168-203位或第168-212位氨基酸的氨基酸序列的标准肽。
14.根据权利要求13的试剂盒，其特征在于，固定化的抗体以固定在测试小管的壁上的方式存在。
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